KR20020005441A - 미생물을 이용한 물질의 제조 방법 - Google Patents

미생물을 이용한 물질의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

미생물을 배지에서 배양하여 배지중에 목적 물질이 생성되어 축적되도록 한 후 목적 물질을 채취함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 목적 물질의 제조 방법에서, 상기 미생물로서, 호흡쇄 경로로서 고에너지 효율의 호흡쇄 경로 및 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 갖는 미생물의 모균주로 부터 창제된, (a) 고에너지 효율의 호흡쇄 경로가 증가되고/되거나 (b) 저에너지 효율의 호흡쇄 경로가 결손된 돌연변이 균주 또는 유전자 재조합 균주가 사용된다.

Description

미생물을 이용한 물질의 제조 방법{Method for producing substance utilizing microorganism}
본 발명은 미생물을 이용하여 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서, 미생물은 물질의 제조에 통상적으로 사용되는 에스체리키아속 세균 또는 코리네형 세균에 속하는 세균중에서 선택되는 것이 일반적이다. 생성하고자 하는 물질은 미생물을 이용하여 통상적으로 제조되는 물질, 예를 들면 L-아미노산, 핵산, 항생물질, 비타민, 성장 인자. 생리활성 물질 등중에서 선택될 수 있다. 본 발명은 미생물을 이용하여 물질을 제조하는 방법에서 최종 목적 물질의 생산성을 향상시키는 수단을 기술한다.
다수의 생물은 생명 활동에 요구되는 에너지를 호흡으로 부터 획득한다. 미생물의 호흡과정에서, 각종 효소 복합체가 일반적으로 종 또는 성장 환경에 따라 활성을 나타내며, 또한 에너지 획득 효율이 매우 다양하다. 탄수화물, 단백질 및 지방족 산은 해당작용, β-산화 등에 의해 아세틸-CoA로 변환되고, 시트르산 사이클에서 분해된다. 이때, NADH의 형태로 보존된 에너지는, NADH 데하이드로게나제(NDH) 및 이후의 옥시도리덕타제로 이루어진 전자전달계를 통해 미생물 세포로 부터 양성자를 배출시키는데 사용되고, 이로써 양성자 농도 구배가 세포막의 내부와 외부사이에 형성된다. 이러한 양성자 농도 구배는 아데노신 트리포스페이트(ATP) 합성의 구동력으로서 사용된다. 이 시점에, 높은 양성자 배출능을 나타내는 경로 및 낮은 양성자 배출능을 나타내는 경로가 NDH 및 옥시도리덕타제의 조합에 의존하는 전자 전달의 경로중에 존재한다. 높은 양성자 배출능의 경로는 고에너지 효율을 나타내며, 낮은 양성자 배출능의 경로는 저에너지 효율을 나타낸다고 간주된다. 따라서, 1 종류의 미생물은 동시에 다수의 호흡 연쇄 전자 전달 경로를 병렬로 함유하며, 이들 경로는 고에너지 효율 및 저에너지 효율의 경로 를 포함한다.
호기성 조건하의 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)의 호흡쇄에는 두 종류의 NDH와 두 종류의 말단 옥시다제가 있다. 즉, NDH의 경우에, 고에너지 효율의 NDH-1(nuo 오페론에 의해 암호화됨) 및 저에너지 효율의 NDH-II(ndh에 의해 암호화됨)이 공지되어 있다. 또한, 말단 옥시다제의 경우에, SoxM형[참조 문헌: Castresana, J. and Saraste, M., Trends in Biochem. Sci., 20, 443-448 (1985)]으로 분류되고 고에너지 효율을 나타내는 사이토크롬 bo형 옥시다제(cyoABCD 오페론에 의해 암호화됨), 및 저에너지 효율을 나타내는 사이토크롬 bd형 옥시다제(cydAB에 의해 암호화됨)가 공지되어 있다. 비록 이들 호흡쇄 효소의 발현양이 성장 환경에 따라 달라질 수 있지만[참조문헌: Minagawa et al., The Journal of Biological Chemistry, 265:11198-11203 (1990); Tseng et al., Journal of Bacteriology, 178:1094-1098 (1996); Green et al., Molecular Microbiology, 12:433-444 (1994); Bongaerts et al., Molecular Microbiology, 16:521-534 (1995)], 이들의 발현 양식의 생리학적 의의에 대하여는 여전히 미지의 사항이 많다.
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)내에는 사이토크롬 bc1 복합체가 있으며, 2종류 이상의 말단 옥시다제, 즉 SoxM형 옥시다제 및 사이토크롬 bd형 옥시다제가 존재한다는 것이 확인된다[참조문헌: The Second Symposium Concerning Metabolic Engineering, Lecture Abstracts, 1999]. 이는 퀴논 풀(pool)로 부터 산소 분자로의 전자 전달 경로에 두 종류의 경로, 즉 사이토크롬 bc1 복합체 및 SoxM형 옥시다제를 이용하는 경로 및 단지 사이크롬 bd형 옥시다제만을 이용하는 경로가 포함된다는 것을 보여준다. 전자는 하나의 전자의 전달에 대한 양성자 운송비가 높은 고에너지 효율의 전자 전달 경로이고, 후자는 하나의 전자의 전달에 대한 양성자 운송비가 낮은 저에너지 효율의 전자 전달 경로이다.
이. 콜라이의 말단 옥시다제에 있어서, 단지 사이토크롬 bo형 옥시다제만을갖는 돌연변이 균주, 단지 사이토크롬 bd형 옥시다제만을 갖는 돌연변이 균주, 및 둘다를 모두 갖는 야생형 균주를 호기성 배양하여 성장 수량을 비교하면, 사이토크롬 bd형 옥시다제만을 갖는 돌연변이 균주에서 성장 수량이 가장 낮으며, 이는 말단 옥시다제의 종류 및 에너지 획득 효율에 따라 달라질 수 있다[참조문헌: Annual Meeting of the Society for fermentation and Bioengineering Japan, 1995, Lecture Abstracts, No. 357].
또한, 일부 호흡쇄 효소에 결함이 있는 돌연변이체의 에너지 효율이 보고되었다[참조문헌: Calhoun et al., Journal of Bacteriology, 175:3020-3925 (1993)].
그러나, NDH-I 및 SoxM형 옥사다제에 대한 유전자와 같이 고효율을 제공하는 호흡쇄 유전자를 증폭시켜 에너지 효율을 변화시키는 것에 관하여는 밝혀진바가 없으며, 물질 제조에 이를 이용하는 시도도 본 발명에 이르기까지 공지된바 없다.
게다가, NDH-II 및 사이토크롬 bd형 옥시다제와 같은 저효율의 호흡쇄 효소의 결실을 물질의 제조에 이용하려는 시도도 없었다.
생체내에서 L-아미노산 및 핵산과 같은 물질을 생합성하는데는 에너지가 요구된다. 이때에 사용되는 대부분의 에너지는 NADH, NADPH 등과 같은 환원력 및 ATP로서 보존된 에너지로 이루어진다. 따라서, 본 발명의 발명자는, 목적 물질의 제조에 이용되는 에너지 공급이 미생물을 이용하여 물질을 제조하는 방법에서 증가된다면, 목적 물질의 생산성이 향상될 것이라는 것을 생각하게 되었다. 이러한 생각을 토대로, 본 발명의 목적은 에너지 효율이 향상된 미생물을 창제하고, 이를 이용하여 목적 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 발명자는, 고에너지 획득 효율을 나타내는 호흡쇄 경로를 증강시키거나, 저에너지 획득 효율을 나타내는 호흡쇄 경로에 결손을 만드는 방법으로 에너지 공급이 증가된 미생물을 창제할 수 있으리라 생각하게 되었다. 구체적으로, 이. 콜라이의 경우, 고에너지 효율의 호흡쇄 효소인 사이토크롬 bo형 옥시다제를 암호화하는 유전자를 증폭시키거나, 저에너지 효율의 호흡쇄 효소인 NDH-II를 암호화하는 유전자를 결실시키는 방법으로 향상된 에너지 효율을 가지리라 여겨지는 균주를 수득하였다. 이어서, 이를 사용하여 L-아미노산을 생산하고, 에너지 효율이 향상된 균주의 L-아미노산 생산성이 향상된다는 것을 발견하였다. 이로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
도 1은 NDH-II 유전자-파괴된 균주를 생산하기 위한 플라스미드 pTS-△ndh의 작제를 도시한다.
도 2는 pMAN 997의 작제를 도시한다.
즉, 본 발명은 다음을 제공한다.
(1) 호흡쇄 경로로서 고에너지 효율의 호흡쇄 경로 및 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 갖는 미생물의 모균주로 부터 창제된, (a) 고에너지 효율의 호흡쇄 경로가 증강되고/되거나 (b) 저에너지 효율의 호흡쇄 경로가 결손된 돌연변이 균주 또는 유전자 재조합 균주인 미생물을 배지에서 배양하여 배지중에 목적 물질이 생성되어 축적되도록 한 후, 목적 물질을 채취함을 특징으로 하는, 미생물을 이용한 목적 물질의 제조 방법;
(2) 상기 (1)에 있어서, 호흡쇄에 관련된 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나 당해 유전자의 발현 조절 서열을 변형시켜 고에너지 효율의 호흡쇄 경로를 증강시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 호흡쇄에 관련된 효소를 암호화하는 유전자를 파괴시켜 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 결손시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(4) 상기 (1) 내지 (3)중의 어느 하나에 있어서, 고에너지 효율의 호흡쇄 효소가 SoxM형 옥시다제, bc1 복합체, NDH-1, 또는 이들중 2 또는 3종을 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(5) 상기 (1) 내지 (4)중의 어느 하나에 있어서, 저에너지 효율의 호흡쇄 효소가 사이토크롬 bd형 옥시다제, NDH-II, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(6) 상기 (1) 내지 (5)중의 어느 하나에 있어서, 미생물에서 SoxM형 옥시다제의 활성을 증강시키고, NDH-II를 결손시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(7) 상기 (1) 내지 (6)중의 어느 하나에 있어서, SoxM형 옥시다제가 사이토크롬 bo형 옥시다제인 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(8) 상기 (1) 내지 (7)중의 어느 하나에 있어서, 미생물이 에스체리키아속 세균 또는 코리네형 세균인 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법;
(9) 상기 (1) 내지 (8)중의 어느 하나에 있어서, 목적 물질이 L-아미노산 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
본 발명에 따르면, 미생물을 배지에서 배양하여 배지중에 목적 물질이 생성되어 축적되도록 한 후, 목적 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 목적 물질의 제조 방법을 통해 종래의 방법과는 상이한 원리에 따라 목적 물질의 생산성이 향상될 수 있다.
이후 본 발명이 상세히 기술될 것이다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 물질은 미생물에 의해 제조될 수 있는 물질인 한 특히 제한되지는 않는다. 이의 예로는, L-트레오닌, L-리신, L-글루탐산, L-루신, L-이소루신, L-발린 및 L-페닐알라닌과 같은 각종 L-아미노산; 구아닐산 및 이노신산과 같은 핵산; 비타민; 항생물질; 성장인자: 생리활성 물질 등이 포함된다.
본 발명에 사용되는 미생물은, 호흡쇄 경로로서 고에너지 효율의 호흡쇄 경로 및 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 갖는 미생물의 모균주로 부터 창제된 (a) 고에너지 효율의 호흡쇄 경로가 증강되고/되거나 (b) 저에너지 효율의 호흡쇄 경로가 결손된, 상기한 바와 같은 목적 물질을 생산할 있는 능력을 지닌 미생물이다.
일반적으로, 이. 콜라이 및 코리네형 세균을 포함하는 미생물은 동시에 다수의 호흡쇄 전자 전달 경로를 병렬로 함유하고, 이들 경로는 전자당 양성자 운송비가 높은 경로 및 낮은 경로를 포함한다. 이.콜라이에서, 예를 들면 NADH의 전자공여체의 경우로는 NADH로 부터 퀴논 풀로의 양성자 전달을 촉매하는 NADH 데하이드로게나제로서 NDH-I 및 NDH-II이 존재한다. 이들중에서, NDH-I은 고에너지 효율을 나타내고 NDH-II은 저에너지 효율을 나타낸다. 즉, NDH-II는 하나의 전자로써 배출될 수 있는 양성자의 분자 수(양성자 운송비)가 0인 반면, NDH-I의 경우는 2인 것으로 여겨진다.
본 발명에서, 상기한 바와 같이 전자당 높은 양성자 운송비를 나타내는 경로, 즉 고에너지 효율의 호흡쇄 경로가 증강되고, 저에너지 효율의 호흡쇄 경로는 결손된다. 고에너지 효율의 호흡쇄 경로는 호흡쇄 경로에 관련된 호흡쇄 효소의 활성을 증강시킴으로써 증강될 수 있다. 저에너지 효율의 호흡쇄 경로는 호흡쇄 경로에 관련된 호흡쇄 효소의 활성을 저하시키거나 소실시킴으로써 결손될 수 있다.
호흡쇄 경로에 관련된 호흡쇄 효소는 호흡쇄 경로를 구성하는 효소인한, 특히 제한되지는 않는다. 구체적으로, 이의 예로는 전자 공여체로 부터 퀴논 풀, 예를 들면 유비퀴논, 디메틸메나퀴논 및 메나퀴논로의 전자의 전달을 촉매하는 데하이드로게나제, 및 퀴논 풀로 부터 전자 수용체로의 전자의 전달을 촉매하는 옥시다제가 포함된다.
퀴논 풀로 부터 전자를 전달하여 물 분자를 생성시키는 반응을 촉매하는 옥시다제는 SoxM형(bo형) 및 bd형으로 분류된다. bo형의 양성자 운송비는 2인 반면에, bd형의 경우 1이다. 따라서, bo형이 더 높은 에너지 효율을 나타낸다.
본 발명에서, 에너지 효율에 관해 사용된 "높은" 및 "낮은"이란 용어는 절대적인 의미로 사용되는 것은 아니고, 상기한 바와 같이 상대적인 개념을 의미하는데 사용된다.
이후에, 고에너지 효율의 호흡쇄 효소의 활성을 증진하는 수단, 및 저에너지 효율의 호흡쇄 효소의 활성을 저하시키거나 소실시키는 수단이 설명될 것이다.
고에너지 효율의 호흡쇄 효소의 활성을 증강시키기 위하여, 예를 들면 당해 효소를 암호화하는 유전자 단편과 미생물 세포에서 기능을 유지하는 벡터, 바람직하게는 다중-복사형 벡터를 연결시켜 재조합 DNA를 제조하고, 미생물속에 도입하여 당해 세포를 형질전환시킨다. 이로써, 형질전환체 균주의 세포내에서 당해 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 수는 증가하고, 결과적으로, 효소 활성이 증폭된다. 이 후, 이러한 과정을 고에너지 효율의 호흡쇄 효소의 유전자로서 사이토크롬 bo형 옥시다제를 암호화화는 cyo 오페론(cyoABCDE)를 예로 들어 설명할 것이다.
이. 콜라이의 cyo 오페론의 서열은 이미 보고되었으므로[참조문헌: Chepuri et al., The Journal of Biological Chemistry, 265:11185-11192 (1990)], 당해 오페론은 상기 서열을 토대로 클로닝될 수 있다. 또한, 에스체리키아속에 속하는 세균의 유전자, 또는 코리네형 세균과 같은 다른 생물로 부터 유래된 유전자가 cyo 오페론으로서 사용될 수 있다.
유전자 클로닝 및 미생물내로의 유전자의 도입에 사용되는 벡터로서, 예를 들면 이. 콜라이내에서 자율 복제가능한 플라스미드가 사용될 수 있다. 이의 구체적인 예로는 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pSTV29 등이 포함된다. 코리네형 세균속에 유전자를 도입하는 경우, 코리네형 세균 및 이. 콜라이내에서 자율 복제가능한 셔틀 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 코리네형 세균내에서 자율 복제가능한 플라스미드의 예의 목록은 다음과 같다:
pAM 330(일본 특개소 58-67699호 공보참조).
pHM 1519(일본 특개소 58-77895호 공보참조).
pAJ 655(일본 특개소 58-192900호 공보참조).
pAJ 611(일본 특개소 58-192900호 공보참조).
pAJ 1844(일본 특개소 58-192900호 공보참조).
pCG 1(일본 특개소 57-134500호 공보참조).
pCG 2(일본 특개소 58-35197호 공보참조).
pCG 4(일본 특개소 57-183799호 공보참조).
pCG 11(일본 특개소 57-183799호 공보참조).
pHK 4(일본 특개평 5-7491호 공보참조).
cyo 오페론을 함유하는 DNA 단편과 벡터를 연결시켜 재조합 DNA를 형성시키기 위하여, 벡터를 먼저 cyo 오페론의 말단에 적합한 제한 효소로 절단한다. 이러한 연결은 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 수행한다.
상기한 바와 같이 제조한 재조합 DNA를 미생물속에 도입하기 위하여, 임의의 공지된 형질전환법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이 K-12에 대하여 보고된, 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조 문헌: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)]; 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대하여 보고된, 증식 단계에 있는 세포로 부터 수용적격(competent) 세포를 수득한 후, 이속에 당해 DNA를 도입하는 방법[참조문헌: Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)]이 사용될 수 있다. 이러한 방법들외에, 재조합 DNA를 용이하게 취한 후, 세포내로 재조합 DNA를 도입할 수 있도록, DNA-수용 세포를 원형질체 또는 스페로플라스트로 만드는 방법도 사용될 수 있는데, 이 방법은 바실루스 서브틸리스, 방선균 및 효모에 적용가능한 것으로 공지되어 있다[참조문헌: Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]. 코리네형 세균의 형질전환은 전기 펄스법에 의해 달성될 수 있다[일본 특개평 2-207791호 참조].
사이토크롬 bo형 옥시다제 활성의 증폭은 cyo 오페론을 숙주의 염색체 DNA상에 다중 복사체로 존재하도록 함으로써 달성될 수 있다. cyo 오페론의 다중 복사체를 에스체리키아 속 세균 및 코리네형 세균에 속하는 세균과 같은 미생물의 염색체 DNA속에 도입하기 위하여, 염색체 DNA내에 다중 복사체가 존재하는 서열을 표적으로 사용하여 상동 재조합을 수행한다. 염색체 DNA내에 다중 복사체가 존재하는 서열로서, 반복 DNA, 또는 전위 인자의 단부에 존재하는 역위 반복서열이 사용될 수 있다. 또한, 일본 특개평 2-109985호 공보에 기술된 바와 같이, cyo 오페론을 트랜스포손에 탑재하여, cyo 오페론의 다중 복사체를 염색체속으로 전이시킬 수 있다. 어느 방법에 의하더라도, 형질전환체 균주의 세포내에 cyo 오페론의 복사체수가 증가되고, 결과적으로 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성이 증강된다.
또한, 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성의 증강은, 전술한 유전자 증폭에 의한 것외에, cyo 오페론의 발현 조절 서열, 예를 들면 프로모터를 강한 것으로 치환함으로써 달성될 수 있다[일본 특개평 1-215280호 공보 참조]. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파지의 PR프로모터 및 PL프로머터, tet 프로모터, amyE 프로모터, 등이 강한 프로모터로서 공지되어 있다. 이러한 프로모터의 치환은 cyo 오페론의 발현을 강화시키고, 결국 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성이 증강된다. 발현 조절 서열의 증강은 cyo 오페론의 복사체 수를 증가시키는 것과 병용될 수 있다.
또한, 고에너지 효율의 호흡쇄 효소의 활성의 증강은, 미생물을 돌연변이유발법으로 처리하여 효소의 세포내 활성이 증가되도록하는 돌연변이를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 돌연변이의 예로는 효소의 비활성을 증가시키는 암호 영역의 돌연변이, 유전자의 발현량을 증가시키는 발현 조절 서열의 돌연변이, 등이 포함된다. 돌연변이유발법으로서, 자외선 조사에 의한 처리, 또는 돌연변이 처리에 통상적으로 사용되는 돌연변이유발제, 예를 들면 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 아질산을 사용한 처리를 이용하는 방법이 열거될 수 있다.
저에너지 효율의 호흡쇄 효소의 활성을 저하시키거나 소실시키기 위하여, 당해 효소의 세포내 활성이 저하되거나 소실되도록 효소의 유전자에 돌연변이를 도입하거나, 당해 유전자가 정상적으로 기능을 발휘하지 못하도록 미생물의 염색체상의 유전자를 파괴한다. 이 후, 저에너지 효율의 호흡쇄 효소의 유전자로서 NDH-II를 암호화하는 ndh를 예로 들어, ndh 유전자를 파괴하는 방법을 설명할 것이다.
이.콜라이의 ndh의 서열은 이미 보고되었으므로[참조문헌: Young et al., European Journal of Biochemistry, 116-165-170 (1981)], 당해 유전자는 상기 서열을 토대로 클로닝될 수 있다. 또한, 에스체리키아속에 속하는 세균의 유전자, 또는 코리네형 세균과 같은 다른 생물로 부터 유래된 유전자가 ndh 유전자로서 사용될 수 있다.
염색체상의 ndh 유전자를, NDH-II의 기능이 정상적으로 발휘되지 못하도록 내부가 결실된 변형된 ndh 유전자(결실형 ndh 유전자)를 함유하는 DNA로 미생물을 형질전환시킨 후, 결실형 ndh 유전자와 염색체상의 ndh 유전자간의 재조합이 이루어지도록 함으로써 파괴시킬 수 있다. 상동 재조합에 의한 이러한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있으며, 직쇄 DNA를 이용하는 방법 및 온도 감수성 복제 제어영역 을 함유하는 플라스미드를 이용하는 방법 등이 있다. 본 발명에서, 온도 감수성 복제 제어영역을 함유하는 플라스미드를 이용하는 방법이 바람직하다.
숙주 염색체상의 ndh 유전자는 다음과 같이 결실형 ndh 유전자로 치환될 수 있다. 즉, 먼저, 온도 감수성 복제 제어영역, 결실형 ndh 유전자 및 약제 내성을 위한 마커 유전자를 삽입하여 재조합 DNA를 제조하고, 이러한 재조합 DNA로 미생물을 형질전환시킨다. 추가로, 생성된 형질전환 균주를 온도 감수성 복제 제어영역이 기능이 발휘하지 못하는 온도에서 배양한 다음, 형질전환 균주를 약물을 함유하는 배지에서 배양하여, 재조합 DNA가 염색체 DNA내로 삽입된 형질전환 균주를 수득할 수 있다.
재조합 DNA가 염색체 DNA속으로 삽입된 이러한 균주에서, 염색체상에 본래부터 존재한 ndh 유전자와 결실형 ndh 유전자가 재조합되며, 염색체 ndh 유전자 및 결실형 ndh 유전자의 두개의 융합 유전자가 재조합 DNA의 다른 부분(벡터 절편, 온도 감수성 복제 제어영역 및 약제 내성 마커)이 두개의 융합 유전자사이에 존재하도록 염색체속에 삽입된다. 따라서, 이 상태에서 정상적 ndh 유전자가 우성이기 때문에, 재조합체는 NDH-II를 발현한다.
이 후, 염색체 DNA상에 결실형 ndh 유전자만이 잔존하도록 하기 위하여, 두개의 ndh 유전자의 재조합에 의해 ndh 유전자의 하나의 복사체를 벡터 절편(온도 감수성 복제 제어영역 및 약물 내성 마커 포함)과 함께 염색체 DNA로 부터 제거한다. 이러한 경우에, 정상 ndh 유전자는 염색체 DNA상에 잔존하고, 결실형 ndh 유전자는 염색체 DNA로 부터 제거되거나, 반대로, 결실형 ndh 유전자가 염색체상에 잔존하고, 정상 ndh 유전자가 염색체 DNA로 부터 제거된다. 두 경우 모두에서, 온도 감수성 복제 제어영역이 기능을 발휘할 수 있는 온도에서 세포를 배양하는 때에, 제거된 DNA는 세포내에서 플라스미드로서 유지될 수 있다. 이어서, 세포를 온도 감수성 복제 제어영역이 기능을 발휘하지 못하는 온도에서 배양하여 플라스미드 DNA를 소실시키면, ndh 유전자 결실 돌연변이가 수득될 수 있다.
이. 콜라이용 온도 감수성 복제기점을 갖는 벡터의 예로는 국제 특허 공보 WO99/03988에 기술된 플라스미드 pMAN997 등이 포함되며, 코리네형 세균용 온도 감수성 복제기점을 갖는 벡터의 예로는 일본 특개평 5-7491호에 기술된 플라스미드pHSC4 등이 포함된다. 그러나, 플라스미드는 이들에 제한되지 않으며, 다른 벡터도 또한 사용될 수 있다.
상기한 방식으로 수득된 바와 같은 이러한 미생물의 구체적 예로는 SoxM형 옥시다제 또는 NDH-1의 활성, 이들 둘 모두의 활성이 증강된 미생물, 및 사이토크롬 bd형 옥시다제 또는 NDH-II의 활성, 또는 이들 둘 모두의 활성이 저하되거나 소실된 미생물이 포함된다. 보다 구체적으로, SoxM형 옥시다제의 활성이 증강되고 NDH-II가 결손된 이. 콜라이를 예로 들 수 있다. SoxM형 옥시다제의 예로는 사이토크롬 bo형 옥시다제가 포함된다.
본 발명에 사용된 미생물은 상기 성질이 부여된 이상 특별히 제한되지 않으며, 이의 예로는 이. 콜라이와 같은 에스체리키아속 세균, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)(코리네박테리움 글루타미쿰)와 같은 코리네형 세균, 바실루스 서브틸리스와 같은 바실루스 세균, 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)와 같은 세라티아 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisae)와 같은 효모, 등에 속하는 세균이 포함된다.
구체적으로, 발효 생산물이 L-트레오닌인 경우, 이. 콜라이 VKPM B-3996(RIA 1867)(미국 특허 제5,175,107호 참조), 코리네박테리윰 아세토아시도필룸(acetoacidophilum) AJ12318(FERM BP-1172)(미국 특허 제5,188,949호 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-리신인 경우, 이. 콜라이 AJ11442(NRRL B-12185, FERM BP-1543)(미국 특허 제4,346,170호), 이.콜라이 W3110(tyrA)(이 균주는 이. 콜라이 W3110 (tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653으로 부터플라스미드 pHATerm을 제거함으로써 수득된다; 국제 특허 공보 WO95/16042 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12435(FERM BP-2294)(미국 특허 제5,304,476호), 및 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ3990(ATCC 31269)(미국 특허 제4,066,501호 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-글루탐산인 경우, 이. 콜라이 AJ12624(FERM BP-3853)(프랑스 특허출원공개 제2,680,178호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12821(FERM BP-4172)(일본 특개펑 5-26811, 프랑스 특허출원공개 제2,701,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12475(FERM BP-2922)(미국 특허 제5,272,067호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ13029(FERM BP-5189)(국제 특허출원 JP95/01586 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-루신인 경우, 이. 콜라이 AJ11478(FERM BP-5274)(일본 특공소 62-34397 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ3718(FERM P-2516)(미국 특허 제3,970,519호 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-이소루신인 경우, 이. 콜라이 KX141(VKPM B-4781)(유럽 특허 출원공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움 플라붐 AJ12149(FERM BP-759)(미국 특허 제4,656,135호 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-발린인 경우, 이. 콜라이 VL1970(VKPM B-4411)(유럽 특허 출원공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12341(FERM BP-1763)(미국 특허 제5,188,948호 참조), 등이 언급될 수 있고; 발효 생산물이 L-페닐알라닌인 경우, 이. 콜라이 AJ12604(FERM BP-3579)(일본 특개평 5-236947호, 유럽 특허출원공개 제488,424호), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12637(FERM BP-4160)(프랑스 특허출원공개 제2,686,898호 참조), 등이 언급될 수 있다.
본 발명에 사용되는 미생물내에서, 목적 물질에 따라, 목적 물질의 생합성에 관련된 효소의 활성이 증강될 수 있다. 또한, 목적 물질의 생산에 불리한 효소의 활성은 저하되거나 소실될 수 있다.
목적 물질은, 상기한 바와 같은 미생물을 배지에서 배양하여 목적 물질이 배지중에 생성되어 축적되도록 한 후, 목적 물질을 채취하는 방법으로 제조될 수 있다.
목적 물질의 생산에 사용되는 배지는 종래부터 사용되온 익히 공지된 배지로서, 이용될 미생물에 따라 선택된다. 즉, 당해 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온, 및 필요한 경우 기타 유기 성분을 함유하는 통상의 배지일 수 있다. 본 발명을 수행하는데 있어 특별한 배지가 요구되지는 않는다.
탄소원으로서, 글루코즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈 또는 전분 가수분해물과 같은 당류; 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 알코올; 푸마르산, 시트르산 또는 석신산과 같은 유기산, 등이 사용될 수 있다.
질소원으로서, 황산암모늄, 염화암모늄 또는 인산암모늄과 같은 무기 암모늄; 대두 가수분해물과 같은 유기 질소; 암모니아 가스; 수성 암모니아, 등이 사용될 수 있다.
유기 미량 영양원으로서 요구되는 물질, 예를 들면 비타민 B1, L-호모세린 및 L-티로신 또는 효모 추출액을 적당한 양으로 함유하는 것이 바람직하다. 상기한 물질외에, 필요한 경우 인산칼륨, 황산마그네슘, 철이온, 망간이온, 등을 소량가한다.
이용될 미생물에 따라 선택되는, 종래부터 사용되어온 익히 공지된 조건하에서 배양을 수행한다. 예를 들면, 호기적 조건하에 16 내지 120 시간 동안 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 바람직하게는 25℃ 내지 45℃로 제어되며, 배양중 pH는 바람직하게는 5 내지 8로 제어된다. 무기 또는 유기성의 산성 또는 알카리성 물질뿐 아니라 암모니아 가스 등이 pH 조절에 사용될 수 있다.
배양 후 배지로 부터 대사 산물을 채취하는데 있어서, 본 발명의 경우에 어떤 특별한 방법이 요구되지 않는다. 즉, 본 발명은, 종래부터 익히 공지된 이온 교환 기술, 침전 기술 및 기타 기술의 조합을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 최선의 양태
이후, 본 발명은 하기의 실시예로써 보다 구체적으로 설명될 것이다.
실시예 1
사이토크롬 bo형 옥시다제 유전자의 클로닝
이. 콜라이의 사이토크롬 bo형 옥시다제를 암호화하는 cyo 오페론(cyoABCDE)의 서열은 이미 보고되었으므로[참조문헌: Chepuri et al., The Journal of Biology Chemistry, 265: 11185-11192], 당해 오페론을 당해 서열을 토대로 클로닝할 수 있다.
구체적으로, 표적 cyo 오페론 유전자는 cyo 오페론을 함유하는 Kohara의 파지 라이브러리[Kohara et al., Cell, 50:495-508 (1987)]로 부터 수득한다. Wizard lambda prep(promega)를 사용하여, 당해 오페론을 함유하는 Kohara의 파지 클론 147[2H5]로 부터 파지 DNA를 수득한다. 수득된 파지 DNA 147[2H5]를 PshBI으로 분해하고, cyo 오페론을 함유하는 수득된 5.5kb 단편을 평활-말단화한 후, pMW119(Nippon Gene)의 SmaI 부위에 삽입하여 프로모터 영역을 함유하는 cyo 오페론을 클로닝한다. 수득된 플라스미드에서, cyo 오페론은 pMW119상의 락토즈 오페론 프로모터에 대해 역방향으로 삽입된다. 이러한 플라스미드를 pMW(CYO)B로 명명한다.
플라스미드 pMW(CYO)B를 이. 콜라이 W3110균주(일본 시즈오카 미시마에 소재하는 국립 유전학 연구소로 부터 입수)에 도입하여 W33110/pMW(CYO)B를 수득한다. W3110 및 W3110/pMW(CYO)B 균주의 세포 추출액에 존재하는 우비퀴놀 옥시다제 활성을 공지된 방법[참조: Kita et al., The Journal of Biological Chemistry, 259:3368-3374 (1984)]을 사용하여 말단 옥시다제 활성으로서 측정한다. 그 결과는 표 1에 제시되어 있다.
우비퀴놀 옥시다제 활성
균주 우비퀴놀 옥시다제 활성(mmol/min/mg 단백질)
W3110/pMW119 0.28
W3110/pMW(CYO)B 0.56
표 1에 보여진 바와 같이 말단 옥시다제 활성이 pMW(CYO)B가 도입된 균주에서 증강됨이 밝혀졌다. 이러한 말단 옥시다제 활성의 증강은 cyo 오페론의 증강을 통한 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성의 증강에 의해 야기되는 것으로 여겨진다.
실시예 2
NDH-II 결손 균주의 획득
NDH-II 결손 균주를 생산하기 위하여, 내부가 분단된 NDH-II의 부분 서열(파괴형 NDH-II 유전자)를 작제한다. NDH-II의 부분 서열을, 이. 콜라이의 NDH-II를 암호화하는 유전자 ndh의 공지된 서열[참조: Young et al., European Journal of Biochemistry, 116:165-170 (1981)]을 토대로 클로닝한다.
구체적으로, 파괴형 NDH-II 유전자를 아래와 같이 작제한다(도 1). 먼저, NDH-II의 부분 서열을 함유하는 약 2.4kb의 DNA 단편을, ndh-1(서열 1) 및 ndh-2(서열 2)를 프라이머로서 사용하여 PCR로 이. 콜라이 염색체 DNA로 부터 증폭시킨다. 이 단편을 pGEM-T 벡터(Promega)내로 클로닝하여 pGEM-ndh를 수득한다. 이 pGEM-ndh를 제한효소 EcoRI 및 StuI으로 분해하고, 수득된 0.5kb의 DNA 단편을 회수하고, EcoRI 및 SmaI으로 분해한 pTWV229(Takara Shuzo)에 연결하여 pTWV-ndh를 수득한다.
이어서, pGEM-ndh를 제한효소 StuI으로 분해하고, 수득된 0.9kb의 DNA 단편을 회수하여 pTWV-ndh의 HincII 부위내에 삽입한다. 이로써, ndh의 부분 서열내에 pTWV229의 다중-클로닝 부위의 일부를 함유하는 pTWV△ndh가 수득된다. 플라스미드 pTWV△ndh는, ndh 서열 내의 StuI 부위에 pTWV229로 부터 유래된 17bp의 서열이삽입된 ndh 서열을 함유한다. 후속적으로, pTWV△ndh를 HindIII와 EcoRI으로 분해하여 수득된 1.5kb의 단편을 온도 감수성 플라스미드 pMAN997(국제 특허 공보 WO 99/03988 참조)의 HindIII와 EcoRI 부위사이에 삽입하여 pTS-△ndh를 수득한다. pTS-△ndh의 온도 감수성을 이용하는 일반적 상동 재조합 기술[참조: Matuyama et al., Journal of Bacteriology, 162:1196 (1985)]에 의해 당해 플라스미드 pTS-△ndh와 W3110 균주의 게놈상의 ndh간의 상동 재조합을 수행하여, pTWV229로 부터 유래된 17bp의 서열이 게놈상의 ndh의 암호 영역에 삽입되었기 때문에 정상적 NDH-II 단백질을 발현하지 못하는 W3110(ndh)를 수득한다. 테트라사이클린 내성을 마커로서 사용하여 P1 형질도입을 수행하여 W3110(tyrA)로 부터의 tyrA 결손을 W3110(ndh) 균주내로 도입하여, W3110(ndh, tyrA)를 수득한다.
전술한 pMAN997를, pMAN031(참조: J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)] 및 pUC19[참조: Takara Shuzo]의 VspI-HindIII 단편을 교환하여 수득한다(도 2).
추가로, W3110(tyrA) 균주는 유럽 특허출원공개 1992년 제48824호에 상세히 기술되어 있는 반면, 이의 제법은 아래에 간략히 기술될 것이다.
이. 콜라이 W3110 균주를 국립 유전학 연구소(일본 시즈오카 미시마 소재)로 부터 입수한다. 이 균주를 스트렙토마이신을 함유하는 LB 플레이트상에 파종하고, 콜로니를 형성하는 균주를 선별하여 스트렙토마이신 내성 균주를 수득한다. 선별된 스트렙토마이신 내성 균주 및 이. 콜라이 K-12 ME8424 균주를 혼합하고, 완전 배지(L-브로쓰: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl)에서 37℃하에 15분간 정치배양을 수행하여 접합을 유도한다. 이. 콜라이 K-12 ME8424 균주는(HfrPO45, thi, relAl, tyrA::Tn10, ung-1, nadB)의 유전형질을 가지며, 상기 국립 유전학 연구소로 부터 입수 할 수 있다. 이 후, 당해 배양물을 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 L-티로신을 함유하는 완전 배지(L-브로쓰: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 아가)에 파종하고, 콜로니를 형성하는 균주를 선별한다. 이러한 균주를 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주로 명명한다.
유럽 특허출원공개공보 1992년 제488424호에는 상기 균주내에 플라스미드를 도입함으로써 수득되는 다수의 균주가 기술되어 있다. 예를 들면, 플라스미드 pHATerm을 도입함으로써 수득된 균주는 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm으로 명명되었고, 1991년 11월 16일에 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로서 통상산업성공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고 )(현재, 독립 행정기관으로서 국제 특허 생물 기탁기관인 고등생명공학공업기술 국립연구소)(우편번호 305-5466, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1-초메 1반 1고 추오 다이-6)에 기탁되어, FERM BP-3653의 수탁번호가 수여되었다. 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주는, 통상의 방법으로 상기 균주로 부터 플라스미드 pHATerm을 제거함으로써 수득될 수 있다.
실시예 3
L-리신의 생산
실시예 1에서 수득된 플라스미드 pMW(CYO)B를 실시예 2에서 수득된 W3110(tyrA) 균주 및 W3110(ndh, tyrA) 균주내에 도입하여, W3110(tyrA)/pAW(CYO)B및 W3110(ndh, tyrA)/pMW(CYO)B를 각각 수득한다. 유사하게, pMW119를 W3110(tyrA)에 도입하여 W3110(tyrA)/pMW119 균주를 수득한다. 이들 W3110(tyrA)/pMW(CYO)B 균주, W3110(ndh, tyrA)/pMW(CYO)B 균주 및 대조군으로서 W3110(tyrA)/pMW119 균주의 L-리신의 생산성을 플라스크에서 배양하여 평가한다. 하기의 조성을 갖는 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 진탕하에 배양을 수행한다. 이 결과는 표 2에 제시되어 있다.
(배지 조성)
글루코즈 40g/L
MgSO4·7H2O 1g/L
KH2PO41g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
효모 추출액(Difco) 2g/L
L-티로신 0.1g/L 또는 0.05g/L
당해 배지를 KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분간 오토클레이빙한다. 그러나, 글루코즈 및 MgSO4·7H2O를 별도로 살균한다. 추가로, 배양전에, 180℃에서 건조 멸균한 일본국 약전에 따른 CaCO330g/L 및 항생물질인 앰피실린 100㎍/L을 당해 배지에 가한다.
L-리신의 생산량
균주 L-Lys(g/L)
W3110(tyrA)/pMW119 0.29
W3110(tyrA)/pMW(CYO)B 0.48
W3110(ndh, tyrA)/pMW(CYO) 0.53
L-리신의 생산성이, 사이토크롬 bo형 옥사다제 활성을 증강시킴으로써 L-리신을 생산하는 이. 콜라이내에서 향상됨이 밝혀졌다. 이는 에너지 획득 효율이 고에너지 효율의 호흡쇄 경로를 증강시킴으로써 향상되고, 당해 에너지는 L-리신 생산에 사용되기 때문인 것으로 고려된다.
또한, L-리신의 생산성이, NDH-II를 결손시킴으로써 L-리신을 생산하는 이. 콜라이내에서 향상됨이 밝혀졌다. 이는 에너지 획득 효율이 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 결손시킴으로써 향상되고, 당해 에너지는 L-리신 생산에 사용되기 때문인 것으로 고려된다.
실시예 4
L-트레오닌의 생산
전술한 방법에 의해 수득된 플라스미드 pMW(CYO)B를 L-트레오닌-생산 세균인 이. 콜라이 VKPM B-3996(RIA 1867)(미국 특허 제5,175,107호 참조, 이후 "B-3996"균주로 지칭함)에 도입하여 B-3996/pMW(CYO)B 균주를 수득한다. 당해 B-3996 균주는, 트레오닌 오페론을 스트렙토마이신 내성 마커를 함유하는 숙주-광역 벡터인 플라스미드 pAYC32[참조: Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167]에 삽입함으로써 수득된 플라스미드 pVIC40[국제 특허 공개공보 WO90/04636]를 보유한다. 당해 B-3996 균주는 USSR 항생물질 연구기관(Antibiotics Research Institute)(VNIIA)에 등록번호 제RIA 1867호로 기탁되었다.
pMW119를 B-3996에 도입하여 대조용으로서 B-3996/pMW119를 수득한다. 이들 B-3996/pMW(CYO)B 및 B-3996/pMW119의 L-트레오닌 생산성을 플라스크에서 배양하여 평가한다. 표 3에 언급된 조성을 갖는 배지를 사용하여 37℃에서 38시간 동안 114 내지 116rpm의 교반하에 배양을 수행한다. 표 3에 언급된 성분 A, 성분 B 및 성분 C를 조제하고 별도로 살균한 후, 이들을 냉각시키고 성분 A 16/20 용량, 성분 B 4/20 용량, 및 성분 C 30g/L의 비로 혼합한다. 이 결과는 표 4에 제시되어 있다.
트레오닌 생산 배지
A (NH4)2SO416g/LKH2PO41g/LFeSO4·7H2O 0.01g/LMnSO4·4H2O 0.01g/L효모 추출액(Difco) 2g/LL-이소루신 50mg/L니코틴산 10mg/LKOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정하고, 10분간 115℃에서 오토클레이빙함(16/20용량)
B 20% 글루코즈 115℃에서 10분간 오토클레이빙함(4/20 용량)MgSO4·7H2O 1g/L
C 일본국 약전에 따른 CaCO3180℃에서 건조 멸균시킴 (30g/L)항생물질(스트렙토마이신 100㎍/L 및 카나마이신 5㎍/L)
L-트레오닌의 생산량
균주 L-트레오닌(g/L)
B-3996/pMW119 13.1
B-3996/pMW(CYO)B 14.3
L-트레오닌을 생산하는 이. 콜라이의 L-트레오닌 생산성이 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성을 증강시킴으로써 향상된다는 것이 밝혀졌다.
실시예 5
L-페닐알라닌의 생산
이. 콜라이 W3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 균주로 부터 일반적인 플라스미드 정제법에 따라 플라스미드 pACMAB를 회수한다. 당해 플라스미드는, 적당한 L-페닐알라닌 생합성계의 탈감작형 코리스메이트 뮤타제/프리펜에이트 데하이드라타제(CM-PDH)에 관한 유전자를 함유하는 DNA 단편을 플라스미드 pACYC184(Apr)의 BamHI와 HindIII 절단 부위사이에 삽입함으로써 수득된 플라스미드이다(참조: 국제 특허 공개공보 WO97/08333). W3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 균주(AJ12604로서 명명)는 1991년 1월 28일에 통상산업성공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편번호 305, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 기탁되어, FERM P-11975의 수탁번호가 수여되었다. 이 후, 이를 1991년 9월 26일자로 부다페스트 조약하에 국제기탁기관으로 이관하여, FERM BP-3579의 수탁번호가 수여되었다.
플라스미드 pACMAB를 SalI으로 처리하여 평활-말단화한다. 이속에, PshBI로 처리하여 Kohara의 전술한 파지 DNA 147[2H5]로 부터 수득된 5.5kb의 cyo 오페론을 함유하는 평활-말단화된 DNA 단편을 삽입시킨다. 수득된 플라스미드 pACMAB-cyo를 W3110(tyrA/pBR-aroG4)속에 도입한다. 수득된 형질전환체 균주를 L-페닐알라닌 생산 배지(글루코즈 20g, 인산수소이나트륨 29.4g, 인산이수소칼륨 6g, 염화나트륨 1g, 염화암모늄 2g, 시트르산나트륨 10g, 글루탐산나트륨 0.4g, 황산마그네슘 7수화물 3g, 염화칼슘 0.23g, 티아민 하이드로클로라이드 2mg, 및 L-티로신 100mg을 물 1L 중에 함유)에서 37℃하에 40시간 동안 배양한다. 상기 배지중에 함유된 L-페닐알라닌을 고성능 액체 크로마토그래피로 정량화한다. 이 결과는 표 5에 제시되어 있다.
L-페닐알라닌의 생산량
균주 L-페닐알라닌(g/L)
W3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 3.9
W3110(tyrA)/pACMAB-cyo, pBR-aroG4 4.2
L-페닐알라닌을 생산하는 이. 콜라이의 L-페닐알라닌 생산성이 사이토크롬 bo형 옥시다제 활성을 증강시킴으로써 향상됨이 밝혀졌다.
본 발명은 미생물을 배지에서 배양하여 배지중에 목적 물질이 생성되어 축적되도록 한 후 목적 물질을 채취함을 포함하는, 미생물을 이용하여 목적 물질을 제조하는 방법을 통해, 호흡쇄 경로에 관련된 효소를 변형시켜 목적 물질의 생산성을 개선시킬 수 있다.

Claims (9)

  1. 호흡쇄 경로로서 고에너지 효율의 호흡쇄 경로 및 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 갖는 미생물의 모(母)균주로 부터 창제된, (a) 고에너지 효율의 호흡쇄 경로가 증가되거나 (b) 저에너지 효율의 호흡쇄 경로가 결손되거나 상기 (a) 및 (b)의 특성을 모두 갖는 돌연변이 균주 또는 유전자 재조합 균주인 미생물을 배지에서 배양하여 배지중에 목적 물질이 생성되어 축적되도록 한 후, 목적 물질을 채취함을 특징으로 하는, 미생물을 이용한 목적 물질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 호흡쇄에 관련된 효소를 암호화하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나 당해 유전자의 발현 조절 서열을 변형시켜 고에너지 효율의 호흡쇄 경로를 증강시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 호흡쇄에 관련된 효소를 암호화하는 유전자를 파괴시켜 저에너지 효율의 호흡쇄 경로를 결손시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중의 어느 한항에 있어서, 고에너지 효율의 호흡쇄 효소가 SoxM형 옥시다제, bc1 복합체, NDH-1, 또는 이들중 2 또는 3종을 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중의 어느 한항에 있어서, 저에너지 효율의 호흡쇄 효소가 사이토크롬 bd형 옥시다제, NDH-II, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중의 어느 한항에 있어서, 미생물에서 SoxM형 옥시다제의 활성을 증강시키고, NDH-II를 결손시킴을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중의 어느 한항에 있어서, SoxM형 옥시다제가 사이토크롬 bo형 옥시다제인 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중의 어느 한항에 있어서, 미생물이 에스체리키아속 세균 및 코리네형 세균으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중의 어느 한항에 있어서, 목적 물질이 L-아미노산 및 핵산으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 목적 물질의 제조 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101123213B1 (ko) * 2008-09-11 2012-03-19 부산대학교 산학협력단 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매
KR20240157846A (ko) 2023-04-26 2024-11-04 주식회사 아이에스피 제조 공정 중 화학용액 자동 분석 시스템
KR20240171498A (ko) 2023-05-30 2024-12-09 주식회사 아이에스피 화학 공정 실시간 관리 시스템

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
JP2001046067A (ja) * 1999-08-04 2001-02-20 Ajinomoto Co Inc 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子
PL341895A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-26 Ajinomoto Kk Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria
AU2000230762A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-31 Ajinomoto Co. Inc. Process for producing l-lysine
EP1481064B1 (en) * 2002-02-27 2011-04-13 DSM IP Assets B.V. Fermentation process
EP1546304B1 (en) 2002-10-04 2013-05-08 Danisco US Inc. Improved production of bacterial strains
AU2003287028B2 (en) 2002-10-04 2008-09-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
DE10254074A1 (de) * 2002-11-19 2004-06-17 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten
EP2348107A3 (fr) * 2003-02-18 2012-07-11 Metabolic Explorer Procédé de préparation de microorganismes évolués permettant la création ou la modification de voies métaboliques
EP1484410B1 (en) * 2003-06-05 2011-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Fermentation methods using modified bacteria with increased byproduct uptake.
ATE397059T1 (de) * 2003-07-29 2008-06-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung von l-lysin oder l- threonin unter verwendung von escherichia- bakterien mit abgeschwächter malatenzymaktivität
FR2862068B1 (fr) * 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
CN101243177B (zh) 2004-01-30 2012-12-05 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和生产l-氨基酸的方法
ATE499441T1 (de) * 2004-02-27 2011-03-15 Kyowa Hakko Bio Co Ltd Verfahren zur herstellung von aminosäuren
US7344874B2 (en) * 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7300776B2 (en) 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
US7482140B2 (en) * 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
US7205132B2 (en) * 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
WO2006078039A1 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid
WO2006129835A1 (en) * 2005-05-30 2006-12-07 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING POLY-gamma-GLUTAMIC ACID AND MICROORGANISM USED IN THE PRODUCTION METHOD
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
JP2008283863A (ja) 2005-08-26 2008-11-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007086618A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) * 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP4954985B2 (ja) 2006-05-09 2012-06-20 三井化学株式会社 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法
EP2025760B1 (en) * 2006-05-09 2013-06-05 Mitsui Chemicals, Inc. Method of producing glycolic acid by regenerating coenzyme
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2008010565A2 (en) * 2006-07-19 2008-01-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2008013996A2 (en) * 2006-07-27 2008-01-31 Gevo Inc. Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems
US9562224B2 (en) * 2006-09-07 2017-02-07 William Marsh Rice University Reduced activity of ubiCA in E. coli
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
WO2008090770A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
JP2010088301A (ja) * 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
KR20100120663A (ko) 2008-01-23 2010-11-16 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산의 제조법
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
JP2011167071A (ja) 2008-05-22 2011-09-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
PE20110369A1 (es) 2008-09-08 2011-06-24 Ajinomoto Kk Un microorganismo que produce l-aminoacido y un metodo para producir un l-aminoacido
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
EP2382320B1 (en) 2009-01-23 2018-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
CN105008532B (zh) 2013-05-13 2017-07-21 味之素株式会社 L‑氨基酸的制造方法
KR20160034320A (ko) * 2013-07-31 2016-03-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 원핵 세포에서의 폴리펩티드의 재조합체 생성 방법
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
BR112016007286B1 (pt) 2013-10-02 2021-07-20 Ajinomoto Co., Inc Métodos de controle de amônia e para produção de uma substância alvo, e, aparelho para controle de amônia
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP6519476B2 (ja) 2013-10-23 2019-05-29 味の素株式会社 目的物質の製造法
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020138178A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium
JP7491314B2 (ja) 2019-02-22 2024-05-28 味の素株式会社 ｙｄｉＪ遺伝子を過剰発現する腸内細菌科に属する細菌を用いたＬ－アミノ酸の製造方法
JP7524909B2 (ja) 2019-04-05 2024-07-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
CN111909917B (zh) * 2019-05-10 2022-10-14 中国科学院微生物研究所 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用
JP7655312B2 (ja) 2019-09-25 2025-04-02 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
JP7362895B2 (ja) * 2019-12-23 2023-10-17 シージェイ チェルジェダン コーポレイション シトクロムｃの活性が強化されたｌ－アミノ酸生産微生物およびこれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
CN113106075B (zh) * 2021-02-25 2022-06-14 齐鲁工业大学 一种细胞色素氧化酶突变体及其应用
KR102654301B1 (ko) * 2021-06-23 2024-04-04 씨제이제일제당 주식회사 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2023195475A1 (ja) 2022-04-04 2023-10-12 味の素株式会社 寄生植物を防除する方法
JP7839035B2 (ja) * 2022-06-27 2026-04-01 花王株式会社 芳香族化合物の製造方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4104124A (en) * 1976-08-30 1978-08-01 Louisiana State University Foundation Process for the production of single cell protein and amino acids
US4783403A (en) * 1984-02-08 1988-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing l-phenylalanine
US5017483A (en) * 1986-02-20 1991-05-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-threonine
DE4027453A1 (de) * 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
WO1995011985A1 (en) * 1993-10-28 1995-05-04 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing substance
FI980551A7 (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia
US6074830A (en) * 1998-06-09 2000-06-13 E. I. Du Pont De Nemours & Company 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
RU2144565C1 (ru) * 1998-11-12 2000-01-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Рекомбинантная плазмидная днк pq_f35, кодирующая гибридный полипептид f 35, обладающий антигенными и иммуногенными свойствами белка vp 35 вируса марбург, способ ее получения и штамм бактерий escherichia coli - сверхпродуцент рекомбинантного полипептида f 35
US7220571B2 (en) * 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
US8206955B2 (en) * 2003-10-21 2012-06-26 Cargill, Incorporated Production of monatin and monatin precursors

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101123213B1 (ko) * 2008-09-11 2012-03-19 부산대학교 산학협력단 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매
KR20240157846A (ko) 2023-04-26 2024-11-04 주식회사 아이에스피 제조 공정 중 화학용액 자동 분석 시스템
KR20240171498A (ko) 2023-05-30 2024-12-09 주식회사 아이에스피 화학 공정 실시간 관리 시스템

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