JPH0570791B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処
理方法に関するものである。

〔発明の背景〕

近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかに
することが必須のこととなつている。とりわけ、
特定の遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片
物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定する
ことが必要不可欠なこととなつている。

DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利用するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決
定しようとしているDNAあるいはDNA断片物の
鎖状分子の一方の端部に³²P等の放射性同位元素
を含む基を結合させることにより、その対象物を
放射性標識物質としたのち、化学的な手段を利用
して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的
に切断する。次に、この操作により得られた塩基
特異的DNA切断分解物の混合物をゲル電気泳動
法により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞ
れ分離展開された形成された分離展開パターン
（ただし、視覚的には見ることができない）を得
る。この分離展開パターンをたとえばＸ線フイル
ム上に可視化してそのオートラジオグラフを得、
得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異的
切断手段とから、放射性同位元素が結合された鎖
状分子の端部から一定の位置関係にある塩基を順
次決定し、これにより対象物全ての塩基配列を決
定することができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはDNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、この塩基特異的DNA合成物の混合物を用い
て上記と同様にしてそのオートラジオグラフから
塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易か
つ高精度で行なうことを目的として、それに利用
されるオートラジオグラフ測定操作において、上
記Ｘ線フイルム等の写真感光材料を用いる従来の
放射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法を利用する方法について既
に特許出願している（特開昭59−83057号、特願
昭58−201231号（特開昭60−93354号））。ここで、
蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるもの
であり、放射線エネルギーを該蛍光体シートの輝
尽性蛍光体に吸収させたのち、可視乃至赤外領域
の電磁波（励起光）で励起することにより、放射
線エネルギーを蛍光として放出させることができ
るものである。この方法によれば、露光時間を大
幅に短縮化することができ、また従来より問題と
なつていた化学カブリ等が発生することがない。
さらに、放射性標識物質のオートラジオグラフ
は、一旦放射線エネルギーとして蛍光体シートに
蓄積されたのち輝尽光として光電的に読み出され
るから、直接にデジタル信号として得たのち適当
な記録媒体に保存することができる。

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオ
ートラジオグラフについて放射性標識が付与され
た核酸の塩基特異的切断分解物もしくは塩基特異
的合成物（以下、単に核酸の塩基特異的断片物と
称する）の分離展開部位（バンド）を視覚的に判
断し、それらのバンドの位置を相互に比較するこ
とにより決定されている。よつて、オートラジオ
グラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれ
ており、そのために多大な時間と労力が費されて
いる。

また、人間の目に依存しているため、オートラ
ジオグラフを解析して得られる核酸の塩基配列が
解析者によつて異なるなど塩基配列情報の精度に
は限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後このデジタル信号に
適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特願昭59−
89615号（特開昭60−23557号）、特願昭60−
226091号（特開昭62−85861号）、特願昭60−
226092号（特開昭62−85862号）等）。オートラジ
オグラフに対応するデジタル信号は、従来の放射
線フイルムを利用する場合には一旦オートラジオ
グラフを該フイルム上に可視画像化したのち、反
射光または透過光を利用して光電的に読み取るこ
とにより得られる。また、蓄積性蛍光体シートを
用いる場合には、オートラジオグラフが蓄積記録
された蛍光体シートを直接に読み出すことにより
得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳
動法などにより支持媒体上に分離展開させて得ら
れた分離展開パターンには種々の歪みおよびノイ
ズが生じがちである。たとえば、試料の作成時に
おいて核酸の塩基特異的断片物の調製、分離が不
十分あつたり、試料を支持媒体の各スロツトに注
入する際に他のスロツトの試料が混入したりする
ことにより、本来現われるべきではない位置にバ
ンド（これをゴーストバンドまたはエクストラバ
ンドと呼ぶ）が現われることがある。あるいは試
料に放射性不純物が混入したり、露光過程で自然
放射線等の照射を受けたりすることによりノイズ
が発生することがある。

また、分離展開開始位置付近のバンドの密な領
域においては一つ一つのバンドが十分に分離して
いず、複数のバンドが融合していることがある。

この結果、これらのエクストラバンド、ノイズ
および融合バンドも含めてバンドの比較同定が行
なわれるために、塩基配列決定に誤差が生じて得
られる情報の精度が低下してしまう。このような
ノイズあるいはバンドの融合が発生した場合であ
つても、そのオートラジオグラフに対応するデジ
タル信号を効率良く信号処理して核酸の塩基配列
を高精度で自動決定することが望まれる。

〔発明の要旨〕

本発明は、オートラジオグラフイーを利用して
核酸の塩基配列を自動決定する方法において、ノ
イズあるいはバンドの融合が生じている分離展開
パターンであつてもそのオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を好適に信号処理することに
より、核酸の塩基配列を簡易かつ高精度で自動決
定することを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された
塩基特異的DNA断片物もしくは塩基特異的RNA
断片物の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分
離展開されて形成された複数の分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において、 １） 分離展開列ごとに分離展開方向ｘに沿つた
直線上で、探索開始点の信号レベルlsおよび信
号レベルの閾値ln（ただし、ｎは０または正の
整数である）に基づいて探索開始点に最も近い
バンドを一つ探し出す工程、および ２） 閾値lnに基づいて該バンドの領域を求めた
のち、この領域の大きさに基づいて ａ） 該バンドは真のバンドであると決定して
バンドを検出する、または ｂ） 該バンドは真のバンドではないと決定し
て上記第一工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について一つのバンド
を検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混
合物を支持媒体上で分離展開させて得られた分離
展開パターンのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号について、分離展開パターンにノイズ
および／または融合バンドが生じている場合であ
つても、ノイズをバンドと判断することなく、か
つ融合バンドを一つ一つのバンドに分離しながら
真正なバンドのみを有効に検出しうる機能を有す
る信号処理回路を通すことにより、核酸の塩基配
列を自動的に簡易かつ高精度で得ることができ
る。

すなわち、予め信号レベルの閾値とバンドの大
きさに関する一定範囲とを設定しておき、まず分
離展開方向に沿つた探索線上で閾値を越える信号
が見つかつた場合にバンド有りとみなし、次いで
このバンドの大きさが一定範囲内である場合に真
正な一つのバンドと決定することにより、エキス
トラバンド等のノイズをバンドと誤認することな
く、また融合バンドを一つのバンドと読み誤るこ
となく、精確にバンドを検出することができる。
特に、バンドの大きさが予め設定された範囲を越
えた場合には閾値をより大きな値に変更して上記
操作をやり直すことにより、ノイズの影響を排除
し、融合バンドを適確に分離しながらバンドを確
定することができる。

また、試料の分離展開条件は展開条件等に左右
されやすいために分離展開列自体が曲がつて蛇行
したり、また支持媒体と写真感光材料もしくは蓄
積性蛍光体シートとを重ね合わせて露光する際
に、その重ね合わせがずれたためなどによりパタ
ーン全体が傾くことが多い。核酸の塩基配列を高
精度で自動決定するためには一般に、各分離展開
列（レーン）についてそのレーンに精確に沿つた
一次元波形（プロフアイル）を作成することが望
まれるが、レーンの蛇行あるいはパターンの傾斜
が生じている場合にはその作成に際して各レーン
を追尾する必要がある。本発明によれば、真のバ
ンドおよびその形状を確定することができるか
ら、この結果を用いて好適にレーン追尾を行なう
ことが可能である。

そして、検出された真正バンド、さらにはこれ
に基づく一次元のプロフアイルに対して更に好適
な信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列
を簡便かつ高精度で自動決定することができる。

〔発明の構成〕

本発明において用いられる試料の例としては、
放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核酸の
塩基特異的断片物の混合物を挙げることができ
る。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一
部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA断
片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断分
解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法に
従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的DNA合成物混合物は前述の
サンガー・クールソン法に従つて、DNAをテン
プレート（鋳型）として、放射性標識が付与され
たデオキシヌクレオシドトリフオスフエートと
DNA合成酵素とを用いて合成することにより得
られる。

さらに、塩基特異的RNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種類の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁶S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知
の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層ク
ロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイー、
ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離展開
方法により支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について、従来の写真感光材料を用いる放射線
写真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法によりそのオートラジオグ
ラフが得られ、次いで適当な読取り（読出し）系
を介して放射性標識物質のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず
支持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低
温もしくは常温で長時間（数時間〜数十時間）重
ね合わせて放射線フイルムを感光させたのち、現
像して放射性標識物質のオートラジオグラフを放
射線フイルム上に可視画像化する。次いで、画像
読取装置を用いて放射線フイルム上に可視化され
たオートラジオグラフを読み取る。たとえば、放
射線フイルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オー
トラジオグラフは電気信号として得られる。さら
に、この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、
オートラジオグラフに対応するデジタル信号を得
ることができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識物質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。

得られたデジタル信号Dxyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標ｘ，ｙとその座標における信号のレ
ベルｚとからなり、一つの信号は一つの画素に対
応している。信号のレベルはその座標における画
像濃度、すなわち放射性標識物質の量を表わして
いる。従つて、一連のデジタル信号（すなわち、
デジタル画像データ）は放射性標識物質の二次元
的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上の放射性標
識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信号には、以下に述べるような本発明の方法によ
り信号処理が施されて、目的の核酸の塩基配列の
決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四
種類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物の組合せにより形成された泳動列（分離展
開列）からなる場合について説明する。

１） グアニン(G)特異的DNA断片物 ２） アデニン(A)特異的DNA断片物 ３） チミン(T)特異的DNA断片物 ４） シトシン(C)特異的DNA断片物 ここで、各塩基特異的DNA断片物は、塩基特
異的に切断分解もしくは合成された、すなわち末
端の塩基を同じくする種々の長さの長さのDNA
断片物からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的DNA合成
物がそれぞれ四つのスロツトに電気泳動されてな
る泳動パターンのオートラジオグラフを示す。泳
動方向はｘ方向である。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

まず第一に、泳動列（レーン）ごとに探索開始
点から始めて泳動方向ｘに沿つた直線（探索線）
上で、探索開始点の信号レベルlsおよび信号の初
期閾値loに基づいてバンドを探し出す。

ここで、泳動方向は、レーンの蛇行およびパタ
ーンの傾斜が生じている場合に、実際のパターン
に完全に一致する泳動方向を意味するものではな
く、試料を電気泳動させようした方向であつて通
常は支持媒体（すなわち、重ね合わせられた写真
感光材料もしくは蓄積性蛍光体シート）の長軸方
向（ｘ方向）を意味する。

また、探索開始点はレーンごとに泳動方向上の
任意の点を選ぶことができる。バンドの探索は泳
動方向に（パターンの上部から下部に向かつて）
行なうのが好ましい。初期閾値loは、バンドの有
無を判別するための信号レベルの閾値（基準値）
ln（ただし、ｎは０または正の整数である）の初
期値であり、比較的低い値に設定される。バンド
の大きさが一定範囲以上である場合には後述する
ように順次より高い値に設定変更されうる。

具体的には、たとえば次のようにしてバンドを
検出する。

第２図１は、一つのレーンについての部分的な
オートラジオグラフであり、バンド１を平面的に
濃淡画像として表示した図である。バンド探索は
泳動方向ｘに沿つた直線２について行なわれる。

第２図２は、この直線２についてｘ方向の位置
と信号レベルとからなる一次元波形を示す。すな
わち、バンド探索はこの一次元波形に基づいて行
なわれるのであるが、デジタル信号は各読取り
（読出し）画素に対応しているから、実際には一
次元波形は不連続点の集合である。

探索開始点の信号レベルlsと初期閾値loとの関
係に基づいて場合分けすると、第３図に示すよう
な五通りの場合が起こりうる。なお、第３図は第
２図２の一次元波形を部分的に示す図であり、白
点は探索開始点を表わし、黒点はバンド検知点を
表わしている。すなわち、 (1) 開始レベルlsが初期閾値lo以下（ls≦lo）で
あつて、かつ信号レベルが増加する傾向にある
場合「第３図１〕、 (2) 開始レベルlsが初期閾値lo以下（ls≦lo）で
あつて、かつ信号レベルが減少する傾向にある
場合〔第３図２〕、 (3) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが増加する傾向にあ場合
〔第３図３〕、 (4) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが減少する傾向にある
（そして、信号レベルは一度閾値loを下回る）
場合〔第３図４）、および (5) 開始レベルlsが初期閾値loより高く（ls＞
lo）、かつ信号レベルが減少する傾向にあるも
のの閾値loを下回らない場合〔第３図５〕、 である。

なお、上記(5)の場合はバンドが近接していてバ
ンドとバンドとの間隔が十分ではないときに生
じ、いわゆるバンドの融合を表わしている。

上記(1)および(2)の場合（ls≦lo）は最も単純な
ケースであり、信号レベルが一次元波形上で次に
初めて閾値lo以上となる点をバンド検知点とす
る。

上記(3)の場合（ls＞lo）には既に開始点が検出
すべきバンドの領域にあるので、信号レベルが次
に開始レベルls以上となる点をバンド検知点とす
る。

上記(4)の場合（ls＞lo）にはまだ開始点が検出
済みのバンドの領域にあるので、信号レベルが一
度閾値loを下回つた後初めて閾値lo以上となる点
をバンド検知点とする。

そして、上記(5)の場合（ls＞lo）にはバンド間
で信号レベルが閾値lo以下とならないので、次に
初めて開始レベルls以上となる点をバンド検知点
とする。

このようにバンド検知点を定めることにより、
既に決定されたバンドを再び検出したり、次に検
出すべきバンドを探し損なうことなく、バンド検
出を行なうことができる。

第二に、探し出されたバンドについて閾値loに
基づいてその領域を求め、次いで領域の大きさか
ら該バンドが真のバンドであるか否かを決定し、
真のバンドである場合にのみ検出すべきバンドと
する。

まず、バンドは上記バンド検知点に連なつてい
る点の集合であるとして、バンド検知点を基点と
してそれに上下左右斜めのいずれかで連続し、か
つ信号レベルが閾値lo以上である点を求める。得
られたバンド検知点を含む連続した領域がバンド
の領域である。

次いで、バンドの領域の大きさを求める。領域
の大きさはたとえば、領域のｘ方向の最大距離x₀
およびｘ方向に直角な方向ｙの最大距離y₀で見積
ることができる。

第４図に、探し出されたバンドの領域（斜線部
分：３）の例を示す。

予め、一つのバンドとして容認できるｘ方向お
よびｙ方向の最小の幅xmin、ymin、並びにｘ方
向およびｙ方向の最大の幅xmax、ymaxを設定
しておく。すなわち、xminおよびyminは真正バ
ンドとノイズを区別するための設定値であり、
xmaxおよびymaxは単一のバンドと複数個が併
合したバンドを区別するための設定値である。

ａ） 距離x₀およびy₀がいずれも上記最小幅と最
大幅の範囲内にある（lmin≦x₀≦xmaxかつ
ymin≦yo≦ymax）場合には、得られたバン
ドは真のバンドであると決定し、このバンドを
検出すべきバンドとする。

b₁） 距離xoおよび距離yoのうちの少なくとも
一方が上記最小幅よりも小さい（xo＜xminま
たはyo＜ymin）場合には、得られたバンドは
エクストラバンドであつて真のバンドではない
と決定したのち、バンド検知点よりさらに下部
の領域についてバンド探索を行なう。

b₂） 上記ａおよびb₁以外の場合であつて、距離
xoおよび距離yoのうちの少なくとも一方が上
記最大幅よりも大きい（xo＞xmaxもしくはyo
＞ymax）場合には、バンドの分離が十分では
ないとして、閾値l₀をl₁に変更して探索開始点
から再びバンド探索をやり直す。

ここで、新たな閾値l₁はl₀に一定の増分Δlを加
えた値（l₁＝l₀＋Δl）であり、閾値を高くしてバ
ンドを探索し直すことにより、融合バンドを一つ
一つに分離して真のバンドを決定し、あるいは相
対的に信号レベルの小さなエクストラバンドを好
適に除去することができる。

一般に、バンド領域が大き過ぎる場合には何度
でも閾値lnをより高い値l_o+1（l_o+1＝l_o＋Δl；ここ
で、ｎ＋１は閾値を変更した回数を表わす）に変
更して、探索開始点からバンド探索を繰り返すこ
とができる。この場合に、予め閾値の最大値
lmaxを設定しておき、変更後の閾値l_o+1が最大値
以下である（l_o+1≦lmax）場合にはこの閾値l_o+1
に基づいて探索開始点からバンド探索をやり直す
が、閾値l_o+1が最大値よりも大きくなる（l_o+1＞
lmax）場合にはバンドの分離は不可能であると
して、該バンドは真のバンドではないと決定して
バンド検知点より下部領域でバンド探索を行なう
のが処理効率および精度の点から好ましい。

なお、バンドの大きさの判定は上記手段に限ら
れるものではなく、たとえばバンド領域に含まれ
る信号の数から判断することも可能である。

このようにして、各レーンについての真のバン
ドが一つ検出されるまで（上記ａの場合が起こる
まで）バンドの探索を繰り返す。

このようにして検出された真正バンドを用い
て、DNAの塩基配列を自動決定することができ
る。たとえば、得られた真正バンドの領域を利用
して各レーンを好適に追尾し、ｘ方向上の位置と
信号のレベルとからなる精確な一次元波形（プロ
フアイルレーン）を得、これに更に適当な信号処
理を施すことより塩基配列を自動決定することが
できる。

たとえば、レーンの追尾は以下のようにして行
なうことができる。

まず、各レーンで検出されたバンドのうち泳動
開始位置に最も近い、すなわち最もパターン上部
に位置するバンド（これをバンドＡとする）を有
するレーンについて、次の追尾開始点（同時に次
のバンドの探索開始点でもある）を決定する。

次の追尾開始点のｙ座標は、第４図に示すよう
に、バンドＡの領域３におけるｙ方向の最大距離
の中点とする。また、ｘ座標は、バンドＡの領域
内でこのｙ座標を有する点のうち追尾開始点から
最も遠い点のｘ座標とする。第４図において、座
標xa，yaが次の追尾開始点であり、矢印の方向
にレーンの追尾（およびバンドの探索）が行なわ
れる。

次に、残りの三つのレーンについてそれぞれ、
次の追尾開始点を決定する。

他のレーンのバンド（これをバンドＢとする）
の領域とバンドＡのｘ方向の領域とが少しでも重
なる場合には、座標xaを次の追尾開始点のｘ座
標とし、バンドＢの領域におけるｙ方向の最大距
離の中点を次の追尾開始点のｙ座標とする。

また、他のレーンのバンドＢの領域とバンドＡ
のｘ方向の領域とが全く重ならない場合には、座
標xaを次の追尾開始点のｘ座標とし、バンドＡ
のレーンにおける次の追尾開始点の座標yaと初
めの追尾開始点（探索開始点）ysとの差を、バン
ドＢのレーンの初めの追尾開始点ys′に加えた
値：ys′＋（va−ys） を次の追尾開始点のｙ座標とする。

そして、レーンごとに新たに設定された追尾開
始点からパターンの下部に向かつてｘ方向に沿つ
た直線上で、上述した方法に従つて再びバンドの
探索を行なう。

この際に、閾値lnは常に初期値l₀から始める。
そして閾値lnはlmax以下で終わるようにするの
が好ましい。

バンドが一つも検出されなくなるまで、本発明
に係るバンド検出操作と上記レーン追尾操作を順
次繰り返す。これにより、レーンの上端部から下
端部までレーン追尾を完了することができる。

以上に述べたレーンの追尾の詳細については、
本出願人による昭和61年４月19日出願の特願昭61
−90607号明細書（特開昭62−247225号）に記載
されている。

このようにして得られたレーンの追尾情報に基
づいて、たとえばレーンに沿つた一定幅の信号を
抽出して一次元のプロフアイルを得たのち、プロ
フアイルについて信号レベルが極大となる位置を
求めることによりバンドの位置を決定する。そし
て、レーン間で決定された真正バンドの位置を相
互に比較することにより、直ちにバンドに序列を
付けることができる。このとき、上記四種類の塩
基特異的DNA合成物の組合せが排他的な組合せ
であることから、異なるレーン上の同じ泳動位置
に二つ以上のバンドは存在しえないことを利用し
て、容易に序列を決定することができる。上記(1)
〜(4)のスロツトはそれぞれ(G)、(A)、(T)、(C)からな
る末端塩基についての情報を有するから、各バン
ドの属するスロツトに対応する塩基で置換するこ
とにより、DNAの塩基配列（例えばＡ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−…）を得ることができる。

このようにして、DNAの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、
DNAの塩基配列についての情報は、上記の表示
形態に限られるものではなく、たとえば所望によ
り同時に各バンドの強度z′を放射性標識物質の相
対量として表示することも可能である。さらに、
DNAの二本の鎖状分子両方についての塩基配列
を表示することもできる。

あるいはまた、DNAの塩基配列情報は、上記
の信号処理がなされたデジタル信号に基づいて画
像として表示することもできる。すなわち、各バ
ンドの補正後の位置をオリジナルのオートラジオ
グラフとともに可視画像化して表示することがで
きる。この場合には、最終的な塩基配列決定を解
析者自身がこの表示画像に基づいて行なうことが
可能である。

なお、上記においては、試料である塩基特異的
DNA合成物の混合物としてＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの排
他的組合めと利用した場合について説明したが、
本発明の信号処理方法はこの組合せに限定される
ものではなく、例えばＧ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ、Ｃな
どの種々の組合せに適用することができる。また
同時に、塩基特異的RNA断片物の混合物（例え
ば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）についても本発明
の方法を適用することができる。さらに、バンド
の検出は、一組の核酸の塩基特異的断片物の分離
展開列に限定されるものではなく、支持媒体上に
同時に分離展開された全ての分離展開列について
行なうことが可能である。

このようにして得られた塩基配列情報について
はこのほかにも、たとえば、既に記録保存されて
いる他の核酸の塩基配列と照合するなどの遺伝言
語学的情報処理を行なうことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配
列についての情報は、信号処理回路から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により磁
気デイスクや磁気テープなどの記憶保存手段を介
して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に表示された記号・数値をビデオ・プリ
ンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱記録
材料上に記録するものなど種々の原理に基づいて
記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、泳動パターンのオートラジオグラフ
の例を示す部分図である。第２図の１は、一つの
レーンについてのオートラジオグラフ（濃淡画
像）の例を示す部分図であり、２は、直線２につ
いてｘ方向の位置と信号レベルからなる一次元波
形を示す。第３図１〜５は、第２図２の一次元波
形の部分拡大図である。第４図は、検出されたバ
ンドの領域の例を示す図である。 １：バンド、２：直線（探索線）、３：バンド
の領域、白点：追尾開始点、黒点：バンド検知
点。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
   片物もしくは塩基特異的RNA断片物の混合物が
   支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
   された複数の分離展開列のオートラジオグラフに
   対応するデジタル信号について信号処理を行なう
   ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
   いて、 １） 分離展開列ごとに分離展開方向ｘに沿つた
   直線上で、探索開始点の信号レベルlsおよび信
   号レベルの閾値ln（ただし、ｎは０または正の
   整数である）に基づいて探索開始点に最も近い
   バンドを一つ探し出す工程、および ２） 閾値lnに基づいて該バンドの領域を求めた
   のち、この領域の大きさに基づいて ａ） 該バンドは真のバンドであると決定して
   バンドを検出する、または ｂ） 該バンドは真のバンドではないと決定し
   て上記第一工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について一つのバン
   ドを検出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ２ 上記第一工程において、探索開始点の信号レ
   ベルlsおよび信号レベルの閾値lnに関して ａ） ls≦lnであるとき、信号レベルが次に閾値
   ln以上となる点をバンド検知点とする、 または ｂ） ls＞lnであるとき、信号レベルが次に閾値
   lnを下回つた後閾値ln以上となる点、もしくは
   信号レベルが次に閾値lnを下回ることなく開始
   レベルls以上となる点をバンド検知点とする、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ３ 上記第二工程において、信号レベルが閾値ln
   以上であるバンド検知点を含む連続した領域を求
   めたのち、この領域のｘ方向の最大距離xnおよ
   びｙ方向の最大距離ynに関して、 ａ） xmin≦xn≦xmaxであり、かつymin≦yn
   ≦ymaxであるとき、距離xnおよびynで区切ら
   れた領域を真のバンドと決定することによりバ
   ンドを検出する、 b₁） xn＜xminもしくはyn＜yminであるとき、
   距離xnおよびynで区切られた領域を真のバン
   ドではないと決定したのちバンド検知点より探
   索方向に第一工程からやり直す。 または b₂） xn＞xmaxもしくはyn＞ymaxであると
   き、距離xnおよびynで区切られた領域を真の
   バンドではないと決定したのち閾値をln＋Δl＝
   l_o+1に変更して探索開始点より探索方向に第一
   工程からやり直す、 （ただし、xmin、xmax、yminおよびymaxは
   それぞれ定数であつて、バンドとして認められ
   るｘ方向の最小幅、ｘ方向の最大幅、ｙ方向の
   最小幅およびｙ方向の最大幅であり；Δlは閾
   値lnの一定増分である） ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ４ 上記第二b₂工程において、 b₂₁） l_o+1≦lmaxであるとき、閾値をl_o+1として
   探索開始点より探索方向に第一工程からやり直
   す、または b₂₂） l_o+1＞lmaxであるとき、距離xnおよびyn
   で区切られた領域を真のバンドではないと決定
   したのちバンド検知点より探索方向に第一工程
   からやり直す、 （ただし、lmaxは定数であつて閾値lnがとり
   うる最大値である） ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の核
   酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ５ 上記第一工程において、分離展開方向にバン
   ドの探索を行なうことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の核酸の塩基配列決定のための信号
   処理方法。 ６ 上記塩基特異的DNA断片物の混合物が、 (1) グアニン特異的DNA断片物、 (2) アデニン特異的DNA断片物、 (3) チミン特異的DNA断片物、 (4) シトシン特異的DNA断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類
   の塩基特異的DNA断片物それぞれ支持媒体上に
   分離展開されて形成された四列の分離展開列から
   なることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の咳酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積
   性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体
   シートに蓄積記録したのち、該蛍光体シートに励
   起光を照射して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して光電的に読み出すことにより得られたもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ８ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせ
   て、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録したのち、該感光
   材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電
   的に読み取ることにより得られたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。