JPS62164629A - 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２及びそ
の製法に関するものである。

従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。

また、溶連菌の菌体を破砕接水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許１１６３８６５号）、溶連菌の菌体を
破砕復水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋白
分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）など
が知られている。

このように、ストレプトコッカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり１機械的に破砕したりし
て全体を分画しなければならなかった。

このような処理で°は、精製は複雑となり、有効成分の
単離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分
として測定された例では分子量２００．０００の蛋白質
（特公昭４８−４３８４１、特開昭５ｌ−４４６１７）
及び分子ｆｆ１１５０，０００の糖蛋白質（特開昭５８
−２２０２６）が知られている程度である。

本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍性成分を
溶出させる方法を鋭意研究したところ、培養中にペニシ
リン又はその関連物質を添加することによって抗腫瘍性
成分が培養液中に溶出することを見出しく特開昭６０−
３０６７７号）、培養液中から生理活性物質５ＰＦ−１
を分離するに至ったのである。（特開昭６０−３０６８
９号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中からより有効
な成分を分離する目的で研究したところ。

本発明において、癌化白血球培養細胞Ｌ　１２１０（以
下培養細胞Ｌ　１２１０という）の生育を阻害し、かつ
、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画分であるこ
とにより特徴づけられる抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２
を分離するに至った。

本発明の抗腫瘍性成分５ＰＦＬＯ−１２は元素分析、呈
色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を含むペプ
チド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトルおよ
び赤外線吸収スペクトルから、既知の抗腫瘍性物質とは
、相違する新規な物質と認められるものである。

本発明は、ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分
ＳＰＦ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２の製造法を包含するものであ
る。

本発明においては、ストレプトコッカス属に属する抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌が広く使用できる。次
に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２生産菌を記載する。

培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・
ハート・インフユージゴン培地（ＢＨＩ培地）等の天然
培地がよく用いられるが、ストレプトコッカス属細菌の
生育に適した培地であれば任意の培地を使用できる。

培養は、ｐ１１５．０〜８．０、好ましくは、６．１〜
７．２であり、培養温度は、３０〜４０℃、好ましくは
、３５〜３７℃であり、嫌気的に静置培養または、攪拌
培養を行なうことができる。

本発明においては、培養中に適当な時期に、ペニシリン
または、その関連物質を添加することが、抗腫瘍性成分
ＳＰＦ、１０−１２の採取に重要な役割をはだすことに
なる。

ペニシリンまたは、その関連物質の添加時期は、３５〜
３７℃の培養で、対数増殖期にかかって後、３〜２０時
間の間、特に５〜１０時間が好ましい。その後１〜２０
時間、好ましくは３〜１５時間培養を継続することによ
り、培養中に抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を多ＨＭ積
させることができる。

ペニシリンまたはその関連物質としては、すでに知られ
たペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であればいか
なるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用いられる。

添加量は、ペニシリンＧで１００〜７０００単位／ｍＱ
、好ましくは、　３００−５０００単位／　ｍ　Ｑ培養
液程度で十分である。

ストレプトコッカス属細菌のペニシリンまたは、その関
連物質の添加培養によって得られた培養液は遠心分離に
よって菌体を除去し、濾液を得る。

濾液は、硫安を添加し、５０〜９０％飽和度の画分を分
取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜を用いて濃縮
する。

得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を含む硫安塩析
物は凍結状態で保存することもできる。

この硫安塩析物から抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２を抽
出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用いる。

又、限外濾過膜を用いて得た濃縮液を、そのまま用いる
こともできる。この水溶液をＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出させ、培
養細胞Ｌ　１２１０の生育を阻害する活性画分を分取し
、この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラ
ムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直
線的に上昇させつつ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナ
トリウム低濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に
対して透析し、ゲル濾過材トヨパールＨＷ−５０Ｆカラ
ムに吸着させ、０．ＩＭ　ＮａＣＱを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応及び培養細
胞Ｌ１２１０に対する活性を調べる。ここで培養細胞Ｌ
１２１０に対して強い活性を示す画分すなわち、トヨパ
ール１Ｉ１１５０Ｆの排除限界（以下Ｖｏと略す）付近
のアンスロン硫安法による呈色反応でピークを形成する
画分を得る。この画分を濃縮し、トヨパールｌｌｌ＋１
６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＩＭ　ＮａＣ１を含む燐
酸緩衝液で溶出させる。５ＰＦ１０−１２はトヨパール
Ｈｌｉ１６０Ｆカラムクロマトグラフィーにおいて２８
０ｎｍの吸収が強く、かつアンスロン硫酸法で弱い呈色
を示す画分として得ることが出来る。

次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
２の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示す。

■８元素元析　Ｃ４１，３〜４３．５％■　　　　５．
９〜６．７％ Ｎ　　　　１４．２〜１６．６％ ０　　　３７．９〜３１．４％ Ａｓｈ　　　０．７〜１．８％ ２、分解点　本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
と黒色となり分解する。

３、比旋光度〔α〕も’＝−８０°〜−９５’　（Ｃ＝
１．０Ｏ）４、紫外線吸収スペクトル　本物質０．１％
の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示される。

５、赤外線吸収スペクトル　第２図に示される。

３３００ｃｍ−１付近及び１６５０ｃｍ−１付近のペプ
チドによる吸収が認められ特徴的である。

６、塩基性、酸性、中性の区別　本物質０．１％の水溶
液のｐＨは５．５〜６．０である。

７、物質の色　淡褐色 ８、呈色反応 ローリ−反応　　　　　　十 ビューレット反応　　　十 ニンヒドリン反応　　　十 アンスロン硫酸反応　　十 モーリッシュ反応　　　十 システィン硫酸反応　　十 オルシン塩酸反応　　　− ９、分子量　ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
０００〜４０，０００である。

１０、　　溶剤に対する溶解性　水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、
エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エ
チル等の溶剤には難溶又は不溶である。

次にインビトロにおける培養細胞Ｌ　１２１０に対する
抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法による呈
色反応の方法を示す。

抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ　１２１０の生育阻止
率（ＩＲ％）の測定により行った。

Ｌ　１２１０細胞を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　１６４
０培地（５＋＋＋ｇ／Ｑカナマイシン含有）に懸濁した
。この培養液０．５ｍ１ｌｌをファルコン２０５８チュ
ーブに注加し、細胞数がｌ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／
　ｔｕｂｅになるようにした。次いでこの培養液に所定
量の標品（抗腫瘍性成分５ＰＦ１０−１２　）を目的濃
度になるように培養液に溶解した０、５ｍΩを注加して
、３７℃で５％ＣＯ□存在下に培養した。標品を添加し
て４８時間後にトリパンブルーによる染色をおこない１
次式によりＩＲ（％）を算出した。

ここで（Ａ）とは対照群の生細胞数を示す。

対照は標品を含まない培養液０．５＋ｎＱを用い同時に
行った。

アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１ｍＱに２ｍ１
２のアンスロン試薬（０，２０ｇｒのアンスロンを１０
０ｍＱの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合３０分
後、標品１ＨＩＱに代えて脱イオン水１ｍＱに２ｍ、Ｉ
２のアンスロン試薬を注加した液を対照として６２０ｎ
ｍで吸収を測定する。定量値はグルコースを用いて同様
に測定して得た検量式より求める。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ストレプトコッカス・ピオゲネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地Ｌｏｏｍ　Ｑに接種し
て３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第１表に示す培地ＡＩＱに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った・ 第１表　培地Ａ マルトース　　　　　　　　　０．２５％肉エキス　　
　　　　　　　１．０％ ポリペプトン　　　　　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．２５％酸性第一燐酸
カリウム　　　０．１％ 硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５％ｐＨ＝６．８ １０Ｑジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＱを接種し、３７℃、１５．５時間、１）１１
６．８．３００回転／分で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンａ　ｒｏｏｏｔｌｔ位／　ｍ　Ｑ
培養液になるように添加して、培養を更に５時間継続し
た。

得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去した。

培養濾液は、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（米
国、ロミコン社）を用いて、１．５Ｑに濃縮した。

この濃縮液を、ＤＥＡＥセルロースカラム（５Ｘ　７０
ｃｍ）に吸着させた後、　１１０１ｕ、ｐ）１７．０の
燐酸緩衝液を用いて、洗浄し１次いで０．３Ｍ塩化ナト
リウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出さ
せ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細
胞Ｌ１２１０の生育を阻害する活性画分を分取した。

この活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム
（７，５Ｘ　５０ｃｍ）に吸着させ、次いで上記燐酸緩
衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて
溶出を行い、培養細胞Ｌ　１２１０に対して活性のある
部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示される。第
３図において点線部分は非吸着部分で、実線部分は塩化
ナトリウム添加部分である。

Ａは培養細胞Ｌ　１２１０生育阻害活性画分で、ＭＰ−
２（特開昭１３０−３０６８９）生育阻害非活性画分で
あり、Ｂは培養細胞Ｌ　１２１０生育阻害非活性画分で
、ＭＰ−２生育阻害活性画分である。

Ａの活性画分の溶出液を分画分子量１０，０００の限外
濾過膜（ミリボア社）で３０ｍ　Ｑに濃縮する。この濃
縮液をトヨパールＨ１ｉ１５０Ｆカラム（５，ＯＸ　１
００ｃｍ）に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩
化ナトリウム０．１Ｍを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。この溶
出曲線は第４図に示される。第４図において実線は全体
の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による呈色
反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここでＣはアン
スロン硫酸法による呈色反応陽性画分であるが、培養細
胞Ｌ１２１０に対する生育阻止活性を調べ活性の強いＶ
ｏ付近の、アンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画分
を得る。Ｄ画分は凍結乾燥する。この凍結乾燥標品を溶
解しトヨパールＨＷ６０Ｆカラム（２，６Ｘ　１００ｃ
ｍ）に吸着させ次いでトヨパール１ｌＷ５０Ｆの場合と
同じ溶出液で溶出する。

この溶出曲線は第５図に示される。第５図において実線
は全体の溶出曲線を示し、黒丸付の実線はアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。

ここでアンスロン硫酸法による呈色反応で強い呈色を示
すＦの画分を５ＰＦ１０−１１とし、Ｇの画分をＳＰＦ
１０−１２とした。

Ｇの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性
成分ＳＰＦ１０−１２であり、０　、６８ｇｒを得た。

実施例２ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３００単位／ｒｔｒＱ培
養液となるように添加し、更に培養を１０時間継続した
。この培養濾液に硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画
分を分取する。

透析により硫安を除き実施例１と同様に精製して抗腫瘍
性成分ＳＰＦ１０−１２０，３４ｇｒを得た。

実施例３ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは３０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を３時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，７３ｇｒを得た。

実施例４ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ＨＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，４６ｇｒを得た。

第２表　培地Ｂ マルトース　　　　　　　　　０．１％肉エキス　　　
　　　　　　　０．５％ポリペプトン　　　　　　　１
．０％ 酵母エキス　　　　　　　　０．２５％塩化ナトリウム
　　　　　　０．１％ ｐＨ＝７．２ 実施例５ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様に３５℃
で培養した。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／
ｒａｉｌ培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗
１１！［癌性成分ＳＰＦ１０−１２０，３２ｇｒを得た
。

第３表　培地Ｃ マルトース　　　　　　　　　０．１％肉エキス　　　
　　　　　　Ｏ，Ｓ％ ポリペプトン　　　　　　　０．５％ カザミノ酸　　　　　　　　０．３％ 酵母エキス　　　　　　　　０．５％ 酸性第一燐酸カリウム　　　０．１％ 硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５％ｐＨ＝６．５ 実施例６ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第４表に示した培地りを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，２９ｇｒを得た。

第４表　培地Ｄ マルトース　　　　　　　　　０．２５％カザミノ酸　
　　　　　　　　０．３％酵母エキス　　　　　　　　
１．０％ 酸性第一燐酸カリウム　　　０．１％ 硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５％ｐＨ＝６．９ 実施例７ ストレプトコッカス・エスピーＡＴＣＣ２１５９７を第
１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養した
。この場合、ペニシリンＧはｔｏｏｏ単位／ｌｎＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分５
ＰＦ１０−１２０．５５ｇｒを得た。

実施例８ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４６を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍΩ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６１ｇｒを得た。

実施例９ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４７を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養
液となるように添加し、更に培養を５時間継続した。こ
の培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分Ｓ
ＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。

実施例１０ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１５４８を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
たにの場合、ペニシリンＧは１０００単位／ｍＱ培養液
となるように添加し、更に培養を５時間継続した。この
培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ１０−１２０，４８ｇｒを得た。

実施例１１ ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ２１０６０を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に培養し
た。この場合、セファロスポリンＣは６００μｇ　／　
ｍ　Ｑ培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製して抗腫
瘍性成分ＳＰＦ１０−１２０，６４ｇｒを得た。

実験例１ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２のイ
ンビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中に記載した
抗腫瘍活性の測定方法により行い、その結果を第５表に
示す。

第５表　ＳＰＦ１０−１２の抗腫瘍活性の結果ＳＰＦ１
０−１２（ｍｇ／ｍＱ）　　　　ＩＲ％０．５　　　　
　　　８７．９ ０．２５　　　　　　５６．１ ０、１２５　　　　　　３２．６ 実験例２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１２のイ
ンビボにおける抗腫瘍活性試験は、Ｃｒｊ　；　ＣＤ−
１（ＩＣＲ系、雌性７週齢）マウスを使用して実施した
。腫瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍｓ−１８０腹水癌細
胞を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内
に５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。

癌細胞接種２４時間後から、１日１回５日間連続してＳ
ＰＦ　１０−１２を腹腔内に投与してその生存数を［１
しその結果を第６表に示す。

第６表　ＳＰＦ１０−１２の抗腫瘍活性−マウスの生存
数日数　　　　０　１０　１５　２０　２５　３０コン
トロール　　　　８／８　６／８　　０／８　０／８　
０／８　０／８ＳＰＦＩＯ−１２（０，９ｍｇ／マウス
＞　　　８／８　　　８／８　　　　７／８　　　６／
８　　　６／８　　　５／８

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ］、０−１２の紫外線吸収
スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペクト
ルを示す。第３図は実施例１における活性画分のＤＥＡ
ＥセファデックスＡ−２３６５カラムの７容出曲線を示
す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパール１ｌＷ６０Ｆ
カラムに吸着させ、０．ＩＭ　ＮａＣΩ含有燐酸緩衝液
による溶出曲線を示す図で、第５図はこのＤ画分をトヨ
パール１ｌＷ６０Ｆカラムに吸着させ、０．ＬＭ　Ｎａ
ＣΩ含有燐酸緩衝液による溶出曲線を示す。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　　３　　図 第　　４　　図 第　　５　　図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分ＳＰＦ
   １０−１２。 １、元素元析　Ｃ　４１．３〜４３．５％ Ｈ　５．９〜６．７％ Ｎ　１４．２〜１６．６％ Ｏ　３７．９〜３１．４％ Ａｓｈ　１０．７〜１．８％ ２、分解点　本物質は１６５℃で褐変し２４０℃になる
   と黒色となり分解する。 ３、比旋光度〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝−８０°〜−９５°
   （Ｃ＝１．００）４、紫外線吸収スペクトル　本物質０
   ．１％の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示さ
   れる。 ５、赤外線吸収スペクトル　第２図に示される。 ３３００ｃｍ＾−＾１付近および１６５０ｃｍ＾−＾１
   付近のペプチドによる吸収が認められ特徴的である。 ６、塩基性、酸性、中性の区別　本物質０．１％の水溶
   液のｐＨは５．５〜６．０である。 ７、物質の色　淡褐色 ８、呈色反応 ローリー反応　＋ ビューレット反応　＋ ニンヒドリン反応　＋ アンスロン硫酸反応　＋ モーリッシュ反応　＋ システイン硫酸反応　＋ オルシン塩酸反応　− ９、分子量　ゲル濾過法による測定では分子量約１０，
   ０００〜４０，０００である。 １０、溶剤に対する溶解性　水に可溶であるが、メタノ
   ール、エタノール、ｎ−プロパノール、アセトン、エチ
   ルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル
   等の溶剤には、難溶又は不溶である。
2. （２）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
   ＳＰＦ１０−１２を採取することを特徴とする抗腫瘍性
   成分ＳＰＦ１０−１２の製法。
3. （３）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１２生産菌を培養するに際し、培養中の適当な
   時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培養する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
   性成分ＳＰＦ１０−１２の製法。
4. （４）ストレプトコッカス属に属する抗腫瘍性成分ＳＰ
   Ｆ１０−１２生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成分
   ＳＰＦ１０−１２を採取するに当たり、培養細胞Ｌ１２
   １０の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫酸法によ
   る呈色反応陽性の画分を分取することを特徴とする特許
   請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分ＳＰＦ１０−１
   ２の製法。