JPS59120097A - ７−ケト−３α−ヒドロキシコラン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はケノデオキシコール酸（正しくは３α、７α−
ジヒドロキシ−５β−コランＭ）（ＣＤＣ）から利胆剤
ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣ）の合成原料として有
用な製造中間体である７−ケドー　３　ｏニーヒドロキ
シ−５β−フラン酸（以下、本明細書において７−ケト
コール酸又は７−ケト体と略称することがある）を微生
物を用いて製造する方法に関する。

従来、ケノデオキシコール酸を原料としてＵＤＣを合成
する方法として、ケノデオキシコール酸の７位のα−ヒ
ドロキシル基をβ−ヒドロキシル基とするために、ケノ
デオキシコール酸を選択的に酸化して７−ケト体とした
後水素化する方法などが知られている。しかしながら、
これらの方法は当然の事乍ら各反応段階において反応性
や選択性の問題があり、収率や得られる製品の純度など
の点で必ずしも満足出来るものではなかった。

本発明者等はかかる現状に鑑み、ケノデオキシコール酸
からその７−ケト体を微生物を用いて製造する方法の可
能性について鋭意研究を進めた結果、シュードモナス属
に属する微生物が７一ケト体生産能を有することを見出
し本発明をするに至った。

即ち、本発明に従えば、シュウトモナス属に属する７−
ケドー３α−ヒドロキシコラン酸生産能を有する微生物
をケノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養して培養
物中に７−ケドー３α−ヒドロキシコラン酸を生成せし
め、これを採取することから成る７−ケドー３α−ヒド
ロキシコラン酸の製造法が提供される。

本発明者等は神奈用県綾瀬市内の土壌よりケノデオキシ
コール酸を含む培地で７−ケト体を生産する能力を有す
る菌を分離することに成功し、この菌株をシュウトモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　Ｓ　Ｄ　−１０２と
命名し、昭和５７年１２月１７日工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託（微工研菌寄第６８４２号）した。

土壌中よりの菌の分離は次の方法によった。

土壌を１％のケノデオキシコール酸ナトリウムを含む肉
汁液体培地に少量懸濁し、３５°Ｃ１４８時間集積培養
を行ない、得られた培養液の１白金耳量を１％のケノデ
オキシコール酸ナトリウムを含む肉汁寒天平板培地に画
線培養し、菌株を純粋分離した。これらの菌株を、各々
１％のケノデオキシコール酸ナトリウムを含む肉汁液体
培地で８〜７２時間培養し、その培養液中の７−ケト体
の定量を行ない、７−ケト体の変換能の高い菌株を得た
。

この菌の菌学的性質は以下の通りであり、これらの試験
及び分類方法ばバージエイズ・マニュアル・オブ・ディ
ターミネイティブ・ハタテリオロジー第７版及び第８版
に準拠し、既知の菌株の菌学的性質との対比からシュウ
トモナス属に属する菌株であると同定した。更にこの菌
の菌学的性質を既知の菌株の中で最も近似するシュウト
モナス・ストソツエリ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５
ｔｕｔｚｅｒｉ）　　Ｉ　ＡＭ１２０９７の菌学的性質
と比較すると次表の通りである。この表に示した菌学的
性質に基づき、シュウトモナス５Ｄ−１０２の菌株は、
その形態、ダラム染色、培養所見及び生理学的性質など
から、バージエイズ・マニュアル・オブ・ディターミネ
イティブ・バタテリオロジー第７版及び第８版に基づき
、シュウトモナス・ス１〜ソツェリに近縁の菌株である
と同定された。しかしながら、シュウトモナス・ストソ
ツェリＩＡＭ１２０９７とシュウトモナス５Ｄ−１０２
とは、コール酸の資化性、デンプンの加水分解性、ＯＦ
テスト並びに糖類の酸化性の点で相違するので新菌株で
あると断定した。

ダラム染色：陰　性 形　　態：桿菌 大　き　さ：０．７５〜０．８０　Ｘ　１．２５〜２．
００μｍ 多形性：なし 運動性：あり 鞭　　毛：単鞭毛 （極鞭毛と思われる） 胞　　子：な　し 集合形態　：単一で存在。

２、培養所見 肉汁寒天平板：３日間の培養で３　ｍ＋ｎ径程のコロニ
ー。白色はぼ円 形。平坦で湿っており光 沢あり。周縁は波状。

肉汁寒天斜面：白色で湿り気が多い。

肉汁液体　　：うすく白濁。白色の沈渣。

肉汁ゼラチン穿刺：表面でよく生育。

液化しない。

ＢＣＰミルク：アルカリ性。ミルクは 変化なし。

３、生理学的性質 硝酸塩の還元；＋ 脱窒反応　　：＋ ＭＲテスト　ニー ＶＰテスト　ニー インドールの生成ニー 硫化水素の生成（クリグラ−培地）：±デンプンの加水
分解ニー クエン酸の利用（コーザー培地）：＋ 〃　　（グリステンＸセン培地）二十 硝酸（Ｎべ）の利用：＋ アンモニア（ＮＨ４）の利用：＋ 色素の生成ニー ウレアーセニー オキシダーゼニ＋ カタラーゼ：＋ 生育の範囲（ｐＨ）　　　：５〜１１ （温度）＝１０℃〜４０°Ｃ 酸素に対する態度：好気的 ＯＦテストニー コール酸の資化能：＋ グリセリン　　　　−− Ｌ−アラビノース　　±　　　− Ｄ−キシロース　　　±　　　− リボース　　　　　　±　　　− Ｄ−グルコース　　　−　　　− Ｄ−マンノース　　　−− Ｄ−フラクトース　　−− Ｄ−ガラクトース　　−− マルトース　　　　　−　　　− シュクロース　　　　±　　　− ラクトース　　　　　−　　　− トレハロース　　　　−　　　− セロビオース　　　　−− 糖　　　顕　　　　　　　酸　　　ガ　スＤ−ソルビト
ール　　−− Ｄ−マニトール　　　−　　　− イノシトール　　　　−− ラフィノース　　　　−　　　− スターチ　　　　　　−　　　− ダラム染色：陰　性 形　　　　態：桿　菌 人　さ　さ：０．５〜１．　ＯＸ　１．　Ｏ〜１．８μ
ｍ多形性：なし 運動性：あり 鞭　　　毛：単極鞭毛 胞　　子：な　し 集合形態　二車−で存在。

２、培養所見 肉汁寒天平板：４８時間で４Ｍ＋１１程のコロニーにな
る。白色で中心 部は微褐色。平坦な円形 で波状の周縁。光沢あり 湿潤。

肉汁寒天斜面：白色。

肉汁液体　　：うす（白濁。白色の沈渣肉汁ゼラチン穿
刺；糸状に生育、ゼラチンを液化せず。

ＢＣＰミルク：アルカリ性。ミルクは 変化なし。

３、生理学的性質 硝酸塩の還元２＋ 脱窒反応　　２＋ ＭＲテスト　ニー ｖＰテスト　−一 インドールの生成ニー 硫化水素の生成（クリグラ−培地）ニーデンプンの加水
分解：＋ クエン酸の利用（コーザー培地）；＋ 〃　　（クリステンセン培地）二十 硝酸（Ｎ−）の利用：＋ アンモニア（Ｎ）卯の利用：＋ 色素の生成ニー ウレアーゼニー オキシダーゼ：＋ カタラーセ：＋ 生育の範囲（ｐＨ）　　　：６〜１０ （ａＬ度）二１０℃〜４０℃ 酸素に対する態度：好気的 ＯＦテスト：０ コール酸の資化能ニー グリセリン　　　　十　　　− Ｌ−アラビノース　　−　　　− Ｄ−キシロース　　　＋　　　− リボース　　　　　　± Ｄ−グルコース　　　十　　　− Ｄ−マンノース　　　−　　　− Ｄ−フラクトース　　±　　　− Ｄ−ガラクトース　　± 糖類なと　　　酸　化　ガ　ス マルトース　　　　　−　　　− シュクロース　　　　−− ラクトース　　　　　−− トレハロース　　　　−　　　− セロビオース　　　　−− Ｄ−ソルビトール　　−　　　− Ｄ−マニトール　　　±　　　− イノシトール　　　　−− ラフィノース　　　　−　　　− スクーチ　　　　　　十　　　一 本発明方法に従えば、シュウトモナス属に属する７−ケ
ドー３α−ヒドロキシコラン酸生産能を有する微生物を
ケノデオキシコール酸を含む栄養培地で培養することに
より７−ケドー３α−ヒドロキシコラン酸を生成せしめ
る。栄養培地中のケノデオキシコール酸濃度には特に限
定はないが、目的７−ケト体の収量、培養条件及び経済
的観点から一般には５〜５００　ｇ／β、好ましくは４
０〜３００　ｇ／βの濃度とする。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養により増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば、炭素源としては、ケノデオキシ
コール酸塩、グルコース、フラクトース、マンノース、
マルトース、シュクロース、エチルアルコール、グリセ
リン、酢酸すど、窒素源としては、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス、コーンステイープリカー等の有機窒素、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム
等の無機窒素が用いられる。また、このほかにリン酸２
水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガンなどの無機塩が添加される。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、一般的に言えば、温度２
５〜４０°ｃ、ｐＨ６，０〜９．０及び２０〜９６時間
程度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的の７−ケト体の採取方法は
慣用方法に従って行うことができる。例えば、培養液を
遠心分離し、上清を希塩酸で酸性にしたのち、酢酸エチ
ルで抽出する。溶媒を留去して生成物を集め、メチルア
ルコールに熔解後加熱還流してメチルエステル化し、冷
却して結晶化、再結晶化して精製し、これを加水分解し
て目的物を得る。

以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。

実施例１ シュウトモナス５Ｄ−１０２を下記の方法で培養した。

ケノデオキシコール酸１０ｇ、水酸化ナトリウム１．２
ｇ、酵母エキス１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．
５ｇ、リン酸水素２カリウム５ｇ、リン酸２水素カリウ
ム２ｇ及び硝酸アンモニウム４ｇに水１０００　ｍ　（
ｌを加え、培地とした。この培地３１を５βジヤーフア
ーメンクーに入れ、１２１°Ｃで６０分間上記殺菌を行
なった。

あらかじめ５００ｍ１坂ロフラスコに上記培地と同一組
成の培地１００ｍ１を入れて３０℃で２日間振盪培養し
て増殖させた培養液２００　ｍ　ｌを無菌的に遠心分離
して得たシュウトモナス５Ｄ−１０２菌体を上記ジャー
ファーメンタ−に接種し、４００　ｒｐｍ、３０℃及び
通気量０．５β／ｍｉｎの培養条件下で５日間培養した
。このようにして得た培養液１βを遠心分離し、菌体を
沈澱させ、上清を得た。この上清に希塩酸（１：　１）
を加えて塩酸酸性としケノデオキシコール酸の酸化生成
物及びケノデオキシコール酸の固形物を析出させ、濾集
した。

濾液を酢酸エチル３００ｍ６で３回抽出し、酢酸エチル
抽出液を合せ、４０°Ｃ以下で減圧濃縮した。得られた
固形物と先に濾集した固形物との合計量は１０．１７　
ｇであった。

この固形物の一部をとり、１％酢酸溶液としＫｉｅｓｅ
ｇｅ１６０　Ｆを用いて薄層クロマトグラフィーを行な
い生じたスポ゛ソトを標品３−ヒドロキシ−７−ケドー
５β−コラン酸及びケノデオキシコール酸のスポットと
比較したところ、同一の位置に同色の発色を示した。ま
た、３−ヒドロキシ−７−ケドー５β−コラン酸の部分
に相当する化合物を分取し、この化合物を下記の方法で
３α−ヒドロキシ′−７−ケトー５β−フラン酸と同定
した。

（イ）薄層クロマトグラフィーによる同定（Ａ）１％酢
酢酸液液３ｐｌＫｉｅｓｅｇｅ１６　ＯＦにスポットし
、風乾後ヘンゼン：ジオキサン：酢酸（７５：２０：２
）の組成の展開溶剤を用いてｌＱｃｍ展開した。乾燥後
、５％硫酸水／８液を噴霧し、１２０℃で１０分間加熱
したところ、標品３α−ヒドロキシ−７−ケドー５β−
コラン酸と同一位置に、同色のスポットがみられた。

（Ｂ）展開溶媒としてイソオクタン：酢酸エチル：酢酸
（１０：　１０　：　２）を用い（Ａ）と同様に展開、
発色させたところ、標品３α−ヒドロキシ−７−ケドー
５β−コラン酸と同一位置に同色のスポットがみられた
。

（ロ）液体クロマトグラフィーによる同定ショーデ・ノ
クス０ＤＳ−Ｆ４１１カラム（昭和電工＠製）を備えた
高速液体クロマトグラフィーに、上記抽出液を１５μβ
注入し、移動相としてメタノール／　Ｈ２Ｏ／　Ｈ３Ｐ
　０４（７５／　２５１０．０２Ｍ重量比）の混合液を
流速ｌ　ｍ　ｌＩ　／　ｍｉｎで流し、検出をＲ１で行
なった。

得られた結果を標品３α−ヒドロキシ−７−ケドー５β
−コラン酸と比較したところ、同一のリテンションタイ
ムを示した。また、１％酢酸溶液に標品３α−ヒドロキ
シ−７−ケドー５β−コラン酸７ｃ、０．５％となる様
に加えて熔解させ、前記と同様にして高速液体クロマト
グラフィーに注入し展開させたところ、標品３α−ヒド
ロキシ−７−ケドー５β−コラン酸が示すリテンション
タイムの位置に一つのピークが得られた。

液体クロマトグラムの面積比から得られた３α−ヒドロ
キシ−７−ケドー５β−コラン酸及びケノデオキシコー
ル酸の相対比を等比したところ以下の通りであった。

以下余白 面積百分率（％） ３α−ヒドロキシ−７−ケトー ５β−フラン酸　　　　　　　　　　　　３０．５ケノ
デオキシコール酸　　　　　　　　　６９，５その他の
ケノデオキシコール酸の酸化　　　０生底物の合計 実施例２ シュウトモナス５Ｄ−１０２を下記の方法で培養した。

ケノデオキシコール酸Ｌｏｇ、水酸化ナトリウム１．２
ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、硫酸マグネシウム
・７水和物０．５ｇ、リン酸水素２カリウム５ｇ及びリ
ン酸２水素カリウム２ｇに、水１０００ｍ＋２を加えて
、これを培地とした。この培地ＩＱｍｊ！を２４龍φ試
験管に分注し、１２１°Ｃで１５分間蒸気殺菌を行なっ
た。

あらかじめ、ケノデオキシコール酸５ｇ、水酸化ナトリ
ウム０．６ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ及び寒天
１５ｇに水１０００ｍβを加え、１２１℃で１５分間蒸
気殺菌を行ない、無菌的に準備した平板培地上に生育さ
せたシュウトモナス３１）−１０２菌を、上記の２４ｙ
ａｍψ・試験管中の培地に１白金耳接種し、３０°Ｃで
３日間振盪培養を行なった。培養後、得られた培養液を
遠心分離機にかけ、菌体を沈澱させ、上清と分離した。

上清に希塩酸を加えることにより白色沈澱として析出し
たケノデオキシコール酸の酸化生成物及びケノデオキシ
コール酸を酢酸エチルｌＱｍ／で抽出した。この抽出液
をそのまま実施例１に述べた薄層クロマトグラフィー及
び液体クロマトグラフィーと、同様の方法で分析したと
ころ、結果は以下の通りであった。

以下余白 高速液体 薄層クロマト　クロマト ３α−ヒドロキシ−７− ケドー５β−コラン酸　　　　　＋　＋　　　　２３．
４ケノデオキシコール酸　　　　　＋　＋　　　　４１
．３その他のケノデオキシコール酸 の酸化生成物　　　　　　　　　＋　＋　　　　３５．
３特許出願人 昭和電工株式会社 特許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　石　１）　　敬 弁理士　山　口　昭　之

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、シュウトモナス属に属する７−ケト−３αヒドロキ
   シコラン酸生産能を有する微生物をケノデオキシコール
   酸を含む栄養培地で培養して培養物中に７−ケドー３α
   −ヒドロキシコラン酸を生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とする７−ケドー３α−ヒドロキシコラン酸の
   製造法。