JPS6223258B2 - - Google Patents
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- JPS6223258B2 JPS6223258B2 JP60251114A JP25111485A JPS6223258B2 JP S6223258 B2 JPS6223258 B2 JP S6223258B2 JP 60251114 A JP60251114 A JP 60251114A JP 25111485 A JP25111485 A JP 25111485A JP S6223258 B2 JPS6223258 B2 JP S6223258B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
グルカゴンは動物の糖代謝に極めて重要な働き
をするホルモンであるが、その血中濃度の測定は
従つて臨床上極めて重要である。本出願は本ホル
モン，特に膵臓由来のグルカゴンの血中濃度の測
定に有用なイムノアツセイ用抗体の製造法に関す
るものである。 グルカゴンには化学構造上類似しているといわ
れる膵グルカゴン と腸管グルカゴンが存在し、血糖値に影響するも
のは主として膵グルカゴンとされている。従つて
臨床的に必要な測定値は主として膵由来グルカゴ
ンの血中濃度であるが、従来、入手可能な膵グル
カゴンと牛血清アルブミンとの縮合物による抗体
の作成操作によつては、膵グルカゴンに特異性を
持つ臨床応用可能な抗体の生成は極くまれであ
り、主として膵グルカゴンと腸管グルカゴンの両
者と交叉する抗体が得られることは良く知られて
いる所である。本発明者らは、膵グルカゴンに特
異的な抗体を作成することが出来る抗原の製造を
目的とし、種々のペプチドを合成して、検討した
結果、グルカゴンの15番からＣ一端に至るペンタ
デカペプチドが本目的に極めて有用なものである
という予期せざる新知見を得、本発明を完成した
ものである。 本発明はＨ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―
Gln―Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met―
Asn―Thr―OHで表わされる新規ペプチド
（Ｉ）と牛血清アルブミンとをグルタルアルデヒ
ドで縮合せしめ、その縮合生成物を哺乳動物に投
与することを特徴とする膵グルカゴンに特異的な
抗体を製造する方法に関する。 本明細書において、アミノ酸，ペプチド，保護
基，活性基，その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC―IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Arg：アルギニン Trp：トリプトフアン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ser：セリン Glu：グルタミン酸 Gln：グルタミン Ala：アラニン Val：バリン Met：メチオニン Met（ｏ）：スチオニンスルフオキシド Leu：ロイシン Phe：フエニルアラニン Tyr：チロシン Lys：リジン His：ヒスチジン Pro：プロリン Gly：グリシン Ile：イソロイシン Cys：シスチン Ｚ ：カルボペンゾキシ Boc：ｔ―ブチルオキシカルボニル OBut：ｔ―ブチルエステル OBzl：ベンジルエステル ONB：Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネン―
２，３―ジカルボキシイミドエステル MBS：Ｎ―ヒドロキシ―ｐ―メトキシベンゼ
ンスルホニル HONB：５―ノルボルネン―２，３―ジカルボ
キシイミド DCC：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド DCU：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルウレア DMF：Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド NMP：Ｎ―メチル―２―ピロリドン TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン TEA：トリエチルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン CMC：カルボキシメチルセルロース BSA：牛血清アルブミン 本発明で用いるペプチド（Ｉ）は、ペプチド合
成の常套手段で製造しうる。固相合成法，液相合
成法のいずれによつてもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段
はたとえば、“The Peptides”，第１巻（1966），
Schroder and Lubke著，Academic Press，
New York，U.S.A.あるいは“ペプチド合成”，
泉屋ら著，丸善株式会社（1975年）に記載されて
おり、たとえばアジド法，クロライド法，酸無水
物法，混酸無水物法，DCC法，活性エステル
法，ウツドワード試薬Ｋを用いる方法，カルボジ
イミダゾール法，酸化還元法，DCC／アデイテ
イブ（例、HONB，HOBt，HOSu）法などがあ
げられる。 本発明で用いるペプチド（Ｉ）は、そのペプチ
ド結合の任意の位置で２分される２種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料をペプチド合成の常套手
段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する
場合、その保護基を常套手段で脱離させることに
より製造しうる。 ペプチド（Ｉ）を製造する反応工程で、Aspは
通常保護しておくのが望ましい場合が多く、最終
工程としてはペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸残基
の少くとも一つが保護された保護ペプチド（Ｉ）
から保護基をすべて脱離することにより製造しう
る場合が多い。 原料の反応に関与すべきでない管能基の保護お
よび保護基，ならびにその保護基の脱離、反応に
関与する官能基の活性化などもまた公知のものあ
るいは手段から適宜選択しうる。 原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカ
ルボベンゾキシ，ｔ―ブチルオキシカルボニル，
ｔ―アミルオキシカルボニル，イソボルニルオキ
シカルボニル，ｐ―メトキシベンジルオキシカル
ボニル，２―クロル―ベンジルオキシカルボニ
ル，アダマンチルオキシカルボニル，トリフルオ
ロアセチル，フタリル，ホルミル，ｏ―ニトロフ
エニルスルフエニル，ジフエニルホスフイノチオ
イルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基
としては、たとえばアルキルエステル（例、メチ
ル，エチル，プロピル，ブチル，ｔ―ブチルなど
のエステル基），ベンジルエステル基，ｐ―ニト
ロベンジルエステル基，ｐ―メトキシベンジルエ
ステル基，ｐ―クロルベンジルエステル基，ベン
ズヒドリルエステル基，カルボベンゾキシヒドラ
ジド基，ｔ―ブチルオキシカルボニルヒドラジド
基，トリチルヒドラジド基などがあげられる。 アルギニンのグアニジノ基の保護基としては、
たとえばニトロ基，トシル基，ｐ―メトキシベン
ゼンスルホニル基，カルボベンゾキシ，イソボル
ニルオキシカルボニル，アダマンチルオキシカル
ボニル等が例示される。また、そのグアニジノ基
は、酸（例、ベンゼンスルホン酸，トルエンスル
ホン酸，塩酸，硫酸など）塩の形で保護してもよ
い。 スレオニンの水酸基は、たとえばエステル化ま
たはエーテル化によつて保護することができる。
このエステル化に適する基としてはたとえばアセ
チル基などの低級アルカノイル基，ベンゾイル基
などのアロイル基，ベンジルオキシカルボニル
基，エチルオキシカルボニル基などの炭酸から誘
導される基などがあげられる。またエーテル化に
適する基としては、たとえばベンジル基，テトラ
ヒドロピラニル基，ｔ―ブチル基などである。し
かしながらスレオニンの水酸基は必ずしも保護す
る必要はない。メチオニンはスルホキサイドの形
で保護しておいてもよい。原料のカルボキシル基
の活性化されたものとしては、たとえば対応する
酸無水物，アジド，活性エステル（ペンタクロロ
フエノール，ｐ―ニテトロフエノール，Ｎ―ハイ
ドロキシサクシンイミド、Ｎ―ハイドロキシベン
ズトリアゾール，Ｎ―ハイドロキシ―５―ノルボ
ルネン―２，３―ジカルボキシイミドなどとのエ
ステル）などがあげられる。ペプタイド結合形成
反応は脱水剤（例、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド，カルボジイミダゾール等のカルボジイミド
試薬）の存在下に実施しうる場合がある。 本ペプタイド縮合反応は溶媒の存在下に行うこ
とができる。溶媒としては、ペプタイド縮合反応
に使用しうることが知られているものから適宜選
択されうる。たとえば無水または含水のジメチル
ホルムアミド，ジメチルスルホキサイド，ピリジ
ン，クロロホルム，ジオキサン，ジクロルメタ
ン，テトラハイドロフラン，酢酸エチル，Ｎ―メ
チルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物な
どがあげられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用されう
ることが知られている範囲から適宜選択され、通
常約−40℃−約60℃，好ましくは約−20℃−約０
℃の範囲から適宜選択される。 本縮合反応終了後、生成物が保護基を有してい
る場合、それは常法により離脱できる。かかる常
法としては、たとえば還元的方法（例、パラジウ
ム黒等の触媒を用いる水素添加，液体アンモニア
中金属ナトリウムによる還元），アシドリシス
（例、トリフルオロ酢酸，フツ化水素，メタンス
ルホン酸等の強酸によるアシドリシス）などがあ
げられる。 上記のようにして製造されたペプチド（Ｉ）は
反応終了混合物から、ペプチドの分離手段，抽
出，分配，カラムクロマトグラフイーなどにより
採取できる。 ペプチド（Ｉ）はアルギニン残基を有するの
で、塩としても採取しうる。塩を形成しうる酸と
しては、たとえば塩酸，臭化水素酸，硝酸，硫
酸，リン酸などの無機酸，あるいはたとえばギ
酸，酢酸，プロピオン酸，乳酸，クエン酸，シウ
酸，マレイン酸などの有機酸があげられる。 本発明で用いるペプチド（Ｉ）を製造しうる原
料もまた前記ペプチド合成の常套手段で、そのア
ミノ酸配列にしたがつて各々のアミノ酸を順次縮
合させることにより製造しうる。 この様にして得られたペンタデカペプチド
（Ｉ）と牛血清アルブミンとの縮合は公知のグル
タルアルデヒド法［例、PROCEEDINGS OF
THE SOCIETY FOR Experimental Biology
and Medicine，128，347―350（1968）］によつ
て実施しうる。牛血清アルブミンは、抗原のキヤ
リアーとして使用するものであり、場合により同
様の目的に使用しうる他の蛋白質で代替しうる場
合もありうる。ペンタデカペプチド（Ｉ）と牛血
清アルブミンの使用量比は10mg対約20mgが最適で
あり、反応PHは7.3前後が良効な結果を与える場
合が多い。また反応時間は室温で２〜６時間がよ
い場合が多いが、特に３時間前後が適当な場合が
多い。 この様にして作成した縮合生成物は常套手段で
４℃前後で水に対して透折し、凍結乾燥して保存
することができる。 以上の様にして製造した本発明の縮合生成物
は、種々の哺乳動物（例、ウサギ，マウス）に常
法に従つて投与することによつて効率よく膵グル
カゴンに対し特異的な、しかも反応性のよい抗体
を産生することができる。ペプチド（Ｉ）は、抗
体産生するに有効な量でよく、たとえばウサギに
１回約２mgの皮下投与を２週間おきに５回行うと
抗体を産生しうる場合もある。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、メルク社製シリカゲルプレート60F254又
は、フナコシ薬品社製 セルロースプレート，ア
ビセルSFを用い、下記の展開溶媒を用いた。 Rf1：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf2：クロロホルム：メタノール：水＝７：
３：0.5 Rf3：ｎ―ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 参考例 １ (1) Boc―Asn―Thr OBzlの製法。 Boc―Thr OBzl 112ｇをTFA300mlに溶かし、
室温で20分間振り混ぜた後、濃塩酸30mlを加え、
溶液を減圧濃縮する。残留物をTHF1に溶か
し、氷冷し、TEA50mlを加えて中和する。これ
にBoc―Asn―OH 76.7ｇ，HONB64.5ｇ，
DCC74.3ｇを加えて15時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去した後、溶媒を減圧で留去し、残留
物を酢酸エチル１に溶かす。これを10％クエン
酸水（300ml×３），飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３），水（300ml×３）で順次洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去
した後、残留物にエーテル（１）に加えて、粉
末として、ろ取した後、アセトニトリルより再結
晶する。収量105.1ｇ（75.2％）mp 165―166℃
〔α〕２３ Ｄ−13.9゜（ｃ＝0.9，DMF中），Rf10.51，
C20H29O7N3としての元素分析計算値：C56.72；
H6.90；N9.92，実験値：C57.01；H6.89；N9.94 (2) Boc―Met（ｏ）―Asn―Thr―OBzlの製造 Boc―Asn―Thr―OBzl 50.0ｇにTFA170mlを
加えて、室温で30分間振り混ぜた後、濃縮しエー
テル500mlを加えて粉末としてろ取し、乾燥す
る。これをTHF400mlに溶かし、氷冷しTEA20ml
を加えた後、Boc―Met（Ｏ）―ONB（Boc―Met
（Ｏ）・OH31.3ｇ，HONB23.3ｇをTHF200mlに溶
解し、氷冷し、DCC26.8ｇを加えて、４時間かき
混ぜて調製する。）を加え、15時間かき混ぜる。
溶媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸エチル
（200ml），エーテル（200ml）を加え、粉末として
ろ取し、アセトニトリルより再沈澱する。収量
48.5ｇ（72.0％），mp.145−147℃〔α〕２３ Ｄ―6.5
（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.19，C25H38O9N4Sとし
ての元素分析計算値：C52.62；H6.71；N9.82；
S5.62，実験値：C52.44；H6.73；N9.60；S5.15 (3) Boc―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzlの
製法 Boc―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl15.0ｇに
TFA45mlを加え、室温で45分間振り混ぜた後、
濃縮し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取
し、乾燥する。これをDMF50mlに溶解し、氷冷
し、TEA5.7mlを加え、これにBoc―Leu―ONB
（Boc―Leu―OH6.69ｇ，HONB5.70ｇ，DCC6.56
ｇより調製）を加えて、15時間かき混ぜる。溶媒
を減圧で留去した後、残留物に酢酸エチル200ml
を加えて、粉末としてろ取し、アセトニトリル―
酢酸エチルより再沈澱する。収量15.0ｇ（83.4
％），m.p.134−136℃，〔α〕２４ Ｄ−15.1゜（ｃ＝
1.0，DMF中），Rf10.25，C13H49O10N5Sとしての
元素分析計算値：C54.45；H7.22；N10.24；
S4.69，実験値：C54.62；H7.60；N9.89；S3.95 (4) Ｚ―Cln―Trp―OBzlの製造 Ｈ―Trp―OBzl・パラトルエンスルホン酸塩
50.0ｇをTHF500mlに溶かし、氷冷し、TEA15.4
ml，Ｚ―Gln―OH28.0ｇ，HONB19.7ｇ，
DCC22.7ｇを加えて、15時間かき混ぜる。析出し
たDCUをろ去した後、濃縮し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶かす。これを飽和炭酸水素ナトリ
ウム水（150ml×２），10％クエン酸（150ml×
２），水（150ml×２）で順次洗浄する。溶媒を減
圧で留去した後、残留物をTHF300mlに溶かし、
不溶物をろ去する。これを濃縮した後、エーテル
500mlを加えて、粉末としてろ取し、アセトニト
リルより再結晶する。収量46.1ｇ（82.8％），
〔α〕２３ Ｄ＋5.8゜（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.60，
C31H32O6N4としての元素分析計算値：C66.89；
H5.80；N10.07，実験値：C66.79；H5.71；
N10.20 (5) Ｚ―Val―Gln―Trp―OHの製造 Ｚ―Gln―Trp―OBzl50.0ｇをメタノール700ml
に溶かし、５時間接触還元（触媒：パラジウム
黒）すると、結晶が析出するので、これをろ取す
る。これをDMF300mlに懸濁し、TEAl3mlを加え
て溶かし、触媒をろ去する。これにＺ―Val―
ONB37.0ｇを加えて、10時間かき混ぜた後、1N
―塩酸100mlを加えて中和し、さらに水500mlを加
えて、粉末としてろ取する。これをメタノールで
十分洗浄する。収量43.0ｇ（84.7％），m.p.246−
247℃〔α〕２３ Ｄ＋12.4゜（ｃ＝0.9，DMF中），
Rf10.14，C29H35O7N5としての元素分析計算値：
C61.58；H6.24；N12.38実験値：C61.86；
H6.30；N12.36 (6) Ｚ―Phe―Val―Gln―Trp―OHの製造 Ｚ―Val―Gln―Trp―OH5.1ｇを酢酸100mlに
溶かし、３時間接触還元したのち触媒をろ去し、
濃縮する。これをDMF200mlに懸濁し、これに
TEA2ml，Ｚ―Phe―OH2.70ｇより調製したＺ―
Phe―ONBを加えて、７時間かき混ぜる。溶媒を
減圧で留去し、残留物に酢酸水を加えてゲルとし
てろ取する。これをメタノールより再沈澱する。
収量5.50ｇ（84.5％），m.p.240℃，〔α〕２４ Ｄ＋4.1
゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.15，C38H44O8N6・1/2
H2Oとしての元素分析計算値：C63.23；H6.28；
N11.64，実験値：C63.11；H6.29；N11.80 (7) Boc―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp
―OHの製造 Ｚ―Phe―Val―Gln―Trp―OH8.5ｇを、
DMF150ml，酢酸50mlの混液に溶かし、５時間接
触還元する。触媒をろ去した後、濃縮し、残留物
にメタノール100mlを加えて結晶としてろ取す
る。これを、DMF200mlに懸濁し、TEA3.0ml，
Boc―Asp（OBzl）ONB（Boc―Asp（OBzl）―
OH3.9ｇ，HONB2.4ｇ，DCC2.7ｇより調製）を
加えて、10時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物に酢酸水を加えて、ゲルとしてろ
取し、DMF，水より再沈澱する。収量6.3ｇ
（58.1％），m.p.191―192℃（分解），〔α〕２４ Ｄ−
6.2
゜（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.11C46H57O11N7・3/
２H2Oとしての元素分析計算値：C60.64；
H6.63；N10.76，実験値：C60.30；H6.48；
N11.34 (8) Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln
―Trp―OHの製造 Boc―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp―
OH6.0ｇに、TFA50mlを窒素気流中加え、10分
間ふり混ぜた後、濃縮しエーテルを加えて粉末と
してろ取する。これをDMF100mlに溶かし、
TEA2.0mlを加え、Boc―Gln―ONB（Boc―Gln
―OH1.76ｇ，HONB1.34ｇ，DCCl.54ｇから調
製）を加えて、15時間かき混ぜる。これに酢酸水
を加えて、粉末として、ろ取したのち、アセトニ
トリル，水より再沈澱する。収量5.50ｇ（82.6
％）、m.p.210−212℃（分解），〔α〕２４ Ｄ−10.1゜
（ｃ＝1.1，DMF中）Rf10.09，C51H65O13N9として
の元素分析計算値：C60.52；H6.47；N12.46，実
験値：C60.19；H6.37；N12.23 (9) Ｚ―Arg（MBS）―Ala―OButの製造 Ｚ―Ala―OBut31.0ｇをメタノール300mlに溶
かし、５時間接触還元した後、触媒をろ去し、濃
縮する。一方、Ｚ―Arg（MBS）―OH・DC
HA53.0ｇを酢酸エチル500mlに懸濁し、10％クエ
ン酸200mlを加えて、よく振り混ぜた後、水洗
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。これを
THF500mlに溶かし、これに、先に調製したＨ―
Ala―OButを加えHONB14.9ｇを加えて氷冷し、
DCC17.1ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、濃縮した後、酢酸エチル500mlに
溶かし、10％クエン酸水（200ml×３），飽和炭酸
水素ナトリウム水（200ml×３），水（200ml×
３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
溶媒を減圧で留去したのち、残留物にエーテル
300mlを加えて粉末として、ろ取する。収量44.5
ｇ（66.8％），m.p.125−127℃，〔α〕２５ Ｄ−6.0゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.62，C28H39O8N5Sとし
ての元素分析計算値：C55.52；H6.49；N11.56；
S5.27，実験値：C55.71；H6.49；N11.81；S5.29 (10) Ｚ―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OButの製造 Ｚ―Arg（MBS）―Ala―OBut43ｇをメタノー
ル500mlに溶かし、５時間還元したのち、濃縮す
る。残留物をDMF200mlに溶かし、Ｚ―Arg
（MBS）―OH（Ｚ―Arg（MBS）―OH・
DCHA49.7ｇより調製），HONB14.0ｇを加え氷
冷し、DCC16.1ｇを加えて、15時間かき混ぜる。
析出したDCUをろ去した後、濃縮し、残留物を
クロロホルム500mlに溶かす。これを10％クエン
酸水（300ml×３），飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３），水（300ml×３）の順に洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去し
たのち、メタノール300mlを加えて、結晶として
ろ取し、メタノールより再結晶する。収量52.4ｇ
（79.2％），m.p.116−118℃，〔α〕２５ Ｄ−8.8゜（
ｃ＝
1.0，DMF中），Rf10.42，C41H57O12N9S2・2H2O
としての元素分析計算値：c50.86；H6.35；
N13.02；S6.62，実験値：C51.05；H6.08；
N13.11；S6.62 (11) Boc―Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―
Ala―OButの製造 Ｚ―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OBut30.OgをDMF80ml，メタノール300mlの混液
に溶かし、７時間接触還元する。触媒をろ去し、
メタノールを減圧で留去したのち、これにBoc―
Ser―OH7.3ｇ，HONB6.3ｇを加え、氷冷し、
DCC7.3ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、溶媒を減圧で留去し、残留物を
クロロムホルム500mlに溶かす。これを飽和炭酸
水素ナトリウム（300ml×２），水（300ml×２）
で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を
減圧で留去したのち、クロロホルム30mlにとかし
シリカゲルのカラム（400ｇ）につける。クロロ
ホルム：メタノール：酢酸（９：0.7：0.35）の
溶媒で展開し、800mlから２までの画分を集め
て、濃縮し、エーテルを加えて粉末とする。収量
25.5ｇ（79.0％），m.p.85−88℃，〔α〕２６ Ｄ−20.9
゜
（ｃ＝1.0，メタノール中），Rf10.33，
C41H64O14N10S2・H2Oとしての元素分析計算値：
C49.09；H6.63；N13.96；S6.39，実験値：
C48.96；H6.55；N13.70；S5.84 (12) Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―OHの製造 Boc―Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala
―OBut10.5ｇにTFA50mlを加え、室温で60分振
り混ぜた後、濃縮し、エーテル300mlを加えて粉
末としてろ取する。これをDMF50mlに溶かし、
TEA4.1ml，Boc―Asp（OBzl）・ONB（Boc―
Asp（OBzl）・OH3.40ｇ，HONB1.97ｇ，
DCC2.27ｇより調製）を加えて15時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸水
を加えて、粉末として、ろ取し乾燥する。これを
アセトニトリル・エーテルより再沈澱する。収量
6.0ｇ（51.5％），m.p.126−130℃，〔α〕２４ Ｄ＋3.5
゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.17，C48H67O17N11S2・
2H2Oとしての元素分析計算値：C49.26；
H6.12；N13.17；S5.48，実験値：C49.62；
H5.84；N13.00；S5.03 (13) Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln
―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl
の製造 Boc―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl3.25
ｇにTFA25mlを加え、室温で15分間ふり混ぜた
後、濃縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉
末として、ろ取し、乾燥する。これをNMP10ml
に溶かし、TEA2ml加えてよく振り混ぜたのち、
エーテル100mlを加え、粉末として再びろ取す
る。これをDMF100mlに溶かし、さらにBoc―
Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp―
OH4.80ｇ，HONB2.70ｇを加えて溶かしたの
ち、氷冷し、DCC1.55ｇを加えて58時間かき混ぜ
ると反応液がゲル状になる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物を含水アセトニトリルで十分に洗
浄する。収量5.75ｇ（76.8％），m.p.23.4℃（分
解）〔α〕２６ Ｄ−15.8゜（ｃ＝0.4，酢酸中），
Rf20.63，C77H104O20N14Sとしての元素分析計算
値：C58.61；H6.64；N12.43；S2.03，実験値：
C59.13；H6.96；N12.40；S1.70 (14) Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―Gln―Asp（OBzl）―phe
―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―
Thr―OBzlの製造 Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―
Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl5.20ｇ
にアニソール１mlを加え、さらに窒素気流中、
TFA35mlを加えて、室温で15分間かき混ぜ、濃
縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉末とし
てろ取する。これをNMP20mlにとかし、
TEA2.77mlを加えて十分に振り混ぜたのち、エ
ーテル200mlを加えて、粉末としてろ取する。こ
れをDMF150mlに溶かし、Boc―Asp（OBzl）―
Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OH3.66ｇ，HONB2.36ｇを加え、氷、食塩で−
10℃り冷却し、DCC1.02ｇを加える。反応液を０
℃で10時間、室温で24時間かき混ぜたのち、析出
したDCUをろ去し、溶媒を減圧で留去する。残
留物に水50mlを加えて粉末としてろ取したのち、
含水アセトニトリルで十分に洗浄する。収量5.3
ｇ（61.1％），m.p.237℃（分解），〔α〕２６ Ｄ−7.1
゜
（ｃ＝0.9，酢酸中），Rf20.63，
C120H161O34N25S3・2H2Oとしての元素分析計算
値：C54.82；H6.32；N13.32；S3.57，実験値：
C54.47；H6.16；N13.07；S3.47 (15) Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）
―Asn―Thr―OHの製造 Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―Gln―Asp（OBzl）―Phe―
Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―
OBzl400mgにアニソール0.25mlを加え、これにメ
タンスルホン酸５mlを加えて、室温で60分振り混
ぜた後、エーテル100mlを加えて油状物を沈澱さ
せる。エーテルを傾斜法で除いたのち、残留物を
水10mlとかし、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通し、溶出液（液量
50ml）を氷冷し、3Nアンモニア水10mlを加えて
０℃で30分間かき混ぜたのち、凍結乾燥する。こ
れを水30mlにとかし、CMCのカラム（2.2×18
cm）に付し、水（500ml）から0.2M酢酸アンモニ
ア水（500ml）までの線型勾配法で溶出し、150ml
から195mlまでの画分を集めて凍結乾燥する。収
量150mg。次にこれを水20mlに溶かし、アンバー
ライトXAD―２のカラム（1.6×５cm）に付し、
水（200ml）から80％エタノール（200ml）までの
線型勾配法で溶出し、180mlから225mlまでの画分
を集め、エタノールを留去したのち、凍結乾燥す
る。収量115mg，〔α〕２４ Ｄ−33.6゜（ｃ＝0.6，50％
酢酸水中），Rf30.54（アビセル），アミノ酸分析
（４％チオグリコール酸5.7N―塩酸加水分解）：
Arg2.03(2)；Trp0.87(1)；Asp3.03(3)；Thr0.97
(1)；Ser0.73(1)；Glu2.13(2)；Ala.1.00(1)；Val1.03
(1)；Met1.00(1)；Leu1.03(1)；Phe1.03(1)，（ペプ
チド含量85.7％） (16) Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met―Asn
―Thr―OH（glucagon（15―29））の製造 Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―Asp―
Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―
Thr―OH225mgを５％チオグリコール酸水20mlに
溶かし、50℃で20時間放置するとゲルが析出す
る。水を減圧で留去したのち、残留物を50％酢酸
５mlに溶かし、セフアデツクスＧ―25のカラム
（2.3×118cm）に付す。50％酢酸水で溶出し、180
mlから240mlまでの画分を集て凍結乾燥する。収
量220mg，〔α〕２４ Ｄ−30.0゜（ｃ＝0.3，50％酢酸水
中），Rf30.59（アビセル），アミノ酸分析（４％
チオグリコール酸，5.7N―塩酸加水分解）：
Arg2.15(2)；Trp0.91(1)；Asp3.13(3)；Thr0.99
(1)；Ser0.87(1)；Gln2.20(2)；Ala1.05(1)；Val0.96
(1)；Met1.00(1)；Leu1.07(1)；Phe1.07(1)；ペプチ
ド含量79.3％ 参考例 ２ glucagon（15―29）とBSAとの結合体の製造 グルカゴン（15―29）10mg，BBA20mgを0.2M
リン酸緩衝液（PH7.3）４mlに溶かし、５％グル
タルアルデヒド水溶液４mlを加えて、室温で３時
間かき混ぜた後、４℃で透析（水２×４）し、
凍結乾燥する。収量38mg。 上記で得られた凍結乾燥物〔グルカゴン（15―
29）とBSAの縮合物〕及びBSAのアミノ酸分析
（各１mgを6N―HCl1ml中で110℃，24時間加水分
解）の測定結果を次表に示す。
をするホルモンであるが、その血中濃度の測定は
従つて臨床上極めて重要である。本出願は本ホル
モン，特に膵臓由来のグルカゴンの血中濃度の測
定に有用なイムノアツセイ用抗体の製造法に関す
るものである。 グルカゴンには化学構造上類似しているといわ
れる膵グルカゴン と腸管グルカゴンが存在し、血糖値に影響するも
のは主として膵グルカゴンとされている。従つて
臨床的に必要な測定値は主として膵由来グルカゴ
ンの血中濃度であるが、従来、入手可能な膵グル
カゴンと牛血清アルブミンとの縮合物による抗体
の作成操作によつては、膵グルカゴンに特異性を
持つ臨床応用可能な抗体の生成は極くまれであ
り、主として膵グルカゴンと腸管グルカゴンの両
者と交叉する抗体が得られることは良く知られて
いる所である。本発明者らは、膵グルカゴンに特
異的な抗体を作成することが出来る抗原の製造を
目的とし、種々のペプチドを合成して、検討した
結果、グルカゴンの15番からＣ一端に至るペンタ
デカペプチドが本目的に極めて有用なものである
という予期せざる新知見を得、本発明を完成した
ものである。 本発明はＨ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―
Gln―Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met―
Asn―Thr―OHで表わされる新規ペプチド
（Ｉ）と牛血清アルブミンとをグルタルアルデヒ
ドで縮合せしめ、その縮合生成物を哺乳動物に投
与することを特徴とする膵グルカゴンに特異的な
抗体を製造する方法に関する。 本明細書において、アミノ酸，ペプチド，保護
基，活性基，その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC―IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Arg：アルギニン Trp：トリプトフアン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ser：セリン Glu：グルタミン酸 Gln：グルタミン Ala：アラニン Val：バリン Met：メチオニン Met（ｏ）：スチオニンスルフオキシド Leu：ロイシン Phe：フエニルアラニン Tyr：チロシン Lys：リジン His：ヒスチジン Pro：プロリン Gly：グリシン Ile：イソロイシン Cys：シスチン Ｚ ：カルボペンゾキシ Boc：ｔ―ブチルオキシカルボニル OBut：ｔ―ブチルエステル OBzl：ベンジルエステル ONB：Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネン―
２，３―ジカルボキシイミドエステル MBS：Ｎ―ヒドロキシ―ｐ―メトキシベンゼ
ンスルホニル HONB：５―ノルボルネン―２，３―ジカルボ
キシイミド DCC：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド DCU：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルウレア DMF：Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド NMP：Ｎ―メチル―２―ピロリドン TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン TEA：トリエチルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン CMC：カルボキシメチルセルロース BSA：牛血清アルブミン 本発明で用いるペプチド（Ｉ）は、ペプチド合
成の常套手段で製造しうる。固相合成法，液相合
成法のいずれによつてもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段
はたとえば、“The Peptides”，第１巻（1966），
Schroder and Lubke著，Academic Press，
New York，U.S.A.あるいは“ペプチド合成”，
泉屋ら著，丸善株式会社（1975年）に記載されて
おり、たとえばアジド法，クロライド法，酸無水
物法，混酸無水物法，DCC法，活性エステル
法，ウツドワード試薬Ｋを用いる方法，カルボジ
イミダゾール法，酸化還元法，DCC／アデイテ
イブ（例、HONB，HOBt，HOSu）法などがあ
げられる。 本発明で用いるペプチド（Ｉ）は、そのペプチ
ド結合の任意の位置で２分される２種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料をペプチド合成の常套手
段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する
場合、その保護基を常套手段で脱離させることに
より製造しうる。 ペプチド（Ｉ）を製造する反応工程で、Aspは
通常保護しておくのが望ましい場合が多く、最終
工程としてはペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸残基
の少くとも一つが保護された保護ペプチド（Ｉ）
から保護基をすべて脱離することにより製造しう
る場合が多い。 原料の反応に関与すべきでない管能基の保護お
よび保護基，ならびにその保護基の脱離、反応に
関与する官能基の活性化などもまた公知のものあ
るいは手段から適宜選択しうる。 原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカ
ルボベンゾキシ，ｔ―ブチルオキシカルボニル，
ｔ―アミルオキシカルボニル，イソボルニルオキ
シカルボニル，ｐ―メトキシベンジルオキシカル
ボニル，２―クロル―ベンジルオキシカルボニ
ル，アダマンチルオキシカルボニル，トリフルオ
ロアセチル，フタリル，ホルミル，ｏ―ニトロフ
エニルスルフエニル，ジフエニルホスフイノチオ
イルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基
としては、たとえばアルキルエステル（例、メチ
ル，エチル，プロピル，ブチル，ｔ―ブチルなど
のエステル基），ベンジルエステル基，ｐ―ニト
ロベンジルエステル基，ｐ―メトキシベンジルエ
ステル基，ｐ―クロルベンジルエステル基，ベン
ズヒドリルエステル基，カルボベンゾキシヒドラ
ジド基，ｔ―ブチルオキシカルボニルヒドラジド
基，トリチルヒドラジド基などがあげられる。 アルギニンのグアニジノ基の保護基としては、
たとえばニトロ基，トシル基，ｐ―メトキシベン
ゼンスルホニル基，カルボベンゾキシ，イソボル
ニルオキシカルボニル，アダマンチルオキシカル
ボニル等が例示される。また、そのグアニジノ基
は、酸（例、ベンゼンスルホン酸，トルエンスル
ホン酸，塩酸，硫酸など）塩の形で保護してもよ
い。 スレオニンの水酸基は、たとえばエステル化ま
たはエーテル化によつて保護することができる。
このエステル化に適する基としてはたとえばアセ
チル基などの低級アルカノイル基，ベンゾイル基
などのアロイル基，ベンジルオキシカルボニル
基，エチルオキシカルボニル基などの炭酸から誘
導される基などがあげられる。またエーテル化に
適する基としては、たとえばベンジル基，テトラ
ヒドロピラニル基，ｔ―ブチル基などである。し
かしながらスレオニンの水酸基は必ずしも保護す
る必要はない。メチオニンはスルホキサイドの形
で保護しておいてもよい。原料のカルボキシル基
の活性化されたものとしては、たとえば対応する
酸無水物，アジド，活性エステル（ペンタクロロ
フエノール，ｐ―ニテトロフエノール，Ｎ―ハイ
ドロキシサクシンイミド、Ｎ―ハイドロキシベン
ズトリアゾール，Ｎ―ハイドロキシ―５―ノルボ
ルネン―２，３―ジカルボキシイミドなどとのエ
ステル）などがあげられる。ペプタイド結合形成
反応は脱水剤（例、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド，カルボジイミダゾール等のカルボジイミド
試薬）の存在下に実施しうる場合がある。 本ペプタイド縮合反応は溶媒の存在下に行うこ
とができる。溶媒としては、ペプタイド縮合反応
に使用しうることが知られているものから適宜選
択されうる。たとえば無水または含水のジメチル
ホルムアミド，ジメチルスルホキサイド，ピリジ
ン，クロロホルム，ジオキサン，ジクロルメタ
ン，テトラハイドロフラン，酢酸エチル，Ｎ―メ
チルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物な
どがあげられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用されう
ることが知られている範囲から適宜選択され、通
常約−40℃−約60℃，好ましくは約−20℃−約０
℃の範囲から適宜選択される。 本縮合反応終了後、生成物が保護基を有してい
る場合、それは常法により離脱できる。かかる常
法としては、たとえば還元的方法（例、パラジウ
ム黒等の触媒を用いる水素添加，液体アンモニア
中金属ナトリウムによる還元），アシドリシス
（例、トリフルオロ酢酸，フツ化水素，メタンス
ルホン酸等の強酸によるアシドリシス）などがあ
げられる。 上記のようにして製造されたペプチド（Ｉ）は
反応終了混合物から、ペプチドの分離手段，抽
出，分配，カラムクロマトグラフイーなどにより
採取できる。 ペプチド（Ｉ）はアルギニン残基を有するの
で、塩としても採取しうる。塩を形成しうる酸と
しては、たとえば塩酸，臭化水素酸，硝酸，硫
酸，リン酸などの無機酸，あるいはたとえばギ
酸，酢酸，プロピオン酸，乳酸，クエン酸，シウ
酸，マレイン酸などの有機酸があげられる。 本発明で用いるペプチド（Ｉ）を製造しうる原
料もまた前記ペプチド合成の常套手段で、そのア
ミノ酸配列にしたがつて各々のアミノ酸を順次縮
合させることにより製造しうる。 この様にして得られたペンタデカペプチド
（Ｉ）と牛血清アルブミンとの縮合は公知のグル
タルアルデヒド法［例、PROCEEDINGS OF
THE SOCIETY FOR Experimental Biology
and Medicine，128，347―350（1968）］によつ
て実施しうる。牛血清アルブミンは、抗原のキヤ
リアーとして使用するものであり、場合により同
様の目的に使用しうる他の蛋白質で代替しうる場
合もありうる。ペンタデカペプチド（Ｉ）と牛血
清アルブミンの使用量比は10mg対約20mgが最適で
あり、反応PHは7.3前後が良効な結果を与える場
合が多い。また反応時間は室温で２〜６時間がよ
い場合が多いが、特に３時間前後が適当な場合が
多い。 この様にして作成した縮合生成物は常套手段で
４℃前後で水に対して透折し、凍結乾燥して保存
することができる。 以上の様にして製造した本発明の縮合生成物
は、種々の哺乳動物（例、ウサギ，マウス）に常
法に従つて投与することによつて効率よく膵グル
カゴンに対し特異的な、しかも反応性のよい抗体
を産生することができる。ペプチド（Ｉ）は、抗
体産生するに有効な量でよく、たとえばウサギに
１回約２mgの皮下投与を２週間おきに５回行うと
抗体を産生しうる場合もある。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、メルク社製シリカゲルプレート60F254又
は、フナコシ薬品社製 セルロースプレート，ア
ビセルSFを用い、下記の展開溶媒を用いた。 Rf1：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf2：クロロホルム：メタノール：水＝７：
３：0.5 Rf3：ｎ―ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 参考例 １ (1) Boc―Asn―Thr OBzlの製法。 Boc―Thr OBzl 112ｇをTFA300mlに溶かし、
室温で20分間振り混ぜた後、濃塩酸30mlを加え、
溶液を減圧濃縮する。残留物をTHF1に溶か
し、氷冷し、TEA50mlを加えて中和する。これ
にBoc―Asn―OH 76.7ｇ，HONB64.5ｇ，
DCC74.3ｇを加えて15時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去した後、溶媒を減圧で留去し、残留
物を酢酸エチル１に溶かす。これを10％クエン
酸水（300ml×３），飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３），水（300ml×３）で順次洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去
した後、残留物にエーテル（１）に加えて、粉
末として、ろ取した後、アセトニトリルより再結
晶する。収量105.1ｇ（75.2％）mp 165―166℃
〔α〕２３ Ｄ−13.9゜（ｃ＝0.9，DMF中），Rf10.51，
C20H29O7N3としての元素分析計算値：C56.72；
H6.90；N9.92，実験値：C57.01；H6.89；N9.94 (2) Boc―Met（ｏ）―Asn―Thr―OBzlの製造 Boc―Asn―Thr―OBzl 50.0ｇにTFA170mlを
加えて、室温で30分間振り混ぜた後、濃縮しエー
テル500mlを加えて粉末としてろ取し、乾燥す
る。これをTHF400mlに溶かし、氷冷しTEA20ml
を加えた後、Boc―Met（Ｏ）―ONB（Boc―Met
（Ｏ）・OH31.3ｇ，HONB23.3ｇをTHF200mlに溶
解し、氷冷し、DCC26.8ｇを加えて、４時間かき
混ぜて調製する。）を加え、15時間かき混ぜる。
溶媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸エチル
（200ml），エーテル（200ml）を加え、粉末として
ろ取し、アセトニトリルより再沈澱する。収量
48.5ｇ（72.0％），mp.145−147℃〔α〕２３ Ｄ―6.5
（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.19，C25H38O9N4Sとし
ての元素分析計算値：C52.62；H6.71；N9.82；
S5.62，実験値：C52.44；H6.73；N9.60；S5.15 (3) Boc―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzlの
製法 Boc―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl15.0ｇに
TFA45mlを加え、室温で45分間振り混ぜた後、
濃縮し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取
し、乾燥する。これをDMF50mlに溶解し、氷冷
し、TEA5.7mlを加え、これにBoc―Leu―ONB
（Boc―Leu―OH6.69ｇ，HONB5.70ｇ，DCC6.56
ｇより調製）を加えて、15時間かき混ぜる。溶媒
を減圧で留去した後、残留物に酢酸エチル200ml
を加えて、粉末としてろ取し、アセトニトリル―
酢酸エチルより再沈澱する。収量15.0ｇ（83.4
％），m.p.134−136℃，〔α〕２４ Ｄ−15.1゜（ｃ＝
1.0，DMF中），Rf10.25，C13H49O10N5Sとしての
元素分析計算値：C54.45；H7.22；N10.24；
S4.69，実験値：C54.62；H7.60；N9.89；S3.95 (4) Ｚ―Cln―Trp―OBzlの製造 Ｈ―Trp―OBzl・パラトルエンスルホン酸塩
50.0ｇをTHF500mlに溶かし、氷冷し、TEA15.4
ml，Ｚ―Gln―OH28.0ｇ，HONB19.7ｇ，
DCC22.7ｇを加えて、15時間かき混ぜる。析出し
たDCUをろ去した後、濃縮し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶かす。これを飽和炭酸水素ナトリ
ウム水（150ml×２），10％クエン酸（150ml×
２），水（150ml×２）で順次洗浄する。溶媒を減
圧で留去した後、残留物をTHF300mlに溶かし、
不溶物をろ去する。これを濃縮した後、エーテル
500mlを加えて、粉末としてろ取し、アセトニト
リルより再結晶する。収量46.1ｇ（82.8％），
〔α〕２３ Ｄ＋5.8゜（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.60，
C31H32O6N4としての元素分析計算値：C66.89；
H5.80；N10.07，実験値：C66.79；H5.71；
N10.20 (5) Ｚ―Val―Gln―Trp―OHの製造 Ｚ―Gln―Trp―OBzl50.0ｇをメタノール700ml
に溶かし、５時間接触還元（触媒：パラジウム
黒）すると、結晶が析出するので、これをろ取す
る。これをDMF300mlに懸濁し、TEAl3mlを加え
て溶かし、触媒をろ去する。これにＺ―Val―
ONB37.0ｇを加えて、10時間かき混ぜた後、1N
―塩酸100mlを加えて中和し、さらに水500mlを加
えて、粉末としてろ取する。これをメタノールで
十分洗浄する。収量43.0ｇ（84.7％），m.p.246−
247℃〔α〕２３ Ｄ＋12.4゜（ｃ＝0.9，DMF中），
Rf10.14，C29H35O7N5としての元素分析計算値：
C61.58；H6.24；N12.38実験値：C61.86；
H6.30；N12.36 (6) Ｚ―Phe―Val―Gln―Trp―OHの製造 Ｚ―Val―Gln―Trp―OH5.1ｇを酢酸100mlに
溶かし、３時間接触還元したのち触媒をろ去し、
濃縮する。これをDMF200mlに懸濁し、これに
TEA2ml，Ｚ―Phe―OH2.70ｇより調製したＺ―
Phe―ONBを加えて、７時間かき混ぜる。溶媒を
減圧で留去し、残留物に酢酸水を加えてゲルとし
てろ取する。これをメタノールより再沈澱する。
収量5.50ｇ（84.5％），m.p.240℃，〔α〕２４ Ｄ＋4.1
゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.15，C38H44O8N6・1/2
H2Oとしての元素分析計算値：C63.23；H6.28；
N11.64，実験値：C63.11；H6.29；N11.80 (7) Boc―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp
―OHの製造 Ｚ―Phe―Val―Gln―Trp―OH8.5ｇを、
DMF150ml，酢酸50mlの混液に溶かし、５時間接
触還元する。触媒をろ去した後、濃縮し、残留物
にメタノール100mlを加えて結晶としてろ取す
る。これを、DMF200mlに懸濁し、TEA3.0ml，
Boc―Asp（OBzl）ONB（Boc―Asp（OBzl）―
OH3.9ｇ，HONB2.4ｇ，DCC2.7ｇより調製）を
加えて、10時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物に酢酸水を加えて、ゲルとしてろ
取し、DMF，水より再沈澱する。収量6.3ｇ
（58.1％），m.p.191―192℃（分解），〔α〕２４ Ｄ−
6.2
゜（ｃ＝1.1，DMF中），Rf10.11C46H57O11N7・3/
２H2Oとしての元素分析計算値：C60.64；
H6.63；N10.76，実験値：C60.30；H6.48；
N11.34 (8) Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln
―Trp―OHの製造 Boc―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp―
OH6.0ｇに、TFA50mlを窒素気流中加え、10分
間ふり混ぜた後、濃縮しエーテルを加えて粉末と
してろ取する。これをDMF100mlに溶かし、
TEA2.0mlを加え、Boc―Gln―ONB（Boc―Gln
―OH1.76ｇ，HONB1.34ｇ，DCCl.54ｇから調
製）を加えて、15時間かき混ぜる。これに酢酸水
を加えて、粉末として、ろ取したのち、アセトニ
トリル，水より再沈澱する。収量5.50ｇ（82.6
％）、m.p.210−212℃（分解），〔α〕２４ Ｄ−10.1゜
（ｃ＝1.1，DMF中）Rf10.09，C51H65O13N9として
の元素分析計算値：C60.52；H6.47；N12.46，実
験値：C60.19；H6.37；N12.23 (9) Ｚ―Arg（MBS）―Ala―OButの製造 Ｚ―Ala―OBut31.0ｇをメタノール300mlに溶
かし、５時間接触還元した後、触媒をろ去し、濃
縮する。一方、Ｚ―Arg（MBS）―OH・DC
HA53.0ｇを酢酸エチル500mlに懸濁し、10％クエ
ン酸200mlを加えて、よく振り混ぜた後、水洗
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。これを
THF500mlに溶かし、これに、先に調製したＨ―
Ala―OButを加えHONB14.9ｇを加えて氷冷し、
DCC17.1ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、濃縮した後、酢酸エチル500mlに
溶かし、10％クエン酸水（200ml×３），飽和炭酸
水素ナトリウム水（200ml×３），水（200ml×
３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
溶媒を減圧で留去したのち、残留物にエーテル
300mlを加えて粉末として、ろ取する。収量44.5
ｇ（66.8％），m.p.125−127℃，〔α〕２５ Ｄ−6.0゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.62，C28H39O8N5Sとし
ての元素分析計算値：C55.52；H6.49；N11.56；
S5.27，実験値：C55.71；H6.49；N11.81；S5.29 (10) Ｚ―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OButの製造 Ｚ―Arg（MBS）―Ala―OBut43ｇをメタノー
ル500mlに溶かし、５時間還元したのち、濃縮す
る。残留物をDMF200mlに溶かし、Ｚ―Arg
（MBS）―OH（Ｚ―Arg（MBS）―OH・
DCHA49.7ｇより調製），HONB14.0ｇを加え氷
冷し、DCC16.1ｇを加えて、15時間かき混ぜる。
析出したDCUをろ去した後、濃縮し、残留物を
クロロホルム500mlに溶かす。これを10％クエン
酸水（300ml×３），飽和炭酸水素ナトリウム水
（300ml×３），水（300ml×３）の順に洗浄し、硫
酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧で留去し
たのち、メタノール300mlを加えて、結晶として
ろ取し、メタノールより再結晶する。収量52.4ｇ
（79.2％），m.p.116−118℃，〔α〕２５ Ｄ−8.8゜（
ｃ＝
1.0，DMF中），Rf10.42，C41H57O12N9S2・2H2O
としての元素分析計算値：c50.86；H6.35；
N13.02；S6.62，実験値：C51.05；H6.08；
N13.11；S6.62 (11) Boc―Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―
Ala―OButの製造 Ｚ―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OBut30.OgをDMF80ml，メタノール300mlの混液
に溶かし、７時間接触還元する。触媒をろ去し、
メタノールを減圧で留去したのち、これにBoc―
Ser―OH7.3ｇ，HONB6.3ｇを加え、氷冷し、
DCC7.3ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出した
DCUをろ去し、溶媒を減圧で留去し、残留物を
クロロムホルム500mlに溶かす。これを飽和炭酸
水素ナトリウム（300ml×２），水（300ml×２）
で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を
減圧で留去したのち、クロロホルム30mlにとかし
シリカゲルのカラム（400ｇ）につける。クロロ
ホルム：メタノール：酢酸（９：0.7：0.35）の
溶媒で展開し、800mlから２までの画分を集め
て、濃縮し、エーテルを加えて粉末とする。収量
25.5ｇ（79.0％），m.p.85−88℃，〔α〕２６ Ｄ−20.9
゜
（ｃ＝1.0，メタノール中），Rf10.33，
C41H64O14N10S2・H2Oとしての元素分析計算値：
C49.09；H6.63；N13.96；S6.39，実験値：
C48.96；H6.55；N13.70；S5.84 (12) Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―OHの製造 Boc―Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala
―OBut10.5ｇにTFA50mlを加え、室温で60分振
り混ぜた後、濃縮し、エーテル300mlを加えて粉
末としてろ取する。これをDMF50mlに溶かし、
TEA4.1ml，Boc―Asp（OBzl）・ONB（Boc―
Asp（OBzl）・OH3.40ｇ，HONB1.97ｇ，
DCC2.27ｇより調製）を加えて15時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸水
を加えて、粉末として、ろ取し乾燥する。これを
アセトニトリル・エーテルより再沈澱する。収量
6.0ｇ（51.5％），m.p.126−130℃，〔α〕２４ Ｄ＋3.5
゜
（ｃ＝1.0，DMF中），Rf10.17，C48H67O17N11S2・
2H2Oとしての元素分析計算値：C49.26；
H6.12；N13.17；S5.48，実験値：C49.62；
H5.84；N13.00；S5.03 (13) Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln
―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl
の製造 Boc―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl3.25
ｇにTFA25mlを加え、室温で15分間ふり混ぜた
後、濃縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉
末として、ろ取し、乾燥する。これをNMP10ml
に溶かし、TEA2ml加えてよく振り混ぜたのち、
エーテル100mlを加え、粉末として再びろ取す
る。これをDMF100mlに溶かし、さらにBoc―
Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―Trp―
OH4.80ｇ，HONB2.70ｇを加えて溶かしたの
ち、氷冷し、DCC1.55ｇを加えて58時間かき混ぜ
ると反応液がゲル状になる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物を含水アセトニトリルで十分に洗
浄する。収量5.75ｇ（76.8％），m.p.23.4℃（分
解）〔α〕２６ Ｄ−15.8゜（ｃ＝0.4，酢酸中），
Rf20.63，C77H104O20N14Sとしての元素分析計算
値：C58.61；H6.64；N12.43；S2.03，実験値：
C59.13；H6.96；N12.40；S1.70 (14) Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―Gln―Asp（OBzl）―phe
―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―
Thr―OBzlの製造 Boc―Gln―Asp（OBzl）―Phe―Val―Gln―
Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―OBzl5.20ｇ
にアニソール１mlを加え、さらに窒素気流中、
TFA35mlを加えて、室温で15分間かき混ぜ、濃
縮し、残留物にエーテル100mlを加えて粉末とし
てろ取する。これをNMP20mlにとかし、
TEA2.77mlを加えて十分に振り混ぜたのち、エ
ーテル200mlを加えて、粉末としてろ取する。こ
れをDMF150mlに溶かし、Boc―Asp（OBzl）―
Ser―Arg（MBS）―Arg（MBS）―Ala―
OH3.66ｇ，HONB2.36ｇを加え、氷、食塩で−
10℃り冷却し、DCC1.02ｇを加える。反応液を０
℃で10時間、室温で24時間かき混ぜたのち、析出
したDCUをろ去し、溶媒を減圧で留去する。残
留物に水50mlを加えて粉末としてろ取したのち、
含水アセトニトリルで十分に洗浄する。収量5.3
ｇ（61.1％），m.p.237℃（分解），〔α〕２６ Ｄ−7.1
゜
（ｃ＝0.9，酢酸中），Rf20.63，
C120H161O34N25S3・2H2Oとしての元素分析計算
値：C54.82；H6.32；N13.32；S3.57，実験値：
C54.47；H6.16；N13.07；S3.47 (15) Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）
―Asn―Thr―OHの製造 Boc―Asp（OBzl）―Ser―Arg（MBS）―
Arg（MBS）―Ala―Gln―Asp（OBzl）―Phe―
Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―Thr―
OBzl400mgにアニソール0.25mlを加え、これにメ
タンスルホン酸５mlを加えて、室温で60分振り混
ぜた後、エーテル100mlを加えて油状物を沈澱さ
せる。エーテルを傾斜法で除いたのち、残留物を
水10mlとかし、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通し、溶出液（液量
50ml）を氷冷し、3Nアンモニア水10mlを加えて
０℃で30分間かき混ぜたのち、凍結乾燥する。こ
れを水30mlにとかし、CMCのカラム（2.2×18
cm）に付し、水（500ml）から0.2M酢酸アンモニ
ア水（500ml）までの線型勾配法で溶出し、150ml
から195mlまでの画分を集めて凍結乾燥する。収
量150mg。次にこれを水20mlに溶かし、アンバー
ライトXAD―２のカラム（1.6×５cm）に付し、
水（200ml）から80％エタノール（200ml）までの
線型勾配法で溶出し、180mlから225mlまでの画分
を集め、エタノールを留去したのち、凍結乾燥す
る。収量115mg，〔α〕２４ Ｄ−33.6゜（ｃ＝0.6，50％
酢酸水中），Rf30.54（アビセル），アミノ酸分析
（４％チオグリコール酸5.7N―塩酸加水分解）：
Arg2.03(2)；Trp0.87(1)；Asp3.03(3)；Thr0.97
(1)；Ser0.73(1)；Glu2.13(2)；Ala.1.00(1)；Val1.03
(1)；Met1.00(1)；Leu1.03(1)；Phe1.03(1)，（ペプ
チド含量85.7％） (16) Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met―Asn
―Thr―OH（glucagon（15―29））の製造 Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―Asp―
Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met（Ｏ）―Asn―
Thr―OH225mgを５％チオグリコール酸水20mlに
溶かし、50℃で20時間放置するとゲルが析出す
る。水を減圧で留去したのち、残留物を50％酢酸
５mlに溶かし、セフアデツクスＧ―25のカラム
（2.3×118cm）に付す。50％酢酸水で溶出し、180
mlから240mlまでの画分を集て凍結乾燥する。収
量220mg，〔α〕２４ Ｄ−30.0゜（ｃ＝0.3，50％酢酸水
中），Rf30.59（アビセル），アミノ酸分析（４％
チオグリコール酸，5.7N―塩酸加水分解）：
Arg2.15(2)；Trp0.91(1)；Asp3.13(3)；Thr0.99
(1)；Ser0.87(1)；Gln2.20(2)；Ala1.05(1)；Val0.96
(1)；Met1.00(1)；Leu1.07(1)；Phe1.07(1)；ペプチ
ド含量79.3％ 参考例 ２ glucagon（15―29）とBSAとの結合体の製造 グルカゴン（15―29）10mg，BBA20mgを0.2M
リン酸緩衝液（PH7.3）４mlに溶かし、５％グル
タルアルデヒド水溶液４mlを加えて、室温で３時
間かき混ぜた後、４℃で透析（水２×４）し、
凍結乾燥する。収量38mg。 上記で得られた凍結乾燥物〔グルカゴン（15―
29）とBSAの縮合物〕及びBSAのアミノ酸分析
（各１mgを6N―HCl1ml中で110℃，24時間加水分
解）の測定結果を次表に示す。
【表】
【表】
上記のアミノ酸分析の結果は、BSA1分子に対
しグルカゴン（15―29）の約10分子が縮合してい
ることを示す。また、本縮合物は約270〜300℃の
分解点を示す。 実施例 １ 抗体の製造法。 参考例２と同様な方法で製造したグルカゴン
（15―29）と牛血清の結合物８mg（グルカゴン
（15―29）２mgを、牛血清と結合したもの）を蒸
留水１mlに溶かし、これにフロイント コンプリ
ート アジユバント（Freund complete
adjuvant）１mlを加えてよく混和し、乳剤を作
り、これをウサギの皮下数ケ所に注射する。以上
の操作を３週間おきに５回行ない、最終の注射
後、10日で採血し、Pilot assayを行なう。その
結果、膵グルカゴンと特異的に反応し、腸管グル
カゴンとは反応せず、最終希釈濃度63000倍で使
用可能なグルカゴン抗体を得る事が出来る。又、
この抗体は、各種グルカゴンフラグメント（グル
カゴン（15―23）NH2，グルカゴン（１―14）
OMe，グルカゴン（25―29））とは全く反応しな
い。
しグルカゴン（15―29）の約10分子が縮合してい
ることを示す。また、本縮合物は約270〜300℃の
分解点を示す。 実施例 １ 抗体の製造法。 参考例２と同様な方法で製造したグルカゴン
（15―29）と牛血清の結合物８mg（グルカゴン
（15―29）２mgを、牛血清と結合したもの）を蒸
留水１mlに溶かし、これにフロイント コンプリ
ート アジユバント（Freund complete
adjuvant）１mlを加えてよく混和し、乳剤を作
り、これをウサギの皮下数ケ所に注射する。以上
の操作を３週間おきに５回行ない、最終の注射
後、10日で採血し、Pilot assayを行なう。その
結果、膵グルカゴンと特異的に反応し、腸管グル
カゴンとは反応せず、最終希釈濃度63000倍で使
用可能なグルカゴン抗体を得る事が出来る。又、
この抗体は、各種グルカゴンフラグメント（グル
カゴン（15―23）NH2，グルカゴン（１―14）
OMe，グルカゴン（25―29））とは全く反応しな
い。
Claims (1)
- １ Ｈ―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―Asp
―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―Met―Asn―Thr
―OHで表わされるペプチドと牛血清アルブミン
とをグルタルアルデヒドで縮合せしめた縮合生成
物を哺乳動物に投与することを特徴とする膵グル
カゴンに特異的な抗体を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60251114A JPS61148128A (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 抗体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60251114A JPS61148128A (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 抗体の製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8855677A Division JPS5424868A (en) | 1977-07-22 | 1977-07-22 | Novel glucagon fragment |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61148128A JPS61148128A (ja) | 1986-07-05 |
| JPS6223258B2 true JPS6223258B2 (ja) | 1987-05-22 |
Family
ID=17217859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60251114A Granted JPS61148128A (ja) | 1985-11-08 | 1985-11-08 | 抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61148128A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2568950Y2 (ja) * | 1992-11-20 | 1998-04-22 | 株式会社共立 | 刈払機の刃部カバー |
-
1985
- 1985-11-08 JP JP60251114A patent/JPS61148128A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61148128A (ja) | 1986-07-05 |
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