JPS638558A - 核酸の塩基配列決定のための信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処理方法に
関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体の機１走や複製のメカニズムを解明するために
、生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこ
ととなっている。とりわけ。

特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　（もしくはＤＮＡ断片物
、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定することが必
要不可欠なこととなっている。

ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジオグラフィーを利用す
るマキサム・ギルバート□ｌａｍａ層−Ｇｉｌｂｅｒｔ
　）法およびサンガー・クールンン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ）法が知られている。前者のマキサム拳ギ
ルバート法は、まず、塩基配列を決定しようとしている
ＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方の端部に
３２　ｐ等の放射性同位元素を含む基を結合させること
により、その対象物を放射性標識物質としたのち、化学
的な手段を利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩
基特異的に切断する０次に、この操作により得られた塩
基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲル電気泳動法に
より分；寥展開し、多数の切断分解物がそれぞれ分離展
開されて形成された分離展開パターン（ただし、視覚的
には見ることができない）を得る。この分離展開パター
ンをたとえばｘ６フイルム上に可視化してそのオートラ
ジオグラフを得、得られたオートラジオグラフと各々の
塩基特異的切断手段とから、放射性同位元素が結合され
た鎖状分子の端部から一定の位置関係にある１１！基を
順次決定し、これにより対象物全ての塩基配列を決定す
ることができる。

また、後者のサンガーΦクールソン法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子と相補的であって、かつ放射
性標識が付与されたＤＮＡ合成物を化学的な手段を利用
して塩基特異的に合成し１この塩基特異的ＤＮＡ合成物
の混合物を用いて上記と同様にしてそのオートラジオグ
ラフから塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精度
で行なうことを目的として、それに利用されるオートラ
ジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の写
真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、Ｍ積
性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する方
法について既に特許出願している（特開昭５９−８３０
５７号、特願昭５８−２０１２３１号）、ここで、蓄積
性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであり、放
射線エネルギーを該蛍光・体シートの輝尽性蛍光体に吸
収させたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）で
励起することにより、放射線エネルギーを蛍光として放
出させることができるものである。この方法によれば、
露光時間を大幅に短縮化することができ、また従来より
問題となっていた化学カブリ等が発生することがない。

さらに、放射性標識物質のオートラジオグラフは、一旦
放射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち
輝尽光として光電的に読み出されるから、直接にデジタ
ル信号として得たのち適当な記録媒体に保存することが
できる。

従来より、核酸の塩基配列は可視化されたオートラジオ
グラフについて、放射性標識が付与された核酸の塩基特
異的切断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単に
核酸の塩基特異的断片物と称する）の分離展開位置（バ
ンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位置を相互に
比較することにより決定されている。よって、オートラ
ジオグラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれて
おり、そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して得られる核酸の塩基配列が解析者によって
異なるなど塩基配列情報の精度には限界がある。

そこで１本出願人は、上記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後このデジタル信号に適当な信号処理
を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を自動的に決定す
る方法についても既に特許出願している（特開昭５９−
１２６５２７号、特願昭５９−８９６１５号、特願昭６
０−２２６０９１号、特願昭６０−２２６０９２号等）
。オートラジオグラフに対応するデジタル信号は、従来
の放射線フィルムを利用する場合には−畦オートラジオ
グラフを該フィルム上に可視画像化したのち、反射光ま
たは透過光を利用して光電的に読み取ることにより得ら
れる。また、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、オ
ートラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを直接
に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分離展開させて得られた分離展開パ
ターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちである。

たとえば、分離展開パターンは一般に、下部領域（すな
わち、分離展開距離が大きな領域）においては分離展開
バンドの間隔が疎であり、一方、上部の分離展開の開始
位置に近づくにつれてバンドの間隔が密になっている。

ここで、下部とは一般に支持媒体の中央付近より下側の
領域を意味し、また上部とは中央付近より上側の領域を
意味する。従って、上部領域においてはバンドの分離が
十分でないため、二乃至三個のバンドが連結して一個の
幅広なバンドを形成しがちである。

また、試料の分離展開の開始位置または開始時点が各列
で異なることによる列間相互の全体的な位置ズレ（いわ
ゆるオフセット歪み）がある。オフセット歪みはたとえ
ば、ゲル媒体など支持媒体の上端に設けられた多数のス
ロット（試料の注入口）の形状（歪みの大きさ）が完全
に同一ではなく個々に異なりがちであることが原因とな
って発生する。また、試料を支持媒体に付着させる際に
付着位置が相互にずれたり、試料注入直前におけるゲル
媒体の尿素の洗い出しが不十分である場合には試料の支
持媒体への浸入速度が異なることも歪みの発生の一因と
なっている。

さらに、試料の作成時において核酸の塩基特異的断片物
の調製、分離が不十分であったり、あるいは試料を支持
媒体の各スロットに注入する際に他のスロットの試料が
混入したりすることにより、木来現われるへきではない
位置にバンド（これをコーストバンドまたはエクストラ
バンドと呼ぶ）が現われることがある。あるいはまた試
料に放射性不純物が混入したり、露光過程で自然放射線
等の照射を受けたりすることによりノイズが発生するこ
とがある。

このようなバンドの連結（融合）、さらにはオフセット
歪みおよびノイズが発生した場合であっっても、そのオ
ートラジオグラフに対応するデジタル信号を効率良く信
号処理して核酸の塩基配列を高精度で自動決定すること
が望まれる。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフィーを利用して核酸の
塩基配列を自動決定する方法において、／ヘンドの融合
が生じている分離展開パターンであってもそのオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号を好適に信号処理す
ることにより、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度で自動
決定することを実現した。

また、本発明は、分離展開パターンにバンドの融合およ
びオフセット歪みが生じている場合であっても、核酸の
塩基配列を簡易かつ高精度で自動決定することを実現し
た。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された塩ノ＾特
異的ＤＮＡ断片物もしくはｉｆ！基特異的ＲＮＡ断片物
の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて
形成された複数の分＃展開列からなる分離展開パターン
のオートラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を決定す
る方法において。

１）分離展開パターンの下部領域において少なくとも二
つのバンドを連続的に検出する工程、２）検出されたバ
ンドの位置からバンドのピッチについての情報を得、こ
のピッチ情報から次に検出されるべきバンドの分離展開
距離の位置を予測する工程、 ３）予測位置に基づいて分離展開パターン上で一つのバ
ンドを検出する工程、 ４）既に検出されているバンドの位置と上記第三工程で
新たに検出されたバンドの位置から、バンドのピッチに
ついての情報を新たに得、このピッチ情報から次に検出
されるべきバンドの分離展開方向の位置を予測する工程
、 および ５）上記第三および第四工程を順次繰り返すことにより
分離展開パターン上の全てのバンドを検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体上で分離展開させて得られた分離展開パターンに
おいて、部分的にバンドの分離が十分でなく融合バンド
が生じている場合でも、そのオートラジオグラフに対応
するデジタル信号を、融合バンドの分離のための信号処
理機能を有する処理回路を通すことにより、核酸の塩基
配列を簡易かつ高精度で得ることができる。また、従来
においては非常に困難であった融合バンドの分離を行な
うことができるから、−回のオートラジオグラフ測定で
得られる塩基配列情報の量が増加し、このことによって
も目的とする核酸の塩基配列決定が容易となるものであ
る。

さらに、分離展開パターンにバンドの融合と同時にオフ
セット歪みが生じている場合であっても、正確にバンド
を分離して検出することができる。また、エクストラバ
ンドなどのノイズが生じていてもノイズをバンドと誤認
することなく真のバンドのみを検出することができる。

すなわち、バンドの間隔が分離展開パターンの上部と下
部上で異なり、下部領域においては一つ一つのバンドが
十分に分離しているため５分ＭＵ開列全体の位置ずれが
生じていても下端から順序を誤ることなくバンドを一つ
ずつ検出することができる。そして、同じ列内あるいは
異なる列間で連続的に検出されたバンドとバンドの間隔
（これをピッチという）を求め、これに基づいて列ごと
に個別に次にバンドが存在するべき位置を予測すること
ができる。これにより、複数のバンドが融合していても
個々のバンドに適正かつ簡単に分離することができる。

また、次のバンドの位置を列ごとに二つの列にまたがっ
て予測することにより、列間で位置ずれが生じていても
その位こずれを考慮して位置予測を行なうことができる
。

このようにして融合バンドを分離しながらバンドを検出
できることにより、核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精
度で行なうことができる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付かされたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基特異的断
片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の断
片物とは長鎖状の分子の一部分を意味する。たとえば、
塩基特異的ＤＮＡ断片物混合物の一種である塩基特異的
ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・ギルバー
ト法に従って、放射性標識が付与されたＤＮＡを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサンガー
・クールノン法に従って、ＤＮＡをテンプレート（９型
）として、放射性標識が付与されたデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素とを用いて合成
することにより得られる。

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
単位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の１１！基からなるが、一方ＲＮＡはアデニン、グ
アニン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法でコ２Ｐ、Ｉ
Ａ　Ｃ１り５Ｓ、コＨ，”Ｉなとの放射性同位元素を保
持させることによって付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸のＩｉＸ基特異
的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支
持媒体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー
、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフ
ィーなど種々の分離展開方法により支持媒体上に分離展
開される。

次に、放射性標識物質が分子ａ展開された支持媒体につ
いて、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により
、あるいは蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方
法によりそのオートラジオグラフが得られ、次いで適当
な読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルム等の写真感光材料とを低。

温もしくは常温で長時間（数時間〜数十時間）重ね合わ
せて放射線フィルムを感光させたのち、現像して放射性
標識物質のオートラジオグラフを放射線フィルム上に可
視画像化する０次いで、画像読取装置を用いて放射線フ
ィルムとに可視化されたオートラジオグラフを読み取る
。たとえば、放射線フィルムに光ビームを照射してその
透過光または反射光を光電的に検出することにより、オ
ートラジオグラフは電気信号として得られる。さらに、
この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、オートラジ
オグラフに対応するデジタル信号を得ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には。

まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間
（数秒〜数十分間）正ね合わせて蛍光体シートに放射性
標識物質から放出される放射線エネルギーを蓄積させる
ことにより、そのオートラジオグラフを蛍光体シートに
一種の潜像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体シー
トは、たとえばプラスチックフィルムからなる支持体、
二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：
Ｅｕ２°）等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および
透明な保護膜がこの順に植層されたものである＊ａ７に
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、Ｘ線
等の放射線が照射されるとその放射線エネルギーを吸収
して蓄積し、そののち可視乃至赤外領域の光で励起する
と蓄積していた放射線エネルギーを輝尽光として放出す
るという特性を有する。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されたオートラジオグラフを読み出す、Ａ体重には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性標識物質のオートラジオ
グラフは可視画像化することなく直接に電気信号として
得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換すること
により、オートラジオグラフに対応するデジタル信号を
得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
ては、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−１
２６５２７号、特開昭５９−１２６２７８号等の各公報
に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体玉に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得る方法として、従来の放射線写真法および放射
線像変換方法を利用する方法について述へたが、これら
の方法に限定されるものではなく、それ以外の如何なる
方法により得られたデジタル信号であっても放射性標識
物質のオートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可ｆ赴である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジオグラフ
の読取り（または読出し）は、放射線フィルム（または
蓄積性蛍光体シート）の全面に亘って行なう必要はなく
、画像領域のみについて行なうことも勿論可能である。

さらに、予め各分離展開列の位置およびバンドの幅等に
ついての情報を入力して読取り（読出し）条件を設定し
ておき、読取り（読出し）操作においては各バンド上を
一本以りの走査線が通過するような走査ｍ密度で光ビー
ムによる走査を行なうことにより、読取り（読出し）時
間を短縮化して必要な情報を効率良く得ることができる
。なお１本発明においてオートラジオグラフに対応する
デジタル信号とは、このようにして得られたデジタル信
号をも包含する。

得られたデジタル信号ｎｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（Ｚ）
とからなり、一つの信号は一つの画素に対応している。

信号のレベルはその座標における画像濃度、すなわち放
射性標識物質の狼を表わしている。従って、一連のデジ
タル信号（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標
識物質の二次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標識物質の
オートラジオグラフに対応するデジタル信号には、以下
に述べるような本発明の方法により信号処理が施されて
、目的の核酸の塩基配列の決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を１次の四種類の放
射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分離展開列）からなる場合に
ついて説明する。

■）グアニンＣＧ）特異的ＤＮＡ断片物２）アデニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３）チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシン（Ｃ）特異的ＤＮＡｌｌＩｒ片物ここで、
各ｍ基特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解も
しくは合成された、すなわち末端の塩基を同じくする種
々の長さのＤＮＡ断片物からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的ＤＮＡ断片物がそれ
ぞれ四つのスロットに電気泳動されてなる泳動パターン
のオートラジオグラフを示す。泳動方向は矢印（↓）の
方向であり、泳動パターンは下部領域においてバンドの
間隔が疎であるが北部になるにつれてその間隔が密とな
っている。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、信
号処理回路において一旦メモリ（バッファーメモリ、ま
たは磁気ディスク等の不揮発性メモリ）に記憶される。

まず第一に、泳動パターンの下部領域において二つ以上
のバンドを連続的に検出する。

ここで、「連続的に１検出するとは一つのバンドを検出
したのち、続いて泳動列の異同に関係なく泳動方向の位
こに関して最近接のバンドを検出することをいう。

たとえば、各泳動列（レーン）の泳動方向に沿った一定
領域内のデジタル信号を抽出したのち、各レーンについ
て抽出された信号の位置とその信号のレベルとからなる
一次元波形を作成する。なお、デジタル信号の検出を、
前記のように各バンドに走査線がかかるような走査線密
度で泳動方向に走査することにより行なった場合には、
得られたデジタル信号から直接に各レーンについて一次
元波形を作成することができる。

第２図は、各レーンについて信号の位置（Ｘ）と信号の
レベル（２）とからなる−次元波形を部分的に示す。こ
こで、Ｘ方向は泳動方向とは逆の方向である。

一次元波形において、たとえば信号のレベルの差分値の
符号が反転する（＋から−に変化する）点を求めること
により、信号レベルが極大となる位置を探し出す、極大
値は、−次元波形が同一であるか否かに関係なく、泳動
方向の位ｆ！１（Ｘ）に関して連続して少なくとも二箇
所で探し出す必要がある。この極大値となる位置をバン
ドの位置とする。これにより、少なくとも一つのバンド
間隔（ピッチ）を得ることができる。検出すべきバンド
の数は、泳動パターンとの総バンド数およびパターンの
状態などによって異なるが、たとえば総バンド数が１５
０〜２００の範囲にある場合には合計で士数個〜数十個
程度のバンドを検出するのが好ましい、また、バンドは
泳動パターンの最下部で検出するのが好ましい。

検出されたバンドの位ｍ（ｘ）から各ハントに序列を付
ける。第１図に示すように、泳動パターンの下部領域に
おいてはバンドの間隔が疎であり、各バンドが十分に分
離しているのでバンドの序列を直ちに決定することがで
きる。第１図において、下部領域の六つのバンドの左Ｘ
１に記されている数字は、バンドの序列を表わしている
。

第二に、これらのバンド間の距＃（ピッチ）についての
情報を得、このピッチ情報から次に検出されるべきバン
ドの泳動方向の位置を予Δ−する。

バンドのピッチＰ１」（ただし、ｉおよびｊはそれぞれ
１≦ｉ≦４および１≦ｊ≦４の範囲の正整数であり、Ｐ
ｌ、はｉレーンからｊレーンに至るバンドのピッチであ
る）は、各バンドのＸ方向の位置の差として求めること
ができる。たとえば、−・番目のバンドと二番目のバン
ドの検出により、第一レーンと第二レーン間のハントの
ピッチＰＩ２を得る。このようにして順に第１図の六つ
のバントのピッチＰ１２．　Ｐ２１．　Ｐｌａ、Ｐｓｖ
、Ｐ’Ｊ３を得る。

また、ｉレーンにおけるバンドのピッチＰｉｉは、同一
レーンで連続して検出された場合（上記においてｉ＝ｊ
の場合）を除いては、同一レーン。

で二つのバンドを検出したときにピッチの平均値として
求めることができる。たとえば、三番目のバンドの検出
によりＰ目を求めることができる。

すなわち、既に同じ第一レーンで一番目のバンドが検出
されており１両バンド間の距離がニビッチ分に相当する
ことから、これらのバンド間の距離（Ｘ方向の位置の差
）をピッチ数２で割って得られた平均値をｐＨとする。

バンドのピッチはパターンＬ部の泳動開始位ｔに近づく
につれて徐々に小さくはなるが、局所的には１０ピフチ
分程度までならばその平均値をとっても十分高精度でバ
ンドの位置予測に用いることができる。

このようにして、バンドのピッチに関する情報を蓄える
。得られたバンドのピッチ情報は、たとえば行列： （ただし、ｉおよびＪはそれぞれ１≦ｉ≦ｎおよびｌ≦
ｊ≦ｎの範囲の整数であり、ｎは２以上の整数であって
分離展開列の数に等しく、ｐＨはｉ列におけるバンドの
ピッチであり、Ｐｉｔはｉ列からｊ列に至るバンドのピ
ッチである）で表わすことができる。

１記六つのバンドの検出により、行列：が得られる。な
お、行夕９の空白部分はピッチＰｉｊが未定義であるこ
とを意味する。

このピッチ情報に基づいて１次に検出されるべきバンド
の位こを予測する。具体的には、最後に検出されたｉレ
ーンのバンドの位置ｘ１にＰｉｊを加えた値が、ｊレー
ンにおいて次に検出されるべきバンドの予測位置　［Ｘ
　ｊ］である。

［Ｘｊｌ＝Ｘｉ　＋ｐｉｊ たとえば、次にバンドが第三レーンで検出されるとすれ
ば、最後に検出された六番目のバンドの位置にＰ３３を
加えた値がその予測位２ｆｆ［ｘ３］である。第三レー
ン以外のレーンについては、バンドのピッチＰ３ｉが得
られていないのでバンドの位置を予測することができな
い。

このようにして、次に検出されるべきバンドの位置はレ
ーンごとに個別に、かつレーン間の位置関係を考慮して
予測することができる。従って、オフセット歪みのよう
なレーン全体の位置ずれを加味した上で各レーンについ
てバンドの位置を予ΔＩＩＩすることができるから、よ
り正確に融合バンドを分離し、エクストラバンドを捨象
して真正バンドのみを検出することができる。

第三に、予測位置に基づいて泳動パターン上で一つのバ
ンドを検出する。

ａ）まず、いずれかのレーンの一次元波形において予測
位置付近で信号レベルが極大となる場合には、この極大
となる位置にバンドが存在すると決定することにより、
バンドを一つ検出する。なお、上記ｔｈ！！基特異的Ｄ
ＮＡ断片物の組合せ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）が相互に排他的
であることから、一つのレーンでバンドが検出されれば
、他のレーンの同−位ｌにはバンドは存在しないと決定
することができる。

ｂ）予測位置付近で信号レベルが極大とならなすかつ位
置を予測することができないレーンがある場合には、位
置の予測されたレーンにはバンドは存在せず他の予測不
能のレーンにバンドが存在するとして、最後に検出され
たバンドの位置より上部の他のレーン上で最初に信号レ
ベルが極大となる位ｌを求め、この位置をバンドの位置
と決定することにより、バンドを検出する。

Ｃ）あるいは、予測位置付近で信号レベルが極大となら
ずかつ全てのレーンで位にか予測されている場合には、
予測位置付近で信号レベルが最も高いレーンにバンドが
存在し、その予測位置をバンドの位ごと決定することに
より、バンドを検出する。

たとえば第２図に示すように、最後に検出された第二レ
ーンのバンド（位置ａ）に対してはピッチＰ２１〜Ｐ２
４に基づいて、それぞれ各レーンの一次元波形上でバン
ドの予測位７１　ｂ　−ｅが決まる。

いずれの予測位置付近においても信号レベルは極大とな
らないので、信号レベルが最大である第四レーン（位置
ｅ）にバンドは存在すると決定する。

これにより、二つ以上のバンドの融合あるいはノイズの
発生によりバンドのピークが定かではない場合であって
も、バンドを好適に分離して検出することができる。

第四に、新たに検出されたバンドの位置と既に検出され
ているバンドの位置とから、バンドのピッチ情報を更新
し、このピッチ情報に基づいて次に検出されるべきバン
ドの位置を再び予測する。

まず、最後にバンドが検出されたｉレーンから新たにバ
ンドが検出されたｊレーンに至るｌ（ンドのピッチを直
接に求めることができる。これをＬ記行列におけるＰ＋
ｊとする。

また、最後にバンドが検出されたレーンとは異なるレー
ンでバンドが検出され（ｉ≠ｊ）、かつｊレーン上で既
にバンドが検出されている場合には、該バンドと新たに
検出されたバンドの間の距離を相当するピッチ数で割っ
た平均値を求め、これを行列におけるＰｊｊとする。

さらに、Ｐ　ｋｊ　（ただし、ｋはｉおよびｊ以外の１
≦に≦４の範囲の整数である）についても、既に求めら
れているＰｋｉを用いて Ｐ　ｋＪ＝　（Ｐ　ｋ１＋　Ｐ　１」）　／　２なる演
算により、平均値として求めることも回旋である。

あるいは、たとえば第一レーンから第二レーンに至るバ
ンドのピッチがＰＩ３からＰ゛１２に更新された場合に
、ピッチの変化は ΔＦ　＋２＝Ｐ’１２−　Ｐ　１２ である。各レーンの相対位置は不変である（すなわち、
レーン間で局所的な位置ずれもしくはその変動は生じて
いない）とすれば、このピッチの変化は純粋に泳動距離
に応じたピッチの変化であると言えるから、他のレーン
と第二レーン間のバンドのピッチについても該バンドの
位置付近であれば同様に変化するとみなすことができる
。

ΔＰ１２＝ΔＰ　３２＝　Ｐ　４２ 従って、 Ｐ’３２＝Ｐ］２＋ΔＰ３２ Ｐ′４２＝Ｐ４２＋ΔＰ４２ として、それぞれバンドのピー２チを更新することがで
きる。

後者の二つ更新手段は、レーン間の位置ずれがそれほど
大きくない場合に有効な方法であり、一つのバンドの検
出によってピッチの微調整を広範に行なうことができる
との利点がある。

次いで、この部分的に更新されたピッチ情報に基づいて
、上記と同様にして次のバンドの予測位置を求める。

このようにして、予測位置に基づいて一つのバンドを検
出するたびにピッチ情報を更新し１次のバンドの位６を
予測する操作を泳動パターンの上端部まで繰り返すこと
により、泳動パターン上の全てのバンドを一つずつ検出
することができる。

バンドを一つ検出するごとにピッチ情報が更新されるか
ら、常に最新のピッチ情報に基づいて次のバンドの位置
予測を精度高く行なうことができる。

なお、泳動パターンにバンドの融合のほかに、スマイリ
ング現象、オフセット歪みなどの種々の歪みあるいはエ
クストラバンド等のノイズが発生している場合には、上
記の操作を行なう前にまたはその途中でこれらの補正の
ための信号処理を行なってもよい。

ここで、スマイリング現象は、支持媒体の中央部のスロ
ットの泳動距離に比べて両端部のスロットの泳動距離が
短くなる現象であり、泳動過程における放熱効果（いわ
ゆるエツジ効果）などが原因となって生じるものである
。信号処理によるこれらの補正の詳細については、本出
願人による特願昭６０−７４８９９号、特願昭６０−７
４９００号、特願昭６０−８５２７５号、特願昭６０−
８５２７６号、特願昭６０−２２６０９１号、昭和６１
年３月２９日出願の特願昭６１−７１８８１号および昭
和６１年４月１９日出願の特願昭６１−９０６０７号の
各明細書に記載されている。

検出された真正バンドの位置をレーン間で相互に比較す
ることにより、直ちにバンドに序列を付けることができ
る。このとき、上記四種類の塩基特異的ＤＮＡ断片物の
組合せが排他的な組合せであることから、異なるレーン
上の同じ位置に二つ以上のバンドは存在しえないことを
利用して、容易に序列を決定することができる。上記（
１）〜（４）のスロットはそれぞれ（Ｇ）、（Ａ）、（
Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基についての情報を有する
から、各バンドの属するスロットに対応する塩基で置換
することにより、ＤＮＡの塩基配列（例えばＡ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−・・・）を得ることができる。

このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての１
′！！基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡの
塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られる
ものではなく、たとえば所望により同時に各バンドの強
度（Ｚ゛）を放射性標識物質の相対量として表示するこ
とも可能、である、さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両
方についての塩基配列を表示することもできる。

あるいはまた、ＤＮＡの塩基配列情報は、上記の信号処
理がなされたデジタル信号に基づいて画像として表示す
ることもできる。すなわち、各／ヘンドの補正後の位置
をオリジナルのオートラジオグラフとともに可視画像化
して表示することができる。この場合には、最終的な塩
基配ター決定を解析者自身がこの表示画像に基づいて行
なうことが可ず近である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ断
片物の混合物とＬ４　（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合
せを利用した場合について説明したが１本発明の信号処
理方法はこの組合せに限定されるものではなく、例えば
（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用
することができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片
物の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）につい
ても本発明の信号処理方法を適用することができる。

このようにして得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既に記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行な
うことも可能である。

と述の信号処理により決定された核酸の塩基配列につい
ての情報は、信号処理回路から出力されたのち１次いで
直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気テー
プなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送される。

記録装ことしては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に表示さ
れた記号＠数値をビデオ・プリンター等に記録するもの
、熱線を用いて感熱記録材料上に記録するものなど種々
の原理に基づいた記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バンドの融合が生じている泳動パターンの例
を示す図である。 第２図は、各レーンについて信号の位置（Ｘ）と信号の
レベル（Ｚ）とからなる−次元波形を示す部分図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
   しくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持媒体上に
   一次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展
   開列からなる分離展開パターンのオートラジオグラフに
   対応するデジタル信号について信号処理を行なうことに
   より、核酸の塩基配列を決定する方法において、 １）分離展開パターンの下部領域において少なくとも二
   つのバンドを連続的に検出する工程、２）検出されたバ
   ンドの位置からバンドのピッチについての情報を得、こ
   のピッチ情報から次に検出されるべきバンドの分離展開
   方向の位置を予測する工程、 ３）予測位置に基づいて分離展開パターン上で一つのバ
   ンドを検出する工程、 ４）既に検出されているバンドの位置と上記第三工程で
   新たに検出されたバンドの位置から、バンドのピッチに
   ついての情報を新たに得、このピッチ情報から次に検出
   されるべきバンドの分離展開方向の位置を予測する工程
   、 および ５）上記第三および第四工程を順次繰り返すことにより
   分離展開パターン上の全てのバンドを検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
   号処理方法。 ２、上記第一および第三工程において、各列について分
   離展開方向に沿った位置と信号のレベルとからなる一次
   元波形を得たのち、この一次元波形上で信号レベルが極
   大となる位置を求めることによりバンドを検出すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配
   列決定のための信号処理方法。 ３、上記第二および第四工程において、バンドのピッチ
   についての情報を、行列： Ｐ＝（Ｐ＿１＿１Ｐ＿１＿２……Ｐ＿１＿ｎＰ＿２＿１
   Ｐ＿２＿２……Ｐ＿２＿ｎ ：Ｐ＿ｉ＿ｉＰ＿ｉ＿ｊ： ：： Ｐ＿ｎ＿１…………Ｐ＿ｎ＿ｎ） （ただし、ｉおよびｊはそれぞれ１≦ｉ≦ｎおよび１≦
   ｊ≦ｎの範囲の整数であり、ｎは２以上の整数であって
   分離展開列の数に等しく、Ｐ＿ｉ＿ｉはｉ列におけるバ
   ンドのピッチであり、Ｐ＿ｉ＿ｊはｉ列からｊ列に至る
   バンドのピッチである） として得ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ４、上記第二および第四工程において、最後に検出され
   たバンドの位置ｘ＿ｉにＰ＿ｉ＿ｊを加えた値を求める
   ことにより、ｊ列において次に検出されるべきバンドの
   位置ｘ＿ｊを予測することを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法
   。 ５、上記第三工程において、 ａ）予測位置付近で信号レベルが極大となる場合には、
   この極大となる位置にバンドが存在すると決定する、 ｂ）予測位置付近で信号レベルが極大とならなずかつ位
   置を予測することができない列がある場合には、最後に
   検出されたバンドの位置より上部の該列上で最初に信号
   レベルが極大となる位置を求め、この位置にバンドが存
   在すると決定する、または ｃ）予測位置付近で信号レベルが極大とならずかつ全て
   の列で位置が予測されている場合には、予測位置付近で
   信号レベルが最も高い列にバンドが存在すると決定する
   、 ことによりバンドを検出することを特徴とする特許請求
   の範囲第２項記載の核酸の塩基配列決定のための信号処
   理方法。 ６、上記第四工程において、 ａ）最後にバンドが検出されたｉ列から新たにバンドが
   検出されたｊ列に至るバンドのピッチを行列におけるＰ
   ＿ｉ＿ｊとする、および ｂ）ｊ列上で既にバンドが検出されている場合には、該
   バンドと新たに検出されたバンドの間の距離をバンドの
   ピッチ数で割った平均値を行列におけるＰ＿ｊ＿ｊとす
   る、 ことによりバンドのピッチについての情報を新たに得る
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ７、上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、（１）グ
   アニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類の塩基
   特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離展開さ
   れて形成された四列の分離展開列からなることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
   ための信号処理方法。 ８、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シー
   トとを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
   ートラジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録したのち
   、該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオグ
   ラフを輝尽光として光電的に読み出すことにより得られ
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ９、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
   、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせて、支持媒体
   上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該感光材料
   に感光記録したのち、該感光材料上に可視化されたオー
   トラジオグラフを光電的に読み取ることにより得られた
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。