JPH0353909B2 - - Google Patents
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- JPH0353909B2 JPH0353909B2 JP59030892A JP3089284A JPH0353909B2 JP H0353909 B2 JPH0353909 B2 JP H0353909B2 JP 59030892 A JP59030892 A JP 59030892A JP 3089284 A JP3089284 A JP 3089284A JP H0353909 B2 JPH0353909 B2 JP H0353909B2
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- seaweed
- enzyme solution
- preparation
- hydrolase
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- Cultivation Of Seaweed (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は海苔の健全なプロトプラストを調製す
る方法、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し
得る海苔のプロトプラストを調製する方法に関す
る。 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
各方面で活発に行なわれるようになり、陸上植物
については既に実用化の段階にまで成功したもの
もみられるようになつた。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ては、その細胞壁を構成している多糖類が陸上植
物における多糖類（主としてセルロース）と異な
り、主としてキシラン、及びマンナンのような難
消化性の多糖類であるため、酵素処理によるプロ
トプラスト化が困難と考えられていた。 因に、Preston等の報告によると、海苔の表層
にマンナンが課粒状に存在しており、海苔の細胞
壁はミクロフイブリル形態のキシランから構成さ
れており、細胞充間物質としてポルフイランが存
在しているとされる。また、L.A.Hanic等による
と、海苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存
在しているとされる。 上述したような海苔特有の組織に鑑み、海苔は
その組織を物理的に切断しないとプロトプラスト
化できないとの観点から、近年、海苔葉体を物理
的手段で切断して得られる葉片にシユードモナス
（Pseudomonas）SPの菌株（Ｐ−１株）の培養
液から得た粗酵素液を約４時間程度作用させてプ
ロトプラストを調製する方法が提案されている。
（日本水産学会、昭和57年秋季講演要旨集、藤田
等「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプ
ラストの分離とその発生」第23頁、213）。 しかし、この方法ではプロトプラストを得るた
めの酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物理
的に切断したものに酵素を作用させるので得られ
るプロトプラストが不健全になる可能性が高く、
したがつてこのプロトプラストを用いての細胞融
合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞融合
の手法においてはそれに用いるプロトプラストの
健全度が非常に主要な要因であつて、プロトプラ
ストが不健全であると細胞融合に当つての融合率
が低くなつて以後の培養による生育も劣るように
なると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 本発明者は、上述したような現状に鑑み、細胞
融合に適した海苔の健全なプロトプラストを得る
には、海苔を物理的に切断することなくその表層
から崩壊させることが必要であるとの見地から海
苔のプロトプラスト化について検討した結果、さ
きに海苔を少なくともマンナン加水分解酵素およ
びキシラン加水分解酵素を含有する酵素液で処理
するか、更にはポルフイラン加水分解酵素も含有
する酵素液で処理することにより、海苔のプロト
プラストを健全な状態で調製し得ることの知見を
得て、海苔のプロトプラストを調製する方法に係
る発明をなした。［特願昭58−149378号（特開昭
60−41485号）］。 すなわち、上記発明に係る方法は、海苔葉体
を、シユードモナス属に属する難消化性多糖類の
加水分解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔
由来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養
して得られる少なくともマンナン加水分解酵素と
キシラン加水分解酵素を含有する酵素液で処理す
ること特徴とする。 而して、本発明者は、その後の研究の結果、上
記微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類に代
えて、海苔の構造多糖類の構成単位であるβ−
１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシド
結合を有する多糖類を構造多糖類成分として含有
する海藻もしくは該海藻由来の多糖類を誘導物質
として含む培地中で培養して得られる培養液から
調製される少くともマンナン加水分解酵素とキシ
ラン加水分解酵素を含有する酵素液で海苔葉体を
処理することによつても海苔のプロトプラスト化
が有効に行ない得ることの知見を得て本発明をな
すに至つた。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明の構成上の主要な特徴は、シユードモナ
ス属（Pseudomonas）に属する難消化性多糖類
の加水分解能を有する微生物を、β−１，３キシ
ロシド結合及びβ−１，４マンノシド結合を有す
る多糖類を構造多糖類成分として含有する海藻
（ただし、海苔葉体を除く）もしくは該海藻由来
の上記多糖類を誘導物質として含む培地中で培養
して得られる培養液から調製した少くともキシラ
ン加水分解酵素とマンナン加水分解酵素とを含有
する酵素液で、海苔葉体を処理することにある。 なお、本発明のその他の構成は以下の説明から
明らかになるであらう。 本発明において、海苔のプロトプラスト化に用
いる酵素液の調製に利用される難消化性多糖類の
加水分解能を有する微生物は海水中から分離され
たシユードモナス属（Pseudomonas）に属する
ものであつて、Pseudomonas sp PT−５の表示
で微工研条寄第330号（FERM BP−330）の受
託番号で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 なお、上記微生物は上記難消化性多糖類である
キシラン、マンナン及びポルフイランの加水分解
能を有し、下記に示す菌学的性質を有する。 菌学的性質： () 形態 Zo BELL 2216E培地に生育した細胞につ
いて、 (イ) 細胞の形態は稈菌で大きさは0.5〜1μｍ×
1.5〜2.5μｍ (ロ) 運動性を有し、鞭毛は単極毛性 (ハ) グラム染色性は陰性 () 生育状態 Zo BELL 2216E斜面培地における生育状
態、 (イ) 20〜27℃の温度で良好に生育する (ロ) 淡黄色の色素を沈着 (ハ) 毛状（filiform）の集落を形成 () 生理学的性質 (イ) カタラーゼテスト 陽性 (ロ) オキシダーゼテスト 陽性 (ハ) グルコースよりの酸の生成 陽性 (ニ) ０−Ｆテスト ０ （Hugh Leifson法による） (ホ) Vibro−Static Agent（０／129） 陰性 (ヘ) 寒天液化能 ＋ (ト) キシラン分解能 ＋ (チ) マンナン分解能 ＋ (リ) 好気性 本発明では上記微生物を、β−１，３キシロシ
ド結合及びβ−１，４マンノシド結合を有する他
を構造多糖類成分として含有する海藻（ただし、
海苔を除く）、例えばイワツダ（海藻の１種）、ハ
ネモ、サボテングサ等と海藻、もしくは該海藻由
来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養し
てマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵
素、更にはポルフイラン加水分解酵素を培地中に
生産させる。 因に、海苔葉体の多糖類は主としてキシランと
マンナンから構成されており、こらら多糖類の結
合様式及び組成単糖を、過ヨウ素酸酸化法及び加
水分解物についての液体クロマトグラフイ分析で
調べた結果、キシランはβ−１，３結合のキシロ
ースのモノポリマーであり、マンナンはβ−１，
４結合のマンノースのモノポリマーであることが
確認されたが、本発明で培地中に誘導物質として
含有させる上記海藻の多糖類及び該海藻由来の多
糖類は、必ずしもβ−１，３キシロシド結合のキ
シロースのモノポリマー及びβ−１，４結合のマ
ンノースのモノポリマーである必要はなく、β−
１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシド
結合を一部含有している二糖類以上のものがあれ
ば使用可能である。 なお、本発明で用いる上記“海藻由来の多糖
類”とは、上述したごときβ−１，３キシロシド
結合及びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖
類を含有する海藻を熱水抽出して可溶性成分を除
去して得られる、主として多糖類から成る残渣、
又は該残渣を更に精製処理して多糖類含量を高め
たものを意味する。 例えば、上記海藻を10倍量の水に浸漬し、オー
トクレーブ中で120℃で30分間加熱したのち、濾
布を用いて可溶性区分を除去し、得られる残渣に
ついて、上記と同様の手順で加熱して可溶性区分
を除去する操作を繰返し行ない（５回程度）、つ
いで得られる残渣を100％エタノールに浸漬し、
室温して一夜放置したのち、可溶性区分を除去
し、乾燥したものを多糖類から成る残渣として用
いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰
返し行なつて得られる残渣（エタノール浸漬を行
なつていないもの）を1N−NaOH溶液に浸漬し、
室温にて一夜放置したのち、可溶性区分を除去し
た残渣をNaOHの20％熱水溶液で抽出し、得ら
れる抽出液を遠心分離し、その上澄み液にフエー
リング溶液を加えて沈澱を生成させ、この沈澱物
を水洗してCuイオンを除去して得られる多糖類
（β−１，４マンノシド結合を有する）もしくは
上記フエーリング溶液を加えて沈澱を生成させた
ときの上澄液にHClを加えてPHを３に調整して得
られる沈澱物から成る多糖類（β−１，３キシロ
シド結合を有する）をそれぞれ精製処理した多糖
類として用いる。 前記誘導物質としての海藻もしくは海藻由来の
多糖類の培地に対する添加量は１〜２重量％が適
当である。 次に、本発明で利用する上記微生物の培養に用
いる培地は、炭素源として上記誘導物質を、窒素
源としてペプトンおよび酵母エキスを、更には無
機質としてK2HPO4、FeCl3などを海水又は人工
海水に溶解し、緩衝液（例えばトリス緩衝液）で
PHを7.5前後に調整したものが好ましい。培地組
成を例示すると下記のとおりである。 培地組成： 上記海藻又は該海藻由来の多糖類 1.0（重量％） ペプトン 1.0 酵母エキス 0.1 K2HPO4 0.01 FeCl3 0.6mg／ トリス緩衝液 0.1（重量％） 上記割合で海水に溶解してPHを7.5に調整する。 本発明で利用する上記微生物の上記培地におけ
る培養条件は、25℃の温度で４日間通気、撹拌通
気下（通気量1000〜2000ml／min、撹拌数100〜
300r.p.m.）に行う。 上述のようにして培養して得られた培養液から
酵素液を調製するには、該培養液を４℃の温度で
30分間遠心分離（10000r.p.m.）し、その上澄液
を酵素液とする。 このようにして得られる酵素液はマンナン加水
分解酵素、キシラン加水分解酵素およびポルフイ
ラン加水分解酵素を含有する。 本発明では上記培養に当たり、上記植物由来の
多糖類として主にマンナンもしくはキシランから
成るものを誘導物質として培地に含有させて主と
してマンナン加水分解酵素もしくはキシラン加水
分解酵素をそれぞれ培地中に生産させ、得られる
培養液からこれらの各酵素を主として含む酵素液
を調製し、両者の酵素液を組合せて海苔葉体のプ
ロトプラスト化に用いることも可能ある。 なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化に
マンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を
主に用いるのは、前者が海苔の表層に存在する顆
粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を
形成して細胞壁を形成しているミクロフイブリル
形態のキシランに対する後者の作用をし易くする
ことに基づくものであり、したがつて、キシラン
加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ポ
ルフイラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞充間物
質としてのポルフイランに作用して分解するので
該酵素を含む酵素液を用いるとプロトプラスト化
が一層促進される。 海苔葉体に作用させる上記酵素液の量は、海苔
葉体を５cm程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素
液を５〜10倍に濃縮したものの10ml程度が適当で
あり、３〜４時間の作用で海苔のプロトプラスト
を調製し得る。 また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用
させるに当つて、該葉体にプロテアーゼを作用さ
せると海苔の表層を被覆している蛋白質の薄い層
を分解し得るのでプロトプラストを調製するうえ
で一層効果的である。プロテアーゼとしてはパパ
インが特に好ましく、10％のパパイン液として葉
体に15〜30分程度作用させると上記蛋白質の薄層
を有効に分解、除去し得る。 なお、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用
は、上記プロトプラスト化のための酵素液による
処理に先立つて行つてもよく、又、該酵素液によ
る処理と平行的に行つてもよい。 上述のようにして得られる海苔のプロトプラス
トは海苔を物理的に切断することなく、酵素処理
によつてのみ調製されるものであるから健全な状
態であつて、細胞融合に利用するのに適してい
る。 例えば、本発明の方法で調製された海苔のプロ
トプラストをペトリ皿内で人工海水（藻類用
Asp.12）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着生し
たプロトプラストの生育状況を観察した結果によ
ると生育状況は非常に良好である。 叙上のように、本発明によると、海苔のプロト
プラストが酵素的処理のみで健全な状態で得られ
るので、今後の海苔の細胞融合技術の進展に益す
るものと言える。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 培地の調製 ペプトン 1.0（重量％） 酵母エキス 0.1（ 〃 ） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／ トリス緩衝液（トリスアミノメタン）
0.1（重量％） イワツダ（海藻の１種）の熱水 1.0（重量％） 抽出残渣 上記組成のものを海水に添加してPH7.5に調整
したものを培地に用いた。 酵素液の調製 上記培地にシユードモナス（Pseudomonas）
sp.PT−５微工研条寄第330号を接種し、300r.p.
m.の撹拌下で通気しながら（通気量2000ml／
min）25℃で４日間培養を行つた。 得られた培養液を４℃の温度で30分間遠心分離
（10000r.p.m.）し、その上澄液を10倍に濃縮して
酵素液とした。 このようにして調製した酵素液の難消化生多糖
類に対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示
すとおりである。
る方法、更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し
得る海苔のプロトプラストを調製する方法に関す
る。 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
各方面で活発に行なわれるようになり、陸上植物
については既に実用化の段階にまで成功したもの
もみられるようになつた。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ては、その細胞壁を構成している多糖類が陸上植
物における多糖類（主としてセルロース）と異な
り、主としてキシラン、及びマンナンのような難
消化性の多糖類であるため、酵素処理によるプロ
トプラスト化が困難と考えられていた。 因に、Preston等の報告によると、海苔の表層
にマンナンが課粒状に存在しており、海苔の細胞
壁はミクロフイブリル形態のキシランから構成さ
れており、細胞充間物質としてポルフイランが存
在しているとされる。また、L.A.Hanic等による
と、海苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存
在しているとされる。 上述したような海苔特有の組織に鑑み、海苔は
その組織を物理的に切断しないとプロトプラスト
化できないとの観点から、近年、海苔葉体を物理
的手段で切断して得られる葉片にシユードモナス
（Pseudomonas）SPの菌株（Ｐ−１株）の培養
液から得た粗酵素液を約４時間程度作用させてプ
ロトプラストを調製する方法が提案されている。
（日本水産学会、昭和57年秋季講演要旨集、藤田
等「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプ
ラストの分離とその発生」第23頁、213）。 しかし、この方法ではプロトプラストを得るた
めの酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物理
的に切断したものに酵素を作用させるので得られ
るプロトプラストが不健全になる可能性が高く、
したがつてこのプロトプラストを用いての細胞融
合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞融合
の手法においてはそれに用いるプロトプラストの
健全度が非常に主要な要因であつて、プロトプラ
ストが不健全であると細胞融合に当つての融合率
が低くなつて以後の培養による生育も劣るように
なると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 本発明者は、上述したような現状に鑑み、細胞
融合に適した海苔の健全なプロトプラストを得る
には、海苔を物理的に切断することなくその表層
から崩壊させることが必要であるとの見地から海
苔のプロトプラスト化について検討した結果、さ
きに海苔を少なくともマンナン加水分解酵素およ
びキシラン加水分解酵素を含有する酵素液で処理
するか、更にはポルフイラン加水分解酵素も含有
する酵素液で処理することにより、海苔のプロト
プラストを健全な状態で調製し得ることの知見を
得て、海苔のプロトプラストを調製する方法に係
る発明をなした。［特願昭58−149378号（特開昭
60−41485号）］。 すなわち、上記発明に係る方法は、海苔葉体
を、シユードモナス属に属する難消化性多糖類の
加水分解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔
由来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養
して得られる少なくともマンナン加水分解酵素と
キシラン加水分解酵素を含有する酵素液で処理す
ること特徴とする。 而して、本発明者は、その後の研究の結果、上
記微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類に代
えて、海苔の構造多糖類の構成単位であるβ−
１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシド
結合を有する多糖類を構造多糖類成分として含有
する海藻もしくは該海藻由来の多糖類を誘導物質
として含む培地中で培養して得られる培養液から
調製される少くともマンナン加水分解酵素とキシ
ラン加水分解酵素を含有する酵素液で海苔葉体を
処理することによつても海苔のプロトプラスト化
が有効に行ない得ることの知見を得て本発明をな
すに至つた。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明の構成上の主要な特徴は、シユードモナ
ス属（Pseudomonas）に属する難消化性多糖類
の加水分解能を有する微生物を、β−１，３キシ
ロシド結合及びβ−１，４マンノシド結合を有す
る多糖類を構造多糖類成分として含有する海藻
（ただし、海苔葉体を除く）もしくは該海藻由来
の上記多糖類を誘導物質として含む培地中で培養
して得られる培養液から調製した少くともキシラ
ン加水分解酵素とマンナン加水分解酵素とを含有
する酵素液で、海苔葉体を処理することにある。 なお、本発明のその他の構成は以下の説明から
明らかになるであらう。 本発明において、海苔のプロトプラスト化に用
いる酵素液の調製に利用される難消化性多糖類の
加水分解能を有する微生物は海水中から分離され
たシユードモナス属（Pseudomonas）に属する
ものであつて、Pseudomonas sp PT−５の表示
で微工研条寄第330号（FERM BP−330）の受
託番号で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 なお、上記微生物は上記難消化性多糖類である
キシラン、マンナン及びポルフイランの加水分解
能を有し、下記に示す菌学的性質を有する。 菌学的性質： () 形態 Zo BELL 2216E培地に生育した細胞につ
いて、 (イ) 細胞の形態は稈菌で大きさは0.5〜1μｍ×
1.5〜2.5μｍ (ロ) 運動性を有し、鞭毛は単極毛性 (ハ) グラム染色性は陰性 () 生育状態 Zo BELL 2216E斜面培地における生育状
態、 (イ) 20〜27℃の温度で良好に生育する (ロ) 淡黄色の色素を沈着 (ハ) 毛状（filiform）の集落を形成 () 生理学的性質 (イ) カタラーゼテスト 陽性 (ロ) オキシダーゼテスト 陽性 (ハ) グルコースよりの酸の生成 陽性 (ニ) ０−Ｆテスト ０ （Hugh Leifson法による） (ホ) Vibro−Static Agent（０／129） 陰性 (ヘ) 寒天液化能 ＋ (ト) キシラン分解能 ＋ (チ) マンナン分解能 ＋ (リ) 好気性 本発明では上記微生物を、β−１，３キシロシ
ド結合及びβ−１，４マンノシド結合を有する他
を構造多糖類成分として含有する海藻（ただし、
海苔を除く）、例えばイワツダ（海藻の１種）、ハ
ネモ、サボテングサ等と海藻、もしくは該海藻由
来の多糖類を誘導物質として含む培地中で培養し
てマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵
素、更にはポルフイラン加水分解酵素を培地中に
生産させる。 因に、海苔葉体の多糖類は主としてキシランと
マンナンから構成されており、こらら多糖類の結
合様式及び組成単糖を、過ヨウ素酸酸化法及び加
水分解物についての液体クロマトグラフイ分析で
調べた結果、キシランはβ−１，３結合のキシロ
ースのモノポリマーであり、マンナンはβ−１，
４結合のマンノースのモノポリマーであることが
確認されたが、本発明で培地中に誘導物質として
含有させる上記海藻の多糖類及び該海藻由来の多
糖類は、必ずしもβ−１，３キシロシド結合のキ
シロースのモノポリマー及びβ−１，４結合のマ
ンノースのモノポリマーである必要はなく、β−
１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシド
結合を一部含有している二糖類以上のものがあれ
ば使用可能である。 なお、本発明で用いる上記“海藻由来の多糖
類”とは、上述したごときβ−１，３キシロシド
結合及びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖
類を含有する海藻を熱水抽出して可溶性成分を除
去して得られる、主として多糖類から成る残渣、
又は該残渣を更に精製処理して多糖類含量を高め
たものを意味する。 例えば、上記海藻を10倍量の水に浸漬し、オー
トクレーブ中で120℃で30分間加熱したのち、濾
布を用いて可溶性区分を除去し、得られる残渣に
ついて、上記と同様の手順で加熱して可溶性区分
を除去する操作を繰返し行ない（５回程度）、つ
いで得られる残渣を100％エタノールに浸漬し、
室温して一夜放置したのち、可溶性区分を除去
し、乾燥したものを多糖類から成る残渣として用
いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰
返し行なつて得られる残渣（エタノール浸漬を行
なつていないもの）を1N−NaOH溶液に浸漬し、
室温にて一夜放置したのち、可溶性区分を除去し
た残渣をNaOHの20％熱水溶液で抽出し、得ら
れる抽出液を遠心分離し、その上澄み液にフエー
リング溶液を加えて沈澱を生成させ、この沈澱物
を水洗してCuイオンを除去して得られる多糖類
（β−１，４マンノシド結合を有する）もしくは
上記フエーリング溶液を加えて沈澱を生成させた
ときの上澄液にHClを加えてPHを３に調整して得
られる沈澱物から成る多糖類（β−１，３キシロ
シド結合を有する）をそれぞれ精製処理した多糖
類として用いる。 前記誘導物質としての海藻もしくは海藻由来の
多糖類の培地に対する添加量は１〜２重量％が適
当である。 次に、本発明で利用する上記微生物の培養に用
いる培地は、炭素源として上記誘導物質を、窒素
源としてペプトンおよび酵母エキスを、更には無
機質としてK2HPO4、FeCl3などを海水又は人工
海水に溶解し、緩衝液（例えばトリス緩衝液）で
PHを7.5前後に調整したものが好ましい。培地組
成を例示すると下記のとおりである。 培地組成： 上記海藻又は該海藻由来の多糖類 1.0（重量％） ペプトン 1.0 酵母エキス 0.1 K2HPO4 0.01 FeCl3 0.6mg／ トリス緩衝液 0.1（重量％） 上記割合で海水に溶解してPHを7.5に調整する。 本発明で利用する上記微生物の上記培地におけ
る培養条件は、25℃の温度で４日間通気、撹拌通
気下（通気量1000〜2000ml／min、撹拌数100〜
300r.p.m.）に行う。 上述のようにして培養して得られた培養液から
酵素液を調製するには、該培養液を４℃の温度で
30分間遠心分離（10000r.p.m.）し、その上澄液
を酵素液とする。 このようにして得られる酵素液はマンナン加水
分解酵素、キシラン加水分解酵素およびポルフイ
ラン加水分解酵素を含有する。 本発明では上記培養に当たり、上記植物由来の
多糖類として主にマンナンもしくはキシランから
成るものを誘導物質として培地に含有させて主と
してマンナン加水分解酵素もしくはキシラン加水
分解酵素をそれぞれ培地中に生産させ、得られる
培養液からこれらの各酵素を主として含む酵素液
を調製し、両者の酵素液を組合せて海苔葉体のプ
ロトプラスト化に用いることも可能ある。 なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化に
マンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を
主に用いるのは、前者が海苔の表層に存在する顆
粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を
形成して細胞壁を形成しているミクロフイブリル
形態のキシランに対する後者の作用をし易くする
ことに基づくものであり、したがつて、キシラン
加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ポ
ルフイラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞充間物
質としてのポルフイランに作用して分解するので
該酵素を含む酵素液を用いるとプロトプラスト化
が一層促進される。 海苔葉体に作用させる上記酵素液の量は、海苔
葉体を５cm程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素
液を５〜10倍に濃縮したものの10ml程度が適当で
あり、３〜４時間の作用で海苔のプロトプラスト
を調製し得る。 また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用
させるに当つて、該葉体にプロテアーゼを作用さ
せると海苔の表層を被覆している蛋白質の薄い層
を分解し得るのでプロトプラストを調製するうえ
で一層効果的である。プロテアーゼとしてはパパ
インが特に好ましく、10％のパパイン液として葉
体に15〜30分程度作用させると上記蛋白質の薄層
を有効に分解、除去し得る。 なお、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用
は、上記プロトプラスト化のための酵素液による
処理に先立つて行つてもよく、又、該酵素液によ
る処理と平行的に行つてもよい。 上述のようにして得られる海苔のプロトプラス
トは海苔を物理的に切断することなく、酵素処理
によつてのみ調製されるものであるから健全な状
態であつて、細胞融合に利用するのに適してい
る。 例えば、本発明の方法で調製された海苔のプロ
トプラストをペトリ皿内で人工海水（藻類用
Asp.12）に懸濁させ、ペトリ皿の底部に着生し
たプロトプラストの生育状況を観察した結果によ
ると生育状況は非常に良好である。 叙上のように、本発明によると、海苔のプロト
プラストが酵素的処理のみで健全な状態で得られ
るので、今後の海苔の細胞融合技術の進展に益す
るものと言える。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 培地の調製 ペプトン 1.0（重量％） 酵母エキス 0.1（ 〃 ） K2HPO4 0.01（ 〃 ） FeCl3 0.6mg／ トリス緩衝液（トリスアミノメタン）
0.1（重量％） イワツダ（海藻の１種）の熱水 1.0（重量％） 抽出残渣 上記組成のものを海水に添加してPH7.5に調整
したものを培地に用いた。 酵素液の調製 上記培地にシユードモナス（Pseudomonas）
sp.PT−５微工研条寄第330号を接種し、300r.p.
m.の撹拌下で通気しながら（通気量2000ml／
min）25℃で４日間培養を行つた。 得られた培養液を４℃の温度で30分間遠心分離
（10000r.p.m.）し、その上澄液を10倍に濃縮して
酵素液とした。 このようにして調製した酵素液の難消化生多糖
類に対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示
すとおりである。
【表】
(注) ……活性が非常に強い
……活性が強い
＋……活性が稍々強い
表にみられるように本発明で用いる酵素液はマ
ンナン及びキシランに対する活性が優れている。 プロトプラストの調製 海苔葉体を５cm程度のもの４〜５枚をＬ型試験
管に入れ、これを上記酵素液10mlを加えて海苔葉
体を該酵素液に浸漬しながら、20℃の温度でモノ
−型振盪器を用いて４時間振盪（70ストローク／
分）させて海苔のプロトプラストを得た。 実施例 ２ 本例は海苔葉体のプロトプラスト化に当つて該
葉体にパパインを作用させた例を示したものであ
る。なお、パパインを葉体に作用させるほかは、
実施例１と同様な手順でプロトプラストの調製を
行つた。 パパインによる処理 Ｌ型試験管に５cm程度の海苔葉体の４〜５枚を
収容し、これにパパイン溶液（酢酸塩バツフアー
に溶解してPH6.0にしたもの）10mlを添加して海
苔葉体を該パパイン溶液に浸漬しながら、25℃の
温度で20分間振盪（モノ−型振盪器70ストロー
ク／分）させた。 プロトプラストの調製 上述のようにしてパパインを作用させた海苔葉
体を、実施例１に記載した手順に従つて酵素液で
60分間処理してプロトプラストを調製した。
……活性が強い
＋……活性が稍々強い
表にみられるように本発明で用いる酵素液はマ
ンナン及びキシランに対する活性が優れている。 プロトプラストの調製 海苔葉体を５cm程度のもの４〜５枚をＬ型試験
管に入れ、これを上記酵素液10mlを加えて海苔葉
体を該酵素液に浸漬しながら、20℃の温度でモノ
−型振盪器を用いて４時間振盪（70ストローク／
分）させて海苔のプロトプラストを得た。 実施例 ２ 本例は海苔葉体のプロトプラスト化に当つて該
葉体にパパインを作用させた例を示したものであ
る。なお、パパインを葉体に作用させるほかは、
実施例１と同様な手順でプロトプラストの調製を
行つた。 パパインによる処理 Ｌ型試験管に５cm程度の海苔葉体の４〜５枚を
収容し、これにパパイン溶液（酢酸塩バツフアー
に溶解してPH6.0にしたもの）10mlを添加して海
苔葉体を該パパイン溶液に浸漬しながら、25℃の
温度で20分間振盪（モノ−型振盪器70ストロー
ク／分）させた。 プロトプラストの調製 上述のようにしてパパインを作用させた海苔葉
体を、実施例１に記載した手順に従つて酵素液で
60分間処理してプロトプラストを調製した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス属（Pseudomonas）に属す
る難消化性多糖類の加水分解能を有する微生物
を、β−１，３キシロシド結合及びβ−１，４マ
ンノシド結合を有する多糖類を構造多糖類成分と
して含有する海藻（ただし、海苔葉体を除く）も
しくは該海藻由来の上記多糖類を誘導物質として
含む培地中で培養して得られる培養液から調製し
た少なくともキシラン加水分解酵素とマンナン加
水分解酵素とを含有する酵素液で、海苔葉体を処
理することを特徴とする海苔のプロトプラストの
調製法。 ２ 前記酵素液による処理に先立ち、海苔葉体を
プロテアーゼで処理する特許請求の範囲第１項記
載の調製法。 ３ 前記酵素液による処理と平行して、海苔葉体
をプロテアーゼで処理する特許請求の範囲第１項
記載の調製法。 ４ 海藻由来の多糖類が該海藻を熱水抽出して得
られる多糖類含有残渣である特許請求の範囲第１
項乃至第３項のいずれか１項に記載の調製法。 ５ 海藻由来の多糖類が該海藻を熱水抽出して得
られる残渣を精製処理したものである特許請求の
範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の調
製法。 ６ 前記酵素液がポルフイラン加水分解酵素も含
有するものである特許請求の範囲第１項乃至第３
項のいずれか１項に記載の調製法。 ７ 前記酵素液がマンナン加水分解酵素を含有す
る酵素液とキシラン加水分解酵素を含有する酵素
液とを組合せたものである特許請求の範囲第１項
乃至第３項のいずれか１項に記載の調製法。 ８ 培地が窒素源としてペプトン及び酵母エキス
を含有するものである特許請求の範囲第１項乃至
第３項のいずれか１項に記載の調製法。 ９ プロテアーゼがパパインである特許請求の範
囲第２項又は第３項記載の調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59030892A JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59030892A JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60176582A JPS60176582A (ja) | 1985-09-10 |
| JPH0353909B2 true JPH0353909B2 (ja) | 1991-08-16 |
Family
ID=12316373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59030892A Granted JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60176582A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6531646B1 (en) * | 1997-12-12 | 2003-03-11 | Northeastern University | Strain manipulation and improvement in the edible seaweed Porphyra |
| CN105754927B (zh) * | 2016-03-22 | 2019-04-16 | 中国海洋大学 | 缢江蓠原生质体的制备方法 |
-
1984
- 1984-02-21 JP JP59030892A patent/JPS60176582A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60176582A (ja) | 1985-09-10 |
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