JPS6192573A - Ｄｎａフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、カルデイオデイラチン様ペプチドをコードす
る塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントに関する。

カルデイオデイラチン（０ａｒｄｉｏｄｉｌａｔｉｎ　
）は。

分子量約７３００を示すペプチドであって、心房由来の
蛋白中の前駆体蛋白を母体とし、筋弛緩作用を有するこ
とが知られている。

〈従来の技術〉 ブタ由来のカルデイオデイラチンのＮ端側の３０個のア
ミノ酸配列は以下のとおシであることが知られている（
Ａｎａｔｏｍｙ　ａｎｄＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　アナト
ミーアンド　エムプリオロジー１６８、３０７−３／３
．／９ざ３　）　。Ａｅｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｖａｌ−８ｏｒ−Ａｅｎ−Ａｌａ−Ａ
ｅｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｅｐ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ａｅｐ そして、この前駆体蛋白自体についても蛋白レベルで検
討がなされているが、ＤＮＡレベルでは未だ解明されて
いなかった。

本発明者は、２１個のアミノ酸からなる心房由来ペプチ
ドであり、Ｎａ“利尿作用等を有するカルデイオナトリ
ン（Ｃａｒｄｉｏｎａｔｒｉｎ　）の前駆体蛋白をコー
ドするｃＤＮＡフラグメントを得る検討過程において、
カルデイオナトリンをコードするＩ）ＮＡ配列とともに
力へディオデイラチンをコードするＤＮＡ配列が同上ｃ
ＤＮＡフラグメント上に存在することを解明した（ｒ］
ａｔｕｒｅ。

３１０、２３　’８４）。

さらに、本発明者は、検討を加え、同上ＣＤＮＡ中に含
まれるカルデイオデイラチン様ペプチドをコードするＤ
ＮＡフラグメントを特定し本発明に到達した。

〈発明の構成〉 本発明の要旨は、カルデイオデイラチン様ペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ７ラグメントにある
。カルデイオデイラテン様ペプチドとは、カルデイオデ
イラチンと間杆な生理活性を有するカルデイオデイラチ
ンそのものおよびカルデイオデイラチン類縁体を意味す
る。カルデイオデイラチン様ペプチドをコードする塩基
配列の一例を下記式（■）に示す。

またカルデイオデイラチン様ペプチドをコードする塩基
配列を含有するＤＮＡフラグメントの一例として、上記
式（１）のカルデイオデイラチ／様ペプチドをコードす
る塩基配列のｊ′末端側に翻訳開始コドン、３′末端側
に翻訳停止コドンを付加した下記式（ＩＩ）で示される
ＤＮＡフラグメントが挙げられる。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明に係るカルデイオデイラテン様ペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡフラグメントの
調Ｈ方法の一例を示す。

ヒト心ｌｒＭ　ｔＦｆｒ片をグアジニルチオンアネート
とともにホモジナイズし、Ｏｓ　ｃｌ平衡密度勾配超遠
心によって全ＲＮＡを分離する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎチャ
ーグウインら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　バイオケミ
ストリー　１８、ｓλり弘−ｊ２り・り、ｌり７り）。

ついで、常法によりこれをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムクロマトグラフィで精製し、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ
を単離する（ｍＲＮＡ原料）。

このｍＲＮＡ原料より、岡山とＢｅｒｇパーグの方法（
ＭＯｌｌｏｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ　モレキュラー　アンド　セル乏−パイオロジ
−）２、１ｔｉ −１７０，／り１２）によって、ｃＤＮＡライブラリー
を得る。すなわち、ｐＢＲＪ２２と８ｖ参〇のハイブリ
ッドプラスミドを用いて、ベクタープライマーとオリゴ
（ａＧ）テールリンカ−を得る。このベクタープライマ
ーと上記ｍＲＮＡ共存下に逆転写酵素を作用させてｃＤ
ＮＡを合成し、その後制限酵素Ｆｌｉｎｄ　Ｉで消化し
、ついで上記リンカ−を用いて環化させる。その後、ｍ
ＲＮＡ部分をＤＮＡで置換して、ｃＤＮＡフラグメント
含有プラスミドを得る。

ついで、常法により、これを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等をアンピシリン耐性に形質
転換して、ｃＤＮＡライブラリーを得る。

ついで、カルデイオナトリン（５ｅｒ−Ｌθｕ−Ａｒｇ
のＭｅｔ −Ａｓｐ−Ａｒｇ−工１ｅ−ＧｌｙをコードするＤＮＡ
配列に相補性の下記ヌクレオチドをプローブとして合成
した。

このクローンを用いて、上述のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングし同プローブと）・イブリダイズするク
ローンを選択する。そのクローンより得られるｃＤＮＡ
フラグメントはマキサム−ギルバード法（（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　１１ＣｎＺ７ｍｎｌＯｇ７）メソツズ　イ
ン　エンザイモロジ−Ｊｊ、≠ブターｚｔｏ、ｉり、ｒ
Ｏ）によって塩基配列 を決定する。

上記ｃＤＮＡフラグメントは必ずしも一定のヌクレオチ
ド配列及びヌクレオチド残基数を有することを要求され
ず、ＤｌｊＡによってコードされる物質がカルデイオデ
イラチンと同様の生理活性を有するカルデイオデイラテ
ン様物質であれば、ヌクレオチド配列の一部が、置換も
しくは削除されあるいはヌクレオチドが付加されたヌク
レオチド配列であってもよい。

また、上記ｃＤＮＡフラグメントは、上記ヒト由来のも
のに限定されず、他の高等動物、たとえばウシ、ブタ、
ウマ、マウス、ラット等に由来するものであってもよい
。

このようにして得られるＤＮＡフラグメントに、メチオ
ニンリンカ−リポソーム結合部位を有するリンカ−ター
ミネションリンカーを付加して、目的とするカルデイオ
デイラチン様ペプチドを表現可能なりＮＡフラグメント
ヲ得ることができる。

上記式（ＩＩ）で示される本発明のＤＮＡフラグメント
は、ｊ′末端側に開始コドン、３′末端側に停止コドン
を有することを特徴とする。クローニング部位の上流に
プロモータ等の発現調節領域を有する発現ベクターのク
ローニング部位に本発明のＤＮＡフラグメントを導入す
ることにより、これを鋳型とする翻訳によりカルデイオ
デイラチン様ペプチドを産生させる場合、非融合蛋白が
得られるので有利である。

次に、このＤＮＡフラグメントを用いて、発現に好適な
プラスミドを構築する本発明の一部様について、さらに
図面により説明する。すなわち、プラスミドｐＨＡＮＦ
４８（Ｎａｔｕｒｅ　３１０，、２Ｊ、Ａブタ　’７４
り　　より得られるカルテイオデイラチンを含む３０／
ｂｐフラグメントと、メチオニンリン力−を結合させた
後、制限酵素Ｂｉｎｄ　Ｉで消化し、ｊ　３３　’ｂｐ
フラグメントを得る。これと図１に示すリポソーム結合
配列（ＲＢＥＩ）を持つリンカ−とを結合し、制限酵素
Ｂａ、ｍＨＩで消化し、図λに示す３　Ａ　ｊ　ｂｐフ
ラグメントを得る。これをプラスミドｐＵＣ！Ｊ’　（
Ｐ、ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより購入）の艷ユ旧部
位に導入し、太り菌を形質転換して、プラスミドｐＵＯ
ｃ（１ｇ（図３）を得る。ついでこのｐＵ　Ｃｃｄ　Ｉ
を制限酵素Ａｙａ　ｌで部分消化し、ターミネーション
（（Ｔｅｒｍ）ＴＧＡ　ＴＡＧ０ＴＡＴＯ）リンカ−を
挿入し、プラスミドｐＵｃｄｆｆ　ｔｅｒｍを得る（図
４）また、Ｔｕｇプロモータを有するプラスミドｐＤＲ
ｊ４’０　（Ｐ、Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより購
入）をＥｃｑＲＩ　、　Ｂａｎ旧で消化し、約３７０　
ｂｐフラグメントを、一方、上記プラスミドｐｌｏｄ　
Ｉ　ｔｅｒｍをＡｐａ　ｌ　、　ＢａｍＨＩで消化し、
ｘ　ａ　ｏ　’ｂｐフラグメントを得る。一方ｐＨＡＮ
Ｆ４’Ｊｒの勝旧、塑Ｉ消化後の大きい断片を得る。こ
の三者を連結し、大ｐＩ＆菌を形質転換して目的とする
グラスミドｐｈｃＤ　（図ｔ）を得る。

〈発明の効果〉 本発明に係るＤＮＡ７ラグメント及びそれを含むプラス
ミドは、カルデイオデイラチン様ペプチドの産生に有効
である。

得られたペプチドは血管拡張剤、血圧降下剤として有用
である。

〈実施例〉 以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明する。

実施例１ 〈原料ＤＮＡフラグメントの調製〉 （１）　　ヒト心臓断片を液体窒素で破砕した後グアニ
ジウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズした
。得られたホモジネートを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　デャー
グウインらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　バイオ
ケミストリー　１８，５２９４−５２９９、１９７９）
にしたがって、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心によっ
て全ＲＮＡを分離した。ついで、常法によりこれをオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーで精製
し、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡ原料とし
た。

（２）一方、岡山とＢｅｒｇパークの方法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｐ；ｙ
　モＶキエツーアンド　セルラー　バイオロジー　２、
／４１−／７０．／りＩｒコ）により、ｐＢＲＪ　Ｊ、
２とＢＶＩＡＯＦ）／Ｓイブリッドプラスミドを用いて
、ベクタープライマーとオリゴ（ｄＧ　）テールリンカ
−を得た。

すなわち、ｐＢＲＪＪＪと５Ｖ４（０（マツプユニット
０，７　／　−０，Ｉｒ　Ａ　）のハイブリッドプラス
ミド≠００μ？を、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中
で制限酵素Ｋｐｎ　ｌで３７℃、ダ時間消化させた。

ついで、常法によりエタノール沈殿によってＤＮＡを回
収し、これをｄＴＴＰを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを添加し
て、３７℃で３０分間反応させて、制限酵素Ｋｐｎ　ｌ
の消化部位に約１０個のｄＴデテール付加させた後、エ
タノール沈殿によりＤＮＡを回収した。ついで、このＤ
ＮＡをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素
Ｈｐａ　ｌにより消化した（３７℃、５時間）。大きい
方のＤＮＡ７ラグメントを、アガロースゲル電気泳動に
より精製し、ガラスパウダー法 （Ｖｏｇｅｌｅｔｅｉｎ　ポーゲルスティンら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

ボーゲルステイン　プロシーディングスオブナショナル
アカデミーオブ！イヱンうつ６１−一１−ニスエイ７６
、６１５−６１９、１９７９）によって回収した。その
後、このＤＮＡＱＯ℃でオリゴ（ｄＡ）セルロースカラ
ムに付し、水で溶出させた後、エタノールで回収し、オ
リゴ（ｄＴ）テールを有するベクターブライマーを得た
。

他方、ｐ　Ｂ　Ｒ，Ｊ　２２と５ｖ４ｃｏ（マツプユニ
ット０．／り〜０，３　Ｊ　）とのノ）イブリッドプラ
スミド１００μ２をウシ血清アルブミンを含む緩衝液中
で、制限酵素シｔｔ　ｌにより消化した（３７℃、１時
間半）。ついで、ＤＮＡを回収し、ｄＧＴＰを含む緩衝
液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼを添加して、３７℃で２０分間反応させ、
約１０〜／！のｄＧデテール付加させた。回収したＩ）
ＮＡを、ウシ血清アルプミンを含む緩衝液中で制限酵素
Ｈ１ｎ４　Ｍにより消化させ（３７℃、７時間）、つい
でアガロースゲル（／、ｔ％）電気泳動に付し、小さい
オリゴ（ｄＧ）テールリンカ−ＤＮＡを抽出。

回収した。

（３）岡山とＢｅｒｇのパークの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｃｒｖ　モ
レキュラーアンド　セル２−　バイオロジー　２、１６
１ー１７０、１４８２）により、ｃＤＮＡライブラリー
を得た。

すなわち、Ｔｒｉｓ−ＲＣ２（ｐＨ１，３）、Ｈｇ０ｌ
ｚ　。

ＫＣｌ、ジチオスレイトール、ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び（ｕｐ）ａｃＴＰを含む水溶液
に上記（１）で得られたｍＲＮＡ３０μｔと上記（２）
で得られたベクタープライマーｉ。

μｔを添加して、逆転写酵素の存在下に３７℃、２０分
間反応させ、プラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを合成し
、これをエタノール沈殿しペレット状で回収した。この
ペレットをＯＱ　Ｏ’ｌ、、ジチオスレイトール、ポリ
（Ａ）、〔ａｒｐ〕ｄＣＴ　Ｐ及びターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有する緩衝液に
溶解し、３７℃、ｉｏ分間反応させ、末端あたりｄＯＭ
ＰのｌＯ〜／ｊの残基全付加させた。

ついで、回収したオリゴ（ａＯ）テールプラスミド−ｃ
ＤＮＡ：ｍＲＮＡを含有するペレットをウシ血清アルブ
ミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｌで３
７℃、７時間消化し、エタノール沈殿により、Ｈｌｎｄ
　Ｉ消化オリゴ（ａｏ）チー／ｌ／（！ＤＮＡ：ｍＲＮ
Ａプラスミドを回収した。

これを前記（２）で得られたオリゴ（ａＧ）テールリン
カ−ＤＮＡを含む緩衝液に溶解し、ｔｊ℃、２分間イン
キュベートし、さらにグλ℃、３０分間保持し、０℃に
冷却した。

ついで、β−ＮＡＤにコチンアデニンジヌクレチド）存
在下、大腸菌（Ｅ、　Ｃ０１１）　ＤＮ　Ａリガーゼを
加えて、−夜インキユベートした。

その後、ｄＡＴＰ％ａ’ｒ’ｒｐ−、−ａｏ’ｒＰ。

ｄＣＴＰ、β−ＭＡＤ、Ｒ　Ｅ。Ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｋ、ｃｏｌｔＤＮＡポリメラーゼ及びＥ．ｃｏｌ
ｉＲＮａＦ３ｅ　Ｈを添加して、この混合物を１２℃、
１時間、次いで室温で７時間インキュベートした後、冷
却し、反応を停止させ目的とするｃＤＮＡフラグメント
含有プラスミドを得た。

ついで、このプラスミドを用いて常法によシ、大腸菌（
Ｆｉ、ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　／　０　／を形質転換した
。

（４）一方、カルデイオナトリンのＭ　ｅ　ｔ　−Ａ　
ｓ　ｐ　−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｉ　１　ｅ　−Ｇ　１　ｙを
コードするＤＮＡ配列に相補性のヌクレオチドを２つの
グループとして合成した。

ついで、このオリゴ■、■をプローブとしてｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングし、μｏ、ｏｏｏのトラン
スフォーマントより同プローブとハイブリダイズする７
２個のクローンを選択した。この７２個のクローンよシ
、ｃＤＮＡフラグメントを抽出し、制限酵素地図を作成
し、それに基いて、マキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｋｎｚ７ｍ０１０ｇ７メソツズ　イン　
エンザイ七ロジー　６２、≠ブター！ｒ６０．／りｒＯ
）によってフラグメントの塩基配列を決定した（ｐＨＡ
ＮＦ４’り。

（Ｎａｔｕｒｅ　３１０、２３、６９９　’８４）。

なおりルデイオデイラチンのＤＮＡ配列は、その分子ｆ
ｇ７．ｓ００から推定されるアミノ酸の数が７２〜７ｊ
でおり、かつ生体内でプロセッシングされやすいアルギ
ニンの位置から推定した。

上記ヒト由来のカルデイオデイラチ／は、上述のブタ由
来のカルデイオデイラチン（ＡｎａｔＯｍ７　ａｎｄ　
Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙアナトミ−　アンド　エンプリオ
ロノー　ｌ６ざ、３０７−３１３、ｌり１ｒＪ）と比較
し、Ｎ端（ｌ］１１３０個ノアミノ酸配列においては、
≠箇所相違する。

〈プラスミドｐｈ（！ｄの調製〉 （１）ｐＨＡＮＦ≠ｔをシ！■とシ郵Ｉで消化し、カル
デイオデイラチンを含む３０／ｂｐフラグメントを得る
。これをメチオニンリンカ−とＴ≠ＤＮＡリガーゼによ
り結合させ（Ｉｒ℃、／≠待時間、ついで制限酵素Ｈ１
ｎｄ　ｉで消化しく３７℃、２時間）、３３３ｂｐフラ
グメントを得る。このフラグメントと図／に示すリポソ
ーム結合配列を有するリンカ−とをＴ≠ＤＮＡリガーゼ
によシ連結しくｔｒ℃、ｉ≠待時間、さらに、制限酵素
独旧で消化し く３７℃、１時間）、図２に示す３６　ｊ　ｂｐフラグ
メントを得た。

一方、プラスミドｐＵ（！ｆを制限酵素ＢａｍＨＩで消
化しく３７℃、２時間）、上記３　Ａ　ｊ　ｂｐフラグ
メントをこのＢａｍＨ１部位に導入した。

ついで、大腸菌ＪＭ１０！を形質転換し、Ｘ　ｔｔｈｌ
上の白コロニーを選択し、プラスミドｐＵＯｃｄＪ’　
（図３）を得た。

上記プラスミドを制限酵素Ａｙａ　ｌで部分消化しく３
７℃、３０分）、停止コドンを含む上記したリンカ−（
ターミネーションリンカ−）をＴ≠ＤＮＡポリメラーゼ
存在下で連結させプラスミドｐＵｏ　ｃｄ　ｒ　ｔｅｒ
ｍを得た（図≠）。

さらに、Ｔａｃプロモータを有するフラスミドｐＤＲｊ
参〇を制限酵素り氏Ｆ１．！、μ史Ｈ１で消化しく３７
℃、２時間）、約３７０ｂｐフラグメントを得る（図ｊ
）。一方、上記プラスミドｐＵ　Ｃｃｄ　Ｉ　ｔｅｒｍ
をＡｐａ　ｌ　、　ＢａｍＨＩで消化しく３７℃、２時
間）、２＆Ｏｂｐフラグメントを得た（図ｊ）。

一方ｐＨＡＮ　Ｆ弘ｔを力迭■、シ些−Ｒ１で消化し、
アンピシリン耐性遺伝子を含有する大きいフラグメント
を得た（図り。

このようにして得た三つの７ラグメントをＴ弘ＤＮＡリ
ガーゼで連結した彼（ｆ℃、／弘時間）、得られたプラ
スミドで大腸菌ＪＭ１０よを形質転換し、形質転換株よ
りプラスミドｐｈＣＤ　（図６）を得た。

〈カルデイオデイラチン様ペプチドの産生〉プラスミド
ｐｈＯＤで形句転換した大腸菌、ＴＭｉｏｓを、Ｍター
ＯＡ培地にて培養したところ、その培養ｆ中に分子量約
７．！　００のカルテイオデイラチン様ペプチドの産生
が確認された。

【図面の簡単な説明】

図／、≠及びｊは、本発明におけるプラスミドの剰遣工
程例の概略図であり、図２は、図１における３　４　ｊ
　ｂｐフラグメントの制限酵素切断地図な示し、図３は
プラスミドｐＵ　Ｃｃｄ　Ｉの切断地図を示し、図ｔは
、プラスミドｐｈＯＤの切断地図を示し、図７は、図ｔ
のプラスミドにおけるカルデイオデイラチン様ペプチド
をコードするメ塙：ｊｊ−配列ケ有するＤＩＪＡ部分の
塩基配列を示す。 出　相　人　　三羨化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　長谷用　　　−にか／名 図２ ３ｂ５ｂｐ□ 巳３ ＆ｍＨＩ　ＢａｍＨＩ 図４ ↓　リカ゛−ぜ ｐｔ／Ｃρθｆｅｒｍ ＠　５ 図　ｂ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルデイオデイラチン様ペプチドをコードする塩
   基配列を含有するＤＮＡフラグメント。
2. （２）カルデイオデイラチン様ペプチドをコードする塩
   基配列が下記式（ I ）で表わされることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメント。 【塩基配列があります】（ I ） （上記式中でＸは【塩基配列があります】又は【塩基配
   列があります】を示す）（３）カルデイオデイラチン様
   ペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡフラグ
   メントが下記式（II）で表わされることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメント。 【塩基配列があります】（II） （上記式中でＸは【塩基配列があります】又は【塩基配
   列があります】を示す）