JPS61287902A - 新規分岐β―サイクロデキストリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一上の１１　　　野 本発明は、新規な分岐β−サイクロデキストリンおよび
その製造方法に関し、更に詳細には、ジマルトシル−β
−サイクロデキストリンおよびその製造方法に関する。

従迷！口支歪− サイクロデキストリンはグルコース残基がβ−１，４−
結合により環状に結合したオリゴ糖であって、グルコー
ス残基６個からなるα−サイクロデキストリン、７個か
らなるβ−サイクロデキストリン、８個からなるγ−サ
イクロデキストリンなどが一般に知られている。

サイクロデキストリンは、その構造から内部に空隙があ
り、この空隙内部は親油性領域となっているので各種の
油性物質を取り込むことができる。

そのため、このような性質を利用しての不安定物質の安
定化■揮発性物質の保持■異臭のマスキング■難・不溶
性物質の可溶化など、種々の用途が考えられているが、
これらサイクロデキストリンは一般的に高価であり、こ
のことがサイクロデキストリンの利用拡大を妨げている
大きな要因ともなっている。もっとも、これらの中でも
β−サイクロデキストリンは、他のサイクロデキストリ
ンに比べれば比較的安価であり、かつ、また、包接作用
も最も強力なことから、利用面において有望視されてい
るものである。

しかしながら、かかるβ−サイクロデキストリンには、
低温域（室温以下）での水に対する溶解度が極めて低い
（１，５５％、２０℃）という欠、αがあり、この点に
おける改良が待たれていた。

明が　　しようと　る、　ヴ 既に、α−サイクロデキストリンにつ゛いてはグルコー
ス残基の０６の位置にグルコースあるいはマルトースが
α−１，６−結合により結合した分岐サイクロデキスト
リンが知られており、このものは分岐のないものに比べ
て水への溶解度が高いことが知られている。

本発明者らは、かかる点に着目し、β−サイクロデキス
トリンに分枝を導入できればその溶解性を改善できるの
ではないかとの着想のもとに種々検討した結果、プルラ
ナーゼの縮合反応を利用すればβ−サイクロデキストリ
ンとマルトースとを結合させることができるとの着想を
得、更に検討の結果、本発明に到達したものである。

貞を　　するための゛ 本発明は、マルトースとβ−サイクロデキストリンを含
む混合物にプルラナーゼを作用させてジマルトシル−β
−サイクロデキストリンを生成させ、生成したジマルト
シル−β−サイクロデキストリンを反応液から分離採取
することからなる、ジマルトシル−β−サイクロデキス
トリンの製造方法およびかくして得られるジマルトシル
ーβ−サイクロデキストリン１こ関するものである。

本発明により得られるジマルトシル−β−サイクロデキ
ストリンは、下記の理化学的性質を有する新規化合物で
ある。

１）分子式　　Ｃ，６Ｈ，ｌ。０，５ ２）分子量　　１７８３ ３）融　点　　２７５．０°Ｃ（非結晶；分解）４）比
旋光度　［α］２．’＋１７４゜（Ｃ−０，１；Ｈ２Ｏ
） ５）ペーパークロマトグラフィー １−ブタノール：１−ラ°ロバノール：水＝３　：５　
：４の展開溶媒を使用してペーパー上に展開した後、ヨ
ウ素溶液を用いる発色およびグルコアミラーゼで前処理
した後硝酸銀を用いる発色により呈色させるとき、それ
ぞれ１スポットを示す。

６）薄層クロマトグラフィー １−ブタ／−ル：エタノール：水＝５：５：２の展開溶
媒を使用して、薄層板（ＤＣ−ＦｅｒｔｉＨｐｌａｔｔ
ｅｎ　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０（メルク社製））上に
展開した後、ヨウ素溶液を用いる発色およびリンモリブ
デン酸／硫酸を用いる発色により呈色させるとき、それ
ぞれ１スポットを示す。

７）高速液体クロマトグラフィー （条　件） カラムサイズ：６φ×５０＋ａｍ 担体：　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−Ｎ１３（ナーデル社製）
溶媒ニアセトニトリル：水＝６５：３５流速：　２．０
ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈析計ＥＲＣ７５２０型（エルマ光学株式
会社製） 本品は上記条件で１ピークを示す。

８）溶解性 水に易溶、エタノールに難溶。

９）性　状 粉末は白色であり、水溶液は無色。

１０）赤外線吸収スペクトル（第１図参照）シ＝３，４
００ｃｍ−１、２，９３０ｃｍ−１、１，１５０ｃｍ−
１、１．０３０ｃｍ−’に吸収を認める。

１１）１コＣ核磁気共鳴スペクトル（第２図参照）δ（
０２０） ６８．３　（１−６結合のＣ６） ７８．９　（マルトシル残基の１−４結合のＣ＜）１０
０．０　（１−６結合のＣ＋） １２）メチル化分析 箱守法にしたがいメチル化した後、メチル化物め加水分
解を行い、生成した加水分解物を還元、アセチル化して
アルディドール−アセテートに誘導、ガスクロマトグラ
フィーにより同定するとき、２，３，４．６−テトラ−
０−メチルグルコース、２，３．６−トリ−０−メチル
グルコース、２．３−ジ−〇−メチルグルフースのモル
比は、１．９ニア、０：１．８であった。

（ガスクロマトグラフィーの条件） 機器：日立にＣ１６３（日立製作新製）カラム：３％Ｅ
ＣＮ５Ｓ−Ｍ（３φ×　２．ＯＯＯｍａ＋）カラム温度
＝１８５℃ キャリヤーガス二Ｎ２ 流速：　５０ａＩｌ／ａ＋ｉｎ 検出器：　ＦＩＤ １３）構　成（酵素による分解生成物）プルラナーゼに
より分解され、マルトースとβ−サイクロデキストリン
を２：１（モル比）の比率で生成する。

なお、上記理化学的性質を有するジマルトシル−β−サ
イクロデキストリンは、β−サイクロデキストリンを構
成するグルコース残基に２個のマルトシル残基が、それ
ぞれ別々の位置にａ−１゜６−結合した構造から成るも
のであることが、メチル化分析およびプルラナーゼを用
いた酵素分解により示された。

本発明によれば、かかるジマルトシル−β−サイクロデ
キストリンは次のごとくして製造される。

即ち、マルトースとβ−サイクロデキストリンを含む基
質濃度４０〜８５％溶液にプルラナーゼを所定量加え、
液の温度、ｐＨなどを酵素の好適作用範囲に維持して、
１日〜６日間反応させ、ジマルトシル−β−サイクロデ
キストリンを生成し、次いで、所望によりクロマトグラ
フィーなどの方法によって反応液から分離採取すること
により製造される。

本発明において用いられるプルラナーゼは、粘質多糖類
プルランのｆｆ−１，６−グルコシド結合を加水分解す
るほか、アミロペクチンやグリコーゲンの６−１１６−
グルコシド結合をも切断する能力を持つ酵素であり、主
としてエアロバクター・エアロデネス（Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、パシラス・５ｐ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ）などの微生物より得られる。これ
らプルラナーゼの使用量は、基質の品質あるいは反応の
実施形式などにより多少の違いはあるが、通常の場合、
β−サイクロデキストリン１グラム当たり１０単位以上
用いられる。このプルラナーゼの酵素活性は次のごとき
方法により測定される。即ち、０．５％プルラン溶液（
プルランを５０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，０
に溶解したもの）２００μｍに酵素液５０μ！（同じ緩
衝液に溶解したもの）を加え、１０分間、５０℃で酵素
反応させる。反応後、反応液中に生成した還元糖をソモ
ギイーネルソン（ＳｏｍｏＨｙｉ　−Ｎｅ１ｓｏｎ）法
で測定する。酵素単位は、この条件で１分間に１μｍｏ
ｌｅのアル））リオースに相当する還元力を生成する酵
素量を１単位とする。

本発明において原料として用いられるマルトースおよび
β−サイクロデキストリンは、いずれも市販の製品をそ
のまま用いることができるが、生成物の分離精製の手数
を考えると純度の高いものを用いるのが有利である。こ
れらマルトースおよ１β−サイクロデキストリンの使用
量は、β−サイクロデキストリンに対して、通常、マル
トース１〜７倍量、好ましくは４〜５倍量用いられ°る
。

また、溶液の濃度は、本発明の方法がプルラナーゼの縮
合反応を利用するものである関係上、一般的に原料基質
の濃度が高いほど好ましく、したがって、本発明におけ
る基質濃度は６０〜８５％で使用することが好ましい。

本発明の方法においては、反応はプルラナーゼの作用条
件に適合させて実施される。したがって、反応温度、９
Ｈなどは用いられる酵素の種Ｍ（起源）によって差はあ
るが、一般に４０〜８０℃、ｐＨ４，０〜７．０で行な
うのが好ましい。

生成したジマルトシル−β−サイクロデキストリンを反
応液から分離するには、例えばトヨパールＨＷ−４Ｏ８
を用いたカラムクロマトグラフィーあるいはワットマン
１７クロムによるペーパークロマトグラフィーを用いる
ことにより容易に行うことができるが、工業的には特に
コスト上の理由からイオン交換樹脂クロマトグラフィー
、大量デルろ過分離性などを用いるのが有利である。

免１へ廟１ 本発明により得られる新規な分岐サイクロデキストリン
は、公知のβ−サイクロデキストリンと同程度の強い抱
接力を有し、かつ、その溶解性において格段に優れてい
るので、医薬品、食品、化粧品その他一般の化学工業分
野でのサイクロデキストリンの用途開発に寄与するとこ
ろが大きい。

及１九 次に実施例を示し、本発明を更に詳細かつ具体的に説明
する。

実施例１゜ マルトース（日本澱粉工業ＫＫＩ！！、純度９９％）２
．００．とβ−サイクロデキストリン（日本食品化工Ｋ
Ｋ！！、純度９８％）０．４０ｇに、ｐＨ５，０゜５０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液０．６３＋ａｌを加え沸騰浴
中加熱溶解する。冷却後、これにバシラス・ｓｐ　（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ）の耐熱性プルラナーゼ（ノボ・
インダストリー・ジャパン社製、２００単位／６）４０
０ａ＋ｇを加え、６０℃で７２時間反応させる。

終了後、この反応液をトヨパールＨＷ−４ＯＳを充填し
たカラム（４，５Ｘ１００ｃｍ：２本）によりゲルろ過
クロマトグラフィーにかけて分離精製を行う、試料負荷
後１３〜１４時間後に溶出されてくる７ラクシロンを集
め、ロータリーエバポレータで濃縮乾燥して、ジマルト
シル−β−サイクロデキストリンの白色粉末１３４ａａ
ｇを得る。

このものの元素分析値は次の通りであった。

元素分析値（ＣｓｓＨ＋−＋。０６．）計算値Ｃ＝４４
．４６％１（＝６．２２％０＝４９．３８％実測値Ｃ＝
４４．３５％Ｈ＝６．２４％また、このものは２７５℃
で分解した。

この得られた粉末について、ペーパークロマトグラフィ
ー（１−ブタノール：１−プロパノール：水＝　３　：
５　：４の展開溶媒を使用して、ヨウ素溶液を用いる発
色およびグルコアミラーゼでペーパーを一度処理した後
硝酸銀を用いる発色により呈色）および薄層クロマトグ
ラフィー（１−ブタノール：エタ７−ル：水＝　５　：
５　：２の展開溶媒を使用して１、ヨウ素溶液を用いる
発色およびリンモリブデン酸／硫酸を用いる発色により
呈色）を行ったところ、それぞれ１スポットを与え単一
物質であることが確認された。

また、上記で得られた粉末５１１ｇとエアロバクターー
エアロデネス（Ａ　ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ）のプルラナーゼ（ノボ・インゲスドリー・ジャ
パン社製、２００単位／６）１単位を９８５．０．５０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液５００μｍに溶解し、５０℃
で一夜反応させたところ、マルトースとβ−サイクロデ
キストリンを２：１の割合で生成することが薄層クロマ
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより
確認された。

更に、上記で得られた粉末３　、８　ｔｒＨをジメチル
スルホキシド２ｍｌに溶解し、メチルスルフィニルカル
バニオン０　、５　ｍｌを加えて、窒素気流中、室温で
４時間反応させ、次いで、この反応液にヨウ化メチル１
．５ｍｌを加えて２０℃以下で１時間反応させた。反応
終了後、クロロホルムで抽出、セファデックスＬＨ−２
０を用いで精製したものをメチル化試料とした。この試
料を硫酸０．１１６１に溶解して４℃で１時間反応させ
た後、更に、蒸留水０．８１を加えて１００℃で４時間
反応させた。

反応液を炭酸バリウムで中和し、遠心上清をダウエック
ス５０Ｗ（Ｈ”）で脱塩、これに水素化ホウ素ナトリウ
ムを加えて一晩放置後、再びダウエックス５０Ｗ（Ｈ”
）で脱塩し、メタノールと共に減圧下に濃縮した。引き
続き、これにピリジン０．１１および無水酢酸０．１　
ｍｌを加えて１００℃で２時間反応させ、この反応液を
水と共に減圧下に濃縮乾固した。このものを、クロロホ
ルムに溶解してガスクロマトグラフィーにより分析した
ところ、２．３，４．８−テトラ−０−メチルグルコー
ス、２，３．６−トリ−０−メチルグルコース、２．３
−ジ−〇−メチルグルコースを１．９ニア、０：１，８
（モル比）の比率で生成した。

以上の結果から、上記の物質はジマルトシル−β−サイ
クロデキストリンであることが確認された。

実施例２〜８ 実施例１と同様な操作手順により、但し基質濃度、酵素
量、反応温度、反応時間を種々に変えて反応を行ない、
次表の結果を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ジマルトシル−β−サイクロデキストリンの
赤外線吸収スペクトルを示し、第２図は、ジマルトシル
−β−サイクロデキストリンの１″Ｃ核磁気共鳴スペク
トルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するジマルトシル−β−
   サイクロデキストリン。 １）分子式　Ｃ＿６＿６Ｈ＿１＿１＿０Ｏ＿５＿５ ２）分子量　１７８３ ３）融点　２７５．０℃（非結晶；分解） ４）比旋光度　［α］＾２＾０＿Ｄ＋１７４°（Ｃ＝０
   ．１；Ｈ＿２Ｏ） ５）ペーパークロマトグラフィー １−ブタノール：１−プロパノール：水＝３：５：４の
   展開溶媒を使用してペーパー上に展開した後、ヨウ素溶
   液を用いる発色およびグルコアミラーゼで前処理した後
   硝酸銀を用いる発色により呈色させるとき、それぞれ１
   スポットを示す。 ６）薄層クロマトグラフィー １−ブタノール：エタノール：水＝５：５：２の展開溶
   媒を使用して、薄層板（ＤＣ−Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔ
   ｅｎ　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０（メルク社製））上に
   展開した後、ヨウ素溶液を用いる発色およびリンモリブ
   デン酸／硫酸を用いる発色により呈色させるとき、それ
   ぞれ１スポットを示す。 ７）高速液体クロマトグラフィー （条件） カラムサイズ：６φ×５０ｍｍ 担体：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−ＮＨ＿２（ナーゲル社製） 溶媒：アセトニトリル：水＝６５：３５ 流速：２．０ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈析計ＥＲＣ７５２０型（エルマ光学株式
   会社製） 本品は上記条件で１ピークを示す。 ８）溶解性 水に易溶、エタノールに難溶。 ９）性状 粉末は白色であり、水溶液は無色。 １０）赤外線吸収スペクトル（第１図参照）ν：３，４
   ００ｃｍ＾−＾１、２，９３０ｃｍ＾−＾１、１，１５
   ０ｃｍ＾−＾１、１，０３０ｃｍ＾−＾１に吸収を認め
   る。 １１）＾１＾３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（第２図参照） δ（Ｄ＿２Ｏ） ６８．３（１−６結合のＣ＿６） ７８．９（マルトシル残基の１−４結合のＣ＿４） １００．０（１−６結合のＣ＿１） １２）メチル化分析 箱守法にしたがいメチル化した後、メチル化物の加水分
   解を行い、生成した加水分解物を還元、アセチル化して
   アルディトール−アセテートに誘導しガスクロマトグラ
   フィーにより同定するとき、２，３，４，６−テトラ−
   ０−メチルグルコース、２，３，６−トリ−０−メチル
   グルコース、２，３−ジ−０−メチルグルコースのモル
   比は、１．９：７．０：１．８を示す。 １３）構成（酵素による分解生成物） プルラナーゼにより分解され、マルトースとβ−サイク
   ロデキストリンを２：１（モル比）の比率で生成する。 （２）マルトースとβ−サイクロデキストリンをプルラ
   ナーゼの存在下に反応させ、該反応液からジマルトシル
   −β−サイクロデキストリンを分離、採取することを特
   徴とするジマルトシル−β−サイクロデキストリンの製
   造方法。