JPS6257306B2 - - Google Patents
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- JPS6257306B2 JPS6257306B2 JP58149378A JP14937883A JPS6257306B2 JP S6257306 B2 JPS6257306 B2 JP S6257306B2 JP 58149378 A JP58149378 A JP 58149378A JP 14937883 A JP14937883 A JP 14937883A JP S6257306 B2 JPS6257306 B2 JP S6257306B2
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- Japan
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- seaweed
- enzyme solution
- hydrolase
- protoplasts
- polysaccharide
- Prior art date
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- Expired
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- Cultivation Of Seaweed (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、海苔の健全なプロトプラストを調製
する方法、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用
し得る海苔のプロトプラストを調製する方法に関
する。 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
非常に盛んとなり、陸上植物においては既に実用
化の段階にまで成功したものもみられるに至つて
いる。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ての細胞融合の研究報告は少なく、その成功例に
ついても未だみられていない。 因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物
では市販の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチ
ーム等）を用いて容易にそれらのプロトプラスト
を調製し得るけれども、アマノリ類をプロトプラ
スト化できる酵素が現在のところ入手し得ないた
め、アマノリ類の細胞融合の技術が陸上植物に比
べて遅れている一因と考えられる。 而して、アマノリ類をプロトプラスト化するた
めの試みとしては今までのところ、藤田等による
「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプラ
ストの分離とその発生」についての報告（日本水
産学会、昭和57年秋季講演要旨集、第23頁、
213）がみられるのみである。この藤田等による
方法は、海苔葉体を物理的手段で細断して得られ
る葉片にシユードモナス（Pseudomonas）SPの
菌株（Ｐ―１株）の培養液から得た粗酵素液を約
４時間程度作用させてプロトプラストを調製する
ものであるが、この方法ではプロトプラストを得
るための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を
物理的に切断したものに酵素を作用させるので得
られるプロトプラストが不健全になる可能性が高
く、したがつてこのプロトプラストを用いての細
胞融合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞
融合の手法においてはそれに用いるプロトプラス
トの健全度が非常に主要な要因であつて、プロト
プラストが不健全であると細胞融合に当つての融
合率が低くなつて以後の培養による生育も劣るよ
うになると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するのは、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 Preston等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフイブリル形態のキシランから構成されてお
り、細胞充間物質としてポルフイランが存在して
いるとされる。また、L.A.Hanic等によると、海
苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存在して
いるとされる。すなわち、このような海苔の組識
上の観点から、海苔は切断しなければプロトプラ
スト化できないと考えられていたものと思われ
る。 本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプ
ロトプラストを得るには、海苔を物理的に切断す
ることなくその表層から崩壊させることが必要で
あるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検討した結果、海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する
酵素液で処理するか、更にはポリフイラン加水分
解酵素も含有する酵素液で処理することにより、
海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得る
ことの知見を得て本発明をなすに至つた。 すなわち、本発明の目的は、細胞融合に有効に
適用し得る海苔の健全なプロトプラストを調製す
る方法を提供することにある。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明の構成上の主要な特徴は、海苔葉体を、
シユードモナス属に属する難消化性多糖類の加水
分解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔由来
の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して
得られる培養液から調製される少なくともマンナ
ン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を含有す
る酵素液で処理することにある。なお、本発明の
其他の構成は以下の説明から明らかになるであろ
う。 本発明で海苔のプロトプラスト化に用いる酵素
液の調製に利用される難消化性多糖類の加水分解
能を有する微生物は、海水中から分離されたもの
であつて、上記多糖類であるマンナン、キシラン
およびポルフイランの加水分解能を有し、下記の
とおりの菌学的性質を有する。 菌学的性質： 形態 ZoBELL2216E培地に生育した細胞につい
て、 (イ) 細胞の形態は桿菌では大きさは0.5〜１μ
ｍ×1.5〜2.5μｍ (ロ) 運動性を有し、鞭毛は単極毛性 (ハ) グラム染色性は陰性 生育状態 ZoBELL2216E斜面培地における生育状態、 (イ) 20℃〜27℃の温度で良好に生育する (ロ) 淡黄色の色素を沈着 (ハ) 毛状（filiform）の集落を形成 生理学的性質 (イ) カタラーゼテスト 陽性 (ロ) オキシダーゼテスト 陽性 (ハ) グルコースよりの酸の生成 陽性 (ニ) Ｏ―Ｆテスト（Hugh Leifson法による）
０ (ホ) Vibro―Static Agent（０／129） 陰性 (ヘ) 塞天液化能 ＋ (ト) キシラン分解能 ＋ (チ) マンナン分解能 ＋ (リ) 好気性 上記菌学的性質に鑑み、本発明で利用する上記
微生物はシユードモナス属（Pseudomonas）に
属する菌株であると同定し得る。なお、この菌株
シユードモナス（Pseudomonas）sp.PT―５は微
工研条寄第330号の受託番号で工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。 本発明では上記微生物を、海苔もしくは海苔由
来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養し
てマンナン加水分解酵素、キシラン加水分解酵素
更にはポルフイラン加水分解酵素を培地中に生産
する。 ここで用いる“海苔由来の多糖類”とは海苔を
熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主
として多糖類から成る残渣、又は該残渣を更に精
製処理して多糖類含量を高めたものを意味する。 例えば、海苔を10倍量の水に浸漬し、オートク
レーブ中で120℃で30分間加熱したのち、濾布を
用いて可溶性区分を除去し、得られる残渣につい
て上記と同様の手順で加熱して可溶性区分を除去
する操作を繰返し行い（５回程度）、ついで得ら
れる残渣を100％エタノールに浸漬し、室温にて
一夜放置したのち、可溶性区分を除去し、乾燥し
たものを多糖類から成る残渣として用いるか、又
は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰返し行つて
得られる残渣（エタノール浸漬を行つていないも
の）を1N―NaOH溶液に浸漬し、室温にて一夜放
置したのち、可溶性区分を除去した残渣をNaOH
の20％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液を遠心
分離し、その上澄液にフエーリング溶液を加えて
沈澱を生成させ、この沈澱物を水洗してCuイオ
ンを除去して得られる多糖類（マンナン）もしく
は上記フエーリング溶液を加えて沈澱を生成させ
たときの上澄液にHC1を加えてPHを３に調整して
得られる沈澱物から成る多糖類（キシラン）をそ
れぞれ精製処理した多糖類として用いる。 上記誘導物質としての海苔もしくは海苔由来の
多糖類の培地に対する添加量は１乃至２重量％が
適当である。 本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培
地は、炭素源として上記誘導物質を、窒素源とし
てペプトンおよび酵母エキスを、更に無機質とし
てK2HPO4、FeCl3などを海水又は人工海水に溶
解し、緩衝液（例えばトリス緩衝液でPHを7.5前
後に調整したものが好ましい。培地組成を例示す
ると下記のとおりである。 培地組成： 海苔又は海苔由来の多糖類 1.0（重量％） ペプトン 1.0 酵母エキス 0.1 K2HPO4 0.01 FeCl3 0.6mg／１ トリス緩衝液 0.1（重量％） 上記割合で海水に溶解してPHを7.5に調整す
る。 本発明で利用する上記微生物の上記培地におけ
る培養条件は、25℃の温度で４日間通気、撹拌通
気下（通気量1000〜2000ml／min、撹拌数100〜
300r.p.m.）に行う。 上述のようにして培養して得られた培養液から
酵素液を調製するには、該培養液を４℃の温度で
30分間遠心分離（10000r.p.m.）し、その上澄液
を酵素液とする。 このようにして得られる酵素液はマンナン加水
分解酵素、キシラン加水分解酵素およびポルフイ
ラン加水分解酵素を含有する。 本発明では上記培養に当り、海苔由来の多糖類
として主にマンナンもしくはキシランから成るも
のを誘導物質として培地に含有させて主としてマ
ンナン加水分解酵素もしくはキシラン加水分解酵
素をそれぞれ培地中に生産させ、得られる培養液
からこれらの各酵素を主として含む酵素液を調製
し、両者の酵素液を組合せて海苔葉体のプロトプ
ラスト化に用いることも可能である。 なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化に
マンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を
主に用いるのは、前者が海苔の表層に存在する顆
粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を
形成して細胞壁を形成しているミクロフイブリル
形態のキシランに対する後者の作用をし易くする
ことに基づくものであり、したがつて、キシラン
加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ポ
ルフイラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞充間物
質としてのポルフイランに作用して分解するので
該酵素を含む酵素液を用いるとプロトプラスト化
が一層促進される。 海苔葉体に作用させる上記酵素液の量は、海苔
葉体を５cm程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素
液を５〜10倍に濃縮したものの10ml程度が適当で
あり、３〜４時間の作用で海苔のプロトプラスト
を調製し得る。 また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用
させるに当つて、該葉体にプロテアーゼを作用さ
せると海苔の表層を被覆している蛋白質の薄い層
を分解し得るのでプロトプラストを調製するうえ
で一層効果的である。プロテアーゼとしてはパパ
インが特に好ましく、10％のパパイン液として葉
体に15〜30分程度作用させると上記蛋白質の薄層
を有効に分解、除去し得る。 なお、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用
は、上記プロトプラスト化のための酵素液による
処理に先立つて行つてもよく、又、該酵素液によ
る処理と平行的に行つてもよい。 上述のようにして得られる海苔のプロトプラス
トは海苔を物理的に切断することなく、酵素処理
によつてのみ調製されるものであるから健全な状
態であつて、細胞融合に利用するのに適してい
る。 例えば、本発明の方法で調製された海苔のプロ
トプラストをペトリ皿内で人工海水（藻類用
Asp.12）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着生し
たプロトプラストの生育状況を観察した結果によ
る生育状況に良好である。 叙上のように、本発明によると、海苔のプロト
プラストが酵素的処理のみで健全な状態で得られ
るので、今後の海苔の細胞融合技術の進展に益す
るものと言える。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 培地の調製 ペプトン 1.0（重量％） 酵母エキス 0.1 （ 〃 ） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／１ トリス緩衝液（トリスアミノメタン）
0.1（重量％） 海苔の熱水抽出残渣 1.0（重量％） 上記組成のものを海水に添加してPH7.5に調整
したものを培地に用いた。 酵素液の調製 上記培地にシユードモナス（Pseudomonas）
sp微工研条寄No.BP―330を接し、300r.p.m.の撹
拌下に通気しながら（通気量2000ml／min）25℃
で４日間培養を行つた。 得られた培養液を４℃の温度で30分間遠心分離
（10000r.p.m.）し、その上澄液を10倍に濃縮して
酵素液とした。 このようにして調製した酵素液の難消化性多糖
類に対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示
すとおりである。 なお、参考として前述した藤田等の方法で用い
た酵素液の調製法を下記に示すとともに、その酵
素活性を調べた結果も併せて表示した。 酵素液の調製法： 培地組成 NH4NO3 0.1（重量％） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／１ トリスアミノメタン 0.1（重量％） アサクサノリ粉末 0.2（重量％） 上記組成を海水に添加してPHを7.5に調整。 アサクサノリ粉末は別に滅菌して添加した。 上記培地に、あらかじめ２日間培養した
Pseudomonas spの菌株を接種し、25℃で５日間
通気下に培養を行ない、ついで２日間静置培養を
行つたのち、得られた培養液をセライト（スタン
ダードスーパーセル）で濾過、除菌したものを酵
素液とした。
する方法、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用
し得る海苔のプロトプラストを調製する方法に関
する。 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
非常に盛んとなり、陸上植物においては既に実用
化の段階にまで成功したものもみられるに至つて
いる。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ての細胞融合の研究報告は少なく、その成功例に
ついても未だみられていない。 因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物
では市販の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチ
ーム等）を用いて容易にそれらのプロトプラスト
を調製し得るけれども、アマノリ類をプロトプラ
スト化できる酵素が現在のところ入手し得ないた
め、アマノリ類の細胞融合の技術が陸上植物に比
べて遅れている一因と考えられる。 而して、アマノリ類をプロトプラスト化するた
めの試みとしては今までのところ、藤田等による
「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプラ
ストの分離とその発生」についての報告（日本水
産学会、昭和57年秋季講演要旨集、第23頁、
213）がみられるのみである。この藤田等による
方法は、海苔葉体を物理的手段で細断して得られ
る葉片にシユードモナス（Pseudomonas）SPの
菌株（Ｐ―１株）の培養液から得た粗酵素液を約
４時間程度作用させてプロトプラストを調製する
ものであるが、この方法ではプロトプラストを得
るための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を
物理的に切断したものに酵素を作用させるので得
られるプロトプラストが不健全になる可能性が高
く、したがつてこのプロトプラストを用いての細
胞融合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞
融合の手法においてはそれに用いるプロトプラス
トの健全度が非常に主要な要因であつて、プロト
プラストが不健全であると細胞融合に当つての融
合率が低くなつて以後の培養による生育も劣るよ
うになると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するのは、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 Preston等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフイブリル形態のキシランから構成されてお
り、細胞充間物質としてポルフイランが存在して
いるとされる。また、L.A.Hanic等によると、海
苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存在して
いるとされる。すなわち、このような海苔の組識
上の観点から、海苔は切断しなければプロトプラ
スト化できないと考えられていたものと思われ
る。 本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプ
ロトプラストを得るには、海苔を物理的に切断す
ることなくその表層から崩壊させることが必要で
あるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検討した結果、海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する
酵素液で処理するか、更にはポリフイラン加水分
解酵素も含有する酵素液で処理することにより、
海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得る
ことの知見を得て本発明をなすに至つた。 すなわち、本発明の目的は、細胞融合に有効に
適用し得る海苔の健全なプロトプラストを調製す
る方法を提供することにある。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明の構成上の主要な特徴は、海苔葉体を、
シユードモナス属に属する難消化性多糖類の加水
分解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔由来
の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して
得られる培養液から調製される少なくともマンナ
ン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を含有す
る酵素液で処理することにある。なお、本発明の
其他の構成は以下の説明から明らかになるであろ
う。 本発明で海苔のプロトプラスト化に用いる酵素
液の調製に利用される難消化性多糖類の加水分解
能を有する微生物は、海水中から分離されたもの
であつて、上記多糖類であるマンナン、キシラン
およびポルフイランの加水分解能を有し、下記の
とおりの菌学的性質を有する。 菌学的性質： 形態 ZoBELL2216E培地に生育した細胞につい
て、 (イ) 細胞の形態は桿菌では大きさは0.5〜１μ
ｍ×1.5〜2.5μｍ (ロ) 運動性を有し、鞭毛は単極毛性 (ハ) グラム染色性は陰性 生育状態 ZoBELL2216E斜面培地における生育状態、 (イ) 20℃〜27℃の温度で良好に生育する (ロ) 淡黄色の色素を沈着 (ハ) 毛状（filiform）の集落を形成 生理学的性質 (イ) カタラーゼテスト 陽性 (ロ) オキシダーゼテスト 陽性 (ハ) グルコースよりの酸の生成 陽性 (ニ) Ｏ―Ｆテスト（Hugh Leifson法による）
０ (ホ) Vibro―Static Agent（０／129） 陰性 (ヘ) 塞天液化能 ＋ (ト) キシラン分解能 ＋ (チ) マンナン分解能 ＋ (リ) 好気性 上記菌学的性質に鑑み、本発明で利用する上記
微生物はシユードモナス属（Pseudomonas）に
属する菌株であると同定し得る。なお、この菌株
シユードモナス（Pseudomonas）sp.PT―５は微
工研条寄第330号の受託番号で工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。 本発明では上記微生物を、海苔もしくは海苔由
来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養し
てマンナン加水分解酵素、キシラン加水分解酵素
更にはポルフイラン加水分解酵素を培地中に生産
する。 ここで用いる“海苔由来の多糖類”とは海苔を
熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主
として多糖類から成る残渣、又は該残渣を更に精
製処理して多糖類含量を高めたものを意味する。 例えば、海苔を10倍量の水に浸漬し、オートク
レーブ中で120℃で30分間加熱したのち、濾布を
用いて可溶性区分を除去し、得られる残渣につい
て上記と同様の手順で加熱して可溶性区分を除去
する操作を繰返し行い（５回程度）、ついで得ら
れる残渣を100％エタノールに浸漬し、室温にて
一夜放置したのち、可溶性区分を除去し、乾燥し
たものを多糖類から成る残渣として用いるか、又
は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰返し行つて
得られる残渣（エタノール浸漬を行つていないも
の）を1N―NaOH溶液に浸漬し、室温にて一夜放
置したのち、可溶性区分を除去した残渣をNaOH
の20％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液を遠心
分離し、その上澄液にフエーリング溶液を加えて
沈澱を生成させ、この沈澱物を水洗してCuイオ
ンを除去して得られる多糖類（マンナン）もしく
は上記フエーリング溶液を加えて沈澱を生成させ
たときの上澄液にHC1を加えてPHを３に調整して
得られる沈澱物から成る多糖類（キシラン）をそ
れぞれ精製処理した多糖類として用いる。 上記誘導物質としての海苔もしくは海苔由来の
多糖類の培地に対する添加量は１乃至２重量％が
適当である。 本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培
地は、炭素源として上記誘導物質を、窒素源とし
てペプトンおよび酵母エキスを、更に無機質とし
てK2HPO4、FeCl3などを海水又は人工海水に溶
解し、緩衝液（例えばトリス緩衝液でPHを7.5前
後に調整したものが好ましい。培地組成を例示す
ると下記のとおりである。 培地組成： 海苔又は海苔由来の多糖類 1.0（重量％） ペプトン 1.0 酵母エキス 0.1 K2HPO4 0.01 FeCl3 0.6mg／１ トリス緩衝液 0.1（重量％） 上記割合で海水に溶解してPHを7.5に調整す
る。 本発明で利用する上記微生物の上記培地におけ
る培養条件は、25℃の温度で４日間通気、撹拌通
気下（通気量1000〜2000ml／min、撹拌数100〜
300r.p.m.）に行う。 上述のようにして培養して得られた培養液から
酵素液を調製するには、該培養液を４℃の温度で
30分間遠心分離（10000r.p.m.）し、その上澄液
を酵素液とする。 このようにして得られる酵素液はマンナン加水
分解酵素、キシラン加水分解酵素およびポルフイ
ラン加水分解酵素を含有する。 本発明では上記培養に当り、海苔由来の多糖類
として主にマンナンもしくはキシランから成るも
のを誘導物質として培地に含有させて主としてマ
ンナン加水分解酵素もしくはキシラン加水分解酵
素をそれぞれ培地中に生産させ、得られる培養液
からこれらの各酵素を主として含む酵素液を調製
し、両者の酵素液を組合せて海苔葉体のプロトプ
ラスト化に用いることも可能である。 なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化に
マンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を
主に用いるのは、前者が海苔の表層に存在する顆
粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を
形成して細胞壁を形成しているミクロフイブリル
形態のキシランに対する後者の作用をし易くする
ことに基づくものであり、したがつて、キシラン
加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ポ
ルフイラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞充間物
質としてのポルフイランに作用して分解するので
該酵素を含む酵素液を用いるとプロトプラスト化
が一層促進される。 海苔葉体に作用させる上記酵素液の量は、海苔
葉体を５cm程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素
液を５〜10倍に濃縮したものの10ml程度が適当で
あり、３〜４時間の作用で海苔のプロトプラスト
を調製し得る。 また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用
させるに当つて、該葉体にプロテアーゼを作用さ
せると海苔の表層を被覆している蛋白質の薄い層
を分解し得るのでプロトプラストを調製するうえ
で一層効果的である。プロテアーゼとしてはパパ
インが特に好ましく、10％のパパイン液として葉
体に15〜30分程度作用させると上記蛋白質の薄層
を有効に分解、除去し得る。 なお、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用
は、上記プロトプラスト化のための酵素液による
処理に先立つて行つてもよく、又、該酵素液によ
る処理と平行的に行つてもよい。 上述のようにして得られる海苔のプロトプラス
トは海苔を物理的に切断することなく、酵素処理
によつてのみ調製されるものであるから健全な状
態であつて、細胞融合に利用するのに適してい
る。 例えば、本発明の方法で調製された海苔のプロ
トプラストをペトリ皿内で人工海水（藻類用
Asp.12）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着生し
たプロトプラストの生育状況を観察した結果によ
る生育状況に良好である。 叙上のように、本発明によると、海苔のプロト
プラストが酵素的処理のみで健全な状態で得られ
るので、今後の海苔の細胞融合技術の進展に益す
るものと言える。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 培地の調製 ペプトン 1.0（重量％） 酵母エキス 0.1 （ 〃 ） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／１ トリス緩衝液（トリスアミノメタン）
0.1（重量％） 海苔の熱水抽出残渣 1.0（重量％） 上記組成のものを海水に添加してPH7.5に調整
したものを培地に用いた。 酵素液の調製 上記培地にシユードモナス（Pseudomonas）
sp微工研条寄No.BP―330を接し、300r.p.m.の撹
拌下に通気しながら（通気量2000ml／min）25℃
で４日間培養を行つた。 得られた培養液を４℃の温度で30分間遠心分離
（10000r.p.m.）し、その上澄液を10倍に濃縮して
酵素液とした。 このようにして調製した酵素液の難消化性多糖
類に対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示
すとおりである。 なお、参考として前述した藤田等の方法で用い
た酵素液の調製法を下記に示すとともに、その酵
素活性を調べた結果も併せて表示した。 酵素液の調製法： 培地組成 NH4NO3 0.1（重量％） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／１ トリスアミノメタン 0.1（重量％） アサクサノリ粉末 0.2（重量％） 上記組成を海水に添加してPHを7.5に調整。 アサクサノリ粉末は別に滅菌して添加した。 上記培地に、あらかじめ２日間培養した
Pseudomonas spの菌株を接種し、25℃で５日間
通気下に培養を行ない、ついで２日間静置培養を
行つたのち、得られた培養液をセライト（スタン
ダードスーパーセル）で濾過、除菌したものを酵
素液とした。
【表】
表にみられるように、本発明で用いる酵素液は
マンナンおよびキシランに対する活性が藤田等の
方法で用いた酵素液に比し優れている。 プロトプラストの調製 海苔葉体を５cm程度のもの４〜５枚をＬ型試験
管に入れ、これに上記酵素液10mlを加えて海苔葉
体を該酵素液に浸漬しながら、20℃の温度でモノ
ー型振盪器を用いて４時間振盪（70ストローク／
分）させて海苔のプロトプラストを得た。 実施例 ２ 本例は海苔葉体のプロトプラスト化に当つて該
葉体にパパインを作用させた例を示したものであ
る。なお、パパインを葉体に作用させるほかは、
実施例１と同様な手順でプロトプラストの調製を
行つた。 パパインによる処理 Ｌ型試験管に５cm程度の海苔葉体の４〜５枚を
収容し、これに10％パパイン溶液（酢酸塩バツフ
アーに溶解してPH6.0にしたもの）10mlを添加し
て海苔葉体を該パパイン溶液に浸漬しながら、25
℃の温度で20分間振盪（モノー型振盪器70ストロ
ーク／分）させた。 プロトプラストの調製 上述のようにしてパパインを作用させた海苔葉
体を、実施例１に記載した手順に従つて酵素液で
60分間処理してプロトプラストを調製した。
マンナンおよびキシランに対する活性が藤田等の
方法で用いた酵素液に比し優れている。 プロトプラストの調製 海苔葉体を５cm程度のもの４〜５枚をＬ型試験
管に入れ、これに上記酵素液10mlを加えて海苔葉
体を該酵素液に浸漬しながら、20℃の温度でモノ
ー型振盪器を用いて４時間振盪（70ストローク／
分）させて海苔のプロトプラストを得た。 実施例 ２ 本例は海苔葉体のプロトプラスト化に当つて該
葉体にパパインを作用させた例を示したものであ
る。なお、パパインを葉体に作用させるほかは、
実施例１と同様な手順でプロトプラストの調製を
行つた。 パパインによる処理 Ｌ型試験管に５cm程度の海苔葉体の４〜５枚を
収容し、これに10％パパイン溶液（酢酸塩バツフ
アーに溶解してPH6.0にしたもの）10mlを添加し
て海苔葉体を該パパイン溶液に浸漬しながら、25
℃の温度で20分間振盪（モノー型振盪器70ストロ
ーク／分）させた。 プロトプラストの調製 上述のようにしてパパインを作用させた海苔葉
体を、実施例１に記載した手順に従つて酵素液で
60分間処理してプロトプラストを調製した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 海苔葉体を、シユードモナス属
（Pseudomonas）に属する難消化性多糖類の加水
分解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔由来
の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して
得られる培養液から調製した少なくともマンナン
加水分解酵素とキシラン加水分解酵素とを含有す
る酵素液で処理することを特徴とする海苔のプロ
トプラストを調製する方法。 ２ 前記酵素液による処理に先立ち、海苔葉体を
プロテアーゼで処理する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３ 前記酵素液による処理と平行して、海苔葉体
をプロテアーゼで処理する特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ４ 海苔由来の多糖類が海苔を熱水抽出して得ら
れる多糖類含有残渣である特許請求の範囲第１項
乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５ 海苔由来の多糖類が海苔を熱水抽出して得ら
れる残渣を精製処理したものである特許請求の範
囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の方
法。 ６ 前記酵素液がポルフイラン加水分解酵素も含
有するものである特許請求の範囲第１項乃至第３
項のいずれか１項に記載の方法。 ７ 前記酵素液がマンナン加水分解酵素を含有す
る酵素液とキシラン加水分解酵素を含有する酵素
液とを組合せたものである特許請求の範囲第１項
乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。 ８ 培地が窒素源としてペプトンおよび酵母エキ
スを含有するものである特許請求の範囲第１項乃
至第３項のいずれか１項に記載の方法。 ９ プロテアーゼがパパインである特許請求の範
囲第２項又は第３項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58149378A JPS6041485A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58149378A JPS6041485A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6041485A JPS6041485A (ja) | 1985-03-05 |
| JPS6257306B2 true JPS6257306B2 (ja) | 1987-11-30 |
Family
ID=15473820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58149378A Granted JPS6041485A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6041485A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02117607U (ja) * | 1989-03-07 | 1990-09-20 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0654071B2 (ja) * | 1989-11-25 | 1994-07-20 | 立山アルミニウム工業株式会社 | 組合せ出窓装置 |
| JP2008125422A (ja) * | 2006-11-20 | 2008-06-05 | Mie Prefecture | 海苔の単細胞化方法及び養殖方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5421427A (en) * | 1977-07-18 | 1979-02-17 | Mitsubishi Electric Corp | Unsaturated polyester varinish composition with low odor |
-
1983
- 1983-08-16 JP JP58149378A patent/JPS6041485A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02117607U (ja) * | 1989-03-07 | 1990-09-20 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6041485A (ja) | 1985-03-05 |
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