JPS62503099A - 固相支持体に結合した核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒ核酸の機能化のための組成および手法」本発明は、一般に核酸の機能化のため の組成と手法に関し。

特に保持体に結合させたポリヌクレオチドの５′標識付けのための組成および手 法に関する。

検出可能な標識をポリヌクレオチドに結合させることによって、核酸の検出およ び定量を行うことができる。検出可能な標識を核酸に結合させることは、ハイブ リダイゼーション検定（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）において重 要であり、前述の検定では。

標識付はポリヌクレオチドプローブを用いて、相補的なヌクレオチド配列を有し 且つハイブリダイゼーションによって保持体結合したポリヌクレオチドプローブ （ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｏｂｅ）に固定された標的核酸が、試料 中に存在するかを調べる０反応基を用いた標識付けを行うことによって、レポー ター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）を結合すること、或いはポリヌクレオ チドの固定化が可能となる。

ハイブリダイゼーション検定に用いるポリヌクレオチドプローブの標識付けの一 つの方法は、放射性同位元素（たとえば。

！！ｐ、３Ｈまたはｌ！Ｓｌ）をプローブに結合するものである。しかしながら 、放射性標識を検出する二つの方法には固有の困難性があるので、この技法の有 用性は限定されている。オートラジオグラフィー　（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａ ｐｈｙ）は、写真乳剤中で銀イオンを還元して銀粒子を形成する時間のかかる手 順であり、またもう一つの検出技法であるシンチレーシッンカウンティング（ｓ ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ）は、高価な装置を必要とし且つ ある程度の遅延が避けられない、さらに、放射性同位元素は、安全上の理由から 特別な取扱いを必要とする　＋ｚｓ１等の幾つかの放射性同位体の貯蔵寿命は比 較的に短いので、そのために臨床診断の場においてさらに有用性が限定される。

非放射性標識付はシステムにおいては、検出を可能にするためのシグナルと会合 したレポーター基を用いて、プローブに「標識付け」を行う。レポーターは、プ ローブの存在または位置を表示するために、シグナルをプローブに会合させるの に用いる薬剤である。信号そのものは、直接に認識できるものであり、分離した または分離可能なシグナル分子によって発生することができる。標識は、正確に はシグナルを取り込むタイプのレポーターである。

標識をプローブに結合する方法の一つが、　Ｈａｒｄ等、欧州特許出願６３．８ ７９号に記載されている＊　Ｗａｒｄは、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）レポーター 分子がプリン（ｐｕｔｉｎｓ）またはピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）環に 共有結合したプローブの製法を開示している。選定されたビオチン基化したプリ ンおよびピリミジンは１次に、酵素法によってプローブの核酸のリン酸ジエステ ルバックボーン内に直接に取り込まれる。しかしながら、酵素技術は費用が嵩み 。

操作が難しい。

その他の方法では、タンパク質によって標識をプローブに連鎖する。−末鎖ポリ オウイルスＲＮＡ（ｐｏｌｉｏ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ）は、ビオチンのＮ−ヒド ロキシスクシニミジルエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ 　ｅｓｔｅｒ）と反応するタンパク質に自然連鎖させて、アビジン（ａｖｉｄｉ ｎ）被覆した球の特異な結合によって検出可能なビオチン基化したレポーター基 を有するＲＮＡプローブを得ることが出来る。　Ｒｉｃｈａｒｄｓ等、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ！、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ　）　、　７６：　６７６−６８０　（１９ ７９）　、同様に、ビオチン標識付けしたチトクロームは、ホルムアルデヒドの 存在するもとでの反応によってＲＮＡに連結させ、その後にアビジン被覆した球 を用いて標識付けることが出来るｍ　Ｍａｎｎｉｎｇ等、　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ ａ　（Ｂｅｒｌ、　）　、　５３：　１０７−１１７（１９７５）　、　Ｌかし ながら、標識付けを必要とする核酸の全てが自然にタンパク質と会合することは なく、また核酸のチトクローム結合の位置ならびに量は容易に予測できないので 、末端標識付けのための化学合成手法がめられる。

このような化学合成手法の一つにおいては、核酸を酸化して３゛アルデヒドに変 換し、さらにアルキルジアミンまたはポリアミンを用いて縮合し、ビオチンの結 合を行うレポーター基をっ（る。Ｂｒｏｋｅｒ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、　５　：３６３−３８４　（１９７８）、同様に核酸の過沃素塩 酸酸化によって得たアルデヒドを用いて、核酸に蛍光標識を結合してもよい。Ｂ ａｕｍａｎ等、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、、　Ｃｔｏｃｈｅｍ、　）　、、２ ９　：　２２７−２３７　（１９８１）　、しかし、自動化された核酸合成プロ セスにおいて、保持体に結合したポリヌクレオチドにレポーター基を結合する技 術が望まれている。

５°標識付けの別の方法においては、ビオチンを２−（ビオチニルアミド）エタ ノールに変換し、さらにリン酸化した重合体保持ヌクレオチドに縮合する。ビオ チンのアミンエタノール誘導体をリボース環の５゛水酸基に縮合すると、ヌクレ オチドの保護を取り除けば、安定したリン酸ジエステル結合が得られる。ＫｅＩ Ｉｐｅ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３：４５−５７　（ １９８５）　ａ　Ｌかしながら、この方法によって特異なレポーター基が結合す るので。

後に種々の望ましいレポーター基を結合するのに用いることが可能な、反応機能 性を有するオリゴヌクレオチドを形成することが出来ない。

溶液中のヌクレオチドは、保護された６−アミノ−１−へフサノールリン酸塩を 用いた縮合によってアミン機能化されている、　Ｂａｋｅｒ等、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　ＣｈｅＩＩ＋、、　２２：　７１３５−７１４７　Ｃ１’９７２）、　・ しかし、これらの手順は実施するのが難しく、こ、れまで固相合成手順に組み込 まれていない。

ヌクレオチドを保持体に結合する別の方法は、アフィニティークロマトグラフィ ー　（ａｆｆｉｎｉｔｙ　＋＝ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によりヌクレアー ゼを精製する際に、Ｐ−アミノフェノールで３゛−誘導された１本鎖のヌクレオ チドを、リンカ−によってゲルマトリックスと結合させる。このリンカ−は、臭 化シアンおよびアジド（ａｚｉｄｅ）を用いて、３．３°ジアミノジプロビルア ミンをマトリックスに結合させることによって形成する。その結果得られるアミ ン機能化ゲルを無水コハク酸で処理し、それからアミン機能化ヌクレオチドに結 合する。Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

１２：　３０５９−３０６５　（１９７８）、　Ｌかしながら、アミン機能化ヌ クレオチドそのものの調製は１手間を要する手順によって溶液中で実施されてい る０例えば＋　Ｂａｋｅｒ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、２２：　７１３ ５−７１４７　（１９７２）を参照のこと。

５°標識付けの一方法においては、キナーゼ処理を行った保護されていないオリ ゴヌクレオチドの５−アミノアルキルホスホラミダイト（５−ａｍｉｎｏａｌｋ ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｊ＋Ｈｔｅ）誘導体を溶液中で調製する。保護され ないオリゴヌクレオチドのキナーゼ処理は。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによっておこなう。キナーゼ処理したオリゴヌク レオチドを、イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）およびジアミノアルカン（ｄ ｉａｓ＋ｉｎｏ　ａｌｋａｎｅ）と反応させる。その結果得られる５”−アミノ アルキルホスホラミダイトＤＮＡを、カリウムＮ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド 中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルと反応させ、ビオチン標 識付けしたオリゴデオキシリボヌクレオチドを調製する。　Ｃｈｏｌｌｅｔ等、 　Ｎｕｃｌｅｔｃラミダイト法（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａ ＋ｐｉｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）または固相ホスホトリエステル法（ｓｏｌｉｄ −ｐｈａｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ　＋ｗｅｔｈ。

ｄ）を用いて合成した、オリゴヌクレオチドを使用しているにもされ、固相から 切り離され１分離され、精製される０機能化の後は、２度目の分離および精製が 必要である。分離および精製はそれぞれ損失を伴い、かつ時間が掛かるので、固 相合成の際にポリヌクレオチドを機能化することが望ましい、さらにキナーゼ処 理反応には、酵素を用いる方法に一般に見られる費用と処理の困難さの問題があ る。

したがって、固相合成を行うポリヌクレオチドにレポーター基を結合させる一般 的な方法および組成がめられている。

光里■翌旌 本発明による組成は、固相合成の際に核酸に結合させる末端標識に関連する。こ の末端標識は、ヒドロキシルアミンのホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍ ｉｄｉｔｅ）である。

本発明による方法は、固相合成の際に核酸に末端標識を結合させることに関連す る。特に、ヒドロキシルアミンのホスホラミダイトは、保持体に結合させたデオ キシオリゴヌクレオシドに縮合される。

詳細な説明 本発明では、ヒドロキシルアミン、望ましくはω−ヒドロキシルアミンのホスホ ラミダイトを、保持体に結合させたオリゴヌクレオシドに縮合する。保持体は、 ケイ酸塩およびセルロースに限らず、核酸の固相合成に有効なものであればいか なる種類であってもよい。ポリヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたはデオキ シリポヌクレオシドとする。

本発明によるω−ヒドロキシルアミンは、一般的にはどのような長さであっても よいが、望ましくは２〜１０の炭素の長さとする。ω−ヒドロキシルアミンは、 アルキル、アリル、シクロアルキル、あるいは一般的にヒドロキシル成分をオリ ゴヌクレオシドに縮合することができ、且つヒドロキシル成分をオリゴヌクレオ シドに反応させることができ、且つ立体障害を起こさずにレポーター基とアミン 成分を反応させることができる構造であればどのようなものであってもよい。特 に望ましいω−ヒドロキシルアミンとしては、エタノールアミン、プロパツール アミン、ブタノールアミン、ペンタノールアミン、ヘクサノールアミン、ヘプタ ツールアミン、オクタツールアミン、ノナノールアミン、デカノールアミン、お よびｐ−アミノフェノールがある。

本発明で使用するレポーター基としては、ビオチニル（ｂｉｏｔｉｎｙｌ）、　 Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、およびフルオレジインイソチオシアン酸塩がある 。レポーター基を合成オリゴヌクレオチドに直接に結合させる方法よりも本発明 が特に優れている点は、合成ポリヌクレオチドの保護解除に必要な厳しい条件に 、標識すなわちレポーター基が耐える必要がないという点である。

したがって１本発明による方法によると、オリゴヌクレオチドは、とりわけ、ビ オチン、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、抗原、および蛍光すなわち化学ルミネセン ス機能で、５°標識付けすることができる。

下記の実施例に述べるハイブリダイゼーション処理に使用するために、単純ヘル ペスウィルスタイプＩ　（Ｈ５Ｖ−１）　Ｗクンバク質Ｄ　（ｇＤ）遺伝子の、 （＋）プラス（コーディング）　１Ｎまたは（−）マイナス（アンチコーディン グ）鎖のいずれがを含む一本鎖ファージを、標的配列として用いた。二本鎖遺伝 子配列の一部を下記の第１表に示す。下の鎖はアンチコーディング鎖である。こ の配列は、　Ｗａｔｓｏｎ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１８：　３８１−３８４ 　（１９８２）に発表されたものである。プラス鎖の一部を１本発明ではプロー ブとして用いた。これらの−末鎖プローブ配列は、第１表において遺伝子のコー ディング鎖の上に引いた文字付き線によって示す。

実施例に用いた標的は、−末鎖ファージ、ファージ２（Φ２）　Ｔニア’）、　 Ｈ５Ｖ−１ｍタンハ’）質Ｄ（ｇＤ）遺伝子（７）１　、４５４塩基を含んでい る（すなわち、第６７塩基から第１　、２８７塩基、開始コドンヌクレオチド数 ２４１は、プラスミドＭ１３ｍｐ１８にりｑ−ンされた）、Φ２のＨＤのマイナ ス鎖配列は、上記の（＋）プラス鎖プローブに相補的な標的として用いる。

下記の実施例においては９本発明の種々の様態を示す一連の実験について述べる 。

実施例１は１本発明による抗体被覆ポリヌクレオチドの標識化の効率を示す、実 施例２は、標的に結合させた２つのプローブから成るハイブリダイゼーションサ ンドインチを捕獲するための１本発明に従って標識付けされたプローブの使用を 示す。

実施例１ 配列５°−Ｐ−＾ＣＣＧＡＡ　ＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＴＣＴ　Ｃ− ３°を有するポリヌクレオチドの５°末端に１本発明による方法によって抗原で 標識付けした。

もっと具体的に説明すると、第１のプローブは、前述したようにオリゴヌクレオ チドＧであった。前述のオリゴヌクレオチドＧの５′標識付けは、フルオレジイ ン（ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を用いておこなってもよい。

オリゴヌクレオチドＧＬよ、５゛アミン能化オリゴヌクレオチドＧをフルオレジ インイソチオシアン酸塩と反応させることによりて、５′フルオレジイン標識付 けを行った。５°チアミン能化オリゴヌクレオチドＧは、その３゛末端によって 固体保持体に結合しているオリゴヌクレオチドＧを、（（ＣＬ）ｔｃ）ｌ）　ｚ ＮＰ（ＱＣｌｌり０（ＣＨりＩＮＨ（ＤＭＴ）の式（式中、　ＤＭＴはジメトキ シトリチル基である）を持つホスホラミダイトと反応させることによって形成さ れた。

このホスホラミダイトの合成においては、ジアゾメタンのエーテル溶液約８　ａ ｌｌを、メタノールＬｏｗ／中の１−７ミノカブリル酸（ウィスコンシン州ミル ウォーキーのＡｌｃｌｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌが販売している）１５９．２ 　ｔｎｇ（１ミリモル）に加えた。メタノールを蒸発させて、ω−アミノカプリ ル酸メチルエステル１７４．９　ｔｎｇを得た。次に、ω−アミノカプリル酸メ チルエステル１７３　ｍｇ（１ミリモル）、塩化ジメトキシトリチル１ミリモル 、およびジイソプロピルエチルアミン１ミリモルを、０℃においてアルゴン雰囲 気のもとで、無水テトラヒドロフラン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ　ｔｅｔｒａｈｙｄ ｒｏｆｕｒａｎ）５　ｍＡに加えた。この混合物を２５℃にまで温め、１時間に わたって攪拌した。溶剤を蒸発させ、粗生成物を酢酸エチル５０ｍＡ！で希釈し た後、水で２回、続いて飽和重炭酸塩および塩水で順次洗った。生成物を無水硫 酸マグネシウム上で乾燥蒸発させ、ω−アミノカプリル酸メチルエステルのジメ トキシトリチル誘導体（ＡＣＡＭ−ＤＭＴ）４６０　ｍｇを得た。

＝７８℃のアルゴン雰囲気の下にある無水テトラヒビ０フ５フの１モル水素化ア ルミニウムリチウム１．２４ａ＋Ｉｌを加えた．この反応混合物を一７８℃で５ 分間攪拌し．続いて２５℃で３０分間攪拌し，その後にテトラヒドロフラン中の ５％の水１０Ｊ！，エーテル２００＋ＩＩＪ，セライト３　ｇ＋　および無水硫 酸マグネシウム０．５ｇで希釈した．得られた混合物を約３０分間攪拌してから ろ過し、一般式〇〇．（ＣＨｚ）　ｓＮＨ−ＤＭＴをもつアルコールを得た。

無水ジクロルメクン１０　蒙ｌ中の８０（ＣＨ．）ＩＮＨ−ＤＭＴ　Ｏ．７２ミ リモルに，ジイソプロピルエチルアミン０．フロミリモルとクロロ−Ｎ、Ｎ゛− ジイソプロピル了ミノメトオキシホスフィン（カリフォルニア州エメリーベルの Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｕｃｌｅａｒが販売している）０．フロミリモルを 加えた。この混合物を２５℃で４０分間攪拌し１次に酢酸エチル５０ｍ１で希釈 し、塩水で４回洗浄した。この反応の生成物は＋　ＭｃＢｒｉｄｅ等、　Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　２４　：　２４５　（１９８３）による 重合体保持体デオキシオリゴヌクレオチド合成において、デオキシヌクレオシド Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトオキシホスフィンとともに使用するホスホラ ミダイト合成手法によって、保持体結合ジオキシヌクレオシドＧに結合させた。

本発明によるデオキシオリゴヌクレオシドへのレポーター基の結合の定量は、下 記に示すデメトキシトリチル検定（ｄｅ＋ｎｅｔｈ。

ｘｙｔｒｉｔｙｌ　ａｓｓａｙ）によって行った。

Ａａｑｓ　×希釈溶液 結合比率＝　Ｘ　１４．３　Ｘ　１０”用いたμモル標識 式中、Ａ４９゜は、除去されたデメトキシトリチル成分を含有する溶液の吸光度 を、波長４９８　ｎｍで測定したものである。この方法によると、結合は９０％ を越えると判断された。

去旅炎叢 第２のプローブであるオリゴヌクレオチドＡは＋　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　Ｃｅ １１．１５：　６８７　（１９７８）（７）手順に従ッテ、！！ｐ　テ標識付は シタ、プローブを使用した日のプローブの比放射能は、　３．２　ＸＩＯ’ｃｐ ｓ／ピコモルであった。

５′フルオレジイン標識のないオリゴヌクレオチドＧを、第１のプローブの対照 として用いた。第２の対照プローブは、標的配列の何れとも相補的でない、 ５”ＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣ３’　の配列を持ち　 ｆｆ！ｐで標識付けをしたもので、使用した日の比放射能は３．２　Ｘ　１０’ 　ｃｐｍ／　ピコモルであった。

標的として用いたのは一本鎖Ｄ２であった。−末鎖Φ２は、第１および第２のプ ローブ、および第１のプローブ対照と相補的であるが、第２の対照プローブとは 相補的でない。

保持体として、イリノイ州ロックランドのＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌが販 売しているものと同等の１７４インチのポリスチレンビーズを、フルオレジイン 抗体（アンチフルオレジイン）で被覆した。アンチフルオレジインの産生には、 ウサギを用いた。硫酸アンモニウム沈澱、続いてＤＥＡＥセルロースクロマトグ ラフィーによって、アンチフルオレジインを精製した。溶液中では、アンチフル オレジインは約１０”の親和力をもち、フルオレジインの蛍光を約９９％消光し た。

アンチフルオレジイン被覆したビーズを調製するために、ビーズをｐＨ８のＩＱ 　ｍＭ　ＮａＨＣＯ＋緩衝液中で、１５秒間超音波処理して洗浄する。超音波処 理の後、ビーズを脱イオン水中で全ての微粒子が取り除かれるまで洗浄する。４ ０＋４！の１０　ｍＭ　Ｎａ）ＩＣＯｓを用いて、約２００個のビーズを被覆す る０次ニ、　０．５７　＋ｍｇ／　ｖａ　１　（Ｄｔｔｊ度の精製アンチフルオ レジイン７．１を加える。ビーズを室温で約６５時間インキュベートする。イン キュベーションの後、ビーズを脱イオン水で洗浄し、＠引フィルター上で風乾す る。

アンチフルオレジイン被覆したビーズはそれぞれ、１つのビーズをＴＤＸ緩衝液 （０，１Ｍ　ＮａＰＯａ、　ｐＨ７，５；　０．１％ＮａＮｘ；　０．１％ウシ ガンマグロブリン）中の１　ｎＭフルオレジイン１．５　ｗａｇと共に、インキ ュベートすることによって示されるように、１．４ピコモル以上のフルオレジイ ンと結合することができる。２５℃で２０時間にわたるインキュベーションによ って、溶液から９７％のフルオレジインが除去された。ビーズを５１ｍ１の脱イ オン水中で３回洗浄し、１回洗浄する毎にビーズをプロンティング（吸い取り） によって乾燥させ、その後に０．Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ中で１０分間インキュベート したが、この間に最初に被覆したフルオレジインの６０％が溶液中に放出された 。このように、各ビーズは約０．９ピコモルのフルオレジインと結合する能力が ある。

［１１５’−フルオレジイン標識したオリゴヌクレオチド、５゛−ビオチン標識 したオリゴヌクレオチド（いずれも３°−３仲末端標識付き）並びにキナーゼ３ 仲標識したオリゴヌクレオチド、およびアンチフルオレジインで被覆したポリス チレンビーズを用いて、下記の条件において一連の捕獲実験をおこなった。

ｓｚｐ標識したオリゴヌクレオチドのうちの１つを１ピコモル含む変性、せん断 したサケ精子ＤＮＡ　（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　２００　／Ｊｇ／　ｗａｌと、　１００μｌのＴＤＸ緩 衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム、　ｐｏ　７．５；　０．１％ＮａＮ３　；お よび０．０１％ウシガンマグロブリン、ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を混合した。

アンチフルオレジイン被覆したポリスチレンビーズをこの溶液に加えた。この系 を２５℃で１８時間インキュベートした後、ビーズを取り出して、２５℃のＴＤ Ｘ緩衝液１ｍｌの中で５分間洗浄した０次にビーズをシンチレーシツンカウンタ ーで測定した。

高温で５分間ビーズを洗浄して、ビーズ上の抗体錯体の安定性を試験した。第■ 表に前述の一連のビーズの捕獲効率および安定性を示す。

第■表 ５”フルオレジイン　５′ビオチン標識　５°５ｚｐ−標識１度皿徴旦友■生− 一　旦友ｌ生−−−−リ１１工第■表に示すように、これらのビーズの捕獲効率 と安定生は高く、ハイブリダイゼーション捕獲系に有用なものである。これらの ビーズには、ビオチン標識あるいは３２Ｐ標議したオリゴヌクレオチドは、はん の僅かしか結合しないか、もしくは全く結合せず、ビーズへの非特異な結合は殆 どないことを示しており、このような系におけるバックグラウンドは非常に低い 。

（２）　フルオレジイン抗体被覆したビーズがフルオレジイン標識したオリゴヌ クレオチドを捕獲する率を、もつと詳細に測定するために、一連のビーズを一つ づつ　ｓｉｐで３゛末端標識しである１ピコモルの５゛−フルオレジイン標識し たオリゴヌクレオチドＡを用いて、時間を変えてインキュベートした。捕獲の百 分率を各ビーズについて測定した。その結果を第■表に示す。

豊麗　オリゴヌクレオチドの捕獲率（％）３０分　４５ １時間　４８ ２時間　７５ ３時間　９１ ４時間　９０ ５時間　８８ ６時間　８６ ７時間　８５ ８時間　８２ 第■表に示すように、２〜３時間内に、ビーズによって５“フルオレジイン標識 付きオリゴヌクレオチドの９０％が捕獲される。ビーズ上の放射性標識の量が、 時間の経過とともに僅かに低減するのは、ビーズから抗体が少し漏れることを示 しているものと考えられる。

（３）実験１ アンチフルオレジイン被覆したビーズの捕獲率が確定したので、第１のプローブ （５″−フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ）１ピコモル、第２の プローブ（３Ｚｐ−標識オリゴヌクレオチドＡ）１ピコモル（使用当日の比放射 ゛能３．２Ｘ１０ｂｃｐｍ／ピコモル）、そして標的（Φ２　ＳＳ、第１および 第２のプローブの双方に相補的である）１ピコモルを、２０　Ｘ　５ＳＰＥ　（ ３，６Ｍ　ＮａＣｌ；　０．２３　Ｍ　ＮａＨｚＰＯａ、　ｐｌ（７，５；およ び２０　ｍＭ　ＥＤＴＡ）を希釈して得り５　Ｘ　５ＳＰＥ　テ５０．ｕ　１　 ニ希釈した。このハイブリダイゼーション溶液を、５０℃で３時間インキュベー トした。このハイブリダイゼーション溶液を、ＴＤＸ　緩衝液１０（ｌｕ７！で 希釈し、アンチフルオレジイン被覆したビーズ１個を加えた。２５℃で３時間イ ンキュベートした後、　ＴＤＸ緩衝液１　ｍｌ、を用いて、３７℃で５分間ビー ズを洗浄し、さらにシンチレーションカウンターで測定する前に、再びＴＤＸ　 １１街液１　ｍｌｌを用いて３７℃で５分間洗浄した。

対照実験 同じプロトコールに基づき、但し下記のように変更を加えて、３つの対照実験を 行った。第１の対照実験（対照１）では、第１のプローブとして、５゛フルオレ ジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ、第２のプローブとして、５゛３仲標識 付きのオリゴヌクレオチドＡを、標的を存在させないで、アンチフルオレジイン 被覆したビーズと共にインキュベートした。第２の対照実験（対照２）では、実 験ｌのフルオレジイン標識したオリゴヌクレオチドＧの替わりに、第１のプロー ブとして、標識付けしていないオリゴヌクレオチドＧを１ピコモル用いた。最後 に、第３の対照実験（対照３）では、第１のプローブとして、５゛−フルオレジ イン標識付きのオリゴヌクレオチドＧを１ピコモル、第２プローブとして、３２ 　８ｇと呼ばれる２ｔｐ−標識付きオリゴヌクレオチド（配列はφ２ＳＳと相補 的である）を１ピコモル、また標的としてΦ２　ＳＳ　１ピコモルを用いた。

これらの実験の結果を第■表に要約する。

実験　４．２ 対照１　０．００２ 対照２　０．０７ 対照３　０．２２ 実験と対照１を比較すると、フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ、 　Φ２ＳＳおよび３２ｐ−標識付きのオリゴヌクレオチド＾から成るハイブリッ ドは、アンチフルオレジイン被覆した固体保持体によって＼選択的に捕獲される ことがわかる。

対照２および３は、正しい抗原標識付きの第１のプローブが存在しなければ、ま た、標的に相補的な正しい第２プローブが存在しなければ、ハイブリッドは効果 的に産生されず、捕獲もされないことを示している。

本発明を考慮すれば、当業者は種々の改善ならびに変更を行うことが出来るもの と思われる。例えば、ここではω−ヒドロキシルアミンが例示されているが、保 持体結合したヌクレオシドとの結合、およびレポーター基との結合を、それぞれ 形成するのに用いる水酸基およびアミン基をもつ全ての分子を用いることができ る。結論として１本発明は、添付する請求の範囲の全範囲を網羅することを意図 する。

国際調査報告 ””’−”口”Ａｌｌ””ＮＯＰＣＴ／ＵＳ８６１０１２９０

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．固相合成の際に核酸に結合する末端標識で，ヒドロキシルアミンのフォスフ ォラミダイトから成るもの。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の末端標識で，前記ヒドロキシルアミンが、１個か ら１０個の炭素原子を含むもの。
3. ３．請求の範囲第２項に記載の末端標識で，前記ヒドロキシルアミンが，エタノ ールアミン，プロパノールアミン，ブタノールアミン，ベンタノールアミン，ヘ クサノールアミン，ヘブタノールアミン，オクタノールアミン，ノナノールアミ ンデカノールアミン，およびＰ−アミノフェノールから成るグループから選択さ れるもの。
4. ４．固相合成の際に核酸に末端標識を結合する方法で，下記の過程，すなわち， ヒドロキシルアミンのフォスフォラミダイトを調製し，さらに ヒドロキシルアミンのフォスフォラミダイトを、保持体結合したポリヌクレオシ ドに縮合することから成るもの。