JPS6249258A - 液体試料中の各種抗体の免疫定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野一 本発明は単数又は複数の抗原に対する各種の型の抗体の
免疫学的定量方法に関する。更に詳細には本発明はＩｇ
Ｍ抗体、ＩｇＧ抗体及び恐らくその他の型例えばＩｇＡ
　、　ｉｇｎ　、　ＩｇＥを含有する液体試料例えば生
物学的・流体の中のＩｇＭ抗体の免疫学的定量方法に関
する。

頓才α皮街−幻ｌｌ穎県 ヒトがバクテリア又はウィルスに感染し７た場合には該
病原ｉ戒生物の殺滅のために−・般には各種の型の抗体
を産生ずる。

木質的に抗体は主としてＩｇＭ型抗体であるがやがてＩ
　Ｆ、、Ｇが優勢となり多年にわたり存続する。抗体の
存在をｊｉ″Ｌに測定することば感染の有無の診断にと
って有用でないことが屡々であるけれどもヒトが免疫性
を有するか否か、又は残る特別な型の感染に対して抵抗
性を有するか否かの測定に＋９いてかなり価値あるもの
である。しかり、なから最初に形成された抗体即ちＩｇ
）Ｉが検出され、ｉ、（ｃに比較された相対的濃度が測
定されるならば、感染が最近起ったものなのか又Ｌ７１
′古い時期に起ったものなのかを知り得るのである。か
ような測定は例えば各種のバクテリア、プロ１−シア及
びウィルスによる感染が胎児にまで及んだ場合の〒朋妊
娠時において極めて重要である。

該測定に伴・う困難性はＩｇＧとＩｇＭとの濃度の相違
にある。分子？農度に関してはヒ１〜血清中のＩｇＧは
ＩｇＨの例えば１０倍以上で存在することが予期される
。Ｉｇ）１又はＩｇＧの通常２％以下のＩｇＨ抗体又は
ＩｇＧ抗体の比率が期待され、これは双方の免疫グロブ
リンにとって同様であろう。

ＩｇＧからＩｇＭ抗体を区別する多くの方法が文献に記
載されている（参考書：　Ｃｈａｎｔｌｅｒ　ａｎｄ　
Ｄｉｍｅｎｔ。

Ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ＩｇＭ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓｓａｙｓ（１９８
１）　１４１７＋　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙｓ
　ｆｏｒｔｈｅ　８０　’ｓ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｐ、　Ｐ
ｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　Ｌａｎｃａｓｔｅｒ。

Ｉｌ、　Ｋ、　）。

赤血球凝望法（Ｃｏｏｍｂｓ　ｅｔ　ａｔ、：　Ｌａｎ
ｃｅｔ　（１９６８）２．１１１５）を除くすべての方
法は選択された抗体を選択的に吸着するためのｉ故量滴
定板（ｍｉｃｒｏｔｉｔ、ｒａｔｉｏｎ　ｐｌａｔｅ）
の管又は凹井（ｗｅｌ＋）の壁に付着（結合）した抗原
又は抗体に依存する。該管又は門外を洗って望ましから
ぬ免疫グロブリン又は他の存在可能な妨害物を除去しζ
からＩＢＭ（又はＩｇＧ　）抗体を標識する方法を適用
し、かようにして被検抗体量を測定する〔例えば記載文
献（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ、　Ｏｓｓ、　Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ、　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ“Ｔｏｘｏｒ＋０ｓ
ｔｉｋａ　ＩｇＨ　ａｎｄ　Ｔ（（Ｇ　Ｍｉｃｒｏｅｌ
ｉｓａ″ｓｙｓｔｅｍ）を参照されたい）。該方法は゛
多くの手作業Ｉ！ｎち非結合抗体からの結合抗体の物理
的分別、洗浄及び長期間の恒温保持を必要とする。最も
多くの試験法における主な妨害物は“リウマチ因イ（ｒ
ｈｅｕｍａ−ｔｏｉｄ　ｆａｃｔｏｒ）”又は”ＲＦ″
とよばれる抗体である。該ＲＦは多価抗原と反応したＩ
Ｐ、Ｇ又は物理的もしくは化学的過程により凝集したＩ
ｇＧと結合したＩｇＭであってすべての被検試料中で大
比率に存在する。更に多くの試験法は半定量的であるに
過ぎず即ち試験結果は重量であられされ得ない。

−灸■９月−吟 従って本発明の［１的は従来既知の定量法におｌｄる上
記の諸欠点を改善すると共に少くともひとっ（７）Ｊｊ
’ｉ：原に対し、ｒＩＸＭ　、ＩｇＧ　Ｊｊ’ｆｆ体を
含有すルノ２ｉならず恐らく他の型の抗体例えばＩ、、
Ｉｔ　、　１ｇ＋１　、１ｇ１シをも含有する液体試料
例えば生物学的流体中のＩＩ′りＩ抗体を著しく迅速に
、６０分間以上を要−りすに定量的に測定する免疫試験
法を提供するに在る。

本発明方法はＭｔｌ＋定に当りＴＨＧ抗体から、又は血
清から、又は体内の流体からの【ｇＭ抗体の物理的分別
を全く必要とし２（い。更に本方法は例えばＩｇＭ抗体
及び他の型の抗体を含む液体試料中の１１′−ＩｇＨ抗
体の量的測定を可能とする。他方法とは異り本発明方法
ば又完全に自動化され得る。

一定−ＩｊＪＪ　（７）−開−示 本発明に従い上記目的達成のために、抗原の少くともひ
とつに対するＩｇＭ　、ＩＢＧ抗体を含むと共に他の型
のもの例えばＴ、、Ａ　、　Ｔ、Ｄ　、　Ｉ８Ｆをも含
む可能＋＜＋のある液体試料をｆＧに対する抗体と反応
させ、該試料が該抗原のひとつに対するＩｇＡ抗体を含
む場合（ＩｇＤ抗体及びＩｇＲ抗体は一般に無視され得
る量で含まれる）にはＩｇＡに対する抗体と反応させる
。微細粒子群例えばラテックス粒子群又は赤血球細胞群
と結合する該抗原及び結合抗原と同型の遊離抗原を主文
において得られた反応生成物に対しｙで加え、該微細粒
子群の凝集度又は非凝集度を測定する。ＩｇＭ抗体量ば
該非凝集微細粒子群量に反比例する。

本発明の特別態様に従うと、ＩｇＧに対する抗体及びＴ
ｇＡに対する抗体であり得る抗体を加えた後に、及びそ
の結果得られた溶液を恒温保持しまた後に、リウマチ因
子による影響を中和するために、及び抗−ｒｇＧ抗体及
び遊離抗原により完全には中和されなかったＩＰ、Ｇ抗
体にもとづく凝集の強化を阻止するために、凝集したＩ
ｇＧを添加する。

本発明の特別態様に従えば、生成されたサスペンシコン
中の凝集−又は非凝集−＝微細粒子」Ｙ量を、比濁法或
は濁度法（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ　ｏｒ　ｔｕｒ
ｂｉｄｉ−ｍｅｔｒｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）によるか又は
凝集−或は非凝集−粒子故旧算法によって測定する。

本発明は又ＩｇＨ抗体、ＩｇＧ抗体及びＴｇＡ抗体を含
む液体試料例えば生物学的流体の中のＩｇＧ抗体プラス
１．Ａ抗体の免疫定量法に関するものであり、この定量
法によれば該液体試料中のｒｇＭ抗体量を一、！＝記方
法によって先ず第一に測定し、次に該ＩｇＡ抗体量を１
．Ｍ抗体プラスＩｇＧ抗体プラス１（ＨＡ抗体の総量か
ら差引き、かようにしてＩｇＧ抗体プラスＩｇＡ抗体量
を得る。全抗体活性量は例えば抗原被覆ラテックスを抗
体によって凝集さ一ヒる方法にもとづくか又は多くの文
献〔例えばＭａｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、：ｔ”ａｒｔｉ
ｃｌｅ　　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏ　　Ａｓ５
ａｙ（ｒ’ＡｃＩＡ）　　ｉｎＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　（１９８１）　、　　７４゜
１０６Δｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）の記載のごと
き凝集粒子数計算法にもとづくものである。

本発明方法の特徴的態様はｒｇＭ抗体の凝集活性の制限
にあり、その結果として他の抗体即ちＩＰ、Ｇ及び恐ら
（ＩｇＡの存在下のＩｇＭ抗体の存在■を正確に測定す
る確立された凝集技術の使用にある。

周知の通りラテックス“Ｌｘ”を抗原“ＡＰ、”　（こ
の抗原は例えば病原性バクテリア又は病原性ウィルスか
らみちびかれ抗体生成へみちびく）で被覆し該Ｌ　ｘ　
Ａ　ｇを細胞４４数器へ通過さ□ｌ！ると申−・のｌ、
ｘＡｇ粒子群の濃度と正比例するピークを醪える。７ｇ
Ｍクラス（ＩｇＭａｈ）の抗体をＬｘＡｇと接触さ・υ
ると該抗体はＬｘＡｇ凝集を起して遊離のＬ　ｘ　Ａ　
ｇ粒子数を減するので該ＬｘＡｇの濃度を減する。この
減少度は被検試料中の全抗体量（ＩｇＧＡｂ及びＩｇＡ
計及び多分子ｇＡＡｂ）に直接的に正比例する。

ＩｇＧＡｂを凝集させる物質の添加によってＩｇＧＡｂ
の反応を省略すること、従ってラテックスとの反応から
除去すること、そして単に１．ＭＡｈとの反応を残すこ
とが可能であることはギスベン等の記載ＣＧ１５ｐｅｎ
　ｅｔ　ａｌ、：　Ｃ１１ｎ、　Ｐｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　［１９７５）２２．３２１）又はシュミツ等
の記載（Ｓｃｈｍ　ｉ　ｔｚａｔ　ａｌ、　：　Ｊ、　
Ｃｌ１ｎ、旧ｃｒｏｂｌｏ１．　　（１９７５）　　１
゜１３２〕のように理論的であると思われる。

ＩｇＡ　（ＩｇＡＡｂ）抗体をも又含有する被検液の場
合には該抗体を凝集させる物質の添加によってラテック
スとの反応物から該抗体をも分離し得る。本発明に従い
ＩｇＧの全部を分離する特異的試薬としてヤギからの抗
血清を選択する。該抗血清はヒトのＩｇＧのいわゆるＦ
ｃ域（抗−Ｐｃ）は対して指向されていてヒ１〜のＩｇ
Ｇ抗体をｉ！択的に６４集するものとして公知である。

ジチオスレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ）はＩｇＧ抗体を破壊
しないがこのｒｌＴＴとの処理によ−２て全ＩｇＨ抗体
を不活性化すると１、ｘＡｇ（７１１凝集が達成される
が但Ｕ７その程度はより少い。ＩｇＧ抗体を凝集さ・０
゛るために該ザスベンシ９ンに対し抗−Ｆｃ抗体を添加
してもちはや１．、ｘ　Ａ　Ｂの凝集は認められない。

従ってＩｇＧ抗体によるラテックスの凝集ばＩｇＧに対
する抗体に３Ｌって阻害されると考えられる。思いがし
Ｊないこととして該ＬｘＡｇ凝集物は、゛′抗−ＦＣ抗
体によって凝集された１、ＧＡｈ　”に対して公知の比
較的高潤度のＩｇＨＡｂ　（１）　Ｉ）　Ｔ処理・已ず
）を添加したときに、予期以トに弱い。このことばラテ
ックス上のＡｇ抗原はＩｇＧＡｂ−抗−Ｐｃ、複合体に
よってマスク（被包）されていると推測される。

次にＴＨＧ抗体とＬｘＡＨ抗体との反応をブロック（阻
１ト）するためにこの・す“スペンションに対して遊Ａ
１［抗原“ＡＰ、”を加える。該抗原はＩ（ＨＭ抗体（
ラテックスをｔＪｉ隼さ一１！得る（）Ｔ、体）をも又
ブＩ７ソクするであろ・うと考えられるかも１−２れな
い。とごろが驚くべきことに遊離抗原濃度が過度で４（
れれば該ブ１−１、ッキングは起らない。全ＩｇＧ抗体
を凝集さ・ｌするために遊離抗原ＡＰ、と抗−Ｐｃ抗体
とを共用することにより遊離粒子群濃度はＩｇＭ抗体の
みによる凝集の場合と明らかに同じである。、−の）１
１実の発１．！、はぞの効果の点で驚異に（ｌｆｆする
＆−１れどもこれし、１双方の抗体の既知の特性と一１
ｉすることなのである。

Ｔ　ｇ　Ｍ　Ａ　ｂはＩｇＧＡｂよりも弱い親和力を有
する、−とが普通である。けれどもその多結合価（１０
結合価）にもとづき、ＩｇＭΔ１〕は繰返しの抗Ｉ串決
定Ｗを有する抗原と優先的に反応する。ラテックスに対
するＡｇのカップリングは八ｇを反復性のものとするの
で従ってＩｇＭＡｂとの反応性を高めど）。従って低温
度の遊離抗原はＩｇＧ抗体の全結合能を飽和させるがこ
れに対してμ；だしく高濃度のｉ！ｌγ離ＡＨ（（１１
１，これは繰返し２の抗原決定基をイ１していない）番
、１、Ｉ　Ｐ、Ｍ抗体を飽和させることを必要とずろで
あろう。

結論とし一ζ本発明方法＋１１、例えばＴＡＧ　に対す
る抗−Ｐｃ抗体の使用により、及び被検液体試才″１が
７Ｆ、Ａ抗体、“既ｊ４夕の通り無視可能の量で一般に
存在するＩｇＤ抗体°及びＩｇｎ抗体を含む場合には明
らかにＩｇｌｌに対する抗体の使用により、ＩｇＨ抗体
活性の測定を可能にする。該ＩｇＧ抗体は事実遊離抗原
と結合し、該抗原点の結合はＩｇＧ抗体及び恐らくはＩ
ｇＡ抗体の不活性化を達成する。

本発明方法は既述の通りｒｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体及びＩ
ｇＡ抗体含有液体試料中のＩｇＧ抗体プラスＴｇＡ抗体
の定量を可能とするものであって該方法に従うと被検液
体試料中のＩＢＭ抗体量を−１−述の方法によって先ず
測定し、次に該１ｇＭ抗体量をＩｇＭ抗体＋ｉＨＧ抗体
＋ｆＡ抗体の全量から差引き、かようにしてＩｇＧ抗体
＋ＩｇＡ抗体量を得る。ＩｇＧ抗体量の測定のためには
反応混合物に対して抗−ＴｇＡ抗体を加えることで充分
であることが明かであり、同様にしてＴｇＡ抗体量を定
めるためには反応混合物に対し抗−ＩｇＧ抗体を加える
ことで充分であることが明かである。

従前技術の多くの方法を誤った陽性の結果にみちび（ひ
とつの問題はりウマチ因子（ＲＦ）によって起るｆ渉（
妨害）であった。ＲＦ　Ｉｆ大部分のＩ　ｇ　Ｇ　Ａ　
ｂ　−Δｇ複合体と結合しているＩｇＨ抗体である。

本発明によれば該リウマチ因子の影響は凝集したＩｇＧ
の添力ｌによって中和される。この中和工程の結果はＩ
ｇＧに対する抗体及び“ＴｇＡに対する抗体であり得る
抗体”の添加の後に“著しく高濃度のりウマチ因子を含
むがＩｇＭＡｂを欠如する血清”を添加し、かようにし
て得られた混合物を恒温保持することにより試験された
。実質Ｉ−異る結果を得た場合はなかった。

ｒｇＭＡｂの特異的測定のためのラテックス凝集試験に
ついて記載された最近の報告（Ｊ、Ｓ、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎｅｔ　ａｌ、：　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｍ　ａｎｔｉｈｏｉｅｓｗ
ｉｔｈ　　ａｎｔｉｇｅｎ　　ｔａｇｇｅｄ　　１ａｔ
ｅｘ　　ｐａｓｔｉｃｌｅｓ　　ｉｎ　　ａｎｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓＳａｙ、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３）　Ｖｏｌ、　１
７．　ｍ、５．９３９）に注意すべきである。はとんど
すべての既往の試験における通りヒトのＩｇＨ抗体に対
する抗体は微量滴定板の開弁（ｗｅｌ＋＞の壁に結合す
る。血清を加えると全Ｉｇ＋１の一部（ＩｇＭ抗体を含
む）が壁に付着する。

この反応の完結の後に抗原被覆ラテックス粒］薯ＩＹを
加える。数１ｌｌｉ、　１ｊｉｌ後己こ微Ｂ＋滴定板に
結合したううソクス量を測定し２、既知流度のＩＦ、Ｍ
抗体使用６１１　Ｊ、り得られた結果と札中１６　Ｌ、
かようにＵ２て抗体０着￥をａ（測する。この方法ｔ、
ｌ：　”１′定量的測定のみに限られる。この測定法４
Ｊ１．Ｍ抗体のみを測イ）ものであり、恒温保持に長時
間を要し、妨害物の洗去を要し、作業は集約的である６
更に患者のＩｇＭ免疫グ１１プリンが高量であるならば
結合１ｇＭＡｈの比率は減少し、従−３て感作能を減じ
、陽性結果を誤り得る危険をもたらす。

このＬｌ的のために本発明方法で使用される恒温保持時
間は短いことに注目されねばなｒ）ない。従ってＩｆ！
Ｇに対する抗体及び“Ｉ　Ｐ、、　Ａに対する抗体であ
り得る抗体”の添加後に、得られた溶液を約１〜１５分
間、温度約３７℃において攪拌Ｆに恒温保持する。他方
において、ｒｉｉｋ細粒子結合抗原及び遊離抗原を加え
た後に、（（Ｉられたサスペンションをも又約１〜１５
分間、）話度約３７℃において攪拌下に恒温保持する。

この同（〉恒温保持時間は、リウマチ因子による影響の
中和に使用される凝隼したＩｇＧの可能な添５．ｎ＋の
後０こ必要であると思われる。

実施セ１１ 本発明方法はいかなる感染症例えばトキソプラズマ症、
勺イトメガロウイルス、庖疹、風疹型及び類似型の感染
症に対して適用され／ｊ）るけれどもＦ文において、−
力ではブルセラ了ボルタス（Ｂｒｕｅｅｌｌａ　ａｂｏ
ｒｔｕｓ）、他方では１−キソブラスマ、ゴンジイ　（
Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）　Ｌニ一対する
ＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体の測定について記載される。

ブラセラ抗原はりボボリザソカライＦ　（Ｉ−、、Ｐ　
Ｓ）であった。

３＃１− 一！２−即ｊｑ世製 ウェスｌファル等の方法（Ｗｅｓｔｐｈａｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、　：Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｏｒｂｏｈｙｄｒａｔ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ＋　　Ｖｏｌ、　　５（１９
６５）　＋　　ｐ、　　８３．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｉ
’ｒｅｓｓｚ　Ｎ、Ｙ、）の水−フコ。ノール操作法（
こ従ってブルセラＬＰＳを抽出した。次にモレノ等の記
載（Ｍｏｒｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ、：Ｊ、　　Ｒａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　（１９７９）　、　　３６１．　１３
８゜Ｉｔ、　２　）の通りにし゛ζフェノール相を３容
）Ｊｉ（７）″メタノール試薬”により沈殿させＮａｌ
中のジメチルスルフォキザイド（５ザイクル）で処理し
た。次に該リボポリ４ノソカライド（Ｉ、Ｉ）Ｓ）を脱
イオン水に対して透析し°ζから凍結乾燥させた。

ラーテッー久−不ニー抗原−（１，に１．、−ｒ”−！
５）−（ト）町竪５倍希釈ＧＢＳ　（ｄＧＢｓ）　　［
但しＣＢＳはｐｌ＋９．２のグリシン緩衝食塩溶液であ
る〕の０．４　ｍ　ｌ！中にとかされたＳＯｐｇのｒ、
　ｐ　ｓに対し５０μｐのラテックス（１０％　ｗ／　
ｖ）　　（Ｋ　１０９　、　Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎ
ｃｅ、　Ｃｏｕｒｂｅｖｏｉｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）を添
加してからこの混合物を１分間３０ワットにおいて音波
処理（ｓｏｒｒｉｃａｔｅ３（Ｍｏｄｅｌ　Ｂ１２５ｏ
ｎｉｆｌｅｒ、　Ｒｒａｎｓｏｎ。

Ｄａｎｈｕｒｙ、　ＣＴ、　０６８１０）　　シた。１
０分間後にＧＢＳの中の１００　ｔｔ　ｇのヒＩ・血清
アルブミン（Ｈ３Ａ。

Ｒｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ、　Ｍａｒｂｕｒｙ／Ｌａｈ
ｎ、　Ｆ　ＲＧ）を加えてからこのサスペンションを再
び音波処理した。室温下の恒温保持２０分間及び遠心回
転器（ＳＳ　３４ｒｏｔｏｒ　ｏｆ　ａ　５ｏｒｖａｌ
ｌ　Ｒ５ＣＤ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中での１０００
０　ｒｅｖ／ｍｉｎにおける１０分間の処理の後に該ラ
テックスを１ｍ７！の水性Ｆデシル硫酸す１−リウム中
に再懸濁化し、音波処理１．てから３７℃で１時間恒温
保持した。該ラテックスを１ｍ７！のＧＢＳで２回洗浄
してから１　ｍ　ｅのＥ］’ｌ”ｌ’Ａ（エチレンジア
ミンテトラ耐酸）−ＧＢＳ〜Ｔ３　Ｓ　Ａ（ウシ血清ア
ルブミン）中に再懸濁化させた。温度−２０℃に冷凍貯
蔵又は凍結乾燥した該ラテ・ノクスは少くとも６力月間
にわたり安定であることが見出された。Ｌ　ｘ　Ｌ　Ｐ
　Ｓを凍結乾燥ｔ、２だ後に融解させ又は再懸濁化させ
てから３０ワットにおいて１５秒間音波処理した。使用
後に１．ｘ　Ｌ　Ｐ　ＳをＩＥＤＴＡ−ＧＢＳ−ＢＳＡ
中で１００倍に希釈しノζ。

抗−７−、ｐｃ抗体 セロチニ等（Ｃｅｒｏｔ、ｊ、ｉｎｉ　ｅｔ　ａｔ、：
　Ｊ　、Ｔｍｎ＋ｔ＋ｎｏｌｏｇｙ（１９６８）１０１
．４３３）の方法に従いパパイン消化によりヒトＩｇＧ
のＦｃフラグメントを羽製し、た。フロイントの完全ア
ジュバント中の１００μｇのヒトのＦｃを３週間毎にヤ
ギに皮肉注射した。

最終注射から１５日後に血清を集め免疫グロプリンを抽
出しその抗−Ｆｃ特異性を検査した後にＣＢＳ中で希釈
（１■／ｍ＃）Ｌ、た状態で使用した。

操−ゴｔ ＣＢＳで５０＝１に希釈されたヒト血清の５０μｐに対
し２５　ｐ　ｅの抗−ＰＣを添加した。この混合物を渦
動下に２分間３７℃に恒温保持した。次に２５μβの凝
集したヒトＩｇＧ免疫グロブリンを濃度２５＋ｎｇ／ｍ
ｆｆで加え、この混合物を更に１０分間３７℃で恒温保
持した。最後にこの混合物に対し、遊離抗原（ＬＰＳ）
と濃度５ｐｇ／ｍｅにおいて混合された２５１１ρの１
．ｘＬＰＳを加えてから更に１０分間３７℃で恒温保持
を継続した。２ｍ７！のＧ　Ｂ　Ｓの添加によってこの
反応を停止させてから得られた混合物を光学的細胞計数
器へ通過さ・Ｕて非凝集Ｉ　Ｘ　Ｌ　ＰＳの濃度を測定
した。ＩｇＭ抗体の濃度は遊離ラテックス粒子群濃度と
逆比例する。

凝集１．ｘ　Ｌ　Ｐ　Ｓの量を直接計測することも可能
であり、光学的手段と異る他方法例えば電気抵抗器を粒
子群の計測に使用することも可能であることは明かであ
る。Ｔ［１Ｍ抗体の過剰濃度にもとづく過誤を避げるた
め乙こ１．００／１及び２００／１希釈血清を用いてこ
の操作をくり返す。

本発明における他の変法に従うとＩＢＭ抗体及びＩｇＧ
抗体の濃度が比較的高い場合に濁度計によりラテックス
の凝集度を測定し得る。ＣＢＳ中の同量のヒト血清及び
抗−Ｆｃを渦動下に２分間３７℃で恒温保持した。次に
上記濃度乙こおける２５μｐの凝集したし）ＩＢＧを加
えてからこの混合物を１時間恒温保持し、その後に濃度
０．０２％において３０ｐρの１、ｘ　ｔ、Ｐ　Ｓを加
えた。この混合物を短時間渦動下に保ち、その後に６２
０ｎｍ及び４０５ｎ１１１において濁度を測定した。６
２０ｎｍの波長は基線を構成する。次にこの混合物を２
時間恒温保持した後に上記の２種の波長において該混合
物の濁度を再測定した。６２０ｎｍと４０５ｎｍとにお
ける最初の測定値と２時間恒温保持後の測定値との間の
差の減少は残留遊離粒子群に逆比例する。得られたサス
ペンションの中の凝集又は非凝集の微細粒子量を濁度計
以外の光学的密度測定器例えば比濁計によって計測する
ことも又可能である。

全抗体活性即ちＩＢＭ抗体＋ＩｇＧ抗体（例えば−ヒ文
中に例示されたｒｇ＾抗体不含有の血清）の活性の定量
法に関し、抗−Ｆｃ抗体の代りにＣｌ５Ｓ緩衝液のみを
使用し、ＬｘＬｒ’Ｓ　＋Ｌ　Ｐ　３０代りにＬ　ｘ　
１．、Ｐ　Ｓを使用する。ＩｇＧ抗体？ａ度のみの測定
のためには、試料のＩｇＨ抗体が試料のジチオスレイト
ール（口ＴＴ）による予備処理の際に破壊される事実を
除外して、全抗体活性の測定に同じ操作を使用する。

ＣＢＳによる希釈の以前の５０　ｔｌｌの血清に対し、
ＣＢＳ中５０ミリモル濃度のｐｌ＋９．２を有する１　
７０ｔｔｌ）のＥＤＴＡを加えた。この混合物に対し水
中１０■／ｍβの濃度における１５μｐのＤＴＴを加え
てから全混合物を３０分間３７℃に恒温保持し、その後
に１５μｌの０．２％過酸化水素溶液の添加によってＤ
ＴＴの反応を停止させた。

次に既述のように操作してから得られた溶液を１／１０
．１／２０及び１／４０に希釈して」二記の定量操作に
供した。

添付図面の第１図はブルセラアボルクスに感染した患者
の血清（上文中に用いられた血清と同じ血清）のＩｇＭ
抗体濃度を示し、該濃度は約１年間にわたり（１分間当
り計測値における）放射免疫測定法（ＲＩ　Ａ）により
得られ、及び（観測凝集単位における）本発明方法によ
り得られた。

該両者の曲線は類似しており、これは本発明の定量方法
が信頼され得ることの証明であることが理解され得る。

例−一？。

一１ｇＧ−及Ｕｊ−−」ゴ１゛右ズヌ−チ−ンん抗一体
Δ測定−し；−／　７”う不ｊメク人抗１１く一上−±
又杭原ｙ−Φ−調−製Ｔ、ゴンジイの胞子土類に予め３
日間感染させたマウスの腹膜浸出物からトキソブラスモ
シス抗原を調製した。腹膜腔を３〜５ｍｊ！の滅菌生理
的食塩水で２〜３回洗浄して洗浄物を貯留させた。

このサスペンションの１ｍｎに対し０．０５ｍｎの抗生
物質ペントレキシル（Ｐｅｎ　ｔｒｅｘｙ　ｌ）及び１
０ｊｐ位のヘパリンを加えこれを円錐形底部をもつ管の
中で１／２時間室温に保持した。次に該管を６００ｒｐ
ｍで４分間遠心処理し、と澄を除き、ペレットを食塩水
中に再懸濁化させ４℃において４０００ｒｐｍで１／２
時間再び遠心処理した。ベレ・７トにｔ＝ＩＵ、　２　
ｍ　／！のＩＭ　　Ｎｉｌ、ｌを加えて赤血球を？’８
１１１Ｌ処理してから４℃において＝１．　ＯＯＯｒｐ
ｍで再び遠心処理し、食塩水を用いてペレットを３回洗
浄してから４℃Ｃ１４０００ｒｐで１／２時間再び遠心
処理した。

該ベレットを２ｍ７！の蒸留水の中に再３脈濁化させて
からドライアイスアセトンを用いて凍結と融解とをくり
返し、その都度該溶液を超音波混合処理に付した。１０
分間３００　Ｏｒｐｍで遠心処理した後に上澄を採りＰ
　Ｂ　Ｓ　−ＮａＣＩ　　（Ｌ　Ｍ）で平衡化されたウ
ルＩ・ロゲル（ｔｌｌｔｒｏＲｅｌ）　３−４のコラム
を通過させた。各フラクションについてこれらをラテ・
２クス−Ｆ（ａｂ’）２抗−１−キソプスモシスに対し
て試験し、ラテックスを凝集さ−Ｖたフラクションを貯
留し、？農縮し、−２０℃に貯蔵した。

ラテン外友二Ｔｈ；、’ｚａ１ｍりび↓９靭）−Φ−班
製力ルボキシ化ラうンクス（１，０％　Ｗ　／　Ｖ　）
（１，に）の２５０　ｐ　ｅに対し２ｒｎ　（！のハル
ビト−ル緩衝化食塩水（ＤＢＳ）（０，０２Ｍ、ｐＨ８
，１）を加え１１００００ｒｐで１０分間遠心処理した
。−１４澄をとり２５０　メ１ρＢＢＳを加えて４℃に
冷却した。次（こ２５ｍｇのカルボジイミド（ＣＩ）Ｉ
）を含有するＢＢＳの２５０７ｚ７！を加えて１０呵の
Ｃ［ＩＴ／１００μ１．Ｌｘの混合物を仕成さ・Ｉ！、
この溶液を新たに調製して４　’ｃに保ち、４℃におい
て渦動下に１時間恒温保持した。

遠心処理を１．　ＯＯ００ｒｐｍにおいて４℃で１０間
行った後にＱ、　５　ｍ　ｅの冷ＢＢＳを力１１えた。

この混合物を水浴中に保持したまま超音波振動にかけて
から４　’ｃにおいてＢＢＳ　（容積（０，５ｍ　１り
中の１−キソ抗原の溶液（１，５■）に対して添加した
。

次にこの溶液を４℃で渦動下に２〜４時間又は回転器−
１−で１６時間恒温保持した。

該ラテックスサスペンションを１％ＣＢ　Ｓを用いて３
回洗浄し、その都度３回遠心処理した後に超音波により
混合した。

貯蔵１／２０希釈、冷凍又は凍結乾燥。

抗二ＶＩ九一体− リＡ ヒ１〜ＩＰ、Ｇθ汗ＣフラグメンＩ・をセロチニ等の方
法（Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　（１９６８３１０
１，４３３）に従いパパイン消化により調製した。完全
フロインＩ・アジュバント中の１００μｇのヒトＰｃを
３週間毎にヤギに列し皮内汁１・Ｊシた。最後の注射か
ら１５日後に血清を集めて免疫グＩ−７プリンを抽出し
その抗−Ｐｃ特異性を検査した後に０．９％食塩水中（
１２■／　ｍ　１　）で使用した。

１」−作 ＧＢＳ／Ｉ％＋３ＳＡ中で５０／］（又は２５／１）に
希釈されたヒト血清の５０　ｐ　（ｌの試料に対し２５
μβの抗−Ｆｃ溶液（０，９％食塩水中１２■／　ｍ　
ｎ　）を加えてから３７℃に１０分間恒温保持した。次
にこの混合物に対し０．９％食塩水中１０■／　ｍ　ｅ
の濃度の凝集ヒトＩｇＧの溶液（ＩｇＧを６３℃で３分
Ｏ間加熱することによる）の２５μβを加えてから３７
℃に１０分間再び恒温保持した。

最後に濃度０．１μｇ　／　ｍ　７！で遊離トキソプラ
スモシス抗原を含有するＬｘｔｏｘｏの５０　ｔｔ　１
を加えた。

３７℃で３０分間更に恒温保持を続けてから２．０ｍ１
４のＣＢＳの添加により反応を停止させた。得られた混
合物を光学的細胞計数器へｊｍ過させて非凝集ラテック
ス粒子群のみを数えた。その濃度ばＩｇＭ抗体に逆比例
する。

別法として遊離ラテックス粒子群濃度を濁度計により計
測し得る。この場合にＴ　ｇ　Ｍ　Ａ　ｂ　濃度又はＩ
ｇＧＡｂ濃度は比較的高い。

ＣＢＳ中のヒト血清、抗−Ｆｃ、の同量を渦動下に３７
゛Ｃで２分間恒温保持した。次に上記？農度の凝集し）
　ＩｇＧの２５７７１を添加し２てこの混合物を１時間
恒温保持し、その後に濃度０，０２％のＬ　ｘ　Ｔ　ｏ
　ｘ　ｏの３０　ｐ　Ａを加えた。この混合物を短時間
渦動下に保持してから６２０μｍ及び４０５μｍにおけ
る濁度を測定した。６２０μｍが基線を構成した。

次にこの混合物を２時間恒温保持し、その後に該混合物
について上記２種の波長におりる読みを再び測定した。

６０５μｍ及び４０５μｍにおける始めと終りについて
の測定値間の差の減少は遊離粒子群残留数に逆比例する
。

全抗体活性の測定のために抗−Ｐｃ０代りにｒｕｎｓ緩
衝液のみを用い、遊離１〜１−ソ抗原を使用せずにＬｙ
ｔｏｘｏを使用した。

ＩｇＧ抗体のみの測定のために、ジチ；（スレイト−ル
（ｒ）ＴＴ）を用いる試料の予備処理による試１’ｌ中
の１．Ｍの破壊を除き、全抗体のために同じ操作を用い
た。

ＣＢ　Ｓによって希釈する以前の血清の５０　、ｆｌ　
＃に対しＧ　Ｂ　Ｓ　’ｌ’　Ｙ農度５０ミリモル、ｐ
ｌ＋９．２のＥＩＩＴＡの１７０μｌを加えた。この混
合物に対し濃度１０ｎｖ／ｍｐのＤ　Ｔ　Ｔ水？容液の
１５μｐを力１１え、次に全混合物を３７℃に３０分間
恒温保持し２、その後に１５μｐの０．２％過酸化水素
溶液の添加によってＤ　Ｔ　Ｔの反応を停止させた。次
に既述の通りに操作して得られた溶液を上記の定量操作
のために１／１０．１／２０及び１／４０に希釈し７だ
。

第２図番才血清希釈の関数としてＴ［ＧＡｈ及びＩ　、
、Ｍ　Ａ　＋１の２種血清（１／２５希釈）中の相対濃
度即ち全抗体（曲線１　）　、ＩｇＧＡｂ（曲線２）Ｉ
ｇＭ八［）（曲線３）に関する相対濃度を示すと共に最
後にＤ　Ｔ　Ｔ　（ＩｇＭ抗体に対する）及び抗−Ｆｃ
ｌｊＣ体（ＩＰ、Ｇ抗体に対する）の添加（こより阻害
された全抗体活１！１（曲線４）茫示す。

第３１２１はｒ：ＬＴｓＡザン１′イ・ノチ試験及びＦ
Ｌ　Ｉ　Ｓへ捕穫試験から得られた成績と比Φ合Ｌ７た
ＩＭｌ’ＡＣＴ　（登録商標名）系と対ブルレラＩｇＭ
抗体測定との間の相関を示す、該相関は前者について相
関係数０．９２、後者について相関係数０．９１を与え
た。

第４図ば１−ギソプラスモシス（１こ対するＩ　Ｐ、Ｍ
抗体の測定のためのＥＬＴＳＡ捕獲技法とＴＭＰＡＣＴ
　（登録商標名）との間の相関を示す。相関係数−〇、
９６゜本発明ばＩ−述の態様に限定されず、本発明の範
囲を逸脱することなく多くの変改を施されｌ）る、こと
が理解されるべきである。

既述の通り微細粒子群としてラテックス粉子ｊ＋Ｙの代
りに赤血球群を使用し得る。ｌｎ　ｃｊ：、　ｉ；を自
明である。

【図面の簡単な説明】

添（」図面の第１図はブルセラアボルタスζ、＝感染し
た患者の血清ＩｇＭ抗体？ｍ度を示し２、第２図は面？
？を希釈０：）関数トｂ　テ１ｇＧＡｂ　及？ＪＩｇＨ
Ａｈ　（７）　２挿１ｆｌＬ　？ｎ中の相対濃度を示す
。曲線ｌは全抗体、曲線２１．；ｉｌ ＩＰ、ＧＡｂ　、曲線３はＩｇＨＡｂ　４こ関する相対
濃度を示ず。 曲線４はＤ　Ｔ　Ｔ及び抗−Ｆｃ抗体の添加により阻害
された全抗体活性を示す。第３図はＦＬＴＳＡ　４Ｊン
ドイソヂ試験及びＥＬＴＳＡ　ｔｄｉ獲試験から得られ
た成績と比較したＩＭＩＩＡＣＴ系と対ブルセラＩｇＨ
抗体測定との間の相関を示す。第４閾はトキソプラスモ
シスに対するＩｇＨ抗体の測定のたぬのＥＬ、ＩＳＡ捕
獲技法とＩＭＦ’ＡＣＴとの間の相関を示す。 イムバグＰＡ、Ｕ、　（増万ｙ・）茅佐）釦０　　　　
１０００　　　　１５００　　　　２０００ＥＬＩＳＡ
　　（ザントイ、／ヴ）　Ａ、Ｕ。 ’９ＭＡｂ稚マ゛ルゼヅ １１−　　’ｅ　　７　）　　Ａ、Ｕ、　　＜ＭＬ　）
”ｇ”Ｊ　ヤイ叫）ＥＬＩＳＡ　（→ｆｌ；）ｉ＞　Ａ
、Ｕ。 Ｆｉｇ、３゜ 手続補正書（方式） １．事件の表示　　昭和６１年特許願第１３５９８号２
、発明の名称　　液体試料中の各種抗体の免疫定量方法
３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）少くともＩｇＭ及びＩｇＧを含有する液体試料例
   えば生物学的流体の中の少くともひとつの抗原に対する
   Ｉｇｎ抗体の免疫定量方法において、少くともひとつの
   抗原に対するＩｇＨ抗体、ＩｇＧ抗体及び恐らくＩｇＡ
   抗体をも含有する液体試料をＩｇＧに対する抗体と反応
   させ、及び該試料がＩｇＡ抗体を含有する場合にはＩｇ
   Ａに対する抗体と反応させ、微細粒子群と結合している
   該抗原及び該結合抗原と同型の遊離抗原を上記反応に、
   よって得られた生成物に対して添加し、これらの微細粒
   子群の凝集度又は非凝集度を測定すること、ＩｇＭ抗体
   量が該非凝集微細粒子群量と逆比例することを特徴とす
   る前記の方法。
2. （２）ＩｇＧに対する抗体及びＩｇＡに対する抗体であ
   り得る抗体を添加した後に得られた溶液を攪拌下に約３
   ７℃の温度で約１〜１５分間恒温保持する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. （３）微細粒子群と結合した抗原及び遊離抗原を添加し
   た後に、得られたサスペンションを攪拌下に約３７℃の
   温度で約１〜１５分間恒温保持する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
4. （４）ＩｇＧに対する抗体及びＩｇＡに対する抗体であ
   り得る抗体を添加した後、及びその後に得られた溶液を
   恒温保持した後に、リウマチ因子によって起される影響
   を中和するために該溶液に対して凝集したＩｇＧを添加
   する特許請求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）恒温保持後に得られた溶液に凝集ＩｇＧを添加し
   た後に該溶液を攪拌下に約３７℃の温度で約１〜１５分
   間再び恒温保持する特許請求の範囲第４項に記載の方法
   。
6. （６）得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
   微細粒子群量を比濁計によって測定する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
7. （７）得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
   微細粒子群量を濁度測定によって計測する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
8. （８）得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
   微細粒子群量を凝集粒子数又は非凝集粒子数の計測によ
   り測定する特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）微細粒子群としてラテックス粒子群又は赤血球群
   を使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。
10. （１０）ＩｇＧ抗体に対する抗体がＩｇＧの抗−Ｆｃ抗
    体であり、抗原がブルセラから由来するリボポリサッカ
    ライドである特許請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体を含有
    する液体試料例えば生物学的流体の中のＩｇＧ抗体＋Ｉ
    ｇＡ抗体の免疫定量方法において、該液体試料中のＩｇ
    Ｍ抗体量を特許請求の範囲第１項記載の方法によって測
    定し、かようにして得られたＩｇＭ抗体量をＩｇＭ抗体
    ＋ＩｇＧ抗体＋ＩｇＡ抗体の総量から差引くことによっ
    てＩｇＧ抗体＋ＩｇＡ抗体量を得ることを特徴とする前
    記の方法。