JPS63188399A - 標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置 - Google Patents

標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置

Info

Publication number
JPS63188399A
JPS63188399A JP62268030A JP26803087A JPS63188399A JP S63188399 A JPS63188399 A JP S63188399A JP 62268030 A JP62268030 A JP 62268030A JP 26803087 A JP26803087 A JP 26803087A JP S63188399 A JPS63188399 A JP S63188399A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
target
probe
support
sample
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP62268030A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2975603B2 (ja
Inventor
マーク・レオ・コリンズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BP Corp North America Inc
Original Assignee
BP Corp North America Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BP Corp North America Inc filed Critical BP Corp North America Inc
Publication of JPS63188399A publication Critical patent/JPS63188399A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2975603B2 publication Critical patent/JP2975603B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/025—High gradient magnetic separators
    • B03C1/031—Component parts; Auxiliary operations
    • B03C1/033—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit
    • B03C1/0335—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit using coils
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/288—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the outer circumference of a recipient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/30—Combinations with other devices, not otherwise provided for
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/18—Magnetic separation whereby the particles are suspended in a liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Silicon Compounds (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明〕 発明の背景 本発明はターゲット分子捕捉に使用するための方法試薬
、組成物、キット、および装置に関する。
詳しくは、本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または
リボ核酸（ＲＮＡ）を臨床試料から捕捉するための方法
、試薬、組成物およびキットに関する。本発明の態様は
非放射性標識技術および自動化に適した臨床試料中の核
酸ターゲットを迅速鋭敏な検出のための方法を提供する
。
下記の定義は本発明の理解を容易にするため提供される
。本適用中に使用される“生物学的結合対”の用語は自
然の親和力または結合能力を示すいずれかの分子対を指
す。本適用のため、“配位子”の用語は生物学的結合対
の中の一分子を指し、“抗配位子″または“受容体”の
用語は生物学的結合対の反対分子を指す。例えば、無制
限に本発明の態様は生物学的結合対がポリ核酸の２個の
補足的成分を包含する核酸混成検定に適用される。
成分の−は配位子を指し、他の成分は抗配位子を指す。
然しなから、生物学的結合対には抗原および抗体、医薬
および医薬受容体の位置および酵素と酵素基質が包含さ
れる。
“プローブとの用語はターゲット抗配位子に選択的に結
合できる既知の性質の配位子を指す。
核酸に適用する時“プローブの用語はターゲット成分に
補足的な塩基配列を有する核酸の成分を指す。
“標識”との用語は検出できる分子部分を指し、実施例
で無制限に放射性同位元素、酵素、発光剤および染料を
包含する。“試薬”の用語は広義に使用され検出反応に
導く反応に加わるいずれかの分子成分を包含する。“共
因子“の用語は広く使用され試薬との反応に加わるいず
れかの成分を包含する。
“回収可能”の用語は広い意味で媒体中に実質的に分散
され、媒体から不動化、ン濾過、分配等により除去また
は分離できる実態を述べるので使用される。
“支持体”の用語は単独で使用する時、フィル＝　１１
− ターおよび膜、並びに回収できる支持体の如き通常の支
持体を包含する。
“可逆性“の用語は配位子および抗配位子に関して、配
位子および抗配位子の全体の化学的性質を永久的に変え
ることのない変化を与える際結合または放出できること
を意味する。例えば、制限なしに、可逆結合に配位子、
または抗配位子を破壊しないｐＨ１温度およびイオン強
度の変化により調節されるような結合または放出が包含
される。
遺伝情報は生細胞のＤＮＡの細い分子中に保存される。
生体内で、ＤＮＡ分子は二重のらせんでその各成分はヌ
クレオチドの連鎖である。各ヌクレオチドは４塩基の一
つが特徴である。即ちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）である。この塩基
は官能基の配向により、ある塩基対が水素結合により引
寄せられ、結合する意味で補足的である。ＤＮＡ中の一
つの成分アデニンは反対の補足成分中のチミンと対とな
る。ＤＮＡ中の一成分のグアニンは反対補足成分中のシ
トシンと対となる。ＲＮＡにおいて、＝　１２− チミン塩基は反対の補足成分中のシトシンと対となるウ
ラシル（Ｕ）により置換される。
ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチドの共有結合連鎖から
なり、ＲＮＡはリボヌクレオチドの共有結合連鎖よりな
る。活性有機体の遺伝コードは塩基対の連鎖中のＤＮＡ
成分に保持される。
各核酸はヌクレオチドの糖の５個の主要ヒドロキシル基
と隣接のヌクレオチドの糖の３個の主要ヒドロキシル基
との間のリンダイジェスタ−により架橋される。天然に
存在するＤＮＡまたはＲＮＡの各直鎖成分は５個の主ヒ
ドロキシル基を有する１個の終端と３個の主ヒドロキシ
ル基を有する今一つの終端を有する。ポリヌクレオチド
の末端は夫々の遊離のヒドロキシルに関して５主要終端
または３主要終端のように称せられる。
ＤＮＡおよびＲＮＡの補足成分は一つの成分の３主要終
端が反対成分の５主要終端に配位しかつ結合する反平行
錯体を形成する。核酸混成化検定は補足領域で２つの拡
散成分が対となる傾向に基づいている。現在、核酸混成
化検定は核酸の混合物中または核酸成分の混合物中完全
なりＮＡ分子中の唯一のＤＮＡまたはＲＮＡベースの順
位または特定の遺伝子を検出かつ同定するのに主として
使用される。
組織または培養試料から抽出した全ＤＮＡまたはＲＮＡ
内で唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ順位または特定の遺伝子
の同定は生理学的または病理学的条件の存在を示す。詳
しくは、ヒトまたは動物組織から抽出した全ＤＮＡまた
はＲＮＡ内の唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ順位または特定
の遺伝子の同定は錐状赤血球貧血、組織相容性、癌およ
びぜんがん症状態または細菌またはウィルス感染の如き
遺伝的疾病または症状の存在を示す。細菌培養またはバ
クテリアを含有する組織から抽出した全ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ中の唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ順位また特定の遺伝
子の同定は抗生物質耐性、トキシン、ウィルスまたはプ
ラスミドの存在を示し、またはバクテリアの種類中の同
定を与える。
従って、核酸混成化検定は疾病の診断および検出におい
て非常に重要性を持つ。更に、核酸混成検定がバクテリ
アを生成する植物病原また毒素を検出するのに使用され
る農業または食品加工に潜在性がある。
最も広く使用される核酸混成化検定法の一つはサザーン
汚点ン濾過混成化法または簡単にサザーン法として知ら
れるＣＢ、　５ｏｔｈｅｒｎ、　ｊ、　ｍｏｌ、　Ｂｉ
ｏｌ。
１　、９８．５０３　（１９７５））サザーン法はター
ゲットのＤＮＡまたはＲＮＡ順位を同定するのに使用さ
れる。この方法は一般に試料ＲＮＡまたはＤＮＡをニト
ロセルロースシートに固定することにより実施される。
固定化された試料ＲＮＡまたはＤＮＡは検出できる放射
性成分を保持するターゲット順位に補足的なベース順位
を有する放射性標識した検体成分に接触する。検体と試
料ＤＮＡの間の混成化を起こさせる。
混成化法は一般に非常に特定的である。もし２つのヌク
レオチドの本体が実質的補足的塩基の対の組織を共有し
なければ標識した検体は試料ＤＮＡまたはＲＮＡと混合
しない。混成化は与えられた条件により３〜４８時間に
起きる。
然しなから、実際問題として検出に際して“バックグラ
ウンド雑音“として現われる標識されたプローブと支持
体の非特定の結合が常にある。
バックグラウンド雑音は検定の感度を減少する。
混成しないＤＮＡ検体は後に洗い去られる。ニトロセル
ロースシートはＸ線フィルムのシート上に置かれ、露光
される。Ｘ線フィルムはＤＮＡ検体に混成され、従って
問題の塩基対の配列を持つＤＮＡ断片を確認するフィル
ムの露出した部分により現像される。
サザーン検定技術と共に放射性標識剤の使用で臨床試料
に核酸検定が応用できる。放射性の崩壊は異質のタンパ
ク質および有機材料を含有する臨床試料においても検出
できる。然しなから、異質のタンパク質および有機材料
の存在は固体支持体に検体の非特定結合に帰因する。更
に、放射性標識技術の使用はＸ線フィルム上のバンドを
視覚化するため長時間の露出を必要とする。代表的なサ
ザーン法は露出に１〜７日を要する。更に、放射性標識
剤の使用は特定の研究室および許可が必要である。
放射性同位元素の標識を包含する検定に関連した上記の
問題は非同位元素の標識を使用する技術改良に導いた。
非同位元素標識の実例には酵素、発光剤および染料が包
含される。発光剤標識は外部のエネルギー源によ、る刺
激に基づき光を放射し、刺激エネルギー源により下記の
範躊に類別される。
即ち、高エネルギー粒子からエネルギーを誘導する放射
性発光、化学反応からエネルギーを得る化学発光、刺激
エネルギーが生物学的系に応用される生物発光および赤
外、可視または紫外光の電磁放射（ホトン）の単位によ
り刺激可能である光発光体または蛍光体標識である。一
般にはスミス等のＡｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　１８．２５３．２７４　（１９８１年）参照のこ
と。
非放射エネルギー源による刺激性の標識を使用する非同
位元素技術検定は放射性同位元素標識検定技術に出会う
健康の危険や認可が避けられる。
更に、非同位元素検定技術はＸ線フィルムの使用に関連
する長時間露出を避は迅速な検出が約束される。
然しなから、非同位元素検定は信頼性を考慮する必要の
ある検定法に感度および特殊性が与えられなかった。発
光体検定では、生物学的試料に保持されたタンパク質お
よび他の分子の存在が刺激光の散乱を起したり、または
発光体標識の発光スペクトルに光を吸収し発光検体の消
滅を生じた。
酵素検定では、生物学的試料に保持されたタンパク質お
よび他の分子の存在が酵素の活性に干渉する。
同様に、比色検定では色の変化が生物学的試料に保持さ
れたタンパク質および他の材料について検出できない。
本発明の態様は支持体および磁性粒子を包含する回収可
能の支持体」二のターゲットおよびバックグラウンド捕
獲に関する。磁性物質は有機化合物の合成用の支持体が
示されＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドの如きオリゴマー
および限定された配列を有する他の多単位の分子が包含
される。例えば、ステーベンΦニー、およびジエネティ
ックスインスチチュートによる欧州特許出願第８３１１
２４９８．８を参照のこと。然しなから、磁性粒子はタ
ーゲットおよびバックグラウンド除去に対し回収可能の
支持体として示されなかった。
磁性粒子の他の利用には、血液中の磁性流体。
アールΦノイバウェル、　ＪＥＥＥ　ｔｒａｎｓａｃｔ
ｉｏｎｓ　ｏｎｍａｇｎｅｔｌｃｓ　ＮＡＧ−９，４４
５（１９７３年）；生物分子の分離のための官能基の付
着、アイ・ギアバーによる米国特許第３．９７０，５１
８　、細胞表面摂取体の標識。
ニス・マーゲル等、　Ｊｏｕｒ、　Ｉｎ＋ｍ　ｍａｔｈ
、　２８　：　３４１−５８　（１９７９年）、治療中
磁性ターゲットのための医薬の付着、ニーセンエイ等、
　　Ｊ、　ａｌ）Ｉ）、　ｐｈｙｓ。
４９　（８）　３５７８　　（１９７８年）、ケーウィ
ーダー等。
Ｐｒｏ、　Ｓｏｃ、　ｏｆ　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏ、　ｍｅ
ｄ、　５８　：　１４１　（１９７８年）、ケイ・モス
バッハ及びニー・シュレッター。
ＦＥＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ　１０２　：　１１２　（１
９７９年）；ウィルス。
バクテリアおよび他の細胞の選択的分離、アールΦモル
デー等、　　Ｎａｔｕｒｅ　２６８　：　４３８　　（
１９７７年）および生物学的ポリマーに対するゲル親和
力クロマドグラフィーにおける支持体として磁性粒子の
混合、ケイ・モスバッハおよびエル・アンダーソン、　
　Ｎａｔｕｒｅ　２７０：３５９　　（１９７７年）が
包含され、これらは参考に本明細書中に包含した。
通常の非回収性支持体にターゲット捕獲を与える二検体
システムの使用がアン・クリスチンシウエンネン、マツ
ティラークソネンおよびハンス・セーダールンドによる
著書の論文中“親和力ベースの収集による核酸混成体の
迅速定量”と題する論文に示された。　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　ａｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ発明の要約 本発明の目的は問題のターゲット分子の検定を遂行する
ために方法、試薬、成分、用具および装備を提供するこ
とである。その他の目的は以後に公開する。便宜上、制
限は無いが本発明の態様はターゲット捕獲、バックグラ
ウンドの捕獲およびそれらの組合わせの分野に類別でき
る。
最初にターゲットの捕獲に向けると、本発明の態様ター
ゲット分子を単離する捕獲と放出サイクルを特徴とする
。この方法は潜在的にターゲット分子を含有する試料媒
体をプローブおよび会合されるまたは結合条件下に少な
くともプローブと会合できる第一の支持体と接触させる
ことを包含する。プローブはターゲット分子に選択的に
可逆的に結合でき検体と回収できる第一支持体とを包含
する錯体を形成する。次いで、支持体は試料媒体から分
離され、第二の媒体に接触せしめられる。
次に支持体は放出条件を受けてターゲットを支持体から
放出し、かつ支持体は第二の媒体から分離される。次い
で、第二の支持体は結合条件下に第二の媒体に接触され
る。第二の°支持体はターゲット分子に選択的に結合で
きる少なくとも一つのプローブと会合されるか会合でき
る。結合条件下でターゲットは更に処理のため第二の支
持体に会合した検体と錯体を形成する。
好ましくは、第一の支持体はそれが試料媒体中で実質的
に均質的分散ができ、かつ実質的に分離され、回収され
るか試料媒体中に不動化される点で回収可能となる。
第一の媒体から第一の支持体の分離により第一の支持体
に付着した非特定的に結合した細胞の砕片が分離する。
更に、第二の支持体へのターゲット分子の結合により検
出のためにターゲットが濃縮され、更に一層精製するた
め放出−捕獲のサイクルがＩ−ｉ、えられる。
更に、本性の態様は回収可能の支持体を特徴とする。こ
の方法はターゲットの核酸を潜在的に保持する試料を検
体の成分に関連して回収可能の支持体と接触することを
包含する。回収可能の支持体は試料媒体内で実質的に均
質分散ができる。プローブ成分は実例としては、プロー
ブ成分を回収可能の支持体に共結合させることにより、
親和力会合、水素結合または非特定的会合により回収可
能の支持体に会合される。
支持体は多くの形態をとることができ、実例として、特
定の形態に縮少し、かつ篩を通過するに際し回収可能な
ニトロセルロース；磁場の適用中試料媒体中にニトロセ
ルロースを移動させる磁性粒子等を充填したニトロセル
ロースまたは材料；清遊されまたは電磁性を示すビーズ
または粒子；−２２＝ および水性媒体の表面に分配するポリスチレンビーズが
包含される。
本発明の好ましい態様には試料媒体中に実質的、均質に
分散する能力を特徴とした磁性ビーズからなる回収可能
の支持体が包含される。好ましくは、磁性ビーズはプロ
ーブ本体を磁性支持体粒子に結合または会合を容易にす
る第一アミン官能基を包含する。磁性支持体ビーズは１
個の丸い磁石で残留磁気を示さぬ超常磁性が好ましい。
第一検体は結合条件下に抗配位子に特定的に結合できる
検体配位子成分を包含する。回収可能の支持体は試料媒
体中で実質的に均質分散でき、結合条件下に配位子に結
合しターゲット−検体支持体錯体を形成できる少なくと
も１個の抗配位子成分を包含する。
次に、回収可能の支持体と試料媒体とは分離され試料媒
体は更に処理される。
本発明の態様は異質材料を含有する臨床試料からターゲ
ット分子を捕獲するのに適する。試料媒体を検体または
回収可能の支持体と接触させる順位は選択の問題である
。然しなから、その選択は一方では検体とターゲットの
間で、かつ他方では検体配位子と支持体抗体との間の結
合の動力学により影響される。
ポリヌクレオチドターゲット分子およびホモポリマー配
位子と抗配位子に適用した時、ホモポリマー配位子およ
び抗配位子の結合は一般にターゲットに結合する配位子
より早い。ターゲットへのプローブの結合は支持体抗配
位子に結合される。
好ましい態様には試料媒体の試薬との接触および混成条
件に混合物を移すことが包含される。次に回収可能の支
持体は試薬と試料媒体中に分散され、検体支持体錯体の
形成に先行してターゲット−検体錯体を形成せしめる。
更に、本発明の態様はプローブ多段システムを特徴とす
る。この方法は前記のように試薬は第一検体およびター
ゲット分子に結合できる少なくとも一つの第二検体を包
含し、かつ検出できる標識成分を有する試薬を包含する
ことが好ましい。
試料媒体から回収可能の支持体を分離する工程はターゲ
ット−（第一および第二）検体−支持体錯−２４一 体から異質の材料を分離するのみならず、ターゲットに
結合されない第二検体も分離する。ターゲットに結合さ
れない第二検体はバックグラウンド雑音の基になり、に
せ信号がターゲットの存在を示す。
更に処理には回収できる支持体からターゲット（第一お
よび第二）プローブ錯体を第二媒体中に放出し、ターゲ
ット（第一および第二）検体錯体を新支持体に再結合す
ることが包含できる。第一回収可能の支持体は検定法に
干渉できる非特定的に結合した材料を保持できる。従っ
て回収できる支持体からのターゲット−検体錯体の放出
および回収できる支持体除去の後に、プローブ配位子に
結合できる抗配位子成分を有する第二の支持体は結合条
件下にターゲット−検体錯体に接触せしめることができ
更にターゲット−検体錯体の精製および濃縮のためのタ
ーゲット−検体の結合または捕獲のサイクルを更に与え
る。
更に、処理にはバックグラウンド捕獲が包含される。
更に本発明の態様には第二検体が第二配位子成分を含有
する方法が包含される。更にこの方法は第二抗配位子成
分を有するバックグラウンド支持体を包含第二配位子成
分および第二抗配位子成分は第二検体がターゲット分子
に結合する時だけ結合条件下に安定に結合できる。更に
この方法はターゲットに結合されない第二検体を潜在的
に含有する媒体を結合条件下にバックグラウンド支持体
に接触させる工程を包含する。次に、バックグラウンド
支持体は媒体から分離されバックグラウンド雑音を減少
する未結合の第二検体を除去する゛。
“バックグラウンド支持体”の用語はフィルターおよび
膜並びに回収できる支持体を包含する通常の意味に使用
される。バックグラウンドへの結合は放出性である必要
はない。
好ましい回収可能の支持体に実例として、制限なく、媒
体内で分散、媒体からの分離のできる粒子、顆粒、ビー
ズ、が包含される。分離の方法は実例として制限なく濾
過、遠心分離、沈殿、表面＝　２６− 浮撰、沈降または電磁場の導入が包含される。
本方法はポリヌクレオチドターゲット分子に応用できる
。好ましくは、第一および第二プローブはターゲットま
たは検体が不動化される状態に反する“溶解した”ポリ
ヌクレオチドターゲット素速く結合する。
溶液中に実質的に分散できる回収可能の支持体は“溶解
した”混成に似態の検体と回収可能の支持体の間で相互
作用できる。溶解すると混成は約３〜１５分で完了する
。本方法の迅速な混成と簡易とは自動化を可能にする。
本方法は非同位元素標識技術を応用でき臨床試料中に含
有された核酸列を異質材料から分離できる。
ターゲット分子がポリヌクレオチドである本方法の態様
には結合条件下に試料媒体の試薬との接触が包含される
。試薬には少なくとも１個の第一ポリヌクレオチド検体
と少なくとも１個の第二ポリヌクレオチド検体が包含さ
れる。第一の検体はターゲット分子と錯体を形成でき第
一のホモポリマー配位子成分を有する。第二検体は第一
検体の外にターゲット分子と錯体を形成できる。第二検
体は第一検体の第一ホモポリマー配位子以上に異なる第
二ホモポリマー配位子成分を有する標識成分を包含する
。次いで、試薬および試料媒体はバックグラウンド支持
体およびターゲット捕獲支持体と接触せしめる。バック
グラウンド支持体は前記第二プローブがターゲットに結
合されぬ時、第二ホモポリマーに結合できる少なくとも
１個の第二ホモポリマー抗配位子成分を包含する。ター
ゲット捕獲支持体は第一プローブの第一ホモポリマー配
位子成分に結合できる少なくとも１個の第一ホモポリマ
ー成分を包含する。バックグラウンド支持体およびター
ゲット捕獲支持体はバックグラウンド雑音を除去し、更
に、ターゲット支持体は更に処理するためターゲット−
（第一および第二）検体錯体を濃縮して細胞のぼたから
ターゲット−（第一および第二）検体錯体を分離する。
更に処理にはターゲット分子の存在を示す標識成分の検
出が包含する。
さてバックグラウンド捕獲に関する本発明の態　２８一 様に特に転すると１態様に検体およびターゲットが錯体
を形成できる方法が包含される。次に錯体の形成されぬ
検体を結合条件下に支持体に接触させる。支持体は未結
合検体と選択的に結合ができる。次に、支持体は検体−
ターゲット錯体から分離する。
更に尚本発明の態様に更に処理のため多数のターゲット
を分離する方法が包含される。
一つの態様は多数の支持体上のターゲット分子に特定の
プローブの連続添加および除去が包含される。更に態様
は試料を第一シリーズのプローブに接触せしめ、かつ多
数の支持体上のターゲットとプローブの捕獲が包含され
る。第一シリーズのプローブは支持体と会合できる配位
子を包含する。
第一プローブシリーズは各ターゲット分子に特定の支持
体に結合できる多数のターゲット全てに対するプローブ
を包含する。支持体は互に分離でき、その分離は支持体
により分離される個々のタイプのターゲット分子を与え
る。
更に本発明の態様には試薬組成が包含される。
試薬組成には第一プローブと第二プローブが包含される
。第一プローブはターゲット分子と錯体を形成し、特に
結合条件で抗配位子に結合できるプローブ配位子成分を
包含する。第二プローブはターゲット分子と錯体を形成
でき検出できる標識成分を包含する。試薬組成は抗配位
子成分を有する回収できる支持体と共に使用する時、試
料媒体中のターゲットを捕獲し検出するのに使用できる
。
更に本試薬組成の態様には第二プローブがターゲット分
子に結合されぬ状態で抗配位子のみに安定して結合でき
る第二配位子成分を有する第二プローブを包含する。試
薬組成は未結合第二プローブを潜在的に含有する試料を
第二配位子成分を有するバックグラウンド支持体と接触
せしめることによりバックグラウンド雑音を減少せしめ
る。
更に態様はオリゴヌクレオチド配位子をプローブに結合
するのに適したオリゴヌクレオチド抗配位子を有する試
料媒体中に実質的に均質分散できる支持体を包含する。
支持体の好ましい態様には実例として分離できる粒子、
顆粒、フィラメントおよびビーズが包含される。分離の
手段には実例として制限無く沈殿、沈降、浮撰、濾過、
遠心分離および電磁石が包含される。
好ましい態様には直径１０〜１００ミクロンのポリスチ
レンビーズが包含され濾過または浮撰により媒体から実
質的に均質分散および分離ができる。
今一つの好ましい態様には鉄磁性ビーズが包含される。
鉄磁性ビーズはＢｉｏ−ＭＡＧの商標で市販され、水性
媒体中に実質的に均質分散でき、電磁場により回収また
は不動化で、きる。鉄磁性ビーズにはアミン反応性被覆
剤で被覆された鉄心が包含される。そのビーズは一般に
球形で１ミクロンの直径を有する。ポリスチレンおよび
鉄磁性ビーズは抗配位子成分を包含するように処理され
る。
更に本発明の態様には生物学的結合対の部分であるター
ゲット分子の検定を遂行するためのキットが包含される
。ターゲットが特定の塩基列を有する場合は、キットは
試薬が第一ポリヌクレオチドプローブおよび第二ポリヌ
クレオチドプローブを包含する試薬を包含する。第一お
よび第二のプローブは両プローブがターゲットに結合さ
れるターゲットの相互に独占部分に結合して錯体を形成
できる。第一のプローブは結合条件下に第一の支持体に
可逆的に結合でき、第二プローブは検出できる標識成分
を包含する。キットには更に支持体をターゲットと錯体
を形成させる第一の支持体および試料媒体から選択的に
分離できるプローブが包含される。
更に本キットの態様には第二プローブとバックグラウン
ド支持体が包含される。第二プローブはターゲットに結
合されない時はバックグラウンド支持体に選択的に結合
できる。バックグラウンド支持体は試薬を包含する媒体
から分離することができ非特定的に結合した第二プロー
ブを除去する。
更に本発明の態様には本方法により検定を遂行するため
の装置が包含される。ターゲットがポリヌクレオチドで
ある場合に、装置には実質的に混合した均質状態の試薬
およびターゲットを入れるのに適した反応室が包含され
る。試薬は第一および第二ヌクレオチドプローブを包含
する。各プローブは各プローブが錯体を形成するターゲ
ットの相互に独占部分に結合でき両プローブはターゲッ
トに結合される。第一プローブは結合条件下に第一の支
持体に可逆的に結合でき、第二プローブは検出できる標
識成分を包含する。更に装置には第一の支持体を試薬と
試料に接触させる手段を包含し、第一プローブとターゲ
ット−プローブ錯体が支持体を結合せしめる。更に装置
には試料、試薬および支持体に結合状態にさせ支持体に
結合したターゲット−プローブ錯体を形成させる手段を
包含する。更に装置には第一のプローブを解放状態にさ
せる手段を包含する。最後に装置は試料および試薬から
支持体を分離する手段を包含する。
“反応容器”の用語は実例として制限なしに槽、試験毛
細管等を、包含するいずれかの収納手段を　゛包含する
広い意味に使用される。
試料、試薬および支持体を結合状態にしまたは試薬およ
び支持体を解放状態に置くための適当な手段は実例とし
て試料試薬および支持体の温度を上昇または低下しポリ
ヌクレオチド成分を変性または焼なまずことのできる温
度調節を包含する。
支持体を試薬または試料から分離する適当な手段は実例
として磁性ビーズと共に使用する電磁石、固着支持体に
固定された繊維、ポリスチレン顆粒等と使用する遠心分
離機を包含する。
更に本発明の態様には結合状態で試薬およびターゲット
をバックグラウンド支持体と接触させ、第二プローブが
ターゲットに特に結合されない標識成分を有するいずれ
かの第二プローブを除去する手段を包含する。
発光標識成分と共に使用に適した本装置の態様には適当
な標識刺激手段を包含する。蛍光標識成分と共に使用す
る装置には適当な波長限定するフィルターを有するレー
ザーまたは光発光部材を包含する。化学発光標識成分と
共に使用する装置には共因子を反応室に噴射する噴射装
置が包含される。
さて図解によって本発明を描いた図面、特に第１図に転
すると必要な試薬組成と共に手順の方法がポリヌクレオ
チド成分の検定に対し図式形体で説明される。通常の検
定技術には多くのターゲット成分が包含され、多くのプ
ローブ成分が使用される。然しなから、本発明の理解を
簡単にするため説明はわずかに限定された数のプローブ
、支持体本体およびターゲットを示す。第１図は回収で
きる支持体を利用する方法を特徴とする。
第１図に説明した検定の工程１は説明として細胞を含有
する臨床試料で開始する。細胞は潜在的にターゲットの
核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを保持し、病源、遺発生状態
または望ましい遺伝子の特徴を示す特に問題の基本順位
を有する。臨床試料はいずれかの排せつ物または大便、
尿、だ液、膿、血精、プラズマ、眼のレンズ液、背骨液
、リンパ液、生殖洗液等の如き生理学的液体から得られ
る。
個々の当業者は技術上既知の手段により生検試料を１個
の細胞懸濁液または少塊に縮少することを希望する。例
えば、固体組織の生検試料は生検試料を０．５Ｍの塩化
ナトリウム、ｉｏ＋ｎＭの塩化マグネシウム、Ｏ，１４
ＭのｐＨ６、８の緩衝液を２５ｍｇ／ｍｌのシクロへキ
シラミドの混合物中で撹拌することにより単一細胞懸濁
液または細胞塊に効果的に縮少できる。差動遠心分離、
密度勾配遠心分離または他の方法の如き確立された方法
による特定細胞タイプの単離もまたこの工程に応用でき
る。
細胞は次にそのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを遊離させ
るため処理される。化学的溶解も技術上周知である。化
学的溶解は希釈アルカリ例えば０．１〜１．０Ｍ水酸化
ナトリウムにより実施できる。
アルカリはまたＤＮＡまたはＲＮＡの変性に役立つ。他
の変性および溶解剤には高温、有機試薬、例えばアルコ
ール、アミド、アミン、尿素、フェノールおよびスルホ
キシドまたはある無機イオン、例えば、トリフッ化酢酸
ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナト
リウム、グアニジンイソチオシアナート、ヨウ化ナトリ
ウム、ヨウ化カリウム、ナトリウムイソチオシアナート
およびカリウムイソシアナートの如きチャトロープ（ｃ
ｈａｒｔｒｏｐｉｃ）塩が包含される。
臨床試料もまた更に容易に処理される分離したセグメン
トにＤＮＡまたはＲＮＡを分割するため種々の制限エン
ドヌクレアーゼを受けさせられる。
試料処理工程の完了時に臨床試料は試料核酸、細胞ぼた
および不純物を包含する。以前に試料核酸は細胞ぼたお
よび不純物からフィルターまたは膜に核酸を非特定的に
結合し、かつフィルターまたは膜から細胞のぼたおよび
不純物を洗浄することにより分離された。然し実際には
若干の細胞のぼたおよび若干の不純物並びに非ターゲッ
トの核酸は非特定的にフィルターまたは膜に結合され洗
浄により除去されない。
工程１に説明される本発明の態様はターゲットの核酸を
潜在的に保持する試料をプローブ成分と会合する回収可
能の支持体と接触させることが包含される。回収可能の
支持体は試料媒体内で実質的に均質分散できる。プロー
ブ成分は実例としてプローブ成分の回収可能の支持体へ
の共結合により、親和力会合、水素結合または非特定的
会合により回収可能の支持体に会合できる。
支持体は多くの形態が採られ、実例として、粒＝　３７
− 状形態に縮少し、篩を通して支持体を含有する試料媒体
を通過させて回収できるニトロセルロース；磁性粒子を
充てんし磁場を印加した際ニトロセルロースを試料媒体
中に移動させるニトロセルロースまたは材料；濾過でき
または電磁性を示すビーズまたは粒子；および水性媒体
の表面に分配するポリエチレンビーズが包含される。
本発明の好ましい態様には試料媒体中に実質的に均質分
散される能力を特徴とする磁性ビーズからなる回収可能
の支持体が包含される。磁性ビーズは磁性支持体粒子に
プローブ本体の共有結合または会合を容易にする第一ア
ミン官能基を含有することが好ましい。磁性支持体ビー
ズは１個の丸い磁石で、残留磁力を示さぬ超常磁性であ
ることが好ましい。
粒子またはビーズは磁鉄鉱からなるが、たとえそれらは
また他の磁性金属、または金属酸化物、および不純金属
または複合材料形態でもそれらが反応表面積を有し、か
つ磁場に反応する能力を示す限りは可能である。鉄と共
に個々にまたは組合わせて使用される他科はコバルト、
ニッケル、およびケイ素に限定されない。
磁鉄鉱または金属酸化物粒子の製造方法はパンデンベル
グ等の“超微細コバルトフェライトの製造と磁気性質”
、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ　ａｎｄ　Ｍａｇ
ｎｅｔｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓ、　１５−１８　；　１
１１７−１８　（１９８０年）；イー・マティエヴイク
の“単分散金属（含水）酸化物−コロイド科学の魅惑的
分野″、　Ａｃｅ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ。
１４　；　２２−２９　（１９８１年）に開示されてい
るが、これらの開示は参考に本明細書に包含した。
本発明の適用に適した磁性ビーズにはＡｄｖａｎｃｅｄ
Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社によりＢｉｏ−ＭＡＧの商品名で
市販される第一アミン官能基を含有する磁性ビーズがあ
る。好ましい磁性粒子は非多孔性であるが、尚プローブ
成分と会合できる。プローブ成分の会合に包含される反
応位置は他の試薬、不純物および細胞物質の非特定的結
合を防止するため閉塞される。磁性粒子は実質的にコロ
イド懸濁液として存在するのが好ましい。粒子の表面に
会合した試薬および基質およびプローブ成分は直接粒子
を取り巻く溶液中に拡大する。プローブ成分は溶解した
試薬および溶解した基質と反応し、固体支持反応物と会
合した速度より早く溶液反応を特徴とする速度および収
率を持つ。更に、粒子のサイズを減すると粒子容積に対
する表面積の比は増大し、それにより更に官能基および
プローブは磁性粒子の単位重量当りに付着される。
反応性アミン官能基を有するビーズはポリヌクレオチド
と反応しポリヌクレオチドをビーズに共有的に固着する
。ビーズはリン酸ナトリウム緩衝液中で１０％グルタル
アルデヒドと反応し、続いてリン酸塩緩衝液中で工程中
のホスホリル化したポリヌクレオチドのエチレンジアミ
ン付加物と反応する。この工程は下記実験プロトコール
中に極め　　　゛て詳細に記載する。
さて、工程２に転すると、プローブ成分と会合した回収
可能の支持体は臨床試料と接触され、工程３に進行して
結合状態に移される。問題のターゲットに特定なプロー
ブ成分は臨床試料中に存在するターゲット成分に結合さ
れる。試料と試薬媒　４０一 体中に分散された回収可能の支持体はそれらが溶液中に
遊離するようにプローブ成分およびターゲットを混成さ
せる。
プローブのターゲットへの交雑は約１５分で完成される
。対照に、プローブまたはターゲットが媒体中に分散す
る能力を持たぬ支持体上に不動化される混成は３〜４８
時間のように長くかかる。
異質のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞のぼたおよび不純物は支持
体に特定的に結合しない。然しなから、実施方法のよう
に、少量の異質ＤＮＡ、ＲＮＡ。
細胞のぼたおよび不純物は回収可能の支持体を包含する
反応容器中に置かれたいずれかの本体に事実非特定的に
結合できかつ結合する。
本発明の態様は更に臨床試料の精製を容易にし異質のＤ
ＮＡ、ＲＮＡ、細胞のぼたおよび更に不純物をターゲッ
トポリヌクレオチドから除去する。
第１図の工程４は臨床試料の支持体の分離と支持体の第
二媒体への懸濁を示す。第二媒体は従ってポリヌクレオ
チド成分に結合した会合したプローブと共に回収可能の
支持体を包含する。ま−Ａ　１　　　− た支持体へ非特定的に結合した異質のＤＮＡ。
ＲＮＡ、細胞のぼたおよび不純物は回収可能の支持体に
より然かも臨床試料中に最初に見出されたものよりはか
なり低濃度で保持される。当業者は若干の望ましくない
材料は第二媒体中の懸濁に先立って支持体を洗浄するこ
とにより減少できることを認めるであろう。
第二媒体中に懸濁した会合したプローブおよびターゲッ
ト成分と共に回収可能の支持体は工程５に述べられる如
く、更に変性され、回収可能の支持体のプローブ成分か
ら解合させる。変性工程は回収可能の支持体から非特定
的に結合した異質のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞のぼたまたは
不純物を放出したり、しなかったりできる。然しなから
、本発明の工程５で回収可能の支持体は最初に第一の臨
床試料媒体から運ばれた非特定的に結合した細胞のぼた
、不純物および異質のＤＮＡおよびＲＮＡ。
の多くをそれと共に保持する第二媒体から除去できる。
工程６に示される如く、新規の支持体は回収可能の支持
体と会合したプローブ成分上のターゲットポリヌクレオ
チド成分を同様に捕獲する結合状態にある第二媒体に導
入される。新規支持体は実際に、更に非特定的に結合し
たＤＮＡ、ＲＮＡ。
細胞のぼた、および不純物を精製除去する工程に循環し
た後光の回収可能の包含することは当業者に認められる
。従って、第二媒体中に存在する不純物のみが第一支持
体から後に放出され、第二媒体中に溶解または懸濁した
支持体に以前に非特定的に結合されたＤＮＡ、ＲＮＡ、
細胞のぼたおよび不純物を包含する。
然しなから、か＼る不純物は第二の回収可能の支持体を
第二媒体から除去し、かつ、再び回収可能の支持体を更
に媒体中に導入し、元の支持体を変性および除去する循
環を反覆することによりターゲットのポリヌクレオチド
から更に除去できる。本発明中に記載した磁性ビーズは
溶液から引上げ、または溶液が汚染容器に除去または付
加されるような場所保持されることは当業者により認め
られる。
“不溶解動力学”成分に似た反応に関与する磁性ビーズ
の能力により変性およびターゲットへの結合の周期の完
了は３〜１５分で完了される。
十分な精製および濃縮の後、ターゲットは工程８に示し
た技術上既知の発光体または放射性方法により検出され
る。ターゲットを含有する媒体の精製により、非同位体
標識成分は細胞のぼたおよび不純物無しに検出できる。
更に本検定方法の態様である多段プローブ法を特徴とす
る第２図に転すると、前回の臨床試料により可溶化剤お
よび試薬の導入により処理されるポリヌクレオチドター
ゲットを含有する臨床試料による初期が説明される。
第２図に示された検定方法の試薬は第一ポリヌクレオチ
ドプローブ成分（Ｐｌ）および第二ポリヌクレオチドプ
ローブ成分（−Ｐ２）が包含され、両プローブ（Ｐ　お
よびＰ　２　）がターゲットに結合するターゲットと錯
体を形成する第一プローブ（Ｐ　　）は結合条件で回収
可能の支持体（Ｓ□）と会合できる。第二プローブは少
なくとも１個の＝　４４　− 検出できる標識成分を有する。標識成分は図中星印また
は星で示される。変性条件の可溶化剤および試薬を導入
した後、臨床試料を含有する溶液は第一および第二プロ
ーブの形態の試薬および細胞のぼた、可溶化剤、不純物
および異常のＲＮＡ。
およびＤＮＡを包含する。
工程２に説明した結合条件で、第一および第二プローブ
（Ｐ　およびＰ２）はターゲットの相互■ に特定の部分に結合する。溶解したターゲットにプロー
ブ（Ｐ１＋Ｐ２）の混成迅速で、かつ固体支持体との会
合により害されない。ターゲットの第一および第二プロ
ーブ成分（Ｐ　およびＰ２）■ への結合を保証する過剰のプローブを使用した。
然しなから、たとえ過剰のプローブ（ＰｌおよびＰ２）
が使用されなくとも、若干のプローブはターゲットの発
見ができず、試料媒体中に未混成が残留する。標識成分
を有する未混成の第二プローブ（Ｐ２）はもし検出中に
存在すればバックグラウンドを構成する。
第一プローブ（Ｐｌ）は支持体上で抗配位子成分に結合
できる配位子により支持体（Ｓｌ）に結合できる。配位
子（Ｌｌ）は実例としてホモポリマーからなる足部分を
包含する。支持体（Ｓｌ）は配位子（Ｌｌ）を受容かつ
結合できる抗配位子（Ａ　）を包含する。抗配位子（Ａ
１）は実例としてプローブ（Ｐ　　）の配位子（Ｌｌ）
を補足すす るホモポリマーを包含する。
工程３に転すると、結合条件下で支持体（Ｓｌ）の抗配
位子成分（Ａ１）は自身がターゲットに結合し、第二プ
ローブ（Ｐ２）に架橋する第一のプローブ（Ｐｌ）の配
位子成分に会合または結合する。支持体は多くの形態を
取ることができる。
ビーズまたは粒状支持体は溶液中に分散し溶液動力学に
近いことを示すターゲット、プローブ反応物との結合に
加わる。更に、回収可能のビーズおよび粒状支持体はプ
ローブ−ターゲット錯体を不溶性ぼたから多くの通常の
フィルターまたは膜に固（ｆの閉塞問題無しに分離でき
る。
然しなから、通常の膜、フィルターまたはセルロース支
持体もまた閉塞が問題でない若干の応用に使用できる。
不溶解のプローブ−ターゲットの迅速な混成により、固
形の非ビーズまたは非粒状膜またはフィルター支持は反
応容器中に包含される。試薬および試料の溶液は支持体
を通過できターゲット捕獲に影響する。支持体（Ｓｌ）
は第２図中回収可能の支持体として示される。未結合第
一および第二プローブ成分、未結合ターゲット可溶化剤
、不純物および細胞のぼたはターゲット−プローブ支持
体錯体と共に溶液中にある。標識成分を有する未結合第
二プローブ（Ｐ２）は雑音を構成しターゲットの存在に
似た信号を生成する。少量の異質細胞のぼた、可溶化剤
、不純物およびプローブもまた非特定的に回収可能の支
持体に結合される。
工程４において支持体（Ｓｌ）は臨床試料媒体から分離
される。回収可能の支持体が使用されれば、分離は回収
可能の支持体を反応容器中に不動化することにより、ま
たは回収可能の支持体を試料媒体から直接抜き出すこと
により達成できる。
不動化した支持体は望ましくない材料を減少するために
洗浄できることは当業者が認めている。
さて工程５に移ると、ターゲット−プローブ支持体錯体
は実質的に異質のＲＮＡ、ＤＮＡ。
可溶化剤、不純物および細胞物質が無く、ターゲット分
子の存在を指示する標識成分の存在をモニターできる。
然しなから、少量の異質のＤＮＡ。
ＲＮＡ、可溶化剤、不純物および細胞物質は尚支持体（
Ｓｌ）に非特定的に結合される。更に、ターゲットと会
合しない意味の未結合第二プローブ（Ｐ　　）もまた支
持体（Ｓｌ）に非特定的に結合され、非同位体標識成分
からの信号に影響する。
標識成分を有する第二プローブ成分（Ｐ２）はそれによ
り検定法の正確さを減するバックグラウンド雑音の重要
な原因である。
従って、代わりの工程５のように、第一支持体（Ｓ　　
）は支持体（Ｓｌ）が変性によってターゲット−プロー
ブ錯体から分離される第二の媒体中に懸濁される。
工程６の変性後、第一支持体（Ｓｌ）は第二媒体から除
去され、第二支持体（Ｓ２）に置換される。第二支持体
（Ｓ２）は第一プローブの配位子成分（Ｌ□）に結合で
きる抗配位子成分（Ａ１）を包含する。
工程７に移ると、結合条件下でターゲット−プローブ錯
体は第二支持体（Ｓ２）と再会合する。
第一支持体（Ｓｌ）の除去により検定媒体から第一支持
体（Ｓｌ）に非特定的に結合した異質の材料、ぼたおよ
びプローブが除去される。
工程８で説明されるように、ターゲット−プローブ錯体
を含有する媒体は標識の存在をモニターできる。然しな
から、更に検定媒体の精製が第一の回収可能の支持体（
Ｓｌ）に非特定的に結合された試料媒体から運ばれ、か
つ続いて第一支持体（Ｓ□）から第二媒体中に溶解また
は解離されたバックグラウンドおよび異質材料の存在を
更に減少するために実施される。
従って、第二の回収可能の支持体（Ｓ２）は第三の媒体
支持体からターゲット−プローブ錯体を放出する条件に
移された媒体および更にサイクルを完了するために除去
された支持体に接触させら−４ｑ　　− れる。サイクルの数は試料のタイプ、標識成分のタイプ
および検出装置の感度による選択の問題である。異なる
タイプの支持体は異なる時間に使用される。従って、回
収可能の支持体は膜またはフィルターの代表的閉塞の問
題を最初に避けるためターゲット−プローブ錯体を試料
媒体または溶液から集めまたは濃縮するのに使用できる
。第二または第三の支持体は第一プローブ（Ｐｌ）の配
位子成分（Ｌｌ）に結合する抗配位子成分（Ａ１）をも
つ膜またはフィルターを包含するこ゛とが好ましい。膜
またはターゲット−プローブ錯体を流動回収させる工程
を単に処理する。
更に本発明の態様はバックグラウンド雑音を減少するの
に特によく適している。さて第３図に関して、第２図で
説明した以前の検定法の改良が記載される。第３図では
、ターゲットのポリヌクレオチドは第２図に記載したプ
ローブ成分に類似した第一および第二プローブ成分（Ｐ
　およびＰ　２　）■ と錯体を形成した。然しなから、第二プローブは第二の
配位子（Ｌ２）を包含する。第二配位子（Ｂ２）は実例
としてホウ酸塩抗配位子と錯化する１個の末端リボヌク
レオチド、補足コポリマーと結合する代替コポリマー、
アビジン抗配位子に結合するビオチン配位子、または説
明したようなホモポリマー配位子（Ｂ２）および補足ホ
モポリマー抗配位子（Ａ２）を包含する。
さて工程１に移ると、第二プローブ（Ｂ２）に選択的に
結合できるバックグラウンド支持体はそれがターゲット
に結合されない時だけ、ターゲット−プローブ錯体を含
有する媒体と接触させられる。媒体は更に、遊離の解離
した第一および第二プローブ（Ｐ　およびＢ２）を包含
する。バックグラウンド雑音のもとになる標識した第二
プローブはバックグラウンド支持体（Ｂ１）と会合した
モル大過剰の抗配位子成分（Ａ２）によりバックグラウ
ンド支持体（Ｂ１）に特定的に結合される。
バックグラウンド支持体（Ｂ１）に未結合の標識プロー
ブ（Ｂ２）が結合した後、バックグラウンド支持体（Ｂ
１）は工程２で説明した媒体から除去される。ターゲッ
ト−プローブ錯体を含有する媒体はバックグラウンド雑
音の減少した第二プローブ（Ｂ２）上に含有した標識の
存在をモニターされる。代わりに、ターゲット−プロー
ブ錯体を含有する媒体は更に処理を受ける。
先きの処理には第３図に記載した工程１〜３又は第２図
と共に以前に記載した工程を反覆することにより更にバ
ックグラウンドの減少が包含できる。例えば、バックグ
ラウンド減少工程は第一および第二プローブの配位子お
よび抗配位子成分が干渉せず、かつターゲットが第一お
よび第二プローブと錯化されるいずれかの点で第２図で
説明したような臨床試料の処理に組入れられる。。
本方法の態様は第４図の図式形態で述べた装置の補助に
より実施される。装置は次の主要な要素を包含する。即
ち、少なくとも１個の収納容器、プローブとターゲット
分子および回収可能の支持体との会合を調節する手段、
試料溶液から回収可能の支持体を分離するための手段、
回収可能の支持体からターゲット分子を放出する手段。
これらの主要な要素は種々の形態が取られ下記に十分に
　５２　一 記載される。
装置はポリヌクレオチドを包含するターゲット分子に関
し、第２図および第３図に記載した方法を適用する目的
を説明するために下記に示される。
従って、ステーション１で、臨床試料は細胞材料を溶解
し、核酸を放出するために収納容器中にチャオトロピッ
クの塩のような可溶化剤、酵素、および界面活性剤と共
に置かれる。収納容器は細胞の分解を容易にするため撹
拌要素を含有する。
収納容器は試料を包含するのに適した容器、管、槽、の
いずれかのタイプが包含される。
自動化分析用に設計した装置では第４図で説明したよう
な装置が多数の収納容器を収容する手段を包含するのが
好ましい。目的を説明ザるため、試料を包含する収納容
器は続いて分析される。
従って、収納容器は第一のステーションに、次いで種々
の検定工程が実施される次のステーションに運ばれる。
種々のステーションは運搬手段で結ばれる。運搬手段に
は回転できる回転板、コンベアベルト等−罠　ｑ　　　
− が包含される臨床病院の設置に応用する時、運搬手段は
手段運動が包含される。従って、病院のスタッフは患者
から組織試料を得て、その試料を収納容器中に置く。組
織試料の分解および溶解剤および試薬の初期の混合を包
含する試料処理は収納容器が更に処理のため次のステー
ションに移されるようにベット側面で開始され続行ステ
ーションに対する引用は図解用である。あるステーショ
ンまたは工程は組合わせたり逆にすること当業者に承認
される。
さて第一ステーションに戻ると、試料および可溶化剤が
封入容器内に加えられ、ここで撹拌要素が試料と可溶化
剤を十分に混合し、細胞材料から核酸を解放する。輸送
手段により封入容器が試薬を受は取るステーション２に
封入容器を運ぶ。
試薬は第一ポリヌクレオチドプローブと第二ポリヌクレ
オチドプローブを含有する。第一および第二プローブは
両プローブがターゲットの相互に独占部分に結合される
ターゲットポリヌクレオチドと錯体を形成できる。第一
プローブは結合条件下に回収可能の支持体に結合できる
。第二ポリヌクレオチドプローブは検出できる標識成分
を包含する。試薬および試料の核酸は加熱手段により変
性され、ステーションに運ばれる。
ステーション３で、封入容器は開いた円で示される第一
の支持体を受ける。第一支持体は撹拌要素を包含する適
当な手段により試料媒体中に均質に分散される。適当な
支持体の実例は制限はないがポリスチレンビーズ、磁性
ビーズ、および他の粒状またはフィラメント物質を包含
する。
説明したように、第一支持体はデオキシチミジン（ｄＴ
）のポリヌクレオチド抗配位子を有する磁性ビーズが包
含される。第一プローブには結合または混成条件中に第
一支持体に結合できるデオキシアデノシン（ｄＡ）の尾
部分が包含される。
ステーション４に移ると、混成条件が冷却要素により試
料媒体に賦課される。然しなから、塩濃度を変化する手
段が熱調節に容易に代替できることは当業者に認められ
る。かくして、ターゲットポリヌクレオチドは第一およ
び第二プローブと錯　５５一 体を形成する。更に、第一プローブのホモポリマーデオ
キシアデノシン（ｄＡ）の尾部分は回収可能の支持体の
デオキシチミジン（ｄＴ）ホモポリマーに混成する。
ステーション４から、封入容器は磁性要素の活動により
回収可能の支持体が封入容器の壁に固定されるステーシ
ョン５に移動される。もし、ポリスチレンビーズを磁性
ビーズに代えると、ポリスチレンビーズは濾過または密
度差により固定化される。試料媒体はそれと共に保持し
た大部分の異質ＤＮＡ、ＲＮＡ、可溶化剤、細胞材料お
よび不純物を廃棄される。固定化した回収可能の支持体
は洗浄され、更に異質のＤＮＡ、ＲＮＡ、可溶化剤、細
胞物質および不純物を除去する。
更に、回収可能の支持体は反応容器の壁に固定化される
と説明したが、回収可能の支持体を磁性要素により反応
容器から除去し、それと共に反応容器壁に非特定的に結
合した異質のＤＮＡ。
ＲＮＡ、可溶化剤および細胞物質を含有する第一の反応
容器を廃棄することも可能である。
回収可能の支持体は第二媒体、同一封入容器または新規
の封入容器中に置かれる。第二媒体中に回収可能の支持
体を含有する封入容器はステーション６に運ばれる。
ステーション６で、第二の媒体は加熱要素を包含する適
当な手段により変性条件に移される。変性法は回収可能
の支持体の（ｄＴ）ホモポリマーからターゲット−第一
および第二プローブ錯体を放出する、異質のＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、不純物および細胞材料を潜在的に保持する第一支
持体は第二の媒体から除去される。バックグラウンド支
持体は次に第二媒体に接触させられてステーション７に
通る。
ステーション７では、冷却要素により第二媒体は混成温
度となる。バックグラウンド支持体は第二プローブに保
持された配位子に非特定的に結合できる第二の抗配位を
包含する。例えば、制限なしに第二プローブの末端ヌク
レオチドは第二支持体に保持されたホウ酸塩成分に特定
的に結合するリボ誘導体に合成される。プローブターゲ
ット錯−へ７　一 体の一部として々−ゲットに結合した第二プローブは立
体障害により第三支持体に保持されたホウ酸塩に結合し
ない。然しなから、未結合の第二プローブはホウ酸塩支
持体に非特定的に結合する。
代わって、第二プローブは第二支持体上のデオキシグア
ニン（ｄＧ）ホモポリマー結合体に結合するデオキシシ
クロシン（ｄＣ）の如きホモポリマーを包含できる。ホ
モポリマーの長さはターゲット第一および第二プローブ
の第二支持体との錯体が安定でないように設計される。
然しなから、第二プローブ単独の第二支持体との錯体は
反応パラメーター内で安定である。実際に、バックグラ
ウンド支持体の未結合第二プローブに対するバックグラ
ウンド捕捉結合は不可逆である。
次に、第二媒体およびバックグラウンド支持体を包含す
る封入容器はターゲット−プローブ錯体に結合しない第
二プローブ成分を有するバックグラウンド支持体が、第
二媒体から分離されるステーション８に運ばれる。バッ
クグラウンド支持体の分離により非特定バックグラウン
ド雑音が媒体から除去される。
説明した如く、バックグラウンドの捕捉はビーズ上で実
施される。然しなからターゲット−第一および第二プロ
ーブ錯体の臨床試料からの最初の精製により第二媒体が
フラッシュされるフィルター又は膜支持体上でバックグ
ラウンド捕捉をして全てまたは大部分の固体のぼたが除
去されることは５業に認められる。
ステーション８から、減少したバックグラウンドをもつ
ターゲット−プローブ錯体を含有する精製媒体はステー
ション９に運ばれる。ステーション９で、膜またはフィ
ルターとして示される第三の支持体は加熱要素により混
成温度にもたらされた第二媒体に接触させられる。第三
の支持体は第一プローブの第一配位子に結合する第一の
抗配位子成分を包含する。従って、もし第一プローブの
第一配位子成分がデオキシアデノシン（ｄＡ）のホモポ
リマーそれであれば、第三支持体はデオキシチミジン（
ｄＴ）のホモポリマーを包含する。
説明した如く、第三の支持体は第二の媒体がノー　５９
　＝ ラッシュされるフィルターまたは膜が包含される。
第三の支持体は更にターゲット−第一および第二のプロ
ーブ錯体の濃縮を行い、更に第三の支持体に特定的に結
合しないバックグラウンドおよび干渉材料を減少させる
。ステーション１０に移ると、第三支持体はターゲット
−第一および第二プローブ錯体を濃縮し、第二プローブ
に保持された標識成分の検出ができる。
本発明は更に、好ましい態様の特徴を例示する下記の代
表的方法および実験の実施例に記載される。
１、方法 Ａ、材料 全ての試薬は分析縁またはそれ以上であった。
官能基のアミノ基を包含する商標Ｂｉｏ−ＭＡＧとして
市販された磁性ビーズはケンブリッジ、ＭＡのアドパン
ストマグネチックス社から得た。
本実施例で、全ての標識したヌクレオチドはニューイン
グランドニューフレアーから得た。酵素の末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴＤＴ）はフロリ
ダ州セントペテルスブルグのライフサイエンス社から得
た。オリゴヌクレオチドｐｄＴ１ｏはファルマチカＰＬ
バイオケミカルから得た。
Ｂ、プローブの合成 下記は代表的プロトコールおよび方法を示す。
さて第６図に関して、二つのプローブはイー・ケースパ
イサーおよびジェー争ニー・ノープル。
Ｊ、　ｏｆ　Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｉ
ｙ　２５７１Ｂ−５５７５１，１９８２年の構成図、第
６図により、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｔ
）のエンテロトキシン遺伝子ｅｌｔＡ、Ｑの機能成分に
対し構成した。
合成した１組のプローブは遺伝子配列４８３の位置に始
まり、長さ３０のヌクレオチドへ延長し、以後Ａ４８３
プローブと称する。合成した第二のプローブは遺伝子配
列５３２の位置に始まり長さ３０のヌクレオチドに延長
し、以後Ａ３３２プローブと称す。合成した第三のプロ
ーブは遺伝子配列７２６の位置に始まり、長さ３９ヌク
レオチドに延長し、以後Ａ７２６と称する。特定の塩基
列（５’　−３’　）−−Ａ１　　− は下記の第１表に示す。
第　　　１　　　表 プローブ　　　　　　　　　　　配　　　　　　　夕Ｉ
ＪＡ４８３　　ＡＧＡ　　ＣＣＧ　　ＧＴＡ　　ＴＴＡ
　　ＣＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＣＴ　　ＧＡＡ　　ＴＡＴ
　　ＡＧＣＡ５８２　　ＡＧＡ　　ＴＴＡ　　ＧＣＡ　
　ＧＧＴ　　ＴＴＣＣＣＡ　　ＣＣＧ　　ＧＡＴ　　Ｃ
ＡＣＣＡＡＡ７２６　　ＧＴＣＡＧＡ　　ＧＧＴ　　Ｔ
ＧＡ　　ＣＡＴ　　ＡＴＡ　　ＴＡＡ　　ＣＡＧ　　Ａ
ＡＴ　　ＴＣＧＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ プローブは技術上利用される方法で合成した。
番号方式はインテリヂエネチック順位列ＥＣ０ｅ１ｔＡ
ρにより入手できる７６８ヌクレオチド順位から適合さ
せた。
プローブＡ７２６の３個の主要末端の１０個のＧ残分中
５′末端に向う３グアニン塩基は毒性遺伝子の補足チト
シン塩基に結合できる。３チトシンの緊張はＤＮＡでは
普通である。１０個のグアニン塩基は、オリゴｄＣ−セ
ルロースの如く支持体上に保持したポリＣ抗配位に結合
できる配位子を形成する。黙しながら、７個のグアニン
塩基は、特に立体障害およびターゲット−プローブ錯体
の粒度によりプローブがターゲットに結合されると３７
℃で支持体と安定な会合を形成しない。プローブＡ７２
６は末端トランスフェラーゼにより３２ｐ　−ｄＣおよ
び３２Ｐ　−ｄ　Ｇの約３残基分のその３′末端へのラ
ンダム付加により改質される。
他のプローブは他のターゲット分子に容易に合成される
ことは当業者は確認できる。
Ｃ９調製 実施例１，２および３におけるターゲットはエンテロト
キシン遺伝子ｅｌｒＡΩである。エンテロトキシン遺伝
子ｅｌｒＡ［はスタンホード大学から得たプラスミドＥ
ＷＤ−２９９の一部として搬送された。
実施例１において、エンテロトキシゲンバクテリアはル
リアブロス中でログー相まで生長した。
エンテロトキシジエンバクテリアは溶解され、プラスミ
ドＥＷＤ−２９９を単離した。
プラスミドＥＷＤ　−２９９は更に限定酵素ＸｂａＩお
よびＨｉｎｄｍに吸収した。４７５ベースの長さの断片
はターゲットとして使用し１％アガロースゲルから電気
溶出により精製した。捕捉工程の効率を追跡するため、
断片は製造者の指示に従い酵素ポリヌクレオチドキナー
ゼと共に”２Ｐ−ＡＴＰで５′末端標識した。
実施例２，３においてエンテロトキシゲンバクテリアお
よび野生型の非エンテロトキシゲンの大腸菌ＪＭ８３を
別個にログ−フェーズまで成育　′した。野生型の大腸
菌は対照として役立てた。
エンテロトキシゲンバクテリア及び野生型のバクテリア
はチャオトロピック溶液中で細胞を実質的に可溶化して
調製した。かくして、ルリアブロス中のバクテリア培養
物を５Ｍまでの濃度の固体グアニジンチオシアナート（
Ｇｕ　Ｓ　ＣＮ）　、０．３　Ｍまでの濃度のＴｒｉｓ
−ＨＣ，Ｑおよび０．１Ｍまでの濃度のＥＤＴＡ　（ｐ
ｔ（７）に添加した。チャオトロパンのバクテリア溶液
は次に５分間１００’ｃに加熱し冷却した。得゛られた
腸毒性バクテリアは続けて、野生型非腸毒性バクテリア
抽出物で希釈した。細胞当り毒プラスミドの濃度と抽出
物中の細胞数は通常の技術で測定した。ＧｕＳＣＮ中に
溶解した元の抽出物はｍ１当り約１０９の腸毒性大腸菌
および１００プラスミド／細胞を含有した。
Ｄ、ビーズの合成 回収可能の支持体は磁性ビーズから調製した。
他の回収可能の支持体には粒子、繊維、ポリスチレンビ
ーズまたは媒体から物理的に回収できる他の種目が包含
される。磁性ビーズは１０個の塩基の長さのデオキシチ
ミジンの付加物で合成しビーズを容易に反覆できる方法
でデオキシアデノシンを尾部にもつプローブと会合せし
めた。
かくして、Ｂ　ｉｏ−ＭＡ　Ｇ　（Ｍ４１００）ビーズ
の如きアミン官能基をもつ１０ｍ１のビーズを４個の２
７５ｍ１Ｔ−フラスコ中で２０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ６，７）で４時間洗浄した。次に、ビーズは２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，７）中２０ｍ１の１０％
クルタルアルデヒド中で室温で３時間反応させた。次に
ビーズは広＜　２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ）１８．
７）で洗浄し、次に一部２０ｍＭリン酸（ｐＨ７，８）
で洗浄した。
−ｃ、　　べ　　　− 別個に、精製したｐｄＴ’　　（ＥＤＴ−ｄＴ、ｏ）の
エチレンジアミン付加体をビーΦシーφエフチュー、ジ
・エムウオールおよびエル・イーオムゲル；　Ｎｕｃｌ
ｃｉｅ　ａｃｉｄ　Ｒｃｓ、　１１６５１３−６５２９
　（１９８３）により：Ｊ、！、Ｊ製した。り弓に本明
細書に包含した。ＥＤ　Ａ　−ｄ　Ｔ　ｔｏの濃度は２
０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７，６）中で１００／ｍｌに調整
した。
ＥＤＡ−ｄＴｌｏは磁性ビーズと混合したＥＤＡ−ｄＴ
ｌｏをビーズの遊離のアルデヒド基と反応させた。ＥＤ
Ａ−ｄＴｌｏとビーズの混合物は多数の５０ｍ１ポリエ
チレンチユーブに分割した。反応混合物とビーズを包含
するチューブ回転子中に加えて、室温で終夜撹拌した。
次にビーズは大型２７５ｍ１Ｔ−フラスコ中で無菌の２
０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８，７＞の溶液で非共有結合のＥ
ＤＴ−ｄＴｌｏを除去のため５回洗浄した。
保存のため、ビーズは０．１％までナトリウムアジドお
よび０．１％までＳＤＳを加えた２０叶リン酸塩の緩衝
液中で何回も維持できる。ビーズ調製物は光を保護して
４℃で保存される。
−６６＝ ビーズは次に予備交雑され０．７５Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ６，８）、０．５％ナトリウムラウロイルサルコ
シン、１０マイクログラム／ｍ１大腸菌、ミリリットル
当り０６５ミリグラムの牛の血清アルブミン（ｆｌｓＡ
）（ヌクレアーゼ−不含）および５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸酢酸ＤＴＡ）の緩衝液（後に“予備交雑緩衝液
”と称する）中で非特定結合位置を閉鎖した。
プローブおよびビーズをターゲット捕捉法にかける前に
２個のビーズの予備交雑を実施した。予備交雑法には１
０容量の予備交雑緩衝液への添加が包含される。
第１の予備交雑法は６０℃で撹拌しつ＼実施した。
第二の予備交雑法は撹拌しつ＼室温で実施した。
０．１％のイソアミルアルコール溶液をその溶液に消泡
剤として添加した。
ｄ　Ｔ　ｔｏ−由来のビーズの結合容量は下記の方法で
測定した。別の容器中で、ｄＴ　　およびｄＡ５゜は５
′末端に夫々３２Ｐ　−ｄ　Ｔおよび”２Ｐ　−ｄ　Ａ
で約１１０６ｄｐ　／マイクロダラムの特定活性まで標
識した。〜次にそのＳａは反応したｄ　Ｔ　５０の既知
量をトリクロロ酢酸の沈澱により正確に 次に、１００．０００〜２００　、０００ｄｐｍ／　ｍ
ｇが実質的に同一のＳａを有する５μｇの３２Ｐ−ｄＡ
５ｏおよび５μｇの　Ｐ　−ｄ　Ｔ　５０を別個に予備
交雑緩衝液を包含するチューブに加え１ｍｌの容量とし
た。
既知試料容量の予備交雑ビーズを４個のチューブに加え
た。４チユ一ブ中２個は”２Ｐ　−ｄ　Ａ５ｏ混合物０
．５ｍｌを入れ、残部の２個のチューブは”２Ｐ　−ｄ
　Ｔ　５ｏ混合物０．５ｍｌを入れた。４溶液の全てを
交雑条件に５分間おいた。ビーズはその後固定化され洗
浄した。次に溶液の活性をモニターした。マイクロダラ
ムで測定したビーズ調製量に対する全結合容量を下記に
記載する。
Ｃ＝Ｖ　（Ａ−Ｊ）／Ｘ あり、■は試料客足に対する容量であり、Ａは８２Ｐ−
ｄＡ溶液中に懸濁したビーズの平均活性ｅｐＨｌであり
、Ｊは３２Ｐ　−ｄ　Ｔ溶液中に懸濁したビーズの平均
活性ｅｐＨｌである。
＝　６８− 当業者は他のビーズ、粒子、フィラメント等が他のヌク
レオチド混合物またはホモポリマーで製剤化できること
を知っている。例えば、ポリＡ由来のビーズは５０ｍ１
の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６）中１００ｍ
ｇポリＡ　（ｍｙ＞　１００．０００）を含有する溶液
を（ｄ　Ｔ　ｔｏの精製ＥＤＡ付加体に対し）置換する
ことにより生成される。
Ｅ、ターゲット捕捉法 ビーズ調製物はターゲットのポリヌクレオチドを捕捉す
るのに使用される。次に回収可能の支持体と回収可能の
捕捉物を例示する代表的ターゲット捕捉実験プロトコー
ルを説明のために記載し、第一プローブＡ４８３および
第二プローブＡ３３２を使用して限定の無い方法が討議
される。第一プローブＡ４８３は３２Ｐ−ｄＣＴＰおよ
び３２１’　−ｄ　Ｇ　ＴＰにより約１１０１０ｄｐ　
／ｍｇの放射能活性に無作為に３′末端に標識される。
第二プローブ、Ａ３８２は酵素の末端トランスフェラー
ゼにより約７０の未標識ｄＡの残留分により尾行される
。
第一に、２００　ｐ　ｇ／　ｍｌの標識プローブＡ４８
３と４００　μｇ　／ｍｌの尾行プローブＡ３３２が１
．４Ｍ塩化ナトリウム中で６５９Ｃ１５分間エンテロト
キシン遺伝子の熱変性した４７５ｍｃｒＸｂａＩ　−Ｈ
ｉｎｄ制限フラグメントの変動量と混合された。
次に、ターゲットの捕捉はターゲットおよびプローブ成
分を含有する媒体を磁性ビーズに非特定的な結合を減少
する予備交雑法に次いで３ミクロダラム／ｍｌのｄＡ５
ｏ結合容量を持つｄ　Ｔ　ｔｏ−磁性ビーズのアリコー
トと接触させることにより開始される。磁性ビーズおよ
びプローブ−ターゲット錯体は５ｍｌポリプロピレンチ
ューブ中で０．１ｍｌ予備交雑緩衝液中室温で２〜５分
間培養された。
チューブはコーニングチューブ磁性分離器中に置かれた
。活性化のコーニングチューブ磁性分離器はチューブの
内壁上の磁性ビーズを不動化するポリプロピレンチュー
ブを通して磁場が印加する。
磁性ビーズがポリプロピレンチューブの側壁に不動化さ
れる時間中、元の媒体は除去され、排出される。
不動化されている間、ビーズは消泡剤としてイソアミル
アルコールを含有する０、６ｍｌの予備交雑緩衝液で３
回洗汗した。予備交雑緩衝液の添加後にビーズは磁場か
らチューブを移すことにより、また媒体を烈しく旋回さ
せることにより再懸濁した。
次に、磁場を再印加して予備交雑緩衝液を除去し、放棄
させてビーズを不動化した。予備交雑緩衝液の添加の循
環、ビーズの再懸濁、ビーズの不動化および予備交雑緩
衝液の放棄は２回反覆した。
ビーズ上に保持されたターゲット−プローブ錯体は検出
、バックグラウンドの捕捉または更にターゲット捕捉の
サイクルの追加工程を包含する工程にさらに利用出来る
。
好ましいターゲット捕捉法にはターゲット−プローブ錯
体の放出および第二支持体上の再捕捉が包含される。支
持体は第一の支持体と化学的に異なるのが好ましい。
ターゲット−プローブ錯体の放出は次の代表的なプロト
コールで実施される。最後の予備交雑緩衝液の除去後に
予備交雑緩衝液はビーズを含有するチューブに添加され
る。ビーズはプローブ−ターゲット錯体をビーズから放
出するため６０℃で１〜２分間培養した。不磁性分離器
は同様に６０°Ｃで活性化し、ターゲット−プローブ錯
体を含有する溶離液をチューブから除去した。溶出液は
追加の回収可能の支持体上で再捕捉されるか、普通の支
持体上で最後の捕捉が行われる。本実施例の如き回収可
能の支持体からターゲット−プローブ錯体の捕捉または
放出は交雑のバックグラウンドを減少が要望される時に
応じて屡々反覆できることは当業者が認めている。
プローブ−ターゲット錯体の最終捕捉は代表的に非特定
的に結合したまたは共有結合したｄＴ−３０００を含有
するニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜上で
実施された。かくて、磁性ビーズ上に保持されたターゲ
ット−プローブ錯体はビーズを予備交雑緩衝液中で６０
℃で３０分間加熱することにより磁性ビーズより放出さ
れた。ビーズは固定化され、溶出液を除去し、磁性微子
を除去するため０．２ミクロンのアクロジスク（ゲルマ
ン）を通過させた。ｄ　Ｔ　−３０００を含有するニト
ロセルロースフィルターが選択され、未標識のプローブ
上のｄＴ尾部を結合、捕捉した。
ターゲット−プローブ錯体の最終捕捉に対し化学的に異
なる固体支持体の使用は前に使用した支持体に高い親和
力を有するバックグラウンド分子の結合を避ける。具体
例として、プローブ−ターゲットと共に繰返し支持体と
結合し溶出することは特殊の支持体に自然の高い親和力
を有する低水準の汚染物に対して可能である。か＼る低
水準の汚染物は非常に異なる組成物の支持体に露出する
ことによる時と同様完全には同一組成の回収可能の支持
体の反覆使用により希釈できない。低水準の汚染物また
は支持体からターゲット−プローブ錯体を放出し再捕捉
する化学的に差異のある手段を利用して減少することも
できる。
Ｆ、バックグラウンドの捕捉法 バックグラウンドの捕捉法はバックグラウンド雑音を選
択的減少させ、ターゲットの存在を示す真の信号が検出
できる。バックグラウンド捕捉は１個のプローブシステ
ムまたは２個以上のプローブを使用するシステムに適用
できる。例えば、１個のプローブを特徴とするバックグ
ラウンド捕捉法では、プローブは標識成分と配位子を包
含する。
プローブはターゲットに結合でき、配位子はプローブが
ターゲットに結合しない時のみ支持体に安定結合を形成
できる。
同様に、実例として、ターゲット捕捉に関して多数のブ
ト１−ブを特徴とするバックグラウンド捕捉法は２個の
プローブを包含する。第一の支持体に結合できる未標識
の配位子を有する第一のターゲット捕捉プローブはター
ゲットを捕捉するのに使用され、検出できる標識成分を
有する第二のバックグラウンド捕捉プローブは第二の／
り・ツクグラウンド支持体に結合できる第二の配位子を
包含する。バックグラウンド捕捉は検定の雑音データに
対して信号を高めるためターゲット捕捉に重要な捕捉で
ある。
下記は第一ターゲット捕捉プローブＡ３８２および第二
のバックグラウンド捕捉プローブＡ７２６およびターゲ
ットのエンテロトキシン遺伝子ｅｌ　ｒＡρを使用する
代表的なバックグラウンド捕捉プロトコールを示す。実
証の目的に使用されるプローブは単に選択の問題である
ことを当業者は認めるであろう。
プローブＡ３３２は最初のターゲット捕捉に対し磁性ビ
ーズを共有的に結合したｄ　Ｔ　ｔｏおよび最終のター
ゲット捕捉に対し非特定的に結合した”３０００に可逆
的結合できる約１００ｄＡ残留分により尾行された。プ
ローブＡ７２６は末端を末端のトランスフェラーゼによ
り３′末端に”２Ｐ　−ｄ　Ｃおよび３２Ｐ　−ｄ　Ｇ
の約３残留分を無作為に末端標識した。プローブＡ７２
６はプローブがターゲットに交雑されない時ｄＣ−セル
ロースに結合できる。
ターゲット−第一および第二プローブ−錯体および潜在
的に未結合の第二プローブを含有する溶液はｄＣ−セル
ロースと混合し、混合物の温度を３７℃に維持した。３
７℃の温度はオリゴｄＣによりｄＣ７の解離温度より高
く、ターゲット−第一および第二プローブ錯体のｄＣ−
セルロースへの結合を抑制する。この温度はまたｄＧ尾
部をもつ未結合の第二プローブのｄＣセルロースへの結
合を促進するｄＣによりｄ　Ｇ　１ｏの解離温度より低
い。
更に、ターゲット−第一および第二プローブ錯体はｄＣ
−セルロース支持体への接近において未結合第二プロー
ブより著しく立体的に妨げられる。
第二プローブＡ７２６を含有するｄＣセルロースは遠心
分離により除去されるが、当業者は濾過の如き他の方法
が同様に使用できることを認めるであろう。残留する溶
出液はターゲット−第一および第二プローブ錯体および
低い濃度の未結合の標識した第二プローブＡ７２６を含
有する。
Ｇ、実施例 回復できる支持体の調製、プローブの調製、ターゲット
およびバックグラウンド捕捉に対する代表的なプロトコ
ールは必要と目的に合った改良ができることを個々の当
業者は知るであろう。下記の実施例は特に註記せぬ限り
上記に概説した代表釣力法を包ａする。
　７６　一 実施例　１ 磁性ビーズを使用するターゲットの捕捉と検定ターゲッ
ト捕捉検定は２個のプローブと磁性ビーズの回収可能の
支持体により実施した。
ターゲットはエンテロトキシン遺伝子ｅｌｒＡΩのＸｂ
ａＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントを包含する。第一プ
ローブは磁性ビーズ支持体のｄ　Ｔ　ｉｏ残留分に結合
できる１３０未標識ｄＡ残分により尾行されたＡ３３２
サータイマーオリゴヌクレオチドプローブを包含した。
第一プローブは磁性ビーズ支持体のｄＴ１ｏＴ１性に結
合できる１３０の未標識ｄＡ残分て尾行されたＡ３３２
サータイマーオリゴヌクレオチドプローブを包含した。
第二のプローブは第一プローブの交雑の位置から下流の
同一ターゲット２０ヌクレオチドに結合できるＡ４８３
サータイマーオリゴヌクレオチドプローブを包含した。
第二プローブは３２Ｐ−ｄＣＴＰおよび３２Ｐ−ｄＧＴ
Ｐにより１１０１０ｄｐ　／マイクロダラムの特定の放
射能まです〜タイマーオリゴヌクレオチドを尾行するこ
とにより標識した。
尾行した第一プローブおよび標識した第二プローブは毒
性遺伝子の種々の量の熱変性した４７５ｍｅｒ制限フラ
グメントと共に１．４Ｍ塩化ナトリウム中で６５℃で１
５分間培養した。非特定結合したバックグラウンド対照
として、尾行したプローブと標識した第二プローブをタ
ーゲット不在にして同一溶液中で培養した。特定的結合
した対照としては、２個の追加反応混合物を形成した。
１反応混合物は変性した大腸菌４マイクログラムで培養
した尾行したプローブと未標識の第二プローブを包含し
、尾行した第一プローブと標識した第二プローブの第二
反応混合物はターゲットＤＮＡのない同一反応混合物中
の１０マイクログラムの変性ヒ）４）ＮＡ中で培養した
。
１５分の交雑期間の後、試料は０．７５モルリン酸塩緩
衝液（ρＩ？６．８）０．７ミリリツトル中でｄＴ−由
来の磁性ビーズで５分間培養した。ビーズは磁気的に固
定化され前記のように更に洗浄した。ターゲットプロー
ブ錯体は０．２モルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）中
で６０℃でビーズから溶出された。
ビーズの第一セットは溶出液およびターゲットプローブ
錯体から分離された。磁性ビーズの第二群は溶出液に添
加されターゲットおよびプローブ錯体を同様に捕捉する
結合条件におかれた。
ビーズの第二セットは洗浄し、ターゲットは同様にター
ゲットから溶出し、ビーズを溶出液から分離した。
ビーズの第三セットはターゲット−プローブ錯体を含有
する溶出液に添加し結合性におきビーズに今一度ターゲ
ットープローブは錯体を捕捉させた。ビーズは更に洗浄
し、ターゲットは前記の如くビーズから溶出した。ビー
ズは次に溶出液から分離し、溶出液は２ミリメートル平
方の穴のｄＴ　　　−ナイロンを通過させ、ターゲラト
ープローブ錯体を捕捉した。
ｄＴ　　　−ナイロン膜はハイブリニスロット装置００
０ 置（ベトルスダリサーチラボラトリー）を使用し、２μ
ｇの”３０００をナイロンに共結合させて調製した。簡
単にはｄＴ　　　（ライフサイエンス）を、塩のないト
リス緩衝液中でジエン−スクリーンにューイングランド
ニュクレアー）の如きナイロン膜上に点在させた。膜は
室温で１０分間乾燥し、次いで１０分間室温に冷却する
以前に更に１０分間赤外線ランプで乾燥した。ナイロン
膜を包含するフィルター装置はＵＶ−ｈランスイルミネ
ーター（フォトダイン）上で旋回し４０ｕｗ／ｃ♂で２
分間ＵＶ光線に露出してフィルターに”３０００を架橋
した。
”３０００膜は膜を通して下記の溶液を連続的に通過さ
せることにより予備交雑した。
（１）１％５ＤＳ （２）　０．５％ＳＤＳ中０．５ｍｇ／　ｍｌ　Ｂ　Ｓ
　Ａおよび最後に （３）予備交雑緩衝液 ターゲット−プローブ錯体を潜在的に含有するｄＴ　　
　・ナイ【７ンは０．２モルのリン酸すトリウノ、およ
び５ミリモルのＥＤＴＡで洗浄した。ナイロン支持体は
第二プローブの８２Ｐ標識成分の存在でオーディオ放射
線写真法で終液モニターした。
オーディオ放射線写真法によりフィルターからカットさ
れベースのシンチレーション流体中で算　８０一 定した。カウントはドックス遺伝子の限定フラグメント
の３フ工ムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌ）を含有する溶液
中毎分２１００および１４００カウントであった。毒遺
伝子を含有する限定フラグメントを３０アトモル（ｃａ
ｔｔｏｍｏｌｃ）を含有する試料は毎分６２カウントの
カウントを生成した。
ＤＮＡを含有しない第三の試料は毎分７カウントを生成
した。１０マイクログラムの熱変性ヒトＤＮＡを含有す
る第四試料は毎分０カウントを生成した。４マイクログ
ラムの熱変性した大腸菌を含有する第五溶液は毎分７カ
ウントを生成した。
プロトコールの絶対感度は毒遺伝子の１０−１８モルと
推定された。標識したターゲット−プローブ錯体の回収
全効率は人力の１〜２％と推定された。
検定は良好な特異性を示した。全体でヒトＤＮＡまたは
大腸菌含有の試料ではＤＮＡをＳまめ試料以上に標識プ
ローブは無かった。実験プロトコールの反覆はターゲッ
トの捕捉全効率は殆んど５％を生成した。この方法はバ
ックグラウンドを未交雑プローブの最初の水準１０１１
分子から約１０４モル−Ｑ　１　　− に減少した。減少およびバックグラウンドは７０グを示
し、捕捉の減少および効率に対し十分以上に補償してい
る。
実施例　２ 本実施はバックグラウンド捕捉と共にターゲット捕捉を
特徴とする。ターゲットおよびバックグラウンド捕捉は
ターゲット捕捉で記載した未標識の第一ターゲット捕捉
プローブＡ３３２および第二標識バックグラウンド捕捉
プローブミックスを使用し実施した。
最初に、１６０　ｎｇ／　ｍｌ　ｄ　Ａ−尾行Ａ３３２
および４０ｎｇ／ｍｌ”２Ｐ−標識プローブＡ７２６を
混合しプローブミックスを生成した。プローブミックス
を種々の量のエンテロトキシゲン遺伝子を含有する５μ
βのバクテリア抽出物に添加した。抽出物−プローブミ
ックスは２２℃で１５分培養した。
１５分の交雑期間の後、試料はターゲット捕捉を行うた
め０．７　ｍｌの０．７５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，
８）中でｄＴ−由来の磁性ビーズと共に５分間培養した
交雑緩衝液１０容量で希釈した。ビーズは磁気的に不動
化され、広く洗浄した。ターゲット−第一および第二プ
ローブ錯体は前記の如く第一支持体から溶出し第一固形
支持体を除去した。
次に、ターゲット−第一および第ニープローブ−錯体を
含有し潜在的に第二プローブを含有する溶出液をｄＣ−
セルロースと混合し、混合物の温度を３７℃に維持した
。３７℃の温度はｄＣ７の解離温度より高く、オリゴｄ
Ｃはターゲット−第一および第ニープローブ錯体のｄＣ
−セルロースへの結合を抑制した。その温度はまたｄＧ
ｌｏの解離温度より低く維持され、オリゴｄＣはｄＧ□
。を有する未標識の第二プローブのｄＣ−セルロースへ
の結合を促進した。ターゲット第一および第二プローブ
錯体はｄＣ−セルロース支持体への接近を未結合の第二
プローブより大きく立体的に妨げた。
然しなから、ｄＣ−セルロースは遠心分離で除去された
が当業者は濾過の如き他の方法が同様に使用できること
を認めるであろう。
残留溶出液は０．２ミクロンのアクロディスク（ゲルマ
ン）を通過させ磁性およびセルロース微粒子を除いた。
次に、溶出液は”３０００を含有するニトロセルロース
フィルターを２２℃で通過させた。ニトロセルロースで
最終のターゲット捕捉を行った。
第　　　２　　　表 信号雑音 工　　　　　程　　　　　　（ｃｐｍ）　　　（ｃｐｍ
）第一実験 ターゲット補釈前　　　　不　明　２００．０００ター
ゲツト捕捉後　　　　　１０５８　　　２１１バツクグ
ラウンド捕捉後　　４９５　　　２５ン濾過後 第二実験 ターゲット捕捉前　　　　不　明　４００．０００ター
ゲツト捕捉後　　　　　１５８８　　　６４２バツクグ
ラウンド捕捉後　　１０８４　　　８９（濾過工程は実
施せず） １ｃｐＩ１１以下の雑音の除去で試料中の極めて少量の
ターゲットの検出ができた。臨床の適用に必要な範囲で
ある１０″′″１８モルの如き少量のターゲットが検出
された。
ターゲット捕捉の１ラウンドは約３０グのバックグラウ
ンドを除去した。１ラウンドのバックグラウンド捕捉で
ターゲットの第一捕捉で既に除去されなかったバックグ
ラウンドを１０グ除去した。
濾過による最終のターゲットの捕捉（第二ラウンドのタ
ーゲット捕捉）により第一〇二工程のいずれでも除去さ
れなかったバックグラウンドを２０グ除去した。ターゲ
ットおよびバックグラウンド捕捉法は本方法で自主的に
バックグラウンドを約６０グずつ減少する働きがある。
バックグラウンド捕捉は第一ターゲット捕捉に適用する
時一層良好に作用する。明らかにバックグラウンド捕捉
はターゲット捕捉より試料中の不純物に一層鋭敏である
。
ターゲット捕捉後のバックグラウンド捕捉の組合わせは
単独の適用のいずれより大きな利点を形成する。
以前の試料は放射性標識成分を引用したが、本方法は非
放射性成分を利用するので検定方法に極めて大きな影響
を与えることが期待される。特に、本発明は蛍光体およ
び化学発光体薬剤を包含する発光体標識成分に適用でき
る。適当な蛍光体標識には実例として側線はなくフルオ
レッセイン、ピレン、アクリジン、スルホローダミン、
エオシン、エリスロシンおよびそれらの誘導体が包含さ
れる。
適当な化学発光剤には実例として側線はないが、ミクロ
パーオキシダーゼ、ルミノール、イソルミノール、グル
コースオキシダーゼ、アクリジニウムエステルおよびそ
れらの誘導体が包含される。
実施例　３ 下記の試料は非放射性標識成分とスパイクした生物学的
媒体から多段ターゲット捕捉を特徴とする。スパイクし
た生物学的媒体は臨床的に医学的セツティングで得られ
る試料に類似する。
エンテロトキシジエン大腸菌と野生型大腸菌の細胞抽出
物は前記の如く調製した。臨床セツティングに類似の環
境で毒遺伝子の検出の感度を測定するため毒性バクテリ
アを含有する抽出物を前記の如く野生型大腸菌を含有す
る抽出物で希釈した。
下記の材料は特徴のない供与体から得た。
即ちヒトの便試料、牛のミルク、ヒトの唾液、ヒトのた
ん、ヒトの全血液、ヒトの血清、ヒトの尿、および精液
である。臨床型の試料は１０分間に亘り溶解した。便試
料は固形のため５ＧｕＳＣＮ、　　０．３Ｍ）リスＨＣ
，Ｑ塩（ｐＨ７，４）、０．１　Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ７）　、１％ベータメルカプトエタノールの溶液に溶
解した。可溶化後に、試料のアリコートを作成し、各ア
リコートを既知量のトキシジエン大腸菌または野生型大
腸菌でスパイクした。混合物を次に粗製のフィルトレー
ジョン（ビオラドエコノコラム）を通し、１００℃で５
分間加熱した。
試料の残分は性質が更に液体で便と異なって処理した。
液体試料を固形のＧｕＳＣＮに添加し最終濃度を５Ｍと
した。固形ＧｕＳＣＮはまた十分にトリス−ＨｅΩ、Ｅ
ＤＴＡ、およびベータメルカプトエタノールを包含させ
便試料と同様に最終濃度を作成した。次に、試料のアリ
コートを作成し、各アリコートは既知量のトキシジエン
大腸菌または野生型大腸菌でスパイクした。混合物を粗
製のフィルトレージョン（ビオラドエコツカラム）を通
し、１００℃に５分間加熱した。
実施例３のプローブの調製は以前の試料と異なる。第一
捕捉試料はプラスミドｐＢＲ３２２で生成させた。プラ
スミドはＨｈａＩおよびＨａｅＩ［Ｉに限定され、プラ
スミドフラグメントはターミナルトランスフェラーゼで
約１００６Ａ残留分により尾行した。ターゲットのプラ
スミドはｐＢＲ３２２と広い同族体を含有する（スパイ
サー及びノープル、Ｊ　Ｂ　Ｃ２５７、５７１Ｂ−２１
）。かくして第一捕捉試料はプラスミドｐＢＲ３２２の
同成分の多数のフラグメントから相対的に大量に生成し
た。
第二標識プローブはターゲットのエンテロトキシン遺伝
子に特定的に混合するように作成した。
第二の標識プローブはバクテリオファージにクローンし
たｅｌ　ｒＡρ遺伝子のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ制
限フラグメントから生成した。大腸菌ＨＢ□。１はバク
テリオファージに感染させ中間ログ相まて成長させた。
大腸菌を取り入れ、バクテリオファージを単離した。バ
クテリオファージはベセスダリサーチ研究所から入手し
た保存ニック−トランスレーンジョンキットを使用し、
ビオチニルｄＣＴＰ（エンゾバイオケミカルズ）でニッ
ク−トランスレーションした。約５％のヌクレオチドを
ビオチニルヌクレオチドで置換し、ビオチン標識した第
二プローブを形成した。
プローブミックスは８μｚ　／　ｍｌの第二Ｍ１８−毒
プローブを２０ｍＭ　）リス−ＨＣ，Ｑ　　（ｐＨ７，
４）および２ｍＭ　　ＥＤＴＡ中で４μｇ／ｍｌの第−
ｄＡ−尾行第一プローブと混合して作成した。プローブ
ミックスは１００℃まで５分間加熱しプローブを変性し
た。
１容量のプローブミックスを希釈シリーズの１容量の試
料と混合し交雑混合物を形成した。交雑混合物は５７℃
で１５分間交雑条件下に維持した。
交雑混合物は続けてＩＯ容量の粘着緩衝液（０，７５Ｍ
リン酸ナトリウム、　ｐＨ６，８、０，５％ナトリウム
ラウリルサルコシン、１０■／ｍ１大腸菌ＤＮＡ。
０．５　ｍｇ／ｍｌうし精液アルブミン（ＥＳＡ−ヌク
レアーゼ無し）およびＥＤＴＡ）で希釈した。交雑条件
を２２℃で約１分維持した。ビーズを次に磁気的に不動
化して交雑混合物から分離した。ビーズは１５分内に２
回洗浄し生物学的標本と未交雑ビオチン標識第二プロー
ブ中の不純物を除去した。
次に、約１分の時間で第一および第二プローブ−ターゲ
ット錯体を粘着緩衝液中に６５℃で磁性ビーズから溶出
した。溶出液および第一ビーズを分離した。
約７分の時間で第一および第二プローブ−ターゲット錯
体は放出してビーズの第二セットに結合し、再び放出さ
れた。ｄＴ１６由来のビーズの第二セットは次に希釈溶
出液に添加し、交雑条件を２２℃で約１分間維持した。
ビーズを洗浄し粘着緩衝液に再懸濁した。ビーズ、粘着
液混合物は次に６５℃におき第一および第二プローブ−
ターゲット錯体を放出した。
５分間に亘りニトロセルロース上で第一および第二プロ
ーブ−ターゲット錯体の最終捕捉を実施した。第二ビー
ズからの溶出液はケルマンのアクロディスク（０，２ミ
クロン）を通して２％過した。第一および第二プローブ
−ターゲット錯体を含有する溶出液を２２℃で”３００
０ニトロセルロースフイルター（粘着緩衝液で予備交雑
した）を通過させた。
３０分の時間にフィルターを第二プローブのビオチン標
識を検出するため更に処理した。検出に使用した緩衝液
の組成は次の第３表に確認される。
第　　　３　　　表 検出緩衝液 緩衝液 番号　　　組　　成 １１ＮＮａＣρ、Ｏ，１Ｍ）リス−ＨＣρ（ｐＨ７，４
）、　５　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃρ２゜０．１％トウィー
ン２０ １ａ　　５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　１０マイクログラム
／ｍｌ大腸菌ＤＮＡとＮｏ、　１ ２　　５％ＢＳＡ、０．５％トウ（−ン−２０とＮｏ。
３　　０．１ＭＮａＣρ、０．１Ｍ　トリス−ＨＣρ（
ｐＨ９，５）、　５０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２最初に
、第一および第二プローブ−ターゲット錯体を保持する
フィルターを検出緩衝液Ｎｏ、　２中で約５分間培養し
た。次にフィルターを検出緩衝液Ｎｏ、１ａ中ストレパ
ビジンーアルカリ性ホスフアターゼ（ベセスダリサーチ
研究所）の１　：　２００希釈溶液中で５分間培養した
。その後に、フィルターは検出緩衝液Ｎｏ、　１中で１
分中３回洗浄し、検出緩衝液Ｎ００３中で１分中２回洗
浄した。
次に、５−ブロモ−４−クロロ−３インドイルホスフエ
ート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（
ＮＢＴ）（キールケかアートおよびベリー）を検出緩衝
液Ｎ０１３中で２倍に希釈し、０．２　ミクロンのアク
ロディスクを通して濾過した。
希釈したＢＣＩＰおよびＮＢＴ溶液をフィルターに添加
し５分間３７℃で発色させた。
次に、フィルターを５０ｍＭ　）リス−ＨＣρ（ｐＨ７
，４）および１０ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中で１分間培
養し反応を停止させた。感度をフィルター上で視覚によ
り、またはＣ８９３０（島津科学）で濃度計走査により
定示した。
本性の工程は下記＠４表に概説する。
第　　　４　　　表 経過時間 １、生物学的試料の解離：ＤＮＡの変性　　　　　１０
１０２、標識および未標識プローブの添加５７℃の溶解
交雑　　　　　　　　　　　　　　　　　１５１５３、
磁性ビーズ上のブローブーターゲット捕捉　　１２６４
、生物学的標本お）（Ｂ＜・卸・５ツクグラウンド除去
のための磁性ビーズ洗浄１５　　　　４１５、プローブ
−ターゲット錯体の溶出　　　　　　１４２６、第二セ
ットのビーズ上の３〜５工程の反覆し洗液回収を除＜７
４９ ７、プローブ−ターゲット錯体のｄＴ３０００−ニトロ
セルロースへの結合　　　　　　　　　５５４８、粘着
緩衝液中のフィルターの培養　　　　　　５５９９６　
ストレプタビジンーアルカリ性ホスフ１ターゼ結合　　
　　　　　　　　　　　　５６４１０、洗　　浄　　　
　　　　　５６９１１、酵素検出のため染料添加　　　
　　　　　　　１５８４第４表は丁度１時間に亘る経過
時間の実例を示したが、この方法は改良でき、より短時
間で実施できる。匹敵する感度の非放射性プローブ検定
には２４時間〜７日を要し、かつ広範な試料調製を必要
とする。
第　　　５　　　表 感　　度　　水　　準 交雑混合物　バクテリ 生物学的標本　　　中の濃度　ア数 バクテリア抽出物のみ　　　　　　　　１５００ヒ　　
　　ト　　　便　　　　　　　２．５％（ｗ／ｖ）　　
　　　２０００牛　　　　　乳　　　　１２．５％（ｖ
／ｖ）　　　ｓｏｏ。
ヒ　　ト　　唾　液　　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ）
　　　　　ｓｏｏ。
ヒ　　　　ト　　　尿　　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ
）　　　　　９０００ヒ　　ト　　精　液　　　　　　
　２．５％（ｖ／ｖ）　　　　　９０００ヒ　　ト　　
血　液　　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ）　　　　　９
０００ヒ　　ト　血　清　　　　　　１２．５％（ｖ／
ｖ）　　　　　９０００ヒ　　ト　　た　ん　　　　　
　１２．５％（ｖ／ｖ）　　　　　９０００更に、本方
法は更に改質され感度を改良できる。
例えば、多段捕捉放出サイクルで熱溶出と化学溶出の組
合わせは雑音に対する信号の比を単一形能の溶出、多段
熱溶用単独または多段化学溶出単独より５倍良好にする
。
同一放出または溶出法の適用は支持体から同一バックグ
ラウンドを放出する傾向がある。然しなから、異なる放
出条件は他の溶出される支持体にバックグラウンドを保
留する傾向がある。バックグラウンドは二つの物理的ま
たは化学的に相違する条件でターゲットに同一の作用を
することはあり得ない。
磁性ビーズ上のターゲット−プローブ錯体の代表的化学
的溶出はビーズを室温で１分間３ＭＧｕＳＣＮに接触せ
しめることである。熱溶出の実施例は前に記載されてい
る。
バクテリアを検出する能力もまたプローブをリボゾーム
のＲＮＡ配列に向けることにより改良される。リボゾー
ムＲＮＡ配列は遺伝子ＤＮＡおよび臨床的に意味のある
プラスミドＤＮＡと比較して細胞当りターゲットが１０
０倍増加する。
かくして、本発明はターゲット捕捉およびバックグラウ
ンドの減少および親和力検定を実施する装置に特徴があ
る。好ましい態様を説明し記載したが本発明は変化およ
び修飾でき、従って説明した正確な詳細に限定はなく、
か＼る変化や変更は本請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
第１図は本検定法の手順の略工程図を示す。 第２図は本検定の多段プローブ法の略工程図を示す。 第３図は第２図に示した本検定の改良を示す略工程図で
ある。 第４図は本検定を実施するための装置の略工程を示す。 第５図はエンテロトキシン遺伝子の機能部分を示す。 （外４名） 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　Ｉａ クーアント　ＤＮＡ 駅枡核誌寸　１闘７研杵＋耳吐物 ＋ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、　４ ：Ｌチーシコン１０ 全文訂正明細書 １、発明の名称〕 標的およびバックグラウンド捕獲法ならびにアフィニテ
ィー検定用装置 ２、特許請求の範囲〕 （１）生物学的結合対の一員である標的分子について試
料を検定する方法であって、 α、試料を結合条件下で試薬および回収可能な支持体と
接触させ、ここでその試薬は第１抗リガンドプローブお
よび第２抗リガンドプローブから成り、第１および第２
プローブは標的分子と結合して複合体を形成することが
でき、第１プローブは結合条件下で回収可能な支持体と
結合でき、そして第２プローブは検出可能な標識成分を
含み；ｂ、試料から回収可能な支持体を実質的に分離し
て、試料中の標的の存在下で標的と第１および第２プロ
ーブを含む分離生成物を形成させ；そして Ｃ０その分離生成物を、標的分子の存在を示す標識成分
の存在について監視する； ことから成る上記方法。 （２）上記標的はポリヌクレオチドを含み、上記第１お
よび第２プローブは標的の相互に排他的な部分と結合し
うるポリヌクレオチドから成る、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 （３）上記の回収可能な支持体はビーズから成る、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 （４）上記ビーズは磁場と相互作用し得る、特許請求の
範囲第３項記載の方法。 （５）回収可能な支持体は試料中に実質的に均質分散し
得る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （６）上記の第２プローブはその第２プローブが標的と
結合していない時第２支持体とさらに結合でき、上記方
法は試料を結合条件下で第２支持体と接触させて第２支
持体と第２プローブとの間に複合体を形成させ、その第
２支持体を試料から分離して未結合第２プローブを除き
、それによりバックグラウンドを低下させることを特徴
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７）標的ポリヌクレオチドを含む可能性のある試料を
、その試料媒体中に実質的に均質分散でき且つ標的ポリ
ヌクレオチドと特異的に会合しうる回収可能なビーズと
接触させることから成る、標的ポリヌクレオチド分子の
捕獲方法。 （８）上記ビーズはプローブポリヌクレオチドによって
標的ポリヌクレオチドと会合できる、特許請求の範囲第
７項記載の方法。 （９）上記のプローブポリヌクレオチドは回収可能な支
持体および標的分子と会合できる、特許請求の範囲第８
項記載の方法。 （ト）上記ビーズはポリスチレンから成る、特許請求の
範囲第７項記載の方法。 （１１）上記の回収可能なビーズは磁場と相互作用しう
る、特許請求の範囲第７項記載の方法。 （至）上記試料を、上記第１プローブを除いた標的部分
と会合し得る検出可能な第２ポリヌクレオチドプローブ
と接触させる工程をさらに含む、特許請求の範囲第７項
記載の方法。 （１３）回収可能な支持体を試料から分離し、その回収
可能支持体を第２媒体と接触させ、その第２媒体を放出
条件に置いて回収可能支持体から標的を放出させる工程
をさらに含む、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ０４）第２媒体を第２支持体と接触させる追加工程をき
み、その第２支持体は結合条件下で標的と複合体を形成
して標的分子を捕獲しうる、特許請求の範囲第１３項記
載の方法。 （１５）回収可能な第２支持体を第３媒体と接触させ、
その第３媒体を放出条件に置いて回収可能な第２支持体
から標的を放出させる工程をさらに含む、特許請求の範
囲第１４項記載の方法。 （１６）第３媒体を、結合条件下で標的と複合体を形成
し得る支持体と接触させて標的を再捕獲せしめる工程を
さらに含む、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 （１７）上記第２媒体における放出条件と上記第３媒体
における放出条件は物理的および化学的に相違ｔ、て５
・る、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 （１８）第２媒体における放出条件は化学的溶出および
熱溶出を含む放出方法の群から選ばれる、特許請求の範
囲第１７項記載の方法。 （１９）第１および第２支持体は化学的に異なっている
、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ０の試料媒体中で実質的に均質な分散体を形成でき且つ
その試料媒体から分離できる回収可能な支持体、および
結合条件下でその回収可能な支持体と標的ポリヌクレオ
チド分子と結合できる第４プローブを含む、標的ポリヌ
クレオチド捕獲用のキット。 （２１）標的分子と結合して標的分子および第１プロー
ブと複合体を形成でき、且つ検出可能な標識成分を含む
第２プローブをさらに含む、特許請求の範囲第２０項記
載のキット。 Ｃ２２）試料媒体中で実質的に均質な分散体を形成でき
、且つ標的ポリヌクレオチドと特異的に結合でき、しか
もその試料媒体から分離できる回収可能なビーズを含む
、標的ポリヌクレオチド捕獲用のキット。 Ｃ２３）上記ビーズは磁場と相互作用しうる、特許請求
の範囲第２２項記載のキット。 圀）試料媒体中の標的ポリヌクレオチドおよびその試料
媒体中で実質的に均質分散でき且つ標的と複合体を形成
できる支持体を収容するのに適した反応室、および標的
の結合した支持体を試料媒体から分離するための手段か
ら成る、標的ポリヌクレオチド検定用の装置。 Ｃ２５）回収可能な支持体を試料媒体から分離するため
の磁気手段をさらに含む、特許請求の範囲第２４項記載
の装置。 Ｃ２６）回収可能な支持体から第、２媒体中へ標的を放
出させるための手段をさらに含む、特許請求の範囲第２
５項記載の装置。 Ｃ２７）標的と結合したプローブに担持された標識成分
を検出する手段をさらに含む、特許請求の範囲第２６項
記載の装置。 （２８）上記支持体は、標的と複合体を形成でき且つ支
持体と会合できる少なくとも１つのプローブを介して標
的と複合体を特徴する特許請求の範囲第２４項記載の装
置。 （２９）標的と結合していない標識成分含有プローブを
支持体と会合させる手段を含む、特許請求の範囲第２７
項記載の装置。 （３０）試料を、結合条件下で標的と複合体を形成でき
且つ標的と結合していない時は支持体と複合体を形成し
うる標識成分含有プローブを含む試薬と、結合条件下で
接触させ；上記試料と試薬を、未結合プローブと結合し
うる支持体と接触させてバックグラウンドを減少させる
；各工程を含む標的分子について試料を検定する方法。 （３１）上記プローブは標的と結合しうる塩基配列を含
む上記支持体に結合可能なホモポリマーリガンドを含む
、特許請求の範囲第３０項記載の方法。 （３２）上記プローブは上記プローブが標的と結合して
いない時よりも標的と結合している時により低温で上記
支持体から放出される、特許請求の範囲第３１項記載の
方法。 （３３）上記リガンドは少なくとも３個の連続した塩基
配列を上記標的と共有する１０ｍａｒホモポリホモポリ
マーリガンド特許請求の範囲第３１項記載の方法。 （３４）標的ポリヌクレオチドと特異的に結合でき且つ
液状媒体中に分散しうるビーズ。 （３５）上記ビーズは磁場と相互作用しうる、特許請求
の範囲第３４項記載のビーズ。 （３６）プローブと結合しうるオリゴヌクレオチドリガ
ンドをさらに含む、特許請求の範囲第３４項記載のビー
ズ。 （３７）上記ビーズはポリスチレンから成る、特許請求
の範囲第３４項記載のビーズ。 （３８）上記ビーズは１〜１０ミクロンの直径を有する
、特許請求の範囲第３４項記載のビーズ。 （３９）上記ビーズはホモポリマーと共有結合しうる表
面を有する、特許請求の範囲第３６項記載のビーズ。 （４０）第１抗リガンドをもつ第１支持体と共に使用す
る試薬組成物であって、標的分子と複合体を形成するこ
とができ且つ上記の第１抗リガンドと結合しうる第１リ
ガンドを含む第１プローブ、およびその第１プローブに
結合した標的分子と複合体を形成することができ且つ検
出可能な標識成分を有する第２プローブから成る上記試
薬組成物。 （４１）上記の第２プローブは第２支持体上に担持され
た第２抗リガンドと結合しうる第２リガンド成分を含む
、特許請求の範囲第４０項記載の試薬組成物。 ３、発明の詳細な説明〕 （産業上の利用分野） 本発明は、標的分子の捕獲に使用するための方法、試薬
、組成物、キットおよび装置に関する。 詳しくは、本発明は臨床試料からデオキシリポ核酸（Ｄ
ＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を捕獲するための方法
、試薬、組成物およびキットに関する。 本発明の態様は、非放射性標識技術および自動化に適合
しうる臨床試料中の標的核酸の迅速かつ高感度の検出方
法を提供する。 （従来技術） 以下の定義は本発明を理解しやす（するために提供され
る。本明細書で用いる０生物学的績合対°′なる用語は
、自然親和力または結合能を示すあらゆる分子対を意味
する。本明細書で用いる”リガンドなる用語は、生物学
的結合対の１つの分子を指し、そして”抗リガンドまた
は６レセプター”なる用語は、生物学的結合対の他方の
分子を指す。例えば、制限するものでないが、本発明の
態様は生物学的結合対が２本の相補的なポリ核酸鎖であ
る核酸ハイブリダイゼーション検定に適用される。ポリ
核酸鎖の一方はリガンドと呼ばれ、他方は抗リガンドと
呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対には抗原と抗
体、薬物と薬物レセプタ一部位、および酵素と酵素基質
が包含される。 ゛プローブ”なる用語は、標的抗リガンドと選択的に結
合しうる既知性質のリガンドを意味する。 核酸に適用するとき、６プローブは標的鋼に相補的な塩
基配列をもつ核酸鎖を指す。 ６標識”′なる用語は検出可能な分子成分を意味し、例
えば制限するものでないが、放射性同位体、酵素、発光
物質、および染料を包含する。。試薬”なる用語は広義
に使用され、検出可能な応答へ導く反応に関与するあら
ゆる分子成分を含む。６コフアクター（補助因子）″”
なる用語は、試薬との反応に関与するあらゆる分子成分
を含み、広い意味で使用される。 ６回収可能°′なる用語は、媒体中に実質的に分散でき
且つ固定化、濾過、分配などによりその媒体から分離し
うる物質を説明するために広い意味で使用される。 ６支持体゛なる用語は、単独で使用する場合、フィルタ
ーや膜のような慣用支持体ならびに回収可能な支持体を
包含する。 リガンドと抗リガンドの結合に関して６可逆的”なる用
語は、リガンドと抗リガンドの全体的な化学的性質を永
久に変えることのない変化を加える際に、結合または解
離しうろことを意味する。例えば制限するものでないが
、可逆的結合はリガンドや抗リガンドを破壊しないｐＨ
１温度およびイオン強度の変化により制御されるこの種
の結合および解離を包含するであろう。遺伝情報は生細
胞中の糸状のＤＮＡ分子に貯えられる。生体内において
、ＤＮＡ分子は二重らせん構造をしており、それぞれの
ＤＮＡ鎖はヌクレオチドの鎖である。 各ヌクレオチドは４種の塩基：すなわちアデニン（Ａ）
、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ
）のうちの１種により特徴づけられる。これらの塩基は
、官能基の向きにより、ある種の塩基対が引きつけ合っ
て水素結合により結合するという意味で相補的である。 一方のＤＮＡ鎖中のアデニンは他方の相補鎖中のチミン
と対合する。一方のＤＮＡ鎖中のグアニンは他方の相補
鎖中のシトシンと対合する。ＲＮＡでは、チミン塩基が
ウラシル（Ｕ）によって置換され、ウラシルは他方の相
補鎖中のシトシンと対合する。 ＤＮＡは共有結合されたデオキシリボヌクレオチド鎖か
ら成り、セしてＲＮＡは共有結合されたりボヌクレオチ
ド鎖から成る。生物の遺伝暗号は塩基対の配列中のＤＮ
Ａ鎖に担持される。 それぞれの核酸は、１つのヌクレオチドの糖の５′ヒド
ロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３′ヒドロキシル
基との間のホスホジエステル結合により結合される。自
然界に存在するＤＮＡまたはＲＮＡのそれぞれの線状鎖
は、遊離の５′ヒドロキシル基をもつ１つの末端と３′
ヒドロキシル基をもつもう１つの末端を有する。ポリヌ
クレオチドの末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関
連して５′末端または３′末端と呼ばれる。ＤＮＡおよ
びＲＮＡの相補鎖は、一方の鎖の３′末端が他方の鎖の
５′末端に配向および結合して逆平行複合体を形成して
いる。 核酸ハイブリダイゼーション検定は、２本の核酸鎖が相
補領域で対合する性質に基づいている。 現在、核酸ハイブリダイゼーション検定は完全なりＮＡ
分子、核酸混合物または核酸フラグメント混合物中に存
在する唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列もしくは特定
遺伝子を検出および同定するために主として使用されて
いる。 組織または培養試料から抽出された全ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ中の唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしくは特定遺伝
子の同定は、生理学的または病理学的症状の存在を示す
。特に、ヒトまたは動物組織から抽出された全ＤＮＡま
たはＲＮＡ中の唯一のＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしくは
特定遺伝子の同定は鎌状赤血球貧血のような遺伝病、組
織適合性、癌および前癌状態、または細菌やウィルス感
染の存在を示す。細菌培養物または細菌を含む組織から
抽出された全ＤＮＡまたはＲＮＡ中の唯一のＤＮＡまた
はＲＮＡ配列もしくは特定遺伝子の同定は抗生物質耐性
、毒素、ウィルスまたはプラスミドの存在を示し、また
細菌型の同定をもたらす。 従って、核酸ハイブリダイゼーション検定は病気の診断
および検査において大きな可能性を持っている。さらに
、核酸ハイブリダイゼーション検定が植物の病因または
毒素産生細菌を検出するために使用される農業および食
品加工の分野においてもその可能性が存在する。 最も広く使用される核酸ハイブリダイゼーション検定法
の１つは、サザンプロットフィルターハイプリダイゼー
ション法またはただ単にサザン法として知られるもので
ある（　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　、　Ｊ。 Ｎｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｉ、　９８．５０３．１９７５
を参照されたい）。サザン法は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ
配列を同定するために使用される。この方法は一般にＡ
ＮＡまたはＤＮＡ試料をニトロセルロースシートに固定
することにより行われる。固定化ＲＮＡまたはＤＮＡ試
料は、標的配列に相補的な塩基配列を有しかつ検出可能
な放射性成分を含む放射性標識プローブＤＮＡ鎖と接触
させ、プローブとＤＮＡ試料とのハイブリダイゼーショ
ン（ハイブリッド形成）を起こさせる。 ハイブリダイゼーション法は一般に極めて特異的である
。もしも標識プローブとＤＮＡまたはＲＮＡ試料とが実
質的に相補的な塩基対機構を共有しないならば、これら
の２本のヌクレオチド鎖は結合しないであろう。ハイブ
リダイゼーションは所定の条件に応じて３〜４８時間を
要する。 しかしながら、実際問題として、検出の際に四バックグ
ラウンドノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｎｏｉ−ｓｇ
）”　として現われる標識プローブと支持体の非特異的
結合が常に存在する。バックグラウンドノイズは検定感
度を低減させる。ハイブリダイズされないＤＮＡプロー
ブはその後洗い落とされる。 ニトロセルロースシートはＸ線フイルムノシート上に置
いて露光される。Ｘ′ｍフィルムはフィルムの露光面を
現像して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするが故に
目的の塩基対配列をもつＤＮＡフラグメントを同定する
。 サザン検定法と共に放射性標識剤を使用することにより
、核酸検定を臨床試料に応用することが可能になった。 放射性崩壊は無関係のタンパク質および有機物質を含む
臨床試料においてでさえも検出可能である。しかしなが
ら、無関係のタンパク質および有機物質の存在は、プロ
ーブと支持体の非特異的結合の一因になる。さらに、放
射性標識技術の使用は、Ｘ線フィルム上のバンドを視覚
化するために長時間の露出を必要とする。一般的なサザ
ン法では露出のために１〜７日を要する。 さらに、放射性標識剤の使用は特別の実験室手段および
ライセンスが必要である。 放射性同位元素標識を使用する検定に関連した上記の諸
問題点は、非同位元素標識を使用する技術の開発へ導い
た。非同位元素標識の例には酵素、発光剤および染料が
含まれる。発光標識は外部エネルギー源による励起の際
に光を発し、励起エネルギー源に応じて次の種類：すな
わち高エネルギー粒子からエネルギーを得る放射線発光
標識；化学反応からエネルギーを得る化学発光標識；励
起エネルギーが生物学的系に適用される生物発光標識；
および赤外線、可視光線または紫外線の電磁線（フォト
ン）単位により励起しつるフォトルミネッセンスまたは
螢光標識；に類別される。一般には、スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら、Ｑｎ、　Ｃ１１ｔ；、　Ｂｉｏｃｈ−ｇｆｎ、
、、１８：２５３．２７４（１９８１）を参照されたい
。 非放射性エネルギー源により励起可能な標識を使用する
非同位元素検定法は、放射性同位元素標識を使用する検
定法に伴う健康への危険性およびライセンスの問題が回
避される。さらに、非同位元素検定法はＸ線フィルムの
使用に伴う長時間露出を避けて迅速な検出が保証されて
いる。 しかしながら、非同位元素検定は信頼しうると見なすに
足る感度または検定特異性を持っていなかった。発光検
定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質および他
の分子の存在が励起光線の散乱を起こし、発光標識の発
光スペクトル中の光を吸収して発光プローブの消光をも
たらす。 酵素検定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質お
よび他の分子の存在が酵素活性を阻害する。 同様に、比色定量検定では、生物学的試料に含まれるタ
ンパク質および他の物質のために色の変化が検出できな
い。 本発明の態様は、支持体および磁性粒子を含めた回収可
能な支持体上での標的およびバックグラウンドの捕獲に
関する。磁性粒子はＤＮＡ、ＲＮＡ。 ポリペプチドおよび一定の配列をもつ多重単位分子のよ
うなオリゴマーを含む有機化合物の合成用支持体として
提案された。例えば、スチーブン・ニー・ベンナー（５
ｔａｖｅｆＬＡ＋Ｂｅｎｔｓｅｒ　）およびジエネテイ
ツクス・インスチチュー）　（ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ　）　　の欧州特許出願第８３１１２４９
３゜８号明細書を参照されたい。しかしながら、磁性粒
子は標的捕獲およびバックグラウンド除去のための回収
可能な支持体として提案されたことはなかった。 磁性粒子の他の利用には血液中の磁性流体、ノイバウア
ー（Ｒ，Ｎｍｕｂａｗｅｒ　）、ＩＥＥＥ　　ｔｒａｎ
ｓａ−ｃｔｉｏｆＬａ　ｏｎ　ｍａｇｎｇｔｉｃｓ　Ｍ
ＡＧ−９，４４５（１９７３）を参照；生体分子の分離
のための官能基の結合、ギアバー（１，０ｉａτｅ９−
）の米国特許第３９７０５１８号明細書を参照：細胞表
面レセプターの標識付け、マーゲル（Ｓ、　Ｍａｒｇｅ
ｔ　）ら、Ｊｏｕｒ、　Ｉｍｍ、Ｍｇｔｈ、　２８　：
２８　：　３４１〜５３（１９７９）を参照；治療中の
磁性目標にするための薬物への結合、センアイ（Ａ、　
Ｓｅｎｙｇｔ　）ら、すｐｐ　、−Ｐｈ１１ｇ、、　　
４　９　　（６）　　二　３５７８（１９７８）　、ウ
イーダー（Ｋ、　Ｗｉｔｄｅｒ　）ら、Ｐｒｏ、Ｓｏｃ
、　　ｏｆＥｚｐ、ｐ−ｉｏ、、Ｍｅｄ、、５８　：１
４１　（１９７８）、　モスバッハＣＫ、　Ｍｏ５ｂａ
ｃｈ　）　　およびシュレーダー（Ｕ、５ｈｒｏｅｄａ
ｒ　）、　ＦＥＢｓ　１ｅｔｔｅｒｓ　　１０２：１１
２（１９７９）を参照；ウィルス、細菌および他の細胞
の選択的分離、モルデー（Ｒ，Ｍｏ１ｄａｙ　）ら、Ｎ
ａｔｒｂｒｅ　２６８：４３８（１９７７）を参照：お
よび生物学的重合体用のゲルアンイニティークロマトグ
ラフィーにおしする担体としての磁性粒子の使用、モス
バッハ（Ｋ、　Ｍｏ５ｂａｃｈ　）およびアンダーソン
（Ｌ−Ａｎｄｔｒｒｓｏｎ　）、ｐａｔｌＬｒｅ　２７
０　：　３５９（１９７７）を参照；が含まれ、上記の
文献は参照によりここに引用される。 慣用の回収不可能な支持体上での標的の捕獲をもたらす
２プローブ系の使用は、）Ｊｒｂｃｌｅｉｃ　Ａｃ１−
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４　（１２）：５０３７
　（１９８６）、”アフィニティーに基づくハイブリッ
ド捕集による核酸ハイブリッドの迅速定量化（Ｆａｓｔ
　Ｑｕａｎ−１ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｓ　ｂｙＡｆｆｉｎｉｔ
ｙ−Ｂａｓｅｄ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　）”と題するアンークリスチン・シュエネン（Ａｎｒ
ｂ−Ｃｈｒｉｓｔｉｎｔｒ　Ｓｙｗ；ｔＬｅｎ　）、マ
ツチ・ラークンネン（Ｍａｔｔｉ　Ｌａａｋｓｏｎｅｎ
　）およびハンス・セダーランド（Ｈａｒｔｓ　Ｓδ’
ｄｇｒｌｕｎｄ）により著された文献中で提案された。 （発明の概要） 本発明の目的は、対象となる標的分子について検定を行
うための方法、試薬、組成物、キットおよび装置を提供
することである。他の目的は以後に提示されるであろう
。便宜上、制限するものではないが、本発明の態様は標
的捕獲、バックグラウンド捕獲、およびこれらの組合せ
の分野に分けることができる。　　　□ 最初に標的捕獲について述べると、本発明の態様は標的
分子を分離するための捕獲／放出サイクルを特徴とする
。この方法は標的分子を含む可能性のある試料媒体を、
プローブおよび第１支持体（結合条件下で少なくとも１
つのプローブと会合した又は会合しうる支持体）と接触
させることを含む。プローブは標的分子と選択的にかつ
可逆的に結合して、プローブ、標的分子および回収可能
な第１支持体から成る複合体を形成することができる。 次に、支持体は試料媒体から分離して第２媒体と接触さ
せる。その後、支持体を放出条件に付して支持体から標
的分子を放出させ、そして支持体を第２媒体から分離す
る。次いで、第２支持体を結合条件下に上記の第２媒体
と接触させる。 第２支持体は標的分子と選択的に結合しうる少なくとも
１つのプローブと会合されるか、又は会合することがで
きる。結合条件下で、標的分子はその後の処理のために
第２支持体に会合したプローブと複合体を形成する。 好ましくは、第１支持体は試料媒体中に実質上均質に分
散でき且つ試料媒体から物理的に分離・回収でき、ある
いは試料媒体中で固定化しりるという意味で回収可能で
ある。 第１媒体からの第１支持体の分離は、第１支持体に非特
異的に結合した細胞破片を除去する。さらに、第２支持
体への標的分子の結合は、検出のために標的分子を濃縮
して更なる精製のための放出／捕獲サイクルを可能にす
る。 本方法の別の態様は回収可能な支持体を特徴とする。本
方法は標的核酸を含む可能性のある試料を、プローブ成
分と会合した回収可能な支持体と接触させることを含む
。回収可能な支持体は試料媒体中に実質上均質に分散で
きる。プローブ成分は例えばプローブ成分と回収可能な
支持体との共有結合により、または親和力会合、水素結
合あるいは非特異的会合により、回収可能な支持体と会
合させることができる。 支持体は多くの形状をとることができ、例えば支持体含
有試料媒体をふるいに通す際に回収しうる特定の形に縮
小したニトロセルロース；磁場をかけた際に試料媒体中
を移動しうるように、磁性粒子または類似物を宮浸させ
たニトロセルロース；濾過可能であるか、または電磁性
を示すビーズもしくは粒子；および水性媒体の表面に分
離するポリスチレンビーズが含まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質上均質に分散
する能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る回収
可能な支持体を包含する。好１しくけ、磁性ビーズはプ
ローブ成分と磁性支持体粒子との共有結合または会合を
容易にする一級アミン官能基を含む。好ましくは、磁性
支持体ビーズは単磁区磁石（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉ
ｎ　ｍａｇｎｅｔ　）であって、残留磁気を示さない超
常磁性である。第１プローブは結合条件下で抗リガンド
と特異的に結合し９るプローブリガンド成分を含む。回
収可能な支持体は試料媒体中で実質上均質に分散でき、
結合条件下にリガンドと結合して標的−プローブ支持体
複合体を形成しうる少なくとも１つの抗リガンド成分を
含む。次に、回収可能な支持体と試料媒体とを分離して
、試料媒体はさらに処理される。 本発明の態様は、無関係の物質、を含む臨床試料媒体か
ら標的分子を捕獲するのに適している。試料媒体をプロ
ーブまたは回収可能な支持体と接触させる順序は選択に
かかわる問題である。しかしながら、その選択は一方で
はプローブと標的との曲の結合速度論、他方ではプロー
ブリガンドと支持体抗リガンドとの間の結合速度論によ
り影響される。 ポリヌクレオチド標的分子およびホモポリマーリガンド
および抗リガンドに適用した場合、ホモポリマーリガン
ドと抗リガンドの結合は一般にプローブと標的の結合よ
りも速い。プローブの標的への結合は、プローブリガン
ドが支持体抗リガンドと結合した後では立体的に妨害さ
れる。好適な態様は試料媒体と試薬とを接触させ、その
混合物をハイブリダイゼーション条件に置くことを包含
する。次に、回収可能な支持体は試薬と試料媒体の混合
物中に分散させて、プローブ−支持体複合体の形成に先
立って標的−プローブ複合体を形成させる。 本発明の別の態様は多重プローブ系を特徴とする。好ま
しくは、本方法は上記のような第１プローブおよび標的
分子に結合でき且つ検出可能な標識成分をもつ少なくと
も１種の第２プローブを包含する。第２プローブは標的
−（第１および第２）プローブ−支持体複合体を形成す
ることができる。 試料媒体からの回収可能な支持体の分離工程は、標的−
（第１および第２）ブローブー支持体複合体から無関係
の物質を除くのみならず、標的分子と結合しないすべて
の第２プローブも分離スル。 標的と結合しない第２プローブはバックグラウンドノイ
ズの一因になり、偽の信号が標的の存在を示すことにな
る。 更なる処理は、標的−（第１および第２）プローブ複合
体を回収可能な支持体から第２媒体中へ放出させ、次い
でその複合体を新たな支持体へ再結合させることを包含
する。回収可能な第１支持体は検定法を妨害しうる非特
異的結合物質を保持するかもしれない。従って、回収可
能な支持体からの標的−プローブ複合体の放出および回
収可能な支持体の除去の後に、プローブリガンドと結合
しうる抗リガンド成分をもつ第２支持体を標的−プロー
ブ複合体と結合条件下で接触せしめて、標的−プローブ
複合体のそれ以上の精製および濃縮のために標的−プロ
ーブの結合または捕獲サイクルをさらに続行することが
できる。 更なる処理はバックグラウンド捕獲を包含する。 本発明の別の態様は、第２プローブが第２リガンド成分
をもつ方法を含む。この方法はさらに第２抗リガンド成
分をもつバックグラウンド支持体を含む。第２リガンド
成分と第２抗リガンド成分は、第２プローブが標的分子
に結合しないときだけ、結合条件下で安定して結合でき
る。この方法はさらに標的に結合しない第２プローブを
含む可能性のある媒体をバックグラウンド支持体と結合
条件下で接触させることを含む。次に、バックグラウン
ド支持体は媒体から分離して未結合第２プローブを除き
、それによりバックグラウンドノイズを池少させる。 ゛バックグラウンド支持体”なる用語は通常の意味で使
用され、フィルター、膜および回収可能な支持体を包含
する。バックグラウンド支持体への結合は解離可能でお
る必要はない。 好適な回収可能支持体には、例えば媒体中に分散できし
かも媒体から分離しうる粒子、顆粒、ビーズまたはフィ
ラメントが含まれるが、これらに限定されない。分離方
法としては、例えば濾過、遠心、沈澱、表面浮選、沈降
、またけ電磁場の導入などがある。 本発明方法はポリヌクレオチド標的分子に応用できる。 ｔＥ’！しくけ、第１および第２プローブは、標的また
はプローブが固定化されている場合とは対照的に、”溶
解した状態パでポリヌクレオチド標的と速やかに結合す
る。 溶液中に実質上分散しうる回収可能支持体は、回収可能
支持体とプローブとの相互作用（これは”溶解状態″の
−・イブリダイゼ−７ヨンを模倣スるものである）を可
能にする。溶解状態では、ハイブリダイゼーションは約
３〜１５分で完結する。 本方法の迅速なハイブリダイゼーシヨンと簡易さにより
自動化が可能である。本方法は臨床試料中に含まれる核
酸配列を無関係の物質から分離することができ、それに
より本方法を非同位元素標識技術に応用することが可能
である。 標的分子がポリヌク７オチドである本方法の態様は、試
料媒体と試薬とを結合条件下で接触させることを含む。 その試薬には少なくとも１つの第１ポリヌクレオチドプ
ローブおよび少なくとも１つの第２ポリヌクレオチドプ
ローブが含１れる。 第１プローブは標的分子と複合体を形成することができ
、第１ホモポリマーリガンド成分を有する。 第２プローブは第１プローブに結合した標的分子と複合
体を形成することができる。その第２プローブは第１プ
ローブの第１ホモポリマーリガンドとは異なる第２ホモ
ポリマーリガンド成分をもつ標識成分を含む。次に試薬
および試料媒体はバックグラウンド支持体と標的捕獲支
持体とに接触させる。バックグラウンド支持体は、第２
プローブが標的と結合しない場合、その第２プローブの
第２ホモポリマーリガンド成分に結合しうる少なくとも
１つの第２ホモポリマ一抗リガンド成分を含む。標的捕
獲支持体は第１プローブの第１ホモポリマーリガンド成
分に結合しつる少なくとも１つの第１ホモポリマー成分
を含む。バンクグラウンド支持体および標的捕獲支持体
はバックグラウンドノイズを除き、さらに標的捕獲支持
体はその後の処理のために標的−（第１および第２）プ
ローブ複合体を濃縮し、且つ細胞破片からその複合体を
分離する。その後の処理には標的分子の存在を示す標識
成分の検出が含まれる。 今や、バックグラウンド捕獲に関する本発明の態様をよ
り詳細に説明すると、１つの態様にはプ（＞ｏ） ローブと標的が複合体を形成する方法が含１れる。 次に、複合体を形成しなかったプローブが結合条件下で
支持体と接触される。その支持体は未結合プローブと選
択的に結合することができる。その後、支持体はプロー
ブ−標的複合体から分離される。 本発明のさらに別な態様は、その後の処理のために多数
の標的を分離する方法を包含する。 １つの態様には多数の支持体上の標的分子に特異的なプ
ローブの逐次付加および除去が含捷れる。 別の態様には試料を第１プローブ系列と接触させて、そ
の標的およびプローブを多数の支持体上へ捕獲する方法
が含１れる。第１プローブ系列は支持体と会合しうるリ
ガンドを富む。第１プローブ系列には、各標的分子に特
異的な、支持体と結合しうる、多数の標的すべてのため
のプローブが含壕れる。支持体は互いから分離すること
ができ、その分離は支持体と共に分離される個々のタイ
プの標的分子をもたらす。 本発明の別の態様は試薬組成物を包含する。試薬組成物
には第１プローブおよび第２プローブが含まれる。第１
プローブは標的分子と複合体を形成することができ、結
合条件下で抗リガンドと特異的に結合しうるプローブリ
ガンド成分を含む。 第２プローブは標的分子と複合体を形成することができ
、検出可能な標識成分を含む。この試薬組成物は抗リガ
ンド成分をもつ回収可能な支持体と共に使用する場合、
試料媒体中の標的を捕獲して検出するのに使用される。 本試薬組成物の別の態様は、第２プローブが標的分子に
結合しない場合のみ、抗リガンドと安定して結合できる
第２リガンド成分をもつ第２プローブを包含する。この
試薬組成物は、未結合第２プローブを含む可能性のある
試料を、第２抗リガンド成分をもつバックグラウンド支
持体と接触させることにより、バックグラウンドノイズ
を減少させる。 別の態様は試料媒体中に実質的に均質分散でき且つプロ
ーブ上のオリゴヌクレオチドリガンドと結合しうるオリ
ゴヌクレオチド抗リガンドを有する支持体を含む。 支持体の好適な態様には、例えば分離可能な粒子、粗粒
、フィラメントおよびビーズが含まれる。 分離手段には例えば沈殿、沈降、浮選、濾過、遠心およ
び電磁気などが含まれ、これらに限定されない。 好適な態様は、実質的に均質分散でき且つ濾過や浮選に
より媒体から分離できる直径が１０〜１００ミクロンの
ポリスチレンビーズを包含する。 他の好適な態様は強磁性ビーズを含む。ＢＩＯ−ＭＡＧ
という商標名で市販されている強磁性ビーズは実質的に
水性媒体中に均質分散でき、しかも電磁場により回収ま
たは固定化することができる。 この強磁性ビーズはアミン反応性被膜で覆われた鉄心を
含む。ビーズはほぼ球形でろって、１ミクロンの直径を
有する。ポリスチレンビーズおよび強磁性ビーズは抗リ
ガンド成分を含むように処理される。 本発明の別の態様は、生物学的結合対の一部である標的
分子について検定を行うためのキットを包含する。標的
が特定の塩基配列をもつポリヌクレオチドである場合、
キットは第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリ
ヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。第１およ
び第２プローブは相互に排他的な標的部分と結合して、
両プローブが標的に結合した複合体を形成することがで
きる。第１プローブは結合条件下で第１支持体と可逆的
に結合でき、第２プローブは検出可能な標識成分を含む
。キットはさらに第１支持体を包含し、この支持体は試
料媒体からの選択的分離を可能にする標的−プローブと
の複合体を形成しうる。 本キットの別の態様は第２プローブおよびバックグラウ
ンド支持体を包含する。第２プローブは、標的と結合し
ない時、バックグラウンド支持体と選択的に結合するこ
とができる。バックグラウンド支持体は、非特異的に結
合した第２プローブを除くために、試薬を含有する媒体
から分離できる。 本発明の別の態様は、本方法に従って検定を行うための
装置を包含する。標的がポリヌクレオチドである場合、
その装置は試薬および標的を実質的に均質な混合状態で
収容するのに適した反応室を含む。試薬には第１および
第２ポリヌクレオチドプローブが含まれる。各プローブ
は相互に排他的な標的部分と結合して、両プローブが標
的と結合した複合体を形成することができる。第１プロ
ーブは結合条件下で第１支持体と可逆的に結合でき、そ
して第２プローブは検出可能な標識成分を含む。その装
置はさらに、第１支持体を試薬および試料と接触させて
、第１プローブおよび標的−プローブ複合体をその支持
体に結合させるための手段を含む。その装置はさらに、
支持体に結合した標的−プローブ複合体を形成すべく試
料、試薬および支持体を結合状態にするための手段を含
む。 その装置はさらに、第１プローブを解離状態にするため
の手段を含む。最後に、その装置は試料および試薬から
支持体を分離するための手段を含む。 ６反応容器”なる用語は広義に使用され、例えば制限す
るものでないがキュベツト、試験管、毛細管などを富め
たすべての収容手段を包含する。 試料、試薬および支持体を結合状態にしたり、あるいは
試薬および支持体を解離状態にするたあの適当な手段は
、例えばポリヌクレオチド鎖を選択的に変性またはアニ
ーリングするために試料、試薬および支持体の温度を上
げたり下げたりしつる温度制御を包含する。 試料または試薬から支持体を分離するための適当な手段
には、例えば磁性ビーズと共に使用される電磁石、固着
支持体に固定された繊維、ポリスチレン粗粒と共に使用
される遠心分離機などが含まれる。 本発明の別の態様は、標的と特異的に結合しなかった標
識成分含有第２プローブを除くために、試薬および標的
をバックグラウンド支持体と結合条件下で接触させるた
めの手段を包貧する。 発光標識成分と共に使用するのに適した本装置の態様は
適当な標識励起手段を含む。螢元標繊成分と共に使用さ
れる装装置は、適当な波長範囲を定めるフィルターを備
えたレーザーまたは光線放射装置を含む。化学発光標識
成分と共に使用される装置は、反応室にコファクターを
注入するための注入装置を含む。 今や、本発明の好適な態様を図示した図面、特に第１図
について見ると、標的ポリヌクレオチド鎖の検定のため
に必要な試薬組成物と共に検定手順が模式図により示さ
れている。通常の検定法では多数の標的鎖が含まれ、多
数のプローブ鎖を使用して検定が行われるであろう。し
かしながら、簡略化して本発明を理解しやすくするため
に、図面には限られた数のプローブ、支持体および標的
のみを示す。第１図は回収可能な支持体を使用する方法
に関する。 第１図に示す検定の工程１は、細胞を含む臨床試料によ
り開始される。細胞は病原体、遺伝病または望ましい遺
伝子特性を示す特に興味ある塩基配列を有する標的核酸
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を保有する可能性がある。その
臨床試料は大便、尿、唾液、膿、血清、血漿、眼レンズ
液、を髄液、リンパ液、生殖器洗液などのような排泄物
または生理学的液体から得られる。当分野で習熟した者
は、当分野で知られた方法にまり生検（バイオプシー）
試料を単一細胞懸濁液または小塊にすることができる。 例えば、固体組織の生検試料はその生検試料を０．５　
Ｍ塩化ナトリウム、１０ｔｈＭ塩化マグネシウム、０．
１４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）およヒ２５Ｔｎ９／
ｄシクロヘキサミドの混合物中で撹拌することにより、
効果的に単−細胞懸濁液寸たは細胞小塊にすることがで
きる。また、この工程において特定の細胞型を示差遠心
、密度勾配遠心または他の方法のような当分野で知られ
た方法により単離することもできる。 その後、細胞はそれらのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを
放出させるべく処理される。化学的細胞溶解が当分野で
よく知られている。化学的細胞溶解は希薄アルカリ水溶
液（例えば０．１〜１．０Ｍ水酸化す）　ＩＪウム）を
用いて行われる。そのアルカリはまたＤＮＡやＲＮＡを
変性するのに役立つ。 その他の変性および細胞溶解剤には高温、有機試薬（例
えばアルコール、アミド、アミン、尿素、フェノールお
よびスルホキシド）、またけある棟の無機イオン（例え
ばトリフルオロ酢酸ナトリウｒスツ１ ム、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、
イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、
ヨウ化カリウム、イソチオシアン酸ナトリウムおよびイ
ソチオシアン酸カリウムのようなカオトロピズム塩）が
含まれる。 臨床試料はまた種々の制限エンドヌクレアーゼの作用に
よりＤＮＡ−またはＲＮＡを分割して、比較的取り扱い
やすいセグメントにすることができる。試料処理工程の
完了時に、臨床試料は試料核酸、細胞破片および不純物
を含有する。過去においては、試料核酸は核酸をフィル
ターや膜に非特異的に結合させ、その後フィルターや膜
かう細胞破片と不純物を洗い落とすことにより、細胞破
片と不純物から分離された。しかしながら、実際には、
若干の細胞破片および若干の不純物ならびに標的以外の
核酸がフィルターや膜に非特異的に結合され、洗浄によ
っても除去されずに残存する。 本発明の態様は、工程１に例示されるごとく、標的核酸
を保有する可能性のめる試料を、プローブ成分と会合し
た回収可能な支持体と接触させることを包含する。回収
可能な支持体は試料媒体中に実質的に均質分散しうる。 プローブ成分は、例えばプローブ成分と回収可能な支持
体との共有結合、親和力会合、水素結合または非特異的
会合により回収可能な支持体と会合することができる。 支持体は多くの形体をとることができ、例えば粒状形体
に縮小され且つ支持体含有試料媒体をふるいに通すとき
回収しうるニトロセルロース；磁場をかけた際にニトロ
セルロースが試料媒体中を移動できるように、磁性粒子
で含浸されたニトロセルロース；ν過できるか又は電磁
性を示すビーズまたは粒子；および水性媒体の表面に分
配されるポリスチレンビーズが富まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質的に均質分散
しうる能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る回
収可能な支持体を包含する。好寸しくけ、磁性ビーズは
プローブと磁性支持体粒子との共有結合または会合を容
易にする菓１アミン官能基を含む。好ましくは、その磁
性支持体ビーズは単磁区磁石であり、残留磁気を示さな
い超常磁性である。 粒子またはビーズは磁鉄鉱粒子から成りうるが、それら
は反応性表面を有し且つ磁場に作用する能力を示す限り
、不純金属、合金筐たは複合材料の形の他の磁性金属ま
たは金属酸化物でありうる。 個々に又は鉄との組合せで使用される他の材料には、コ
バルト、ニッケルおよびケイ素が含まれるが、これらに
限定されない。磁鉄鉱または金属酸化物粒子の製法はパ
ンデンベルグ（Ｖａ％ｄｅｎｂｅｒｇｈａ）ら、゛超微
細コバルトフェライトの製法および磁Ｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ、　１５〜１８　：　１１１７〜１８（１９８０）；
マチエビツク（Ｅ、Ｍ’ａｔｉｊｇｔＩｉｃ）、”単分
散金属（含水）酸化物−ｍ−コロイド科学の興味ある分
野”、Ａｃｃ、、Ｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、、１４　：　２２
〜２９　（１９８１）に記載されており、その内容は参
照によりここに引用される。 本発明で使用するのに適した磁性ビーズには、アドバン
スト・マグネティクス社（ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅ
ｔｉｃｅ、Ｉｎｃ、）からＥＩＯ−ＷＡＧという商標名
で市販されている第１アミン官能基含有磁性ビーズが含
まれる。好適な磁性粒子は非多孔質であるにもかかわら
ず、プローブ成分と会合することができる。プローブ成
分の会合に関与しない反応性部位は遮断して他の試薬、
不純物および細胞物質の非特異的結合を防ぐことが好ま
しい。磁性粒子は好ましくは実質的にコロイド状の懸濁
物として存在する。試薬および基質および粒子表面に会
合したプローブ成分は、その粒子を取り囲む溶液中に直
接延在している。プローブ成分は固体支持体に担持され
た反応と関連した速度ではなくむしろ溶液中の反応に特
徴的な速度および収率でもって、溶液中の溶存試薬およ
び基質と反応する。さらに、粒子サイズを減するにつれ
て、粒子の表面槓対容積の比が増加し、それにより磁性
粒子の単位重量あたりより多くの官能基およびプローブ
を結合さセうる。 反応性アミン官能基を有するビーズは、ポリヌクレオチ
ドをそのビーズに共有結合させるべくポリヌクレオチド
と反応させることができる。ビーズはリン酸ナトリウム
緩衝液中で１０％グルタルアルデヒドと反応させ、続い
て実験プロトコールにおいてより詳しく説明する方法に
よりリン酸緩衝液中でリン酸化ポリヌクレオチドのエチ
レンジアミン付加物と反応させる。 さて工程２に戻ると、プローブ成分と会合した回収可能
支持体は臨床試料と接触させ、工程３に進んで結合条件
に置く。対象となる標的に特異的なプローブ成分は臨床
試料中に存在する標的鎖に結合される。試料および試薬
媒体中に分散した回収可能支持体は、あたかもそれらが
溶液中で遊離状態にあるように、プローブ成分と標的を
ハイブリダイズさせることができる。 プローブと標的のハイブリダイゼーションは約１５分で
完結する。これとは対照的に、媒体中に分散する能カン
もだない支持体上にプローブまたは標的が固定化された
ハイブリダイゼーションでは３〜４８時間もの長時間を
要する。 無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞破片および不純物は支持
体と特異的に結合しない。しかしながら、実際的方法と
して、少量の無関係のＤ　Ｎ　Ａ　、　ＲＮＡ、細胞破
片および不純物は回収可能支持体を含む反応容器内に置
かれたすべての物体に非特異的に結合することができ、
現に結合する。本発明の態様は、標的ポリヌクレオチド
から無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞破片および不純物を
取り除くべく臨床試料の更なる精製を容易にするもので
ある。 第１図の工程４は臨床試料からの支持体の分離および第
２媒体中への支持体の懸濁を示す。従って、第２媒体は
標的ポリヌクレオチド鎖と結合したプローブをもつ回収
可能支持体を含む。筐た、その支持体と非特異的に結合
した無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞破片および不純物も
随伴されるが、臨床試料中に初めに存在していた濃度よ
りもかなり低い濃度である。当分野で習熟した者は、第
２媒体中に懸濁する前に支持体を洗浄することにより若
干の望ましくない物質を減らすことができることを認め
るであろう。 第２媒体中に懸濁された回収可能支持体（会合プローブ
および標的をもつ）は工程５に示すような変性に付され
、それにより回収可能支持体のプローブ成分から標的を
解離させる。変性操作は回収可能支持体から非特異的に
結合した無関係のＤＮＡ５ＲＮＡ、？＃Ｊ胞破片または
不純物を放出させたり、放出させなかったりする。しか
しながら、本方法の工程５１′ｉ第１臨床試料媒体から
初めに運ばれた非特異的に結合した細胞破片、不純物、
無関係のＤＮＡおよびＲＮＡの多くを支持体と共に保有
する第２媒体から、回収可能支持体を分離させる。 工程６に示すように、新しい支持体が結合条件下で第２
媒体中に導入され、その回収可能支持体と会合したプロ
ーブ成分上に標的ポリヌクレオチド鎖が再び捕獲される
。当分野で習熟した者は、新しい支持体が非特異的に結
合したＤＮＡ、ＲＮＡ。 細胞破片および不純物をさらに精製・除去する工程に循
環させた後のもとの回収可能支持体を実際に含みうるこ
とを認めるであろう。従って、第２妹体中に存在する不
純物のみが、以前に支持体へ非特異的に結合され、その
後第１支持体から放出されて第２媒体中に溶解または懸
濁されたＤＮＡ。 ＲＮＡ、細胞破片および不純物を包含する。 しかしながら、この種の不純物は回収可能な第２支持体
を第２媒体から分離し、そして再び回収可能な支持体を
別の媒体に導入し、変性し、古い支持体を分離すること
から成るサイクルを繰り返すことにより、標的ポリヌク
レオチドからさらに除去することができる。当分野で習
熟した者は、溶液が除去されるかまたは収態容器へ添加
されるとき、本発明で説明した磁性ビーズは適所に保持
しやすく、また溶液から取り出しやすいことを認めるで
ろろう。 ゛溶解状態の反応速度論（１ｎｓｏｌｕｔｉｏｎｋｉ１
Ｌｅｔｉｃｓ　）”をまねた反応に関与する磁性ビーズ
の能力は、変性および標的への結合のサイクルの光子を
３〜１５分で達成させる。 十分な精製および濃縮後に、標的は工程８に示すような
当分野で知られた発光または放射性検定法により検出す
ることができる。標的を含む媒体のＭ製は、細胞破片お
よび不純物の不在下での非同位体標識成分の検出を可能
にする。 さて今や第２図に転すると、第２図は多重プロ・−ブ法
を特徴としており、そこには可溶化剤および試薬の導入
により先の図面の臨床試料と同様に処理されるポリヌク
レオチド標的を含む臨床試料から始まる本検定法の別の
態様が示されている。 第２図に示した検定法の試薬には第１ポリヌクレオチド
プローブ＠（Ｐ＋）および第２ポリヌクレオチドプロー
ブ鎖（Ｐ２）が含まれ、両プローブ（ＰｔおよびＰ２）
は標的と結合して標的との複合体を形成することができ
る。第１プローブ（Ｐｌ）は結合条件下に回収可能支持
体（Ｓ＋　）と会合しうる。第２プローブは検出可能な
少なくとも１つの標識成分を有している。図面において
、標識成分は星印により示される。変性条件下での可溶
化剤および試薬の導入後、臨床試料を含む溶液は標的ポ
リヌクレオチド、第１および第２プローブの形の試薬、
細胞破片、可溶化剤、不純物および無関係のＤＮＡおよ
びＲＮＡを含有するであろう。 工程２に示すように、第１および第２ブローブＣＰ＋お
よびＦ２）は標的の相互に排他的な部分と結合条件下で
結合する。溶解状態での両プローブ（ＰｌおよびＦ２）
と標的とのノ・イブリダイゼーションは迅速であり、し
かも固体支持体との会合により妨害されない。第１およ
び第２プローブ鎖（ＰｌおよびＦ２）への標的の結合を
確実にするために、過剰のプローブが使用される。しか
しながら、たとえ過剰のプローブ（ＰＩおよびＦ２）が
使用されないとしても、若干のプローブは標的を発見で
きずに試料媒体中にノ・イブリダイズされたいま１残存
するであろう。ハイブリダイズされなかった標識成分含
有第２プローブ（Ｆ２）ｉｌ−１′、もしも検出中に存
在するならば、バックグラウンドノイズの原因になるで
あろう。 第１プローブ（Ｐ＋）は支持体上の抗リガンド成分と結
合しうるリガンドにより支持体（Ｓｌ）と結合できる。 リガンド（Ｌｌ）には例えばホモポリマーから成る尾部
が含１れる。支持体（、Ｓ’、）ｆｌ！Ｊガント（Ｌｌ
）を受容してそれと結合しうる抗リガンド（ＡＩ）を包
含する。抗リガンド（Ａｔ）には例えばプローブ（Ｐｌ
）のリガンド（Ｌ＋）に相補的なホモポリマーが含まれ
る。 さて工程３に転すると、結合条件下で支持体（Ｓｌ）の
抗リガンド成分（Ａ＋）は第１プローブ（Ｐ＋）のリガ
ンド成分（Ｌｌ）と会合域たけ結合し、そしてその第１
プローブはそれ自体が標的と結合し且つ第２プローブ（
Ｆ２）に連結している。支持体はいろいろな形をとるこ
とができる。ビーズまたは粒状支持体は溶液中に分散さ
れ、溶解状態に近い反応速度論を示す反応により標的−
プローブとの結合に加わることができる。さらに、回収
可能なビーズおよび粒状支持体は、より一般的なフィル
ターや膜にもともと存在する目詰りの問題なしに、不溶
性細胞破片からプローブ−標的複合体を分離させつる。 しかしながら、一般的な膜、フィルターまたにセルロー
ス支持体も目詰りが問題とならないいくつかの用途にお
いて便用できる。溶液中でのプローブと標的との迅速な
ハイブリダイゼーションゆえに、固体の非ビーズ状また
は非粒状膜もしくはフィルター支持体を反応容器中に組
み入れることができる。試薬および試料の溶液は支持体
を通過して、標的が捕獲される。支持体（Ｓｌ）は回収
可能な支持体として第２図に示される。 溶液中には標的−プローブ支持体複合体と共に未結合の
第１および第２プローブ成分、未結合標的、可溶化剤、
不純物および細胞破片が存在する。 標識成分をもつ未結合第２プローブ（Ｆ２）はノイズの
原因となり、標的の存在によく似た信号を発する。少量
の無関係の細胞破片、可溶化剤、不純物およびプローブ
も回収可能支持体と非特異的に結合しつる。 工程４において、支持体（Ｓｌ）ｌｌ−１′臨臨床試料
体から分離される。回収可能支持体を使用する場合、分
離は反応容器内に回収可能支持体を固定化することによ
り、または試料媒体から回収可能支持体を直接取り出す
ことにより達成しつる。当分野で習熟した者は、固定化
支持体を洗浄して望ましくない物質を減らすことができ
ることを認めるであろう。 さて工程５に転すると、標的−プローブ支持体複合体は
実質的に無関係のＲＮＡ、ＤＮＡ、可溶化剤、不純物お
よび細胞物質を含まず、従って標的分子の存在を示す標
識成分の存在について監視することができる。しかしな
がら、少量の無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、可溶化剤、不純
物および細胞物質が１だ支持体（Ｓｌ）と非特異的に結
合しているかもしれない。さらに、標的と会合していな
いという意味で未結合の第２プローブ（Ｆ２）もまた支
持体（Ｓｌ）と非特異的に結合でき、非同位体標識成分
からの信号に影響を及ぼす。標識成分をもつ未結合第２
プローブ（Ｆ２）の存在はバックグラウンドノイズの王
な原因となり、それにより検定法の正確度が減ぜられる
。 従って、別の工程５として、第１支持体（Ｓｌ）を第２
媒体中に懸濁し、その第２媒体中で変性することにより
支持体（Ｓｌ）を標的−プローブ複合体から分離するこ
とができる。 変性後、工程６において、第１支持体（Ｓｌ）は第２媒
体から分離され、第２支持体（Ｓ２）と置き換えられる
。第２支持体（Ｂ２）は第１プローブのリガンド成分（
Ｌｌ）と結合しうる抗リガンド成分（ＡＩ）を含む。 工程７に移ると、標的−プローブ複合体は結合条件下で
第２支持体（Ｂ２）と再会合する。第１支持体（Ｓｌ）
の除去は、その第１支持体（Ｓｌ）と非特異的に結合し
た無関係の物質、破片およびプローブを検定媒体から除
去する。 工程８に示すように、標的−プローブ複合体を含む媒体
は標識の存在について検定される。しかしながら、検定
媒体をさらに精製することにより、第１支持体（Ｓｌ）
に非特異的に結合され、その後第１支持体（Ｓりから第
２媒体中に溶解または解離された試料媒体由来の無関係
の物質およびバックグラウンドの存在をさらに減するこ
とができる。 従って、回収可能な第２支持体（Ｂ２）を第３媒体と接
触させ、その第３媒体を支持体から標的−プローブ複合
体を放出させる条件に至らせ、その後支持体を除去して
更なるサイクルを完結させることができる。サイクルの
回数は試料のタイプ、標識成分の種類、および検出装置
の感度に応じて選択されるだろう。異なるタイプの支持
体を異なる時点で使用してもよい。従って、回収可能な
支持体を使用することにより初めに試料媒体または溶液
から標的−プローブ複合体を集めまたは濃縮し、こうし
て膜やフィルターに特有の目詰りの問題を避けることが
できる。第２または第３支持体Ｆｉ第１プローブ（Ｐｌ
）のリガンド成分（Ｌｌ）と結合する抗リガンド成分（
Ａりをもつ膜またはフィルターを含むのが好ましい。膜
またにフィルター支持体は標的−プローブ複合体を流動
回収させる処理工程を単純化することができる。 本発明の別の態様はバックグラウンドノイズを減らすの
に特に適している。今や第３図を見ると、そこには第２
図に示した検定法の変法が示されている。第３図におい
て、標的ポリヌクレオチドは第２図に記載のプローブ成
分と類似した第１および第２プローブ成分ＣＰ＋および
Ｂ２）と複合体を形成している。しかしながら、第２プ
ローブは第２リガンド（Ｂ２）を貧む。その第２リガン
ド（Ｂ２）には例えばホウ酸抗リガンドと複合体を形成
する単一末端リボヌクレオチド、相補的コポリマーと結
合するコポリマー、アビジン抗リガンドに結合するビオ
チンリガンド、または図示したようなホモポリマーリガ
ンド（Ｂ２）および相補的ホモポリマー抗リガンド（Ａ
２）が包含される。 今や工程１に転すると、第２プローブ（Ｂ２）が標的と
結合していない時だけその第２プローブ（Ｂ２）と選択
的に結合しつるバックグラウンド支持体が、標的−プロ
ーブ複合体を含む媒体と接触させられる。その媒体は遊
離の、会合していない第１および第２プローブ（Ｐｌお
よびＢ２）をさらにｆむ。バックグラウンドノイズの原
因となる標識された第２プローブ（Ｂ２）は、バックグ
ラウンド支持体（Ｂｌ）と会合した大過剰モルの抗リガ
ンド成分（Ａ２）により、そのバックグラウンド支持体
（Ｂ１）と特異的に結合する。未結合の標識プローブ（
Ｂ２）とバックグラウンド支持体（Ｂ４）との結合後、
工程２に示すようにバックグラウンド支持体（Ｂ１）を
媒体から除去する。標的−プローブ複合体を含有する媒
体は、バックグラウンドノイズの減少後、第２プローブ
（Ｂ２）に保有された標識の存在について検定される。 あるいは、標的−プローブ複合体を含む媒体は更なる処
理に付される。 更なる処理は第３図に示した工程１〜３、または第２図
に示した諸工程を繰り返すことによるバックグラウンド
の更なる減少を包含する。例えば、バックグラウンド減
少工程は、第１および第２プローブのリガンドおよび抗
リガンド成分が干渉せず、且つ標的が第１および第２プ
ローブと複合体を形成するいずれかの時点で、第２図に
示すような臨床試料の処理に組み入れられる。 本方法の態様は第４図に模式図で示した装置を用いて実
施される。この装置１は次のような王な要素：すなわち
少なくとも１つの収納容器、プローブと標的分子および
回収可能な支持体との会合を制御する手段、試料溶液か
ら回収可能支持体を分離する手段、および回収可能支持
体から標的分子を放出させる手段を包含する。これらの
主な要素は多種多様な形をとることができ、以下でさら
に詳しく説明する。 この装置はポリヌクレオチドを含む標的分子に関して第
２図および第３図で示した方法を適用して、例示目的の
ために以下で説明されるであろう。 こうして、ステーション１では、臨床試料が細胞物質を
溶解して核酸を放出させるために、可溶化剤（例えばカ
オトロピズム塩、酵素および界面活性剤）と−緒に収納
容器中に入れられる。その収納容器は細胞の破壊を容易
にするための撹拌部材を備えている。その収納容器は試
料を入れるのに適したどのような型の容器、管またはキ
ュベツト（浅い水ばち）であってもよい。 自動分析用に設計された器械では、第４図に示した装置
は多数の収納容器を受答する手段を含むであろう。例示
目的のために、試料を含む収納容器は逐次分析される。 こうして、収納容器は巣１ステーションへ、続いて検定
法の種々の工程が行われる後続のステーションへ搬送す
れる。 各ステーションは搬送手段により連結されている。搬送
手段には回転可能なターンテーブル、コンベアーベルト
などが含まれる。臨床病院に設定する場合、搬送手段は
手動移動を含みうる。従って、病院スタッフが患者から
組織試料を採取し、その試料を収納容器に入れる。組織
試料の破壊および可溶化剤と試薬類の初期混合を含めた
試料処理はベッドのそばで開始され、そしてその後の処
理のために収納容器を後続のステーションへ移動させな
がら継続されるであろう。ステーションへの言及は例示
目的のためである。当分野で習熟した者は、いくつかの
ステーションまたは工程を組み合わせたり逆にしたりし
うろことを認めるであろう。 さて第１ステーシヨンに戻ると、試料と可溶化剤を収納
容器に入れ、その中の撹拌部材により試料と可溶化剤を
完全に混合して細胞物質から核酸を放出させる。搬送手
段によりその収納容器をステーション２へ運び、そこで
収納容器は試薬を受は取る。 試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌ
クレオチドプローブを宮む。第１および第２プローブは
標的ポリヌクレオチドと複合体を形成することができ、
その際両プローブは標的の相互に排他的な部分と結合す
る。第１プローブはまた結合条件下で回収可能な支持体
と結合しつる。 第２ポリヌクレオチドプローブは検出可能な標識成分を
含む。試薬と核酸試料は加熱部材により変性され、その
後ステーション３に運ばれる。 ステーション３において、収納容器は円により示される
第１支持体を受は取る。第１支持体は適当な手段（撹拌
部材を含む）により試料媒体中に均質分散される。適当
な支持体の例にはポリスチレンビーズ、磁性ビーズおよ
び他の粒状またはフィラメント状物質が宮まれるが、こ
れらに限定されない。先に例示したように、第１支持体
はデオキシチミジン（ｄＴ）のポリヌクレオチド抗リガ
ンドを有する磁性ビーズでありうる。第１プローブは結
合またはハイブリダイゼーション条件下で第１支持体に
結合しつるデオキシアデノシン（ｄＡ）の尾部を含む。 ステーション４へ移動すると、そこでは冷却部材で冷却
されることにより試料媒体にハイブリダイゼーション条
件が課せられる。しかしながら、当分野で習熟した者は
塩濃度を変える手段が熱制御手段に容易に取って代わり
得ることを認めるであろう。こうして、標的ポリヌクレ
オチドは第１および第２プローブと複合体を形成し、さ
らに第１プローブのホモポリマーデオキシアデノシン（
ｄＡ）尾部が回収可能支持体のデオキシチミジン（ｄＴ
）ホモポリマーとハイブリダイズする。 ステーション４からステーション５へ収納容器は移動し
、そこで回収可能な支持体が磁性部材を活性化すること
により収納容器の壁に固定化される。ポリスチレンビー
ズを磁性ビーズの代わりに使用する場合、ポリスチレン
ビーズＦｉ濾過または密度差により固定化されるであろ
う。試料媒体は大部分の無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、可溶
化剤、細胞物質および不純物を保有し、廃棄される。固
定化された回収可能支持体は無関係のＤ　Ｎ　Ａ、ＲＮ
Ａ。 可溶化剤、細胞物質および不純物をさらに除くために洗
浄される。 さらに、回収可能支持体は反応容器の壁に固定化される
ように例示されているが、磁性部材により回収可能支持
体を反応容器から取り出して、反応容器の壁に非特異的
に結合しやすい無関係のＤＮＡ５ＲＮＡ、可溶化剤およ
び細胞物質を含む第１の反応容器を処分することもでき
る。 回収可能支持体は同一の収納容器か又は新たな収納容器
中の第２媒体に添加される。第２ｆｓ体中に回収可能支
持体を當む収納容器はステーション６に送られる。 ステーション６において、第２媒体は加熱部材を含む適
当な手段で変性条件に至らせる。この変性工程は回収可
能支持体の（ｄＴ）ホモポリマーから標的−第１および
第２プローブ複合体を遊離させる。無関係のＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、不純物および細胞物質を営む可能性のめる第１支
持体は第２媒体から除去する。その後バックグラウンド
支持体を第２媒体と接触せしめ、ステーション７へ送る
。 ステーション７で第２媒体は冷却部材により・・イブリ
ダイゼーション温反にする。バックグラウンド支持体は
第２プローブに担持されたリガンドと特異的に結合しう
る第２抗リガンドを含む。例えば、制限するものでない
が、第２プローブの末端ヌクレオチドは第２支持体に担
持されたボウ酸成分と特異的に結合するリボ誘導体とし
て合成される。プローブ−標的複合体の一部として標的
に結合した第２プローブは、立体障害のために第３支持
体に担持されたホウ酸と結合しないだろう。 しかしながら、未結合の第２プローブはホウ酸支持体と
特異的に結合するだろう。また、第２プローブは第２支
持体上のデオキシグアニン（ｄＧ）ホモポリマーリンカ
−と結合するデオキシシトシン（ｄｃ’）のようなホモ
ポリマーを含みうる。ホモポリマーの長さは、標的−第
１および第２プローブと第２支持体との複合体が不安定
であるが、第２プローブ単独と第２支持体との複合体が
反応パラメーター内で安定であるように考案される。実
際、未結合第２プローブに対するバックグラウンド支持
体のバックグラウンド捕獲結合は不可逆的である。 次に、第２媒体およびバックグラウンド支持体を含む収
納容器はステー７ヨン８に搬送され、ここで標的−プロ
ーブ複合体に結合していない第２プローブ鎖を有するバ
ックグラウンド支持体が第２媒体から分離される。バッ
クグラウンド支持体の分離により、媒体から非特異的な
バックグラウンドノイズが除かれる。 先に述べたように、バックグラウンド捕獲はビーズ上で
実施される。しかしながら、当分野で習熟した者は、臨
床試料からの標的−第１および第２プロ〜プ複合体の初
期精製により全部または大部分の固体砕片が除かれ、第
２媒体が通過するフィルターまたは膜支持体上にバック
グラウンドが捕獲されることを認めるであろう。 ステーション８から、バックグラウンドの低減した標的
−プローブ複合体を営む精製媒体はステーション９へ送
られる。ステーション９で、加熱部材によりハイブリダ
イゼーション温度にした第２媒体を第３支持体（膜また
はフィルターとして図示される）と接触させる。第３支
持体は第１プｒ６１） ローブの第１リガンド成分と結合する第１抗リガンド成
分を含有する。従って、第１プローブの第１リガンド成
分がデオキ７アデノ７ン（ｄＡ）（Ｄ＊ホモポリマーあ
る場合、第３支持体はデオキシチミジン（ｄｒ）のホモ
ポリマーを含む。先に述べたように、第３支持体は第２
媒体が通過し得るフィルターまたは膜であるが、ビーズ
や粒子も使用できる。第３支持体は標的−第１および第
２プローブ複合体をさらに濃縮するのに役立ち、そして
第３支持体と特異的に結合しないバックグラウンドおよ
び妨害物質をさらに低減せしめる。ステーション１０へ
移ると、第３支持体は標的−第１および第２プローブ複
合体を濃縮し、それにより第２プローブに担持された標
識成分の検出が可能となる。 本発明は以下の一般方法および好適な態様の特徴を例示
する以下の実施例においてさらに詳述される。 ■、方法 Ａ、物質 全ての試薬は分析用またはそれ以上のものであった。Ｅ
ＩＯ−ＷＡＧという商標名で市販されている官能性アミ
ノ基會有磁性ビーズはアドバンスト・マグネチツクス社
（ＭＡ、ケンブリッジ）から入手した。 本実施例において、全ての標識ヌクレオチドはニューイ
ングランド・ヌクレアーから入手した。 酵累ターミナルデオキ７ヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼ（ＴＤＴ）はライフ・サイエンス社（フロリダ州セ
ントピータースバーグ）から入手した。 オリゴヌクレオチドｐｄＴｒｏはファーマシアＰＬバイ
オケミカルズから入手した。 Ｂ、プローブの合成 一般的なプロトコールおよび方法を以下に説明する。第
６図を参照されたい。２つのプローブはスパイサー（Ｓ
ｐｉｃｇｒ、ＩＥ、に、）およびノープル（Ｊ。 Ａ、Ｎｏｂｌｅ）、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｃｈｅｔｎ、２５７　＋５５７１６〜５５７５１　（１
９８２）に記載される構築マツプ（第６図）に従って、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のエンテ
ロトキシン遺伝子ａｌｔＡ１のセンス鎖（ａｅｎｔｒｅ
　５ｔｒａｎｄ）に構築された。 １組のプローブはその遺伝子配列の４８３位から始まっ
て３０ヌクレオチド長だけ延びるように合成され、以後
Ａ４８３プローブと名づけだ。第２プローブはその遺伝
子配列の５３２位から始まって３０ヌクレオチド長だけ
延びるように合成され、以後これをＡ３３２プローブと
名づけだ。第３プローブはその遺伝子配列の７２６位か
ら始まって３９ヌクレオチド長だけ延びるように合成さ
れ、以後これをＡ７２６プローブと名づけだ。特定の塩
基配列（５′→３′）を以下の表Ｉに示す：上記プロー
ブは当分野で利用し得る方法により合成された。ナンバ
リング方式はインテリジエネテイクス・シーフェンス・
バンクＥＣＯＥＬＴ　Ａｌから入手し得る７６８ヌクレ
オチド配列から適応させた。 プローブＡ７２６の３′末端の１０個のＧ残基のうち、
５′末端へ向かう３個のグアニン塩基はトキシン遺伝子
の３個の相補的なシトシン塩基と結合することができる
。３個の連続したシトシンはＤＮＡ中に普通に見られる
。１０個のグアニン塩基はオリゴｄＣ−セルロースのよ
うな支持体に担持されたポリＣ抗リガンドと結合し得る
リガンドを形成する。しかしながら、７個のグアニン塩
基は３７℃で、特にプローブが標的と結合している場合
は、立体障害および標的−プローブ複合体の大きさのた
めに、支持体と安定な会合を形成しないだろう。プロー
ブＡ７２６はターミナルトランスフェラーゼを用いてそ
の３′末端へ約３個の３２Ｐ−ｄＣおよび３２Ｐ−ｄＧ
残基をランダム付加することにより修飾した。 当分野で習熟した者は、他のプローブを別の標的分子に
対して容易に合成し得ることを認めるであろう。 Ｃ０調製 実施例１．２および３の標的はエンテロトキシン遺伝子
ｅｌｔＡ１である。エンテロトキシン遺伝子ｇｌｔＡ１
はスタンフォード大学から入手したプラスミドＥＷＤ　
−２９９の一部として保有される。 実施例１において、エンテロトキシン産生菌をルリア培
地中で対数期まで増殖させた。その細菌を溶解し、プラ
スミドＥＷＤ　−２９９を単離した。 プラスミドＥＷＤ　−２９９は制限酵素Ｘｂα■および
Ｈ６ｎｄ　Ｉ［Ｉで消化した。４７５塩基長のフラグメ
ントな標的として使用し、１％アガロースゲルから電気
溶出により精製した。捕獲工程の効率を追跡するために
、フラグメントは酵素ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て製造者の指示に従って３２Ｐ−ＡＴＰで５′末端標識
した。 実施例２および３では、エンテロトキシン産生菌および
野生型エンテロトキシン非産生大腸菌ＪＭ８３を別々に
対数期まで増殖させた。野生型大腸菌は対照として役立
つ。エンテロトキシン産生菌と野生型菌の抽出物は、カ
オトロピズム溶液中で細胞を実質上可溶化することによ
り別々に調製した。こうして、ルリア培地中の細菌培養
物を５Ｍ濃度の固体グアニジニウムチオシアネート（Ｇ
ｌＬＳＣＮ）、０．３Ｍ濃度のトリス−ＨＣｌ、および
０１濃度のＥＤＴＡ（ｐＡ７　）に添加した。その後カ
オトロピズムー細菌溶液は１００℃で５分間加熱し、冷
却した。得られたエンテロトキシン産生菌抽出物は野生
型エンテロトキシン非産生菌抽出物で段階的に希釈した
。細胞当たりのｔｏｗプラスミドの＃度および抽出物中
の細胞数は慣用技法で測定した。ＧｗＳＣＮ中で可溶化
したもとの抽出物は約１０’個／　ｍ１３のエンテロト
キシン産生大腸菌および細胞当たり１００個のプラスミ
ドを言んでいた。 Ｄ、ビーズの合成 回収可能な支持体は磁性ビーズから製造した。 他の回収可能支持体には粒子、繊維、ポリスチレンビー
ズまたは媒体から物理的に分離し侍る他の物品が宮まれ
る。磁性ビーズは１０塩基長のデオキシチミジンの付加
物をもつように合成され、その結果ビーズはデオキシア
デノシンを尾部に付加したプローブと容易に可逆的な方
法で会合することができる。 従って、ＢＩＯ−ＭＡＧ（Ｍ４１００）ビーズのような
アミン官能基をもつビーズ１００成は４個の２７５ｍＡ
Ｔフラスコ中で２０　ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，
７）により４回洗浄した。その後ビーズは２０　ｍＭリ
ン酸ナナトリウム中１％グルタルアルデヒドで洗浄した
。次いで、ビーズは２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６
，７）中の１０％グルタルアルデヒド１００ｍＡと室温
で３時間反応させた。 その後ビーズハ２０ｒｌＬＭリン酸ナトリウム（２ｇ６
．７）で十分に洗浄し、次に２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７
，６）で−回洗浄した。 別個に、精製したｐｄＴｌｏのエチレンジアミン（ＥＤ
Ａ）付加物（Ｅ　ＤＡ　−ｄＴｌｏ　）をチュー（Ｃｈ
ｗ。 Ｂ、Ｃ，Ｆ、）、ウオール（Ｇ、Ｍ、Ｗａｈｌ　）、お
よびオーダル（Ｌ、Ｅ、Ｏｒｇｇｌ　）、Ｎｓｃｌｇｉ
ｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒａｓ、１１　ｒ６５１３〜６５２９（
１９８３）（参照によりここに引用される）に従って製
造した。ＥＤＡ−ｄＴｌｏの濃度は２０　ｍＭＭリン塩
（ｐＨ７，６）中１０Ｄ／ｍｇに調整した。 ＥＤＡ−ｄＴｌｏは磁性ビーズの遊離アルデヒド基と反
応させるために磁性ビーズと混合した。ＥＤＡ−ｄＴｌ
、とビーズの混合物は複数の５ＱｍＪポリプロピレン製
チューブに分割して入れた。反応混合物とビーズを含む
チューブは回転器の中に置き、室温で一晩撹拌した。 次に、ビーズは大型の２７５ｍＡＴ７ラスコ中で滅菌２
０ｍＷ　’Ｊン酸塩（ｐＨ６，７）の洗液により５回洗
浄して非共有結合したＥＤＡ−ｄＴ、、を除き、その洗
液で希釈して２０ＯＮとした。 貯蔵のために、ビーズＦ１２０　ｔｎＭ　ＩＪン酸塩緩
衝ｉ（０，１％アジ化ナトリウムおよび０１％ＳＤＳを
営む）中で数ケ月間保存できる。ビーズ調製物は光を遮
断して４℃で保存される。 その後、ビーズは非特異的結合部位を遮断するために、
Ｑ、７５　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨｓ、ｓ）、０．５
％ラウロイルサルコシンナトリウム、１０μグ／ｒｒＬ
ｌ大腸菌ＤＮＡ、０．５ｍ９７ｍ１３ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）（ヌクレアーゼ王宮）および５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）から成る緩衝液（以後
６プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液”と呼ぶ）中でプ
レハイブリダイゼーションを行った。標的捕獲法でプロ
ーブとビーズを使用する前に、ビーズのプレハイブリダ
イゼーションを２回実施した。そのプレハイブリダイゼ
ーション法はヒー、！’を１０倍容量のプレハイブリダ
イゼーション緩衝液中に入れることを包含していた。 第１のプレハイブリダイゼーション法ハ撹拌しながら６
０℃で行った。第２のプレハイブリダイゼーション法は
渦巻きを起こさせながら室温で実流した。この溶液には
０．１％のイソアミルアルコールを消泡剤として添加し
た。 ｄＴｌｏ　−付加ビーズの結合能は次の方法により測定
した。別々の容器中で、ｄＴ５ｏ　およびｄＡ５０はそ
れぞれ”Ｐ−ｄＴおよび３２Ｐ−ｄＡを用いて約１０’
　ｄｐｍ／μ２　の比活性（ＳｃＬ）になる壕で５′末
端標識した。次に、既知量の反応したｄＴ５ｏ　　のＳ
ｃをトリクロロ酢酸沈降により正確に測定した。 次いで、Ｉ　Ｏ０，０００〜２００．０００　ｄｐｒｎ
Ａｎ９の実質的に同一のＳｃをもつ３２Ｐ−ｄＡ５ｏ　
５μ？および３２Ｐ−ｄＴ５ｏ　　５μｍはプレハイブ
リダイゼーション緩衝液を含むチューブに別々に加えて
１罰の容量とした。 プレハイブリダイズしたビーズはその既知試料容量を４
個のチューブに入れた。４個のチューブのうち２個Ｕそ
れぞれ（１，５ｍＡの３２１−　ｄ　Ａｓｏ　　混合物
乞添加し、残りの２個のチューブはそれぞれ０．５廐の
３２　ｐ−（Ｉ　Ｔｓｏ　　混合物を添加した。４つの
溶液すべてはハイフ“リダイゼーション条件に５分間お
いた。その後ビーズを固定化して洗浄し、次に溶液の比
活性を測定した。マイクログラムで測定した一定賞のビ
ーズ調製物の総結合能Ｃは次式で表される： Ｃ＝Ｖ　（Ａ−Ｔ　）／Ｘ 上記式中Ｘは３２　ｐ　−ｄ　Ｔ５ｏ　の比活性（ｃｐ
ｍＡｎ９　）であり、Ｖは全容童対試料答量の容量化で
あり、Ａは３２Ｐ−ｄＡ溶液中に懸濁したビーズの平均
活性（ｃｐ−）であり、そしてＴは”Ｐ−ｄＴ溶液中に
懸濁したビーズの平均活性（Ｃｐ−）である。 当分野で習熟した者は他のビーズ、粒子、フィラメント
などを他のヌクレオチドコポリマーまたはホモポリマー
と共に使用できることを認めるであろう。例えば、ポリ
Ａ付加ビーズは（精製したｄＴｌｏのＥＤＡ付加物の代
わりに）　２０　ｔｎＭ　ＩＪン酸ナトリウム（ｐＨ７
，６）　５０ｍ１Ｈ４’ｌＫポリＡ（ＭＷ）１００，０
００）１００Ｔｎ９’＆ｆｆ有する溶液を使用すること
により製造された。 Ｅ、標的捕獲法 ビーズ調製物は標的ポリヌクレオチドを捕獲するために
使用した。回収可能な支持体および可逆的捕獲を証明す
る一般的な実験標的捕獲法を以下に説明するが、例示目
的のために（制限するものではない）第１プローブＡ４
８３および第２プローブＡ３３２を使用してその捕獲法
を論じるであろう。第１プローブＡ４８３は３２Ｐ−ｄ
ｃＴＰおよび”Ｐ−ｄＧＴ斗用いて約１０”　ｄｐｔｎ
／ｍ９　　の比放射能ヘランダムに３′末端標識した。 第２プローブＡ３３２は酵素ターミナルトランスフェラ
ーゼを用いてＦＪ７０個の未標識ｄＡ残基を尾部に付加
した。 １ず初めに、標識プローブＡ　４８３　２００μ２／ｍ
ｌと尾部付加プローブＡ３３２　４００ｐｆｆ／ｍｌは
、いろいろな量の工／テロトキクン遺伝子の熱変性した
４　７５　ｍｅｒ　Ｘｂａ　■−Ｈ１ｆＬｄ　［［制限
フラグメントと１．４Ｍ基塩化ナトリウム中５℃で１５
分間混合した。 次に、標的捕獲は標的とプローブ成分を含む媒体を、ｄ
　Ｔ１．−磁性ビーズ（磁性ビーズに対する非特異的結
合を減じるためのプレノ・イブリダイゼーション俊に３
μグ／罰のｄＡ５ｏ結合能をもつビーズ）のアリコート
と接触させることにより開始した。 磁性ビーズとプローブ−標的複合体は５Ｎポリプロピレ
ンチユーブ中でプレハイブリダイゼーション緩衝液Ｑ、
　ｌ　ｍ１３と共に室温で２〜５分間インキュベーショ
ンした。 チューブはコーニング（Ｃｏｒ％ｉｇ）チューブ磁気分
離機に配置した。コーニングチューブ磁気分離機は活性
化されると、ポリプロピレンテユープを通して磁場を印
加し、その磁場により磁性ビーズがチューブ内壁に固定
化される。磁性ビーズがホリプロピレンチューブの側壁
に固定化されているうちに、もとの媒体を取り出して捨
てた。 固定化されている間に、ビーズは消泡剤としてインアミ
ルアルコールを含むプレノーイブリダイゼーション緩衝
液Ｑ、５罰ずつで３回洗浄した。プレハイブリダイゼー
ション緩衝液の添加後、チューブを磁場から移動させ、
その媒体を激しく渦巻き混合することによりビーズを再
懸濁させた。 次に、磁場を再度印加してビーズを固定化させ、プレハ
イブリダイゼーション緩衝液を捨てた。プレハイブリダ
イゼーション緩衝液の添加、ビーズの再懸濁、ビーズの
固定化、およびプレー・イブリダイゼーション緩衝液の
除去から成るサイクルは２回繰り返した。ビーズに保持
された標的−プローブ複合体は検出、バックグラウンド
捕獲または更なる標的捕獲サイクルの追加工程を含めた
その仮の処理のために利用可能である。 好適な標的捕獲法は標的−プローブ複合体の放出および
第２支持体への再捕獲を包含する。好ましくは、その支
持体は第１支持体と化学的に異なるものである。 標的−プローブ複合体の放出は次の一般方法により行わ
れる。最後のプレノ・イブリダイゼーション緩衝液の除
去後、ビーズを含むチューブにプレハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液を加えた。ビーズは撹拌下に６０℃で１〜２
分間インキュベーションして、ビーズからプローブ−標
的複合体を放出させた。温度を６０℃に維持した１まで
再び磁性分離機を活性化させ、遊離の標的−プローブ複
合体を言む溶出液をチューブから分離した。その溶出液
は別の回収可能支持体上に再捕獲されるか、またけ通常
の支持体上での最終捕獲に付される。 当分野で習熟した者は、標的−プローブ被合体の回収可
能支持体（例えば本実施例の磁性ビーズ）への捕獲およ
びその支持体からの放出がハイブリダイゼーションのバ
ックグラウンドを低下させるために所望回数反復し得る
ことを認めるであろう。 標的−プローブ複合体の最終捕獲は、一般にｄＴ−３０
００を非特異的に結合させた又は共有結合させたニトロ
セルロースフィルターまたはナイロン膜上で実施された
。従って、磁性ビーズに担持された標的−プローブ複合
体は、そのビーズをプレハイブリダイゼーション緩衝液
中６０℃で２分間加熱することにより、磁性ビーズから
放出させた。ビーズを固定化し、溶出液を分離し、０２
ミクロンのアクロディスク（ゲルマン社製）に通して磁
性微粒子を除去した。ｄＴ−３０００を保有するニトロ
セルロースフィルターは未Ｔａ４Ｗｔｌｔ　フｏ　−−
ｙ−上のｄＡ尾部を選択し、結合し、捕獲した。 標的−プローブ複合体の最終捕獲のために化学的に異な
る支持体を使用すると、前に使用した支持体に対して高
い親和力を有するバックグラウンド分子の結合が回避さ
れる。例えば、特定の支持体に対してもともと高い親和
力を有する低レベルの汚染物質は、支持体と繰り返し結
合してプローブ−標的複合体と共に溶出されやすい。こ
のような低レベル汚染物質は非宮に異なる組成の支持体
にそれらをさらすのと同程度に完全には同じ組成の回収
可能支持体の反復使用により希釈されない。 低レベル汚染物質は１だ化学的に異なる手段を用いて標
的−プローブ複合体を支持体から放出させ、再捕獲する
ことにより減少させることができる。 Ｆ、バックグラウンド捕獲法 バックグラウンド捕獲法はバックグラウンドノイズを選
択的に減少させて、標的の存在を示す真の信号の検出を
可能にする。バックグラウンド捕獲は単一プローブ系ま
たは２以上のプローブを使用する系に適用できる。例え
ば、単一プローブを特徴とするバックグラウンド捕獲法
において、そのプローブは標識成分とリガンドを含む。 プローブは標的と結合することができ、リガンドはプロ
ーブが標的と結合していない時だけ支持体と安定した結
合を形成することができる。 同様に、例えば、標的捕獲と関連して複数のプローブを
特徴とするバックグラウンド捕獲は２つのプローブを含
む。第１の標的捕獲プローブ（第１支持体と結合し得る
未標識リガンドを含む）は標的を捕獲するために使用さ
れ、そして第２のバックグラウンド捕獲プローブ（検出
可能な標識成分を営む）は第２バックグラウンド支持体
と結合し得る第２リガンドを有する。バックグラウンド
捕獲は検定の信号対ノイズのデータを高めるための標的
捕獲に対する価値ある補足的方法である。 第１の標的捕獲プローブＡ３３２および第２のバックグ
ラウンド捕獲プローブＡ７２６ならびに標的エンテロト
キシン遺伝子ｅｌｔ　Ａｌを使用する代表的なバックグ
ラウンド捕獲法について以下に説明する。当分野で習熟
した者は、証明のために使用されるプローブが単に選択
の問題であるにすぎないことを認めるであろう。他のプ
ローブも当然使用できる。 プローブＡ３３２は初期標的捕獲のために磁性ビーズに
共有結合されたｄＴｌｏ　　および最終標的捕獲のため
にニトロセルロースに非特異的に結合されたｄ　７’ａ
ｏｏｏ　と可逆的に結合しうる約１００個のｄＡ残基な
その尾部に有していた。プローブＡ７２６はターミナル
トランスフェラーゼを用いてその３′末端に約３個の”
Ｐ−ｄＣおよび３２Ｐ−ｄσ残残基シランダム付加るこ
とにより標識した。プローブＡ７２ｆｌｔそのプローブ
が標的とハイブリダイズしない場合にｄＣ−セルロース
と結合できる。 標的−第１および第２プローブ複合体を含有し且つ未結
合第２プローブを含む可能性のある溶液はｄＣ−セルロ
ースと混合し、その混合物の温度を３７℃に維持した。 この温度（３７８Ｃ）はオリゴｄＣとｄＣ７の解離温度
よりも高く、標的−第１および第２プローブ複合体のｄ
Ｃ−セルロースへの結合を防止する。この温度はまたオ
リゴｄＣとｄＧｌｏのｊｉｆｆ温度よりも低く、ｄＧ尾
部をもつ未結合第２プローブのｄＣ−セルロースへの結
合ヲ促進する。さらに、標的−第１および第２プローブ
俵合体は未薪合第２プローブよりもｄＣ−七ルロース支
持体へのその接近において著しく立体的に妨害される。 第２プローブＡ７２６を言むｄＣ−セルロースは遠心に
より除かれるが、当業者はｐ過のような他の方法も同様
に使用できることな認めるであろう。残留溶出液は標的
−第１および第２プローブ複合体と濃度の低下した未結
合標識第２プローブＡ７２６を含有する。 Ｇ、実施例 当分野で習熟した者は、回収可能支持体の製造、プロー
ブの製造、標的捕獲およびバックグラウンド捕獲のため
の一般方法が特別な要求および目的に合うように変更し
うろことを認めるであろう。 以下の実施例は特に指定しない限り上記に概略した一般
的方法を包含する。 標的捕獲検定は２種のプローブと回収可能な磁性ビーズ
支持体を用いて実施した。標的はエンテロトキシン産生
遺伝子ａｌｔＡＩのＸｂａ　ｌ　−Ｈｌｎｄ　［［フラ
グメントを當んでいた。第１プローブは磁性ビーズ支持
体のｄＴｌｏ残基ど結合しうる１３０個の非標識ｄＡ残
基を尾部に付加したＡ３３２　３０ｍａｒオリゴヌクレ
オチドプローブであった。第２プローブは第１プローブ
の７１イブリダイゼーシヨＣ８１） ン位置から２０ヌクレオチド下流で同じ標的に結合Ｌ’
ＦＩるＡ　４８３　３０　ｍｇデオリゴヌクレオテドプ
ローブであった。その第２プローブは３０ｍａｒオリゴ
ヌクレオチドに３２Ｐ−ｄｃＴＰおよび３２Ｐ−ｄＧＴ
Ｐを末端付加して１０１°ｄ　ｐ　ｔｎ／ｐ　ｆの比放
射能とすることにより標識した。 末端付加した第１プローブと標識した第２プローブは１
．４Ｍ塩化ナトリウム中でｔｏｗ遺伝子の熱変性した４
７５ｍｅｒ制限フラグメントの可変量と６５℃にて１５
分間インキュベーションした。非特異的に結合するバッ
クグラウンド対照として、禾端付加第１プローブと標識
第２プローブは標的の不在下に同一の溶液中でインキュ
ベーションした。特異的に結合する対照として、さらに
２つの反応混合物を調製した。第１の反応混合物は末端
付加第１プローブと非標識第２プローブを含み、４μ２
の変性大腸菌ＤＮＡとインキュベーションした。第２の
反応混合物は末端付加第１プローブと標識第２プローブ
を含み、標的ＤＮＡ不含の同一反応混合物中で１０μｉ
の変性と）ＤＮＡとインキュベーションした。 １５分のハイブリダイゼーション期間後、試料はＱ、　
７５　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）　０．７ｍ８中
でｄＴ−付加磁性ビーズと５分間インキュベーションし
た。その後ビーズは磁気的に固定化して前述の如く十分
に洗浄した。標的−プローブ複合体は０．２０　Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）　０．６ｍｇ中６０℃でビー
ズから溶出した。第１群のビーズをその溶出液および標
的−プローブ複合体から分離した。第２群の磁性ビーズ
を溶出液に添加し、結合条件に至らしめて標的−プロー
ブ複合体を再度捕獲させた。第２群のビーズを洗浄し、
標的をビーズから再溶出して、溶出液からビーズを分離
した。 第３群のビーズは標的−プローブ複合体を含む溶出液に
加え、結合乗件下に置いてビーズにもう一部標的一プロ
ーブ複合体を捕獲させた。その後ビーズを十分に洗浄し
、前述の如く標的をビーズから溶出した。ビーズをその
溶出液から分離し、溶出液は２酊四方のスロット中のｄ
　’Ｉ’５ｏｏｏ−ナイロン膜を通して標的−プローブ
複合体を捕獲させた。 ｄ　Ｔ３ｏｏｏナイロン膜はハイブリースロット装置（
ｈｙｂｒｉ−ｓｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　；ベトレ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−）を使用して２μグのｄ
Ｔ３ｏｏ。 をナイロンに共有結合させることにより作った。 簡単に述べると、ｄＴ３ｏｏｏｃライフ・サイエンス社
製）は無塩トリス緩衝液中でＧｅ％ｅ−８ｏデｇｇ？Ｌ
Ｔ″Ｌにューイングランド・ヌクレアー社製）のような
ナイロン膜上に直接点在させた。その膜を室温で１０分
間乾燥し、次に赤外線ランプの下でさらに１０分間乾燥
した後、さらに１０分間室温へ冷却した。ナイロン膜を
備えたフィルター装置はＵＶ−トランスイルミネーター
（フォトダイン社製）上で上下逆にし、４０　ｕＷ／ｃ
１ｎ”で２分間ＵＶ光籾に露光してｄ　Ｔ３０００をフ
ィルターに架橋させた０ ｄＴ３ｏｏｏ膜は次の溶液をこの膜に順次通すことによ
りプレハイブリダイズさせた： （１）１％ＳＤＳ； ＋２１　０．５％ＳＤＳ中の０．５　ｍ９７ｄ　ＢＳＡ
　；および最後に （３）　　プレハイブリダイゼーション緩衝液標的−プ
ローブ複合体を含む可能性のあるｄ　”３００Ｇ　−ナ
イロン膜は０．２Ｍリン酸ナトリウムおよび５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡで洗浄した。このナイロン支持体は第２プローブ
の３２Ｐ標識成分の存在についてオーディオラジオグラ
フィーで一晩監視した。 オーディオラジオグラフィー後、バンドをフィルターか
う切り取ってペースシンチレーション液体中で計数した
。ｔｏｗ遺伝子を含む制限フラグメント３フ工ムトモル
（１ｏ−１５モル）を富有する溶液では２１００および
１４００　ａｍｐのカウント数であった。ｔｏｗ遺伝子
を含む制限フラグメント３０アトモル（１０−１８モル
）を含有する試料は６２６ｐｍのカウント数であった。 ＤＮＡを含まない第３試料は７ｃｐｍであった。 １０μりの熱変性したヒ）ＤＮＡを官有する第４試料は
Ｏｒ、ｐｍであった。４μｍの熱変性した大腸菌ＤＮＡ
を官有する第５試料は７り席であった。 ／ＱＣ，Ｎ この検定法の絶対感度は１ｏ−１８モルのｔｏｗ遺伝子
であると推定された。標識された標的−プローブ複合体
の全回収効率はインプット（投入量）の１〜２％である
と推定された。この検定法は良好な特異性を立証した。 ＤＮＡを全く含まない試料中に標識プローブが存在しな
いのと同様に、ヒトＤＨＡＩたけ大腸菌ＤＮＡを含む試
料中にも標識プローブは存在しない。実験プロトコール
を繰り返すことにより、約５％の全標的捕獲効率が得ら
れた。この方法は−・イブリダイズされない標識プロー
ブの初期レベル１０１′モルから約１０’モルヘパツク
グラウンドを減少させた。バックグラウンドの減少は捕
獲効率の減少を十分以上に補償する７０グ（ｌｏｇ）の
改善を示す。 実施例２゜ 本実施例はバックグラウンド捕獲と共に標的捕獲を特徴
とする。標的およびバックグラウンド捕獲ハ標的捕獲の
処で述べた非標識の第１標的捕獲プローブＡ３３２．お
よび標識された第２バツクグラウンド捕獲プローブＡ７
２６を使用して行つた。 まず初めに、１６０％ｆ／ｍｌのｄＡ−末端付加Ａ３３
２と４０　ｆＬｐ／ｍ／＋の３２Ｆ−標識プローブＡ７
２６を混合してプローブ混合物を調製した。このプロー
ブ混合物を可変量のエンテロトキシン産生遺伝子を含む
細菌抽出物５μｔに加えた。抽出物−フ。 ローブ混合物は２２℃で１５分間インキユベー７ヨンし
た。 １５分のノ・イブリダイゼーション期間後、試料を１０
倍容量のプレノ・イブリダイゼーション緩衝液で希釈し
、０７５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）０７成中でｄ
Ｔ−付加磁性ビーズと共に５分間インキュベーションし
て標的捕獲ヲ行った。ヒースを磁気的に固定化して十分
に洗浄した。標的−第１７第２プローブ複合体を前述の
如く第１支持体から溶出し、第１支持体を除去した。 次に、標的−第１７第２プローブ複合体な言みまた未結
合の第２プローブを含む可能性のある溶出液はｄＣ−セ
ルロースと混合し、混合物の温度を３７℃に維持した。 この温度（３７℃）はオリゴｄＣとｄＣ７の解離温度よ
りも高く、そのために標的−第１７第２プローブ複合体
がｄＣ−セルロースに結合するのを防止する。この温度
はまたオリゴｄＣとｄＧ、ｏの解離温度よりも低く保た
れ、そのためにｄＧｌ、尾部をもつ未結合第２プローブ
がｄＣ−セルロースに結合するのを促進する。標的−第
１７第２プローブ複合体はｄＣ−セルロース支持体への
接近において未結合第２プローブよりも著しく立体的に
障害を受ける。ｄＣ−セルロースは遠心により分離され
たが、当業者は沖過のような他の方法も同様に使用しう
ろことを認めるであろう。 残存する溶出液は０２ミクロンの１クロデイスク（ゲル
マン社製）を通して磁性微粒子およびセルロース微粒子
を除去した。その後、溶出液は２２℃テｄ　Ｔ　３００
０　ヲ営むニトロセルロースフィルターに通した。ニト
ロセルロースにより最終標的捕獲を実施した。 下記の表２はバンクグラウンド捕獲の適用を示す： 表　　　２ 第１実験 濾過後　　　　　　　　　３９５　　　　　　＜１第２
実験 １　ｃｐｍ以下にノイズを減少させることにより、試料
中の極少量の標的を検出することができる。 １０−１８モル程度に少ない量（これは臨床用途に必要
とされる範囲内である）の標的も検出された。 １ラウンドの標的捕獲は約３０グのバックグラウンドを
除去した。１ラウンドのバックグラウンド捕獲は、初回
の標的捕獲で除去されなかったバックグラウンドを１０
グ減少させた。濾過による最終標的捕獲（第２ラウンド
の標的捕獲）は、初めの２工程のどちらによっても除去
されなかったバックグラウンドを２０グ減少させた。標
的およびバックグラウンド捕獲法は独立して作用し、本
実２Ｍ？ｌＪではバックグラウンドを約６０グまで減少
させた。バックグラウンド捕獲は、第１回目の標的捕獲
後に行う場合、よりよく作用すると思われる。明らかに
、バックグラウンド捕獲は標的捕獲よりも試料中の不純
物に対してより一層感受性である。 標的捕獲後にバックグラウンド捕獲を併用することは、
いずれか一方の単独使用に比べてより大きな利点をもた
らす。 上記実施例は放射性標識成分について詳述したものであ
るが、本方法は非放射性標識成分を使用する検定法に対
して多大な影響を及ぼしうろことが期待される。特に、
本方法は螢光剤や化学ルミネッセンス剤のような発光標
識成分に適用されるだろう。適当な螢光標識には、例え
ばフルオロセイン、ヒレン、アクリジン、スルホローダ
ミン、エオシン、エリスロシンおよびそれらの誘導体が
含まれるが、これらに限定されない。適当な化学発光剤
には、例えばミクロペルオキシダーゼ、ルミノール、イ
ンルミノール、グルコースオキシダーゼ、アクリジニウ
ムエステルおよびそれらの誘導体が含まれる。 実施例３゜ 以下の実施例は非放射性標識成分およびスパイクした（
　５ｐｉｋｅｄ）生物学的媒体からの多重ラウンドの標
的捕獲を特徴とする。スパイクした生物学的媒体は医療
現場で臨床的に得られる試料と似ている。 エンテロトキシン産生大腸菌および野生型大腸菌の細胞
抽出物は前述のように調製した。臨床現場に類似した環
境におけるｔｏｚ遺伝子の検出感度を測定するために、
トキシン産生菌の抽出物は前述の如く野生型大腸菌の抽
出物で希釈した。 次の物質は匿名の提供者から得られた：すなわちヒト大
便試料、牛乳、ヒト唾液、ヒトたん、ヒト全血、ヒト血
清、ヒト尿およびヒト精液。これらの臨床型試料は１０
分間にわたり可溶化した。 大便試料は固体であるためにＳＭ　ＧｗＳＣＮ、０．３
Ｍトリス−ＨＣｔ（ｐＨ７，４）、０．ＩＭ　　ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７）、１％β−メルカプトエタノールの溶液中
で可溶化した。０Ｔ溶化後、試料のアリコートを作り、
各アリコートは既知量のトキシン産生大腸菌または野生
型大腸菌のいずれかでスパイクした。この混合物はその
後粗沖過（ｃｒｗｄｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：バイオラ
ンド・エコツカラム）に通して１００℃で５分間加熱し
た。 残りの試料はその性状がより液状であったので大便とは
異なる方法で処理した。液状試料を固体のＧｖｔＳＣＨ
に加えて最終濃度を５Ｍとした。固体のＧｕＳＣＭは１
だ大便の場合と同じ最終濃度とするために、十分量のト
リス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡおよびβ−メルカプトエタノー
ルを宮んでいた。次に試料のアリコートを作り、各アリ
コートは既知量のトキシン産生大腸菌または野生型大腸
菌でスパイクした。この混合物は粗ｐ過に通し、１００
℃で５分間加熱した。 実施例３のプローブの作製は前の実施例と相違している
。第１捕獲プローブはプラスミドｐＢＲ３２２を用いて
作製された。このプラスミドはＨｈａ（およびＨａｅｆ
ｆｌで制限し、プラスミドフラグメントの末端にターミ
ナルトランスフェラーゼを用いて約１００個のｄＡ残基
を付加した。標的プラスミドはｐＢＲ３２２と広範囲に
わたって相同である（スパイサーおよびノープル、ＪＢ
Ｃ２５７，５７１６〜５７２１を参照）。こうして、第
１捕獲プローブは比較的大量にプラスミドｐＢＲ３２２
０両鎖の多数のフラグメントから作製された。 第２標識プローブは標的エンテロトキシン遺伝子と特異
的に結合するように作られた。第２標識プローブはバク
テリオファージＭ１３ｍｐ１８にクローニングされたｅ
ｌｔＡｌ遺伝子のＥｃｏＲｌ　−Ｈ１ｎｄ■制限フラグ
メントから作製された。大腸菌ＨＢ１０１にバクテリオ
ファージを感染させ、中間対数期１で増殖させた。大腸
菌を収穫し、バクテリオファージを単離した。バクテリ
オファージはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから
入手しうるストック・ニック−トランスレーション・キ
ラｒ９３） トを用いてビオチニル化ｄｃＴＰ　（エンゾ・バイオケ
ミカルズ社ｆｆ）でニック−トランスレーションを行っ
た。約５％のヌクレオチドがビオチニルヌクレオチドで
置換されて、ビオチン標識第２プローブを形成した。 プローブ混合物は２０　ｍＷ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ７
，４）および２ｍＭ　　ＥＤＴＡ中で８μｆ／ｍｌの第
２Ｍ１３−ｔｏｗプローブと４μグ／ｍＥの第１ｄＡ付
加プローブとを混合することにより調製した。このプロ
ーブ混合物は１００℃で１０分間加熱してプローブを変
性させた。 １容量のプローブ混合物は希釈段階の１容量の試料と混
合してノ・イブリダイゼーション混合物を調製した。ハ
イブリダイゼーション混合物はノ）イブリダイゼーショ
ン条件下に５７°Ｃで１５分間維持した。その後、この
ノ・イブリダイゼーション混合物は１０谷童の遮断緩衝
液（０，７５Ｍ　＋、１ン酸ナトリウム、ｐＨ８，０，
５％ラウリルサルコシンナトリウム、１０ｍ９７ｍＡ大
腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　、　　０．５　ｍｇ／　ｒｎｌウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ：ヌクレアーゼ不含）および５ｍ
ＭＥＤＴＡ）で希釈した。このハイブリダイゼーション
混合物に前述の如く製造したｄ　Ｔ、。 付加磁性ビーズを加えた。−・イブリダイゼーション条
件を２２℃で約１分間維持した。その後、ビーズを磁気
的に固定化することにより、・・イブリダイゼーション
混合物から分離した。ビーズは１５分の間に２回洗浄し
て生物学的試料中の不純物とハイブリダイズされなかっ
たビオチン標識第２プローブを除去した。 次に、約１分間で、第１／第２プローブ−標的複合体を
遮断緩衝液中６５℃で磁性ビーズから溶出した。溶出液
と第１ビーズを分離した。 約７分間で、第１７第２プローブ〜標的複合体は第２群
のビーズに可逆的に結合させ、その後再び解離させた。 第２群のｄＴ１ｏ付加ビーズを希釈溶出液に加え、ハイ
ブリダイゼーション条件を２２℃で約１分維持した。そ
の後ビーズを洗って遮断緩衝液中に再懸濁した。そのビ
ーズ遮断緩衝液混合物を６５℃に高めて第１／第２プロ
ーブ−標的複合体を数量させた。 ５分間にわたり、ニトロセルロース上で第１７第２ブロ
ーグー標的複合体の最終捕獲を実施した。 第２ビーズからの溶出液はゲルマン・アクロディスク（
０２ミクロン）を通過させた。その稿、ｄ　７’３１］
００ニトロセルロースフイルター（遮断緩衝液でプレハ
イブリダイズしたもの）に２２℃で第１７第２プローブ
−標的複合体含有溶出液を通過させた。 約３０分間で、フィルターＦｉ第２プローブのビオチン
標識を検出すべくさらに処理した。検出に使用した緩衝
液の組成を以下の表３に示す。 表　　３ 検出用緩衝液 緩衝液 １　　　１Ｍ　ＮａＣＬ、０６１Ｍ）リス−ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，４）、５ｔｎＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％ツイーン
２０ １ａ　　　５ｍ９／ｍｌ　　ＢＳＡ、　　１ＯＰｆ／ｍ
ｌ大腸菌ＤＮＡを含む緩衝液／ｌ６１ ２　　５％　ＢＳＡ、　　０．５％ツイーン２０を含む
緩衝液扁１ ３　　　０、ＩＭ　　ＮａＣ４０，ＩＭ）リス−ＨＣ１
（ｐＨ９，５）、５０ｍｕ　ＭｇＣｌ２まず初めに、第
１７第２プローブ−標的複合体を保有するフィルターは
検量緩衝液／Ｉ６２甲で約５分間インキュベーションし
た。次に、フィルターは検出緩衝液Ａ６１ａ中のストレ
プトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ）の１：２００希釈物中で５
分間インキュベーションした。その後、フィルターは検
出緩衝液／１６１で１分間に３回洗浄し、次いで検出緩
衝液／Ｉ６３で１分間に２回洗浄した。 ＱＫ、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフ
ェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＥＴ）（キールケガード・アンド・ベリー社製）を
検出緩衝液／ｉ６３で１２倍に希釈し、０．２ミクロン
のアクロディスクを通して濾過した。希釈したＥＣＩＰ
／ＮＥＴ溶液をフィルターに加え、３７℃で１５分間発
色させた。 次に、フィルターは５０　ｍＷ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ
７，４）および１０　ｍｕ　　ＥＤＴＡ中で１分間イン
キュベーションして反応を停止させた。感度はフィルタ
ー上で視覚的に、−またはＣ８９３０（高滓サイエンテ
ィフィック社製）でデンシトメーター走査することによ
り測定した。 拳法の工程を以下の表４に示す。 表　　４ １．生物学的試料の溶解；　　　　１０　　　１０ＤＮ
Ａの変性 ２、標識プローブと非標識プ　　１５　　２５０−ブを
加える；溶液中 ５７℃でハイブリダイゼ ーションを行う ３、＠性ビーズ上にプローブ　　　１　　２６−標的複
合体を捕獲する ４、磁性ビーズを洗浄して生　　１５　　４１物学的試
料中の不純物お よびハイブリダイゼーシ ョンバックグラウンドを 除去する ５、プローブ−標的複合体を　　　１　　４２溶出する ６、第２群のビーズを用いて　　　７　　４９工程３−
５を繰り返す （但し洗浄を省く） ７、プローブ−標的複合体を　　　５　　５４ｄ　Ｔ３
０００　−　”−トロセルロ ースへ結合させる ８、　フィルターを遮断緩衝液　　　５　　５９中でイ
ンキュベーション する ９、ストレプトアビジンーア　　　５　　６４ルカリ性
ホスフアターゼ を結合させる １０、洗浄　　　　　　　　　　　　５　　６９１１、
粱料を添加して酵素を検　　１５　　８４出する １２、反応を止める　　　　　　　　１　　８５表４は
経過時間が１時間を越える例を説明したが、本性は変更
が可能であり、より短い時間で行うことができる。匹適
する感度の非放射性プローブ検定は１２時間〜７日を要
し、大量の試料調製物を必要とする。 本検定法の感度を以下の表５に示す。 表　　５ 感度水準 細菌抽出物単独　　　　　　　　　　　　１５００ヒト
大便　　　　　　２．５％（ｗ／ｖ）　　　２０００牛
乳　　　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ）　　　３０００
？−）唾液　　　　　ｔ２．５％（ｖ／Ｖ）　　　３０
００ヒト尿　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ）　　　９０
００ヒト精液　　　　　　２．５％（ｖ／ｖ）　　　９
０００ヒト血ｙ、　　　　　　１２．５％（Ｖ／Ｖ）　
　　９０００ヒト血清　　　　　１２．５％（ｖ／ｖ）
　　　９０００ヒト挾　　　　　　　　１２．５％（ｖ
／ｖ）　　　　９０００本法は感度を改善するためにさ
らに改変することができる。例えば、多段捕獲放出サイ
クルにおいて熱溶出および化学的溶出を併用することに
より、単一溶出、多段熱溶出単独または多段１ヒ学的溶
出単独に比べて信号対ノイズの比が５倍以上高まるであ
ろう。 同じ放出法または溶出法を使用すると、支持体から同じ
バックグラウンドを放出させる傾向がある。しかしなが
ら、異なる放出条件を使用すると、他の方法では溶出さ
れやすいバックグラウンドが支持体に保持される傾向が
ある。バックグラウンドは２つの物理的または化学的に
異なる条件下で標的に対して全く同様にふる１うとは考
えられない。 磁性ビーズ上の標的−プローブ複合体の代表的な化学溶
出法は、ビーズを３ＭＧｒｂＳＣＮと室温で１分間接触
させることである。熱溶出の例は先に説明した。 細菌を検出する能力は１だプローブをリボソームＲＮＡ
配列に向けることにより改善されるであろう。リボノー
ムＲＮＡ配列はゲノムＤＮＡや臨床上重要なプラスミド
ＤＮＡと比較したとき細胞当たりの標的の１０００倍増
加を与える。 こうして、本発明Ｆｉ標的捕獲およびバックグラウンド
減少ならびにアフイニテイ検定を実施するための装置を
特徴とする。好適な実施態様を例示し説明してきたが、
本発明は変更および修飾が可能であり、従って説明した
細部に限定されるべきでなく、特許請求の範囲に含１れ
るこのような変更および修飾も本発明に包含されるべき
である。 ４、図面の簡単な説明 第１α図および第１ｂ図は本発明の好適な検定法の手順
を示す模式図である。 第２α図および第２ｂ図は本発明の多重プローブ検定法
の手順を示す模式図である。 第３図は第２α図および第２ｂ図に示した本検定法の変
法を゛示す模式図である。 第４図は本検定法を実施するための装置を示す模式図で
ある。 第５図はプローブ合成のための構築マツプを示す模式図
である。 （外４名） ＦＩＧ、　ｌａ ａ核阪料十鞄胞石臣片十不札特 〜　　　　　　　　　　　　　奮 畔　　　　　　　　　　　　　　Ｈ ＦＩＧ、　４ 医科　　　　−１溶イｍＩ＋１ ＝［−１−１ ′Ｎ瑳チ殺 ロ、ＴＩ勅酔　　４Ｗ掴キＸ スフーシジン１　　　　　　　　　　又ノーン冨ン２　
　　　　　　　　　ステーソジン３ヒ１〕吾モー１ニ ーーニソ′ ン１ン６ ｐＢＲ３２２棟榎ｎ−グリ ＦＩＧ、　５

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、多数の生物学的結合対であるターゲット分子につい
    て試料を検定する方法であって、 ａ）試料を、結合条件下に試薬と回収可能の支持体とに
    接触させ、こゝに試薬は第一の抗配位子プローブ及び第
    二の配位子プローブよりなり、第一および第二プローブ
    はプローブがターゲットに結合されるターゲット分子と
    錯体を形成でき、第一のプローブは結合条件下に回収で
    きる支持体に結合でき、第二プローブは検出できる標識
    部分を含有し、 ｂ）試料中ターゲットの存在下に、ターゲットおよび第
    一、第二プローブからなる除去生成物を形成する試料か
    ら回収可能な支持体を実質的に分離し、かつ ｃ）ターゲット分子の存在を示す標識部分の存在のため
    に除去生成物をモニターする、 ことからなることを特徴とする方法。 ２、前記のターゲットがポリヌクレオチドを包含し、か
    つ前記の第一、第二プローブがターゲットの独占部分と
    相互に結合できるポリヌクレオチドからなる特許請求の
    範囲第１項記載の方法。 ３、前記の回収可能の支持体がビーズからなる特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ４、前記のビーズは磁場と相互に作用し得る特許請求の
    範囲第３項記載の方法。 ５、前記の回収可能の支持体は試料内で実質的に均質分
    散できる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、前記の第二プローブは更に前記第二プローブがター
    ゲットに結合されない時第二の支持体に結合でき、かつ
    前記の方法が前記の試料を結合条件下に前記第二支持体
    に接触させ、前記第二支持体と前記第二プローブとの間
    に錯体を形成せしめ、かつ前記第二支持体を試料から分
    離し、未結合の第二プローブをバックグラウンドに還元
    させ試料から分離することよりなる特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ７、潜在的にターゲットポリヌクレオチドを含有する試
    料を前記試料媒体中で実質的に均質な分散を形成できる
    回収可能のビーズと接触せしめることよりなり、かつ前
    記回収可能のビーズはターゲットポリヌクレオチドと特
    に会合させることを特徴とするターゲットポリヌクレオ
    チドに対するターゲット捕捉方法。 ８、前記のビーズがプローブポリヌクレオチドにより前
    記ターゲットポリヌクレオチドと会合できる特許請求の
    範囲第７項記載の方法。 ９、前記のプローブポリヌクレオチド分子が回収可能の
    支持体およびターゲット分子と会合できる特許請求の範
    囲第８項記載の方法。 １０、前記のビーズがポリスチレンよりなる特許請求の
    範囲第７項記載の方法。 １１、前記の回収可能のビーズが磁場と相互作用できる
    特許請求の範囲第７項記載の方法。 １２、更に、前記の試料を前記第一プローブのターゲッ
    ト独占部分と会合できる第二のポリヌクレオチド検体と
    接触させる工程を包含し、前記第二プローブが検出でき
    る特許請求の範囲第７項記載の方法。 １３、更に、回収可能の支持体を試料から分離し、回収
    可能の支持体を第二の媒体と接触させ、かつ第二の媒体
    を回収可能の支持体からターゲットを放出する放出条件
    に置く工程からなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １４、第二の媒体を第二の支持体に接触させる付加工程
    を包含し、前記第二の支持体がターゲット分子を捕捉で
    きる結合条件下にターゲットと錯体を形成できる特許請
    求の範囲第１３項記載の方法。 １５、更に、第二の回収可能の支持体を第三の媒体に接
    触し、第三の媒体を放出条件に従わせ回収可能支持体か
    らターゲットを放出せしめる工程からなる特許請求の範
    囲第１４項記載の方法。 １６、更に、第三の媒体をターゲットの再捕捉する結合
    条件下にターゲットと錯体を形成できる支持体と接触せ
    しめる工程からなる特許請求の範囲第１５項記載の方法
    。 １７、前記の第二媒体における前記放出条件と前記第三
    媒体における前記放出条件とは物理的にかつ化学的に別
    個である特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８、前記の第二媒体における前記放出条件は化学的溶
    出および熱的溶出を包含する放出方法の群より選択され
    る特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、前記の第一および第二の支持体は化学的に別個で
    ある特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２０、試料媒体中で実質的に均質な分散体を形成できる
    回収可能の支持体からなるターゲットポリヌクレオチド
    捕獲用のキットであって、かつ前記キットには結合条件
    下に回収可能の支持体に結合できる第一プローブと前記
    ターゲット分子を包含する。 ２１、更に、ターゲット分子に結合し、ターゲット分子
    および前記第一プローブと錯体を形成することのできる
    第二プローブよりなり、前記第二プローブは検出できる
    標識成分を包含する特許請求の範囲第２０項記載のキッ
    ト。 ２２、試料媒体内で実質的に均質な分散体を形成できる
    回収可能のビーズよりなり、前記ビーズが特定的に前記
    のターゲットと結合でき、かつ前記の試料媒体から分離
    のできるターゲットのポリヌクレオチド捕獲のためのキ
    ット。 ２３、前記のビーズが磁場と相互作用し得る特許請求の
    範囲第２２項記載のキット。 ２４、試料媒体中のターゲットのポリヌクレオチドおよ
    び試料媒体中で実質的に均質な分散ができ、かつターゲ
    ットと錯体の形成できる支持体および試料媒体からター
    ゲットの結合された支持体を分離する手段を封入するの
    に適した反応室からなることを特徴とするターゲットの
    ポリヌクレオチドの検定を実施するための装置。 ２５、更に、回収可能の支持体を試料媒体から分離する
    ための磁場手段からなる特許請求の範囲第２４項記載の
    装置。 ２６、ターゲットを前記回収可能の支持体から第二の媒
    体中に放出する手段を包含する特許請求の範囲第２５項
    記載の装置。 ２７、更に、前記ターゲットに結合された検体に保持さ
    れた標識成分を検出する手段よりなる特許請求の範囲第
    ２６項記載の装置。 ２８、前記の支持体は前記のターゲットと錯体を形成し
    、かつ支持体と会合することのできる少なくとも１個の
    検体によりターゲットと錯体を形成する特許請求の範囲
    第２４項記載の装置。 ２９、プローブを会合し、ターゲットに結合しない標識
    部分を支持体と共に保持する手段からなる特許請求の範
    囲第２７項記載の装置。 ３０、試料を結合条件下にプローブを包含する試薬と接
    触させ、前記プローブは標識成分を有し、かつ混合条件
    下に前記のターゲットと錯体を形成でき、前記プローブ
    がターゲットに結合しない場合に支持体と錯体を形成で
    き、および前記の試料と試薬とを未結合のプローブと結
    合できる支持体と接触させる工程を包含するターゲット
    分子に対する試料検定の方法。 ３１、前記のプローブは前記ターゲットに結合できる基
    礎順位を包含する前記支持体に結合できるホモポリマー
    配位子を包含する特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、前記のプローブがターゲットに結合された時に、
    前記のプローブが結合されぬ時より低い温度で前記支持
    体から前記のプローブが放出される特許請求の範囲第３
    １項記載の方法。 ３３、前記の配位子が少なくとも３個の連続する基礎順
    位を前記のターゲットと共有する１０量体ホモポリマー
    を包含する特許請求の範囲第３１項記載の方法。 ３４、ターゲットのヌクレオチドと特定の会合ができ、
    かつ液体媒体中で分散できるビーズ。 ３５、前記のビーズが磁場と相互作用できる特許請求の
    範囲第３４項記載のビーズ。 ３６、更に、プローブに結合できるオリゴヌクレオチド
    からなる特許請求の範囲第３４項記載のビーズ。 ３７、前記のビーズがポリスチレンよりなる特許請求の
    範囲第３４項記載のビーズ。 ３８、前記のビーズが１〜１０ミクロンの直径を有する
    特許請求の範囲第３４項記載のビーズ。 ３９、前記のビーズはホモポリマーが共結合される表面
    を有する特許請求の範囲第３６項記載のビーズ。 ４０、第一の抗配位子を有する第一の支持体と使用する
    ための試薬組成であって第一プローブと第二プローブと
    よりなり、前記第一プローブがターゲット分子と錯体を
    形成でき、前記第一抗配位子に結合できる第一の配位子
    を包含し、かつ前記第二プローブは前記第一検体と共に
    前記ターゲット分子と錯体を形成でき、かつ検出できる
    標識成分を有することを特徴とする試薬組成。 ４１、前記第二検体が第二支持体に保持された第二抗配
    位子と結合できる第二配位子成分を包含する特許請求の
    範囲第４０項記載の試薬組成。
JP62268030A 1986-10-23 1987-10-23 標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置 Expired - Lifetime JP2975603B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92215586A 1986-10-23 1986-10-23
US922155 1986-10-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63188399A true JPS63188399A (ja) 1988-08-03
JP2975603B2 JP2975603B2 (ja) 1999-11-10

Family

ID=25446589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62268030A Expired - Lifetime JP2975603B2 (ja) 1986-10-23 1987-10-23 標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5780224A (ja)
EP (1) EP0265244B1 (ja)
JP (1) JP2975603B2 (ja)
CN (1) CN1016645B (ja)
AT (1) ATE80949T1 (ja)
AU (1) AU621812B2 (ja)
CA (1) CA1309329C (ja)
DE (1) DE3781860T2 (ja)
ZA (1) ZA877772B (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0341087A (ja) * 1989-03-17 1991-02-21 Eastman Kodak Co 核酸の増幅および検出方法
US5789165A (en) * 1993-05-10 1998-08-04 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Method and reagent for simultaneously assaying one or more ligands in a group of preselected ligands
JP2008301806A (ja) * 1994-10-13 2008-12-18 Solexa Inc 分子タグ化システム
JP2009545323A (ja) * 2006-08-01 2009-12-24 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2010183910A (ja) * 2010-05-17 2010-08-26 Sekisui Medical Co Ltd 核酸固定用磁性粒子
JP2019187361A (ja) * 2018-04-27 2019-10-31 国立大学法人 東京大学 メチル含有基修飾核酸を精製、分離または濃縮する方法

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
JPH02503983A (ja) * 1987-06-26 1990-11-22 イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー 捕捉ビーズを用いる組み換えクローン化ｎａからの混入配列のアフイニテイ除去
AU2735988A (en) * 1987-12-21 1989-07-13 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
NO165894C (no) * 1988-05-24 1991-04-24 Gunnar Paulsen Analysemetode for gener.
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
WO1990006045A2 (en) * 1988-11-21 1990-06-14 Dynal As Nucleic acid probes
GB8827160D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab Detection & quantitative determination of rna & dna
ATE122721T1 (de) * 1988-11-21 1995-06-15 Dynal As Verfahren zur herstellung von cdns.
US5759820A (en) * 1988-11-21 1998-06-02 Dynal As Process for producing cDNA
GB8827167D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab In vitro mutagenesis
US5512439A (en) * 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
DE3840462A1 (de) * 1988-12-01 1990-06-07 Berthold Lab Prof R Verfahren und vorrichtung zur messung der chemilumineszenz
CA2026573A1 (en) * 1989-02-03 1990-08-04 John B. Findlay Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
WO1990010717A1 (en) * 1989-03-10 1990-09-20 Gene-Trak Systems Preventing interference with affinity capture schemes
ATE118824T1 (de) 1989-03-10 1995-03-15 Amoco Corp Immobilisierte oligonukleotidsonden und ihre verwendungen.
US5580970A (en) * 1989-12-01 1996-12-03 Amoco Corporation Detection of HPV transcripts
WO1991008307A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-13 Microprobe Corporation Enhanced capture of target nucleic acid by the use of oligonucleotides covalently attached to polymers
EP0529070A1 (en) * 1991-02-27 1993-03-03 Amoco Corporation Methods for improving the sensitivity of hybridization assays
US5556748A (en) * 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
JPH0560761A (ja) * 1991-08-30 1993-03-12 Imuno Baion:Kk 重合体の分析方法
US5468852A (en) * 1992-02-18 1995-11-21 Shimadzu Corporation Oligonucleotides for detecting bacteria
WO1993022457A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Massachusetts Institute Of Technology Screening for genetic variation
US5312730A (en) * 1992-05-27 1994-05-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Immune complex transfer with lypophilic bridge
KR950011619A (ko) * 1993-10-22 1995-05-15 쿠라우찌 노리타카 알레르기질환검출용 dna프로브, 및 그것을 사용한 알레르기 질환유전자의 검출방법
DE4421058A1 (de) 1994-06-16 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur magnetischen Abtrennung von Flüssigkeitskomponenten
US5837144A (en) * 1994-06-16 1998-11-17 Boehringer Mannheim Gmbh Method of magnetically separating liquid components
DE4434093A1 (de) * 1994-09-23 1996-03-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz
DE19512368A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh System zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren
US6919175B1 (en) 1995-04-01 2005-07-19 Roche Diagnostics Gmbh System for releasing and isolating nucleic acids
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
US5853974A (en) 1995-06-07 1998-12-29 Chiron Corporation Enhancement of alkaline phosphatase with SDS in chemiluminescent substrates
ES2271994T3 (es) * 1997-05-02 2007-04-16 Gen-Probe Incorporated Hibridacion en dos pasos y captura de un polinucleotido.
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
WO1999037819A2 (en) 1998-01-27 1999-07-29 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6686150B1 (en) 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US20040203078A1 (en) * 1998-07-22 2004-10-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Labeled complex, process for producing same and process for utilizing same
US5973138A (en) * 1998-10-30 1999-10-26 Becton Dickinson And Company Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles
US20030032029A1 (en) * 1998-12-21 2003-02-13 Nanogen, Inc. Three dimensional apparatus and method for integrating sample preparation and multiplex assays
US6852493B2 (en) 1999-05-14 2005-02-08 Iris Biotechnologies, Inc. Magnetic field enhanced hybridization of target molecules to immobilized probes
ATE232560T1 (de) * 1999-05-27 2003-02-15 Iris Biotechnologies Inc Verfahren für die erhöhung der hybridisierungsrate von nukleinsäuren
ATE417127T1 (de) 1999-07-26 2008-12-15 Clinical Micro Sensors Inc Nukelinsäuresequenzbestimmung mittels elektronischem nachweis
AU2001241939A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-12 Maxygen, Inc. Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination and nucleic acid fragment isolation
DE10211321A1 (de) * 2002-03-14 2003-09-25 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Abfangsonden beim Nachweis von Nukleinsäuren
EP1498486A4 (en) * 2002-03-29 2005-08-03 Prec System Science Co Ltd NUCLEIC ACID LIBRARY AND PROTEIN LIBRARY
KR20050008720A (ko) 2002-05-17 2005-01-21 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 표적 핵산 서열의 분리, 증폭 및 검출을 위한 자동화 시스템
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
US7759106B2 (en) 2004-05-19 2010-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Construction of live attenuated Shigella vaccine strains that express CFA/I antigens (CfaB and CfaE) and the B subunit of heat-labile enterotoxin (LTB) from enterotoxigenic E. coli
DK1778867T3 (da) 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
US20060057613A1 (en) * 2004-07-26 2006-03-16 Nanosphere, Inc. Method for distinguishing methicillin resistant S. aureus from methicillin sensitive S. aureus in a mixed culture
EP1909108B1 (en) 2005-03-10 2019-05-29 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes
CA2842402C (en) 2005-03-10 2016-02-23 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples
WO2008045158A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
DE102006058374A1 (de) * 2006-12-08 2008-07-03 Biosensor Gmbh Analyseverfahren und portables Analysegerät
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
WO2009140374A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
WO2010068473A1 (en) * 2008-11-25 2010-06-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting small rnas, and uses thereof
CN105618264B (zh) * 2009-05-15 2021-04-06 简·探针公司 用于在执行磁性分离工序的仪器中实现磁体的自动移动的方法和设备
US8808990B2 (en) 2011-05-12 2014-08-19 Exact Sciences Corporation Serial isolation of multiple DNA targets from stool
US8993341B2 (en) 2011-05-12 2015-03-31 Exact Sciences Corporation Removal of PCR inhibitors
CN103649298A (zh) 2011-05-12 2014-03-19 精密科学公司 核酸的分离
WO2015089438A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
KR102323205B1 (ko) * 2014-08-22 2021-11-08 삼성전자주식회사 표적물질 분리장치 및 표적물질 분리방법
EP3265179A4 (en) 2015-03-04 2018-07-18 The University of Chicago Beta-catenin inhibitors in cancer immunotherapy
EP4417691A3 (en) 2016-09-15 2024-11-13 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
CN110740748A (zh) 2017-01-17 2020-01-31 芝加哥大学 肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性cd8+t细胞
CN112946253B (zh) * 2019-12-11 2022-11-08 广东菲鹏生物有限公司 用于免疫诊断试剂中固相载体的封闭阶段处理剂及应用和产品

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6093355A (ja) * 1983-09-26 1985-05-25 オーソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコーポレーテツド 核酸検出のためのサンドイツチハイブリダイゼーシヨン方法
JPS60237361A (ja) * 1984-04-27 1985-11-26 エンゾー　バイオケム　インコーポレイテツド 目標遺伝物質の検出方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3970518A (en) * 1975-07-01 1976-07-20 General Electric Company Magnetic separation of biological particles
US4351824A (en) * 1981-02-05 1982-09-28 Icl Scientific Polystyrene latex reagents, methods of preparation, and use in immunological procedures
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4554088A (en) * 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
GB8507706D0 (en) * 1985-03-25 1985-05-01 Genetics Int Inc Magnetic nucleic acid sequences
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US4752566A (en) * 1985-12-17 1988-06-21 Genetics Institute, Inc. Displacement polynucleotide method and reagent complex employing labeled probe polynucleotide
JP2806924B2 (ja) * 1985-12-20 1998-09-30 ベーリングヴェルケ・アクチェンゲゼルシャフト 粒子分離方法
EP0232967B1 (en) * 1986-01-10 1993-04-28 Amoco Corporation Competitive homogeneous assay

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6093355A (ja) * 1983-09-26 1985-05-25 オーソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコーポレーテツド 核酸検出のためのサンドイツチハイブリダイゼーシヨン方法
JPS60237361A (ja) * 1984-04-27 1985-11-26 エンゾー　バイオケム　インコーポレイテツド 目標遺伝物質の検出方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0341087A (ja) * 1989-03-17 1991-02-21 Eastman Kodak Co 核酸の増幅および検出方法
US5789165A (en) * 1993-05-10 1998-08-04 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Method and reagent for simultaneously assaying one or more ligands in a group of preselected ligands
JP2008301806A (ja) * 1994-10-13 2008-12-18 Solexa Inc 分子タグ化システム
JP2009545323A (ja) * 2006-08-01 2009-12-24 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2016027824A (ja) * 2006-08-01 2016-02-25 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2018171078A (ja) * 2006-08-01 2018-11-08 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2018174941A (ja) * 2006-08-01 2018-11-15 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2022075866A (ja) * 2006-08-01 2022-05-18 ジェン－プロウブ インコーポレイテッド 核酸の非特異的標的の捕捉方法
JP2010183910A (ja) * 2010-05-17 2010-08-26 Sekisui Medical Co Ltd 核酸固定用磁性粒子
JP2019187361A (ja) * 2018-04-27 2019-10-31 国立大学法人 東京大学 メチル含有基修飾核酸を精製、分離または濃縮する方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE80949T1 (de) 1992-10-15
DE3781860T2 (de) 1993-05-06
EP0265244A2 (en) 1988-04-27
EP0265244B1 (en) 1992-09-23
CN1016645B (zh) 1992-05-13
JP2975603B2 (ja) 1999-11-10
CN87107800A (zh) 1988-07-13
ZA877772B (en) 1988-04-20
AU621812B2 (en) 1992-03-26
EP0265244A3 (en) 1989-05-10
DE3781860D1 (de) 1992-10-29
CA1309329C (en) 1992-10-27
US5780224A (en) 1998-07-14
AU8009787A (en) 1988-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5780224A (en) Target and background capture methods and apparatus for affinity assays
US5750338A (en) Target and background capture methods with amplification for affinity assays
USRE37891E1 (en) Target and background capture methods with amplification for affinity assays
EP0328829B1 (en) Method for affinity assays using target amplification
JP2862547B2 (ja) 核酸精製、分離及びハイブリダイゼーション用ポリカチオン性支持体
DE3785591T2 (de) Kompetitiver homogener test.
CA1285330C (en) Analyte detection by means of energy transfer
US6306587B1 (en) Template-directed photoligation
KR100245284B1 (ko) 이중 d-루프 형성의 진단학적 응용
EP0235726B1 (en) Rapid detection of nucleic acid sequences in a sample by labeling the sample
US5082935A (en) Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination
EP2383575A1 (en) Method for pretreating specimen and method for assaying biological substance
WO1989012110A1 (en) Labeled nucleic acid probe
JPH0919292A (ja) 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
JPS63313598A (ja) 核酸含有試料中の核酸配列のアツセイ
JPS61195699A (ja) ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ
Shanker et al. Nanotechnology and detection of microbial pathogens
KR101460450B1 (ko) 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
EP4144865A1 (en) Microparticle probe for isolating and detecting nucleic acid for multiple diagnostics
US6468751B1 (en) Method and apparatus for performing amplification of nucleic acid on supports
JPS617469A (ja) 分子遺伝プロ−ブ及びその形成方法及び検査方法及び分子遺伝プロ−ブを使用する方法
EP0425217A2 (en) A hybridization assay for campylobacter rRNA
CN118086315B (zh) 一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体及其应用
Xu et al. Ultrahighly Sensitive Homogeneous Detection of DNA and MicroRNA by Using Single‐Silver‐Nanoparticle Counting
JPH03123500A (ja) 核酸の分別方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070903

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080903

Year of fee payment: 9