JPS61226059A - 抗デオキシリボ核酸抗体用吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略記する）を
高分子担体に安定した状態で固定して成る抗Ｄ　Ｎ　Ａ
抗体用吸着材に関するものである。さらに詳しくいえば
、本発明は、滅菌か゛容易で、かつ選択性が優れる上に
吸着能力が大きく、しかも取扱いか容易であって、全身
性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の要因物質であ
る抗１’）　Ｎ　ノル抗体やＤ　Ｎ　Ａ−抗Ｄ　Ｎ　Ａ
抗１本免疫複合体を、該疾患患者の＋ｆｎ漿中から除去
するのに好適に用いられる安定性に優れた吸着材に関す
るものである。

従来の技術 近年、医工学技術の著しい発展に件５・、全身性エリテ
マトーデス、慢性関節リウマチ、強皮症などの自己免疫
疾患の治療には、患者の血液中からこれらの疾患の要因
物質を除去する血液浄化療法か確立されつつある。この
血液浄化療法としては、これまで血漿交換法、ろ過法、
吸着法などが試みられているか、いずれの方法もなんら
かの欠点かあり必ずしも満足しうるちのとはいえなり・
。

例えば、血漿交換法は、患者の血漿を新鮮な凍結血漿又
は血漿製剤で置き換える方法であるか、置換液の大量撞
゛保か困ｔ＃であり、かつ血性肝炎などの感染の危険性
があるなど、重要な問題を有している。またろ過法とし
ては、で２種のフィルターにより特定の分子量を有する
もののみを分画除去する二重ろ渦状などが試みられてい
るか、十分な分画能を有するフィルターは見出されてお
らず、しかもこの方法は分子サイズによる分画であるた
め、有用物質ら同時に除去されるので、血漿補充液を必
要とするなどのｊｉｊＪ題があって、まだ実用化に至っ
ていない。−・方吸着法については、吸着材として活性
炭、スチレン−ノビニルベンゼン共重合体、陰イオン交
換樹脂などを用いた！（工肝臓や吸着聖人−］［腎臓か
すでに実用化されている。しがしなから、これらの吸着
材は、抗Ｄ　Ｎ　Ａ抗体などの比較的高分子窄成分を選
択的に吸着除去する能力を有していない。

これらの方法の中で、血液中の疾患要因物質を除去する
には、吸着法が種々の点で右利であり、そのため、特定
の疾患要因物質のみを吸着除去しうる吸着＋４の開発か
望まれている。

ところで、生化学分野においては、抗原−抗体、酵素−
基質、酵素−１！１１害剤、ホルモン−レセプターなど
、それぞれの物質量だけに存在する特ｐＪ的な川原作用
を利用して、特定タンパク質成分を分離ネ！’ｉ　製’
１−る手法、すなわもアフィニティクロマトグラフィー
か広く用いられている１、このアフィニティクロマトグ
ラフィーに用いる吸着イ・（は、目的物質と親和・ｌ’
ｌを有する物質を担体に固定、ト溶化した乙ので゛ある
。

このようなアフィニティクロマトグラフィーの原理を応
用し、血液中の抗１’）　Ｎ　Ａ抗体などの免疫物質を
除去するのに、該免疫物質と特異的に免疫反応する物質
を利用する研究か積極的に行われている。例えば、全身
性エリテマト−デ゛又に関しては、吸着１象物質として
、抗Ｄ　ＮＡ抗困やＩ−）　Ｎ　Ａ　−抗り１寸、Ｘ抗
体免疫複合１４（が考えられ、これらに対する吸着利と
して、（１）メチル化アルブミンを多糖類ゲル粒子に固
定したもの（特開昭５５−１２０８７５号公報）、（２
）セルロースに１吸着させた１）ＮＡを寒天ゲルで包括
したらの〔［クリニカル・アンド・イクスペリメンタル
・イミュノロノー（ＣＩｉｎ。

ｈｌ〕、　ｌ＋ｎｍｕｎｏ１．）ｌ第２．・１巻、第２
３１−２３７ペーン（１９７６イ１′）〕、（３）活性
炭に吸着させたＤ　Ｎ　Ａをフロンオンで包括したもの
〔［クリニカル・イミュノロジー・アンド・イミュノパ
ソロンー（ＣＩｉｎ。

１１１１１１１１１１１Ｏ１，１ｍｍｕｎｏｐａｌｈｏ
１．）ｌ第８巻、　第９　（’ｌ　−９６ページ（１９
７７年）〕、（，１）　Ｉ’）　Ｎ　Ａと二価金属イオ
ンとの複合１本〔「ジャーナル・オフパ・イミュノロジ
カル・メソッズ（，１，ｒｖｎｕｎｏｌ、　ｌイｅ　ｔ
：　ｌ＋　ｏ　ｄ　ｓ月第′イ（）巻１第８９−９．１
ページ（１９８１年）〕、（５）ＤＮＡを高分子コラー
ゲン膜にアシルアットで共有結合したもの〔［バイオテ
クノロジ゛−・アンド・バイオエンジニアリング（ｌｉ
ｉｏｔ、ｅｃｌ＋ｎｏ１．　Ｂｉｏｅｎｇ、　）Ｉ第２
６巻、第６６５〜６６９ページ（］９９８４年〕などが
ｔｒｉ案されている。

このような生体高分子を固定化した吸着材においては、
滅菌時、あるいは保存中や使用中における安定性に優れ
ていることが必要であり、特に使用時において固定化し
たＤ　Ｎ　Ａやたんばく質が゛１１１１液中に溶出する
と重大な副作用が生じるＩ３それがある。したがって、
生体高分子を吸着材に利用する場合は、できるだけ強固
に固定化する必要がある。

しかしなから、前記の吸着材においては、固定化物の安
定性に−〕いて必ずしも満足しうるちのではなく、また
いずれも滅菌の手段か゛不明であって、実用上の問題か
ある。

発明か解決しようとする問題点 本発明の目的は、このようなイ（情のもとで、１゛Ｉ走
菌が容易で、か−゛）選択性か優れる十に吸着能力が大
きく、しかも取扱いが容易であって、全身性エリテマト
ーデスなどの自己免疫疾患の要因物質である抗１）Ｎ　
Ａ抗体やｌ）　Ｎ　Ａ−抗ｒ）　Ｎ　Ａ抗体免疫複合体
を、該疾患患者の血漿中から除去するのに好適に用いら
れる安定性に優れた吸着４（４を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、エポキシ基と結合
しうる官能基を有する高分子化合物を担体として用い、
これにエポキシ基を導入し、該エポキシ基を介してＤ　
Ｎ　Ａを化学結合させたらのかｒｉｉｊ記１」的に適合
しうろことを見出し１、二の知見に基づいて本発明を完
成するに至った。

すなわち、本発明は、エポキシ基を導入した高分子化合
物に、該エポキシ基を介してｌ’、）　Ｎ　Ａを化学結
合させて成る抗１’）　Ｎ　Ａ抗体用吸着材を提０（す
るものである。

これまで゛、エポキシ基を介してｌ）　Ｎ　Ａを担体に
固定化する方法は、たんばく質などの精製のために、ア
フィニテイクロマ）・グラフィー用吸着剤に用いられた
例はあるか、血漿浄化用吸着剤に適用された例はない。

本発明においては、担体としこエポキシ基を導入しうる
ような官能基、例えば水酸基やチオール基を有する高分
子化合物が用いられるか、非特異的な吸着能をもたない
非イオン性物質か望よい）。

このようなものとしては、例えばアガロース系、デ゛キ
ス１ラン系、セルロース系、ポリビニルアルコール系な
どの水酸基含有高分子化合物か好適である３、また、担
体の形状については、表面積が大きいものであれば特に
制限はなく、例えばビーズ状、繊維状、中空糸状などの
形状を有するものか用いられる。

前記高分子化合物にエポキシ基を導入する方法としでは
、アルカリ性条件下でエピクロロヒドリンや、１，１１
−ビア、（２＋：（−エポキシプロポキン）７タンのよ
うなビスオキシラン化合物などを作用させる公知の方法
の中から汀意のＪｊ法を用いる、二とかて゛ぎ　る。

次に、エポキシ７Ｊζが導入された高分子化合物に、該
エポキシ丸！−を介してＤ　Ｎ　Ａを化合結合させるた
めには、例えばｐｆｌ　！］−１３、好ましくはＨ）、
５〜１２のアルカリ性水溶液中におい′乙該エポキシ基
導入高分子化合物と所望のｒ）　Ｎ　Ａとを、３（）・
−８０°Ｃ１好士しくは１．　ｆｌ　−Ｇ　ｆｉ　’Ｃ
の２６１度に保ちなから所要時間反応させれば」：い。

温度か代すぎると反応速度か遅く、か−）加熱した際の
固定化１）Ｎ　Ａの１−分な安定４１′１か゛イ：１ら
れず、−ノｊ高すぎると１”’）　Ｎ　Ａの固定化１ｊ
）、が減少する。また反応時間は’（Ａ＋’＋度に１っ
て左右されるか、通常５　＝　４．　（’１時間程度で
・よい１、さらに、高分子化合物に月するｌ’）　Ｎ　
Ａの（旧よ１、該高分子化合物に導入されたエポキシＪ
１（の１武によって適宜選ばれ、またその濃度は高い方
か固定化１ｊ）か多くなる。

このようにしてＤ　Ｎ　Ａか固定化された高分子化合物
をろ刷上　１−分に洗浄することにより、本発明の１吸
着祠が得られる。

発明の効果 本発明の吸着イ・利よ、従来のものと異なりＤ　ＮＡか
エポキシ基を発して担体の高分子化合物に（板めて安定
に結合しており、例えばＤ　Ｎ　Ａの脱落は・１°Ｃの
温度で７０　Ｂ　ｌ用保存した場合は・・１％以下、８
０°Ｃで１時間熱処理した場合は２％以下であるように
僅かであり、また抗Ｄ　Ｎ　Ａ抗体に月する吸着活性も
保存や熱処理によって損われなり）など、優れた特徴を
有している。

さらに、エポキシ基は安定なエーテル結合やチオエーテ
ル結合を介して担体に導入されてし）るので、該エポキ
シ基の脱落のおそれはなく、その上エポキシ基の導入の
際に担体の架橋が同時に起こるので、該担体は強固とな
り、加熱などに対して安定性に優れたものとなる。した
がって、滅菌方法としては、簡便な加熱方法を適用する
ことかできる。

このように本発明の吸着材は安定性に没れ、かつその製
造や滅菌が容易である−１−に、選択性能や吸着性能に
ついては従来のものと比較し一ζ遜色かなく、例えば全
身性エリテマトーデスなとの自己免疫疾患の血液浄化療
法として、その要因物質である抗１）　Ｎ　Ａ抗体やＤ
　Ｎ　Ａ−抗Ｉ）Ｎ　Ａ抗体免疫複合本を該疾患思考の
血漿中から除去するのに好適に用いられる。。

実権例 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ セファローズ、′口Ｉ　（ファルマシア利製）をエビク
ロロヒドリン処理して得られた、水分９５．６重（ｉ（
％、エポキシ基導入喰８　り　ｌＯｍｏ　ｌ　／　ｇ乾
燥ビーズのビーズ５ｇと、サケ楯液山米のＤ　Ｎ　Ａ　
［和光純薬玉業（株）製〕を０．５Ｍ炭酸ナトリウム−
水酸化すｌ・リウム（モル比’７　：　、Ｅ　）水溶液
に溶かした、ｌ）Ｎ　Ａｉ農度４．７重量％、ｐＨ１０
，７の溶液１　ｆ−１ｒＩρとをｉｉＲイγし１．１　
ｉｌ　’Ｃで２．１時間振とうした。次いで、ピースを
０．１ぺ抽１酸ｌＪ＆ｔ！ＩＩｊ液（ｐｌ＋４．０）及
び０　、２　Ｍ炭酸紙ｊΦｊ液（＋＋Ｉ１９．０）で゛
繰り返し洗浄後、０．１八４ホウ酸緩イ千Ｊ液（ｐＨ７
，３）、１Ｍ塩化す１す・クム溶液及び蒸留水で洗浄し
て、Ｄ　Ｎ　Ａを固定化したビーズ状吸着材を１１１だ
。

このもののＤＮＡの含有量を、モリブデンブルー法によ
るリンの測定より求めたところＩｌ’ｉ、燥吸着４４１
　ｇ当り２３Ｉｌ！ｇであった。

次に、このようにして得られた吸着ヰＪ’１．５ｇ（乾
燥重量８７目）に０．０１Ｍホウ酸緩衝液−生理食塩水
（ｐＨ７，５：ｌ　１Ｆ）ｍｐを加え、８　（１’Ｃで
１時間振とうした。処理後、溶液の２　Ｏｆ’ｌ　ｎＲ
における吸光度測定及び吸着材中のリンの測定により、
Ｄ　Ｎ　Ａの脱落率を求めたところ、１．８％であった
。なお、吸着Ｈの形状は熱処理後も変化が認められなか
った。

実施例２ 実施例１と同様にして作成した、Ｄ　Ｎ　Ａ鯖介量間保
存後、１Ｍ塩化ナトリウム溶液及び蒸留水で洗浄した。

このもののＤ　Ｎ　Ａ含有量は乾燥吸着材１ｇ当りＩ　
、’＋　ｆｌ　ｔｈｇて゛あった。

実施例３ トヨパールＩＮＶ　　（ｉ　５　〔東洋曹達１゜業（株
）製〕を１．４−ビス（２，：（−エポキシプロポキシ
）フタンで処理して１：１られた、水分８９．６’ｉ’
ｊｉ％、エボキシノ、（導入１往０．１９ｖｎｏ　ｌ　
／　ｙ乾１．％ｉ、ピース゛のビーズ５ｙと、「）Ｎノ
ル濃度５．１重ｈ１９６．１＋１ＩＩｌ、）！の→Ｊケ
ｌＩＩ□液１１１来の１’、）　Ｎ　Ａ溶液１０岬とを
；１５合し、実施例１と同様に処理して、Ｄ　Ｎ　Ａを
固定化したビーズ状吸着月を得た。このもののＤ　Ｎ　
Ａ含有１廿は轄１へＩ・Ｉ汲オ’ｆ４・４１　ｇ当り５
〃９で゛あった。

実施例３・１ エピクロロヒドリンで゛処理した、エポキシ基導入計０
．０６ｍロ＋ｏｌ／ｇ乾燥ガーゼのガーゼ１．２９に、
ｒｌＮＡ濃度５．２重け％、１＋ＩＩ］１．２のサケ精
液由来のＤ　Ｎ　Ａ溶液２０ｍ０を加え、実施例１と同
様に処理して、Ｄ　Ｎ　Ａを固定化した吸着材をイ）ま
た。このムののＤ　Ｎ　Ａ含有量は、乾１・ｖ・吸着材
１ｇ当り３躍９であった。

実施例５ エビクロロヒドリンで処理した、エポキシ基導入量０．
０７＋０＋ｎｏｌ／　ｇ乾燥繊維の細繊化ポリビニルア
ルコール繊維１．０ｇに、Ｄ　Ｎ　Ａ濃度５．１重量％
、１〕１１１１．３のサケ精液製Ｄ　Ｎ　Ａ溶液２０７
１ρを加え、実施例１と同様に処理して、ＤＮＡを固定
化した吸着４・Ａを得た。このもののＤ　Ｎ　Ａ含有量
は、乾燥吸着材１ｇ当りＳＩｎｇで゛あった。

実施例６ 担体としてセファローズ、４．８を用い、実施例１と同
様に処理して得られた水分含量９２．７重量％のビーズ
状吸着材５（Ｊｉ９（ＤＮＡ含有量０．７ｈｙ）を、０
．０ｇＭリン酸緩衝液−十理食塩水（ｐＨ７，３、以下
ＰＢＳと略記する）で洗浄後、このものと、全身＋Ｌエ
リテマトーデス患者の血清２５０μｐとを混合し、１時
間振とうした。

処理前後の血清をＰＢＳで倍々に希釈した系列を作り、
抗ネイティブＤＮＡｈ＋ＤＮＡ）抗体を、抗ｎ　Ｄ　Ｎ
　Ａ抗体テストキット（カレスタツド社製）を用いてけ
い光抗体法で測定し、陰性になる希釈倍率を求めた。そ
の結果を次表に示す。

参考例 担体としてセファローズ４Ｂを用い、実施例１と同様に
処理して得られた水分含量９４．１重量％のビーズ状吸
着材５０　ｆ’ｌ　ｍｇ（１’）　Ｎ　Ａ含有量４．５
６〜）をＰＢＳで洗浄後、このものと、牛血清アルブミ
ン及びγ−グロブリンそれぞれ１（）ηｇをＦ’　Ｂ　
Ｓ　］　（’１ｙｔｒｌに溶かした液とを混合上　２５
°Ｃで１時間振とうしたのも、［Ｊ　ｖ吸収により牛血
清アルブミン及びγ−グロブリンの吸着をそれぞれ調べ
たが、いすれの場合ら吸着は認められなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　エポキシ基を導入した高分子化合物に、該エポキシ
   基を介してデオキシリボ核酸を化学結合させて成る抗デ
   オキシリボ核酸抗体用吸着材。 ２　高分子化合物が水酸基を含有するものである特許請
   求の範囲第１項記載の吸着材。 ３　水酸基を含有する高分子化合物がアガロース系、デ
   キストラン系、セルロース系又はポリビニルアルコール
   系化合物である特許請求の範囲第２項記載の吸着材。