JPS61162169A - 新規なバシルス・ズブチルスｔｕ株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は生産能の改良された耐熱性プルラナーゼ様酵素
性生産菌バシルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＴＯ株に関するものである。

〔従来技術〕

プルラナーゼはプルランのα−１，６−グルコシド結合
を切断し、最終的にマルトトリオースを生成する酵素で
あり１種々の細菌、放線菌などにより生産されることが
知られている。α−１，６−グルコシド結合を切断する
酵素には、プルラナーゼの他にイソアミラーゼ、Ｒ−酵
素、アミロ−１，６−グルコシダーゼと呼ばれる種々の
酵素があり、総称してα−１，６−グルコシダーゼ、あ
るいは一般に、枝切り酵素（ｄｓｂｒａｎｃｈｉｎｇ　
ｅｎｚｙｍｅ）と呼ばれている。

プルラナーゼなどの枝切り酵素は、最近、β−アミラー
ゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させることにより、
マルトースを収量よく生産するのに使用したり、またグ
ルコアミラーゼのα−１，６−グルコシド結合切断能を
おぎなうために、グル１コアミラーゼと併用して、澱粉
からグルコースを・収量よく製造する、などに利用され
る有用な酵素である。

しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラーゼと併
用するためには、グルコアミラーゼがｐＨ４〜５．温度
５５〜６０℃に最適作用域をもつために。

少なくとも５５℃〜６０℃で長時間使用できる熱安定性
をもち、且つｐ旧〜５で作用できる酵素であることが要
求される。

しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵素ｌｔ、
、一部の微生物のもの（バシルス・ステアロサーモフィ
ラス（日本農芸化学会大会昭和４７年度講演要旨集第８
８頁）、バシルス・アシドプルリティカス（特開昭５７
−１７／１０８り、Ｓｔ；ａｒｃｈ、　３４．３４０（
１９８２）））を除き、殆んどは最適作用温度が４０°
Ｃ〜５０℃付近にあって、熱安定性に劣ることが欠点で
あった。

〔目的及び効果〕

本発明者は、前記目的にかなった枝切り酵素を開発する
ことを目的として、広く自然界より微生物の検索を行っ
てきた結果、最適作用ｐＨが約５〜約７．５の広い範囲
にあり、且つ最適温度が６０−６３℃の高い温度にある
、従来のプルラナーゼとは違つると考えられたので、生
産能を高めるための微生物の改良について種々検討して
きた結果、紫外線照射あるいはニトロソグアニジンなど
の薬剤処理により誘発された、ツニカマイシン（Ｔｕｎ
ｉｃａｎ＋ｙｃｉｎ）に耐性を示す突然変異株が生産能
を顕著に増加していることを認めた。

第１表は５本発明のプルラナーゼ様酵素を生産する、バ
シルス・ズブチルスの親株とツニカマイシン耐性を示す
突然変異株（バシルス・ズブチルスＴＵ株と命名）によ
るプルラナーゼ様酵素の生産能の一例を示している。

第１表 に比べ顕著に増大したものであることがわかった。

本発明はこの知見にもとすいてなされたものである。

〔構　　成〕

本発明は、プルラナーゼ様酵素生産能の増強されたツニ
カマイシン耐性をもつバシルス・ズブチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｕＭ：１ｌｉｓ）ＴＯ株に関するものであ
る。

以下に、本発明の内容を、更に具体的に示す。

本発明のツニカマイシン耐性株は以下のようにして造成
された。

バシルス・ズブチルスの親株（ＦＥＲＭ口Ｐ−６７２）
を蒸温水に懸濁し、紫外線（ｉｓｔｔ）を約３０ｃｍの
距離から１〜ＩＯ分間照射する。照射された菌１ｔＩＩ
濁液の一部を２５〜１００μｇ／ｍＱのツニカマイシン
を含む培地（ボリペブ］−ン１％、可溶性澱粉１％、Ｋ
２１１１）０．０．３％。

ＭｇＳＯ４・７１１２００．１％）に入れ、３０℃で１
〜３日間好気的に培養する。生育した微生物を、寒天を
含む同培地で平板培地に散布し、３０°Ｃでインキユベ
ーされた菌株が得られた。なお、ツニカマイシン耐性変
異株は２５〜１００μｇ／１ｎｉ）、のツニカマイシン
を含むＪＴｉ地に比較的良好に生育するが、親株は生育
を示さない。従って、本菌株（バシルス・ズブチルスＴ
Ｕ株）は、ツニカマイシに耐性を示し、且つ。

プルラナーゼ様酵素が著しく高い点において、新規なバ
シルス・ズブチルス変異株と考えられるものである。

なお、その他の菌学的性質を以下に示す。

（１）形態的性質； 桿菌で大きさ０．５〜０．７Ｘ０．８−１．２ｐ非運動
性、ダラム陽性、胞子は球形〜楕円形。

（２）培養的性質； （ｃ）肉汁液体培養；　生育はよくないが混濁を生じ、
沈降する。

（ｄ）クエン酸寒天斜面培養；　わずかに生育する。

（ｅ）ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆっくり液化する
。

（ｆ）ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次いでペプ
トン化する。

（ｇ）ポテト培養；生育はあまりよくない。

（３）生化学的性質 （ａ）硝酸塩の還元；　　陰性 （ｂ）カタラーゼ；　　　陽性 （ｃ）チロシナーゼ；　　陰性 （ｄ）インドール；　　　生成しない （ｅ）クエン酸の利用；　陽性 （ｆ）硫化水素の生成；　陽性 （ｇ）ウレアーゼ；　　　陰性 （ｈ）Ｐｉ粉の加水分解；　陽性 （ｉ）炭水化物の利用；　Ｄ−グルコース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト−ら酸を生成す
るが、ガスの発生は認れら机ない。

（４）生育ｐｌ＋及び生育温度 木菌は中性イ１近よりも、弱アルカリ性のｐｌ＋７．５
〜８．５で良好に生育する。生育最適温度は３５℃〜４
５゛Ｃにあり、最高生育温度は約５０°Ｃである。

木菌は、バチルスズブチルスＴＯ１微工研条寄第６８４
汗として二１−業技術院微生物］、業技術研究所に寄託
されている。

木菌により生産されるプルラナーゼ様酵素の性質を以下
に記載する。

（１）作用；　プルランのα−１，６−グルコシド結合
を分解し、主としてマルト１〜リオースを生成す６３°
Ｃ（第２図）。

（３）作用ｐ１１及び最適作用ｐＨ；１％プルラン、０
．０５Ｍ緩衝液で１１１１１定したとき、ｐｌ＋約３．
５〜約ｌ】の広いｐｉ範囲に作用する。第１図に示す通
り、ｐ　＋１５　（、Ｉ近とｐＨ７〜７．５にピークが
認められ、最適作用ｐＨは約５〜約７．５の広い範囲に
あると考えられる（クエン酸−リン酸二ナトリウ１２緩
衝液とリン酸緩衝液、２％プルテン、５５”Ｃで３０分
間反応）。

（４）熱安定性；　　０．０５Ｍ＋−リス緩衝液（ｐＨ
７，０）のもとて各温度で１０分間加熱後、プルランを
基質として残存活性を測定した。その結果、５０℃、１
０分間の加熱までは殆んど失活が認められず、　５０゛
Ｃ１１０分間の加熱で約３０％失活した。そして、６０
゛Ｃ１１０分間の加熱で約８０％失活した。

（５）　ｐＨ安定性；　　０．１Ｍ緩衝液のもとて３０
゛Ｃで３時間放置後、プルランを基質として残存活性を
測定した結果、ｐＨ約５〜約１０で安定であった。

（６）阻害剤ｉ１Ｘ１０−３Ｍの１１バ（１２、静ＮＯ
３で９０％以」二阻害された。また同濃度のＺｎＳＯ４
により認められた（１％プルラン、３０分反応）。

（８）精製方法；　木酵素は液体培養物の培養濾液から
、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸留水で洗５ｔＩ
ｉ後０．５ＭＫ］１．またはリン酸−カリウム溶液で抽
出し１次いで、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマト
グラフィー、口１ｏ（Ｈｃｌ　Ａ１．５ｍによるカラム
クロマトグラフィー、同カラムによる再クロマトグラフ
ィー等によりクロマ１〜的及び電気泳動的に均一まで精
製することができる。

（９）分子量；　旧ｏｇｅｌ　Ａｏ、５ｗｌでａｔり定
した分子量は約５５万であった。

（ｌＯ）活性測定法； プルラナーゼ活性の測定は、０．１Ｍリン酸緩衝液単位
とした。

以上から明らかなように、本発明のプルラナーゼ様酵素
はｐｌ＋約５〜約７．５の極めて広いｐ＋＋範囲に最適
作用ｐｌ＋が認められ、また、最適作用温度は６０〜６
３℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であり、本発明
風））１１に知られているバシルス属のプルラナーゼ（
例えば、ＡＨｒｊｃ　Ｉ’３ｉｏ１．　ｃｈｃｍ、　４
０．１５２３（１９７６）。

特公昭５９−　：Ｈ］６３０、特開昭５７−１７／１０
８９）とは異った新規なプルラナーゼ様酵素であるとい
うことができる。

また１本発明のプルラナーゼ様酵素は、プルランを基質
とするとき、最終的に、主としてマルトトリオースを生
成するプルラナーゼ活性を示すと同時に、アミロース、
アミロペクチン、グリコーゲンなどのα−１，４−グメ
コシド結合分解活性をもち、マルトースとマルトトリオ
ースを主成分として生成するα−アミラーゼ活性をもっ
ている。

このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫安分
画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交→＋≦よる吸
着グロマトグラフイー、ゲル濾過、Ｒ：ｍｍ体などへの
吸着などのタンパク質請製方法−キ→て分離されず、５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉｅ　Ｆ
ｉｎｅＧｈ’ｉ＋ｌｌ１ｃａｌｓ製）、Ｃｅ１ｌｕｌｏ
ｆｉｎｅ　ＧＣ７００ｍ（チッソ■製）Ｅｉｏ３ｅｌ　
Ａ−０，５ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、製）などを用
いたゲル濾過法により測定された分子量が４５〜５５万
の高分子量である（通常のプルラナーゼの分子量は１０
万前後）ことから、それぞれの活性をもつ複数個のサブ
ユ゛ニットがかなり強固に結合し、複合酵素を形成して
いることが考えられる（第３図は。

ＢｉｏＨｅｌ　Ａ１．５ｍによるα−アミラーゼ活性、
プルラナーゼ活性及びタンパク質の溶出曲線を示してい
るが、これら三者の溶出パターンは完全に一致している
）。

本発明の微生物の生産するプルラナーゼ様酵素は極めて
熱安定性に優れ、且つＰ旧、５〜８の広いｐＨ域で良好
に作用するため、グルコアミラーゼによ％の糖化条件で
あるｐＨ４，５〜５．０、温度５５〜６０７ｉ１ｈπト
いても効果的に作用することができる。従っ舒「犀発明
の微生物により生産される酵素をグル丁アミラーゼと併
用して、澱粉に作用される場合は、グルコアミラーゼ噴
独の場合に比べ２〜３％グルコースを増収することがで
きる。また、最高の糖化率に到達する時間も著しく短縮
することができる。すなわち、このことはグルコアミラ
ーゼの使用量を節減できることを示している。

本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するためには、窒
素源として、ペプトン、肉エキス、酵素エキス、カゼイ
ン、コーン・ステイープ・リカー、大豆粕、魚粉のよう
な有機窒素源や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナ
トリウム、硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素の
ような無機窒素源のいずれか、または両方を使用する。

炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン。

マルトース、グルコース等が使用される。そしてこれに
補足する栄養源として、リン酸塩、マグネシウム塩や、
少量のマンガンや鉄化合物が添加される。

培養は、ＰＨ約５〜約９．温度２５〜５５℃で行なうこ
とができるが、通常、　ｐＨ７〜９、温度３０℃前後で
２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆んど菌体外に
生産されるので、培養後、濾過または遠心分離して除菌
し、上澄液を回収する。そして、必要に応じ濃縮し、硫
酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどにより塩析するか
、または、アセトン、イソプロパツール、エタノール、
メタノール等の有機溶剤を加えて該酵素を沈殿物として
回収し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存する
。

本酵素を使用し、単独または、グルコアミラーゼやβ−
アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化する反応は、通
常、ｐＨ４〜９、温度４０℃〜７０℃で行われる。

以下に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ 大豆粕５％、コーン・ステイープ・リカー０．６％、肉
エキス０．３％、リン酸２カリ０．３％、硫酸マグネシ
ウム０．１％、可溶性澱粉２％、尿素０．５％、ソデイ
ウム・ドデシルサルフェート０．０６％、硫酸銅ｓｘｔ
。

＋　Ｓ　Ｍ、塩化マンガン２．５Ｘ１０−　”　Ｍ、塩
化カルシウムＩＸ”１Ｏ−３に、硫酸亜鉛ｌＸｌ０−’
Ｍ、硫酸鉄ｌＸｌ０−５Ｍからなる培地（ｐ）１７．０
）　１０ｍ　Ｑを２００ｍ　Ｑ容三角フラスコに入れ、
１２０℃で２０分間殺菌したのち、バシルス・ズブチル
スＴＯ株（ＦＥＲＭ　Ｐ−６８４）または親株（ＦＥＲ
Ｎ　ＢＰ−６７２）を接種し、　３０℃で４日間振盪培
養（１６０ｒｐ■）した。、培養後、遠心分離して得た
上澄液について生産されたプルラナーゼ活性を測定した
結果は第２表に示す通りであった。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図；　プルランを基質としたときの最適ｐＨを示す
。 第２図；　プルランを基質としたときの最適温度を示す
。 第３図；　　Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ１．５ｍカラム（１，５
Ｘ８７Ｃ１１）によるプルラナーゼ活性、アミラーゼ活 性及びタンパク質（２８０ｎｉにおける吸収）の溶出曲
線を示す。 特許出願人工業技術院長　等々カ　達 第３日 フラクシ′！Ｉ／ 官庁出願 手続士甫正書（自発） 昭和６１年２月７日 １、事件の表示　　　昭和６０年特許願第　　　　５８
９　号２、発明の名称 新規なバシルス・ズプチルスＴＵ株 ３、補正をする者 ４、指定代理人 □ ６、補正による増加する発明の数　　な　し７、補正の
対象　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄８、補正の
内容　　別紙のとおり １紙 （１）明細書第１頁第１Ｏ行目の「・・・・・・様酵素
性生産菌」を「・・・・・・様酵素生産菌」に訂正する
。 （２）明細書第５頁第２〜３行目の「蒸温水」を「蒸溜
水」に訂正する。 （３）明細書第８真下末より第３行目の「プルテン」を
「プルラン」に訂正する。 （４）明細書第１１頁第５行目の「グメコシド」を「グ
ルコシド」に訂正する。 （５）明細書第１１真下末より第７行目のｒＥｉｏｇｅ
ｌＪをｒＢｉｏｇｅｌＪに訂正する。 （６）明細書第１２真下末より第４行目の「酵素」を「
酵母」に訂正する。 （７）明細書第１４頁第１３行目のｒ　（ＦＥＲ阿Ｐ−
６８４）　Ｊをｒ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６８４）　Ｊに訂
正する。 （８）明細書第１４頁第２表の左横ｒＴＮ株」をｒＴＵ
株」に訂正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ツニカマイシン耐性をもつバシルス・ズブチルス
   ＴＵ株