JPS6212226B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規物質ネプラノシンＤおよびその誘
導体の製法にかんする。さらに詳しくは新規物質
ネプラノシンＤ生産菌であるアンピユラリエラ・
エス・ピー・A11079（Ampullariella sp.
A11079）を培地に培養し、その培養物から新規
物質ネプラノシンＤを採取する新規物質ネプラノ
シンＤの製法ならびに該物質にかんするものであ
る。さらに本発明はネプラノシンＤより誘導され
る誘導体ならびそれらの製法をも抱合するもので
ある。 本発明の新規物質ネプラノシンＤは下記の物理
化学的性質を有する化合物である。 〓〓〓〓〓
(1) 元素分析：Ｃ＝49.70，Ｈ＝4.64，Ｎ＝21.20 (2) 分子量（マススペクトルよりの値）：264 (3) 分子式：C₁₁H₁₂N₄O₄ (4) 融点：236―237℃ (5) 旋光度：〔α〕^２３ _Ｄ＝−145゜（Ｃ＝0.6％，
H₂O） (6) 紫外線吸収スペクトル： λ_nax＝251mμ（Ｅ〓〓＝479）（水）（第１
図） λ_nax＝251mμ（Ｅ〓〓＝453）（酸性水） λ_nax＝256mμ（Ｅ〓〓＝508）（アルカリ
水） (7) 赤外線吸収スペクトル（KBr法）（第２図） 3420〜3120，2940〜2880，1680，1580，
1545，1510，1440，1390，1305，1210，1110，
1075，1040，1000，990，975，900，845，780
cm^-1の各波長に吸収帯を有する。 (8) 核磁気共嗚スペクトル 重ジメチルスルホキサイド中100MHzにおけ
るネプラノシンＤの核磁気共嗚スペクトルは第
３図に示す通りである。（内部基準DSS） (9) 溶解性 水、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホル
ムアミド、酢酸、ピリジンに可溶。 酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキ
サンに不溶。 (10) 呈色反応 過マンガン酸カリ脱色反応、過ヨーソ酸酸化
反応は陽性、 ニンヒドリン反応、フエーリング反応、塩化
第二鉄反応は陰性。 (11) 色性状：白色針状結晶 (12) Rf値：（東京化成社製シリカゲルｆを使
用） ｎ―ブタノール：酢酸：水（６：１：１） Rf＝0.27 ｎ―ブタノール：濃アンモニア水：水（10：
0.5：２）Rf＝0.07 ｎ―プロパノール：濃アンモニア水：水 （10：１：１）Rf＝0.18 アセトン：水（10：１）Rf＝0.33 これらの物理化学的性質より本物質ネプラノシ
ンＤの平面構造として次式が与えられた。 新規物質ネプラノシンＤの生物学的性質につい
て述べる。 急性毒性 ネプラノシンＤをマウス腹腔内に100mg／Kg投
与した結果死亡例はなく全例生存が認められた。 本発明の新規な物質ネプラノシンＤ産生放線菌
は、新潟県中頚城郡妙高高原町のネギ畑の士壌よ
り分離した放線菌で、アンピエラリエラ（Ampu
―llariella）属に属し、アンピエラリエラ・エ
ス・ピーA11079と称する（微生物受託番号微工
研菌寄第4494号、FERM―Ｐ No.4494）のもの
である。以下その菌学的諸性状について述べる。 〔〕 形態的性状 スターチ・無機酸寒天塔地上で、30℃、10〜15
日間培養し、観察した所見は次の通りである。 基生菌糸は曲線状で分枝をもつて伸長し、直径
0.5〜0.8μであり、未発育の気菌糸をわずかに形
成する。 基生菌糸より生じた胞子のう柄に胞子のうを着
生し、胞子のうの形は円柱状ないしビン状で、大
きさ５〜15×10〜25μであり、中に多数の胞子の
う胞子がたてに平行に連鎖して配列されている。 胞子のう胞子は水中で運動性を有する遊走子で
あり、形は棒状で、大きさは0.5〜1.0×1.0〜2.0
μであり、極性でふさ状の鞭毛を有している。 〔〕 ジアミノピメリン酸組成 全菌体分析によるジアミノピメリン酸はメゾー
及びヒドロキシ型が検出された。 〔〕 各種培地上における生育状態 各種培地上で、30℃、20日間培養し、観察した
所見は第１表に示した通りである。スターチ・無
機塩寒天培地およびオート・ミール寒天培地上で
未発育の気菌子がわずかに形成される以外は、気
菌糸の形成は認められない。色の表示はカラー・
ハーモニー・マニアル（Color Harmony
〓〓〓〓〓
Manual）第４版、1958年（Container
Corporation of America）による色の分類に従
つたものである。

【表】 〓〓〓〓〓

【表】 〔〕 生理学的性質 生理学的諸性状は以下に示す通りである。 １ 炭素源の資化性

【表】 ２ 生育温度範囲：10〜45℃ ３ 脱脂牛乳：ペプトン化及び凝固とも陽性 ４ メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地；
陰性 ペプトン・イースト・鉄寒天培地；陽性 ５ 澱粉の加水分解：陽性 ６ セルロースの加水分解：陰性 ７ カゼインの加水分解：陽性 ８ ゼラチンの液化：陽性 ９ チロシンの分解：陰性 10 キサンチンの分解：陰性 11 ヒポキサンチンの分解：陰性 12 硫化水素の生成：陰性 13 硝酸塩の還元：陰性 上述の本菌A11079株の性状をバージーズ・マ
ニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey′s Maunal of Determinative
Bacteriology）第８版1974年第707〜708頁のアク
チノプラナセア（Actinoplanaceae）の検索表に
て検索した結果、アンピユラリエラ属に属するも
のと同定され、本菌をアンピユラリエラ・エス・
ピー・A11079と命名した。 本発明の新規な物質ネプラノシンＤは下記の如
くして得られる。即ち例えば、上記のアンピユラ
リエラ・エス・ピーA11079株を培地に培養す
る。この場合用いられる培地は人工培地でも天然
培地でもよく、また固体培地または液体培地でも
よいが、特に大量生産のためには液体培地が適当
である。培地成分としてはネプラノシンＤ生産菌
が同化しうる炭素源、窒素源、無機塩類、その他
が用いられる。例えば炭素源としてはグルコー
ス、グリセリン、可溶性スターチ、糖密などがあ
げられ、また窒素源としてはペプトン、コーンス
チープリカー、大豆粉、肉エキス、米ヌカ、カゼ
イン水解物、硝酸塩、アンモニウム塩などがあげ
られ、その他の無機塩類としては食塩、リン酸
塩、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガンな
〓〓〓〓〓
どの微量栄養物を適宜に添加してもよい。また必
要な場合には消泡剤としてシリコーン油、大豆油
などの動植物鉱物油などを添加してもよい。これ
ら栄養物質を含有する培地に生産菌株を培養する
には固体培養法でもよいが液体培養法でもよい。
液体培養法を行なう場合には、通気撹拌培養する
のが有利であり、この場合の培養温度は使用する
菌の最適の温度25〜30℃付近、また培養日数は条
件によつて多少異なるが通常２〜４日程度であ
り、さらに培地のPHは中性ないし弱酸性のほぼ中
性付近に保つのがよい。 このようにして得られた培養物には、ネプラノ
シンＤが含有されている。この培養物から目的と
する本物質を採取するには、微生物の代謝産物を
培養物から採取するのに通常とられる分離手段が
適宜利用される。本物質ネプラノシンＤは水溶性
弱塩基性の物質であるから、例えばその培養液
を適当な吸着剤に接触せしめて有効成分を吸着さ
せ、次いで適当な溶媒で溶出せしめて分別採取す
ることができる。吸着剤としては活性炭、陽イオ
ン交換樹脂、活性アルミナ、シリカゲルなどが用
いられ、溶出溶媒は使用する吸着剤によつて異な
るが水溶性有機溶媒の含水溶液、例えば含水メタ
ノール、含水アセトン、含水ジオキサンなどや
酸、アルカリもしくは塩の水溶液などが適宜用い
られる。さらに、本物質の弱塩基性物質の性質を
利用して分離精製することができる。例えばアン
バーライトIRC―50（商品名：ローム・アンド・
ハース社製）、アンバーライトIR―120（商品
名）あるいはダウエツクス50（商品名：ダウケミ
カル社製）などの陽イオン交換樹脂に吸着させ、
これを適当な酸、アルカリもしくは塩の水溶液を
用いて有効成分を溶出することができる。 また吸着剤とイオン交換樹脂と組合せて分離、
採取、精製してもよい。例えば培養液を陽イオ
ン交換樹脂アンバーライトIR―120（商品名）に
チヤージして有効成分を吸着させ、これをアルカ
リ水溶液、例えば3.7Nアンモニア水にて溶出し
て、その活性画分を得、これを中性ないし弱塩基
性にPH調整した後、活性炭に吸着し、70％メタノ
ールなどの溶出溶媒にて溶出し、さらにこれを陰
イオン交換樹脂アンバーライトIRA―410（商品
名）にチヤージして、水にて溶出せしめ、有効成
分を含む区分を集めて濃縮し、粗製物を得、これ
をシリカゲルの吸着クロマトグラフイーにて精製
する。 以上のような各方法で分離、精製された結晶
は、再結晶法にて純化される。得られた本物質ネ
プラノシンＤが単一物質であることは、再結晶に
より単一の融点を示し、各種溶媒系でのペーパー
クロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイー、
紙電気泳動などで単一のスポツトを示すことよ
り明らかである。 本物質ネプラノシンＤは有用な抗ガン抗生物質
ネプラノシンＡの合成原料として有用である。 以下にネプラノシンＤよりネプラノシンＡの合
成経路ならびにその合成の中間体として得られる
各種ネプラノシンＤ誘導体について述べる。 ネプラノシンＤのシクロペンテン環部分の３つ
の水酸基をベンゾイルクロライドを反応させて保
護しておき、これにメルカプト化剤例えば５硫化
リンを反応させてアデニン構造部分の水酸基をメ
ルカプト基に変換し、次いで水酸基の保護基を脱
離して、ネプラノシンＤ誘導体（）を得る。こ
の誘導体（）をアルキル化剤例えばヨウ化メチ
ルでメチル化してネプラノシンＤ誘導体（）を
得る。ネプラノシンＤ誘導体（）はメタノール
性アンモニアで処理することによりネプラノシン
Ａに変換することができる。 一方ネプラノシンＤのシクロペンテン環部分の
３つの水酸基を無水酢酸にてアセチル化して保護
しておき、ハロゲン化剤例えばチオニルクロライ
ドを反応させることにより、ネプラノシンＤ誘導
体〔３〕を得ることができる。この化合物は、メ
タノール性アンモニア水処理によりネプラノシン
Ａに変換することができる。 これらの反応経路を図示すれば以下の通りであ
る。 〓〓〓〓〓
〓〓〓〓〓
このようにして得られる各種ネプラノシンＤ誘
導体の物理化学的性質は以下の通りである。

〔参考例 ２〕

ネプラノシンＤ誘導体〔３〕よりネプラノシ
ンＡの製造 実施例６で得られたネプラノシンＤ誘導体
〔３〕をスチール製耐圧ボンベに入れ、飽和した
メタノール性アンモニア35mlを加え、100℃にて
５時間反応した。反応後冷却し、その内容物を減
圧乾固して結晶性粉末を得た。このものをシリカ
ゲルカラムクロマトグラフイにて精製してネプラ
ノシンA286mgを得た。物性は前記参考例１で得
られたものと同一であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はネプラノシンＤの紫外線吸収スペクト
ルを示し、第２図はネプラノシンＤの赤外線吸収
スペクトルを示し、第３図はネプラノシンＤの核
磁気共嗚スペクトルを示す。 〓〓〓〓〓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記構造を有するネプラノシンＤおよびその
   誘導体 式中R₁は―OH、―SH、―SCH₃基又はCl原子
   を示し、R₂は水素原子又はアセチル基を示す。 ２ R₁が―OH、R₂が水素原子である特許請求の
   範囲第１項記載のネプラノシンＤ。 ３ R₁が―SH、R₂が水素原子である特許請求の
   範囲第１項記載のネプラノシンＤ誘導体。 ４ R₁が―SCH₃、R₂が水素原子である特許請求
   の範囲第１項記載のネプラノシンＤ誘導体。 ５ R₁が―Cl原子、R₂が水素原子である特許請
   求の範囲第１項記載のネプラノシンＤ誘導体。 ６ R₁が―Cl原子、R₂がアセチル基である特許
   請求の範囲第１項記載のネプラノシンＤ誘導体。 ７ 資化性の炭素源および窒素源ならびに無機物
   資を含む培地にアンピユラリエラ属に属するネプ
   ラノシンＤを産生する菌を接種し、培養後、その
   培養物より新親物資ネプラノシンＤを採取するこ
   とを特徴とする新規物質ネプラノシンＤの製法。 ８ 菌がアンピユラリエラ・エス・ピーA11079
   である特許請求の範囲第７項記載の新規物質ネプ
   ラノシンＤの製法。