JPS626168A - 蛋白質結合ハプテン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は下記式で表わされる抗てんかん剤の免疫分析、
特に酵素免疫分析（以下Ｅｌ＾という）に利用される蛋
白質結合ハプテンに関する。

前記化合物［＋］はａｍな抗てんかん剤として知られて
いる［特開昭５４−１０３８２３　］。

化合物［＋１の部分てんかん症の治療における血中「効
ａ度は約６〜Ｌｏｎｇ／冒ｌといわれている。

各患者に体重当り同量の化合物［Ｄを投与しても一定の
血中濃度は得られない。これは薬剤の吸収。

分布９代謝、排泄等に個体差があるためで、更に併用さ
れる他の薬剤との相互作用による影響も考えられる。こ
のために各患者における血中ｉＱ度を測定して、上記し
た望ましいレベルを保ち、できるだけ副作用の発生を少
なくするように薬剤を投与すること（ｔｈｅｒａｐｅｕ
Ｈｃ　ｄｒｕｇ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）が必要となる
。

以」二の理由から、迅速、正確かつ筒便な化合物［目の
定量法の開発が望まれている。現在、その定量は高速液
体クロマトグラフィー法（以下＋１ＰＬＣ法という）に
よって行われているが、分析には多量の被検体（血清の
場合０．５〜１ｍ１以上）が必要であること、抽出操作
等の前処理および特殊な専用機器を要するなどの欠点が
あり、日常の臨床検査に用いるには問題が多い。

化合物［１］に特異的に結合する抗体を調製することが
できれば、少量の被検体で、前処理が不要な種々の免疫
分析法により化合物［１］を定量することが可能である
。化合物［＋］に対する抗体は、化合物［＋］を動物に
投与しても得られない。化合物［＋］に対する抗体はへ
ブチ７、すなわち化合物［１］またはこれに類する化合
物とアルブミンの如き高分子蛋白質との結合物を動物に
非経口投与することにより得られる。しかし、化合物［
１］の３位のスルフ１モイル部分を介して結合した化合
物［１］と高分子蛋白質との結合物を動物に非経口投与
して得た抗体は、後記比較例１に示すように免疫分析に
適さないものであった。

免疫分析に用いる化合物［目に対する抗体は、化合’１
５［１］（亦Ｗ識抗原）お上び欅諭された化合物［１］
（標繊抗ね）の双方とほぼ同じ強さで反応することが要
求される。更に、抗体は化合物［１］と類似する化合物
、例えば化合物［！］の代謝物と反応しないことが必要
である。抗体が非ｅ［抗原よりも標識抗原とはるかに強
く反応するとか、化合物［１］以外の化合物と反応する
ときは、免疫分析そのものが成立しないこともある。こ
のような免疫分析に適した化合物［］］に対する抗体は
未だ調製されていない。

問題を解決するための手段 本発明は一般式 ［式中、Ｔは蛋白質残基を意味し、Ｘは結合基を意味す
る］ で表わされる蛋白質結合ハプテン（以下、単に結合物と
いう）に関する。

ここにおいて、Ｔで表わされる蛋白質残基の例としては
、ウシ血清アルブミン、グロブリフ％ヘモシアニンなど
の免疫原としての蛋白質残基あるいはβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、ベルオキクダーゼ、リパーゼ、アルカリフォ
スフ１ターゼ、グルツース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ等の酵素ｅ：Ｉｍ剤としての酵素蛋白質残基が
挙げられる。

更に具体的な結合物［■］の例としては、一般式［■］
における結合基Ｘが次式で表わされる場合が挙げられる
。

［（Ｕ）Ｐ　（Ｕｌ）　、（Ｕｌ）−−Ｗ　　（ＣＨ２
）−Ｚ　　］（式中、Ｚは単結合、−Ｎ）１−１−Ｓ−
１−Ｏ−、−ＣＯ−または低級アルキレフ基を意味し、
かつ２はベンズインキサゾール環の５．６または７位と
結合している。

ｎは０ないし３の整数であり、Ｗは＝Ｎ−１−ＮＨ−ま
たは−Ｓ−であり、Ｕは＝　ＣＨ−であり、Ｕｌは低級
アルキレン基であり、但し、Ｕ　ｓ　Ｕ　Ｉ、Ｕｌの順
序は任意である。）特に好ましい結合物［Ｕｌは、Ｚが
ベンズイソ李−サゾール環の５または６位に結合してい
る場合！ある。結合基Ｘを介して結合している蛋白質残
基Ｔと化合物［！］に対応する部分（以下／１ブテン部
分という）との結合割合は、一般式［■］には表示され
ていないが、前者１モル相当に対し後者が１〜５０モル
相当である。両者の結合割合は結合反応時において後述
の化合物［１１１］や結合剤の社類を変えるとか、これ
らの使用割合を変えるとか、または反応条件を変えるこ
とにより調節できる。

結合物を常法によりウサギ９壬ルモブト、ヤギの如き哺
乳動物に繰り返し非経口投与すれば化合物［＋］に対す
る抗体が得られる。

本発明の結合物を抗体を得るための免疫原として用いる
ときには、ハプテンがより多くの割合で結合するように
条件を設定するのがよい、この場合の蛋白質残基Ｔは、
反応の結果少々変性していても特に１８Ｉ＆ｉｇはない
。

蛋白質ｌｉｌ基が酵素残基である本発明の結合物を免疫
訂として用いることは可能である。しかし、高価な酵素
をこのような目的で用いることは好ましいことではない
、かかる結合物は、ＥｌＡ法における酵素標識抗原とし
て用いるのが好ましい、酵素標識抗原としての本発明の
結合物は、酵素残基１モル相当に対してハプテン部分が
１〜１０モル相当、好ましくは１〜５モル相当から構成
される。この場合、両者の結合は酵素活性が失活しない
ような緩和な条件下で行われる。

一般式［ｎ］で表わされる本発明の結合物は、例えば次
の一般式［１１１］ ［式中、Ｙは直接あるいは結合剤により蛋白質と結合し
得る基を意味する］ で表わされる化合物と先に挙げた蛋白質とを結合させる
ことにより得られる０通常、蛋白質と化合物口１との結
合は結合剤の助けをかりることにより行われる。化合物
［１１］における官能基Ｙと結合剤の１１ｗ１はこの分
野で通常用いられるものが選択される。なお、化合物［
１１１と蛋白質とがスルフ１モイル部分を介して結合す
ることはできるだけ避るべきである。そのためには適切
な官能基Ｙおよび結合剤を選択するとか、化学当量より
も少い量の結合剤を用いるとか、あるいは緩和な結合条
件を選ぶ、とかが行われる０例えば、官能基ＹとしてＨ
−Ｗ’　−（ＣＩ■ｔ）−Ｚ　−（Ｚおよびｎは前掲と
同じであり　Ｗ　７は”−Ｎ　Ｉ（−または−８−であ
る）で表わされる基を選択し、そして結合剤としてグル
タルアルデヒドや次式で表われるマレイミド誘導体を選
択すれば、不適当な結合物の生成が少（てすむ。

（式中、Ｒはフェニレン基または低級アルキレフ基を意
味する）。

な右、化合物［１１１］はジャーナル　オブ　メディシ
ナル　ケミストリー（Ｊ、　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈ
ｅｗ、＞２２、（２＞　１８０（１９７９）に紀αの方
法またはこれに準する方法等により製造できる。

かくしで得られる本発明の結合物は化合物［目の免疫分
析における抗体を得るための免疫原として、またＥ１＾
法における酵素標識抗原としてａ川である。

具体例 次に実施例、参考例および比較例を挙げて本発明を更に
詳細に説明する。

実施例１　　ウシ血清アルブミン結合物の調製ウシ血清
アルブミンの０．２Ｍリン酸Ｉｎ街溶液（ｐＨ７，５０
■ｇ／２．５ｉｊＦ　）に５−アミノ−３−スルファモ
イルメチル−１，２−ベンズイソオキサゾールの０．Ｉ
Ｎ塩酸溶液（１５−ｇ／　０．５■ｌ）を加え、さらに
重炭酸水素ナトリウム粉末を添加しｐＨを７に調節する
。撹拌下、０．０２　Ｍグルタルアルデヒド２．５冒ｌ
を滴下し、室温で２時間撹拌する。

つぎに１Ｍリジン溶液（ｐ　Ｈ７，５）　０．２５冒！
を添加して反応を停止し、０．９％塩化ナトリウム水溶
液２１に対し一昼夜透析し、さらに水２１に対して一昼
夜透析する。これを凍結乾燥して免疫原であるウシ血清
アルブミン結合物３９．２−ｇを得る。

参考例１　　抗体の調製 実施例１で得た結合物を０．９％塩化ナトリウム水溶液
に溶解して１％溶液となす、これに等容量の７０イ／ド
の完全アジュバントを加えて乳化したものをウサギの足
筐左右１ケ所、背部皮下８ケ所にそれぞれ０．１１１ず
つ注射する。２週間後に背部皮下５ケ所に０．Ｉｍｊｌ
ずつ注射する。その後２週問毎に６回注射し、最終注射
の１０日後に！ＩＩ！ＩＩＪＩから全血を採取し、常法
により抗体（抗血清）を得る。

実施例２　　酵索結合物（酵素標識抗ｇ）の調製大腸１
山来β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ベーリ／ガー社製）水
溶液（１０曹ｇ／ｍｌ　）Ｏ，Ｉｗｊを０．２Ｍす７酸
９Ｗｒ液（ＰＨ７）１■ｌと５−アミノ−３−スルファ
モイルメチル−１，２−ベンズイソオキサゾールの０．
ＩＮ塩酸溶液（５ｗｇ／ｍＪ　）０．１■ｌの混液に添
加し混合する。これを撹拌しながら１．５％グルタルデ
ヒド水溶液０．１　ｍｌを添加し室温で３０分間撹拌す
る゛。この溶液を０．０２Ｍリン酸ＩＩＮ液（ｆ）Ｉ−
１７）−０，９％塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセ
フ７デブクスＧ２５（ファルマシア社製）カラム（２Ｘ
２５　ｃｍ）にかけ同緩衝液で溶出し、５■ｌ　ずつ分
画する。酵素活性の高い６〜８番目の分画を集め、ｐＭ
３０Ｂ（アミコン社ｍ）で限外濾過し、膜上に残った残
渣を同緩衝液Ｉｏｎｓ　１で洗浄ｔｌｔｓ８ｍｌの０．
９％塩化ナトリウム−０，１％ウシ血１ｎ７ｉｖｉ　ミ
７−０．０４Ｍ　！ｊ　７Ｍ緩％液（ｐＨ７）（以下緩
衝液Ａという）で洗い出して最終容量８■ｌとなしたも
のを酵素ＩＩ諭抗原液として冷所保存する。

参考例２　　　Ｅｌｌ演法よる化合物［目の定量試　　
薬 ■標準抗原溶液 化合物〔１］をメタノールに溶解し、１００μｚｅａｌ
の溶液となす、用時、これを緩衝液Ａで希釈して標準抗
原溶液となす。

■酵索標議抗原溶液 実施例２で得た酵素Ｗ識抗原液を緩衝液Ａで１００倍希
釈する。

■抗体溶液 参考例！で得た抗血清をｖＩｉ衝液Ａ″ｌ？　１０００
倍希釈する。

０不溶化第二抗体溶液 抗つサギＩｇＧヤギ血清（マイルス社製）と乳酸菌（ラ
クトバチルス　プランタラム　＾ＴＣＣ−８０１４）ノ
細胞壁とをグルタルアルデヒドを用いて特開昭５２−１
１７４１！１号明細四の実施例１に開示された方法に準
じて結合し、調製する。

■洗浄液 ０．９％塩化ナトリウム水溶液 ■蛍光酵素基質溶液 ０．１５ｍ　Ｍ　４−メチルウンベリフェリル　β−Ｄ
−ガラクトビラ／シトー１ｍＭ塩化マグネシウム−緩衝
液Ａからなる溶液。

■反応停止溶液 ０．１Ｍリン酸カリウム−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ
ｌｌ） 操　　作 試験管に被検体液１００μ！、試薬■１００μｌ右よび
試薬■Ｉ００μ！をとり混合し、３７℃で４置する。３
０分後、試薬０２００μ！を加え同温度でさらに４置す
る。１５分後、試薬■４■ｊを加えた後、１０分間遠心
分順（３０００ｒｐｍ）する、上清を除去後、沈殿に５
００μｌの緩衝液Ａおよび１００μｌの試薬Ｏを加え、
３７℃で４置する。　１０分後、試薬■２．５ｍｊｌを
加え、励起波長３０５　ｎｍ、蛍光波長４４８ｎ■にお
ける蛍光強度を測定する。

参考例３　　交差反応と標準曲線 被検体として種々：ａｒＩＫの化合物［１１または種々
濃度の下記化合物ａないしＣを用い、参考例２同様のＥ
ｌ＾を行い第１図の結果を得た。第１図に示すように化
合物Ｅ目と化合物ａ〜Ｃの間には交差性は認められなか
、た、なお、ｍ１図における化合物〔目についての腺は
標準曲線に相当する。

化合物ａ（化合物［１］の代謝物） ３−カルボキシ−１，２−ベンズイソオキサゾール 化合物ｂ（化合物［１］の代謝物） ３−（Ｎ−アセチルスルファモイルメチル）−１，２−
ベンズインオキサゾール 化合物Ｃ（化合物【１］の異性体） ２−スルフ１モイルメチル−１，３−べ／ズイソオキサ
ゾール 参考例４　　　血清中の化合物〔１１の定量化合物［１
］を含ａするヒト血清の３検体をＧ樹液Ａで５０〜８０
０倍まで希釈し、これを参考例２のＥ１Ａ法で測定した
。その結果、希釈倍数と測定値の間には原点を通る直線
関係が成立することが認められた。またこのヒト血清検
体に試験管あたり２０ｎｇの化合物［１］を添加したも
のについてＥ１＾法で測定した。その結果、添加回収率
は平均９９．８％と良好であった。

参考例５　　　１１ＰＬＣ法とＥ１＾法との比較３４例
のヒト血清中の化合物［１］をＥ１＾法ならびにＩＩ　
Ｐ　Ｌ　Ｃ法（高速液体クロマトグラフィー法）で測定
した。その結果、画法には良好な相関関係が成立すこと
が認められた。

比較例１ 次の試薬を用いるほかは参考例２と同様な方法（比較法
）で患者［１ｉＩｉｎ中の化合物［＋］を定量した。

抗体二次の結合物を動物に投与して得られた抗体（式中
ｎＳ＾は牛血清アルブミ／残基を意味する。） 酵素標識抗原： （式中β−Ｄ−Ｇａｌはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ残基
を意味する。） また同一検体について参考例２のＥｌＡ法（本発明法）
およびＨＰ　Ｌ　Ｃ法によっても化合物［１］を定量し
た。その結果を次表に示す。

前装に示すように、本発明法による定量結果はＩＩ　Ｐ
　Ｌ　Ｃ法のそれと極めてよ（一致した。しかし比較法
は、　ＨＰＬＣ法と必ずしも一致、しなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体に対する化合物［１］および化合物［１］
の構造類似化合物の交差性を表わす。 特許出願人　　　大日本製薬株式会社 代　　理　　人　　　　　小　　島　　−晃第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔは蛋白質残基を意味し、Ｘは結 合基を意味する］ で表わされる蛋白質結合ハプテン。 ２）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＴおよびＸは前掲と同じものを意 味する］ で表わされる特許請求の範囲第１項記載の蛋白質結合ハ
   プテン。 ３）Ｔがウシ血清アルブミン残基である特許請求の範囲
   第１項記載の蛋白質結合ハプテン。 ４）Ｔが酵素残基である特許請求の範囲第１項記載の蛋
   白質結合ハプテン。 ５）酵素残基がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ残基である特
   許請求の範囲第４項記載の蛋白質結合ハプテン。