JPS62247254A - 核酸の塩基配列決定のための信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処理方法に
関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体のａ能や複製のメカニズムを解明するために、
生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこと
となっている。とりわけ。

特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　（もしくはＤＮＡ断片物
、以ド同様）などの核酸の１１！基配列を決定すること
が必要不ＩＩｆ矢なこととなっている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなとの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジ才グラフィーを利用す
るマキサム・ギルバート（＋４ａｘａ鵬−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ　）法およびサンガー・クールソ７　（Ｓａｎｇｅｒ
−（：ｏｕ、１ｓｏｎ）法が知られている。前者のマキ
サム・ギルパート法は、まず、塩基配列を決定しようと
しているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方
の端部に３２　ｐ　’Ｊの放射性同位元素を含む基を結
合させることにより、その対象物を放射性標識物質とし
たのち、化学的なｆ段を利用して鎖状分子の各構成中位
間の結合を塩基特異的に切断する。次に、この操作によ
り得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲル
電気泳動法により分離展開し、多数の切断分解物がそれ
ぞれ分離Ｉｔ＜開されて形成された分離展開パターン（
ただし、視覚的には見ることができない）を得る。この
分離展開パターンをたとえばＸ線フィルム」二に可視化
してそのオートラジオグラフを得、得られたオートラジ
オグラフと各々のＪ！！基特異的切断−［段とから、放
射性同位元素が結合された鎖状分子の端部から一定の位
置関係にある塩基を順次決定し、これにより対象物全て
の＃１基配列を決定することができる。

また、後者のサンカー・クールンノ法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子−と相補的であって、かつ放
射性標識が付！ｊ−されたＤＮＡ合成物を化学的な１段
を利用して１１！、！、（特異的に合成し、この塩基特
異的ＤＮＡ合成物の混合物を用いてＬ記と同様にしてそ
のオートラジオグラフからＩｉ！基配列配列定する方法
である。

本出願人は、Ｊ二記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精
度で行なうことを目的として、それに利用されるオート
ラジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の
写真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄
積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する
方法について既に特許出願している（特開昭５９−８３
０５７号、特願昭５８−２０１２３１４じ−）。ここで
、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであ
り、放射線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体
に吸収させたのち　ｔ＋（視乃至赤外領域の電磁波（励
起光）で励起することにより、放射線エネルギーを蛍光
として放出させることができるものである。この方法に
よれば、露光時間を大幅に短縮化することができ、また
従来より問題となっていた化学カブリ等が発生すること
がない、さらに、放射性標識物質のオートラジオグラフ
は。

・旦放射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積された
のち輝尽光として光電的に読み出されるから、直接にデ
ジタル信号として得たのち適当な記録媒体に保存するこ
とができる。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオートラジ
オグラフについて放射性標識が付榮された核酸の塩基特
異的切断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単に
核酸の塩基特異的断片物と称する）の分＃展開部位（バ
ンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位置を相互に
比較することにより決定されている。よって、オートラ
ジオグラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれて
おり、そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して得られる核酸の塩基配列が解析者によって
異なるなど１１！基配列情報の精度には限界がある。

そこで、本出願人は、Ｌ記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後このデジタル信号−に適当な信１）
処理を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を１゛１動的
に決定する方法についても既に特許出願している（特開
昭５９−１２６５２７号、特願昭５９−８９６１５号、
特願昭６０−２２６０９１号−１特願閑６０−２２６０
９２号等）、オートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、従来の放射線フィルムを利用する場合には一旦オ
ートラジオグラフを該フィルム上にｏｆ視両画像化たの
ち、反射光または透過光を利用して光電的に読み取るこ
とにより得られる。また、蓄積性蛍光体シートを用いる
場合には、オートラジオグラフが蓄積記録された蛍光体
シートを直接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分ａ展開させてＩｉＩられた分離展
開パターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちであ
る。たとえば、試料の作成時において核酸の塩基特異的
断片物の調製、分離がネト分であったり、試料を支持媒
体の各スロットに注入する際に他のスロットの試料が混
入したりすることにより、本来現われるべきではない位
とにバンド（これをゴーストバンドまたはエクストラバ
ンドと呼ぶ）が現われることがある。あるいは試料に放
射性不純物が混入したり、露光過程で自然放射線等の照
射を受けたりすることによりノイズが発生することがあ
る。

また、分１ｌＩＩ展開開始位置付近のバンドの密な領域
においては−・つ一つのバンドが七分に分離していす、
複数のバンドが融合していることがある。

この結果、これらのエクストラバンド、ノイズおよび融
合バンドも含めてバンドの比較同定が行なわれるために
、塩基配列決定に誤差が生じて得られる情報の精度が低
ドしてしまう、このようなノイズあるいはバンドの融合
が発生した場合であっても、そのオートラジオグラフに
対応するデジタル信号を効率良く信り処理して核酸の塩
基配列を品枯Ｉｆｆで１°１動決定することが申まれる
。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフィーを利用して核酸の
塩基配列を自動決定する方法において、ノイズあるいは
バンドの融合が生じている分離展開パターンであっても
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号を好適
に信号処理することにより、核酸の塩基配列を簡易かつ
高精度で自動決定することを実現した。

すなわち１本発明は、放射性標識が付４Ｆされた塩基特
異的ＤＮＡ断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混
合物が支持媒体上に−・次元的方向に分離展開されて形
成された複数の分離展開列のオートラジオグラフに対応
するデジタル信号について信号処理を行なうことにより
、核酸の塩基配列を決定する方法において、 ｌ）分離展開列ごとに分１ｌＩｌ展開力向Ｘに沿った直
線１−で、探索開始点の信号レベル交Ｓおよび信５！ｆ
レベルの悶（Ｍｉｎ（ただし、ｎはＯまたは正の整数で
ある）に基づいて探索開始点に最も近いバンドを一つ探
し出す工程、および ２）悶値見。に基づいて該バンドの領域を求めたのち、
この領域の大きさに基づいて ａ）該バンドは真のバンドであると決定してバンドを検
出する、または ｂ）該バンドは真のバンドではないと決定して上記第一
・工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について−・つのバンドを検
出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体上で分離展開させて得られた分離展開パターンの
オートラジオグラフに対応するデジタル信号について、
分離展開パターンにノイズおよび／または融合バンドが
生じている場合であっても、ノイズをバンドと判断する
ことなく、かつ融合バンドを一つ一つのバンドに分離し
ながらイを正なバンドのみを有効に検出しうる機ス赦を
有する信り処理回路を通すことにより、核酸の塩基配列
を自動的に簡易かつ高精度で得ることができる。

すなわち、ｔめ信号レベルの悶イ１とバンドの大きさに
関する　・定範囲とを設定しておき、まず分離展開方向
に沿った探索線Ｅで閾値を越える信号が見つかった場合
にバンド有りとみなし、次いでこのバンドの大きさが一
定１ｉ囲内である場合に真正な−のバンドと決定するこ
とにより、エキストラバンドＴのノイズをバンドと誤認
することなく、また融合バンドを一つのバンドと読み誤
ることなく、精確にバンドを検出することができる。

特に、バンドの大きさが予め設定された範囲を越えた場
合には悶イめをより大きな値に変更してＬ記操作をやり
直すことにより、ノイズの影響を排除し、融合バンドを
適確に分離しながらバンドを確定することができる。

また、試料の分離展開条件は展開条件等に左右されやす
いために分ｇｌ展開列自体が曲がって蛇行したり、また
支持媒体と写真感光材料もしくは蓄活性蛍光体シートと
を重ね合わせて露光する際に、その東ね合わせがずれた
ためなどによりパターン全体が傾くことが多い、核酸の
塩ノＳ配列を高精度で自動決定するためには一般に、各
分離展開列（レーン）についてそのレーンに精確に沿っ
た一次元波形（プロファイル）を作成することが望まれ
るが、レーンの蛇行あるいはパターンの傾斜が生じてい
る場合にはその作成に際して各レーンを追尾する必要が
ある０本発明によれば、真のバンドおよびその形状を確
定することができるから、この結果を用いて好適にレー
ン追尾を行なうことがＩＩｆ濠である。

そして、検出された真正バンド、さらにはこれに基づく
一次元のプロファイルに対して更に好適な信号処理を行
なうことにより、核酸の塩基配列を簡便かつ高精度で自
動決定することができる。

［発明の構ｊ＆］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付ケされたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基特異的断
片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の断
片物とは長鎖状の分子−の一部分を意味する。たとえば
、１１！基特異的ＤＮＡ断片物ｔシ合物の一種である塩
基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・
キルパート誌に従って、放射性標識が付ＴされたＤＮＡ
を塩基特異的に切断分解することにより得られる。

゛　また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサン
ガー嚇り−ルソン法に従って、ＤＮＡをテンブレー）　
（＃ＰＪ型〕として、放射性標識が付′Ｆされたデオｔ
ジヌクレオシドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素と
を用いて合成することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
中位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、　・方ＲＮＡはアデニン、グア
ニン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法でコ２ｐ、直
４（：、ｎ５．３Ｈ，１２ＫＩなどの放射性同位元素を
保持させることによって付ｑ−される。

試料である放射性標識が付午された核酸の塩基特異的断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー
など種々の分離展開方法により支持媒体上に分離展開さ
れる。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒体につい
て、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性イケ光体シートを用いる放射線像変換方
法によりそのオートラジオグラフが得られ１次いで適ち
な読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルムＴの写真感光材料とを低温もしくは常温
で長時間（数時間〜数ト時間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム１；にｉ＋［親画像化
する０次いで１画像読取装置を用いて放射線フィルムト
に可視化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえ
ば、放射線フィルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オートラジ
オグラフは電気信号として得られる。さらに、この電気
信（）をＡ／Ｄ変換することにより、オートラジオグラ
フに対応するデジタル信号を得ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には。

まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間
（ａ秒〜数七分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性
標識物質から放出される放射線エネルギーを、ＶＭさせ
ることにより、そのオートラジオグラフを蛍光体シート
に一種のＷＩ像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体
シートは、たとえばプラスチックフィルムからなる支持
体、二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢ
ｒ：Ｅｕ２°）ｋｇの輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、
および透明な保護膜がこの順に積層されたものである。

蓄積性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、
Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エネルギーを
吸収して蓄積し、そののち口ｆ視乃至赤外領域の光で励
起すると？Ｓ積していた放射線エネルギーを輝尽光とし
て放出するという特性を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに石積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。囲体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性ｌＩ：！識物質のオート
ラジオグラフは可視画像化することなく直接に電気信号
として得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換す
ることにより、オートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得ることができる。

Ｌ述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
ては、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−１
２６５２７号、特開昭５９５９−１２ｓｚ７；７の各公
報上記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信５）をずする方法として、従来の放射線写真υ、およ
び放射線像変換方法を利用する方法について述べたが、
これらの方法に限定されるものではなく、それ以外の如
何なる方法により得られたデジタル（−ｉシ）であって
も放射性標識物質のオートラジオグラフと対応関係があ
る限り、本発明の信号処理方法を適用することがｉｒ（
能である。

また、］−記いずれの方法においてもオートラジオグラ
フの読取り（または読出し）は、放射線フィルム（また
は蓄積性蛍光体シート）の全面に「（って行なう必要は
なく、画像領域のみについて行なうことも勿論口ＨＥで
ある。

得られたデジタル信号ｏｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（２）
とからなり、一つの信号は・つの画素に対応している。

信号のレベルはその座標における画像Ｃ度、すなわち放
射性標識物質の量を表わしている。従って、一連のデジ
タル信号（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標
識物質の二次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標識物質の
オートラジオグラフに対応するデジタル信号には、以ド
に述べるような本発明の方法により信号処理が施されて
、目的の核酸の塩基配列の決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四種類の放
射性標識が付かされた塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分＃展開列）からなる場合に
ついて説明する。

ｌ）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アテニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３〕チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシンＣＣ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各１１
！基特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もし
くは合成された。すなわち末端の塩基を同じくする種々
の長さのＤＮＡ断片物からなる。

第１図は、Ｌ：、記憶種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物が
それぞれ四つのスロットに電気泳動されてなる泳動パタ
ーンのオートラジオグラフを示す、泳動方向はＸ方向で
ある。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、信
号処理方法において−ｌメモリ（バッファーメモリ、ま
たは磁気ディスク等の不揮発性メモリ）上記憶される。

まず第・に、泳動列（レーン）ごとに探索開始点から始
めて泳動方向Ｘに沿った直線（探索線）Ｌで、探索開始
点の信号レベルｆＬｓおよび信号の初期間４／ｆ　ｌ　
ｏに基づいてバンドを探し出す。

ここで、泳動方向は、レーンの蛇行およびパターンの傾
斜が生じている場合に、実際のパターンに完全に一致す
る泳動方向を意味するものではなく、試料を゛ＩＬ！、
気泳動させようとした方向であって通常は支持媒体（す
なわち、東ね合わせられた写真感光材料もしくはｉＷ積
性蛍光体シート）の長袖方向（Ｘ方向）を意味する。

また、探索開始点はレーンごとに泳動方向りの任意の点
を選ぶことができる。／ヘンドの探索は泳動方向に（パ
ターンの上部からド部に向かって）行なうのが好ましい
、初期間４／ｉｌｏは、バンドの有無を判別するための
信号レベルの悶（／ｉ　（基準値）文ｎ（ただし、ｎは
ＯまたはＩＥの整数である）の初期（１であり、比較的
低い値に設定される。バンドの大きさが一定範囲以上で
ある場合には後述するように順次より高い値に設定変更
されうる。

具体的には、たとえば次のようにしてバンドを検出する
。

ｍ２１４（１）は、−・つのレーンについての部分的な
オートラジオグラフであり、バンドｌを平面的にｃ５淡
画像として表示した図である。バンド探索は泳動方向Ｘ
に沿った直線２について行なわれる。

第２図（２）は、この直ｍ２についてＸ方向の位置と信
号レベルとからなる一次元波形を示す。

すなわち、バンド探索はこの一次元波形に基づいて行な
われるのであるが、デジタル信−〕は各読取り（読出し
）画素に対応しているから、実際には・次元波形は不連
続点の集合である。

探索開始点の信号−レベル文Ｓと初期閾値をｌｎ＋Δｌ
＝ｌｎ＋１１文０との関係に基づいて場合分けすると、
第３図に示すような１１通りの場合が起こりうる。なお
、第３図は第２図（２）の・次元波形を部分的に示す図
であり、白点は探索開始点を表わし、黒点はバンド検知
点を表わしている。すなわち、（１）開始レベル文Ｓが
初期田植見。以Ｆ（ｉｓ≦見。）であって、かつ信号レ
ベルが増加する傾向にある場合［第３図（１）］、（２
）開始レベル文Ｓが初期闇値見。以ド（ＵＳ≦Ｊｉｏ）
であって、かつ信号レベルが減少する傾向にある場合［
第３図（２）］、 （３）開始レベル！；Ｌｓが初期１１１Ｌｏより高く（
文Ｓ＞文。）、かつ信号レベルが増加する傾向にある場
合［第３図（３）］、 （４）開始レベル文Ｓが初期闇値２゜より高くＣ１ｓ＞
ｎｏ）、かつ信号レベルが減少する傾向にある（そして
、信号レベルは−・爪間４ｔｌｎｏをド回る）場合［第
３図（４）］　、および（５）開始レベル！Ｌｓが初期
田植す０より高く（ｉｓ＞ｆＬｏ）、かつ信号レベルが
減少する傾向にあるものの闇値ｎｏをＦ回らない場合［
第３図（５）］、 である。

なお、」−記（５）の場合はバンドが近接していてバン
ドとバンドとの間隔が七分ではないときに生じ、いわゆ
るバンドの融合を表わしている。

ト記（１）および（２）の場合（立Ｓ≦見。）は最も弔
純なケースであり、信号レベルが一次元波形りで次に初
めて閾値文０以七となる点をバンド検知点とする。

Ｌ記（３）の場合（交Ｓ＞文０）には既に開始点が検出
すべきバンドの領域にあるので、信号レベルが次に開始
レベルｉｓ以上となる点をバンド検知点とする。

Ｌ記（４）の場合Ｃ１ｓ　＞立０）にはまだ開始点が検
出済みのバンドの領域にあるので、信号レベルが・度闇
値文。をド回った後初めて閾値をｌｎ＋Δｌ＝ｌｎ＋ぬ
見。

以１−となる点をバンド検知点とする。

そして、Ｌ記（５）の場合（！；Ｌｓ　＞文。）にはバ
ンド間で信号レベルが闇値！；Ｌｏ以丁とならないので
１次に初めて開始レベルＵＳ以上となる点をバンド検知
点とする。

このように／ヘンド検知点を定めることにより、既に決
定されたバンドを１呼び検出したり１次に検出すべきバ
ンドを探し損なうことなく、バンド検出を行なうことが
できる。

第ニーに、探し出されたバンドについて闇値文〇に基づ
いてその領域を求め１次いで領域の大きさから該バンド
が真のバンドであるか否かを決定し、真のバンドである
場合にのみ検出すべきバンドとする。

まず、バンドは上記バンド検知点に連なっている点の集
合であるとして、バンド検知点を基点としてそれに１−
ド左右斜めのいずれかで連続し、かつ４．１号レベルが
闇値文０以−Ｌである点を求める。

得られたバンド検知点を含む連続した領域がバンドの領
域である。

次いで、バンドの領域の大きさを求める。領域の大きさ
はたとえば、領域のＸ方向の最大距離Ｘ０およびＸ方向
に直角な方向ｙの最大圧ｆｔ　ｙ　。

で見積ることができる。

第４図に、探し出されたバンドの領域（斜線部分＝３）
の例を示す。

ｔめ、一つのバンドとして容認できるＸ方向およびＸ方
向の最小の輻ｘｍｉｎ　、　　ｙｍｉｎ　、　並びにＸ
方向およびＸ方向の最大の＠ｘｍａｘ　、　　ｙｍａｘ
を設定しておく、すなわち、ｘ＋ｓｉｎおよびｙｌｎは
真正バンドとノイズを区別するためのｊＱ定定直１あり
、Ｘ　Ｉｌａ！およびＶ　ｌｅａ！は巾−・のバンドと
複数個が併合したバンドを区別するための設定イ１であ
る。

ａ）距ｆｌｌ　Ｘ　ｏおよび距離ｙｏがいずれも上記最
小幅と最大幅の範囲内にある（　ｘ　ｓｉｎ≦ｘ（、≦
ｘ　ｗａｘかつｙ　ｓｉｎ≦Ｙｏ≦ｙｍａｘ）場合には
、得られたバンドは真のバンドであると決定し、このバ
ンドを検出すべきバンドとする。

ｂ、）距離Ｘｏおよび距離ｙｏのうちの少なくとも・方
が１−記最小幅よりも小さい（ｘＯくｘ　１ｎまたはｙ
Ｏ＜ｙｍｉｎ）場合には、得られたバンドはエクストラ
／へンドであって真のバンドではないと決定したのち、
バンド検知点よりさらにド部の領域についてバンド探索
を行なう。

ｂｚ）ｌ二記ａおよびす、以外の場合であって、距離Ｘ
ｏおよび距離ｙｏのうちの少なくとも−・方が上記最大
幅よりも大きい（Ｘｏ＞Ｘ層ａ！もしくはｙ。＞ｙｍａ
ｘ）場合には、バンドの分離が部分ではないとして、闇
値交０を１．に変更して探索開始点からｌ’Ｔびバンド
探索をやり直す。

ここで、新たな闇植立、は交０に一定の増分Δ交を加え
た値（文、＝見。＋６文）であり、悶イｔ１を高くして
バンドを探索し直すことにより、融合バンドを−・つ一
つに分離して真のバンドを決定し、あるいは相対的に信
号レベルの小さなエクストラバンドを好適に除去するこ
とができる。

一般に、バンド領域が大き過ぎる場合には何度でも１１
１文、をより高い１１見。、！（見。、１＝２゜＋Δ交
；ここで、ｎ＋１は闇値を変更した回数を表わす）に変
更して、探索開始点からバンド探索を綴り返すことがで
きる。この場合に、予め１ｌｌｉの最大植立■ａＸを設
定しておき、変更後の闇値交。、１が最大値以下である
Ｃ１ｎ−１≦皇■ａＸ　）場合にはこのＬ４ｔｉｌ。や
□に基づいて探索開始点からバンドＶｒＲＺ＋？をやり
直すが、闇値ｎｏや、が最大値よりも大きくなるｎｏや
１Σ（Ｌｍａｘ）場合にはバンドの分離は不可ス對であ
るとして、該バンドは真のバンドではないと決定してバ
ンド検知点よりＦ部領域でバンド探索を行なうのが処理
効率および精度の点から好ましい。

なお、バンドの大きさの判定はＬ記ｐ段に限られるもの
ではなく、たとえばバンド領域に含まれる信号の数から
判断することも可ｍである。

このようにして、各レーンについて真のバンドが一つ検
出されるまで（上記ａの場合が起こるまで）バンドの探
索を繰り返す。

このようにして検出された真正バンドを用いて、ＤＮＡ
の塩基配列を自動決定することができる。たとえば、得
られた真正バンドの領域を利用して各レーンを好適に追
尾し、Ｘ方向りの位置と信号゛のレベルとからなる精確
な一次元波形（プロファイルレーン）を得、これに更に
適当な信り処理を施すことにより塩基配列を自動決定す
ることかでさる。

たとえば、レーンの追尾は以下のようにして行なうこと
ができる。

まず、各レーンで検出されたバンドのうち泳動開始位置
に最も近い、すなわち最もパターンＬ部に位置するバン
ド（これをバンドＡとする）を有するレーンについて、
次の追尾開始点（同時に次のバンドの探索開始点でもあ
る）を決定する。

次の追尾開始点のＸ座標は、第４図に示すように、バン
ドＡの領域３におけるＸ方向の最大距離の中点とする。

また、Ｘ座標は、バンドＡの領域内でこのＸ座標を有す
る点のうち追尾開始点から最も遠い点のＸ座標とする。

第４図において、座標（Ｘａ、Ｙａ）が次の追尾開始点
であり、矢印の方向にレーンの追尾（およびバンドの探
索）が行なわれる。

次に、残りの三つのレーンについてそれぞれ、次の追尾
開始点を決定する。

他ル−ンのバンド（これをバンドＢとする）の領域とバ
ンドＡのＸ方向の領域とが少しでも重なる場合には、座
標Ｘａを次の追尾開始点のＸ座標とし、バンドＢの領域
におけるｙ方向の最大距離の中点を次の追尾開始点のＸ
座標とする。

また、他のレーンのバンドＢの領域とバンドＡのＸ方向
の領域とが全く重ならない場合には、座標Ｘａを次の追
尾開始点のＸ座標とし、バンドＡのレーンにおける次の
追尾開始点の座６１　ａと初めの追尾開始点（探索開始
点）ｙｓとの差を、バンドＢのレーンの初めの追尾開始
点ｙｓ゛に加えた値：　　ｙｓ’＋（ｙａ−ｙｇ） を次の追尾開始点のＸ座標とする。

そして、レーンごとに新たに設定された追尾開始点から
パターンの下部に向かってＸ方向に沿った直線上で、１
述した方法に交って再びバンドの探索を行なう。

この際に、悶イメ１交。は常に初期１１文。から始める
。そして悶イ／１文。は！；ＬＩｌａｘ以ドで終わるよ
うにするのが好ましい。

バンドが・つも検出されなくなるまで１本発明に係るバ
ンド検出操作と上記のレーン追尾操作を順次繰り返す、
これにより、レーンの上端部からド端部までレーン追尾
を完ｒすることができる。

以しに述べたレーンの追尾の詳細については、本出願人
による昭和６１年　月　　［１出願の特願昭６１−　　
　　号明細古に配植されている。

このようにして得られたレーンの追尾情報に基づいて、
たとえばレーンに沿った一定幅の信号を抽出して一次元
のプロファイルを得たのち、プロファイルについて信号
レベルが極大となる位置を求めることによりバンドの位
置を決定する。そして、レーン間で決定された真正バン
ドの位置を相〃に比較することにより、直ちにバンドに
序列を付けることができる。このとき、上記四種類の塩
基特異的ＤＮＡ合成物の組合せが排他的な組合せである
ことから、異なるレーン上の回じ泳動位置に二つ以］二
のバンドは存在しえないことを利用して、容易に序列を
決定することができる。上記（１）〜（４）のスロット
はそれぞれ（Ｇ）。

（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基についての情
報を有するから、各バンドの属するスロットに対応する
塩基で２！検することにより、ＤＮＡの塩基配列（例え
ばＡ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−・・・）を得ることが
できる。

このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩
基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配
列についての情報は、上記の表示形態に限られるもので
はなく、たとえば所望により同時に各バンドの強度（２
°）を放射性標識物質の相対量として表示することも可
能である。さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方につい
ての塩基配列を表示することもできる。

あるいはまた、ＤＮＡの塩基配列情報は、上記の信号処
理がなされたデジタル信号に基づいて画像として表示す
ることもできる。すなわち、各バンドの補正後の位置を
オリジナルのオートラジオグラフとともに１４視画像化
して表示することができる。この場合には、最終的な塩
基配列決定を解析者自身がこの表示画像に基づいて行な
うことがＩＩ）俺である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ合
成物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せ
を利用した場合について説明したが、本発明の信号処理
方法はこの組合せに限定されるものではなく、例えば（
Ｑ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用す
ることができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物
の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）について
も本発明の方法を適用することができる。さらに、バン
ドの検出は、−組の核酸の塩基特異的断片物の分Ｉ１１
展開列に限定されるものではなく、支持媒体にに同時に
分離展開された全ての分離展開列について行なうことが
可能である。

このようにして得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既上記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言、ＲＨ学的情報処理を
行なうこともｎ１能である。

」−述の０壮処理により決定された核酸の塩基配夕１に
ついての情報は、信号処理回路から出力されたのち、次
いで直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気
テープなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送され
る。

記録装置としては、たとえば、感光材料りをレーザー光
等で走査して光学的上記録するもの、ＣＲＴ笠に表示さ
れた記号・数値をビデオ−プリンター等上記録するもの
、熱線を用いて感熱記録材料に上記録するものなど種々
の原理に基づいた記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、泳動パターンのオートラジオグラフの例を示
す部分図である。 第２図の（１）は、一つのレーンについてのオートラジ
オグラフ（濃淡画像）の例を示す部分図であり、（２）
は、直線２についてＸ方向の位置と信号レベルとからな
る一次元波形を示す。 第３図（１）〜（５）は、第２図（２）の−次元波形の
部分拡大図である。 第４図は、検出されたバンドの領域の例を示す図である
。 ｌ：バンド、２：直線（探索線）、 ３：／ヘントの領域。 白点：追尾開始点、黒点：バンド検知点特許出願人　　
富七写真フィルム株式会社代　　理　　人　　　弁理上
　　　柳　　川　　泰　　男第１図 ソ 第２図 第 ア ３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持媒体上に
   一次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展
   開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につ
   いて信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を決
   定する方法において、 １）分離展開列ごとに分離展開方向ｘに沿った直線上で
   、探索開始点の信号レベルｌ＿ｓおよび信号レベルの閾
   値ｌ＿ｎ（ただし、ｎは０または正の整数である）に基
   づいて探索開始点に最も近いバンドを一つ探し出す工程
   、および ２）閾値ｌ＿ｎに基づいて該バンドの領域を求めたのち
   、この領域の大きさに基づいて ａ）該バンドは真のバンドであると決定してバンドを検
   出する、または ｂ）該バンドは真のバンドではないと決定して上記第一
   工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について一つのバンドを検出
   する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ２、上記第一工程において、探索開始点の信号レベルｌ
   ＿ｓおよび信号レベルの閾値ｌ＿ｓに関して ａ）ｌ＿ｓ≦ｌ＿ｎであるとき、信号レベルが次に閾値
   ｌ＿ｎ以上となる点をバンド検知点とする、または ｂ）ｌ＿ｓ＞ｌ＿ｎであるとき、信号レベルが次に閾値
   ｌ＿ｎを下回った後閾値ｌ＿ｎ以上となる点、もしくは
   信号レベルが次に閾値ｌ＿ｎを下回ることなく開始レベ
   ルｌ＿ｓ以上となる点をバンド検知点とする、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ３、上記第二工程において、信号レベルが閾値ｌ＿ｎ以
   上であるバンド検知点を含む連続した領域を求めたのち
   、この領域のｘ方向の最大距離ｘ＿ｎおよびｙ方向の最
   大距離ｙ＿ｎに関して、 ａ）ｘｍｉｎ≦ｘ＿ｎ≦ｘｍａｘであり、かつｙｍｉｎ
   ≦ｙ＿ｎ≦ｙｍａｘであるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿
   ｎで区切られた領域を真のバンドと決定することにより
   バンドを検出する、 ｂ＿１）ｘ＿ｎ＜ｘｍｉｎもしくはｙ＿ｎ＜ｙｍｉｎで
   あるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を
   真のバンドではないと決定したのちバンド検知点より探
   索方向に第一工程からやり直す、 または ｂ＿２）ｘ＿ｎ＞ｘｍａｘもしくはｙ＿ｎ＞ｙｍａｘで
   あるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を
   真のバンドではないと決定したのち閾値をｌ＿ｎ＋Δｌ
   ＝ｌ＿ｎ＿＋＿１に変更して探索開始点より探索方向に
   第一工程からやり直す、 （ただし、ｘｍｉｎ、ｘｍａｘ、ｙｍｉｎおよびｙｍａ
   ｘはそれぞれ定数であって、バンドとして認められるｘ
   方向の最小幅、ｘ方向の最大幅、ｙ方向の最小幅および
   ｙ方向の最大幅であり；Δｌは閾値ｌ＿ｎの一定増分で
   ある） ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ４、上記第二ｂ＿２工程において、 ｂ＿２＿１）ｌ＿ｎ＿＋＿１≦ｌｍａｘであるとき、閾
   値をｌ＿ｎ＿＋＿１として探索開始点より探索方向に第
   一工程からやり直す、または ｂ＿２＿２）ｌ＿ｎ＿＋＿１＞ｌｍａｘであるとき、距
   離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を真のバンドで
   はないと決定したのちバンド検知点より探索方向に第一
   工程からやり直す、 （ただし、ｌｍａｘは定数であって閾値ｌ＿ｎがとりう
   る最大値である） ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ５、上記第一工程において、分離展開方向にバンドの探
   索を行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６、上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、 （１）グアニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類の塩基
   特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離展開さ
   れて形成された四列の分離展開列からなることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ７、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シー
   トとを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
   ートラジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録したのち
   、該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオグ
   ラフを輝尽光として光電的に読み出すことにより得られ
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ８、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせて、支持媒体
   上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該感光材料
   に感光記録したのち、該感光材料上に可視化されたオー
   トラジオグラフを光電的に読み取ることにより得られた
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。