JPS61243362A - 核酸の塩基配列決定のための信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のだめの信号処理方法に
関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体の機能や複製のメカニズムを解明するために生
物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のことと
なっている。とりわけ、特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　
（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）などの核酸の塩基
配列を決定することが必要不可欠なこととなっている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム拳ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
　）法およびサンガー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサム・ギ
ルバート法は、まず塩基配列を決定しようとしているＤ
ＮＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部に３
２　ｐ等の放射性同位元素を含む基を結合させることに
より、その対象物を放射性標識物質としたのち、化学的
な手段を利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基
特異的に切断する。次に、この操作により得られた塩基
特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲル電気泳動法によ
り分離展開し、多数の切断分解物がそれぞれ分離展開さ
れて形成された分離展開パターン（ただし、視覚的には
見ることができない）を得る。この分離展開パターンを
たとえばＸ線フィルム上に可視化してそのオートラジオ
グラフを得、得られたオートラジオグラフと各々の塩基
特異的切断手段とから、放射性元素が結合された鎖状分
子の端部から一定の位置関係にある塩基を順次決定し、
これにより対象輪金ての塩基配列を決定することができ
る。

また、後者のサンガー・クールノン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放射
性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利用
して塩基特異的に合成し、この塩基特異的ＤＮＡ合成物
の混合物を用いて上記と同様にしてそのオートラジオグ
ラフから塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精度
で行なうことを目的として、それに利用されるオートラ
ジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の写
真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄積
性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する方
法について既に特許出願している（特開昭５９−８３０
５７号、５８−２０１２３１号）、ここで、蓄積性蛍光
体シートは輝尽性蛍光体からなるものであり、放射線エ
ネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収させた
のち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で励起する
ことにより、放射線エネルギーを蛍光として放出させる
ことができるものである。この方法によれば、露光時間
を大幅に短縮化することができ、また従来より問題とな
っていた化学カブリ等が発生することがない、さらに、
放射性標識物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エ
ネルギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光と
して時系列的に読み出されるから、画像のほかに記号、
数値など任意の形で表示記録することが可能である。

従来より、核酸の塩基配列決定をしようとする者は、可
視化されたオートラジオグラフについて、放射性標識が
付与された核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特
異的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物と称す
る）のそれぞれの分離展開位置を視覚的に判断し、分離
展開列間で相互に比較することにより核酸の塩基配列を
決定している。よって、得られたオートラジオグラフの
解析は通常人間の視覚を通して行なわれており、そのた
めに多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して決定された核酸の塩基配列が解析者によっ
て異なるなど得られる情報の精度には限界がある。

そこで１本出願人は、上記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後、このデジタル信号に適当な信号処
理を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を自動的に決定
する方法についても既に特許出願している（特開昭５９
−１２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号、特願
昭５９−８９６１５号、特願昭５９−１４０９０８号等
）。オートラジオグラフに対応するデジタル信号は、従
来の放射線フィルムを利用する場合には一旦オートラジ
オグラフを該フィルム上に可視画像化したのち、反射光
または透過光を利用して光電的に読み取ることにより得
られる。また、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、
オートラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを直
接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分離展開させて得られた分離展開パ
ターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちである。

その代表的なものに、試料の分離展開の開始位置または
開始時点が各列で異なることによる列間相互の全体的な
位置ズレ（いわゆるオフセット歪み）がある、オフセッ
ト歪みはたとえば、ゲル媒体など支持媒体の上端に設け
られた多数のスロット（試料の注入口〕の形状（凹みの
大きさ）が完全に同一ではなく個々に異なりがちである
ことが原因となって発生する。また、試料を支持媒体に
付着させる際に付着位置が相互にずれたり、試料注入直
前におけるゲル媒体の尿素の洗い出しが不十分である場
合には試料の支持媒体への浸入速度が異なることも歪み
の発生の−因となっている。

ヌロントの形状が不ぞろいであるために分離展開パター
ンにオフセット歪みが発生した場合の具体例を第１図に
示す。第１図（ａ）は、試料の分離展開に使用された支
持媒体の上端部を示しており　（ｂ）は同一試料を（１
）〜（４）の各スロ、ントに注入したのち分ｇｌ展開し
て得られたパター／を示す。第１図（ａ）に示すように
、第三スロットが他のスロットよりも凹みが大きい結果
、（ｂ）に示すように第三スロットの分離展開列のみが
全体的にｆ方にずれており、他の列との間でズレ（Δｙ
）を生じている。このような列間の相対的な位置ズレを
オフセット歪みという。

このような歪みが発生した場合にも、そのオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を効率良く信号処理して
核酸の塩基配列を高精度で自動決定することが望まれて
いる。

［発明の要旨コ 本発明者は、オートラジオグラフィーを利用して核酸の
塩基配列を自動決定する方法において。

オフセット歪みの生じている分離展開パターンであって
もそのオートラジオグラフに対応するデジタル信号を好
適に信号処理することにより、核酸の塩基配列を簡易か
つ高精度で自動決定することを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された塩基特異
的ＤＮＡ断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合
物が支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成さ
れた複数の分離展開列のオートラジオグラフに対応する
デジタル信号について信号処理を行なうことにより、核
酸の塩基配列を決定する方法において。

１）各分離展開列について下部の少なくとも二つの／＜
ンドを検出し、下端から順にバンドに通し番号を付する
工程、 ２）分離展開列ごとに、該バンドの番号とその分離展開
距離との相関関係を得る工程、３）得られた相関関係か
ら分離展開列間における分離展開位置の差を得る工程、 ４）各分離展開列について、より上部の少なくとも一つ
のバンドを検出し　得られた分離展開距離の差を列間の
位置ズレとして該バンドの分離展開位置を補正したのち
、その位置に基づいて該バンドに続き番号を付する工程
。

５）既に検出されているバンドに上記第四工程で新たに
検出されたバンドを加え、これらのバンドについて分離
展開列ごとにバンドの番号とその分離展開距離との相関
関係を新たに得る工程、および ６）ト記第三乃至第五工程を順次繰り返すことにより、
各分離展開列上の全てのバンドにその補ＩＥ位置に基づ
いて序列を何する工程、を含むことを特徴とする核酸の
塩基配列決定のだめの信号処理方法を提供するものであ
る。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体りで分離展開して得られた分離展開パター　ンに
オフセット歪みが発生している場合でも、そのオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号をオフセット歪みの
補正のための信号処理機能を有する適当な信号処理回路
を通すことにより、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度で
得ることができる。

分離展開パターンは一般に、下部（すなわち分離展開距
離が大きい領域）においては分離展開バンドの間隔が疎
であり、一方、上部の分離展開の開始位置に近づくにつ
れてバンドの間隔が密になっている。ここで、下部とは
一般に支持媒体の中央付近より下側の領域を意味し、ま
た上部とは中央付近より上側の領域を意味する。そのた
め、分離展開列相互においてオフセット歪みが生じてバ
ンドの位置がずれている場合であっても、下部領域にお
いては各列のバンドの位置を相互に比較することにより
、その序列を比較的容易に決定することが可能である。

しかしながら、上部領域においてはバンドの間隔が密で
あるために列間の位置ズレはバンドの序列決定を困難に
し、得られる核酸の塩基配列に誤差が生じる原因となる
。

本発明者は、バンドの間隔が分離展開パターンの上部と
下部とで異なり、下部領域においてはオフセント歪みが
生じている場合でもバンドの序列を決定することが容易
であることに注目して、オフセット歪みの補正を適性か
つ簡単に行なう方法を見い出した。すなわち、下部領域
においてはバンドの序列が容易に決定され、かつバンド
の通し番号とその分離展開距離との間で一定の相関関係
が得られることから、この関係に基づいてそれより上部
領域の列間の位置ズレを部分的に決定することができ、
これによりオフセット歪みを逐次補正することができる
。

特に、バンドの通し番号とその分離展開距離との相関関
係は局部的には直線で表わすことができるから、相関関
係を得るのに用いるバンドの数があまり多くない場合に
は直線で近似することができ、容易にこの相関関係を求
めることができる。

従って、本発明は、列間の位置ズレを逐次に補正する方
法であり１位置ズレが分離展開方向に局部的に異なる場
合であっても高精度に位置補正を行なうことができる。

そして、オフセット歪みの補正がなされたデジタル信号
に基づいて核酸の塩基配列を簡易かつ高精度に決定する
ことができるものである。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては。

放射性標識が付与されたＤＮＡ、ＲＮＡ等の４８酸の塩
基特異的断片物の混合物を挙げることができる。ここで
、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。

たとえば、塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である
塩基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム
・ギルバート法に従って、放射性標識が付与されたＤＮ
Ａを塩基特異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールラン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（鋳型
）として、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素とを用いて合成
することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
単位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、グアニ
ン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で３２　ｐ　
、　＋４　（：　、　３１＋　３．３　Ｈ，”Ｉ　す、
！’）放射性同位元素を保持させることによって付与さ
れる。

試料である放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー
など種々の分離展開方法により支持媒体上に分離展開さ
れる。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒体につい
て、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
によりそのオートラジオグラフが得られ、次いで適当な
読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低温（−９０〜−
７０℃）で長時間（数十時間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム上に可視画像化する６
次いで、画像読取装置を用いて放射線フィルム上に可視
化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フィルムに光ビームを照射してその透過光または反
射光を光電的に検出することにより、オートラジオグラ
フは電気信号として得られる。さらに、この電気信号を
Ａ／Ｄ変換することにより。

オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得ること
ができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、まず、支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間（数秒〜
数十分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性標識物質
から放出される放射線エネルギーを蓄積させることによ
り、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに一種の潜
像として記録する、ここで、蓄積性蛍光体シートは、た
とえばプラスチックフィルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ”）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明な保護
膜がこの順に積層されたものである。蓄積性蛍光体シー
トに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線等の放射線が
照射されるとその放射線エネルギーを吸収して蓄積し、
そののち可視乃至赤外領域の光で励起すると蓄積してい
た放射線エネルギーを輝尽光として放出するという特性
を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。具体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換すること
により、オートラジオグラフに対応するデジタル信号を
得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
ては、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−１
２８５２７号、特開昭５９−１２６２７８号等の各公報
に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述べたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性標識
物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はなく
１画像領域のみについて行なうことも勿論可能である。

さらに、本発明においては、予め各分離展開列ノ位置お
よびバンドの幅等についての情報を入力して読取り（読
出し）条件を設定しておき、読取り（読出し）操作にお
いては各バンド上を走査線が通過するような走査線密度
で光ビームによる走査を行なうことにより、読取（読出
）時間を短縮化して必要な情報を効率良く得ることがで
きる。

なお、本発明においてオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号とは、このようにして得られたデジタル信号
をも包含する。

得られたデジタル信号Ｉ）ｘｙは、放射線フィルム（ま
たは蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座
標（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（２
）とからなる。信号のレベルはその座標における画像濃
度、すなわち放射性標識物質の量を表わしている。従っ
て、一連のデジタル信号（すなわち、デジタル画像デー
タ）は放射性標識物質の二次元的な位置情報を有してい
る。

このようにして得られた支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号には、以下に述べるような本発明の方法により信号
処理が施されて、目的の核酸の塩基配列決定が行なわれ
る。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四種類の放
射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分離展開列）からなる場合に
ついて説明する。

１）グアニンＣＧ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各塩基
特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もしくは
合成された、すなわち末端の塩基を同じくする種々の長
さのＤＮＡ断片物からなる。

第２図は、上記四種類の塩基特異的ＤＮＡ断片物をそれ
ぞれ四個のスロットに電気泳動してなる泳動パターンの
オートラジオグラフを示す、第２図に示すように、得ら
れたオートラジオグラフにはオフセット歪みが発生して
いる。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、信
号処理回路において−Ｈメモリ（バッファーメモリ、ま
たは磁気ディスク等の不揮発性メモリ）に記憶される。

まず、各泳動列（レーン）について二つ以りのバンドを
検出し、その序列を決定する。

たとえば、各レーンの泳動方向に沿った一定領域内のデ
ジタル信号を抽出したのち、各レーンについて抽出され
た信号の位置（ｙ）とその信号のレベル（Ｚ）とからな
る−次元波形を作成する。

なお、デジタル信号の検出を、前記のように各バンドに
ついて走査線がかかるような走査線密度で泳動方向に走
査することにより行なった場合には、直接に各レーンに
ついてその一次元波形を作成することができる。

第２図は、各レーンについて信号の位置（ｙ）と信号の
レベル（Ｚ）とからなる−次元波形を示す、なお、第２
図において、縦軸の位置（ｙ＝ｙｏ）はデジタル画像デ
ータとの基準原点を示す。

第２図の各−次元波形の右側部分（ｙが大である領域）
において、たとえば信号のレベルの差分値の符号が反転
する（＋から−に変化する）点を求めることにより、信
号レベルが極大となる位置を探し出す、この極大値をと
る位置をバンドの位置とする。検出すべきバンドの数は
、泳動パターン上の総バンド数およびパターンの状態な
どによっても異なるが、たとえば総バンド数が１５０〜
２００の範囲にある場合には各レーンについて１０個程
度のバンドを検出するのが好ましい。

得られたバンド全部について、泳動位置（ｙ）が基準原
点から遠い順に通し番号（ｎ）を付す。

泳動パターンの下部領域においては、８２図の一次元波
形から明らかなようにバンドの間隔が疎であるために、
オフセット歪みが生じていてもバンドの位置がレーン間
で逆転するようなことがなく、バンドの序列を容易に決
定することができる。

次に、各レーンについて、バンドの番号とその泳動距離
との相関関係を求める。

たとえば、横軸にバンド番号（ｎ）をとり、縦軸に泳動
距離（ｙ　’）をとったグラフを作成することにより、
第４図の直線１〜４に示すような回帰直線を得る。なお
第４図は、各レーンについてのバンド番号（ｎ）と泳動
距ｇｌ　（ｙ　’）とからなる回帰直線を示す、直線１
〜４はスロットの番号に対応する。

ここで、泳動距１１１（ｙ’）は基準原点（ｙｏ）から
各バンドの位置までの距ＩＩ　（ｙ　’　＝ｙ−Ｖｏ）
を表わす、基準原点はたとえばスロットの位置とするこ
とができる。従って、レーン相互に位置ズレがある場合
に共通の基準原点からの距離ｙ°は真の泳動距離とは限
らない、また、各レーンの回帰直線は 一般式：　　Ｙ’＝ａｎ＋ｌ） で表わされる。ここで、ａおよびｂはそれぞれ定数であ
る。

通常、泳動パターンの下部領域においては局所的に、バ
ンド番号と泳動距離とが直線関係を有しており、第４図
の直線１〜４に示すような回帰直線で近似することがで
きる。ここで、オフセット歪みが発生していなければ、
検出された／ヘンドは一つの回帰直線上に存在したはず
である。換言すれば、各レーンについて得られた四本の
回帰直線は一つに重なったはずである。

なお、バンド番号とその・泳動位置との相関関係の表わ
し方は、上記の回帰直線に限定されるものではなく、た
とえば適当な高次曲線で近似して回帰曲線とすることに
より一層高精度に相関関係を決定することもできる。

次いで、得られた相関関係からレーン間の泳動距離の差
を求め、この差を次に検出されるべきバンド領域におけ
る列間の位置ズレとする。

レーン間の泳動距離の差はたとえば、まず各回帰直線を
ｎが大となる方向に外挿し、横軸の任意の点における泳
動距ｇｌｙ’をそれぞれ求めることにより、その差とし
て得ることができる。そして、この泳動距離の差をその
付近における（すなわち、次に検出されるべきバンド領
域における）列間の位置ズレとする。具体的には、第一
スロットおよび第ニスロットのレーン間の泳動距離の差
は　第４図において直線ｌおよび２をそれぞれ右方向（
ｎが大となる方向）に延長したときの任意のへ（ｎ　＝
　ｎ　ａ）における泳動距離の差ｙ゛、２として得られ
る。この差が、オフセット歪みによるレーン間の位置ズ
レに相当する。

既にバンドの検出された下部領域より上部の領域におい
て一つ以上のバンドを検出し、これらのバンドについて
、上記で決定されたレーン間の位置ズレに基づいて泳動
位置の補正を行なったのち序列を付ける。

バンドの検出は、各レーンの一次元波形から前記と同様
にしてその極大値を求めることにより行なうことができ
る。

泳動位置の補正は、得られた泳動距離の差だけ新たに検
出されたバンドの位１１（ｙ）をＬ部またはｒ部方向に
ずらす、たとえば、第ニスロットのバンドについては、
ｙに関してｙ′、２の値だけ減算することにより、泳動
位置を補正することができる。このようにして、レーン
ごとにレーン間の位置ズレを補正することができ、泳動
パターンのオフセット歪みを是正することができる。

この補正された位置に基づいて各バンドを相互に比較し
、下端から順に続き番号を付す、この際に、上記四種類
の塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せが排他的な組合せで
あることから、一つのバンドが二つ以上のレーンに同時
に存在することはないことを利用して、容易にバンドの
序列を決定することができる。

さらに、レーンごとに、既に検出されているバンドにこ
の新たに検出されたバンドを加え、その代りにバンド番
号の最も若いバンドを除外して、再びバンドの番号とそ
の泳動距離との相関関係（回帰直線もしくは回帰曲線）
を求める。たとえば、第４図の直線ｌ”〜４°に示すよ
うな回帰直線が新たに得られる。この場合に、相関関係
を求めるのに用いられるバンドのデータ量は常に一定で
あるから、得られる相関関係はデータによって異なるこ
となく直線などほぼ一定の関係式で表わすことができる
。

この修正された回帰直線に基づいて再び１次に検出され
るべきバンド領域におけるレーン間の位置ズレを求め、
該領域で新たに検出されたバンドについて泳動位置の補
正を行ない、そしてバンドに序列を付す。

このようにして、各レーンを一定領域ごとに区分し、区
分ごとに上述の操作を繰り返すことにより、各レーン上
の全てのバンドについてオフセラ、ト歪みによる位置ズ
レを補正することができる。

レーン間の位置ズレはレーン全体を通して必ずしも一様
であるとは限らないので、区分的に位置ズレを補正する
ことにより高精度にオフセット歪みの補正を行なうこと
ができる。

一回の操作で検出、位置補正されるバンドの数は相関関
係を得るのに用いられるバンド数の半分以下であるのが
好ましく、たとえば一つのレーン当り３〜５個程度であ
る。

あるいは、バンドの通し番号とその泳動距離との相関関
係は、巾に既に検出されているバンドに新たに検出され
たバンドを加えて、これら検出済の全てのバンドに対し
て求めてもよい、ただし、上記操作を重ねるにつれて相
関関係は直線ではなく、適当な曲線（多項式あるいは指
数関数等）を最少二乗法などで近似した回帰曲線（第５
図参照）で表わされるようになる。

なお、第５図において、曲線１〜４はそれぞれ各レーン
で検出されたバンド全てについてのバンド番号（ｎ）と
泳動距離（ｙ゛）とからなる回帰曲線である。

また、上記操作を−バンド単位で繰り返してもよい、す
なわち、一つのバンドを検出するたびにバンドの通し番
号とその泳動距離との相関関係を修正し、次に検出され
るべきバンド領域におけるレーン間の位置ズレを求めて
もよく、これにより泳動位置の補正をより精度高く行な
うことができる。たとえば、第５図に示すように、１〜
ｎｂ番目のバンドのデータに基づいて各レーンごとに回
帰曲線１〜４を求めたのちｎが大となる方向に外挿する
ことにより、次のｎｂ＋１番目のバンドについて第一ス
ロットと第三スロットのレーン間の泳動距離の差はＹ’
＋コと決定される。

このようにして得られたバンドの通し番号が即ち、目的
とするＤＮＡの塩基配列を意味している。）：記（１）
〜（４）のスロットはそれぞれ（Ｇ）、（Ａ）、（Ｔ）
、（Ｃ）からなる末端塩基についての情報を有するから
、各バンドの属するスロットに対応する塩基で置換する
ことにより、ＤＮＡの塩基配列（例えば、Ａ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−・・・）を得ることができる。

なお、本発明において泳動パターンにスマイリング現象
が発生している場合には、デジタル信号に上述のオフセ
ット歪みの補正を行なう前に、スマイリングの補正を行
なってもよい。

スマイリング現象は、支持媒体の中央部のスロットの泳
動距離に比べて両端部のスロットの泳動距離が短くなる
現象であり、泳動過程における放熱効果（いわゆるエツ
ジ効果）などが原因となって生じるものである。

スマイリングの補正は、たとえば、以下のようにして行
なうことができる。

スマイリング現象の発生している泳動パターンにおいて
は通常、バンド（幅方向に長い帯状である）が、スマイ
リング効果の程度に応じて泳動方向に対して直角ではな
く傾きを有していることから、まず各レーンについて少
なくとも一つのバンドの傾きを検出する。傾きはたとえ
ば、デジタル画像データ上を、各バンドに少なくとも二
本の走査線がかかるように走査してデジタル信号を抽出
したのち、各走査線について一次元波形を作成　−し、
その極大値の位置を結んで得られる回帰直線から求める
ことができる。あるいは、オートラジオグラフの読取（
読出）過程において予め上記のようなデジタル信号を検
出しておいてもよい。

次に、スマイリング効果の程度の最も小さな一つのレー
ン（基準レーンとする）上の一つのバンド（基準バンド
）を求め、このバンドの傾きと他のレーンの最寄りのバ
ンドの傾きとから、基準バンドを当該他レーンに外挿し
、他のレーンにおける基準バンドの相対位置を決定する
０次いで、この相対位置と基準レーン上の位置とから、
各レーンについて泳動距離の比率を求める。得られた比
率は各レーンのスマイリング効果の程度を表わしており
、この比率に基づいて各レーンの泳動距離を一括して伸
縮させる。このようにして、全てのレーンについてスマ
イリングの補正を行なうことができる。

あるいは、全てのバンドについてその傾きを検出し、基
準レーン以外のレーン上の各バンドをその傾きに基づい
て基準レーンに外挿することにより、個々のバンドにつ
いて個別に泳動距離の補正をすることもできる。この場
合には、予め全てのバンドが検出され、バンド単位でス
マイリングの補正が行なわれることになる。

なお、デジタル信号処理によるスマイリング現象の詳細
については１本出願人による特願昭６０−　　　号［昭
和６０年４月９日出願（１）］および特願昭６０−　　
　号［昭和６０年４月９日出願（２）］の各明細書に記
載されている。

以上に述べた方法により、ＤＮＡの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡ
の塩基配列についての情報は、旧記の表示形態に限られ
るものではなく、たとえば所望により同時に各バンドの
強度（Ｚ”）を放射性標識物質の相対量として表示する
ことも可能である。また同時に、オートラジオグラフの
可視画像とともに画像として表示することも可能である
。さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方についての塩基
配列を表示することもできる。

また、上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断
片物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せ
を利用した場合について説明したが１本発明の信号処理
方法はこの組合せに限定されるものではなく、例えば（
Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用す
ることができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物
の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）について
も本発明の信号処理方法を適用することができる。さら
に、オフセット歪みの補正は、−組の核酸の塩基特異的
断片物の分離展開列に限定されるものではなく、支持媒
体上に同時に分離展開された全ての分離展開列について
行なうことが可能である。

このようにして得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既に記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行な
うことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配列につい
ての情報は、信号処理回路から出力されたのち、次いで
直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気テー
プなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に表示さ
れた記号・数値をビデオ・プリンター等に記録するもの
、熱線を用いて感熱記録材料りに記録するものなど種々
の原理に基づいた記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図の（ａ）は、支持媒体の上端部に設けられたスロ
ットの形状を示す部分図であり、（ｂ）は、オフセット
歪みが発生した分離展開パター・ノの例を示す図である
。 第２図は、オフセット歪みが発生した泳動パターンの例
を示す図である。 第３図は、各レーンについて信号の位置（ｙ）と信号の
レベル（２）とからなる−次元波形を示す図である。 第４図は、各レーンについてバンド番号（ｎ）と泳動比
ｆｌｌ　（ｙ　’）とからなる回帰直線を示す図である
。直線１〜４および直線１′〜４“はそれぞれ（１）〜
（４）のスロットに対応する。 第５図は、各レーンについてバンド番号（ｎ）と泳動比
！（ｙ’）とからなる回帰曲線を示す図である０曲線１
〜４はそれぞれ（１９〜（４）のスロットに対応する。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　　理　　
人　　　弁理士　　　柳　　川　　泰　　男一一一一一
一〉Ｘ 第２図 會 ：し 第４図 ｎ 明細書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正致
します。 手続？１０正書 昭和６０年　６月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持媒体上に
   一次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展
   開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につ
   いて信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を決
   定する方法において、 １）各分離展開列について下部の少なくとも二つのバン
   ドを検出し、下端から順にバンドに通し番号を付する工
   程、 ２）分離展開列ごとに、該バンドの番号とその分離展開
   距離との相関関係を得る工程、 ３）得られた相関関係から分離展開列間における分離展
   開距離の差を得る工程、 ４）各分離展開列について、より上部の少なくとも一つ
   のバンドを検出し、得られた分離展開距離の差を列間の
   位置ズレとして該バンドの分離展開位置を補正したのち
   、その位置に基づいて該バンドに続き番号を付する工程
   、 ５）既に検出されているバンドに上記第四工程で新たに
   検出されたバンドを加え、これらのバンドについて分離
   展開列ごとにバンドの番号とその分離展開距離との相関
   関係を新たに得る工程、および ６）上記第三乃至第五工程を順次繰り返すことにより、
   各分離展開列上の全てのバンドにその補正位置に基づい
   て序列を付する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ２、上記第一および第四工程において、各列の分離展開
   方向に沿ってデジタル信号を抽出したのち、各列におけ
   る抽出信号のレベルが極大となる位置を求めることによ
   り、バンドを検出することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法
   。 ３、上記第二工程において、バンドの番号とその分離展
   開距離との相関関係を回帰直線もしくは回帰曲線として
   得ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸
   の塩基配列決定のための信号処理方法。 ４、上記第三工程において、分離展開列間における分離
   展開距離の差を、回帰直線もしくは回帰曲線をバンド番
   号が大となる方向に外挿したときの分離展開距離の差と
   して得ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
   核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ５、上記第五工程において、既に検出されているバンド
   に第四工程で新たに検出されたバンドを加え、かつ既に
   検出されているバンドのうち番号の小さなバンドを除外
   し、これらのバンドについて分離展開列ごとにバンドの
   番号とその分離展開距離との相関関係を新たに得ること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配
   列決定のための信号処理方法。 ６、上記第一工程の前に、各分離展開列について少なく
   とも一つのバンドの分離展開方向に対する傾きを検出し
   たのち、この傾きに基づいて該バンドの他の分離展開列
   における相対位置を求めることにより、各バンドの分離
   展開距離を補正することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７、上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、（１）グ
   アニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類の塩基
   特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離展開さ
   れて形成された四列の分離展開列からなることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ８、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シー
   トとを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
   ートラジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録したのち
   、該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオグ
   ラフを輝尽光として光電的に読み出すことにより得られ
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ９、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせて、支持媒体
   上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該感光材料
   に感光記録したのち、該感光材料上に可視化されたオー
   トラジオグラフを光電的に読み取ることにより得られた
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。