JPS6047675A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミクロコツカス属に属する新規な微生物に関す
る。

従来、脂肪酸のω−末端のみを選択的に酸化することは
工業的には困難とされてきた６例えば、ラクトン系ムス
ク（じゃ香合成香料）の主成分であるヘキサテカノライ
ドの製造にはω−ヒドロキシパルミチン酸が使用される
が、ムスクが高価であるのは、この前駆体たるω−ヒド
ロキシパルミチン酸の製造が国難なことに起因する。即
ち、バルミチン酸のω−末端を選択的に酸化してω−ヒ
ドロキシパルミチン酸とすることは、合成化学上困難で
ある。

一万、微生物にノルマルパラフィンを資化させてジカル
ボン酸を製造する際に副産物とじてω−ヒドロキシ高級
脂肪酸も得られることが報告されている（例えば特公昭
４８−２６２３８）このようにω−ヒドロキシ高級脂肪
酸はノルマルパラフィンのアルカン資化性菌によるジカ
ルボン酸への代謝中間体であるが、そ吟著量生産は困難
とされている。その理由とこてはω−ヒドロキシ高級脂
肪酸の生成速度に比べて、そのジカルボン酸への転化速
度の方がずっと大きいためと推測される。

また、ω−ヒドロキシ脂肪酸と同様にラクトン系ムスク
の主成分である大環状ラクトンの有用な中間体としては
ω−ハロカルボン酸があ属、ノカルディア属に属し、ア
ルキルハライドからω−ハロカルボン酸を生産する能力
を有する菌を培養し、ω−ハロカルボン酸を生産する方
法が報告されている（特開昭５７−５０８９３号）。

そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑みアルキル（又
はアルケニル）ハライドを対応するω−ハロカルボン酸
に変換する能力を有する菌を自然界より広く検索した結
果、ミクロコツカス属に屈する微生物中に斯かる能力を
有するものがあることを見出し１本発明を完成した。

すなわち、本発明はミクロコツカス属に属し、アルキル
（又はアルケニル）ハライドを資化してω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する新規なミクロコツカス・エ
スピー〇ＫＳＭ−Ｂ−８（微工研菌冨第７００３号）に
関するものである。

次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌学的性質
を詳述する。

（ａ）形態 ｌ）ｍ胞の形および大きさ： 球菌、直径０．８〜１．２ル ２）集団：不規則連鎖及び房状は認められない３〕Ｍ動
性：　なし ４）胞子：　形成しない ５）グラム染色性；　陽性 ６）抗酸性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 ｌ〕肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。

うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落を生ずる。う
す緑色の光沢を有す。

３）肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿を生じない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する５）リドマスミ
ルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しない。リドマス
の還元はない。

（Ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）Ｍ’Ｒテスト：　＠性 ４）ＶＰテスト：　陰性 ５）インド−ルの生成：　陰性 ６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）：　陰性７）テンプ
ツの加水分解：　陰性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅ　ｒの培地：　わずかに利用にするＣｈｒ’１
ｓｔｅｎｓｅｎ　（７）培地：　利用する８）無機窒素
源の利用 硝酸ＩＭ：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素１１）ウレア
ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地：　陰性 ＳＳＲ培地：　四隅性 １２）オキシダーゼ：　陰性 １３）カタラーゼ：　陽性 １４）生汀の範囲： １４〜４２℃（最適２８〜３５℃） ｐＨ５，０〜９．５（最適８．５〜８．０）１５）酸素
に対する態度：　好気性 １Ｂ）ＯＦテスト：　陰性 １７〕糖類からの酸、カスの生成　： Ｌ−アラビノース　：　− Ｄ−キシロース　：　− Ｄ−クルコース　：　− Ｄ−マンノース　：　− Ｄ−フラクトース　二　− Ｄ−ガラク］・−ス　− 麦芽糖　・　− シｗｍ　・　− 乳糖　・　− トレハロース　・　− Ｄ−ソルビット　・　− Ｄ−マンニット　二　− イノシ・ント　二　− グリセリン　、− テンプツ　・　− １Ｂ）５％塩化ナトリウム耐性：　生汗する１８Ｊ採東
地：沖縄県石垣島平久保町の土壌から分離 以」二の菌学的性質を有する菌についてパージエイのマ
ニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄ
ｅ−認め、ミクロコツカス＄エスピー〇ＫＳＭ−８−８
Ｅ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ−８−８
）と命名した。なお、本菌株は、倣工研菌寄第７００３
号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。

分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパラフィン
含有培地を用い常法で行なった。

本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用する菌株が
良好に生胃し、アルキル（又はアルケニル）ハライドか
らのω−ハロカルポジ酸の生産を順調に行なわしめるた
め４と適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、無機
塩などからなる。炭素源としては、炭水化物（例えば、
グルコース、フラクトース、シュクロース、ソルビトー
ル等）、有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸等　）、
炭化水素（例えば、ｎ−ドデカン、ｎ−へキサテカン等
〕、アルキル（又はアルケニル）ハライドなど資化され
るものならばいずれも使用できる。また、窒素源あるい
は有機栄養源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸
カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩類、酵母エキス
、肉エキス、ペプトンが挙げ養要求を必要とする変異株
を用いる場合には、その栄養要求を満たす物質を培地に
添加しなければならない。

培養は培地を加熱等により殺゛菌後、菌を接種し、２８
〜３５°Ｃで３〜５日振盪又は通気撹拌すれば良い。ｐ
Ｈは６．５〜８程度に調整すると良い結果が得られる。

水に難溶性の炭素源等を使用する場合には、ポリオキシ
エチレンンルビタン等の各種界面活性剤を培地に添加す
ることも可能である。

値上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源として用
いることもできるが、菌体を培養液より分子ｌｌＶする
場合は、通常の固液分離手段か用いられる。このように
分離された生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体等）も
酵素源としてもちいることができる。

アルキル（又はアルケニル）ハライドを反応基質として
本菌株を上記の如く培養するとω−ハロカルホン酸が生
産される。これらの培養液養液そのものを酸性とし、エ
チルエーテル、酢酸エチル又はクロロホルム−メタノー
ル混液等の有機溶媒で抽出する。この抽出物をカラムク
ロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法を用いてω
−ハロカルホン酸を単離することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 採取した土壌及び土壌付着の落葉藩校の小スパーチル１
杯分（約０．５ｇ）を１０ｍ文滅菌水に懸濁し、充分撹
拌した後放置する。かくして＃’４られる土壌懸濁液上
清の１００倍希釈液０．１ｍｌを下記組成のｎ−ヘキサ
デカン含有の分離用寒天培地（Ｉ）に直接移し、３０℃
にて５１コ間ｊＦｉ養する。

分離用寒天培地（Ｉ）　組成 ＮＨ４ＮＯ３２５ｇ ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ Ｍｇ　ＳＯ４・　７Ｈ２０５ｇ ＫＣｌ　５ｇ 酵母エキス　１ｇ 寒天　２０　ｇ ポリオキシエチレンー ソルヒクンモノラウリン耐エステル （平均ＥＯ数２０モル）　５０ｍｇ 水道水　ｌ　文 上記分離用寒天培地〔１〕の調製法は、寒天とそれ以外
の培地成分を別滅菌し、６０℃付近に冷却後両者を混合
し、ダイナミックシェーカーで充分攪拌、乳化させた後
、滅菌シャーレに分注するものである。

上記培養により発生するコロニーの一白金耳を滅菌水で
１００倍希釈し、この希釈液０．１ｍ文を下達の分離用
寒天培地（Ｉｔ）に移し、３０’Ｃ！にて３日間培養し
、生じた複数のコロニーが相互間に相異しないことを肉
眼的及び顕微鏡的に確認する。なお、分離用寒天培地（
Ｉｆ）は、分離用寒天培地（Ｉ）の組成よりｎ−ヘキサ
デカンとポリオキシエチレンソルビクンモ７ラウリン酪
エステルを除いた寒天培地の底にｎ−ヘキサテンれ分離
用寒天培地（Ｉ）と同組成の斜面寒天培地に接種し、３
０℃で３日間培養し、１０木の斜面借地上の菌株が肉眼
的及び顕微鏡的に同一菌株であることを確認し、また、
これら１０菌株の各梠地上の性状及び生理学的性質が同
一であることを確認した。上記菌株の各培地上の斗状及
び生理学的性質は前述した通りである。

上記試験の結果、各１０本の培養菌はすべて自然界より
純粋に分離された単一菌株であることが判る。

次いで、上記で純粋培養された斜面培地」二の菌株より
一白金耳を滅菌した１０％グリセリン水溶１夜（２ｍｆ
Ｌ）の入った凍結保存用バイアルに懸濁し、−８０℃に
て凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存後、迅速に解
凍し得られる懸渇液の一白金耳を普通寒天培地に蘇生後
前記と同条件下に各培地上での性状及び生理学的性質を
調べた結果、凍結前とは変化が認められなかった９ また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰次いで、本
菌株を利用してω−ハロカルボン酸を製造した例を参考
例として挙げる。

参考例１ セチルクロライド５０ｇ、リン酸ニアンモニウム　ＩＯ
ｇ、リン酸−カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩
）０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）０．０２ｇ、硫酸亜
鉛（７水塩）　０．０１８ｇ、硫酸マンガン（４〜６水
塩）　ｏ、ｏｌｅ　ｇ、酵母エキス２ｇを水道水１Ｍに
溶かしｐＨを７．０に調製した。この液体培地５　ｍｌ
を５０ｍ１容振盪試験管に仕込み、１２０°Ｃで１５分
間蒸気減菌した後、ミクロコツカス・エスピー＊　ＫＳ
Ｍ−Ｂ−８（Ｍｉｃｒｏｃｏ−ｃｃｕｓ　ｓｐ、ＫｓＭ
−Ｂ−８）−を−白金耳接種し、３０℃で９６時間振盪
培養した。

培養終了後、この培養液に９Ｎ硫酸１ｍｌを加えｐＨを
強酸性として、クロロホルム−メタノール（２：　ｌ）
武液２０ＩＩｌｌで抽出した。この抽出液を減圧下濃縮
した後メタノールーＢＦ３月虫＆Ｍでメチル化し、ガス
クロマトグラフィーにルエステル（測定にあたってエス
テル化したもの）のマスパターンを示した。

第１表 １事件の表示 昭和５８年特許願第５３８４７号 ２）Ａ明の名称 新規微生物 ３補正をする者 ｌＪＳ件との関係　特許出願人 力で 東京都千代田区霞亭関−丁目３−１ 明細書および図面 ６補正の内容 別紙のとおり 明細書１８頁の第１表の後に次のとおり挿入する。

［４、図面の簡単な説明

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の性質を有する微工研菌寄第７００３号として
   寄託された新規なミクロコツカス・エスピー・ＫＳＭ−
   ８−８株。 （ａ）形態 １）、細胞の形および大きさ： 球菌、直径０．８〜１．２　弘 ２）集団：不規則連鎖及び房状は認められない３）運動
   性：　なし ４）胞子、　形成しない ５）ダラム染色性　陽性 ６）抗酸性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。 うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな１′。 落を生ずる。うす緑色の光沢を有す。 ３〕肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿を生しない。 ４）肉汁セラチン穿刺培＠】 ３Ｉ：ｌ培養で菌生育し、−Ｌ部のみ滴化する５）す！
   ・マスミルク： わずかにアルカリ性を示しペプＩ・ン化しない。リドマ
   スの還元はない。 （ｃ）生理学的性質 １）硝酩塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）Ｍ　ＲテスＩ・：　陰性 ４）Ｖ　Ｐテスト：　陰性 ５）インドールの生成二　陰性 ６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）：　陰性７）テンブ
   ンの加水分解：　随性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅ　ｒの培地：　わずかに利用するＣｈｒｉｓｔ
   ａｎｓｅｎの培地：　利用する９）無機窒素源の利用 硝酸塩：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素＋１）ウレア
   ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地：　陰性 ＳＳＲ培地二　四隅性 １２）オキシダーゼ：　陰性 ｔ３）カタラーゼ；　陽性 １４）生育の範囲： １４〜４２℃（最適２８〜３５℃） ｐＨ５，０〜９．５（最適６．５〜８．０）１５〕酸素
   に対する態度：　好気性 ＋８）ＯＦテスト；　陰性 １７）糖類からの酢、カスの生成　： Ｌ−アラヒノース　：　− Ｄ−キシロース　二　− Ｄ−グルコース　：　− Ｄ−マンノース　：　− Ｄ−フラクトース　二　− り一カラクトース　二　− 麦芽糖　・　− ショ糖　・　− 乳糖　・　− トレハロース　・　− Ｄ−ンルビッｉ・　・　− Ｄ−マンニット　゛　− イノシラ！・　・　− クリセリン　− デンプン　・　− １８）５％塩化ナトリウム１′＠４性；　生育する