JPS6230103A - キトサンオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｄ−グルコサミンの単糖類を含まず、主とし
てＤ−グルコサミンの重合度が２〜８のオリゴ糖を含む
キトサンオリゴ塘を高収率で得ることができるキトサン
オリゴ糖の製造法に関するものであって、本発明により
得られたキトサンオリゴ塘は、食品添加物、化粧品成分
、医薬品または医療材料などの広範な用途に利用できる
ものである。

〔技術の背景および従来技術の説明〕

キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得られる多
筒類であって、セルロースと極めてよく似た化学構造を
有していて、セルロースを構成するグルコースの２位の
水酸基がアセトアミド基で置換された２−アセトアミド
−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコ
サミン）がβ−１，４結合した直鎖状の多糖類である。

一方において、キトサンの分解産物のキトサンオリゴ糖
、たとえば、キトビオース（ｃ　Ｉｃ　Ｎ　）２　　、
キトトリオース　（ＧＩＣＮ）３、キトテトラオース（
Ｇ　１　ｃ　Ｎ）４　　、キトペンタオース（ＧＩＣＮ
）５、およびキトヘキサオース（Ｇ　ｌ　ｃ　Ｎ　）ｅ
　　などがアミノ糖（塩基性の塘）であることから、こ
れらのキトサンオリゴ環を食品添加物（増量剤）、化粧
品成分または医薬品などの広範な用途に利用することが
考えられ、これらのキトサンオリゴ環を経済的に製造す
る技術の開発が要望されている。

また最近、キトサンオリゴ環のうちのキトヘキサオース
（ＧｌｃＮ）　　およびキトヘプタオース（Ｃ１ｃＮ）
７　に担カビ住が見出され〔ディー・エフ・ケンドラお
よびり−・ニー・ハドウイガ一二エクスペリメンタル・
マイコロジー（Ｄ、Ｆ。

Ｋｅｎｄｒａ　ａｎｄ　Ｌｅｅ　Ａ＋Ｈａｄｗｉｇｅｒ
　：　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｙｃｏｌＯｇ）’　
）第８巻、第２７６−２８１　ｍ　（１９８４年）〕、
重合度の比較的大きいキトサンオリゴ蔚の′ｍ造技術の
開発が要望されている。

これまでに、塩酸による加水分解法〔ニス・ティー・ホ
ロウィッツ他：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエテイ　（Ｓ、Ｔ。

Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ　
）第７９巻、第５０４６−５０４９０（１９５７年）〕
、亜硝酸による酸化分解法〔エフ・ヤク他：セルロース
・ケミストリ・アンド・テクノロジー（Ｆ、　Ｙａｋｕ
　ｅｔ　ａＬ　：Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）第１１巻、第
４２１−４３０頁（１９７７年）〕、および塩素による
酸化分解法（平野茂博ら：日本農芸化学会、昭和５９年
度大会、講演要旨集第３３０頁）がキトサンの化学的な
分解法として知られている。塩酸による加水分解法は、
キトサンオリゴ環を生産することができるが、高濃度の
塩酸および長時間の反応を必要とし、また多量のＤ−グ
ルコサミンの車Ｈａの生成により反応液からキトサンオ
リゴ環を単離する工程を必要とし、そのための操作がは
ん雑になり、そのコストも高いという難点がある。

また亜硝酸または塩素による酸化分解法は、酸化による
脱アミノ化のために、純粋なキトサンオリゴ環を得るこ
とが困難であるという難点がある。

これに対して、酵素法によるキトサンの分解では、酵素
の特異性を利用することができるので、Ｄ−グルコサミ
ンのような８Ｍ類の生成を少なくして、目的とするキト
サンオリゴ環を著量に生産することができる。これまで
に報告されているキトサンを分解する酵素には、バチル
ス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｐ、　）　　Ｒ−４の生産する
キトサナーゼ〔トミナガおよびツジサカ：ビオヒミカ・
工・ビオフイジ力・アクタ（Ｙ、Ｔｏｍｉｎａｇａ　＆
　Ｙ、Ｔｓｕｊｉｓａｋａ　：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）第４１０
巻、第１４５−１５５頁（１９７５年）〕、ペニシリウ
ム・イスランデイクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　１ｓ
ｌａｎｄｉｃｕＬ）の生産するキトサナーゼ〔ディー・
エム・プエントン等：ジャーナル・オプ・ジェネラル・
ミクロバイオロジー（Ｄ、Ｍ、　Ｆｅｎｔｏｎ　ｅｔ　
ａｌ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍ
ｉＣｒＯｂｉＯＩＯｇｙ）　ｌ　第１２６巻、第１５１
−１６５頁（１９８１年）〕、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ、ｓｐ、’）　　９９−５の生産するキトサナーゼ
（層内：日本農芸化学会、昭和５９年度大会ミ講演要旨
害　４第５５０頁）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ−）　Ｎｏ、　６　（ジエイ・ニ
ス・プライス等：ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｓ、Ｐｒ１ｃｅｅｔ　ａｌ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１２４巻、第１
５７４−１５８５頁（１９７５年）〕およびストレプト
マイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇ
ｒｉｓｅｕＳ）の生産するキトサナーゼ〔オオタカラ：
キチン、キトサン・アンド・リレイテツド・エンザイム
ス （Ａ、０ｈｔａｋａｒａ　　：　　Ｃｈｉｔｉｎ＋　　
Ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ＲｅｌａｔｅｄＥｎｚｙｍ
ｅｓ　）第１４７〜１６０頁（１９８５年）、アカデミ
ツクプレス〕が知られているが、キトサンオリゴ環を著
量に生産するという報告は見当らない。

本発明者らは、キトサンオリゴ環を経済的に生産する技
術の開発を企図して、キトサナーゼを生産する細菌の検
索を行なって得られたバチルス属に属する微生物の変異
株のバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｎｏ、　７−　Ｍが
キトサナーゼを生産しうろことおよびこのキトサナーゼ
をキトサンに作用させると、Ｄ−グルコサミンのｍ糖類
を生成することなく、キトサンオリゴ環だけを生産しう
ろことを見出し、これらの知見にもとづいて本発明に到
達し１こ。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、Ｄ−グルコサミンの単糖類を生産する
ことなく、キトサンオリゴ糖を著量に生産しうる経済的
に実施可能のキトサンオリゴ糖の製造法を提供すること
にある。

本発明は、キトサンを、バチルス属に属する微生物によ
り生産される酵素であって、５〜１１のｐＨ領域におい
て安定なキトサナーゼによって分解して、Ｄ−グルコサ
ミンのｍ剪類を含むことなく、主として重合度が２〜８
のオリゴ濠を含むキトサンオリゴ塘を得ることを特徴と
するキトサンオリゴ糖の製造法である。

本発明のキトサンオリゴ糖の製造において、キトサナー
ゼは、バチルスＮｏ、７−Ｍ（微工研菌寄第８１３９号
）の培養によって生産されたキトサナ−−ゼを使用する
ことができ、キトサンは、キトサン溶液の他に、コロイ
ダルキトサンを使用することができ、さらにキトサナー
ゼによるキトサンの加水分解をｐＨ６付近の反応液にお
いて行なうのが好ましい。

〔発明の詳細な説明〕

本発明により製造されるキトサンオリゴ塘は、Ｄ−グル
コサミンの重合度が２〜８のオリゴ糖を主として含み、
Ｄ−グルコサミンの単糖類を含まないキトサンオリゴ糖
である。

このキトサンオリゴ糖は、陽イオンとして作用し、また
吸湿性を有するから、化粧品に使用したときに皮膚の保
湿剤として有用である。またキトサンオリゴ糖のうちの
比較的高重合度のものは、安全性が高く、かつ祝カビ性
および＠菌性を有するから、化粧品、食品等の防腐剤、
また土壌改良剤または皿子コーティング剤などにおける
抗カビ剤および抗菌剤として使用するのに適している。

本発明のキトサンオリゴ糖の製造においては、先ずキト
サン溶液を調製する。キトサンは酸に溶けるので、キト
サンに酸水溶液を加えて、キトサン溶液とする。これと
は別にキトサナーゼ溶液を調製し、前に得られたキトサ
ン溶液とともに、反応温度においてブレインキュベート
した後、キトサナーゼ溶液をキトサン溶液に加え、反応
温度にお７）てキトサンをキトサナーゼによって分解す
る。

反応温度はキトサナーゼの作用温度の３０〜８０’Ｃと
することができるが、４０℃前後の温度にするのが好ま
しい。また反応液のｐＨは、キトサナーゼの作用ｐＨ範
囲の３〜９とすることができるが、その最適ｐＨの６前
後のｐＨにするのが好ましい。

本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用するキトサンは
、キトサナーゼによって分解されるものであれば、いか
なるものであっても、これを使用することができるが、
脱アセチル化度５０〜１００％のキトサンを使用するの
が好ましい。これらのキトサンにキトサナーゼを加えて
、分解する場合、前記のキトサン溶液の他に、コロイダ
ルキトサンを水に懸濁した状態におくこともできる。

キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサンを溶解し
ろるものであれば、育機酸または無機酸のいかなるもの
であっても、これを使用することができるが、塩酸また
は硝酸の希薄溶液、ギ酸、の希薄溶液を使用するのが好
ましい。

キトサンオリゴ糖の重合度分布は反応時間によって変化
するから、予備実験において、反応時間と生成物のキト
サンオリゴ剪の重合度分布の関係を実験的に求めておき
、これに基づいて所望の重合度分布のキトサンオリゴ剪
を得るのに必要な反応時間とすることもできる。

所定の反応時間の経過後に、反応液中のキトサナーゼを
失活して、反応を停止し、反応液の遠心分屋または濾過
によって上澄液を集め、これを常法のイオン交換樹脂に
よるクロマトグラフィー、ゲル濾過または活性炭による
着色物質の除去などを行なって、不純物を除去した後、
乾燥して、所望のキトサンオリゴ塘の粉末を得る。

本発明のキトサンオリゴ糖の製造に使用されるキトサナ
ーゼは、５〜１１のｐＨｆ域において安定であり、キト
サンを分解したときに、Ｄ−グルコサミンのＨＬＮ類を
生成することなく、主として重合度２〜８のオリゴ糖を
生成するキトサナーゼで（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）
　Ｎｏ、　７−　Ｍ　（微工研菌寄第８１３９号）を培
養した時に、培地中に生産される。

バチルスＮｏ、　７−　Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生層の土壌よりキチンまたはキトサンを唯一の炭
素源とする培地に生育しうる細菌として分離されたバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎｏ、　７株を親
株として、この親株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロソ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ　）で処理して突然変異
を誘発させ、得られたストレプトマイシン耐性の変異株
の中から、高活性のキトサナーゼを生産しうるものとし
て分離された変異株であって、微工研菌寄第８１３９号
（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８１３９）として通商産業省微生物
工業技術研究所に寄託されている。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈの菌学的性質は以下に示され
る。

Ａ、細胞の形態 （１）細胞の形および大きさ：短桿菌、（肉汁および肉
汁寒天斜面培養、３７℃、２４〜７２時間の培養） （２）細胞の多形性の何無二無し、 （３）運動性の有無二有り、 （肉汁寒天半流動高府穿＠培養） （４）胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞子、球
状、 〔トーナー（Ｄｏｒｎｅｒ　）の染色法およびウイッツ
（Ｗｉｔｚ）変法ｊ （５）ダラム染色性：陽性、 〔肉汁寒天斜面培養、３７°Ｃ，１８時間、ヒュツカ−
（Ｈｕｃｋｅｒ　）の変法により染色〕Ｂ、各培地にお
ける生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（３７℃、２４〜１６８時間）
：糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白色のコロニ
ーを形成する。コロニーの表面は凹凸でやや光沢があり
、半透明である。時間の経過とともに盛上ってくる。色
素は生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養（３７°Ｃ１２４〜１６８時間
）二に布状に盛上った乳白色のコロニーを形成する。

コロニーは凸円形の隆起があり、光沢がある。生育は良
好で、時間とともに拡がってくる。色素は生産しない。

（３）充汁液体培養（３７℃、２４〜１６８時間）：表
面に膜を形成しない。時間とともに全体的に濁ってくる
。底部にｖｘ　＜ｍ粒状）の沈デンが形成され、徐々に
多くなってくる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２５℃、２４〜１６８時
間）： 穿刺線に沿って生育し、液化する。表面および内部は漏
斗状に生育し、液化する。液化部分は白濁する。

（５）リドマスミルク（３７℃、２４〜１６８時間）：
２日後から上部が少しずつ液化し、４日目には色は完全
に変色し、酸性となった。凝固はしない。

時間の経過とともに、液化は進み、半透明になった。

Ｃ０生理学的性質 （１）硝酸塩の還元ニー （悄酸塩肉汁培地、３７℃、２４゛〜１２０時間）（２
）脱窒反応ニー ２４〜１２０時間） （３）ＭＲテスト：十 （３７°０１２４〜１６８時間） （４）ＶＰテスト（アセチルメチルカルビノール生成試
験：＋ （３７℃、２４〜１６８時間） （５）インドールの生成ニー （３７°０１２４〜１６８時間） （６）硫化水素の生成ニー （ＴＳＩ寒天法、３７℃、２４〜１６８時間）（７）デ
ン粉の加水分解：十 （３７℃、２４〜１６８時間） （８）クエン酸の利用 （コーザーの培地、３７’Ｃ，２４〜１６８時間）二　
− （クリステンセンの培地、３７’（：、２４〜１６８時
間）：十 （９）無機窒素源の利用（３７”（：、２４〜１６８時
間） 隔酸恒　：　尖！２、 アンモニウム塩：未定、 （１０）色素の生成 （マンニット・酵母エキス寒天斜面ｔ＠地）：〔キング
（Ｋｉｎｇ　）　Ａ寒天斜面培地コニ−（１１）蛍光の
留無：無し く１２）ウレアーゼ：＋ （クリステンセンーウレア寒天培地、３７’（：。

２４〜１６８時間） （１３）オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、３７’（：、２４〜４８時間）（１４
）カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、３７℃、２４〜４８時間）（１５）生
育の範囲＝　（肉汁寒天培地）温度：未定、 ｐＨ：　５〜１０゜ 添加食塩濃度：未定、 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、３７℃、２４〜７
２時間） （＋７）Ｏ−Ｆテスト〔ヒュー−ライフソン（ｌｌｕｇ
ｈ　−Ｌｅｉｆｓｏｎ　）法、３７℃、Ｄ−グルコース
〕　：発酵的に酸を生成する。

（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　） （１８）塘類からの酸およびガスの生成の有無（３７℃
、２４〜１６８時間）： 糖　類　　　　　酸　　　ガス Ｄ−グルコース　　＋　　　　− Ｄ−マンノース　　−− Ｄ−ガラクトース　−− Ｄ−フラクトース　十　　　　− Ｌ−アラビノース　−− Ｄ−キシロース　　−− Ｄ−ソルビット　　−− Ｄ−マンニット　　−− イノジット　　　　−− マルトース　　　　＋　　　　− サッカロース　　　十　　　　− ラクトース　　　　−− デン粉　　　　　　　＋　　　　− セルロース　　　　−− グリセリン　　　　−− 以上の菌学的性質について、バージエイス・マニュアル
・オブ・デターミネイティブ・パクテリオロジー（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）の第８版（
１９７４年）を検索したところ、ｌｈ７−Ｍ株はバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　Ｉ２Ｉに属するのが相当で
あることがわかった。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼのｉ素化学的性質は以下に示すとおりである。

（１）作用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意にβ−１，４
結合を分解して、主としてキトサンオリゴＭ　（Ｇｌｃ
Ｎ）　　（ｎ＝２−８）　（２ｆｆｉ体〜８！！に体）
を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液体クロマトグラ
フィーを用いてキトサン分解液から分隔することができ
る。この分解液におけるキトサンの分解度は約４５％で
ある。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）にも作用
し、ある程度はこれを分解するが、キチンには仝〈イ乍
用しない−（２）作用温度範囲および最適作用温度：可
溶性キトサンを基質とした場合、８０℃まで作用し、最
適作用温度は５０℃である。

ｐＨ６，０において１０分間反応させた場合の温度と比
活性の関係を第１図に示す。

（３）作用ｐＨ範囲および最適ｐＨ： ｐＨ３〜９の範囲において作用し、最適ｐＨはｐＨ６で
ある。

１％可溶性キトサン１７７ＺＡ！に各ｐＨの緩衝液２ｍ
Ｊおよび酵素液１　ｒｎＩ！を加えた反応液を３７℃に
おいて１０分間反応させた場合のｐＨと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。

（４）熱安定性： ５０℃における１５分間の保温まで、はぼ安定で、６０
６Ｃにおける１５分間の加熱により、酵素の約４０％が
失活し、７０６Ｃにおける１５分間の加熱により、完全
に失活した。

温度と比活性の関係を第３図に示す。

（５）ｐＨ安定性： ０．１Ｍ緩′Ｉ１１？液中で３０°Ｃにおいて２時間放
置した後、残存する酵素活性を測定したが、ｐＨ５〜１
１の範囲において安定であった。ｐＨｌｏ〜ｌ】におい
て安定であることは、バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより
生産されたキトサナーゼの大きな特徴の一つである。ｐ
Ｈと比活性の関係を第４図に示す。

（６）阻害剤： バチルスＮａ７−Ｈにより生産されたキトサナ−ＰｂＣ
１、ＡｇＮ０　　、およびＰＣＭＢの存在によりはぼ１
００％が阻害された。

（７）基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を０．２５％とした
時に、酵素反応液４　ｍ１１当り酵素蛋白質１ｍｌによ
って１時間後に遊離する全還元糖とへキソサミンのｆ！
ｋ（〜／哩蛋白質／時）を測定した。

その結果が第１表に示される。

（以下余白） お　第１表　基質特異性 注）　※：ライシッヒ（Ｒｅ１５５１ｇ　）法による。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼは、コロイダルキトサン、可溶性キトサンおよびグラ
イコールキトサンをよく分解し、カルボキシメチルセル
ロース（ＣＭＣ）も若干分解したが、粉末キトサンには
作用しなかった。またコロイダルキチン、グライコール
キチン、粉末キチンおよびメチルセルロースは全く分解
しなかった。

（８）分子量： ５ＯＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分子量を
測定した結果を第５図に示す。第５図において（○）は
バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼの分子量であって、約４１　、０００である。

セファデックスＧ−１００を用いたゲル濾過法により分
子量を測定した結果を第６図に示す。第６図において（
０）はバチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産されたキト
サナーゼの分子量であって、約３０，０００である。

（９）酵素力価の画定法： の０．１Ｍ酢酸水溶液に溶解し、Ｏ，１Ｍ酢酸ナトリウ
ム水溶液でｐＨ６，０に調整した後、０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ：　６．０）を加えて、全容を＋００ｍ１にし
て、基質の１％可溶性キトサン溶液を調製する。

３７６Ｃにおいて５分間プレインキュベー１−シた基質
の１％可溶性キトサン溶液１ｍ７！に、同様にブレイン
キュベートした酵素液１　ｒｎｌを加え、３７℃におい
て正確に１０分間酵素反応を行なわせる。その径反応液
を３分間煮沸して酵素反応を停止させ、反応液中に生成
した還元糖を定１する。

この条件において１μモルのグルコサミンに相当する還
元糖を遊離させる酵素量を、１単位（ｕｎｉｔ）のキト
サナーゼ活性とする。

以下において本発明を参考例および実施例によってさら
に詳しく説明する。

参考例 （種培養の調製） ２５０ｍ／！容三角フラスコに、酵母エキス０．８％、
ペプトン０．４％、肉エキス０．２％、コロイダルキ１
−４＋−ノｎ、５Ｑ＜Ｋ−７）ｔｐ彷／に慣Ｏｈ　　（
ｎＬＩ　°　７．９１Ｒｎｍ、５を入れ、常法により殺
菌した後、これに予め成体培養したバチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ−）　Ｎｏ、　７−Ｍ　　（ＦＥＲＭＰ
　−８１３９）を接種し、３０℃において、１日間振と
う培養した。

（酵素生産用培養液の調製） ５１１容三角フラスコ２本に、上記と同一の組成の液体
培地をそれぞれｌｌずつ入れ、常法により殺菌した後、
これに上記で得られた種培養液４０ＴｒＬｌを接種し、
３０℃において、４日間振とう培養した。培養液を６＋
ＯＯＯｒ、ｐ、ｍにおいて遠心分藤して、菌体を除去し
、得られた上澄液のキトサナーゼの活性をｈ”Ｊ記の酵
素力価の測定法によって測定した。上澄液１ｒｒＬｌ当
り０．９９単位であった。

（酵素液の精製） 上記で得られた上澄液を混合し、得られた混合液１．８
１１に固体硫安１，０１５　ｇ（硫安８０％飽和に相当
する）を加え、濾過し、得られた沈デン物を蒸留水に溶
解し、１７７ｍ１とした。この酵素液を蒸留水、引き続
いて、０．０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ：　６．０）に
対して透析した後、得られた酵素液を、予め０．０２　
Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−
５０を充填したカラム（２，６ｃｍ（径）Ｘ４５ｃｍ（
長さ）〕に流してキトサナーゼを吸着させた。はとんど
の不純蛋白質は素通り区分に集まっていた。このカラム
を０．０２Ｍリン酸綴衝液３５０ｍＪで洗浄した後、０
〜０．５Ｍの塩化ナトリウムで直線的濃度勾配により酵
素蛋白質を溶出した。

次にキトサナーゼ活性を示した第２１８〜２４０のフラ
クションを合し、これをダイアフローメンブレンフィル
ターＰＨ−１０（アミコン社製品）を用いた限外濾過装
置で１７倍に濃縮し、このｌｌ：Ｉ縮液に、セファデッ
クスＧ−１００を用いるゲル濾過を行なった。

このゲル濾過のキトサナーゼ活性を示した第５０〜６３
のフラクションを合し、再びＣＭ−セファデックスＣ−
５０によるカラムクロマトグラフィーを行なった。前回
と同じ条件で酵素を吸着し、０〜０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムで直線的濃度勾配により酵素蛋白質を溶出した。

このカラムクロマトグラフィーにおいて２〜４２　ｕｎ
ｉｔ　／　ｒＩＬｌのキトサナーゼ活性を示すフラクシ
ョンが得られた。

実施例１ ５００ｒｒＬｌ容のビーカーに、キトサン（脱アセチル
化度：９９％）１５ｇを取り、これに脱イオン水１５０
ｍＪおよびＩＮ酢酸７５ｍＪを加え、充分撹拌した径、
脱イオン水を加えて、全体を３００ｍ７！とじた。この
キトサン酢酸溶液のｐＨは５．６８であった。

このキトサン酢酸溶液ＩＱｍＪを試験管に取り、３７℃
の恒温槽において１０分間ブレインキュベートした。

これとは別に、参考例のＣＭ−セファデックスＣ−５０
によるカラムクロマトグラフィーで得たキトサナーゼ溶
液を水で希釈し、１０．５ｕｎｉｔ　／呪とし、その１
１を試験管に取り、前記と同様にブレインキュベートし
、これを前記のキトサン酢酸溶液に加え、３７９Ｃの恒
温槽において反広六什ブー　竿７１’ＡＩ−千すＩＬＩ
；　ｌ川の式ヌブ我２−　好験管を沸とう浴に浸漬し、
反応液を加熱して反応を停止させ、それぞれの反応液に
おける還元着の生成ｍ＜ｔｒｔｙグルコサミン／ｍ７り
および高速液体クロマトグラフィーによるキトサンオリ
ゴ糖の重合度別の生成量の割合を調べた。

その結果は第７図および第８図に示すとおりであった。

第７図は、反応時間と還元糖の生成量の関係を示し、そ
のタテ軸は還元糖の生成ｆｆｉ　（１グルコサミン／ａ
ｌ）であり、そしてヨコ軸は反応時間（時間）である。

第８図はキトサンオリゴ糖の重合度別の割合を示し、そ
のヨコ軸はキトサンオリゴ恒の重合度であり、そしてタ
テ軸は生成したキトサンオリゴ糖におけるそれぞれの重
合度のキトサンオリゴ塘の含有比率（％）である。第２
図におけるそれぞれの重合度のキトサンオリゴ糖の含有
比率は、棒グラフの面積比によって示される。

実施例２ 実施例Ｉのキトサン酢酸溶液１０ｍ１を試験管に取り、
３７℃の恒温槽においてＩＯ分間プレインキユベートし
た。

これとは別に、参考例のＣＭ−セファデックスＣ−５０
によるカラムクロマトグラフィーで得たキトサナーゼ溶
液を水で希釈して、？　ｕｎｉｔ　／　ｒｒＬＩ！およ
び３．５　ｕｎｉｔ　／　ｍｌｌのキトサナーゼ溶液の
それぞれを！１ＩｉｌｌｌＬ−ｚ、それぞれＩ　Ｒｊ？
をそれぞれの試験管に取り、前記と同様に３７℃の恒温
槽においてプレインキユベートシ、これらをそれぞれの
前記のキトサン酢酸溶液に加え、３７°Ｃの恒温槽で反
応させた。第９図に示す時間の経過径に、試験管を沸と
う浴に浸漬し、反応液を加熱して反応を停止させ、それ
ぞれの反応液における還元糖の生成量（哩グルコサミン
／ＴｒＬｌ）を測定した。

その結果は第９図に示すとおりであった。

第９図は、反応時間と還元糖の生成量の関係を示し、そ
のタテ軸は還元環の生成量０１グルコサミン／１ｒＬＪ
）であり、そのヨコ軸は反応時間（時間）である。そし
て（−〇−）は７ｕｎｉｔ／喘のキトサナーゼの結果で
あり、また（−Δ−）は３．５　ｕｎｉｔ　／ｍｌのキ
トサナーゼの結果である。

実施例３ ５０ｏｍ、ｇ容のビーカーにキトサン（脱アセチル化度
＝９９％）１５ｇを取り、これに脱イオン水ｘｓｏｍｚ
およびＩＮ乳酸８２．５ＴＬｌを加え、充分撹拌した後
、脱イオン水を加えて、全体を３００ｍ１とした。この
キトサン乳酸溶液のｐＨは５．９０であった。

このキトサン乳酸溶液１０７７ＬＪを試験管に取り、３
７℃の恒温槽において１０分間ブレインキュベートした
。

これとは別に、参考例のＣＭ−セファデックスＣ−５０
によるカラムクロマトグラフィーで得たキトサナーゼ溶
液を希釈して１０．５　ｕｎｉｔ　／　ｍｅとし、その
Ｉ　ＴＪを試験管に取り、前記と同様にプレインキユベ
ートシ、これを前記のキトサン乳酸溶液に加え、３７℃
の恒温槽で反応させた。第１Ｏ図に示す時間の経過後に
、試験管を沸とう浴に浸漬し、反応液を加熱して反応を
停止させ、それぞれの反応液における還元糖の生成ｆＩ
ｋ（７ｎｇグルコサミン／７ｎｌ＞を測定した。

その結果は第１Ｏ図に示すとおりであった。

第１０図は反応時間と還元糖の生成量の関係を示し、そ
のタテ軸は還元環の生成量（ｒｒＬｇグルコサミン／ｒ
ｒＬＩりであり、そのヨコ軸は反応時間（時間）である
。

実施例４ ５００ｔｙｕ！容のビーカーにキトサン■〔脱アセチル
化度：９７％、粘度（０，５％酢酸ＩＱＱｍＩ！にキト
サン０．５ｇを溶解した時の粘度）　　：　２７０　ｃ
ｐｓ）　３ｙを取り、これに脱イオン水１００ｒｒＬＪ
ｉ！およびＩＭ酢酸ｉｓｍｚを加え、充分に撹拌した後
、脱イオン水を加えて、全体を３００ｍ１ｌとした。こ
のキトサン■酢酸溶液のｐＨは５．３０であった。

このキトサン■酢酸溶液１０ＴＬ！！を試験管に取り、
３７℃の恒温槽において１０分間ブレインキュベートし
た。

これとは別に、参考例のＣＭ−セファデックスＣ−５０
によるカラムクロマトグラフィーで得たそのｌ　ｎＩ！
を試験管に取り、前記と同様にブレインキュベートし、
これを前記のキトサン■酢酸溶液に加え、３７℃の恒温
槽において反応させた。

第１ｆ図に示す時間の経過後に、試験管を沸とう浴に浸
漬し、反応液を加熱して反応を停止させ、それぞれの反
応液における還元糖の生成１ｉｔ（７１ｇグルコサミン
／ｍｌ）を測定した。

キトサン■〔脱アセチル化度＝９９％、粘度（０，５％
酢酸１００ｍＪにキトサン０．５ｇを溶解した時の粘度
）　　：　１００　ｃｐｓ）およびキトサン■〔脱アセ
チル化度：９９％、粘度（０，５％酢酸１００ｉＩｌに
キトサン０．５ｇを溶解した時の粘度〕：２０　ｃｐｓ
　）をそれぞれ使用し、それぞれ前記と同様にして、そ
れぞれの反応液における還元糖の生成ｆｆ１Ｏ醇グルコ
サミン／ｒｒＬｌりを測定した。

その結果は第１１図に示すとおりであった。

第１１図は反応時間と還元環の生成量の関係を示し、そ
のタテ軸は還元環の生成ｍ（７７Ｌ９グルコサミン／ｍ
ｅ）　　であり、ヨコ軸は反応時間（時間）である、そ
して（−〇−）はキトサン■の結果であり、（−Ｘ−）
はキトサン■の結果であり、また（−へ−）はキトサン
■の結果である。

実施例５ ２５＋）ｍＪ容の三角フラスコにキトサン５１／（ｍア
セチル化度：９９％）を取り、脱イオン水５０ｍｇおよ
びＩＮ酢酸２７．５ｍ／！を加え、充分に撹拌した後、
脱イオン水を加えて、全体を１００ｍ１！とじた。この
キトサン酢酸溶液のｐＨは５．７４であった。このキト
サン酢酸溶液を３７°Ｃの恒温槽において１５分間ブレ
インキュベートした。

これとは別に参考例のＣＭ−セファデックスＣ−５０に
よるカラムクロマトグラフィーで得たキトサナーゼ浴液
を希釈して、１０．５　ｕｎｉｔ　／　ｍｌｌとし、そ
の＋ｏｍｇを試験管に取り、前記と同様にプレインキユ
ベートシ、これを前記のキトサン酢酸溶液に加え、３７
°Ｃの恒温槽において反応させた。

１時間４０分後に三角フラスコを沸とう浴に６分間入れ
、反応液を加熱して反応を停止させた。反応液の還元層
の生成量を、グルコサミン塩酸塩を標準試料として、測
定し、２２．５　ｍｌｉ　／　ｍｌの結果を得た。

反応液を遠心分離し、さらに濾紙で濾過した後、凍結乾
燥して、６．１８ｇのキトサンオリゴ着粉末を得た。

反応時間を６時間としたこと以外は、前記と同様にして
還元層の生成Ｗｋ　２５．８　ｍ９　／ｍｌ　（Ｄ反応
Ｈを得、さらに６．３８ｇのキトサンオリゴ糖粉末を得
た。

それぞれの反応液の一部を高速液体クロマトグラフィー
にかけて、キトサンオリゴ猜の重合度別の生成量を調べ
た。

その結果は第１２図に示すとおりであった。−第１２図
において、ヨコ軸はキトサンオリゴ糖の重合度であり、
そのタテ軸は生成したキトサンオリゴ着におけるそれぞ
れの重合度のキトサンオリゴ糖の含有比率（％）である
。第１２図におけるそれぞれの重合度のキトサンオリゴ
糖の含有比率は棒グラフの面積比によって示される。第
１２図の（ａ）は１時間４０分の反応における結果であ
り、（ｂ）は６時間の反応における結果である。

実施例６ １Ｎ酢酸２７−５ｍ１ｌの代りに、ＩＮ乳酸３１ｍ／を
使用したこと以外は、実施例５と同様にして、ｐＨ５，
７４のキトサン乳酸溶液をつくり、これを、実冴例５と
同様にして、反応液の還元［４１を測定し、キトサンオ
リゴ糖の重合度別の生成量を調べ、そしてキトサンオリ
ゴ糖の粉末を得た。

１時間４０分の反応における反応液の還元糖の生成量は
１９．４　ｍｌｉ　／　ｒｒＬｌであり、そしてキトサ
ンオリゴ塘粉末の取量は６．５３．９であり、また６時
間の反応における反応液の還元層の生成量は２４、３　
ｍ！ｇ／　ｍｌであり、そしてキトサンオリゴ糖の収量
は６．９２ｇであった。

キトサンオリゴ糖の重合度別の生成量の測定の結果は第
１３図に示すとおりであった。

第１３図において、ヨコ軸はキトサンオリゴ着の重合度
であり、そのタテ軸は生成したキトサンオリゴ糖におけ
るそれぞれの重合度のキトサンオリゴ糖の含有比率（％
）である。第１３図におけるそれぞれの重合度のキトサ
ンオＩＪ−ｆｉｎ！の今右１す軍は棒グラフの面積比に
よって示される。第１３図の（ａ）は１時間４０分の反
応における結果であり、（ｂ）は６時間の反応による結
果である。

〔発明の効果〕

Ｄ−グルコサミンの１１１Ｍ類を生成することなく、主
として重合度２〜８のオリゴ糖を含むキトサンオリゴ塘
を効率的に製造しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、キトサナーゼの作用温度範囲における温度と
比活性の関係を示す図表、第２図はキトサナーゼの作用
ｐＨ範囲におけるｐＨと比活性の関係を示す図表、第３
図は、キトサナーゼの熱安定性における温度と比活性の
関係を示す図表、第４図は、キトサナーゼのｐＨ安定性
におけるｐＨと比活性の関係を示す図表、第５図および
第６図はキトサナーゼの分子ｆｆｉ測定の結果を示す図
表、第７図は、実施例Ｉにおける反応時間と還元層の生
成量の関係を示す図表、Ｎ８図は、実施例１におけるキ
トサンオリゴ糖の重合度別の割合を示す図表、第９図は
、実施例２における反応時間と還元層の生成量の関係を
示す図表、第１０図は、実施例３における反応時間と還
元糖の生成量の関係を示す図表、第１＋図は、実施例４
における反応時間と還元糖の生成量の関係を示す図表、
第１２図は、実施例５におけるキトサンオリゴ剪の重合
度別の割合を示す図表、そして第１３図は、実施例６に
おけるキトサンオリゴ刻の重合度別の割合を示す図表で
ある。 出願人　片倉チッカリン株式会社 （ほか２名）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサンを、バチルス属に属する微生物により生
   産される酵素であって、５〜１１のｐＨ領域において安
   定なキトサナーゼによって分解して、Ｄ−グルコサミン
   の単糖類を含むことなく、主として重合度が２〜８のオ
   リゴ糖を含むキトサンオリゴ糖を得ることを特徴とする
   キトサンオリゴ糖の製造法。
2. （２）バチルス属に属する微生物が、バチルスＮｏ．７
   −Ｍ（微工研菌寄第８１３９号）であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載のキトサンオリゴ糖の製
   造法。
3. （３）キトサンが、コロイダルキトサンであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載のキ
   トサンオリゴ糖の製造法。
4. （４）キトサナーゼによるキトサンの分解をｐＨ６の前
   後において行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項ないし第３項のいずれかに記載のキトサンオリゴ糖の
   製造法。