JPS62296875A - ノイラミニダ−ゼの製造法 - Google Patents
ノイラミニダ−ゼの製造法Info
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- JPS62296875A JPS62296875A JP61139896A JP13989686A JPS62296875A JP S62296875 A JPS62296875 A JP S62296875A JP 61139896 A JP61139896 A JP 61139896A JP 13989686 A JP13989686 A JP 13989686A JP S62296875 A JPS62296875 A JP S62296875A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の詳細な説明
産業上の利用分野
本発明は、ノイラミニダーゼの製造方法、詳しくは誘導
物資の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を充用する新
規な変異株の培養によるノイラミニダーゼの製造方法に
関する。
物資の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を充用する新
規な変異株の培養によるノイラミニダーゼの製造方法に
関する。
従 来 の 技 術
ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ）は
、別名シアリダーゼ（ｓｉａｌｉｄａｓｅ ）とも呼ば
れ、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号ＥＣ，３，２
，１゜１８に分類され、系統名ではＮ−アセチルノイラ
ミネート・グリコヒドラ−ぜ（Ｎ −ａｃｅｔｙｌｎｅ
ｕｒａ−ｍｉｎａｔｅ ｇｌｙｃｏｈｙｄｒａｓｅ）
と呼ばれる酵素である。
、別名シアリダーゼ（ｓｉａｌｉｄａｓｅ ）とも呼ば
れ、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号ＥＣ，３，２
，１゜１８に分類され、系統名ではＮ−アセチルノイラ
ミネート・グリコヒドラ−ぜ（Ｎ −ａｃｅｔｙｌｎｅ
ｕｒａ−ｍｉｎａｔｅ ｇｌｙｃｏｈｙｄｒａｓｅ）
と呼ばれる酵素である。
本酵素は、生体の重要な成分である種々のシアル醗含有
複合糖質等に作用して、シアル酸を切断、遊離させる働
きを有する。
複合糖質等に作用して、シアル酸を切断、遊離させる働
きを有する。
上記ノイラミニダーゼの供給源としては、従来コレラ菌
、ガス壊痘菌、肺炎菌、ジフテリア菌等の病原性細菌が
主流を占めていたが、本発明者らの研究開発により、ア
ースロバフタ− （Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属その他の数種の属
に属１゛る非病原性細菌から、感染の危険を伴うことな
く、上記酵素を工業的規模で製造する技術が先に確立さ
れた〔特公昭５０−１１９９１号公報、特許第８０１０
８９号及び特公昭５２−３９９１７号公報、特許第９１
４５５６号参照〕。
、ガス壊痘菌、肺炎菌、ジフテリア菌等の病原性細菌が
主流を占めていたが、本発明者らの研究開発により、ア
ースロバフタ− （Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属その他の数種の属
に属１゛る非病原性細菌から、感染の危険を伴うことな
く、上記酵素を工業的規模で製造する技術が先に確立さ
れた〔特公昭５０−１１９９１号公報、特許第８０１０
８９号及び特公昭５２−３９９１７号公報、特許第９１
４５５６号参照〕。
しかしながら、上記本発明者らが先に開発した本酵素の
製造技術では、コロミン酸等の誘導物質を培地に存在さ
せることが必要で、この誘導物質の不存在下では、目的
とする酵素は到底工業的規模で生産できないものであっ
た。即ち、上記光に開発した技術に利用される微生物は
、いずれもコロミン酸等の誘導物質の不存在下ではノイ
ラミニダーゼ生産能を実質的に発現しないものであった
。
製造技術では、コロミン酸等の誘導物質を培地に存在さ
せることが必要で、この誘導物質の不存在下では、目的
とする酵素は到底工業的規模で生産できないものであっ
た。即ち、上記光に開発した技術に利用される微生物は
、いずれもコロミン酸等の誘導物質の不存在下ではノイ
ラミニダーゼ生産能を実質的に発現しないものであった
。
しかるに上記コロミン酸等は、通常その調製に繁雑な操
作等を要し且つ高価なものであり、その入手が容易でな
い不利があった。
作等を要し且つ高価なものであり、その入手が容易でな
い不利があった。
発明が解決しようとする問題点
本発明は、上記技術の最大の欠点とするコロミン酸等の
利用を必須とする点を解消し、該コロミン酸等を利用せ
ずとも、工業的規模で大ｍのノイラミニダーゼを製造で
きる技術を１１ｎ発することを目的とする。
利用を必須とする点を解消し、該コロミン酸等を利用せ
ずとも、工業的規模で大ｍのノイラミニダーゼを製造で
きる技術を１１ｎ発することを目的とする。
本発明省らは、上記目的から、更に鋭意研究をｍねた結
果、先に開発した技術に利用するアースロバフタ−属に
属する微生物を、変異処理して得られる変異株の内に、
コロミン酸等の誘導物質の無添加培地にＪ３いて、目的
酵素を著■生産できる微生物が存在し、即ち、上記変異
処理により誘導物質不存在下でのノイラミニダーゼ生産
能を付与された変異微生物が創製され、該変異微生物の
培養によるときには、上記目的が達成されることを見出
した。本発明は、この知見に基づいて完成されたもので
ある。
果、先に開発した技術に利用するアースロバフタ−属に
属する微生物を、変異処理して得られる変異株の内に、
コロミン酸等の誘導物質の無添加培地にＪ３いて、目的
酵素を著■生産できる微生物が存在し、即ち、上記変異
処理により誘導物質不存在下でのノイラミニダーゼ生産
能を付与された変異微生物が創製され、該変異微生物の
培養によるときには、上記目的が達成されることを見出
した。本発明は、この知見に基づいて完成されたもので
ある。
問題点を解決するための手段
本発明によれば、アースロバフタ−属に属し、誘導物質
の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を発現する、変異
株を培養して、培養物よりノイラミニダーゼを採取する
ことを特徴とするノイラミニダーゼの製造法が提供され
る。
の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を発現する、変異
株を培養して、培養物よりノイラミニダーゼを採取する
ことを特徴とするノイラミニダーゼの製造法が提供され
る。
本明細書において、誘導物質とは、先に開発したアース
ロバフタ−属１１１ 菌その他の細菌のｉ８養の際、培
地に添加することによって、２等細菌にノイラミニダー
ゼ生産性を付与する物質をいう。該誘導物質にはコロミ
ン酸を初めとして、その関連化合物、例えばシアル酸、
結合型シアル酸を含有ザるガングリオシド、シアロムコ
多糖類等やマンノサミン、Ｎ−７セチルマンノサミン等
のシアル酸分解物等が包含される。
ロバフタ−属１１１ 菌その他の細菌のｉ８養の際、培
地に添加することによって、２等細菌にノイラミニダー
ゼ生産性を付与する物質をいう。該誘導物質にはコロミ
ン酸を初めとして、その関連化合物、例えばシアル酸、
結合型シアル酸を含有ザるガングリオシド、シアロムコ
多糖類等やマンノサミン、Ｎ−７セチルマンノサミン等
のシアル酸分解物等が包含される。
本発明方法によれば、上記変異株の利用に基づいて、そ
の′Ａ製に繁雑な操作を要ししかも高価で、その利用に
不利が伴われるコロミン酸等のＩｎ物質の使用を回避し
て、通常の微生物の培養に用いられる培地中で、著量の
目的とするノイラミニダーゼを産生、蓄積させることが
でき、従って、該酵素を工業的規模で大損に且つ容易に
製造することかできる。
の′Ａ製に繁雑な操作を要ししかも高価で、その利用に
不利が伴われるコロミン酸等のＩｎ物質の使用を回避し
て、通常の微生物の培養に用いられる培地中で、著量の
目的とするノイラミニダーゼを産生、蓄積させることが
でき、従って、該酵素を工業的規模で大損に且つ容易に
製造することかできる。
本発明方法においては、アースロバフタ−属に属する変
異株を用いることが重要である。しかして該変異株は、
アースロバフタ−屈に属する公知の各種菌を親株として
、之等に、一般に用いられている各種の変異処理手段を
適用することにより得られる。ここで親株としては、ア
ースロバフタ−属に属し誘導物質の存在下にノイラミニ
ダーゼを産生する各種のものをいずれも使用できる。そ
の例としては、例えばアースロバフタ−ウレアファシェ
ンス（Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｃａｆａｃｉ
ｅｎｓ ）ＡＴＣＣ７５６２、アースロバフタ−オキシ
ダンス（Ａ、 ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ） ＡＴＣＣ１３
３４４、アースロバフタ−オキシダンス（Ａ 、 ｏｘ
ｙｄａｎｓ ）ＡＴＣＣ１４３５８等を例示できる。
異株を用いることが重要である。しかして該変異株は、
アースロバフタ−屈に属する公知の各種菌を親株として
、之等に、一般に用いられている各種の変異処理手段を
適用することにより得られる。ここで親株としては、ア
ースロバフタ−属に属し誘導物質の存在下にノイラミニ
ダーゼを産生する各種のものをいずれも使用できる。そ
の例としては、例えばアースロバフタ−ウレアファシェ
ンス（Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｃａｆａｃｉ
ｅｎｓ ）ＡＴＣＣ７５６２、アースロバフタ−オキシ
ダンス（Ａ、 ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ） ＡＴＣＣ１３
３４４、アースロバフタ−オキシダンス（Ａ 、 ｏｘ
ｙｄａｎｓ ）ＡＴＣＣ１４３５８等を例示できる。
また上記変異処理手段としては、一般によく知られてい
る各種の手段、例えばニトロソグアニジン（Ｎ−メチル
−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン）、マイトマ
イシンＣ，４−ニトロキノリン−１−オキシド、メチル
メタンスルホン酸、エチルメタンスルホン酸、エチルエ
タンスルホン酸、２−アミノプリン、５−ブロモウラシ
ル、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、アクリフラビン、ア
クリジンマスタード等の化学突然変異誘起剤処理手段、
ｘｉ等の放射線照射処理手段、紫外線照射処理手段等を
単独で又は適宜組合せて利用することができる。
る各種の手段、例えばニトロソグアニジン（Ｎ−メチル
−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン）、マイトマ
イシンＣ，４−ニトロキノリン−１−オキシド、メチル
メタンスルホン酸、エチルメタンスルホン酸、エチルエ
タンスルホン酸、２−アミノプリン、５−ブロモウラシ
ル、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、アクリフラビン、ア
クリジンマスタード等の化学突然変異誘起剤処理手段、
ｘｉ等の放射線照射処理手段、紫外線照射処理手段等を
単独で又は適宜組合せて利用することができる。
本発明に特に好適に用いられる上記変異株の一例として
は、アースロバフタ−ウレアファシェンスＡＴＣＣ７５
６２を親株として化学的突然変異誘起剤処理により１ｑ
られた、アースロバフタ−ウレアファシェンスＭ１０５
７を例示できる。
は、アースロバフタ−ウレアファシェンスＡＴＣＣ７５
６２を親株として化学的突然変異誘起剤処理により１ｑ
られた、アースロバフタ−ウレアファシェンスＭ１０５
７を例示できる。
該Ｍ １０５７株は、より具体的には、以下の変異処理
手段を採用して得られる。即ら、親株を、ます、ペプト
ン１．０％（重伍％、以下同じ）、酵母エキス０．５％
及びグルコース０．１％を含有し、ｐＨを約７．２に調
節したし培地に一白金耳稙菌し、３０℃で振盪培養し、
中期対数期で集菌し、生理食塩水で洗浄後、約５Ｘ１０
’細胞／−前後になるように生理食塩水に懸濁させて細
胞懸濁液を調製する。次に上記で調製した懸濁液に、最
終温度が約５０〜２００ｕ（］／ＩＱとなるようにニト
ロソグアニジンを添加し、約３０℃前後で約３０〜１２
０分間軽く振盪処理を施した後、遠心分離により菌体を
集め、これを生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に懸濁さ
せる。上記懸濁液の一部を取って、これを通常の生育培
地、例えばペプトン０．５％、酵母エキス０．５％及び
寒天２．０％からなる固体培地（以下これをｒＹＰＡ培
地Ｊと呼ぶ）に塗りつけ、これを約３０℃前後で培養し
てコロニーを形成させ、形成された各コロニーを、ＹＰ
Ａ培地から寒天を除いた培地（ｒＹＰ培地」）に移し代
え、更に約３０℃前後で一夜振盪培養する。上記により
得られる培養液を遠心分離後、上澄液について、常法に
従いノイラミニダーピ活性を測定して、著量の目的酵素
生産能を有する菌株を選択する。
手段を採用して得られる。即ら、親株を、ます、ペプト
ン１．０％（重伍％、以下同じ）、酵母エキス０．５％
及びグルコース０．１％を含有し、ｐＨを約７．２に調
節したし培地に一白金耳稙菌し、３０℃で振盪培養し、
中期対数期で集菌し、生理食塩水で洗浄後、約５Ｘ１０
’細胞／−前後になるように生理食塩水に懸濁させて細
胞懸濁液を調製する。次に上記で調製した懸濁液に、最
終温度が約５０〜２００ｕ（］／ＩＱとなるようにニト
ロソグアニジンを添加し、約３０℃前後で約３０〜１２
０分間軽く振盪処理を施した後、遠心分離により菌体を
集め、これを生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に懸濁さ
せる。上記懸濁液の一部を取って、これを通常の生育培
地、例えばペプトン０．５％、酵母エキス０．５％及び
寒天２．０％からなる固体培地（以下これをｒＹＰＡ培
地Ｊと呼ぶ）に塗りつけ、これを約３０℃前後で培養し
てコロニーを形成させ、形成された各コロニーを、ＹＰ
Ａ培地から寒天を除いた培地（ｒＹＰ培地」）に移し代
え、更に約３０℃前後で一夜振盪培養する。上記により
得られる培養液を遠心分離後、上澄液について、常法に
従いノイラミニダーピ活性を測定して、著量の目的酵素
生産能を有する菌株を選択する。
かくして、選択された菌株のひとつとしてＭ１０５７株
を取得する。該株は、親株と対比して誘導物質の非存在
下に著量のノイラミニダーゼ産生能を有する点において
、際立った相違が認められる以外に、その菌学的性質は
親株と同一の特徴を右してＪ３す、これはアースロバフ
タ−属に属する変異株と同定される。
を取得する。該株は、親株と対比して誘導物質の非存在
下に著量のノイラミニダーゼ産生能を有する点において
、際立った相違が認められる以外に、その菌学的性質は
親株と同一の特徴を右してＪ３す、これはアースロバフ
タ−属に属する変異株と同定される。
上記Ｍ１０５７株は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、アースロバフタ−ウレアファシェンス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
）Ｍ１０５７として寄託されており、その受託番号は［
微工研菌奇託第８８０４号、ＦＥＲＭ Ｐ−８８０４
Ｊである。
技術研究所に、アースロバフタ−ウレアファシェンス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
）Ｍ１０５７として寄託されており、その受託番号は［
微工研菌奇託第８８０４号、ＦＥＲＭ Ｐ−８８０４
Ｊである。
本発明者の研究によれば、また上記親株（Ａ。
ｕｒｅａｒａｃｉｅｎｓ Ａ Ｔ ＣＣ７５６２）に限
らず、本発明者らが先に開発した方法に利用されるアー
スロバフタ−属に属し、誘導物質添加培地でノイラミニ
ダーゼ生産能を有づ“る微生物は、いずれも上記と同様
のニトロソグアニジンを用いた処理により、同様に、誘
導物質無添加培地で＠量のノイラミニダーゼ生産能を有
する変異株に誘導できる。更に、上記ウレアファシェン
スを含めた各種の微生物は、之等を親株として、上記二
１へロソグアニジンを用いた変異処理以外の、前述した
各種の化学突然変異誘起剤利用による変異処理手段並び
にｘｒＡ等の放射線又は紫外線の照射手段により、同様
にノイラミニダーゼ生産能を有する変異株に誘導するこ
とができる。
らず、本発明者らが先に開発した方法に利用されるアー
スロバフタ−属に属し、誘導物質添加培地でノイラミニ
ダーゼ生産能を有づ“る微生物は、いずれも上記と同様
のニトロソグアニジンを用いた処理により、同様に、誘
導物質無添加培地で＠量のノイラミニダーゼ生産能を有
する変異株に誘導できる。更に、上記ウレアファシェン
スを含めた各種の微生物は、之等を親株として、上記二
１へロソグアニジンを用いた変異処理以外の、前述した
各種の化学突然変異誘起剤利用による変異処理手段並び
にｘｒＡ等の放射線又は紫外線の照射手段により、同様
にノイラミニダーゼ生産能を有する変異株に誘導するこ
とができる。
之等のことより、上記微生物は、いずれもノイラミニダ
ーゼ生産能を潜在的に有しているが、通常この能力は発
現されず、上記変異処理によって上記潜在的酵素生産能
が活性化され、確実に発現されるものになると考えられ
る。いずれにせよ、従来かかる顕著に向上された酵素生
産能を有するアースロバフタ−属微生物は、知られてお
らず、勿論公知のアースロバフタ−風微生物が変異処理
によって、かかる酵素生産能を発現するものとなるとい
う事実も全く知られていない。
ーゼ生産能を潜在的に有しているが、通常この能力は発
現されず、上記変異処理によって上記潜在的酵素生産能
が活性化され、確実に発現されるものになると考えられ
る。いずれにせよ、従来かかる顕著に向上された酵素生
産能を有するアースロバフタ−属微生物は、知られてお
らず、勿論公知のアースロバフタ−風微生物が変異処理
によって、かかる酵素生産能を発現するものとなるとい
う事実も全く知られていない。
本発明方法は、上記のごとくして得られるアースロバク
ター属に属する変異株を、培養することにより実施され
る。
ター属に属する変異株を、培養することにより実施され
る。
この培養は、通常の液体培地及び固体培地のいずれを用
いても実施できるが、通常液体培地を用いるのがイｉ刊
である。また所望酵素を出産するためには、振盪培養や
通気撹拌培養等を行なうのが好ましい。上記培養に当り
培地としては、特にＲ１１限はなく、微生物の培養に一
般に用いられている栄養ｆＱ等を含有する各種の培地が
いずれも利用できる。該栄養源としては、例えばブドウ
糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、
グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハ
ク酸等の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝ｉ
ｌｌ！ｊ３！等の窒素源等を例示できる。また培地には
上記炭素源及び窒素源の他、例えばリン、マグネシウム
、カリブクム、ナトリウム等の無）ツ塩類、ホウ素、銅
、ヨウ素、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン
等の微量元索類及び酵母エキス、ビタミン類等の微量生
育因子等を適宜添加使用することもでさる。更に上記培
地としては、例えば動物組織抽出物又は浸出物等を含打
する天然培地乃至半合成培地等も使用することができる
。２等天然乃至半合成培地の具体例としては、例えばト
ッド・ヘライツト肉汁（Ｔ ｏｄｄト１ｃｖｉｔｔＢｒ
ｏｔｈ）やプレイン・ハート・インフユージ」ン（３ｒ
ａｉｎ ）（ｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ）培地
等の名称ぐ市販されているものを例示できる。
いても実施できるが、通常液体培地を用いるのがイｉ刊
である。また所望酵素を出産するためには、振盪培養や
通気撹拌培養等を行なうのが好ましい。上記培養に当り
培地としては、特にＲ１１限はなく、微生物の培養に一
般に用いられている栄養ｆＱ等を含有する各種の培地が
いずれも利用できる。該栄養源としては、例えばブドウ
糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、
グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハ
ク酸等の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝ｉ
ｌｌ！ｊ３！等の窒素源等を例示できる。また培地には
上記炭素源及び窒素源の他、例えばリン、マグネシウム
、カリブクム、ナトリウム等の無）ツ塩類、ホウ素、銅
、ヨウ素、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン
等の微量元索類及び酵母エキス、ビタミン類等の微量生
育因子等を適宜添加使用することもでさる。更に上記培
地としては、例えば動物組織抽出物又は浸出物等を含打
する天然培地乃至半合成培地等も使用することができる
。２等天然乃至半合成培地の具体例としては、例えばト
ッド・ヘライツト肉汁（Ｔ ｏｄｄト１ｃｖｉｔｔＢｒ
ｏｔｈ）やプレイン・ハート・インフユージ」ン（３ｒ
ａｉｎ ）（ｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ）培地
等の名称ぐ市販されているものを例示できる。
上記各種培地を利用した変異株のｉ８養条件としては、
Ｊ８養温度約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３０℃
とするのがよく、培Ｍ開始後約１５〜７０時間の間に、
ノイラミニダーゼ活性が最高に達する。従ってこの時期
に培養を停止して培養液から所望のノイラミニダーゼを
採取すればよい。
Ｊ８養温度約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜３０℃
とするのがよく、培Ｍ開始後約１５〜７０時間の間に、
ノイラミニダーゼ活性が最高に達する。従ってこの時期
に培養を停止して培養液から所望のノイラミニダーゼを
採取すればよい。
この培養液からの目的酵素の採取は、通常の方法に従い
、例えば培養液から菌体を分離除去した後、ン青澄液に
硫安塩析法、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を
施すことにより実施でき、かくし’ｒ ３７ 製ノイラ
ミニダーＵを取（ｑできる。
、例えば培養液から菌体を分離除去した後、ン青澄液に
硫安塩析法、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を
施すことにより実施でき、かくし’ｒ ３７ 製ノイラ
ミニダーＵを取（ｑできる。
実 施 例
以下、実施例を挙げて本発明方法を更に詳しく説明Ｊる
。
。
尚、各個におけるノイラミニダーゼ活性は、以下の方法
により測定した。即ち、酵素試料液０、１ｍ１２．０．
４％Ｎ−７セチルノイラミンラクトース（ベーリンガー
マンハイム山之内社製）溶液０．０５−及び０．２μ酢
Ｍ緩衝液（ｐｌ」５．０）０．０５−の合π１０，２−
を、３７℃で１０分間反応させて、遊離したＮ−アセチ
ルノイラミン酸（シアル酸）の量を、チオバルビッール
酸法（Ｌ、Ｗａｒｒｅｎ 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、 ２３４゜１９７１ （１９５９））により定量
した。
により測定した。即ち、酵素試料液０、１ｍ１２．０．
４％Ｎ−７セチルノイラミンラクトース（ベーリンガー
マンハイム山之内社製）溶液０．０５−及び０．２μ酢
Ｍ緩衝液（ｐｌ」５．０）０．０５−の合π１０，２−
を、３７℃で１０分間反応させて、遊離したＮ−アセチ
ルノイラミン酸（シアル酸）の量を、チオバルビッール
酸法（Ｌ、Ｗａｒｒｅｎ 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、 ２３４゜１９７１ （１９５９））により定量
した。
ノイラミニダーゼ活性の１単位とは、上記反応条件下で
？）１１素液１鵬が１分間に１μモルのＮ−アセチルノ
イラミン酸を遊離する活性を言う。
？）１１素液１鵬が１分間に１μモルのＮ−アセチルノ
イラミン酸を遊離する活性を言う。
実施例７
ラクトース０．５ｇ、リン酸第ニアンセニウム０．２ｏ
、Ｊｕ化すトリウム０．３！Ｊ 、リン酸第二カリウム
０．１ｑ、硫酸マグネシウム０．０１ｇ及び水１００閾
を、５００仙容三角フラスコに入れ、ｐｌ−１を７．０
に調節し、加熱滅菌して培養液を作成した。
、Ｊｕ化すトリウム０．３！Ｊ 、リン酸第二カリウム
０．１ｑ、硫酸マグネシウム０．０１ｇ及び水１００閾
を、５００仙容三角フラスコに入れ、ｐｌ−１を７．０
に調節し、加熱滅菌して培養液を作成した。
上記培養液にアースロバフタ−ウレアファシェンスＭ１
０５７株（微工研菌寄託第８８０４号）を接種し、２８
℃にて２４時間振盪培養を行ない、培養ろ液（１ｏ５閾
）を得た。
０５７株（微工研菌寄託第８８０４号）を接種し、２８
℃にて２４時間振盪培養を行ない、培養ろ液（１ｏ５閾
）を得た。
得られた粗酵素液１１１１ｆ２当りのノイラミン酸−ぜ
活性は、２，８単位であった。
活性は、２，８単位であった。
次いで、上記で得られた培養炉液１００−を、硫安で塩
析し、３０〜９０％飽和区分（ｖｉ和度はオスボーン法
で表示、以下同じ）を、受用の水に溶かし、１０ｍＭ酢
Ｍ Ｉ ｉＪ液（ｐｉ−１４，５）に対して透析した。
析し、３０〜９０％飽和区分（ｖｉ和度はオスボーン法
で表示、以下同じ）を、受用の水に溶かし、１０ｍＭ酢
Ｍ Ｉ ｉＪ液（ｐｉ−１４，５）に対して透析した。
また、可溶性澱粉とコロミン酸とを２Ｎ苛性ソーダに溶
かし、これにエピクロルヒドリンを加えて調製したコロ
ミン酸をリガンドとするゲルをカラムに充頃し、該カラ
ムに上記透析液を通して吸着させ、これを１００ｍＭ酢
Ｍ緩厨液（ｐ）」４．５）にて溶出させて、精製ノイラ
ミニダーゼ２７３．８単位を得た（収率９７４８％）。
かし、これにエピクロルヒドリンを加えて調製したコロ
ミン酸をリガンドとするゲルをカラムに充頃し、該カラ
ムに上記透析液を通して吸着させ、これを１００ｍＭ酢
Ｍ緩厨液（ｐ）」４．５）にて溶出させて、精製ノイラ
ミニダーゼ２７３．８単位を得た（収率９７４８％）。
かくして得られたノイラミニダーゼ精製標品中には、プ
ロテアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルトラ−ぜ、
ホスホリパーゼＣ及びグリコシダーピ類の混在は認めら
れなかった。
ロテアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルトラ−ぜ、
ホスホリパーゼＣ及びグリコシダーピ類の混在は認めら
れなかった。
比較例１
実施例１において、変異株Ｍ１０５７に代えて、その親
株であるアースロバフタ−ウレアファシェンス△ＴＣ０
７５６２株を用い、同様にして培養して（；１られた酵
素活性を測定した。その結果、Ｉ８養液１戒値の酵素活
性は０．００２１Ｊ１位であつた。
株であるアースロバフタ−ウレアファシェンス△ＴＣ０
７５６２株を用い、同様にして培養して（；１られた酵
素活性を測定した。その結果、Ｉ８養液１戒値の酵素活
性は０．００２１Ｊ１位であつた。
尚、この親株は、コロミン醒添加培地、即ちコロミンＮ
ｏ、５０ 、リン酸第ニアンモニウム０．２ａ、ｍ化ナ
トリウム０．３ａ 、リン酸第二カリウム０．１ｇ、Ｉ
ＭマグネシウムＯ，ｏｌａ及び水１００鵬からなり、ｐ
Ｈ１を７．０に調節し、加熱滅菌してＸｌｌ製した培地
での培養によれば、培養１１２当り３．２の酵素活性を
示した。
ｏ、５０ 、リン酸第ニアンモニウム０．２ａ、ｍ化ナ
トリウム０．３ａ 、リン酸第二カリウム０．１ｇ、Ｉ
ＭマグネシウムＯ，ｏｌａ及び水１００鵬からなり、ｐ
Ｈ１を７．０に調節し、加熱滅菌してＸｌｌ製した培地
での培養によれば、培養１１２当り３．２の酵素活性を
示した。
実施例２
ペプトン１．０ｇ、酵母エキス０．５％、ＮａＣ９０，
５％及び水１００ｍＧを５００ｍＧ容三角フラスコに入
れ、ｐＨ６，５になるように苛性ソーダで調節し、加熱
滅菌した培養液に、実施例１と同一のアースロバタター
ウレアフ？シエンスＭ１０５７株を接種し、３０”Ｃ
にて２４時間振盪培養を行なった。得られた培養か液を
粗酵素液とした。
５％及び水１００ｍＧを５００ｍＧ容三角フラスコに入
れ、ｐＨ６，５になるように苛性ソーダで調節し、加熱
滅菌した培養液に、実施例１と同一のアースロバタター
ウレアフ？シエンスＭ１０５７株を接種し、３０”Ｃ
にて２４時間振盪培養を行なった。得られた培養か液を
粗酵素液とした。
この液のノイラミニダーゼ活性は、３．０単位であった
。
。
この透析液を、実施例１と同様にしてアフイニテイ力ラ
ムに吸着させ、同様に溶出を行なって、２９２．２単位
のノイラミニダーゼを得たく収率９７．４％）。１ｑら
れたノイラミニダーゼ精製標品中には、実施例１と同様
に夾雑酵素の混在は全く認められなかった。
ムに吸着させ、同様に溶出を行なって、２９２．２単位
のノイラミニダーゼを得たく収率９７．４％）。１ｑら
れたノイラミニダーゼ精製標品中には、実施例１と同様
に夾雑酵素の混在は全く認められなかった。
（以 上）
受託番号変更届
昭和６２年６月１８日
２ 発明の名称
ノイラミニダーゼの製造法
３ 手続をした者
４代理人
５ 旧寄託機関の名称
７ 新寄託機関の名称
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所８ 新受託
番号 微工研条寄第１３９１号 ９ 添付書類の目録
番号 微工研条寄第１３９１号 ９ 添付書類の目録
Claims (1)
- （１）アースロバクター属に属し、誘導物質の不存在下
にノイラミニダーゼ生産能を発現する、変異株を培養し
て、培養物よりノイラミニダーゼを採取することを特徴
とするノイラミニダーゼの製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61139896A JPH07114695B2 (ja) | 1986-06-16 | 1986-06-16 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
| PCT/JP1987/000386 WO1987007640A1 (fr) | 1986-06-16 | 1987-06-12 | Procede de preparation de neuraminidase |
| EP87903919A EP0274533B1 (en) | 1986-06-16 | 1987-06-12 | Process for preparing neuraminidase |
| DE8787903919T DE3785021T2 (de) | 1986-06-16 | 1987-06-12 | Verfahren zur herstellung von neuraminidase. |
| US07/640,548 US5116752A (en) | 1986-06-16 | 1991-01-15 | Process for preparing neuraminidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61139896A JPH07114695B2 (ja) | 1986-06-16 | 1986-06-16 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62296875A true JPS62296875A (ja) | 1987-12-24 |
| JPH07114695B2 JPH07114695B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=15256133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61139896A Expired - Lifetime JPH07114695B2 (ja) | 1986-06-16 | 1986-06-16 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5116752A (ja) |
| EP (1) | EP0274533B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07114695B2 (ja) |
| DE (1) | DE3785021T2 (ja) |
| WO (1) | WO1987007640A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8986646B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-03-24 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2724588B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-03-09 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
| JP2726898B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-03-11 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｌ及びガングリオシド類の製造法 |
| DK0502550T3 (da) * | 1991-03-07 | 1995-05-29 | Kanto Ishi Pharma Co Ltd | Colominsyre og delvis hydrolyse-produkter af colominsyre til fremstilling af medikamenter til behandling af hepatitis, nephritis og arthritis |
| IT1252228B (it) * | 1991-12-17 | 1995-06-05 | T Associated Bio Technologies | Procedimento per la produzione di neuraminidasi |
| US20230233437A1 (en) * | 2020-05-25 | 2023-07-27 | Shizuoka Prefectural University Corporation | Elastin production promoter and cosmetic preparation for skin |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5356386A (en) * | 1976-11-01 | 1978-05-22 | Risaachi Fuandeeshiyon Obu Za | Noilaminitase |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6034181A (ja) * | 1983-08-04 | 1985-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
| JPS60184384A (ja) * | 1984-02-29 | 1985-09-19 | Marukin Shoyu Kk | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
| JP2902838B2 (ja) * | 1991-11-13 | 1999-06-07 | 住友化学工業株式会社 | 無電解ニッケルメッキ液組成物 |
-
1986
- 1986-06-16 JP JP61139896A patent/JPH07114695B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-12 WO PCT/JP1987/000386 patent/WO1987007640A1/ja not_active Ceased
- 1987-06-12 EP EP87903919A patent/EP0274533B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-12 DE DE8787903919T patent/DE3785021T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-01-15 US US07/640,548 patent/US5116752A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5356386A (en) * | 1976-11-01 | 1978-05-22 | Risaachi Fuandeeshiyon Obu Za | Noilaminitase |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8986646B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-03-24 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
| US9017632B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-04-28 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
| US9068257B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-06-30 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
| US9255009B2 (en) | 2009-06-26 | 2016-02-09 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
| US9840419B2 (en) | 2009-06-26 | 2017-12-12 | Element Six Technologies Limited | Diamond material |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0274533B1 (en) | 1993-03-24 |
| DE3785021D1 (de) | 1993-04-29 |
| WO1987007640A1 (fr) | 1987-12-17 |
| US5116752A (en) | 1992-05-26 |
| JPH07114695B2 (ja) | 1995-12-13 |
| DE3785021T2 (de) | 1993-09-16 |
| EP0274533A1 (en) | 1988-07-20 |
| EP0274533A4 (en) | 1988-10-24 |
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