KR20140053910A

KR20140053910A - 탈면역화된 혈청-결합 도메인 및 혈청 반감기를 연장하기 위한 그것의 용도

Info

Publication number: KR20140053910A
Application number: KR1020137033962A
Authority: KR
Inventors: 에지오 본비니; 바스와티 바라트; 링 후앙; 레슬리 에스. 존슨
Original assignee: 마크로제닉스, 인크.
Priority date: 2011-05-21
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2014-05-08
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: US20160333111A1; EP2714079A2; CA2836873A1; US9376495B2; HK1190341A1; ES2605784T3; EP2714079B2; IL229576A0; JP2017137320A; US20200095333A1; IL229576B; MX2013013587A; CN104080804B; EA201391753A1; EP2714079A4; BR112013029892A2; AU2012259162C1; JP2014524890A; AU2012259162A1; JP6145088B2

Abstract

본 발명은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들면 항원-결합 분자)에 관한 것이다. 혈청-결합 단백질의 존재는 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분이 없는 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 연장시킨다. 본 발명은 또한 그런 분자를 사용하는 방법 및 용도에도 관련된다.

Description

탈면역화된 혈청-결합 도메인 및 혈청 반감기를 연장하기 위한 그것의 용도{DEIMMUNIZED SERUM-BINDING DOMAINS AND THEIR USE FOR EXTENDING SERUM HALF-LIFE}

관련 출원과의 교차-참조

본 출원은 미국 특허 출원 일련 번호 61/488,725 (2011년 5월 21일 출원, 현재 계류중)의 권리를 주장하고, 그 출원은 본원에서 전체적으로 참조로 포함된다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 37 C.F.R.1.821에 따라 하나 또는 그 이상의 서열 목록을 포함하며, 그것은 지면과 컴퓨터 판독가능한 매체에 공개되었고, 그런 지면과 컴퓨터 판독가능한 공개물은 본원에 전체가 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들면 항원-결합 분자)에 관한 것이다. 혈청-결합 단백질의 존재는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분이 결핍되어 있는 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교하여 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시킨다. 본 발명은 또한 그런 분자를 사용하는 방법 및 용도에도 관련된다.

본 발명은 특히 이중체 분자, 다르게는 "이중 친화성 재표적화 시약"("DART"), 다양한 질병과 장애, 이를테면 면역학적 장애 및 암의 치료에 사용되는 그것의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이중체 분자는 동일하거나 상이한 에피토프를 인식할 수 있는 최소한 두 개의 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 결합하는 최소한 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 추가로 에피토프는 동일하거나 상이한 분자로부터 유래하거나 또는 동일하거나 상이한 세포 상에 위치할 수 있다. 이중체 분자의 개별적인 폴리펩티드 사슬은 비-펩티드성 결합, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 각각의 폴리펩티드 사슬 내에 위치한 시스테인 잔기의 이황화 결합과 같은 공유 결합을 통해 공유 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자는 추가로 Fc 영역을 포함하는데, 그것은 분자 안에 항체-유사 기능성이 공학적으로 도입되는 것을 가능하게 한다.

공유 이중체의 디자인은 단일 사슬 Fv 구성물 (scFv)을 토대로 한다 (Holliger et al. (1993) "' Diabodies' : Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 변형되지 않은 무상 IgG에서, VL과 VH 도메인은 별도의 폴리펩티드 사슬, 즉 각각 가벼운 사슬(경쇄)과 무거운 사슬(중쇄)에 위치한다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용, 및 특히 VL과 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프 결합 부위 중 하나를 형성한다. 대조적으로, scFv 구성물은 단일 폴리펩티드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하며, 이때 도메인들은 두 개의 도메인의 기능성 에피토프 결합 부위로의 자체-어셈블리를 가능하게 하는 충분한 길이의 가요성 링커에 의해 분리된다. 불충분한 길이 (약 12 아미노산 잔기 미만)의 링커로 인해 자체 어셈블리가 불가능한 경우, 2개의 scFv 구성물은 서로 상호작용하여 이가 분자를 형성하는데, 한 사슬의 VL은 다른 사슬의 VH와 결합된다 (Marvin et al (2005) "Recombinant Approaches To IgG - Like Bispecific Antibodies ", Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). 더욱이 구성물의 c-말단에 시스테인 잔기의 첨가는 폴리펩티드 사슬의 이황화 결합을 가능하게 하여, 그 결과 형성되는 이량체가 이가 분자의 결합 특성으로 간섭받는 일 없이 안정화되는 것으로 밝혀졌다 (Olafsen et al. (2004) " Covalent Disulfide - Linked Anti - CEA Diabody Allows Site - Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Application ", Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27). 나아가, 상이한 특이성의 VL 및 VH 도메인이 선택되는 경우, 이가뿐 아니라 이중특이성 분자가 구성될 수 있다.

이가 이중체는 치료법과 면역진단을 포함하여 광범위한 용도에 사용된다. 이가의 특성은 다양한 용도에서 이중체의 디자인 및 공학적으로 조작될 때 매우 큰 유연성을 가능하게 하고, 다량체 항원에 대한 증강된 결합능력, 상이한 항원의 교차 결합, 및 두 가지 표적 항원의 존재에 의존하는 특이한 세포 유형에 대한 직접적인 표적화를 제공한다. 그것의 증가된 결합가, 낮은 분해속도 및 순환계로부터의 신속한 제거 (대략 50kDa 또는 그 이하의 작은 크기의 이중체인 경우)로 인해 해당 기술분야에 공지되어 있는 이중체 분자는 또한 종양 영상화 분야에서 특별하게 사용되고 있다 (Fitzgerald et al. (1997) " Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ", Protein Eng. 10:1221). 특히 중요한 것은 상이한 세포의 교차결합, 예를 들면 세포독성 T 세포의 종양 세포에 대한 교차결합이다 (Staerz et al (1985) " Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells ", Nature 314:628-631, 및 Holliger et al (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T- Cells Mediated By A Bispecific Diabody ", Protein Eng. 9:299-305). 이중체 에피토프 결합 도메인은 또한 T 림프구, 천연 킬러 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포 상에 발현된 CD3, CD16, CD32, 또는 CD64와 같은 어떠한 면역 이펙터 세포의 표면 결정기에 대해 지시될 수 있다. 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정기, 예컨대 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 이중체 결합은 또한 이펙터 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Holliger et al. (1996) " Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T- Cells Mediated By A Bispecific Diabody ", Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen ( CEA )- Specific T- Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti - CD3 x Anti - CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti - CEA Bispecific Fusion Proteins ", Cancer Res. 59:2909-2916). 정상적으로 이펙터 세포 활성화는 항원 결합 항체의 Fc-FcγR 상호작용을 경유한 이펙터 세포에 대한 결합에 의해 야기되고; 그로써 이런 관점에서는 본 발명의 이중체 분자는 그것들이 Fc 도메인을 포함하는지의 여부와 관계없이 (예컨대 해당 기술분야에서 공지되었거나 본원에서 예시된 어떠한 이펙터 기능 분석 (예컨대 ADCC 분석)에서 분석되는 바와 같이) Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다. 종양 및 이펙터 세포에 교차결합함으로써 이중체는 종양 세포에 근접한 곳에 이펙터 세포를 가져올 뿐 아니라 효과적인 종양 사멸을 유도한다 (Cao et al. (2003) " Bispecific Antibody Configurates In Therapeutics", Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).

이펙터 세포 수용체 및 면역 시스템에서의 그것의 역할

관례적인 면역 기능에서 항체-항원 복합체와 면역 시스템의 세포와의 상호작용은 항체-의존성 세포독성, 비만세포 탈과립화, 및 식세포작용과 같은 이펙터 기능으로부터 림프구 증식과 항체 분비를 조절하는 것과 같은 면역조절 신호에 이르기까지 광범위한 배열의 반응을 초래한다. 이런 상호작용들은 모두 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인이 조혈세포 상의 특수 세포 표면 수용체에 결합함으로써 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 야기된 세포 반응의 다양성은 Fc 수용체의 구조적 이종성으로부터 유발된다. Fc 수용체는 아마도 세포내 신호화를 중재하는 구조적으로 관련된 항원 결합 도메인을 공유한다.

단백질의 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 구성원인 Fcγ 수용체는 면역글로불린 분자의 Fcγ 부분에 결합할 수 있는 표면 당단백질이다. 패밀리의 각 구성원은 Fcγ 수용체의 알파 사슬 상의 인식 도메인을 통해 하나 또는 그 이상의 이소타입의 면역글로불린을 인식한다. Fcγ 수용체는 면역글로불린 하위유형에 대한 그것들의 특이성에 의해 규정된다. IgG에 대한 Fcγ 수용체는 FcγR로, IgE에 대해서는 FcεR로, IgA에 대해서는 FcαR로 언급된다. 상이한 부속 세포들은 상이한 이소타입의 항체에 대한 Fcγ 수용체를 포함하고, 항체의 이소타입은 부속 세포들이 주어진 반응에 참여할 것인지의 여부를 결정한다 (Ravetch J.V. et al. (1991) " Fc Rsceptors", Annu. Rev. Immunol. 9:457-92; Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors", Microbes and Infection, 3:131-139; Billadeau D.D. et al. (2002), "ITAMs Versus ITIMs : Striking A Balance During Cell Regulation ", The Journal of Clinical Investigation, 2(109):161-1681; Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors ", Science, 290:84-89; Ravetch J.V. et al., (2001) " IgG Fc Receptors ", Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors : Rubor Redux ", Cell, 78(4):553-60). 상이한 Fcγ 수용체, 그것을 발현하는 세포, 및 그것의 이소타입 특이성은 아래의 표 1에 요약한다 (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York로부터 채택됨).

Fc γ 수용체

이 패밀리의 각 구성원은 통합 막 당단백질로서, 면역글로불린-관련 도메인의 C2-세트에 관련된 세포외재성 도메인, 단일 막 회전 도메인 및 가변적 길이의 세포질내 도메인을 포함한다. 세 가지의 공지된 FcγR이 있는데, 각각 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII(CD16)로 표시된다. 세 개의 수용체는 구별되는 유전자에 의해 코드화되지만, 세 가지 패밀리 구성원 사이의 광대한 상동성은 이것들이 아마도 유전자 복제에 의해 공통적인 전구체로부터 발생했음을 시사한다.

Fc γRII( CD32 )

FcγRII 단백질은 단량체 Ig에 대한 낮은 친화성 (10⁶ M^-1)으로 인해 복합체화된 IgG에만 결합하는 40kDa 통합 막 당단백질이다. 이 수용체는 가장 광범위하게 발현되는 FcγR이고, 모든 조혈세포, 이를테면 단핵세포, 대식세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 비만 세포, 및 혈소판 상에 존재한다. FcγRII는 그것의 면역글로불린 결합 사슬에 단지 두 개의 면역글로불린-유사 영역을 가지고, 따라서 IgG에 대한 FcγRI보다 훨씬 더 낮은 친화성을 가진다. 세 개의 사람 FcγRII 유전자 (FcγRII-A, FcγRII-B, FcγRII-C)가 있으며, 이것들은 모두 응집체 또는 면역 복합체로 IgG에 결합한다.

FcγRII-A와 FcγRII-B의 세포질 도메인 내에서 구별되는 차이점은 수용체 결찰에 대한 두 가지의 기능적으로 이종성인 반응을 유발한다. 기본적인 차이점은 A 이소형태는 세포 활성화, 예컨대 식세포 작용 및 호흡 폭발을 유도하는 세포 내 신호화를 개시하는 반면, B 이소형태는 억제 신호, 예컨대 억제하는 B-세포 활성화를 개시한다는 점이다.

Fc γRIII( CD16 )

이 부류 안에서의 이종성으로 인해, FcγRIII의 크기는 마우스와 사람에서 40 내지 80kDa의 범위이다. 두 가지 사람 유전자는 두 개의 전사물, 즉 통합 막 당단백질인 FcγRIIIA와, 글리코포스파티딜-이노시톨 (GPI)-결합 버전인 FcγRIIIB를 코드화한다. 하나의 쥐과 유전자는 막 회전 사람 FcγRIIIA에 상동성인 FcγRIII을 코드화한다. FcγRIII은 다른 두 개의 FcγR의 각각과 구조적 특성을 공유한다. FcγRII와 같이, FcγRIII은 IgG와 낮은 친화성으로 결합하고, 상응하는 두 개의 세포외재성 Ig-유사 도메인을 함유한다. FcγRIIIA는 대식세포, 비만세포에서 발현되고 NK 세포에서는 단독 FcγR이다. GPI-결합된 FcγRIIIB는 현재 사람 호중구에서만 발현되는 것으로 알려져 있다.

Fc γR을 통한 신호화

활성화 및 억제 신호는 둘 다 결찰 후 FcγR을 통해 변환된다. 전혀 다른 이들 반대의 기능은 상이한 수용체 이소형태 중에서도 구조적 차이로부터 유발된다. 면역수용체 티로신 기초 활성화 모티프 (ITAM) 또는 면역수용체 티로신 기초 억제 모티프 (ITIM)으로 불리는, 수용체의 세포질 신호화 도메인 내에 있는 두 개의 구별되는 도메인이 상이한 반응을 담당한다. 이들 구조에 대한 상이한 세포질 효소의 충원은 FcγR-중재된 세포 반응의 결과를 지시한다. ITAM-함유 FcγR 복합체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA를 포함하는 한편, ITIM-함유 복합체는 FcγRIIB만을 포함한다.

사람 호중구는 FcγRIIA 유전자를 발현한다. 면역 복합체 또는 특이한 항체 교차결합을 통한 FcγRIIA 뭉침은 수용체-결합 키나아제와 함께 ITAM을 응집시키는 작용을 하고, 그것은 ITAM 인산화를 촉진한다. ITAM 인산화는 Syk 키나아제에 대한 도킹 부위로서 작용하고, 그것의 활성화는 하류 기질 (예컨대 PI₃K)의 활성화를 초래한다. 세포 활성화는 전 염증성 조절제의 방출을 유도한다.

FcγRIIB 유전자는 B 림프구 상에서 발현되는데, 그것의 세포외재성 도메인은 FcγRIIA에 96% 동일하고, 구별할 수 없는 방식으로 IgG 복합체와 결합한다. FcγRIIB의 세포질 도메인에서 ITIM의 존재는 FcγR의 이 억제성 하위부류를 규정한다. 최근에 이 억제의 분자 기초가 수립되었다. 활성화 FcγR과 함께 공동 결찰되는 경우, FcγRIIB의 ITIM은 인산화되고 이노시탈 폴리포스페이트 5'-포스파타제 (SHIP)의 SH2 도메인을 끌어당기고, 그것은 ITAM-함유 FcγR-중재된 티로신 키나아제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저를 가수분해하고, 따라서 세포내 Ca⁺⁺의 유입을 방지한다. 그러므로 FcγRIIB의 교차결합은 FcγR 결찰에 대한 활성화 반응을 꺾고 세포 반응성을 억제한다. B 세포 활성화, B 세포 증식 및 항체 분비도 따라서 무산된다.

표 1. 면역글로불린 이소타입의 Fc 영역에 대한 수용체

발명의 개요

본 발명은 특히 공유 이중체 및/또는 공유 이중체 분자 및 암, 자가면역 장애, 알레르기 장애 및 박테리아, 진균 또는 바이러스에 의해 유발된 감염성 질병을 포함하는 다양한 질병과 장애의 치료에 사용되는 그것들의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명의 이중체는 두 개의 상이한 세포 상의 두 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는데, 그 중 첫 번째 에피토프는 두 번째 에피토프와 상이한 세포 유형에 발현되어 이중체는 두 세포를 함께 연결할 수 있다.

상세하게 설명하자면, 본 발명은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드 (및 특히 항원-결합 분자)를 제공하는데, 이때 상기 혈청-결합 단백질 부분은 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분이 없는 경우 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교하여 연장시킨다.

본 발명은 또한 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 그러한 폴리펩티드의 부분을 그것에 공유 결합된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장하기 위해 사용하는 용도 (또는 그런 용도를 포함하는 방법)에도 관련되는데, 혈청 반감기의 연장은 알부민 결합 단백질이 부족한 경우의 항원-결합 분자의 혈청 반감기와 관련된다.

본 발명은 추가로 상기 설명된 폴리펩티드 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 폴리펩티드 사슬은 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 추가 부분을 포함하고, 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분은 둘 다 혈청 단백질에 결합할 수 있다.

본 발명은 특히 상기 설명된 폴리펩티드 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민-결합 도메인 (ABD), 또는 그것의 알부민-결합 변이체이고, 특히 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민-결합 도메인 (ABD)는 스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)이다.

본 발명은 특히 상기 설명된 폴리펩티드 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 알부민 결합 도메인은 다음을 포함한다:

(A) 위치 71, 위치 74, 또는 위치 79에서 발린에서 알라닌으로의 변이;

(B) 위치 64에서 류신의 알라닌으로의 변이, 위치 65에서 이소류신의 알라닌으로의 변이, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이; 또는

(C) 위치 66에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 변이, 위치 70에서 트레오닌의 세린으로의 치환, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이.

본 발명은 또한 상기 설명된 폴리펩티드 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 알부민-결합 도메인은 SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, 또는 SEQ ID NO:329의 서열을 가진다.

본 발명은 나아가 상기 설명된 항원-결합 분자 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 항원-결합 분자는 항원-결합 분자이다. 본 발명은 또한 항원-결합 분자가 서로 상호작용하여 두 개의 항원-결합 부위를 형성하는 최소한 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성된 이중체이고, 이때 최소한 하나의 폴리펩티드 사슬은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함한다. 본 발명은 또한 그러한 이중체의 구체예에 관련되는데, 이때 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 사슬은 둘 다 혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함하고 및/또는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬은 상호간에 공유 결합된다.

본 발명은 특히 상기 설명된 이중체 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 이중체는

(A) 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체 또는 T-세포 수용체 (TCR); 및

(B) 종양-관련 항원에 결합한다.

본 발명은 특히 상기 설명된 모든 이중체 또는 용도의 구체예와 관련되는데, 이때 항원은 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 자궁경부암 항원, 췌장암종 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 결장암 항원, 고환암 항원, 신경교아세포종 암항원, B 세포 악성과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비호지킨성 림프종과 관련된 항원, 또는 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원이다.

한 구체예에서, 본 발명은 공유 이중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 임의로 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 임의로 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 공유 이중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 세 번째 및 네 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성한다.

어떤 측면으로, 본 발명은 이중체 분자에 관련되고, 그 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하는데, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 공유 이중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 이중체 분자의 이량체이고, 각각의 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 각 이중체 분자의 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 각 이중체 분자의 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 공유 사중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 이중체 분자의 이량체이고, 첫 번째 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성하며; 두 번째 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 세 번째 에피토프에 특이한 세 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL3)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 네 번째 에피토프에 특이한 네 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH4)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 네 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL4)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 세 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH3)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하고, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 세 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL3)(VH3)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 네 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL4)(VH4)를 형성한다.

본 발명의 어떤 측면으로, 첫 번째 에피토프, 두 번째 에피토프, 및 적용할 수 있다면 세 번째 에피토프 및 네 번째 에피토프는 동일할 수 있다. 다른 측면으로 첫 번째 에피토프, 두 번째 에피토프, 및 적용할 수 있다면 세 번째 에피토프 및 네 번째 에피토프는 각각 상호간에 다를 수 있다. 세 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 특정 측면에서, 첫 번째 에피토프와 세 번째 에피토프는 동일할 수 있다. 네 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 특정 측면에서, 첫 번째 에피토프와 네 번째 에피토프는 동일할 수 있다. 세 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 어떤 측면에서 두 번째 에피토프와 세 번째 에피토프는 동일할 수 있다. 네 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 어떤 측면으로, 두 번째 에피토프와 네 번째 에피토프는 동일할 수 있다. 본 발명의 바람직한 측면으로, 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프는 상이하다. 세 번째 에피토프 결합 도메인과 네 번째 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 또 다른 측면으로, 세 번째 에피토프와 네 번째 에피토프는 상이할 수 있다. 전술한 것들의 어떠한 조합도 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

발명의 특별한 측면으로, 이중체 또는 이중체 분자의 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 동일한 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 다른 측면으로 이중체 또는 이중체 분자의 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 동일한 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 또 다른 측면으로 이중체 또는 이중체 분자의 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 상이한 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 또 다른 측면으로 이중체 또는 이중체 분자의 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 상이한 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 전술한 것들의 어떠한 조합도 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 어떤 측면으로, 이중체 또는 이중체 분자의 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬 사이의 공유 결합은 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 최소한 하나의 시스테인 잔기와 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 최소한 하나의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통하여 이루어질 수 있다. 이황화 결합에 기여하는 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 도메인 내에 있는 것을 포함하여 폴리펩티드 사슬의 어느 곳에서든지 발견될 수 있다. 특정 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 첫 번째 도메인에서 발견되고, 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 다섯 번째 도메인에서 발견된다. 첫 번째, 두 번째, 네 번째 및 다섯 번째 도메인은 결합에 기여하는 가변 영역에 상응한다. 바람직한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 사슬 사이의 이황화 결합에 기여하는 시스테인 잔기는 각각 세 번째 및 여섯 번째 도메인 내에 위치한다. 이 구체예의 특별한 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하는데, 그것은 아미노산 서열 (SEQ ID NO :17)에 의해 코드화될 수 있다. 이 구체예의 다른 측면으로 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하는데, 그것은 아미노산 서열 (SEQ ID NO :17)에 의해 코드화될 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 사람 IgG의 힌지 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함하는데, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO :78)에 의해 코드화될 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면으로 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 사람 IgG의 힌지 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함하는데, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO :78)에 의해 코드화될 수 있다. 이 구체예의 어떤 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO :77)을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면으로 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 힌지 도메인을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면으로, 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 힌지 도메인을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면으로, 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 사람 카파 경쇄의 C-말단 6 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO :23)을 포함하고; 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함한다.

다른 구체예에서, 이황화 결합에 기여하는 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드 상의 시스테인 잔기는 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 도메인의 외부 및 두 번째 폴리펩티드 사슬의 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 도메인 외부에 위치할 수 있다. 특히 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 첫 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 첫 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 두 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 두 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 세 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 세 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 나아가, 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 네 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 네 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 다섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 다섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 따라서 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 시스테인 잔기는 여섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 여섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 특별한 측면으로, 이황화 결합은 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 최소한 두 개의 시스테인 잔기와 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 최소한 두 개의 시스테인 잔기 사이에 있을 수 있다. 특별한 측면으로, 세 번째 도메인과 여섯 번째 도메인이 Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함하지 않는 경우, 시스테인 잔기는 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있고 두 번째 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있을 수 있다. 전술한 것들의 어떠한 조합이든지 본 발명에 포함되는 것으로 인지될 것이다.

앞에서 설명된 본 발명의 특정 구체예에서 본 발명의 공유 이중체는 이중체 분자의 이량체를 포함하는데, 이때 각 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이 구체예의 어떤 측면으로 이중체 분자는 이량체를 형성하기 위해 공유결합될 수 있는데, 이때 공유 결합은 펩티드 결합이 아니다. 이 구체예의 바람직한 측면으로 공유 결합은 이량체의 이중체 분자 각각의 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상에 있는 최소한 하나의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합이다. 본 발명의 더 바람직한 측면으로, 공유 결합은 이량체를 형성하는 각각의 이중체 분자의 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상에 있는 최소한 하나의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합이며, 이때 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 각각의 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인에 위치한다.

본 발명의 어떤 측면으로, 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 두 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 첫 번째 도메인은 세 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 세 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 두 번째 도메인은 첫 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 첫 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 나아가 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 두 번째 도메인은 세 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 세 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 따라서 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 첫 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 첫 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 세 번째 도메인은 두 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 두 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬과 관련해서는, 네 번째 도메인은 다섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 다섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 네 번째 도메인은 여섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 여섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬의 다섯 번째 도메인은 네 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 네 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬의 다섯 번째 도메인은 여섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 여섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 따라서 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 네 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 네 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬의 여섯 번째 도메인은 다섯 번째 도메인에 대해 N-말단이거나 다섯 번째 도메인에 대해 C-말단일 수 있다. 전술한 것들의 어떠한 조합이든지 본 발명에 포함되는 것으로 인지될 것이다.

특정 구체예에서, 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 세 번째 도메인에 대해 C-말단에 위치하거나, 또는 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 첫 번째 폴리펩티드 사슬 상의 세 번째 도메인에 대해 N-말단에 위치할 수 있다. 두 번째 폴리펩티드 사슬과 관련해서는, 네 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 여섯 번째 도메인에 대해 C-말단에 위치하거나, 또는 네 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 여섯 번째 도메인에 대해 N-말단에 위치할 수 있다. 이 구체예의 어떤 측면으로, 본 발명은 공유 이중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 이중체 분자의 이량체이고, 각각의 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며, 세 번째 도메인은 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인 둘 다에 대해 N-말단에 위치하고; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하며, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 각 이중체 분자의 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 각 이중체 분자의 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 각 이중체 분자의 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 공유 사중특이성 이중체에 관련되는데, 그 이중체는 이중체 분자의 이량체이고, 첫 번째 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 첫 번째 에피토프에 특이한 첫 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 두 번째 에피토프에 특이한 두 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며, 세 번째 도메인은 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인 둘 다에 대해 N-말단에 위치하고; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 두 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 첫 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하며, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 첫 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL1)(VH1)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL2)(VH2)를 형성하며, 두 번째 이중체 분자는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 그 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 세 번째 에피토프에 특이한 세 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL3)의 결합 영역을 포함하는 첫 번째 도메인, (ii) 네 번째 에피토프에 특이한 네 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH4)의 결합 영역을 포함하는 두 번째 도메인, 및 (iii) Fc 도메인 또는 그것의 일부분을 포함하는 세 번째 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 도메인은 첫 번째 및 두 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며, 세 번째 도메인은 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인 둘 다에 대해 N-말단에 위치하고; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 (i) 네 번째 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL4)의 결합 영역을 포함하는 네 번째 도메인, (ii) 세 번째 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH3)의 결합 영역을 포함하는 다섯 번째 도메인, 및 (iii) 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 여섯 번째 도메인을 포함하며, 상기 네 번째와 다섯 번째 도메인은 네 번째 및 다섯 번째 도메인이 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않도록 공유 결합되며; 이때 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬은 공유 결합되는데, 단 공유 결합은 펩티드 결합이 아니며; 첫 번째 도메인과 다섯 번째 도메인은 연합하여 세 번째 에피토프에 결합하는 첫 번째 결합 부위 (VL3)(VH3)를 형성하고, 두 번째 도메인과 네 번째 도메인은 연합하여 네 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 결합 부위 (VL4)(VH4)를 형성한다.

상기에서 논의된 것과 같이, 개별적인 폴리펩티드 사슬 상의 도메인은 공유 결합된다. 특정 측면으로, 첫 번째와 두 번째 도메인, 첫 번째와 세 번째 도메인, 두 번째와 세 번째 도메인, 네 번째와 다섯 번째 도메인, 네 번째와 여섯 번째 도메인, 및/또는 다섯 번째와 여섯 번째 도메인 사이의 공유 결합은 펩티드 결합일 수 있다. 특히 첫 번째 및 두 번째 도메인, 및 네 번째 및 다섯 번째 도메인은 첫 번째와 두 번째, 및 네 번째와 다섯 번째 도메인이 결합 부위를 형성하기 위해 연합하지 않는 한, 각각 세 번째와 여섯 번째 도메인에 의해, 또는 추가의 아미노산 잔기에 의해 분리될 수 있다. 아미노산 잔기의 수는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직한 한 측면으로, 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수는 8이다.

본 발명의 어떤 측면으로, Fc 도메인을 포함하는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬의 도메인, 즉 임의로 세 번째 및 여섯 번째 도메인은 각각 추가로 도메인이 힌지-Fc 영역을 포함할 수 있도록 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드 사슬 또는 두 번째 폴리펩티드 사슬은 또한 Fc 도메인을 포함하지 않으면서 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 중쇄, 경쇄, 힌지 영역, Fc 도메인, 및/또는 힌지-Fc 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 포함하여 어떠한 면역글로불린 유형으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 측면으로, 면역글로불린 유형은 IgG, 또는 그것의 어떠한 하위유형, 즉 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄이다. 다른 측면으로 경쇄 및 중쇄가 유도되는 면역글로불린은 인간화되거나 키메릭화된 것이다.

나아가 이중체 또는 이중체 분자가 결합하게 되는 첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프, 및 적용할 수 있다면 세 번째 에피토프와 네 번째 에피토프는 동일한 항원으로부터의 상이한 에피토프이거나 또는 상이한 에피토프로부터의 상이한 에피토프일 수 있다. 항원은 항체가 생성될 수 있는 어떠한 분자일 수 있다. 예를 들어 단백질, 핵산, 박테리아 독소, 세포 표면 마커, 자가면역 마커, 바이러스 단백질, 약물 등이다. 특별한 측면으로, 이중체의 최소한 하나의 에피토프 결합 부위는 특별한 세포, 예컨대 B-세포, T-세포, 식세포, 천연 킬러 (NK) 세포 또는 수지상 세포 상의 항원에 특이적이다.

본 구체예의 어떤 측면으로, 이중체 또는 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 부위는 Fc 수용체에 특이한데, 그 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체 또는 억제성 Fc 수용체일 수 있다. 특별한 측면으로 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이고, Fcγ 수용체는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 수용체이다. 보다 바람직한 측면으로 FcγRIII 수용체는 FcγRIIIA (CD16A) 수용체 또는 FcγRIIIB (CD16B) 수용체이고, 보다 바람직하게는 FcγRIII 수용체는 FcγRIIIA (CD16A) 수용체이다. 바람직한 다른 측면으로, FcγRII 수용체는 FcγRIIA (CD32A) 수용체 또는 FcγRIIB (CD32B) 수용체이고, 보다 바람직하게는 FcγRIIB (CD32B) 수용체이다. 특히 바람직한 측면으로, 이중체의 한 결합 부위는 CD32B에 특이적이고, 다른 결합 부위는 CD16A에 특이적이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 이중체 또는 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 부위는 활성화 Fc 수용체에 특이적이고, 최소한 하나의 다른 부위는 억제성 Fc 수용체에 특이적이다. 이 구체예의 어떤 측면으로, 활성화 Fc 수용체는 CD32A이고 억제성 Fc 수용체는 CD32B이다. 이 구체예의 다른 측면으로, 활성화 Fc 수용체는 BCR이고, 억제성 Fc 수용체는 CD32B이다. 이 구체예의 또 다른 측면으로, 활성화 Fc 수용체는 IgERI이고 억제성 Fc 수용체는 CD32B이다.

한 에피토프 결합 부위가 CD16A에 특이적인 경우, VL과 VH 도메인은, 그 서열이 클론되어 있고 본원에 기술되어 있는 마우스 항체 3G8의 VL 및 VH 도메인과 동일하거나 그것에 유사할 수 있다. 한 에피토프 결합 부위가 CD32A에 특이적인 다른 경우에, VL과 VH 도메인은 마우스 항체 IV.3의 VL 및 VH 도메인과 동일하거나 그것에 유사할 수 있다. 한 에피토프 결합 부위가 CD32B에 특이적인 또 다른 경우에, VL과 VH 도메인은, 그 서열이 클론되어 있고 본원에 기술되어 있는 마우스 항체 2B6의 VL 및 VH 도메인과 동일하거나 그것에 유사할 수 있다. 3G8, 2B6 및 IV.3의 VL 또는 VH 도메인 중 어느 것이든지 어떠한 조합으로든지 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 본 발명은 또한 첫 번째 에피토프가 CD32B에 특이적이고, 두 번째 에피토프가 CD16A에 특이적인 이중특이성 이중체 또는 이중체 분자에도 관련된다.

다른 측면으로 에피토프 결합 부위는 병원성 항원에 특이적일 수 있다. 본원에서 사용되는 병원성 항원이란 암, 감염 및 자가면역 질병을 포함하여 특이한 병원성 질병에 포함된 항원이다. 그러므로 병원성 항원은 종양 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 또는 자가면역 항원일 수 있다. 예시적인 병원성 항원으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 리포다당류, 사람 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 (예컨대 E16 및/또는 E53 항원) 및 간염 바이러스로부터의 바이러스 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이러스 항원, 핵산 (DNA 및 RNA) 및 콜라겐이 있다. 바람직하게는 병원성 항원은 중화 항원이다. 바람직한 측면으로, 한 에피토프 결합 부위가 CD16A 또는 CD32A에 특이적인 경우 다른 에피토프 결합 부위는 자가면역 항원을 제외한 병원성 항원에 특이적이다. 또 다른 바람직한 측면으로, 한 에피토프 결합 부위가 CD32B에 바람직한 경우, 다른 에피토프 결합 부위는 어떠한 병원성 항원에 특이적이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자는 동일 세포 상의 두 개의 상이한 항원에 결합하는데, 예를 들면 한 항원 결합 부위는 활성화 Fc 수용체에 특이적인 반면, 다른 것은 억제성 Fc 수용체에 특이적이다. 다른 구체예에서, 이중체 분자는 두 개의 구별되는 바이러스 중화 에피토프, 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니지만 웨스트 나일 바이러스의 E16 및 E53에 결합한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이중체는 다양한 질병 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 질병 또는 장애를 치료하기 위한 방법에 관련되는데, 그 방법은 치료의 필요가 있는 환자에게 본 발명의 공유 이중체 또는 이중체 분자의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지며, 공유 이중체 또는 이중체 분자의 최소한 하나의 결합 부위는 병원성 항원, 에컨대 암세포의 표면 또는 박테리아 또는 비리온의 표면에 발현된 항원에 특이적이고, 최소한 하나의 다른 결합 부위는 Fc 수용체, 예컨대 CD16A에 특이적이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 질병 또는 장애를 치료하기 위한 방법에 관련되는데, 그 방법은 치료의 필요가 있는 환자에게 본 발명의 이중체 또는 이중체 분자의 유효량을 투여하는 것으로 이루어지며, 이중체 또는 이중체 분자의 최소한 하나의 결합 부위는 CD32B에 특이적이고, 최소한 하나의 다른 결합 부위는 CD16A에 특이적이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 병원성 항원에 대한 면역 내성을 유도하는 방법에 관련되는데, 그 방법은 본 발명의 공유 이중체 또는 공유 이중체 분자의 유효량을 치료의 필요가 있는 환자에게 투여하는 것으로 이루어지며, 공유 이중체 또는 공유 이중체 분자의 최소한 하나의 결합 부위는 CD32B에 특이적이고, 최소한 하나의 다른 결합 부위는 상기 병원성 항원에 특이적이다. 이 구체예의 측면으로, 병원성 항원은 면역 내성이 요구되는 알레르기원 또는 다른 분자, 예컨대 이식된 조직 상에 발현된 단백질일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 독소 제거 방법에 관련되는데, 그 방법은 본 발명의 공유 이중체 또는 이중체 분자의 유효량을 그럴 필요가 있는 환자에게 투여하는 것으로 이루어지며, 상기 공유 이중체 또는 이중체 분자의 최소한 하나의 결합 부위는 세포 표면 마커에 특이적이며 최소한 하나의 다른 결합 부위는 독소에 특이적이다. 특별한 측면으로, 투여된 본 발명의 이중체는 하나의 결합 부위가 Fc와 같은 세포 표면 마커에 특이적이고 다른 결합 부위는 박테리아 독소 또는 약물에 대해 특이적인 이중체이다. 한 측면으로 세포 표면 마커는 적혈구에서는 발견되지 않는다.

본 발명은 추가로 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 분자의 반감기를 증가시키기 위한 방법을 제공하는데, 그 방법은 둘 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인을 분자에 연결 (예컨대 직접 또는 포합을 통해 간접적으로, 또는 결합에 의해 등)시키는 것을 포함한다. 본 발명은 특히 그런 방법의 구체예에도 관련되는데, 그 구체예에서, 둘 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인의 연결은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인을 분자에 연결시키는 것을 포함하고, 보다 구체적으로 본 발명은 둘 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인의 연결이 2개의 알부민 결합 도메인을 분자에 연결시키는 것을 포함하는 그런 방법의 구체예에 관련된다. 그런 둘 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인은 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게는 SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, 또는 SEQ ID NO:329의 서열로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명은 특히 둘 또는 그 이상의 알부민 결합 도메인이 동일하거나 알부민 결합 도메인 중 2개가 동일한 그런 방법의 구체예에 관련된다. 본 발명은 특히 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 분자가 이중체인 그런 방법의 구체예에 관련된다.

정의

다르게 정의되지 않는 한, 해당 기술분야의 모든 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 본원에서 사용된 전문용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가지는 것으로 의도된다. 어떤 경우에 통상적으로 이해되는 의미를 가진 용어들이 명료성 및/또는 쉬운 참조를 위해 본원에서 정의되는데, 그런 정의를 본원에 포함시키는 것을, 해당 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석할 필요는 없다. 본 발명의 실시는 다른 표시가 없는 한 해당 기술분야의 숙련성에 포함되는 분자생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 종래 기법들을 사용할 것이다. 그런 기법들은 예를 들면 다음과 같은 문헌에서 충분히 설명된다: Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, including supplements through 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; 및 Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000).

본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "항체" 및 "항체들"은 단클론성 항체, 다중특이성 항체, 사람 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메릭 항체, 다클론성 항체, 카멜화된 항체, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-결합된 이중특이성 Fvs (sdFv), 인트라바디(intrabody), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예컨대 항-Id 및 본 발명의 항체에 대한 항-항-Id 항체를 포함하여), 및 상기 중 어느 것이든지의 에피토프-결합 단편을 나타낸다. 특히 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 어떠한 유형 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예컨대 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 하위부류일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이하게 결합한다", "특이하게 인식한다" 및 유사한 용어는 분자가 항원 (예컨대 에피토프 또는 면역 복합체)에 특이하게 결합하고 다른 분자에는 특이하지 않게 결합하는 것을 의미한다. 항원에 특이하게 결합하는 분자는 예컨대 면역분석, BIAcore, 또는 해당 기술분야에 공지되어있는 다른 분석법에 의해 측정되는 바 보다 낮은 친화성으로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는 항원에 특이하게 결합하는 분자는 다른 단백질과는 교차반응하지 않는다. 항원에 특이하게 결합하는 분자는 예를 들면 면역분석, BIAcore, 또는 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 다른 기법들에 의해 확인될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 복합체"는 최소한 하나의 표적 분자와 최소한 하나의 이종성 Fcγ 영역-함유 폴리펩티드가 서로 결합하여 보다 큰 분자량의 복합체를 형성하게 될 때 형성되는 구조를 말한다. 면역 복합체의 예를 들면 가용성이거나 과립일 수 있는 항원-항체 복합체 (예컨대 세포 표면상의 항원/항체 복합체)이다.

본원에서 사용되는 용어 "중쇄", "경쇄", "가변 영역", "프레임워크 영역", "불변 도메인", 등은 면역학 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 가지며 자연 발생 면역글로불린 및 합성 (예컨대 재조합) 결합 단백질 (예컨대 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, 키메릭 항체 등)의 상응하는 도메인을 나타낸다. 자연 발생 면역글로불린 (예컨대 IgG)의 기본적인 구조 단위는 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄를 가지는 사량체로, 보통 약 150,000Da의 당단백질로서 표시된다. 각 사슬의 아미노-말단 ("N") 부분은 주로 항원 인식에 기여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 ("C") 부분은 불변 영역을 규정하는데, 단일 불변 도메인을 가지는 경쇄와 세 개의 불변 도메인과 힌지 영역을 가지는 중쇄로 구성된다. 그러므로 IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-V_L-C_L-c이고, IgG 중쇄의 구조는 n-V_H-C_H1-H-C_H2-C_H3-c (H는 힌지 영역이다)이다. IgG 분자의 가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어지며, 그것은 항원 및 프레임워크 절편으로 언급되는 비-CDR 절편과 접촉하는 잔기를 함유하며, 일반적으로 구조를 유지하며 CDR 루프의 위치를 결정한다 (어떤 프레임워크 잔기는 접촉 항원을 포함하기도 한다). 그러므로 V_L 및 V_H 도메인은 구조 n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c를 가진다.

결합 단백질 또는 항체 (본원에서 정의된 것들을 포함하여)를 언급할 때, 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 Kabat의 정의, 면역학적 관심의 단백질 서열 (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991)을 따른다. 면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산은 사슬의 아미노산의 위치에 의해 표시된다. Kabat에는 항체에 대한 수많은 아미노산 서열이 기술되어 있고, 각 하위그룹에 대한 아미노산 일치 서열이 확인되어 있으며, 각 아미노산에 대한 잔기 번호가 부여되어 있다. Kabat의 넘버링 제도는 보존된 아미노산을 참조함으로써 Kabat의 일치 서열 중 하나로 의문의 항체를 배열함으로써 Kabat의 제요에 포함되지 않은 항체에도 확장될 수 있다. 잔기 번호를 배정하는 이런 방법은 실제에서 표준이 되어왔고, 키메릭 또는 인간화된 변이체를 포함하여 상이한 항체의 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어 사람 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산에 동등한 위치를 차지한다.

본원에서 사용되는 용어 "중쇄"는 IgG 항체의 중쇄를 규정하기 위해 사용된다. 무상의 천연 IgG에서 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, CH1, 힌지, CH2및 CH3을 포함한다. 본 명세서를 통털어서 IgG 중쇄의 잔기의 넘버링은 문헌에서와 같이 EU 색인의 것과 같다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)). "Kabat에서와 같은 EU 색인"은 사람 IgG1 EU 항체의 넘버링을 나타낸다. 사람 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 아미노산 서열의 실례는 아래에서 설명되는 것과 같이 도 1A 및 1B에 제시한다. 도 1A 및 1B는 또한 IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입의 아미노산 사열은 각각의 힌지 영역의 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 대체함으로써 IgG1 서열과 나란히 배열되고, 그것은 동일한 위치에서 중쇄간 S-S 결합을 형성한다. IgG2 및 IGG3 힌지 영역에 대해서는 모든 잔기가 EU 색인에 의해 넘버링되지는 않는다.

"힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 사람 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230까지 뻗어있는 것으로서 정의된다. 사람 IgG1 힌지 영역의 아미노산 서열의실례는 도 1A에 도시된다 (도 1A의 아미노산 잔기는 Kabat 시스템에 따라 넘버링된다). 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 도 1A에 도시된 것과 같은 동일한 위치에 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 대체함으로써 IgG1 서열과 나란히 배열될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 유사한 용어는 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 사람 IgG1을 함유하는 아미노산 서열의 실례는 도 1B에 도시된다. 경계는 약간씩 달라질 수 있지만, Kabat 시스템에 따라 넘버링되는 바, Fc 도메인은 아미노산 231부터 아미노산 447까지 연장되어 있다 (도 1B의 아미노산 잔기는 Kabat 시스템에 따라 넘버링된다). 도 1B는 또한 IgG 이소타입 IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열의 실례를 제공한다.

IgG의 Fc 영역은 두 개의 불변 도메인, CH2와 CH3을 포함한다. 사람 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 보통 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 아미노산 231부터 아미노산 341까지 뻗어있다 (도 1B). 사람 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은 보통 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 아미노산 342부터 447까지 연장된다 (도 1B). 사람 IgG Fc 영역의 CH2 도메인 ("Cγ2" 도메인으로도 언급됨)은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려 두 개의 N-연결된 분지된 탄수화물 사슬이 무상의 천연 IgG의 두 개의 CH2 도메인 사이에 끼워져 있다.

본원에서 사용되는 용어 "FcγR 결합 단백질", "FcγR 항체", 및 "항-FcγR 항체"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 다양한 면역글로불린-유사 또는 면역글로불린-유도된 단백질을 나타낸다. "FcγR 결합 단백질"은 V_L 및/또는 V_H 도메인과의 상호작용을 통해 FcγR에 결합한다 (Fcγ-중재 결합과는 구별된다). FcγR 결합 단백질의 실례로는 전체 사람, 다클론성, 키메릭 및 인간화된 항체 (예컨대 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함함), 그것의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편), 이중기능성 또는 다중기능성 항체 (예컨대 Lanzavecchia et al., 91987) " The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes ", Eur J. Immunol. 17:105-111 참조), 단일 사슬 항체 (예컨대 Bird et al. (1988) " Single -Chain Antigen - Binding Proteins ", Science 242:423-26 참조), 융합 단백질 (예컨대 파지 디스플레이 융합 단백질), "미니바디(minibody)" (예컨대 미국 특허 5,837,821호) 및 V_L 및/또는 V_H 도메인 또는 그것의 단편을 포함하는 다른 항원 결합 단백질이 있다. 한 측면으로 FcγRIIIA 결합 단백질은 "사량체 항체", 즉 일반적으로 자연 발생 IgG의 구조를 가지고 가변 및 불변 도메인, 즉 V_L 도메인과 경쇄 불변 도메인을 포함하는 두 개의 경쇄와 V_H 도메인과 중쇄 힌지 및 불변 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "FcγR 길항체" 및 유사한 용어는 단백질 및 비-단백성 물질을 나타내고, FcγR의 최소한 하나의 생물학적 활성을 길항하는, 예컨대 신호화를 차단하는 작은 분자를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 분자는 IgG의 FcγR에의 결합을 차단함으로써 신호화를 차단한다.

본원에서 사용되는 용어, 폴리펩티드 또는 단백질의 맥락에서 "유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가의 도입에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 또한 변형된, 즉 어떠한 유형의 분자든지 폴리펩티드 또는 단백질에의 공유 부착에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 예를 들어 제한하려는 것은 아니지만, 항체는 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해성 절단, 세포성 항원 또는 다른 단백질에의 결합 등에 의해 변형될 수 있다. 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 기법, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 특이한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 사용하는 화학적 변형에 의해 제조될 수 있다. 나아가 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 유도체는 그것이 유도된 폴리펩티드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 가진다.

본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 비-단백질성 유도체의 맥락에서 첫 번째 유기 또는 무기 분자의 구조를 기초로 형성되는 두 번째 유기 또는 무기 분자를 말한다. 유기 분자의 유도체로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 히드록실, 메틸, 에틸, 카르복실, 또는 아민기의 첨가 또는 결실에 의해 변형된 분자를 포함한다. 유기 분자는 또한 에스테르화, 알킬화 및/또는 인산화될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "이중체 분자"는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬 또는 단백질의 복합체를 의미하고, 각각은 최소한 하나의 VL 및 하나의 VH 도메인 또는 그것의 단편을 포함하며, 이 두 개의 도메인은 모두 단일한 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 어떤 구체예에서, "이중체 분자"는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 상기 복합체의 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이할 수 있는데, 즉 이중체 분자는 단일-다량체 또는 이종-다량체일 수 있다. 특정 측면으로, "이중체 분자"는 이량체 또는 사량체 또는 VL과 VH 도메인을 둘 다 포함하는 상기 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 다량체 단백질을 포함하는 개별적인 폴리펩티드 사슬은 사슬간 이황화 결합에 의해 사량체의 최소한 하나의 다른 펩티드에 공유 결합될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "장애" 및 "질병"은 대상의 상태를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 특히 용어 "자가면역 질병"은 대상 자체의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및/또는 기관 손상을 특징으로 하는 대상의 상태를 언급하기 위한 용어 "자가면역 장애"와 상호교환적으로 사용된다. 용어 "염증성 질병"은 염증, 바람직하게는 만성 염증을 특징으로 하는 대상의 상태를 언급하기 위해 "염증성 장애"와 상호교환적으로 사용된다. 자가면역 장애는 염증과 관련될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 더욱이 염증은 자가면역 장애에 의해 유발될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 그러므로 어떤 장애는 자가면역 및 염증성 장애 둘 다 특징이 될 수 있다.

본원에서 사용된 "동일한 폴리펩티드 사슬"은 또한 거의 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 사슬, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 아미노산 차이를 가지는, 바람직하게는 보존성 아미노산 치환을 가짐으로써 두 개의 폴리펩티드 사슬의 활성이 유의미하게 달라지지 않는 사슬을 포함하는 사슬을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "암"은 세포의 비정상적인 제어되지 않는 성장으로부터 유발되는 신생물 또는 종양을 말한다. 본원에서 사용되는 바 암은 명백하게 백혈병 및 림프종을 포함한다. 어떤 구체예에서, 암은 국소적인 상태를 유지하는 양성 종양을 나타낸다. 다른 구체예에서, 암은 이웃하는 신체 구조를 침습하여 파괴하고 멀리 있는 부위로까지 확산되는 악성 종양을 말한다. 어떤 구체예에서, 암은 특수한 암 항원과 관련된다.

본원에서 사용되는 용어 "면역조절제" 및 그것의 변이체는 숙주의 면역 시스템을 조절하는 제제를 말한다. 어떤 구체예에서, 면역조절제는 면역억제제이다. 다른 어떤 구체예에서, 면역조절제는 면역자극제이다. 면역조절제로는, 그것에 한정되지는 않지만, 작은 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 융합 단백질, 항체, 무기 분자, 모방제, 및 유기 분자를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 사람에서 항원성 또는 면역원성 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 비-단백질 분자의 단편을 말한다. 면역원성 활성을 가지는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유도하는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편이다. 항원성 활성을 가지는 에피토프는 해당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 어떠한 방법에 의해서, 예를 들면 면역분석에 의해 측정되는 바, 그것에 항체가 면역특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편이다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원일 필요는 없다.

본원에서 사용되는 용어 "단편"은 또 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 최소한 5개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 10개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 15개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 20개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 25개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 40개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 50개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 60개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 70개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 80개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 90개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 100개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 125개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 150개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 175개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 200개의 연속적인 아미노산 잔기, 최소한 250개의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드의 단편은 폴리펩티드의 최소한 하나의 기능을 보유한다.

본원에서 사용되는 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자 (예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예컨대 mRNA), DNA와 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 그러한 유사체는 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 이노신 또는 트리틸화된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 그런 유사체는 또한 분자에 유익한 속성, 예컨대 뉴클레아제 내성 또는 세포막을 가로지를 수 있는 증가된 능력을 갖게 하는 변형된 골격을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있고, 단일-가닥 및 이중-가닥 부분을 둘 다 함유할 수 있으며, 삼중-가닥 부분도 함유할 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.

본원에서 사용되는 "치료적으로 효과적인 양"은 질병 또는 장애를 치료 또는 관리하기에 충분한 치료제의 양을 말한다. 치료적으로 효과적인 양은 질병의 개시를 지연 또는 최소화하기에, 예컨대 암의 확산을 지연 또는 최소화하기에 충분한 치료제의 양을 말할 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 질병의 치료 또는 관리에 유익한 치료를 제공하는 치료제의 양을 나타낼 수 있다. 나아가 본 발명의 치료제와 관련하여 치료적으로 효과적인 양은 질병의 치료 또는 관리에 치료 유익을 제공하는 치료제 단독의, 또는 다른 치료제와 조합된 치료제의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "예방제" 및 "예방 제제들"은 장애의 방지, 또는 장애의 재발 또는 확산의 방지에 사용될 수 있는 어떠한 제제(들)을 나타낸다. 예방적으로 효과적인 양은 과증식성 질병, 특히 암의 재발 또는 확산, 또는 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 과증식성 질병에 취약한 사람들, 예를 들면 유전적으로 암에 취약하거나 이전에 발암물질에 노출된 적이 있는 사람들에서 그런 질병의 재발을 방지하기에 충분한 예방제의 양을 나타낼 수 있다. 예방적으로 효과적인 양은 또한 질병의 방지에 예방적인 유익을 제공하는 예방제의 양을 나타낼 수 있다. 나아가 본 발명의 예방제와 관련하여 예방적으로 효과적인 양은 질병의 방지에 예방적인 유익을 제공하는 예방제 단독의, 또는 다른 제제와 조합된 예방제의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "방지하다", "방지하는" 및 "방지"는 예방제 또는 치료제의 투여의 결과로서 대상의 장애의 하나 또는 그 이상의 증상의 재발 또는 개시가 방지되는 것을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "조합하여"는 하나 이상의 예방제 및/또는 치료제의 사용을 나타낸다. 용어 "조합하여"의 사용은 예방제 및/또는 치료제가 장애가 있는 대상에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 첫 번째 예방 또는 치료제는 두 번째 예방 또는 치료제가 장애가 있는 대상에게 투여되기 전 (예컨대 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전)에, 동시에, 또는 후 (예컨대 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후)에 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 항원과의 상호작용으로부터 결과되는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 항체 의존성 세포 중재된 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 중재된 식세포작용 (ADCP), 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 포함한다. 이펙터 기능은 항원의 결합 후에 작동하는 기능과 항원 결합에 관계없이 작동하는 기능을 모두 포함한다.

본원에서 사용되는 "이펙터 세포"는 하나 또는 그 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 또는 그 이상의 이펙터 기능을 중재하는 면역 시스템의 세포를 의미한다. 이펙터 세포는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 단핵 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산성 백혈구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립형 림프구, 랑게르한스 세포, 천연 킬러 (NK) 세포를 포함하고, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 사람, 마우스, 쥐, 토끼, 및 원숭이를 포함한 어떠한 유기체로부터든지 유도될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 복합체에 특이하게 결합하는" 및 그와 유사한 용어는 면역 복합체에 특이하게 결합하고, 다른 분자에는 특이하게 결합하지 않는 분자를 나타낸다. 면역 복합체에 특이하게 결합하는 분자는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와는, 예컨대 면역분석, BIAcore, 또는 해당 기술분야에 공지되어 있는 다른 분석에 의해 측정되는 바 더 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 바람직하게는 면역 복합체에 특이하게 결합하는 분자는 다른 단백질과는 교차결합하지 않는다. 면역 복합체에 특이하게 결합하는 분자는 예를 들면 면역분석, BIAcore, 또는 해당 기술분야에 공지되어 있는 다른 분석에 의해 확인될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "안정한 융합 단백질"은 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 통상적인 생화학적 및 기능적 분석법을 사용하여 평가되는 바 제조 및/또는 보관 중에 검출할 수 없는 수준으로 최소한의 분해를 진행하고, 생물학적 활성, 예컨대 FcγR에 대한 결합능력을 잃어버리지 않으면서 연장된 시간 동안 보관될 수 있는 융합 단백질을 말한다.

바람직한 구체예의 설명

이중체 분자의 각각의 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인과 VH 도메인을 포함하며, 그것들은 도메인이 자체 어셈블리로부터 제한되도록 공유 결합된다. 2개의 폴리펩티드 사슬의 상호작용으로 VL-VH 짝이 생성될 것인데, 그것은 두 개의 에피토프 결합 부위, 즉 이가 분자를 형성한다. VH 또는 VL 도메인 중 어느 것도 폴리펩티드 사슬 내의 어떠한 위치에 구속되지 않는데, 즉 아미노 (N) 또는 카르복시 (C) 말단에 제한되지 않으며, 또한 도메인들은 서로 상대적인 위치에 제한되지 않는다, 즉 VL 도메인은 VH 도메인에 대해 N-말단이 될 수 있고, 그 역도 가능하다. 유일한 제한은 상보하는 폴리펩티드 사슬이 기능성 이중체를 형성하기 위해 활용될 수 있다는 것이다. VL 및 VH 도메인이 동일한 항체로부터 유도되는 경우, 두 개의 상보하는 폴리펩티드 사슬은 동일할 것이다. 예를 들어 결합 도메인이 에피토프 A에 특이한 항체로부터 유도되는 경우 (즉 결합 도메인이 VL_A-VH_A 상호작용으로부터 형성되는 경우), 각각의 폴리펩티드는 VH_A 및 VL_A를 포함할 것이다. 항체의 두 개의 폴리펩티드 사슬의 단일 이량체화는 두 개의 VL_A-VH_A 결합 부위의 형성을 초래할 것이고, 그 결과 이가의 단일특이성 항체가 유발된다. VL 및 VH 도메인이 상이한 항원에 특이한 항체로부터 유도되는 경우 이중기능성 이중특이성 이중체의 형성은 두 개의 상이한 폴리펩티드 사슬의 상호작용, 즉 이종이량체의 형성을 필요로 한다. 예를 들어 이중특이성 이중체의 경우 한 폴리펩티드 사슬은 VL_A와 VL_B를 포함할 것이고, 상기 사슬의 단일 이량체화는 두 개의 VL_A-VL_B 결합 부위의 형성을 초래할 것이며, 그 중 어느 것이든지 결합하지 않거나 결합을 예측할 수 없다. 대조적으로, 두 개의 상이한 폴리펩티드 사슬이 상호작용하지 않는 경우, 예컨대 재조합 발현 시스템에서 하나는 VL_A와 VH_B를 포함하고, 다른 하나는 VL_B와 VH_A를 포함하는 경우, 두개의 상이한 결합 부위는 VL_A-VH_A 및 VL_B-VH_B를 형성할 것이다. 모든 이중체 폴리펩티스 사슬 쌍에 대해, 두 사슬의 잘못된 배열 또는 잘못된 결합, 즉 VL-VL 또는 VH-VH 도메인이 일어날 가능성이 있다; 그러나 기능성 이중체의 정제는 해당 기술분야에 공지되었거나 본원에 예시된 어떠한 친화성 기초 방법, 예컨대 친화성 크로마토그래피를 사용하여 적절하게 이량체화된 결합 부위의 면역특이성을 토대로 쉽게 관리될 것이다.

다른 구체예에서, 이중체의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인을 포함한다. 이중체 분자의 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인은 우선적으로 이량체화되어서 그 결과 면역글로불린-유사 특성, 예컨대 Fc-FcγR 상호작용을 나타내는 이중체 분자의 형성을 초래한다. Fc를 포함하는 이중체는 이량체일 수 있는데, 예를 들면 두 개의 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있고, 각각은 VH 도메인, VL 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 상기 폴리펩티드 사슬의 이량체화는 변형되지 않은 이가 항체의 구조와는 구별되는 구조를 가지긴 하지만 Fc 도메인을 포함하는 이가의 이중체를 초래한다 (도 11). 그런 이중체 분자는 야생형 면역글로불린과 비교하여 변경된 표현형, 예컨대 변경된 혈청 반감기, 결합 특성 등을 나타낼 것이다. 다른 구체예에서, Fc 도메인을 포함하는 이중체 분자는 사량체일 수 있다. 그런 사량체는 두 개의 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬, 즉 VL, VH 및 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬과, 두 개의 '더 가벼운' 폴리펩티드 사슬, 즉 VL 및 VH를 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 상기 더 가볍고 더 무거운 사슬은 상호작용하여 단량체를 형성하고, 상기 단량체는 그것의 짝을 짓지 못한 Fc 도메인을 통해 상호작용하여 Ig-유사 분자를 형성한다. 그런 Ig-유사 이중체는 4가이고 단일특이성, 이중특이성 또는 사중특이성일 수 있다.

이중체 분자의 최소한 두 개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 에피토프를 인식할 수 있다. 상이한 에피토프는 동일한 항원으로부터 올 수도 있고 또는 에피토프는 상이한 항원으로부터 유래할 수도 있다. 한 구체예에서, 에피토프는 상이한 세포로부터 온다. 다른 구체예에서, 에피토프는 동일한 세포 또는 바이러스의 세포 표면 항원이다. 에피토프 결합 부위는 그것에 대해 항체가 생성될 수 있는 어떠한 항원이든지 인식할 수 있다. 예를 들어 단백질, 핵산, 박테리아 독소, 세포표면 마커, 자가면역 마커, 바이러스 단백질, 약물 등이다. 특별한 측면으로, 이중체의 최소한 하나의 에피토프 결합 부위는 특정 세포, 예컨대 B-세포 또는 T-세포, 식세포작용 세포, 천연 킬러 (NK) 세포 또는 수지상 세포 상의 항원에 특이적이다.

이중체의 폴리펩티드 사슬의 각각의 도메인, 즉 VL, VH 및 FC 도메인은 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있다. 펩티드 링커는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 아미노산일 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 링커 서열은 핵산 서열 (SEQ ID NO:74)에 의해 코드화된 GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)이다.

어떤 구체예에서, 이중체 분자의 각각의 폴리펩티드 사슬은 본 발명의 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 최소한 하나의 대응 시스테인 잔기와 상호작용하여 사슬간 이황화 결합을 형성할 최소한 하나의 시스테인 잔기를 포함하도록 공학적으로 조작된다. 상기 사슬간 이황화 결합은 이중체 분자를 안정화시키는 역할을 하여 재조합 시스템에서 발현 및 회수를 개선시키고, 그 결과 안정하고 일관된 구조뿐 아니라 생체 내에서 분리 및/또는 정제된 생성물의 안정성이 개선되는 결과를 유발한다. 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 단일 아미노산으로서 또는 보다 큰 아미노산 서열의 일부로서, 예컨대 힌지 도메인으로서 폴리펩티드 사슬의 어떠한 부분에든지 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 존재하도록 공학적으로 조작된다. 어떤 구체예에서, 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 아미노산 서열 LGGC 내에서 폴리펩티드 사슬에 도입된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 LGGC를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 힌지 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 서열 내에서 폴리펩티드에 도입된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자의 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 IgG 힌지 도메인, 예컨대 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자의 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함하는데, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:78)에 의해 코드화된다. 다른 구체예에서, 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 아미노산 서열 LGGCFNRGEC (SEQ ID NO:17) 내에서 폴리펩티드 사슬에 도입되고, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:76)에 의해 코드화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 LGGCFNRGEC (SEQ ID NO:17)를 포함하고, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:76)에 의해 코드화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 최소한 하나의 시스테인 잔기는 아미노산 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23) 내에서 폴리펩티드 사슬에 도입되고, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:75)에 의해 코드화될 수 있다. 특정 구체예에서, 이중체를 포함하는 폴리펩티드 사슬의 C-말단은 아미노산 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)을 포함하고, 그것은 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:75)에 의해 코드화될 수 있다.

어떤 구체예에서, 이중체 분자는 최소한 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 그것들은 각각 아미노산 서열 LGGC를 포함하며 상기 LGGC 서열의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의하여 공유 결합된다. 다른 특정 구체예에서 이중체 분자는 최소한 두 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 그 중 하나는 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)를 포함하는 반면, 다른 것은 힌지 도메인 (최소한 하나의 시스테인 잔기를 함유함)을 포함하고, 이때 상기 최소한 두 개의 폴리펩티드 사슬은 FNRGEC (SEQ ID NO:23)의 시스테인 잔기와 힌지 도메인의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의하여 공유 결합된다. 특별한 측면으로, 힌지 도메인에 위치한, 이황화 결합에 기여하는 시스테인 잔기는 Cys-128이고 (Kabat EU에 따라 넘버링됨; 변형되지 않은 무상 IgG 중쇄의 힌지 도메인에 위치함), SEQ ID NO:23의 대응하는 시스테인 잔기는 Cys-214이다 (Kabat EU에 따라 넘버링됨; 변형되지 않은 무상 IgG 경쇄의 C-말단에 위치함) (Elkabetz et al. (2005) " Cysteins In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains ", J. Biol. Chem. 280:14402-14412). 또 다른 구체예에서, 최소한 하나의 시스테인 잔기는 아미노산 사슬의 N-말단에서 발생하도록 공학적으로 조작된다. 또 다른 구체예에서, 최소한 하나의 시스테인 잔기는 이중체 분자의 폴리펩티드 사슬의 링커 부분에서 발생하도록 공학적으로 조작된다. 추가의 구체예에서, VH 또는 VL 도메인은 원래의 VH 또는 VL 도메인에 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하도록 공학적으로 조작되어 상기 아미노산 변형이 원래의 아미노산이 시스테인으로 치환되는 것을 포함한다.

본 발명은 Fc 도메인 또는 그것의 일부 (예컨대 CH2 도메인, 또는 CH3 도메인)를 포함하는 이중체 분자를 포함한다. Fc 도메인 또는 그것의 일부는 그것에 한정되는 것은 아니지만 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하여 어떠한 면역글로불린 이소타입 또는 알로타입으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인 (또는 그것의 일부)는 IgG로부터 유도된다. 특정 구체예에서, IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 그것의 알로타입이다. 한 구체예에서, 이중체 분자는 Fc 도메인을 포함하고, 그 Fc 도메인은 어떠한 면역글로불린 이소타입으로부터 독립적으로 선택된 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다 (즉 Fc 도메인은 IgG로부터 유도된 CH2 도메인 및 IgE로부터 유도된 CH3 도메인, 또는 IgG1으로부터 유도된 CH2 도메인 및 IgG2로부터 유도된 CH3 도메인을 포함한다). 상기 Fc 도메인은 본 발명의 이중체 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬에, 상기 폴리펩티드 사슬의 다른 도메인 또는 부분과 관련하여 어떠한 위치에든지 공학처리될 수 있다 (예컨대 Fc 도메인 또는 그것의 일부는 사슬의 폴리펩티드의 VL 및 VH 도메인 둘 다에 대해 C-말단이 될 수 있고, VL 및 VH 도메인 둘 다에 대해 N-말단이 될 수도 있으며, 또는 한 도메인에 대해서는 N-말단이 되고, 다른 말단에 대해서는 C-말단이 될 수 있다 (즉 폴리펩티드 사슬의 두 도메인 사이에 있을 수 있다)).

본 발명은 또한 힌지 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 힌지 도메인은 어떠한 면역글로불린 이소타입 또는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함한 알로타입으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 힌지 도메인은 IgG로부터 유도되는데, 이때 IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 그것의 알로타입이다. 상기 힌지 도메인은 Fc 도메인과 함께 이중체 분자를 포함하는 폴리펩티드 사슬에 공학적으로 조작될 수 있어서 이중체 분자는 힌지-Fc 도메인을 포함한다. 어떤 구체예에서, 힌지 및 Fc 도메인은 독립적으로 해당 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 예시된 어떠한 면역글로불린 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 힌지 및 Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 최소한 하나의 다른 도메인, 예컨대 VL 도메인에 의해 분리된다. 힌지 도메인, 또는 임의로 힌지-Fc 도메인은 본 발명의 폴리펩티드에, 그 폴리펩티드 사슬의 다른 도메인 또는 위치와 관련하여 어떠한 위치에든지 공학적으로 조작될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 힌지 도메인을 포함하는데, 그 힌지 도메인은 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있고, 이때 상기 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 힌지-Fc 도메인을 포함하고, 그 힌지-Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 사슬은 힌지-Fc 도메인을 포함하고, 그 힌지-Fc 도메인은 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 있다.

상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명은 폴리펩티드 사슬의 다량체를 포함하고, 그 폴리펩티드 사슬의 각각은 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 어떤 측면으로 상기 다량체의 폴리펩티드 사슬은 추가로 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 이량체화는 면역글로불린-유사 기능성, 즉 Fc 중재된 기능 (예컨대 Fc-FcγR 상호작용, 보체 결합 등)을 나타내는 이중체 분자의 형성을 유도한다. 어떤 구체예에서, VL 및 VH 도메인을 포함하는 각각의 폴리펩티드 사슬은 동일한 특이성을 가지며, 상기 이중체 분자는 이가이고 단일특이적이다. 다른 구체예에서, VL 및 VH 도메인을 포함하는 각각의 폴리펩티드 사슬은 상이한 특이성을 가지며, 이중체는 2가이고 이중특이적이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자는 폴리펩티드 사슬의 사량체를 포함하고, 그 폴리펩티드 사슬의 각각은 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 어떤 구체예에서, 사량체의 두 개의 폴리펩티드 사슬은 추가로 Fc 도메인을 포함한다. 사량체는 그러므로 각각이 VL, VH 및 Fc 도메인을 포함하는 두 개의 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬과, VL 및 VH 도메인을 포함하는 두 개의 '더 가벼운' 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 더 무거운 사슬의 Fc 도메인을 통하여 단량체의 이량체화와 결합된 더 무거운 사슬과 더 가벼운 사슬의 이가 단량체로의 상호작용은 4가 면역글로불린-유사 분자의 형성을 유도할 것이다 (실시예 2 및 3에서 예시됨). 어떤 측면으로 단량체는 동일하고, 4가 이중체 분자는 단일특이적이거나 이중특이적이다. 다른 측면으로 단량체는 상이하며, 4가 분자는 이중특이적이거나 사중특이적이다.

상술된 것과 같은 사중특이성 이중체 분자의 형성은 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬의 상호작용을 필요로 한다. 그런 상호작용은 잠재적인 사슬 짝짓기 오류의 많은 변이체로 인해 단일 세포 재조합 제조 시스템 내에서는 효율적으로 이루어지기 어렵다. 짝짓기 오류의 가능성을 감소시키기 위한 한 가지 해법은 원하는 폴리펩티드 사슬 쌍에 "knobs-into-holes"형 돌연변이를 공학적으로 도입하는 것이다. 그런 돌연변이는 단일이량체화를 능가하는 이종이량체화를 선호한다. 예를 들어 Fc-Fc 상호작용과 관련하여, 아미노산 치환 (바람직하게는 '손잡이 (knob)'를 형성하는 부피가 큰 측면 기를 포함하는 아미노산, 예컨대 트립토판으로의 치환)이 CH2 또는 CH3 도메인에 도입될 수 있어서, 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지할 것이고 돌연변이된 도메인이 그 안에 상보하는, 또는 부응하는 돌연변이가 공학적으로 도입되어 있는 도메인과 쌍, 즉 '구멍 (hole)'을 이루도록 (예컨대 글리신으로의 치환) 압박이 될 것이다. 그런 돌연변이 세트는 이중체 분자를 포함하는 어떠한 폴리펩티드 쌍에 공학적으로 도입될 수 있고, 나아가 상기 쌍의 폴리펩티드 사슬의 어떠한 부분에든지 공학적으로 도입될 수 있다. 단일이량체화보다는 이종이량체화를 선호하도록 하는 단백질 공학조작 방법, 특히 면역글로불린-유사 분자의 공학조작과 관해서는 해당 기술분야에 잘 알려져 있고 본원에도 포함된다 (Ridgway et al . (1996) "' Knobs - Into - Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization ", Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al . (1997) " Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library ", J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al . (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody : Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis ", J. Immunol. Methods 296:95-101).

본 발명은 또한 변이체 Fc 또는 변이체 힌지-Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 이중체 분자를 포함하는데, 그 변이체 Fc 도메인은 비교할만한 야생형 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인 (또는 그것의 일부)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형 (예컨대 치환, 삽입, 결실)을 포함한다. 변이체 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 분자 (예컨대 항체)는 정상적으로는 야생형 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 분자와 비교하여 변경된 표현형을 가진다. 변이체 표현형은 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석으로 분석되는 바, 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소에 대한 변경된 민감성 또는 변경된 이펙터 기능으로서 발현될 수 있다. 이펙터 기능을 변경시키는 것으로 확인된 Fc 도메인 변이체는 본 발명자들의 동시 출원인 국제 출원 WO04/063351, 미국 특허 출원 공보 2005/0037000 및 2005/0064514, 미국 임시 출원 60/626,510 (2004.11.10에 출원됨), 60/636,663 (2004. 12. 15에 출원됨), 및 60/781,564 (2006. 3. 10에 출원됨), 및 미국 특허 출원 11/271,140 (2005. 11.10에 출원됨), 및 11/305,787 (2005. 12. 15에 출원됨)에 개시되어 있다.

본 발명의 이중특이성 이중체는 동시에 두 개의 별도의 구별되는 에피토프에 결합할 수 있다. 어떤 구체예에서 에피토프는 동일한 항원으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 에피토프는 상이한 항원으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 최소한 하나의 에피토프 결합 부위는 T 림프구, 천연 킬러 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포상에 발현된 면역 이펙터 세포 (예컨대 CD3, CD16, CD32, CD64 등)상에 발현된 결정기에 특이적이다. 한 구체예에서, 이중체 분자는 이펙터 세포 결정기에 결합하고 또한 그 이펙터 세포를 활성화시킨다. 이런 관점에서, 본 발명의 이중체 분자는 그것이 추가로 Fc 도메인을 포함하는가와 무관하게 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다 (예컨대 ADCC 분석과 같이 해당 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 예시된 어떠한 이펙터 기능 분석으로 분석되는 것과 같이). 어떤 구체예에서 본 발명의 이중특이성 이중체는 종양 세포 상의 암 항원과 이펙터 세포 결정기 두 가지와 결합하는 한편, 상기 세포를 활성화한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 이중체 또는 이중체 분자는 상기에서 (배경기술의 설명 단원) 설명된 것과 같이, 활성화 및 억제성 수용체에 동시에 결합하고, 그로써 그것들을 동일한 세포에 결합시킴으로써 표적, 예컨대 이펙터 세포의 활성화를 억제할 수 있다 (예컨대 CD32A와 CD32B, BCR과 CD32B, 또는 IgERI와 CD32B 두 가지에 모두 결합한다). 이 구체예의 추가의 측면으로, 이중특이성 이중체는 동시에 바이러스 상의 두 개의 중화 에피토프 (예컨대 RSV 에피토프; WNV 에피토프, 예를 들면 E16 및 E53)에 결합함으로써 항-바이러스 특성을 나타낼 수 있다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 이중체 분자는 특이한 세포 유형을 표적화하기 위하여 독특한 기회를 제공한다. 예를 들면 이중특이성 이중체 또는 이중체 분자는 표적 세포 또는 조직 유형에 독특한 항원세트를 인식하는 에피토프 결합 부위들의 조합을 포함하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 추가로, 개별적인 항원 중 하나 또는 두 가지가 다른 조직 및/또는 세포 유형에 별도로 꽤 흔하게 있는 경우, 낮은 친화성 결합 도메인이 이중체 또는 이중체 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 그런 낮은 친화성 결합 도메인은 개별적인 에피토프 또는 항원에 치료 목적에 부합하게 충분할 정도로 결합할 수 없을 것이다. 그러나 두 개의 에피토프 또는 항원이 단일한 표적 세포 또는 조직 상에 존재하는 경우, 단지 하나의 항원만을 발현하는 세포 또는 조직에 비해, 세포 또는 조직에 대한 이중체 또는 이중체 분자의 결합 능력은 증가되어 상기 세포 또는 조직이 본 발명에 의해 효과적으로 표적화될 수 있을 것이다. 그런 이중특이성 분자는 단지 하나의 항원에 대한 특이성을 가지는 단일특이성 이중체 또는 항체에 비하여 상기 두 개 항원을 모두 발현하는 세포 상의 그것의 표적 항원 중 하나 또는 둘 다에 대한 증강된 결합을 나타낼 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 이중체의 결합 특성은 결합 활성 및/또는 하나 또는 그 이상의 FcγR 중재자 이펙터 세포 기능 (Fc-FcγR 상호작용을 통해 또는 FcγR에 대한 이중체 분자의 면역특이적 결합에 의해 중재된다)을 측정하기 위한 시험관 내 기능성 분석에 의해 특성확인된다 (단원 4.2 및 4.3 참조). 본 발명의 분자, 예컨대 이중체의 FcγR에 대한 친화성 및 결합 특성은 결합 도메인-항원 또는 Fc-FcγR 상호작용, 즉 각각 결합 도메인에 대한 항원의 특이한 결합 또는 Fc 항원의 FcγR에 대한 특이한 결합을 측정하기 위해 해당 기술분야에 공지되어 있는 시험관 내 분석, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 ELISA 분석, 표면 플라스몬 공명 분석, 면역침전 분석을 사용하여 측정될 수 있다 (단원 4.2 참조). 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분자는 시험관 내 기초 분석에서의 그것과 같이 생체 내 모델 (예컨대 본원에 기술되고 개시된 모델)에서 유사한 결합 특성을 가진다. 그러나 본 발명은 시험관 내 기초 분석에서 원하는 표현형을 나타내지는 않지만 생체 내에서 원하는 표현형을 나타내는 본 발명의 분자를 배제하지는 않는다.

어떤 구체예에서 본 발명의 분자는 주형 분자의 비교할만한 부분에 비하여 변경된 글리코실화 패턴 또는 변경된 글리코형을 포함하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 공학적으로 조작된 글리코형은 다양한 목적, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 이펙터 기능의 증강에 유용할 수 있다. 공학적으로 조작된 글리코형은 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해, 예를 들면 공학적으로 조작된 또는 변이체 발현 스트레인에 의해, 하나 또는 그 이상의 효소, 예를 들면 DI N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 III (GnTIII)와의 공동발현에 의해, 또는 이중체가 발현되고 정제된 후에 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 공학적으로 조작된 글리코형의 생성 방법은 해당 기술분야에 공지되어 있고, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 문헌에 설명된 것들을 포함한다: Umana et al . (1999) " Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody - Dependent Cellular Cytotoxic Activity", Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al . (2001) " Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti - CD20 CHO Production Cell Line : Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII ", Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) " Lack Of Fucose On Human IgG1 N- Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody - Dependent Cellular Toxicity ", J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al . (2003) " The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N- Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex - Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody -Dependent Cellular Cytotoxicity ", J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent^TM technology (Biowa, Inc. Princeton, NJ); GlycoMAb^TM glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al . (2004) " Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA ", JMB, 336:1239-49.

본 발명은 나아가 본 발명의 이중체를 생성하기 위한 비천연 아미노산의 통합을 포함한다. 비천연 아미노산이 단백질 안에 통합되는 것을 허용하기 위해 천연 생합성 기계를 사용하는 것과 같은 그런 방법은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있다 (예컨대 Wang et al. (2002) " Expanding The Genetic Code ", Chem. Comm. 1:1-11; WAng et al. (2001) " Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli", Science, 292:498-500; van Hest et al. (2001) " Protein - Based Materials , Toward A New Level Of Structural Control ", Chem. Comm. 19:1897-1904 참조). 대체 전략은 아미노 아실-tRNA의 생합성에 기여하는 효소에 초점을 맞춘다 (Tang et al. (2001) " Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled - Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host ", J. Am. Chem. Soc. 123(44):11089-11090; Kiick et al . (2001) " Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli ", FEBS Lett. 502(1-2):25-30).

어떤 구체예에서, 본 발명은 글리코실화 부위를 첨가하거나 결실시킴으로써 본 발명의 분자의 VL, VH 또는 Fc 도메인을 변형시키는 방법을 포함한다. 단백질의 탄수화물을 변형시키는 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 본 발명에도 포함된다. 예컨대 미국 특허 6,218,149호; EP 0 359 096 B1; 미국 공보 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 공보 2003/0115614; 미국 특허 6,218,149호; 미국 특허 6,472,511호 참조.

본 발명의 이중체 분자는 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체에 대한 결합 리간드인 도메인을 포함하도록 구성될 수 있다. 그런 결합 리간드, 및 특히 정상 세포에서는 발현되지 않는 것들은 조직적합성 60 (H60) 분자, 레티노산 초기 유도성 유전자-1 (RAE-1)의 생성물, 및 쥐의 UL16-결합 단백질 유사 전사물 1 (MULT1)을 포함한다 (Raulet D.H. (2003) " Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands", Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand - Expressing Tumor Cells ", Blood 106:1711-1717). 사람 NKG2D와 반응하는 추가의 리간드는 다형태 MHC 부류 I 사슬-관련 분자 MICA 및 MICB를 포함한다 (Diefenbach, A. et al. (1999) " Natural Killer Cells : Stress Out , Turn On , Tune In ", Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) " Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D , A Receptor For Stress - Inducible MICA ", Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA 및 MICB 유전자: 그것들의 다형태에 관한 수수께끼는 풀려질 수 있을까?", Trends Immunol. 22:378-385).

MICA의 서열은 SEQ ID NO :311이다:

MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH

LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL

AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW

TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV

LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT

QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV

LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD

QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA

MICB의 서열은 SEQ ID NO :312이다:

PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE

DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED

SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM

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AAEGP

T-세포 수용체에 특이하게 결합하는 항체는 항-TCR 항체 BMA 031을 포함한다 (Kurrle, R. et al. (1989) ' BMA 031 - A TCR - Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application ", Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) " Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex", Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell", J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) " Construction , Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor ", J. Immunol. 147(12):4366-4373). NKG2D 수용체에 특이하게 결합하는 항체는 KYK-2.0을 포함한다 (Kwong, KY et al. (2008) " Generation , Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti - Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ", J. Mol. Biol. 384:1143-1156; 및 PCT/US09/54911).

그런 이중체의 사용에도 불구하고, 표적 세포는 이제 (NKG2D) 수용체를 정렬하는 세포에 의해 결합될 수 있는 세포가 되도록 재지시된다. NKG2D 수용체는 모든 사람 (및 다른 포유류) 천연 킬러 세포 상에서 (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D , A Receptor For Stress - Inducible MICA", Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) " The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ", Immunity 17(1):19-29), 및 모든 CD8⁺ T 세포 상에서 (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8 αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ", Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) " The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ", Immunity 17(1):19-29) 발현된다.

또는 달리, 본 발명의 이중체 분자는 T-세포 수용체 ("TCR")에 대한 결합 리간드인 도메인을 포함하도록 구성될 수 있다. TCR은 천연적으로 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에 의해 발현되는데, 그런 세포가 항원-제공 세포의 부류 I 또는 부류 II MHC 단백질에 의해 결합되고 제공되는 항원성 펩티드를 인식하는 것을 가능하게 한다. pMHC (펩티드-MHC) 복합체의 TCR에 의한 인식는 항원-제공 세포의 사이토킨 생성과 용해를 유도하는 세포 면역 반응의 증식을 개시한다 (예컨대 Armstrong, K.M. et al. (2008) " Conformational Changes And Flexibility In T- Cell Receptor Recognition Of Peptide - MHC Complexes ", Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) " Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T- Cell Epitopes For Adoptive T- Cell Therapy ", Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) " Master Switches Of T- Cell Activation And Differentiation", Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes", Am. J. Ther. 12(6):534-550).

그런 이중체 분자가, 예를 들어 표적 세포의 표면에 제공된 수용체에 결합할 수 있는 최소한 하나의 에피토프-결합 도메인을 추가로 포함하도록 구성함으로써, 그런 이중체 분자는 DART 분자가 될 것이고, 그로써 표적 세포에 결합할 수 있고, 그로써 표적 세포가 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체 또는 TCR (그것이 표적 세포-결합 이중체 상에 제공되든 아니든)에 대한 결합 리간드를 나타내도록 유발한다 (Germain, C. et al. (2008) " Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein ", Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672).

그런 이중체는 어떠한 원하는 표적 세포를 NK 세포-중재된 세포 용해 또는 T-세포 중재된 세포독성의 표적인 세포 안에 재지시하기 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 표적 세포의 표면에 제공된 수용체에 결합할 수 있는 이중체의 에피토프-결합 도메인은 종양-관련 항원에 결합하여 NK 세포-중재된 세포 용해 또는 T-세포 중재된 세포독성에 대한 기질로 그런 암세포를 재지시하는 에피토프이다. 특히 관심있는 것은 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 자궁경부암 항원, 췌장 암종 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 결장암 항원, 고환암 항원, 신경교아종 암항원, B 세포 악성종양과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비-호지킨성 림프종과 관련된 항원, 또는 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원인 종양-관련 항원들이다.

그런 용도에 적당한 종양-관련 항원들로는 다음과 같은 것들이 있다: A33 (결장 암종 항원; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); 베타-카테닌 (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (암배아성 항원; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol . 18(2):206-13); EGF-R (상피 성장인자 수용체; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); 인유두종 바이러스-E6/인유두종 바이러스-E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (전립선 특이 항원; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); TNF-수용체 (TNF-α수용체, TNF-β 수용체; 또는 TNF-γ 수용체; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); 또는 VEGF 수용체 (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8).

상기 용도를 위한 추가의 종양-관련 항원 (및 그러한 항원에 대해 특이하게 반응하는 항체를 개시하는 공보)으로는 다음과 같은 것들이 있다: ADAM-9 (미국 특허 공보 2006/0172350호; PCT 공보 WO 06/084075); ALCAM (PCT 공보 WO 03/093443); 카르복시펩티다제 M (미국 특허 공보 2006/0166291호); CD46 (미국 특허 7,148,038호; PCT 공보 WO 03/032814); 사이토케라틴 8 (PCT 공보 WO 03/024191); Ephrin 수용체 (및 특히 EphA2 (미국 특허 7,569,672호; PCT 공보 WO 06/084226); 인티그린 알파-V-베타-6 (PCT 공보 WO 03/087340); JAM-3 (PCT 공보 WO 06/084078); KID3 (PCT 공보 WO 05/028498); KID31 (PCT 공보 WO 06/076584); LUCA-2 (미국 특허 공보 2006/0172349호; PCT 공보 WO 06/083852); 온코스타틴 M (온코스타틴 수용체 베타) (미국 특허 7,572,896호; PCT 공보 WO 06/084092); PIPA (미국 특허 7,405,061호; PCT 공보 WO 04/043239); RAAG10 (미국 특허 7,527,969호; PCT 공보 WO 04/001381); ROR1 (미국 특허 5,843,749호); TES7 (PCT 공보 WO 08/066691); 및 트란스페린 수용체 (미국 특허 7,572,895; PCT 공보 WO 05/121179).

또한 관심이 있는 것은 특별한 감염성 병원체, 예컨대 바이러스 병원체, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), B형 간염 바이러스 (HBV), 인플루엔자, 인유두종 바이러스 (HPV), 수족구 (코사키) 바이러스, 광견병 바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 및 위장염의 원인성 병원체, 이를테면 로타바이러스, 아데노바이러스, 칼리시 바이러스, 아스트로 바이러스 및 노워크 (노로) 바이러스; 박테리아 병원체, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 대장균, 살로넬라 타이피뮤리움, 슈도모나스 아에루기노사, 비브리오 콜레라, 나이지리아 고노르호에아, 헬리코박터 파이롤리, 헤모필루스 인플루엔자, 시겔라 다이센테리아에, 스타필로코쿠스 아우레우스, 미코박테리움 투베르큘로시스 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 진균류 병원체 및 홈울타리갯지렁이와 같은 기생충에 특이한 항원들이다.

또는 달리 그런 에피토프는 Fc 수용체 (예컨대 FcγRI 또는 FcγRII)에 결합할 수 있어서, 예를 들면 NK 세포-중재된 세포 용해에 대한 기질로 급성 단세포성 백혈병 세포를 재지시할 수 있다.

1. 이중체 결합 도메인

본 발명의 이중체는 일반적으로 면역글로불린 또는 항체로부터 유도된 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 결합 도메인이 유도되는 항체는 동물 기원, 이를테면 조류와 포유류 (예컨대 사람, 비-사람 영장류, 쥐과 동물, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭)로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는 항체는 사람 또는 인간화된 단클론성 항체이다. 본원에서 사용되는 "사람" 항체는 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하고, 사람 면역글로불린 라이브러리 또는 합성 사람 면역글로불린 코딩 서열의 라이브러리로부터 분리되거나 또는 사람 유전자로부터 항체를 발현하는 마우스로부터 분리된 항체를 포함한다.

본 발명은 암, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 감염성 질병의 치료 및/또는 방지를 위해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 항체를 본 발명의 이중체에 대한 결합 도메인의 공급원으로 사용하는 용도를 포함한다. 공지된 암 항체의 비-제한적인 실례는 아래의 단원 (7.1)에서 제공되며, 열거된 표적 항원에 대해 특이적인 다른 항체 및 아래의 단원 (6.1)에서 열거된 암 항원에 대한 항체; 아래의 단원 7.2에서 제공되는 자가면역 질병 및 염증성 질병의 치료 및/또는 방지를 위해 공지된 항체의 비제한적인 실례 및 아래의 단원 6.2에 열거된 항원에 대한 항체; 다른 구체예에서는 아래의 단원 6.3에 열거된 감염성 질병과 관련된 에피토프에 대한 항체들이 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 그것은 부여된 이펙터 기능 및/또는 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교할만한 분자와 비교하여 FcγIIB에 대한 증강된 친화성 및 FcγIIIA에 대한 감소된 친화성을 가지도록 본 발명의 방법에 의해 확인될 수 있다. 본 발명에 따라 공학적으로 조작될 수 있는 염증성 장애의 치료 또는 방지를 위해 사용되는 항체의 비-제한적인 실례는 아래의 표 9에 제시되며, 자가면역 장애의 치료 또는 방지를 위해 사용되는 항체의 비-제한적인 실례는 표 10에 제시된다.

사람에서의 항체의 생체 내 사용 및 시험관 내 검출 분석을 포함하여 어떤 용도를 위해서는 사람, 키메릭 또는 인간화된 항체로부터 유도된 가변 도메인을 포함하는 이중체를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 완전히 사람 항체로부터 유래된 가변 도메인이 특히 사람 대상의 치료적 치료를 위해 바람직하다. 사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하는, 상기에서 설명된 파지 디스플레이 방법을 포함하여 해당 기술분야에 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다 (예컨대 미국 특허 4,444,887호 및 4,716,111호; 및 국제 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741).

인간화된 항체는 예정된 항원에 결합할 수 있고, 실질적으로 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역과 실질적으로 비-사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 CDR을 포함하는 항체, 그것의 변이체 또는 단편이다. 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린 (공여체 항체)의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 사람 면역글로불린 일치 서열의 그것인 최소한 하나, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 모두 또는 실질적으로 모두 포함할 수 있다.

인간화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 정확하게 원래의 서열에 상응할 필요는 없다. 예를 들어 공여체 CDR 또는 일치 프레임워크는 최소한 하나의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이가 될 수 있어서 그 부위에 있는 CDR 또는 프레임워크 잔기는 일치 또는 공여 항체 중 하나에 상응하지 않는다. 그러나 그런 돌연변이는 대규모가 아닌 것이 바람직하다. 보통 인간화된 항체 잔기의 최소한 75%, 때로는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 원래의 프레임워크 영역 (FR) 및 CDR 서열의 그것에 상응할 것이다. 인간화된 항체는 해당 기술분야에 공지되어 있는 다양한 기법, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 기법을 사용하여 제조될 수 있다: CDR-그래프팅 (유럽 특허 EP 239,400; 국제 공보 WO 91/09967; 및 미국 특허 5,225,539호, 5,530,101호, 및 5,585,089호), 베니어링 또는 표면 복원 (유럽 특허 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan (1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand - Binding Properties ", Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al . (1994) " Human - Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non - CDR Complementarity-Modulating Residues ", Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al . (1994) " Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing , Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973), 사슬 셔플링 (미국 특허 5,565,332호), 및 아래와 같은 문헌들에 개시된 기법, 예컨대 미국 특허 6,407,213호, 5,766,886호, 5,585,089호, 국제 공보 9317105, Tan et al . (2002) " Superhumanized' Antibodies : Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline Sequences : Application To An Anti - CD28 ", J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al . (2000) "Design And Synthesis Of Germline - Based Hemi - Humanized Single - Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen ", Protein Eng. 13:353-60, Morea et al . (2000) " Antibody Modeling : Implications For Engineering And Design ", Methods 20:267-79, Baca et al . (1997) " Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display", J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al . (1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR - Grafting And Variable Domain Resurfacing ", Protein Eng. 9:895-904, Couto et al . (1995) " Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates ", Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al . (1995) " Anti - BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization", Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies ", Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) " Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains . Implication For Humanization Of Murine Antibodies", J. Mol. Biol. 235:959-973, Jones et al . (1986) " Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature 321:522-525, Riechmann et al . (1988) ' Reshaping Human Antibodies For Therapy ", Nature 332:323-327, 및 Presta (1992) " Antibody Engineering", Curr. Op. Biotech. 3(4):394-398. 때로 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선하기 위하여 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들면 항원 결합과 특별한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위하여 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 확인된다 (Queen et al., 미국 특허 5,585,089호; 미국 공보 2004/0049014 및 2003/0229208; 미국 특허 6,350,861호; 6,180,370호; 5,693,762호; 5,693,761호; 5,585,089호; 및 5,530,101호 및 Riechmann et al . (1988) " Reshaping Human Antibodies For Therapy ", Nature 332:323-327).

가장 바람직한 구체예에서, 인간화된 결합 도메인은 공여 쥐 항체와 동일한 에피토프에 특이하게 결합한다. 당업자는 본 발명이 일반적인 항체의 CDR 그래프팅을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 그러므로 공여체 및 수용체 항체는 동일한 종의 동물로부터 및 심지어 동일한 항체 부류 또는 하위부류로부터 유도될 수 있다. 그러나 보다 통상적으로는 공여체 및 수용체 항체는 상이한 종의 동물로부터 유도된다. 전형적으로 공여체 항체는 비-사람 항체, 예컨대 설치류 mAb이고, 수용체 항체는 사람 항체이다.

어떤 구체예에서, 공여체 항체로부터의 최소한 하나의 CDR은 사람 항체로 이식된다. 다른 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 각각의 최소한 둘 및 바람직하게는 세 개의 모든 CDR이 사람 항체로 이식된다. CDR은 Kabat CDR, 구조적 루프 CDR 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 최소한 하나의 CDR 이식된 중쇄 및 최소한 하나의 CDR-이식된 경쇄를 포함하는 인간화된 FcγRIIB 항체를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용된 이중체는 변형된, 즉 어떠한 유형의 분자의 이중체에의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 그것에 의해 제한되는 것이 아니라 이중체 유도체는 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등에 의해 변형된 이중체를 포함한다. 수많은 화학적 변형 중 어느 것이든지 공지된 기법, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 특수한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등에 의해 수행될 수 있다. 추가로 유도체는 하나 또는 그 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.

키메릭 항체는 예컨대 비-사람 항체로부터 유도된 가변 영역과 사람 면역글로불린 불변 영역을 가지고 있는 항체와 같이, 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도된 분자이다. 키메릭 항체의 제조 방법은 해당 기술분야에 알려져 있다 (Morrison (1985) " Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies", Science 229:1202-1207; Oi et al . (1986) " Chimeric Antibodies ", BioTechniques 4:214-221; Gillies et al . (1989) " High - Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes ", J. Immunol. Methods 125:191-202; 및 미국 특허 6,311,415호, 5,807,715호, 4,816,567호, 및 4,816,397호).

때로, 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선하기 위하여 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들면 항원 결합과 특별한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위하여 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 확인된다 (미국 특허 5,585,089호; 및 Riechmann et al . (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy ", Nature 332:323-327).

본 발명의 이중체의 결합 도메인이 유래되는 단클론성 항체는 해당 기술분야에 알려져 있는 광범위한 기법, 이를테면 하이브리도마의 사용, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 그것들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 단클론성 항체는 해당 기술분야에 공지되어 있고 예를 들어 문헌에 교시된 것들을 포함한 하이브리도마 기법을 사용하여 제조될 수 있다: Harlow et al ., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al ., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). 본원에 사용된 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "단클론성 항체"는 단일 클론, 이를테면 어떠한 진핵, 원핵, 또는 파지 클론으로부터 유도된 항체를 말하며, 그것이 제조되는 방법을 말하지 않는다.

하이브리도마 기술을 사용하여 특이한 항체를 제조하고 선별하기 위한 방법은 기본적인 것이며 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 비-제한적인 실례에서, 마우스들은 관심의 항원 또는 그런 항원을 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 일단 면역 반응이 검출되면, 예컨대 항원에 대해 특이한 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장이 수득되고 비장세포가 분리된다. 그런 다음 비장세포는 잘 알려져 있는 기법에 의해 어떠한 적당한 골수종 세포에 융합된다. 하이브리도마가 선택되고 제한 희석법에 의해 클론된다. 그런 다음 하이브리도마 클론은 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 해당 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 분석된다. 일반적으로 고수준의 항체를 함유하는 복수 액은 마우스를 포지티브 하이브리도마 클론으로 복강 내 접종함으로써 생성될 수 있다. 관심의 항원은 그것들에 제한되는 것은 아니지만, 아래의 단원 8.1에서 제공되는 암과 관련된 항원, 단원 8.2에서 제공되는 자가면역 질병 및 염증성 질병과 관련된 항원, 단원 8.3에서 제공되는 감염성 질병과 관련된 항원, 및 단원 8.4에서 제공된 독소를 포함한다.

항체는 또한 해당 기술분야에 공지되어 있는 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 파지 입자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면상에 표출된다. 특별한 구체예에서, 그런 파지는 레퍼토리 또는 조합적 항체 라이브러리 (예컨대 사람 또는 쥐과)로부터 발현된 항원 결합 도메인, 예컨대 Fab 및 Fv 또는 이황화-결합 안정화된 Fv를 표출하기 위해 활용될 수 있다. 관심의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원으로, 예컨대 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합된 또는 포획된 항원을 사용하여 선택되거나 확인될 수 있다. 이들 방법에 사용된 파지는 전형적으로 필라멘트형 파지, 이를테면 fd 및 M13이다. 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 하나에 재조합적으로 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 그것의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 실례는 아래의 문헌에 개시된 것들을 포함한다: Brinkmann et al . (1995) " Phage Display Of Disulfide -Stabilized Fv Fragments ", J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al . (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins ", J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al . (1994) " Isolation Of Tumor Cell - Specific Single - Chain Fv From Immunized Mice Using Phage - Antibody Libraries And The Re - Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments ", Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al . (1997) " An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries ", Gene, 187:9-18; Burton et al . (1994) " Human Antibodies From Combinatorial Libraries ", Advances in Immunology, 57:191-280; PCT 출원 PCT/GB91/01134; PCT 공보WO 90/02809; WO 91/10737; WO　92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 미국 특허 5,698,426호; 5,223,409호; 5,403,484호; 5,580,717호; 5,427,908호; 5,750,753호; 5,821,047호; 5,571,698호; 5,427,908호; 5,516,637호; 5,780,225호; 5,658,727호; 5,733,743호 및 5,969,108호.

파지 디스플레이 기술은 항체의 그것의 항원에 대한 친화성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이 기법은 고친화성 항체를 얻는데 유용할 것이다. 친화성 성숙으로서 언급되는 이 기술은 돌연변이생성 또는 CDR 워킹과, 초기 또는 원래의 항체와 비교될 때 항원에 대해 더 높은 친화성으로 결합하는 항체를 확인하기 위해 동족 항원을 사용하여 재-선택을 사용한다 (Glaser et al . (1992) " Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti - Tac Antibody ", J. Immunology 149:2607-2614). 단일 뉴클레오티드보다 전체 코돈을 돌연변이시키는 것은 아미노산 돌연변이의 반-무작위 레퍼토리를 초래한다. 각각이 단일 CDR에서 단일 아미노산 변경에 의해 달라지고 각각의 CDR 잔기에 대한 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유하는 변이체 클론들의 푸울로 구성되는 라이브러리가 구성될 수 있다. 항원에 대해 결합 친화성이 증가된 돌연변이들은 표지된 항원과 고정된 돌연변이체를 접촉시킴으로써 선별될 수 있다. 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 선별 방법이든지 항원에 대한 증가된 결합 능력을 나타내는 돌연변이 항체를 확인하는 데 사용될 수 있다 (예컨대 ELISA) (Wu et al . (1998) " Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin , An Alphav Beta3 - Specific Humanized mAb ", Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037-6042; Yelton et al . (1995) " Affinity Maturation Of The Br96 Anti - Carcinoma Antibody By Codon - Based Mutagenesis ", J. Immunology 155:1994-2004). 경쇄를 무작위 추출하는 CDR 워킹도 또한 가능하다 (Schier et al. (1996) " Isolation Of Picomolar Affinity Anti -C- ErbB -2 Single - Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site ", J. Mol. Bio. 263:551-567).

본 발명은 또한 프레임워크 또는 CDR 영역에 돌연변이 (예컨대 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환)을 포함하는, 본원에 기술된 또는 해당 기술분야에 공지된 어떠한 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인의 사용을 포함한다. 바람직하게도, 이들 결합 도메인의 돌연변이는 그것들이 면역특이적으로 결합하는 FcγRIIB에 대한 결합 도메인의 결합 능력 및/또는 친화성을 유지 또는 증강시킨다. 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기법 (예컨대 면역분석)은 특별한 항원에 대한 항체의 친화성을 분석하기 위해 사용될 수 있다.

해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기법들은 항체, 또는 그것의 단편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있고, 이를테면 예컨대 아미노산 치환을 초래하는 부위-특정 돌연변이생성 및 PCR-중재된 돌연변이생성이 있다. 바람직하게는 유도체는 원래의 항체 또는 그것의 단편과 비교하여 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유도체는 하나 또는 그 이상의 예상되는 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어진 보존성 아미노산 치환을 포함한다.

1.1 Fc γ RIIB 에 면역특이적으로 결합하는 에피토프 결합 부위를 포함하는 이중체

특별한 구체예에서, 본 발명의 이중체의 최소한 하나의 결합 도메인은 FcγRIIB의 최소한 하나의 활성을 아고나이즈한다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 활성은 B 세포 수용체-중재된 신호화의 억제이다. 다른 구체예에서, 결합 도메인은 B 세포의 활성화, B 세포 증식, 항체 생성, B 새포의 세포내 칼슘 유입, 세포 주기 진전, 또는 FcγRIIB 신호 변환 경로의 하나 또는 그 이상의 하류 신호화 분자의 활성을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIB의 인산화 또는 SHIP 충원을 증강시킨다. 발명의 추가의 구체예에서, 결합 도메인은 B 세포 수용체-중재된 신호화 경로의 MAP 키나아제 활성 또는 Akt 충원을 억제한다. 다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcεRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 아고나이즈한다. 특별한 구체예에서, 상기 결합 도메인은 FcεRI-유도된 비만 세포 활성화, 칼슘 이동, 탈과립화, 사이토킨 생성, 또는 세로토닌 방출을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 도메인은 FcγRIIB의 인산화를 자극하고, SHIP의 충원을 자극하고, SHIP 인산화 및 그것의 Shc와의 결합을 자극하거나, 또는 MAP 키나아제 패밀리 구성원 (예컨대 Erk1, Erk2, JNK, p38 등)의 활성화를 억제한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 도메인은 p62dok의 티로신 인산화 및 그것의 SHIP 및 rasGAP와의 결합을 증강시킨다. 또 다른 구체예에서, 발명의 결합 도메인은 단핵세포 또는 대식세포에서 FcγR-중재된 식세포작용을 억제한다.

다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIB의 최소한 하나의 활성을 길항한다. 한 구체예에서, 상기 활성은 B 세포 수용체-중재된 신호화의 활성화이다. 특별한 구체예에서, 결합 도메인은 B 세포 활성, B 세포 증식, 항체 생성, 세포 내 칼슘 유입, 또는 FcγRIIB 신호 변환 경로에서 하나 또는 그 이상의 하류 신호화 분자의 활성을 증강시킨다. 또 다른 특별한 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIB의 인산화 또는 SHIP 충원을 감소시킨다. 발명의 추가의 구체예에서, 결합 도메인은 B 세포 수용체 중재된 신호화 경로에서 MAP 키나아제 활성 또는 Akt 충원을 증강시킨다. 다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcεRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 길항한다. 특별한 구체예에서 결합 도메인은 FcεRI-유도된 비만 세포 활성화, 칼슘 이동, 탈과립화, 사이토킨 생성, 또는 세로토닌 방출을 증강시킨다. 또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIB의 인산화를 억제하고, SHIP의 충원을 억제하고, SHIP 인산화 및 그것의 Shc와의 결합을 억제하거나, 또는 MAP 키나아제 패밀리 구성원 (예컨대 Erk1, Erk2, JNK, p38 등)의 활성화를 증강시킨다. 또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 p62dok의 티로신 인산화 및 그것의 SHIP 및 rasGAP와의 결합을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 단핵세포 또는 대식세포에서 FcγR-중재된 식세포작용을 증강시킨다. 또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 비장세포, 대식세포에 의한 식세포작용, 옵소닌화된 입자의 제거를 방지한다.

다른 구체예에서, 최소한 하나의 결합 도메인은 발명의 이중체를, FcγRIIB를 발현하는 세포에 표적화하기 위하여 사용될 수 있다.

특별한 한 구체예에서, 결합 도메인 중 하나는 각각 ATCC 승인 번호 PTA-4591 및 PTA-4592를 가지는 클론 2B6 또는 3H7에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체로부터 유도된다. 항체 2B6 및 3H7을 생성하는 하이브리도마는 특허과정을 목적으로 한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)에 2002년 8월 13일에 기탁되었고, 각각 승인 번호 PTA-4591 (2B6을 생성하는 하이브리도마에 대해) 및 PTA-4592 (3H7을 생성하는 하이브리도마에 대해)를 부여받았다. 바람직한 구체예에서, 결합 도메인은 사람 또는 인간화된 것이고, 바람직하게는 클론 3H7 또는 2B6에 의해 생성된 항체의 인간화된 버전으로부터 유도된다.

본 발명은 또한 FcγRIIB, 바람직하게는 사람 FcγRIIB, 보다 바람직하게는 천연 사람 FcγRIIB에 특이하게 결합하고, 클론, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 각각 PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, 및 PTA-5959의 승인 번호를 가지는 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 및 1F2로부터 유도되는, 다른 항체로부터의 결합 도메인과의 이중체를 포함한다. 상기 확인된 클론을 생성하는 하이브리도마는 부다페스트 조약의 규정 하에 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)에 2004년 5월 7일에 기탁되었다. 바람직한 구체예에서, 상술된 항체로부터의 결합 도메인은 인간화된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 이중체에 사용된 결합 도메인은 하나 또는 그 이상의 상보적으로 결정하는 영역 (CDR), 바람직하게는 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 항체의 6개의 CDR을 모두 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 결합 도메인은 각각 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2로부터 생성된 마우스 단클론성 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 및/또는 예컨대 ELISA 분석 또는 다른 적절한 경합 면역분석에서 측정되는 것과 같이, 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2로부터 생성된 마우스 단클론성 항체와 경합하며, 또한 결합 도메인이 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 결합한다.

본 발명은 또한 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 가변성 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대해 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 99% 동일한 가변성 중쇄 및/또는 가변성 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인을 가지는 이중체를 포함한다. 본 발명은 나아가 상기 항체 또는 그것의 단편이 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하고, 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 가변성 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열에 대해 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 99% 동일한 하나 또는 그 이상의 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인을 가지는 이중체를 포함한다. 두 개의 아미노산 서열의 % 동일성의 측정은 해당 기술분야의 숙련자에게 공지된 어떠한 방법, 이를테면 BLAST 단백질 연구조사에 의해 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 결합 도메인이 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하고, 엄격한 조건하에서 클론 B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화되는 결합 도메인을 함유하는 이중체의 용도를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIA보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하고, 엄격한 조건 하에서 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 가변성 경쇄 및/또는 가변성 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 가변성 경쇄 및/또는 가변성 중쇄를 포함한다. 바람직한 다른 구체예에서, 결합 도메인은 FcγRIIA보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하고, 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR의 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함한다. 엄격한 혼성화 조건은, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)에서 약 45℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화된 후, 0.2X SSC/0.1% SDS로 약 50 내지 65℃에서 1회 또는 그 이상 세척되는 혼성화, 또는 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 어떠한 다른 엄격한 혼성화 조건을 포함한다 (예를 들면 Ausubel, F.M. et al ., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley and Sons, Inc., NY pp6.3.1 ~ 6.3.6 및 2.10.3 참조).

본 발명은 또한 프레임워크 또는 CDR 영역에 돌연변이 (예컨대 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환)를 포함하는 상술된 어떠한 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인의 용도를 포함한다. 바람직하게는 이들 결합 도메인의 돌연변이는 결합 도메인이 특이적으로 결합하는 FcγRIIB에 대한 결합 도메인의 결합 능력 및/또는 친화성을 유지 또는 증강시킨다. 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기법들 (예컨대 면역분석)이 특별한 항원에 대한 항체의 친화성을 분석하기 위해 사용될 수 있다.

해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기법은 항체, 또는 그것의 단편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있는데, 이를테면 부위-특정 돌연변이생성 및 PCR-중재된 돌연변이생성이고, 그것은 아미노산 치환을 초래한다. 바람직하게는 유도체는 원래의 항체 또는 그것의 단편에 비교하여 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유도체는 하나 또는 그 이상의 예상되는 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어진 보존성 아미노산 치환을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 결합 도메인은 인간화된 항체로부터 유도된다. 인간화된 FcγRIIB 특이적 항체는 최소한 하나, 및 전형적으로는 두 개의, 실질적으로 모든 가변성 도메인을 포함할 수 있고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-사람 면역글로불린 (즉 공여체 항체)의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 사람 면역글로불린 일치 서열의 그것이다.

본 발명의 이중체는 사람 항체 (수용체 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 하나 또는 그 이상의 CDR의 하나 또는 그 이상의 영역이 FcγRIIA보다 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하는 공여체 단클론성 항체, 예컨대 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 마우스 단클론성 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR의 유사한 부분에 의해 치환되어 있는, FcγRIIB에 특이한 인간화된 가변성 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서 인간화된 항체는 각각 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2와 동일한 에피토프에 결합한다.

바람직한 구체예에서, 인간화된 FcγRIIB 결합 도메인의 CDR 영역은 FcγRIIB에 특이한 쥐과 동물의 항체로부터 유도된다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술된 인간화된 항체는 수용체 항체, 즉 공여체 단클론성 항체의 결합 특이성을 보유하기 위해 필요한 사람, 중쇄 및/또는 경쇄 가변성 도메인 프레임워크 영역의 변경, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 아미노산 결실, 삽입, 변형을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술된 인간화된 항체의 프레임워크 영역은 자연 발생적인 인간 항체 가변 영역의 프레임워크 영역의 정확한 아미노산 서열로 구성될 필요는 없지만, 다양한 변경, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니나 인간화된 항체의 특성을 변경, 예를 들어 쥐과 동물의 FcγRIIB 특이적 항체와 동일한 표적에 특이적인 인간화된 항체 영역의 결합 특성을 개선시키는 아미노산 결실, 삽입, 변형을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 최소 횟수의 변경이 비-사람 프레임워크 잔기의 대규모 도입을 피하고 사람에서 인간화된 항체의 최소한의 면역원성을 보장하기 위하여 프레임워크 영역에서 이루어진다. 공여체 단클론성 항체는 바람직하게는 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 단클론성 항체이다.

특수한 구체예에서, 결합 도메인은 CDR-이식된 항체가 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하는 상기 CDR-이식된 항체의 가변 도메인을 포함하는데, 이때 CDR-이식된 항체는 수용체 항체의 프레임워크 잔기와, 상기 항체가 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하는 공여체 단클론성 항체, 예컨대 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 단클론성 항체로부터의 잔기를 포함하는 중쇄 가변성 영역 도메인을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 이중체는 상기 항체가 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하는 CDR-이식된 항체로부터의 가변성 도메인을 포함하는데, 이때 CDR-이식된 항체는 수용체 항체의 프레임워크 잔기와, 상기 항체가 FcγRIIA에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 FcγRIIB에 특이하게 결합하는 공여체 단클론성 항체, 예컨대 클론 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2에 의해 생성된 단클론성 항체로부터의 잔기를 포함하는 경쇄 가변성 영역 도메인을 포함한다.

본 발명에 사용되는 인간화된 항-FcγRIIB 가변성 도메인은 CDR1 (SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:25) 및/또는 CDR2 (SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1 (SEQ ID NO:30 또는 SEQ ID NO:31) 및/또는 CDR2 (SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, 또는 SEQ ID NO:35) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:37)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.

한 특정 구체예에서, 이중체는 인간화된 2B6 항체로부터의 가변 도메인을 포함하는데, 이때 VH 영역은 사람 생식선 VH 절편 VH1-18 (Matsuda et al . (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region Locus ", J. Exp. Med. 188:2151-2162) 및 JH6 (Ravetch et al . (1981) " Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus : Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes ", Cell 27(3 Pt. 2): 583-91)로부터의 FR 절편, 및 2B6 VH의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역으로 구성되며, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 가진다. 한 구체예에서, 2B6 VH는 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 2B6 VH 도메인은 Hu2B6VH, SEQ ID NO:85의 아미노산 서열을 가지며, SEQ ID NO:86의 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 이중체는 또한 VL 영역을 포함하는데, 그것은 사람 생식선 VL 절편 VK-A26 (Lautner-Rieske et al . (1992) " The Human Immunoglobulin Kappa Locus . Characterization Of The Duplicated A Regions ", Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) 및 JK4 (Hieter et al . (1982) " Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes ", J. Biol. Chem. 257:1516-22)의 FR 절편, 및 SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 가지는 2B6VL의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역으로 구성된다. 한 구체예에서, 2B6 VL은 SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, 또는 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가진다. 특정 구체예에서 2B6 VL은 Hu2B6VL, SEQ ID NO:87의 아미노산 서열을 가지며, SEQ ID NO:88의 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화될 수 있다.

또 다른 특정 구체예에서, 이중체는 인간화된 3H7 항체로부터의 가변 도메인을 가지는데, 이때 VH 영역은 사람 생식선 VH 절편으로부터의 FR 절편과 3H7 VH의 CDR 영역으로 구성되며, SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 가진다. 다른 특정 구체예에서 인간화된 3H7 항체는 또한 VL 영역을 포함하는데, 그것은 사람 생식선 VL 절편의 FR 절편과 3H7VL의 CDR 영역으로 구성되며, SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가진다.

특히 결합 도메인은 천연 사람 FcγRIIB의 세포외재성 도메인에 면역특이적으로 결합하며, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 또는 1F2의 CDR 서열을 다음 조합의 어느 것으로든지 포함한다 (또는 달리 그것으로 구성된다): VH CDR1과 VL CDR1; VH CDR1과 VL CDR2; VH CDR1과 VL CDR3; VH CDR2와 VL CDR1; VH CDR2와 VL CDR2; VH CDR2와 VL CDR3; VH CDR3과 VH CDR1; VH CDR3과 VL CDR2; VH CDR3과 VL CDR3; VH1 CDR1, VH CDR2와 VL CDR1; VH CDR1, VH CDR2와 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2와 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3과 VL CDR1; VH CDR2, VH CDR3과 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR1, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR1; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR2 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3; 또는 본원에 개시된 VH CDR과 VL CDR의 어떠한 조합.

본 발명의 이중체에 포함될 결합 도메인을 유도하기 위한 항체는 추가로 에피토프 지도화에 의해 특성확인될 수 있는데, 그로써 항체는 FcγRIIA에 비교하여 FcγRIIB에 대해 가장 큰 특이성을 가지는 것이 선택될 수 있다. 항체의 에피토프 지도화 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 본 발명의 방법에도 포함된다. 어떤 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 FcγRIIB의 영역을 포함하는 융합 단백질은 본 발명의 항체의 에피토프를 지도화하는 데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 사람 IgG2의 Fc 부분에 융합된 FcγRIIB의 영역의 아미노산 서열을 함유한다. 각각의 융합 단백질은 추가로 아래의 표 2에 나타난 것과 같이, 상동체 수용체, 예컨대 FcγRIIA로부터의 상응하는 영역을 사용한 수용체의 특정 영역의 아미노산 치환 및/또는 대체를 포함한다. pMGX125 및 pMGX132는 FcγRIIB 수용체의 IgG 결합 부위를 함유하는데, 전자는 FcγRIIB의 C-말단을 포함하고, 후자는 FcγRIIA의 C-말단을 포함하며, C-말단 결합을 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 것은 IgG 결합 부위에 FcγRIIA 치환을 가지며 FcγRIIA 또는 FcγRIIB N-말단 중 하나를 가진다. 이들 분자는 항체가 결합하는 경우 수용체 분자의 부분을 측정하는 것을 보조할 수 있다.

표 2. 단클론성 항-FcγRIIB 항체의 에피토프를 연구하기 위해 사용될 수 있는 융합 단백질의 목록. 잔기 172 내지 180은 FcγRIIA와 B의 IgG 결합 부위에 속한다. FcγRIIA 서열로부터의 특수한 아미노산은 진하게 표시된다.

융합 단백질은 본 발명의 항-FcγRIIB 항체에 대한 결합의 측정을 위한 어떠한 생화학적 분석, 예컨대 ELISA에서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 에피토프 특이성의 추가의 확인은 FcγRIIA 서열로부터의 특이한 잔기들로 대체된 특수 잔기를 가지는 펩티드를 사용함으로써 이루어질 수 있다.

항체는 발명의 항체의 기능, 특히 FcγRIIB 신호화를 조절하는 활성을 확인하기 위한 분석을 사용하여 특성확인될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 특성확인 분석법은 FcγRIIB의 ITIM 모티프의 티로신 잔기의 인산화를 측정할 수 있거나, 또는 B 세포 수용체-생성된 칼슘 이동의 억제를 측정할 수 있다. 본 발명의 특성확인 분석법은 세포-기초 또는 세포-유리 분석법일 수 있다.

해당 기술분야에는, 비만 세포에서 고친화성 IgE 수용체, FcεRI과 FcγRIIB의 공동응집이 항원-유도된 탈과립화의 억제, 칼슘 이동, 및 사이토킨 생성을 유도한다는 것이 잘 수립되어 있다 (Metcalfe D.D. et al . (1997) " Mast Cells ", Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) " Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors ", Annu. Rev. Immunol. 17:875-904). 이 신호화 경로의 분자적 세부사항은 최근에 밝혀졌다 (Ott V. L. (2002) " Downstream Of Kinase, p62 ( dok ), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling", J. Immunol. 162(9):4430-4439). 일단 FcεRI과의 공동응집이 이루어지고 나면, FcγRIIB는 그것의 ITIM 모티프에 있는 티로신 상에서 신속하게 인산화되고, 그런 다음 Src 동종성-2 함유 이노시톨-5-포스파타제 (SHIP), SH2도메인-함유 이노시탈 폴리포스페이트 5-포스파타제를 충원하고, 그것은 다시 인산화되고 Shc 및 p62^dok (p62^dok는 어댑터 분자 패밀리의 원형이다)와 결합하는데, 그것은 아미노말단 플렉스트린 상동 도메인 (PH 도메인)과 같은 신호화 도메인, PTB 도메인, 및 PXXP 모티프와 많은 인산화 부위를 함유하는 카르복시 말단 영역을 포함한다 (Carpino et al . (1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells", Cell, 88:197-204; Yamanshi et al . (1997) " Identification Of The Abl - And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein , Dok ", Cell, 88:205-211).

본 발명에 사용하기 위한 항-FcγRIIB 항체는 하나 또는 그 이상의 IgE 중재된 반응을 조절하는 능력에 대해 마찬가지로 특성확인될 수 있다. 바람직하게는 IgE에 대한 고친화성 수용체와 FcγRIIB에 대한 저친화성 수용체를 공동발현하는 셀라인이 IgE 중재된 반응을 조절하는 데 있어서 항-FcγRIIB 항체를 특성확인하는 데 사용될 것이다. 특정 구체예에서, 전길이의 사람 FcγRIIB로 형질전환된 쥐 호염기성 백혈병 셀라인으로부터의 세포 (RBL-H23; Barsumian E.L. et al . (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines : Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones ", Eur. J. Immunol.11:317-323)가 사용될 것이다. RBL-2H3은 IgE-중재된 세포 활성화 후에 이어지는 신호화 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 온 특성확인이 잘 되어있는 쥐 셀라인이다. RBL-2H3 세포에서 발현되고 FcεRI와 공동응집될 때 FcγRIIB는 FcεRI-유도된 칼슘 이동, 탈과립화, 및 사이토킨 생성을 억제한다 (Malbec et al . (1998) " Fc Epsilon Receptor I- Associated Lyn - Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation ", J. Immunol. 160:1647-1658; Daeron et al . (1995) " Regulation Of High - Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low - Affinity IgG Receptors ", J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L. (2002) " Downstream Of Kinase , p62 ( dok ), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling ", J. Immunol. 162(9):4430-4439).

본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한 FcεRI 유도된 비만 세포 활성화의 억제에 대해 특성확인될 수 있다. 예를 들어 FcγRIIB로 형질전환되어 있는 쥐 호염기성 백혈병 셀라인으로부터의 세포 (RBL-H23; Barsumian E.L. et al . (1981) " IgE -Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines : Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones ", Eur. J. Immunol.11:317-323)는 IgE로 민감화되고 FcεRI을 단독으로 응집하기 위하여 토끼 항-마우스 IgG의 F(ab')₂단편으로, 또는 FcγRIIB와 FcεRI을 공동응집하기 위하여 전체 토끼 항-마우스 IgG로 자극된다. 이 시스템에서, 하류 신호화 분자의 간접적인 조절은 민감화되고 자극된 세포에 본 발명의 항체를 첨가할 때 분석될 수 있다. 예를 들어 FcγRIIB의 티로신 인산화 및 SHIP의 충원 및 인산화, MAP 키나아제 패밀리 구성원, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 Erk1, Erk2, JNK, 또는 p38의 활성화; 및 p62^dok의 티로신 인산화 및 그것의 SHIP 및 RasGAP과의 결합이 분석될 수 있다.

본 발명의 항체에 의한 FcεRI 유도된 비만 세포 활성화의 억제를 측정하기 위한 한 가지 예시적인 분석은 다음을 포함할 수 있다: 사람 FcγRIIB로 RBL-H23 세포를 형질전환함; RBL-H23 세포를 IgE로 민감화시킴; RBL-H23 세포를 토끼 항-마우스 IgG의 F(ab')₂단편으로 자극하거나 (FcεRI을 단독으로 응집하고 FcεRI-유도된 신호화를 유도하기 위하여, 대조표준으로 사용), 또는 전체 토끼 항-마우스 IgG로 RBL-2H3 세포를 자극함 (FcγRIIB와 FcεRI을 공동응집하기 위하여, 그 결과 FcεRI-중재된 신호화가 억제됨). 전체 토끼 항-마우스 IgG 항체로 자극된 세포는 추가로 본 발명의 항체와 사전 인큐베이션될 수 있다. 본 발명의 항체와 사전 인큐베이션된 세포 및 본 발명의 항체로 사전 인큐베이션되지 않은 세포의 FcεRI-의존성 활성을 측정하고, 이들 세포에서 FcεRI-의존성 활성의 수준을 비교하는 것은 본 발명의 항체에 의한 FcεRI-의존성 활성의 조절을 가리킬 것이다.

상기에서 설명된 예시적인 분석은 예를 들면, FcγRIIB 수용체에 대한 리간드 (IgG) 결합을 차단하고 FcγRIIB와 FcεRI의 공동응집을 방지함으로써 FcεRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 길항하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 분석은 마찬가지로 FcγRIIB와 FcεRI의 공동응집을 증강시키고, FcγRIIB와 FcεRI의 공동응집을 촉진함으로써 FcεRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 아고나이즈하는 항체를 확인한다.

어떤 구체예에서, 본원에 기술되었거나 해당 기술분야에 공지되어 있는 확인된 항-FcγRIIB 항체의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항-FcγRIIB 이중체는 비만 세포 또는 호염기성 세포의 탈과립화를 모니터링 및/또는 측정함으로써, 바람직하게는 세포-기초 분석으로, IgE 중재된 반응을 조절하는 그 이중체의 능력에 대해 특성확인된다. 바람직하게는, 그런 분석에 사용하기 위한 비만 세포 또는 호염기성 세포는 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 표준 재조합 방법을 사용하여 사람 FcγRIIB를 함유하도록 공학적으로 조작되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항-FcγRIIB 항체는 세포-기초 β-헥소사미니다제 (과립에 함유된 효소) 방출 분석으로 IgE 중재된 반응을 조절하는 능력에 대해 특성확인된다. 비만 세포 및 호염기성 세포로부터의 β-헥소사미니다제 방출은 급성 알레르기 반응 및 염증 상태에서 일차적인 사건이다 (Aketani et al . (2001) " Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL -2 H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen - Specific IgEs ", Immunol. Lett. 75:185-189; Aketani et al . (2000) "A Screening Method For Antigen - Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling ", Anal. Chem. 72:2653-2658). 다른 염증성 중재자, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 세로토닌과 히스타민의 방출은 본 발명의 방법에 따라 IgE 중재된 반응을 측정하기 위해 분석될 수 있다. 비록 이론에 구속되기를 의도하지는 않지만, 특별한 작용 메커니즘에 의해 비만 세포 및 호염기성 세포로부터의 β-헥소사미니다제 방출과 같은 과립의 방출은 다가 항원과의 FcγRI의 교차결합에 의해 개시된 세포 내 칼슘 농도 의존성 과정이다.

사람 비만 세포를 연구하는 능력은 적당한 장기간의 사람 비만 세포 배양물의 부재에 의해 제한되어 왔다. 최근에 LAD1 및 LAD2로 표시된, 두 개의 신규한 줄기세포 인자 의존성 사람 비만 세포 라인이 비만 세포 육종/백혈병에 걸린 환자로부터 골수를 흡입함으로써 수립되었다 (Kirshenbaum et al . (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma / Leukemia ; Activation Following Aggregation Of FcRI Or Fc γ RI ", Leukemia research, 27:677-82). 두 개의 셀라인은 모두 FcεRI 및 여러 사람 비만 세포 마커를 발현하는 것으로 기술되어 있다. LAD1 및 2 세포는 IgE 중재된 반응에 미치는 본 발명의 항체의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기에서 설명된 것과 같은 세포-기초 β-헥소사미니다제 방출 분석은 LAD 세포에서 본 발명의 항-FcγRIIB 항체에 의한 IgE-중재된 반응의 어떠한 조절을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 분석에서, 사람 비만 세포, 예컨대 LAD 1은 키메릭 사람 IgE 항-니트로페놀 (NP)로 프라임되고 다가 항원인 BSA-NP로 도전되며, 세포 탈과립화는 상층액에 방출된 β-헥소사미니다제를 측정함으로써 모니터된다 (Kirshenbaum et al . (2003) " Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma / Leukemia ; Activation Following Aggregation Of FcRI Or Fc γ RI ", Leukemia research, 27:677-82).

어떤 구체예에서, 만약 사람 비만 세포가 해당 기술분야에 공지되어 있는 표준 방법, 예컨대 FACS 염색을 사용하여 측정되는 바, 내인성 FcγRIIB를 저수준으로 발현한다면, 본 발명의 항-FcγRIIB 항체에 의해 중재된 억제성 경로의 활성화에서 그 차이를 모니터 및/또는 검출하기가 어려울 것이다. 그러므로 본 발명은 대체 방법, 즉 FcγRIIB 발현이 사이토킨과 특별한 성장 조건을 사용하여 상향조절될 수 있는 방법을 포함한다. FcγRIIB는 사람 단핵세포 셀라인, 예컨대 THP1 및 U937에서 (Tridandapani et al . (2002) " Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells ", J. Biol. Chem., 277(7):5082-5089), 그리고 일차 사람 단핵세포에서 (Pricop et al . (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines ", J. of Immunol., 166:531-537) IL4에 의해 매우 상향조절되는 것으로 설명되었다. 디부티릴 고리형 AMP로 U937 세포를 분화하는 것은 FcγRII의 발현을 증가시키는 것으로 설명되었다 (Cameron et al . (2002) " Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line , U937 , With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor , FcgammaRIIB ", Immunology Letters 83, 171-179). 그러므로 본 발명의 방법에 사용하기 위한 사람 비만 세포에서의 내인성 FcγRIIB 발현은 검출의 민감성을 증강시키기 위하여 사이토킨, 예컨대 IL-4, IL-13을 사용하여 상향 조절될 수 있다.

항-FcγRIIB 이중체는 또한 B-세포 수용체 (BCR)-중재된 신호화의 억제에 대해 분석될 수 있다. BCR-중재된 신호화는 최소한 하나 또는 그 이상의 하류 생물학적 반응, 예컨대 B 세포의 활성화 및 증식, 항체 생성 등을 포함할 수 있다. FcγRIIB과 BCR의 공동응집은 세포 주기 진전과 세포 생존의 억제를 유도한다. 나아가 FcγRIIB과 BCR의 공동응집은 BCR-중재된 신호화의 억제를 유도한다.

구체적으로, BCR-중재된 신호화는 최소한 하나 또는 그 이상의 다음을 포함한다: 하류 신호화 분자의 조절 (예컨대 FcγRIIB의 인산화 상태, SHIP 충원, Btk 및/또는 PLCγ의 국지화, MAP 키나아제 활성, Akt (항-아폽토시스 신호)의 충원, 칼슘 이동, 세포 주기 진전, 및 세포 증식.

비록 BCR 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제의 많은 이펙터 기능이 SHIP을 통해 중재되긴 하지만, 최근에 SHIP 결핍 마우스로부터의 리포다당 (LPS)-활성화된 B 세포가 칼슘 이동, Ins(1,4,5)P₃ 생성, 및 Erk 및 Akt 인산화의 상당한 FcγRIIB-중재된 억제를 나타내는 것이 증명되었다 (Brauweiler et al . (2001) " Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells ", Journal of Immunology, 167(1):204-211). 따라서 SHIP 결핍 마우스로부터의 생체 외 B 세포는 본 발명의 항체를 특성확인하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체에 의한 BCR 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 측정하기 위한 한 가지 예시적인 분석은 다음을 포함할 수 있다: SHIP 결핍 마우스로부터 비장의 B 세포를 분리하는 것, 상기 세포를 리포다당으로 활성화시키는 것, 그리고 상기 세포를 BCR을 응집하기 위하여 F(ab')₂ 항-IgM으로 또는 BCR과 FcγRIIB를 공동응집하기 위하여 무상 항-IgM으로 자극하는 것. BCR과 FcγRIIB를 공동응집하기 위하여 무상 항-IgM으로 자극된 세포는 추가로 본 발명의 항체와 사전 인큐베이션될 수 있다. 세포의 FcγRIIB-의존성 활성은 해당 기술분야에 공지된 표준 기법에 의해 측정될 수 있다. 항체와 사전 인큐베이션된 세포와 사전 인큐베이션되지 않은 세포에서의 FcγRIIB-의존성 활성 수준을 비교하고, 수준을 비교하는 것은 항체에 의한 FcγRIIB-의존성 활성의 조절을 가리킬 것이다.

FcγRIIB-의존성 활성을 측정하는 것은 예를 들면 유동 세포분석법에 의해 세포 내 칼슘 이동을 측정하는 것, Akt 및/또는 Erk의 인산화를 측정하는 것, PI(3,4,5)P₃의 BCR-중재된 축적을 측정하는 것, 또는 B 세포의 FcγRIIB-중재된 증식을 측정하는 것을 포함한다.

분석법은 예를 들면 BCR 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를, FcγRIIB 및 BCR의 공동응집을 방지함으로써 FcγRIIB 수용체에 대한 리간드 (IgG) 결합 부위를 차단하고 BCR 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 길항함으로써 조절하는, 본 발명에 사용하기 위한 이중체 또는 항-FcγRIIB 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 분석법은 또한 FcγRIIB와 BCR의 공동응집을 증강시키고 BCR 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 아고나이즈하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

항-FcγRIIB 항체는 사람 단핵세포/대식세포에서 FcγRII-중재된 신호화에 대해 분석될 수 있다. FcγRIIB와 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하고 있는 수용체와의 공동응집은 그것의 이펙터로서 SHIP을 사용하는 FcγR-중재된 식세포 작용을 하향 조절하는 작용을 한다 (Tridandapani et al . (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells ", J. Biol. Chem., 277(7):5082-5089). FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집은 FcγRIIB의 ITIM 모티프 상의 티로신 잔기의 신속한 인산화를 초래하고, 그것은 SHIP의 인산화의 증강, SHIP과 Shc와의 결합, 및 120의 분자량 및 60 내지 65kDa의 단백질의 인산화를 유도한다. 또한 FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집은 세포 조절에 포함되고 아폽토시스를 억제하는 작용을 하는 세린-트레오닌 키나아제인 Akt의 인산화의 하향 조절을 유발한다.

항-FcγRIIB 이중체는 또한 사람 단핵세포/대식세포에서 FcγR-중재된 식세포 작용에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어 사람 단핵세포 셀라인으로부터 세포인 THP-1은 FcγRII에 대한 마우스 단클론성 항체 IV.3의 Fab 단편 및 염소 항-마우스 항체 중 어느 것으로 (FcγRIIA를 단독으로 응집하기 위하여), 또는 전체 IV.3 마우스 단클론성 항체 및 염소 항-마우스 항체로 (FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집을 위하여) 자극될 수 있다. 이 시스템에서, 하류 신호화 분자의 조절, 예컨대 FcγRIIB의 티로신 인산화, SHIP의 인산화, SHIP과 Shc와의 결합, Akt의 인산화, 및 120의 분자량을 가지고 60 내지 65kDa인 단백질의 인산화는 본 발명의 분자가 자극된 세포에 첨가될 때 분석될 수 있다. 또한 단핵세포 셀라인의 FcγRIIB-의존성 식세포작용 효율은 본 발명의 항체의 존재 및 부재시에 직접 측정될 수 있다.

본 발명의 항체에 의한 사람 단핵세포/대식세포에서의 FcγR-중재된 식세포작용의 억제를 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석은 다음을 포함할 수 있다: THP-1 세포를 IV.3 마우스 항-FcγRII 항체 및 염소 항-마우스 항체 중 어느 하나로 (FcγRIIA를 단독으로 응집하고 FcγRIIA-중재된 신호화를 유도하기 위하여), 또는 항-FcγRII 항체 및 염소 항-마우스 항체로 (FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집과 FcγRIIA-주재된 신호화를 억제하기 위하여) 자극하는 것. 마우스 항-FcγRII 항체와 염소 항-마우스 항체로 자극된 세포는 추가로 본 발명의 분자와 사전 인큐베이션될 수 있다. 발명의 분자와 사전 인큐베이션된 자극된 세포와 발명의 항체와 사전 인큐베이션되지 않은 세포의 FcγRIIA-의존성 활성을 측정하는 것과 이들 세포에서의 FcγRIIA-의존성 활성 수준을 비교하는 것은 본 발명의 항체에 의한 FcγRIIA-의존성 활성의 조절을 가리킬 것이다.

기술된 예시적인 분석은 예를 들면 FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집을 방지함으로써 FcγRIIB 수용체의 리간드 결합을 차단하고 FcγRIIA의 FcγRIIB-중재된 억제를 길항하는 결합 도메인을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 분석은 마찬가지로 FcγRIIA와 FcγRIIB의 공동응집을 증강시키고 FcγRIIA 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 아고나이즈하는 결합 도메인을 확인한다.

관심의 FcγRIIB 결합 도메인은 I 항체를 포함하는 한편 플루오레세인 처리된 IgG-옵소닌화된 양 적혈구 (SRBC)를 이미 전에 설명된 방법에 의해 식세포 작용을 하는 THP-1 세포의 능력을 측정함으로써 분석될 수 있다 (Tridandapani et al . (2000) " The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor - Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells ", J. Biol. Chem. 275:20480-7). 예를 들어 식세포작용을 측정하기 위한 예시적인 분석법은 다음을 포함한다: THP-1 세포를 본 발명의 항체로 또는 FcγRII에 결합하지 않는 대조 항체로 처리하는 것, 상기 세포들의 활성 수준을 비교하는 것, 이때 세포의 활성 (예컨대 로세팅 활성 (THP-1 세포 결합 IgG-코팅된 SRBC의 수), 부착 활성 (THP-1 세포에 결합된 SRBC의 총 수), 및 식세포 작용 속도)의 차이는 본 발명의 항체에 의한 FcγRIIA-의존성 활성의 조절을 가리킬 것이다. 이 분석법은 예를 들면 FcγRIIB 수용체의 리간드 결합을 차단하고 식세포 작용의 FcγRIIB-중재된 억제를 길항하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 분석법은 또한 FcγRIIA 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제를 증강시키는 항체를 확인할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합 도메인은 사람 단핵세포/대식세포에서 최소한 하나 또는 그 이상의 다음 방법으로 FcγRIIB-의존성 활성을 조절한다: 하류 신호화 분자들의 조절 (예컨대 FcγRIIB의 인산화 상태의 조절, SHIP 인산화의 조절, SHIP 및 Shc 결합의 조절, Akt의 인산화의 조절, 대략 120의 분자량 및 60 내지 65kDa의 추가 단백질의 인산화의 조절) 및 식세포 작용의 조절.

1.2 CD16A 결합 도메인

아래의 단원은 공유 이중체 제조를 위한 경새 및 중쇄 가변 영역에 대한 공급원으로서 사용될 수 있는 CD16A 결합 단백질에 대해 논의한다. 본 발명에서 CD16A 결합 단백질은 항-CD16A 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 분자를 포함하고, 그 VH 및 VL 도메인은 본 발명의 이중체의 제조에 사용된다.

다양한 CD16A 결합 단백질이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 적당한 CD16A 결합 단백질로는 사람 또는 인간화된 단클론성 항체뿐 아니라 CD16A 결합 항체 단편 (예컨대 scFv 또는 단일 사슬 항체, Fab 단편, 미니바디) 및 경쇄 가변 영역 도메인, 중쇄 가변 영역 도메인, 또는 둘 다와의 상호작용을 통해 CD16A에 결합하는 다른 항체-유사 단백질을 포함한다.

어떤 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 CD16A 결합 단백질은 비-사람 항-CD16A 항체, 예컨대 마우스 항-CD16A 항체로부터 유도된 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 CDR과, 하나 또는 그 이상의 사람 면역글로불린의 프레임워크 서열로부터 유도된 하나 또는 그 이상의 프레임워크 영역을 가지는 VL 및/또는 VH 도메인을 포함한다. CDR 및 다른 서열들이 얻어질 수 있는 비-사람 항-CD16A 단클론성 항체가 많이 공지되어 있다 (Tamm et al . (1996) " The Binding Epitopes Of Human CD16 ( Fc gamma RIII ) Monoclonal Antibodies . Implications For Ligand Binding", J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al . (1989) p.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al ., eds. New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis). 또한, 하기 실시예에서 나타나는 것과 같이, 세포상에 발현된 사람 CD16A를 인식하는 새로운 CD16A 결합 단백질은 단클론성 항체 및 관련된 결합 단백질의 제조 및 선택을 위한 잘 알려져 있는 방법들 (예컨대 하이브리도마 기술, 파지 디스플레이 등)을 사용하여 얻어질 수 있다: 예를 들면 O'Connell et al . (2002) " Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies", J. Mol. Biol. 321:49-56; Hoogenboom et al . (2000) " Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology ", Imm. Today 21:371078; Krebs et al . (2001) " High - Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies ", J. Imm. Methods 254:67-84; 및 본원에 인용된 다른 참고문헌들. 비-사람 종으로부터의 단클론성 항체는 해당 기술분야에 공지되어 있는 항체 인간화 기법을 사용하여 키메릭화되거나 인간화될 수 있다.

또는 달리 CD16A에 대한 전체 사람 항체는 사람 면역 시스템의 요소들을 가지는 유전자 도입 동물을 사용하여 (미국 특허 5,569,825호 및 5,545,806호 참조), 사람 말초혈 세포를 사용하여 (Casali et al . (1986) " Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV ", Science 234:476-479), 문헌에 개략적으로 설명된 일반적인 프로토콜 (Huse et al . (1989) " Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda ", Science 246:1275-1281)을 따라 사람 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 선별함으로써, 그리고 다른 방법들에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 결합 공여체는 3G8 항체 또는 그것의 인간화된 버전, 에컨대 미국 특허 출원 공보 2004/0010124에 개시된 것들로부터 유래된다. 어떤 목적에 대해서는 3G8에 의해 동일한 에피토프에서 결합된 CD16A 수용체에 결합하는, 또는 3G8에 의한 결합을 차단하기 위해 이 에피토프에 충분히 밀접하게 위치한 CD16A 결합 단백질을 사용하는 것이 유익할 것이라고 여겨진다. 원하는 결합 특성을 가지는 결합 단백질을 확인하기 위한 에피토프를 지도화하는 방법 및 경합성 결합 실험들은 실험적 면역학의 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다 (Harlow and Lane, 상기 동일; Stahli et al . (1983) " Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies ", Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al . (1986) " Analysis Of The Fine Specificity And Cross - Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies ", J. Immunol. 137:3614-3619; Morel et al . (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin : Affinity And Specificity Determinations", Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al . (1990) " Epitope -Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks ", Virology 176:546-552; 및 Moldenhauer et al . (1990) "Identity Of HML -1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B- ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia ", Scand. J. Immunol. 32:77-82). 예를 들어 만약 두 개의 항체가 ELISA 플레이트 상의 항원을 포획하기 위하여 항체들 중 하나를 사용함으로써 동일한 부위에 결합한다면 두 번째 항체가 포획된 항원에 결합하는 능력을 측정하는 것이 가능하다. 에피토프 비교는 또한 첫 번째 항체를 직접 또는 간접적으로 효소, 방사성 핵종 또는 플루오로포어로 표지하고, 용액 중에서 또는 고체 상에서 미표지된 두 번째 항체가 첫 번째 항원의 세포 상의 항원에의 결합을 억제하는 능력을 측정함으로써 이루어질 수 있다.

또한 ELISA 플레이트 상에 형성된 면역 복합체에의 CD16A 수용체의 결합을 차단하는 항체의 능력을 측정하는 것이 가능하다. 그런 면역 복합체는 플루오레세인과 같은 항원으로 플레이트를 먼저 코팅한 후, 그 플레이트에 특이한 항-플루오레세인 항체를 적용함으로써 형성된다. 이 면역 복합체는 그런 다음 sFcRIIa와 같은 가용성 Fc 수용체에 대한 리간드로서 작용한다. 또는 달리 가용성 면역 복합체는 형성된 후 직접 또는 간접적으로 효소 방사성 핵종 또는 플루오로포어로 표지될 수 있다. 그런 다음 항체가 세포 상의 Fc 수용체에 대한 이들 표지된 면역 복합체의 결합을 용액 중에서 또는 고체 상에서 억제하는 능력이 측정될 수 있다.

본 발명의 CD16A 결합 단백질은 사람 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어 Fc 영역은 scFv 결합 단백질에는 존재하지 않는다. Fc 영역은 예를 들면 사람 또는 인간화된 사량체 단클론성 IgG 항체에 존재한다. 상기에서 설명된 것과 같이, 본 발명의 어떤 구체예에서, CD16A 결합 단백질은 변경된 이펙터 기능, 예컨대 변경되지 않은 Fc 영역 (예컨대 천연 발생 IgG1 단백질의 Fc)에 비교하여 보체의 C1 성분 또는 Fc 수용체와 같은 이펙터 리간드에 대한 감소된 친화성을 가지는 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, Fc 영역은 위치 297에 상응하는 Fc 영역 아미노산에서 글리코실화되지 않는다. 그런 항체는 Fc 이펙터 기능이 결핍되어 있다.

그러므로 CD16A 결합 단백질은 결합 단백질의 Fc 도메인의 부재로 인해 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분과 같은 이펙터 리간드에 대해 Fc-중재된 결합을 나타내지 않을 수 있는 반면, 다른 경우에 결합 또는 이펙터 기능의 결핍은 항체의 불변 영역의 변경으로 인한 것이다.

1.2.1 mAb 3 G8 CDR 서열에 유사한 CDR 서열을 포함하는 CD16A 결합 단백질

본 발명의 실시에 사용될 수 있는 CD16A 결합 단백질은 마우스 단클론성 항체 3G8의 CDR로부터 유도된 CDR 서열을 포함하는 (즉 그것과 동일하거나 유사한 서열을 가지는) 단백질을 포함한다. 마우스 3G8 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코드화하는 상보하는 cDNA는 CDR 코딩 서열을 포함하여, 설명된 것과 같이 클론되고 서열화되었다. 3G8의 핵산 및 단백질 서열은 아래에 제공된다. 마우스 가변 영역 및 CDR 서열을 사용하여, 3G8 CDR로부터 유도된 상보하는 결정 영역을 포함하는 대다수의 키메릭 및 인간화된 단클론성 항체가 제조되었고, 그것들의 특성이 분석되었다. 고친화성으로 CD16A에 결합하고 다른 바람직한 특성을 가지는 인간화된 항체를 확인하기 위하여, 3G8로부터 유도된 CDR을 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체 중쇄가 제조되었고, 3G8로부터 유도된 CDR을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 경쇄와 조합되어 (공동발현에 의해) 분석을 위한 사량체 항체가 제조되었다. 그 결과의 사량체 항체의 특성은 아래에서 설명되는 것과 같이 측정되었다. 아래에서 설명되는 것과 같이, 3G8 CDR을 포함하는 CD16A 결합 단백질, 예컨대 본원에서 설명된 인간화된 항체 단백질은 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

1.2.1.1 VH 영역

한 측면으로, 본 발명의 CD16A 결합 단백질은 최소한 하나의 CDR (및 통상적으로 3개의 CDR)이 마우스 단클론성 항체 3G8 중쇄의 CDR (보다 전형적으로는 3개의 모든 CDR)의 서열을 가지고, 그것에 대한 결합 단백질의 나머지 부분이 실질적으로 사람의 것인 (사람 항체 또는 항체들의 중쇄 가변 영역으로부터 유도되고 실질적으로 그것에 유사한) 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.

한 측면으로, 본 발명은 실질적으로 사람 프레임워크의 3G8 항체로부터 유도된 CDR을 포함하는 인간화된 3G8 항체 또는 항체 단편을 제공하지만, 이때 중쇄 가변 도메인의 CDR의 최소한 하나는 상응하는 마우스 항체 3G8 중쇄 CDR과는 서열이 다르다. 예를 들어 한 구체예에서, CDR(들)은 해당 기술분야에 알려져 있거나 아래의 표 3과 4A-H에 나타나 있는 것과 같이, 최소한 CD16A에 대한 3G8의 결합에 영향을 미치는 것으로 해당 기술분야에 알려져 있는 하나 또는 그 이상의 CDR 치환을 가진다는 점에서 3G8 CDR 서열과 상이하다. 적당한 CD16 결합 단백질은 0, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이들 치환을 포함할 수 있고 (및 때로는 이들 치환 중 1 내지 4개를 가진다) 임의로 추가의 치환도 가질 수 있다.

표 3. VH 도메인 치환

표 4a. 3G8 V_H로부터 유도된 V_H 서열*

*: 표 4A의 문자는 표 4B에서 H까지의 서열을 나타낸다.

표 4b. FR1

표 4c. CDR1

표 4d. FR2

표 4e. CDR2

표 4f. FR3

표 4g. CDR3

표 4h. FR4

한 구체예에서, CD16A 결합 단백질은 그것의 서열이 SEQ ID NO:68로 제공되는 Hu3G8VH-1의 VH 도메인과 동일하거나, 유사한 중쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명은 (1) Hu3G8VH-1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:68)과 상기 표 1에서 나타낸 CDR의 0, 1, 또는 그 이상의 치환만큼 다르고; (2) Hu3G8VH-1의 VH 도메인과 표 1에 나타낸 프레임워크의 0, 1 또는 하나 이상의 치환만큼 다르고; (3) 나머지 위치에서 Hu3G8VH-1 VH 서열에 대해 최소한 80% 동일한, 자주 최소한 약 90%, 및 때로는 최소한 약 95% 동일하거나, 또는 심지어 최소한 약 98% 동일한 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하는 CD16A 결합 단백질을 제공한다.

본 발명의 CD16 결합 단백질의 예시적인 VH 도메인은 3G8VH, Hu3G8VH-5 및 Hu3G8VH-22의 서열을 가진다 (각각 SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70). 3G8VH 및 Hu3G8VH-5의 서열 (각각 SEQ ID NO:79 및 SEQ ID NO:69)을 코드화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:80과 SEQ ID NO:81에 의해 제공된다.

VH 도메인은 Hu3G8VH-1의 서열 (SEQ ID NO:68)과 표 3에 제시된 치환의 최소한 하나, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 또는 최소한 6개의 치환만큼 상이하다. 이들 치환은 CD16A에 대한 친화성의 증가 및/또는 사람에게 투여될 때 CD16A 결합 단백질의 면역원성의 감소를 초래하는 것으로 여겨진다. 어떤 구체예에서, 나머지 위치들에서 Hu3G8VH-1 VH 도메인과의 서열 동일성의 정도는 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95% 또는 최소한 약 98%이다.

예시를 위해, 그리고 제한 없이, 많은 CD16A 구성 단백질 VH 도메인의 서열은 표 4에 제시된다. 사람 Cγ1 불변 영역에 융합된 이들 서열을 포함하는 중쇄는 hu3G8VL-1 경쇄 (아래에서 설명됨)와 공동발현되어 사량체 항체를 형성하고, CD16A에 대한 항체의 결합은 hu3G8VH-1 VH 도메인과 비교하여 아미노산 치환의 영향을 평가하기 위해 측정되었다. VH 도메인이 hu3G8VH-1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 및 45의 서열을 가지는 구성물은 높은 친화성 결합을 나타냈고, hu3G8VH-6 및 -40 VH 도메인은 중간 정도의 결합을 나타냈다. hu3G8VH-5 및 hu3G8VH-22 (각각 SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70)의 VH 도메인을 포함하는 CD16A 결합 단백질은 특히 선호할만한 결합 특성을 가지는 것으로 여겨진다.

1.2.2 VL 영역

선호할만한 결합 특성을 가지는 경쇄 가변 도메인 서열을 확인하기 위하여 유사한 연구가 수행되었다. 한 측면으로 본 발명은 최소한 하나의 CDR (및 통상적으로는 3개의 CDR)이 마우스 단클론성 항체 3G8 경쇄의 CDR (보다 전형적으로는 3개의 모든 CDR)의 서열을 가지고, 결합 단백질의 나머지 부분은 실질적으로 사람인 (사람 항체 또는 항체들의 중쇄 가변 영역으로부터 유도되거나 실질적으로 그것과 유사한) 경쇄 가변 도메인을 함유하는 CD16A 결합 단백질을 제공한다.

한 측면으로, 본 발명은 실질적으로 사람 프레임워크에 3G8 항체로부터 유도된 CDR을 함유하는 인간화된 3G8 항체의 단편을 제공하는데, 이때 경쇄 가변 도메인의 최소한 하나의 CDR은 마우스 단클론성 항체 3G8 경쇄 CDR과 서열이 다르다. 한 구체예에서, CDR(들)은 3G8 서열과 최소한 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예컨대 표 2에 제시된 하나 또는 그 이상의 치환을 CDR에 가진다는 점에서 상이하다 (예컨대 CDR1의 위치 24에서 아르기닌; CDR1의 위치 25에서 세린; CDR1의 위치 32에서 티로신; CDR1의 위치 33에서 류신; CDR2의 위치 50에서 아스파르트산, 트립토판 또는 세린; CDR2의 위치 53에서 세린; CDR2의 위치 55에서 알라닌 또는 글루타민; CDR2의 위치 56에서 트레오닌; CDR3의 위치 93에서 세린; 및/또는 CDR3의 위치 94에서 트레오닌). 다양한 구체예에서, 가변 도메인은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 이들 치환을 가지고 (자주 1 내지 4개의 이들 치환을 가진다), 임의로 추가의 치환도 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 적당한 CD16A 결합 단백질은 그 서열이 표 6에 제시된 Hu3G8VL-1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:71)과 동일한, 또는 그것과 유사한 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명은 (1) Hu3G8VL-1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:71)과 표 5에서 나타낸 CDR 치환의 0, 1, 또는 그 이상의 치환만큼 다르고; (2) Hu3G8VL-1의 VL 도메인과 표 5에 나타낸 프레임워크 치환의 0, 1 또는 그 이상의 치환만큼 다르고; (3) 나머지 위치에서 Hu3G8VL-1 VL 서열 (SEQ ID NO:71)에 대해 최소한 80% 동일한, 자주 최소한 약 90%, 및 때로는 최소한 약 95% 동일하거나, 또는 심지어 최소한 약 98% 동일한 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 CD16A 결합 단백질을 제공한다.

표 5. 3G8 V_L 도메인 치환

표 6a. 3G8 V_L로부터 유도된 V_L 서열*

*: 표 6A의 문자는 표 6B에서 H까지의 서열을 나타낸다.

표 6b. FR1

표 6c. CDR1

표 6d. FR2

표 6e. CDR2

표 6f. FR3

표 6g. CDR3

표 6h. FR4

본 발명의 CD16 결합 단백질의 예시적인 VL 도메인은 표 5 및 6에 나타낸 바와 같이 3G8VL, Hu3G8VL-1 또는 Hu3G8VL-43의 서열을 가진다 (각각 SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:72). 3G8VL (SEQ ID NO:82) 및 Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO:71)을 코드화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:83과 SEQ ID NO:84에 의해 제공된다.

VL 도메인은 Hu3G8VL-1의 서열 (SEQ ID NO:71)과 표 2에 제시된 치환의 0, 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 또는 최소한 9개의 치환만큼 상이하다. 이들 치환은 CD16A에 대한 친화성의 증가 및/또는 사람에게 투여될 때 CD16A 결합 단백질의 면역원성의 감소를 초래하는 것으로 여겨진다. 어떤 구체예에서, 나머지 위치들에서 서열 동일성의 정도는 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95% 또는 최소한 약 98%이다.

예시를 위해, 그리고 제한 없이, 많은 CD16A 결합 단백질 VL 도메인의 서열은 표 6에 제시된다. 사람 Cκ 불변 도메인에 융합된 이들 서열을 포함하는 경쇄는 Hu3G8VH 중쇄 (상기에서 설명됨)와 공동발현되어 사량체 항체를 형성하고, CD16A에 대한 항체의 결합은 Hu3G8VL-1 VL 도메인과 비교하여 아미노산 치환의 영향을 평가하기 위해 측정되었다. VL 도메인이 hu3G8VL-1, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 및 42의 서열을 가지는 구성물은 높은 친화성 결합을 나타냈고, hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 및 41은 중간 정도의 결합을 나타냈다. hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 및 hu3G8VL-43 의 VL 도메인을 포함하는 CD16A 결합 단백질은 특히 선호할만한 결합 특성을 가지는 것으로 여겨진다 (각각 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73 및 SEQ ID NO:72).

1.2.2.1 VL 및/또는 VH 도메인의 조합

해당 기술분야에 공지되고 본원에서 설명되는 것과 같이, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 그것들이 이중체를 생성하기 위해 결합하는 조건 하에서 재조합적으로 발현되거나, 또는 시험관 내에서 그렇게 조합될 수 있다. 그러므로 본원에서 설명된 3G8-유도된 VL-도메인은 본원에서 설명된 3G8-유도된 VH-도메인과 조합되어 CD16A 결합 이중체를 생성할 수 있고, 그런 조합은 모두 포함된다.

예시를 목적으로, 그리고 제한 없이, 유용한 CD16A 이중체의 실례는 최소한 하나의 VH 도메인과 최소한 하나의 VL 도메인을 포함하는 것들이고, 이때 VH 도메인은 hu3G8VH-1, hu3G8VH-22 또는 hu3G8VH-5 (각각 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70 및 SEQ ID NO:69)로부터 유래되고, VL 도메인은 hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 또는 hu3G8VL-43 (각각 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73 및 SEQ ID NO:41)으로부터 유래된다. 특히, hu3G8VH-22 (SEQ ID NO:22)와, hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 또는 hu3G8VL-43 (각각 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:70 및 SEQ ID NO:41), 또는 hu3G8VH-5 (SEQ ID NO:69) 중 하나와 hu3G8VL-1 (SEQ ID NO:71)을 포함하는 인간화된 항체는 선호할만한 특성을 가진다.

숙련자들에게는 본원에 설명된 VL 및 VH 도메인의 서열이 추가로 기술분야에 공지된 방법, 에컨대 친화성 성숙에 의해 변형될 수 있다는 것이 인식될 것이다 (Schier et al . (1996) " Isolation Of Picomolar Affinity Anti -C- ErbB -2 Single -Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site ", J. Mol. Biol. 263:551-567; Daugherty et al . (1998) " Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display", Protein Eng. 11:825-832; Boder et al . (1997) " Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries ", Nat. Biotechnol. 15:553-557; Boder et al . (2000) " Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen - Binding Affinity ", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97:10701-10705; Hudson et al . (2003) " Engineered Antibodies ", Nature Medicine 9:129-39). 예를 들어 CD16A 결합 단백질은 CD16A에 대한 증가된 친화성 및/또는 CD16B에 대한 감소된 친화성을 가지는 단백질을 확인하기 위한 친화성 성숙 기법을 사용하여 변형될 수 있다.

CD16 결합 단백질의 한 실례는 마우스 3G8 항체이다. 인간화된 3G8의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 도 2, 9, 14에 제시되고, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:72로 나타난다.

2. Fc 영역 또는 그것의 일부를 포함하는 이중체

본 발명은 Fc 도메인 또는 그것의 일부 (예컨대 CH2 또는 CH3 도메인)를 포함하는 이중체 분자를 포함한다. 어떤 구체예에서, Fc 도메인, 또는 그것의 일부는 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역의 하나 또는 그 이상의 불변 도메인(들) (예컨대 CH2 또는 CH3)을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 도메인 또는 그것의 일부를 포함하는 분자를 포함하는데, 이때 상기 Fc 도메인 또는 그것의 일부는 비교되는 야생형 Fc 도메인 또는 그것의 일부와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형 (예컨대 치환)을 포함한다. 변이체 Fc 도메인은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 결합 활성 또는 이펙터 기능 분석 중 어느 것, 예컨대 ELISA, SPR 분석, 또는 ADCC로 분석되는 것과 같이, 상기 변이체 Fc 도메인을 포함하는 항체의 표현형을 변경하기 위해 주로 사용된다. 그런 변이체 Fc 도메인, 또는 그것의 일부는 본 발명에서 기능적으로, 예컨대 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석에서 분석되는 것과 같이, Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 본 발명의 이중체 분자에 의해 나타난 이펙터 기능을 부여하거나 변형시키는 용도로 사용된다. 이펙터 기능을 변경시키는 것으로 확인된 Fc 도메인 변이체는 본 발명자들의 동시 출원인 국제 출원 WO04/063351, 미국 특허 출원 공보 2005/0037000 및 2005/0064514, 미국 임시 출원 60/626,510 (2004. 11. 10. 출원), 60/636,663 (2004. 12. 15. 출원), 및 60/781,564 (2006. 3. 10. 출원), 및 미국 특허 출원 11/271,140 (2005. 11. 10. 출원) 및 11/305,787 (2005. 12. 15. 출원)에서 개시된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 해당 기술분야에 공지되어 있고, 다음 문헌들에서 개시된 것과 같은 어떠한 Fc 변이체의 사용을 포함한다: Duncan et al . (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High - Affinity Fc Receptor On IgG", Nature 332:563-564; Lund et al . (1991) " Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG ", J. Immunol. 147:2657-2662; Lund et al . (1992) " Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII ", Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al . (1994) "A Non - Activating " Humanized " Anti - CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo ", Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al . (1995) " Improved Biodistribution , Tumor Targeting , And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath -1H", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11980-11984; Jefferis et al . (1995) " Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors : The Role Of Glycosylation ", Immunol. Lett. 44:111-117; Lund et al . (1995) " Oligosaccharide - Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors ", FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al . (1996) " Modulation Of Fc ( Gamma )R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions ", Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) " Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains ", J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al . (1999) " Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities ", Eur. J. Immunol. 29:2613-2624; Idusogie et al . (2000) " Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Fc ", J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al . (2000) " Elimination Of Fc Receptor - Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 ", J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al . (2000) " In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies ", Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al . (2001) " Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement ", J. Immunol. 166:2571-2575; Shields et al . (2001) " High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma RI , Fc gamma RII , Fc gamma RIII , And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R", J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Jefferis et al . (2002) " Interaction Sites On Human IgG - Fc For FcgammaR : Current Models ", Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al . (2002) " Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function ", Biochem. Soc. Trans. 30:487-490; US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572.

어떤 구체예에서, 상기 Fc 영역의 아미노산의 하나 또는 그 이상의 변형은 Fc 영역의 친화성 및 결합 능력을 감소시키고, 그로써 본 발명의 이중체 분자의 하나 또는 그 이상의 FcγR 수용체에 대한 친화성 및 결합 능력도 감소시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역, 또는 그것의 일부를 포함하는 이중체를 포함하고, 이때 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 그 변이체 Fc 영역은 하나의 FcγR에만 결합하고, 이때 상기 FcγR은 FcγRIIIA이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역, 또는 그것의 일부를 포함하는 이중체를 포함하고, 이때 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 그 변이체 Fc 영역은 하나의 FcγR에만 결합하고, 이때 상기 FcγR은 FcγRIIA이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역, 또는 그것의 일부를 포함하는 이중체를 포함하고, 이때 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 그 변이체 Fc 영역은 하나의 FcγR에만 결합하고, 이때 상기 FcγR은 FcγRIIB이다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함하는데, 이때 상기 변이체는 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있고 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 측정되는 바, Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자에 비교하여, 증가된 ADCC 활성 및/또는 증가된 FcγRIIA (CD32A)에 대한 결합을 부여하거나 중재한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함하는데, 이때 상기 변이체는 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있고 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 측정되는 바, Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자에 비교하여, 감소된 ADCC 활성 (또는 다른 이펙터 기능) 및/또는 증가된 FcγRIIB (CD32B)에 대한 결합을 부여하거나 중재한다.

본 발명은 또한 둘 또는 그 이상의 IgG 이소타입으로부터의 도메인 또는 영역을 포함하는 Fc 도메인의 용도를 포함한다. 해당 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, Fc 영역의 아미노산 변형은 Fc-중재된 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 크게 영향을 미칠 수 있다. 그러나 기능적 특성에서의 이들 변경은 선택된 IgG 이소타입의 맥락에서 시행될 때 추가로 개량되고 및/또는 조작될 수 있다. 유사하게, 이소타입 Fc의 천연 특성은 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형에 의해 조작될 수 있다. 다중 IgG 이소타입 (즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 그것들의 힌지 및/또는 Fc 도메인의 아미노산 서열의 차이로 인해 혈청 반감기, 보체 고정, FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성 (예컨대 ADCC, CDC)을 포함하여 상이한 물리적 및 기능적 특성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 영역은 원하는 특성을 가지는 이중체를 공학적으로 조작하기 위하여 그것들의 각각의, 별도의 결합 및/또는 이펙터 기능 활성을 토대로 독립적으로 선택된다. 대부분의 구체예에서, 상기 아미노산 변형과 IgG 힌지/Fc 영역은 본원에 기술되거나 해당 기술분야에 공지된 것과 같이 IgG1의 맥락에서 결합 및/또는 이펙터 기능 활성에 대해 별도로 분석될 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 영역은 이중체 분자 또는 다른 Fc-함유 분자 (예컨대 및 면역글로불린)의 맥락에서 FcγR 결합 또는 이펙터 기능에 대해 별도로 분석될 때 유사한 기능성, 예컨대 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 나타낸다. 상기 아미노산 변형 및 선택된 IgG Fc 영역의 조합은 그런 다음 추가적으로, 또는 보다 바람직하게는 상조적으로, 야생형 Fc 영역을 포함하는 발명의 이중체 분자와 비교하여 본 발명의 이중체 분자의 상기 기능성을 변형시키는 작용을 한다. 다른 구체예에서 상기 아미노산 변형 및 IgG Fc 영역은 본원에서 기술되고 해당 기술분야에 공지되어 있는 것과 같이 야생형 Fc 영역을 포함하고 있는 이중체 분자 또는 다른 Fc 함유 분자 (예컨대 면역글로불린)의 맥락에서 FcγR 결합 및/또는 이펙터 기능에 대해 별도로 분석될 때, 반대 기능, 예컨대 FcγRIIA에 대한 각각 증가되고 감소된 친화성을 나타낸다; 상기 "반대" 아미노산 변형 및 선택된 IgG 영역의 조합은 그런 다음 Fc 영역을 포함하지 않거나 동일한 이소타입의 야생형 Fc 영역을 포함하고 있는 발명의 이중체와 비교하여 발명의 이중체의 특이한 기능성을 선택적으로 강화하거나 감소시킨다. 또는 달리 본 발명은 해당 기술분야에 공지되어 있는 아미노산 변형과 신규한 특성을 나타내는 선택된 IgG 영역의 조합을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 그 특성은 상기 변형 및/또는 영역이 본원에 기술된 것과 같이 독립적으로 분석될 때 검출될 수 없었다.

다중 IgG 이소타입, 및 그것의 도메인의 기능적 특성들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 아미노산 서열은 도 1A-1B에 표시된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 특이한 IgG 이소타입으로부터의 둘 또는 그 이상의 도메인의 선택 및/또는 조합은 FcγR에 대한 친화성을 포함하여 원래의 이소타입의 어떠한 공지된 변수를 토대로 이루어질 수 있다 (표 7; Flesch et al . (2000) " Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G", J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al . (1993) " Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody ", J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al . (1991) " Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1 / IgG2 Hybrid And Point - Mutated Antibodies ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040). 예를 들어 FcγRIIB에 대해 제한된 결합을 나타내거나 결합하지 않는 IgG 이소타입, 예컨대 IgG2 또는 IgG4로부터의 영역 또는 도메인의 사용은 이중체가 활성화 수용체에 대한 결합을 최대화하고 억제성 수용체에 대한 결합을 최소화하기 위하여 공학적으로 조작되는 것이 요구되는 경우에 특별히 사용될 수 있다. 유사하게 C1q 또는 FcγRIIIA에 우선적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 IgG 이소타입, 예컨대 IgG3 (Bruggemann et al . (1987) " Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies", J. Exp. Med. 166:1351-1361)으로부터의 Fc 영역 또는 도메인의 사용은 이펙터 기능 활성, 예컨대 보체 활성화 또는 ADCC가 최대화되도록 이중체 분자를 공학적으로 조작하기 위해, ADCC를 증강시키는 것으로 해당 기술분야에 공지되어 있는 Fc 아미노산 변형과 조합될 수 있다.

표 7. Flesch와 Neppert (1999, J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156)로부터 채택된 FcγR에 결합하는 IgG의 일반적인 특성

A: 복합체를 형성한 IgG에만 결합한다.

3. 분자 포합체

본 발명의 이중체 분자는 이종성 폴리펩티드 (즉 비관련 폴리펩티드; 또는 그것의 일부)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 포합되어 (공유 및 비-공유적 포합 둘 다 포함함) 바람직하게는 최소한 10, 최소한 20, 최소한 30, 최소한 40, 최소한 50, 최소한 60, 최소한 70, 최소한 80, 최소한 90 또는 최소한 100 아미노산의 폴리펩티드가 융합 단백질을 생성할 수 있다. 융합은 반드시 직접적일 필요는 없지만 링커 서열을 통해 일어날 수 있다.

나아가 발명의 이중체 분자 (즉 폴리펩티드)는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료제 또는 약물 부분에 포합될 수 있다. 직접 포합에 대한 대안으로서, 다가, 예컨대 발명의 4가 이중체 분자 상의 다중 에피토프 결합 부위로 인해 이중체의 최소한 하나의 결합 영역은 이중체 결합에 영향을 미치지 않으면서 치료제 또는 원하는 약물 부분에 결합하도록 디자인될 수 있다.

치료제 또는 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 가지고 있는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그런 단백질은 예를 들면 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 (즉 PE-40), 또는 디프테리아 독소, 리신, 젤로닌, 및 포키위드 항바이러스 단백질, 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 인터페론, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 α-인터페론 (IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 아폽토시스 유발제 (예컨대 TNF-α, TNF-β, PCT 공보 WO97/33899에 개시되어 있는 것과 같은 AIM I), AIM II (PCT 공보 WO 97/34911), Fas 리간드, 및 VEGI (PCT 공보 WO 99/23105), 혈전증 제제 또는 항-혈관신생제 (예컨대 안지오스타틴 또는 엔도스타틴), 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대 림포카인, 예컨대 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 및 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 대식세포 콜로니 자극 인자 ("M-CSF"), 또는 성장인자 (예컨대 성장 호르몬 ("GH")); 프로테아제, 또는 리보뉴클레아제를 포함한다.

발명의 이중체 분자 (즉 폴리펩티드)는 정제를 용이하게 하기 위해 마커 서열, 예컨대 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 다른 것들 중에서도 pQE 벡터에 제공된 태그 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)이고, 다른 것들도 상업적으로 활용가능하다. 문헌에 기술되어 있는 것과 같이 (Gentz et al . (1989) "Bioassay For Trans - Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein : Trans - Activation Requires mRNA Synthesis ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824), 예를 들면 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그로는, 그것에 한정되는 것은 아니지만 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 "HA" 태그 (Wilson et al . (1984) " The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein ", Cell, 37:767-778) 및 "플래그" 태그 (Knappik et al . (1994) " An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments ", Biotechniques, 17(4):754-761)가 있다.

추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (포괄적으로 "DNA 셔플링"으로 언급된다)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 발명의 분자의 활성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 더 큰 친화성 및 더 낮은 분해 속도를 가지는 에피토프 결합 부위) (일반적으로 미국 특허 5,605,793호; 5,811,238호; 5,830,721호; 5,834,252호; 및 5,837,458호, 및 Patten et al . (1997) " Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines", Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) " Artificial Evolution By DNA Shuffling ", Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al . (1999) " Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling ", J. Mol. Biol. 287:265-276; 및 Lorenzo et al . (1998) " PCR - Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus ", BioTechniques 24:308-313; 이들 특허와 공보는 각각 본원에 그 전체가 참조되는 것으로 포함된다). 발명의 이중체 분자, 또는 발명의 분자를 코드화하는 핵산은 추가로 오류가 나기 쉬운 (error-prone) PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 재조합 전의 다른 방법들에 의해 무작위 돌연변이생성이 이루어짐으로써 변경될 수 있다. 발명의 분자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 부분들은 하나 또는 그 이상의 이종성 분자의 하나 또는 그 이상의 성분, 모티프, 구획, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

본 발명은 또한 진단 또는 치료제 또는 그것에 대한 혈청 반감기가 증가/감소되거나 및/또는 세포의 특별한 하위세트에 대해 표적화되기를 원하는 어떠한 다른 분자에 포합되거나 그것을 면역특이적으로 인식하는 발명의 이중체 분자를 포함한다. 발명의 분자는 진단학적으로, 예를 들면 주어진 치료 양생법의 효능을 측정하기 위하여 임상 시험 과정의 일부로서 질병, 장애 또는 감염의 발달 또는 진전을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 검출은 발명의 분자를 검출가능한 물질에 결합시킴으로써 또는 검출가능한 물질을 면역특이적으로 인식하는 분자에 의해 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 실례로는 다양한 효소, 보결 기, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 검출가능한 물질은 발명의 분자에 직접 또는 해당 기술분야에 공지되어 있는 기법을 사용하여 중간체 (예컨대 해당 기술분야에 공지되어 있는 링커)를 통해 간접적으로 결합 또는 포합될 수 있고, 또는 분자는 검출가능한 물질을 면역특이적으로 인식할 수 있다: 상기 물질에 면역특이적으로 결합한다. 예를 들어 미국 특허 4,741,900호에는 본 발명에 따라 진단제로 사용하기 위한 항체에 포합될 수 있는 금속 이온이 개시되어 있다. 그런 진단 및 검출은 분자가 검출가능한 물질을 면역특이적으로 인식하도록 디자인함으로써 또는 발명의 분자를 검출가능한 물질, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 물질에 결합시킴으로써 이루어질 수 있다: 다양한 효소, 효소, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결 기 복합체, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비스무스 (²¹³Bi), 탄소 (¹⁴C), 크로뮴 (⁵¹Cr), 코발트 (⁵⁷Co), 플루오르 (¹⁸F), 가돌리늄 (¹⁵³Gd, ¹⁵⁹Gd), 갈륨 (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), 게르마늄 (⁶⁸Ge), 홀뮴 (¹⁶⁶Ho), 인듐 (¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In, ¹¹¹In), 요오드 (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), 란타늄 (¹⁴⁰La), 루테튬 (¹⁷⁷Lu), 망간 (⁵⁴Mn), 몰리브덴 (⁹⁹Mo), 팔라듐 (¹⁰³Pd), 인 (³²P), 프라세오디뮴 (¹⁴²Pr), 프로메튬 (¹⁴⁹Pm), 레늄 (¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re), 로듐 (¹⁰⁵Rh), 루테뮴 (⁹⁷Ru), 사마륨 (¹⁵³Sm), 스칸듐 (⁴⁷Sc), 셀레늄 (⁷⁵Se), 스트론튬 (⁸⁵Sr), 황 (³⁵S), 테크네튬 (⁹⁹Tc), 탈륨 (²⁰¹Ti), 주석 (¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn), 트리튬 (³H), 크세논 (¹³³Xe), 이테르븀 (¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb), 이트륨 (⁹⁰Y), 아연 (⁶⁵Zn); 다양한 양전자 방출 단층 촬영법을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온.

발명의 이중체 분자는 세포독소 (예컨대 세포정지 또는 세포파괴 제제)치료제 또는 방사능 요소 (예컨대 알파-방사체, 감마-방사체 등)를 면역특이적으로 인식하거나 또는 그것들에 포합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 어떠한 제제를 포함한다. 예를 들면 다음과 같은 것들이 있다: 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 그것들의 유사체 또는 상동체. 치료제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 항대사물질 (예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대 메클로로에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플라티늄 (II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예컨대 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생물질 (예컨대 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 유사분열 억제제 (예컨대 빈크리스틴 및 빈블라스틴).

더욱이 본 발명의 이중체 분자는 방사성 금속 이온과 포합하기에 유용한 방사능 물질 또는 대환식 킬레이터와 같은 치료 부분에 포합되거나 또는 그것을 면역특이적으로 인식하도록 디자인될 수 있다. (방사능 물질의 실례에 대해서는 상기 참조). 어떤 구체예에서, 대환식 킬레이터는 링커 분자를 통해 폴리펩티드에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA)이다. 그런 링커 분자는 통상적으로 기술분야에 공지되어 있고 문헌에서도 설명되어 있다 (Denardo et al . (1998) " Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N",N'''-Tetraacetic Acid ( DOTA )- Peptide - ChL6 , A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker , To 2- Iminothiolane -2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast Cancer Xenografts ", Clin. Cancer Res. 4:2483-2490; Peterson et al . (1999) " Enzymatic Cleavage Of Peptide -Linked Radiolabels From Immunoconjugates ", Bioconjug. Chem. 10:553-; 및 Zimmerman et al , (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67- Cu - Labeled Anti - Neuroblastoma mAb chCE7 F( ab' )2 Fragments", Nucl. Med. Biol. 26:943-950).

그런 치료 부분, 이를테면 예컨대 Fc 도메인을 폴리펩티드에 포합시키기 위한 기법은 잘 알려져 있다: Arnon et al ., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al ., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2 nd Ed .), Robinson et al . (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy , Baldwin et al . (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; and Thorpe et al . (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody - Toxin Conjugates ", Immunol. Rev., 62:119-158.

발명의 이중체 분자는 그것에 포합된 치료 부분과 함께 또는 그것 없이, 또는 단독으로, 또는 치료를 위한 치료제로서 사용하기 위한 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토킨(들)과 조합하여 투여될 수 있다. 단독으로 투여되는 경우, 다가, 예컨대 사가의 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프는 발명의 분자와 동시에 또는 이어서 투여될 수 있는 치료제, 예컨대 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토킨(들)을 면역특이적으로 인식하도록 디자인될 수 있다. 이런 방식으로 이중체 분자는 직접 포합과 유사한 방식으로 치료제를 특이하게 표적화할 수 있다. 또는 달리 발명의 분자는 Segal의 미국 특허 4,676,980호에 기술되어 있는 것과 같이 항체 이종포합체를 형성하기 위하여 항체에 포합될 수 있다. 발명의 이중체 분자는 또한 고체 지지체에 부착될 수 있는데, 그것은 특히 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 유용하다. 그런 고체 지지체로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이 있다.

이중체 분자의 결합의 특성확인

본 발명의 이중체 분자는 다양한 방법으로 특성확인될 수 있다. 특히 발명의 분자는 항원, 예컨대 FcRIIIA 또는 FcRIIB에 면역특이적으로 결합하는 능력, 또는 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 경우에는 Fc-FcγR 상호작용, 즉 Fc 도메인의 FcγR에 대한 특이한 결합을 나타내는 능력에 대해 분석될 수 있다. 그러한 분석은 용액 중에서 (Houghten (1992) " The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides ", BioTechniques, 13:412-421), 비즈 상에서 (Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand - Binding Activity ", Nature, 354:82-84), 칩 상에서 (Fodor (1993) " Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips", Nature, 364:555-556), 박테리아 상에서 (미국 특허 5,223,409호), 포자 상에서 (미국 특허 5,571,698호; 5,403,484호; 및 5,223,409호), 플라스미드 상에서 (Cull et al . (1992) " Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869) 또는 파지 상에서 (Scott et al . (1990) " Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library ", Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Libraries : A Source Of Specific Protein Binding Molecules ", Science, 249:404-406; Cwirla et al . (1990) " Peptides On Phage : A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; 및 Felici (1991) " Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector ", J. Mol. Biol., 222:301-310) 수행될 수 있다. 항원, 예컨대 FcγRIIIA에 면역특이적으로 결합하는 것으로 확인된 분자들은 그런 다음 그것의 항원에 대한 특이성 및 친화성에 대해 분석될 수 있다.

다중 에피토프 결합 도메인을 포함하도록 공학적으로 조작되어 있는 발명의 분자들은 하나 또는 그 이상의 항원 (예컨대 암 항원 및 다른 항원 (예컨대 FcγR)과의 교차 반응성)에 대한 면역특이적 결합에 대해, 또는 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 경우 Fc-FcγR 상호작용에 대해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해 분석될 수 있다. 면역특이적 결합, 교차 반응성 및 Fc-FcγR 상호작용을 분석하기 위해 사용될 수 있는 면역분석법으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 예컨대 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석, ELISA (효소 결합된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 프레시피틴 반응, 겔 확산 프레시피틴 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정화 분석, 면역방사측정, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석, 적지만 명명된 것들과 같은 기법을 사용하는 경합성 및 비-경합성 분석 시스템이 있다. 그런 분석법들은 기본적인 것이고 해당 기술분야에 잘 알려져 있다 (Ausubel et al ., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).

항원-결합 도메인 상호작용 또는 Fc-FcγR 상호작용의 결합 친화성 및 오프-레이트(off-rate)는 경합성 결합 분석에 의해 측정될 수 있다. 경합성 결합 분석의 한 실례는 표지된 항원, 예컨대 사량체 FcγR (예컨대 ³H 또는 ¹²⁵I, 단원 4.1 참조)을 관심의 분자 (예컨대 사량체 FcγR (단원 4.1 참조)과 같이, 증가하는 양의 미표지 에피토프의 존재 하에 다중 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 분자)와 함께 인큐베이션하는 것과, 표지된 항원에 결합된 분자를 검출하는 것을 포함하는 방사선 면역분석이다. 본 발명의 분자의 항원에 대한 친화성 및 결합 오프-레이트는 Scatchard 분석에 의해 포화 데이터로부터 측정될 수 있다.

항원 또는 FcγR에 대한 본 발명의 분자의 친화성 및 결합 특성은 항원-결합 도메인 또는 Fc-FcγR에 대해 해당 기술분야에 공지되어 있는 시험관 내 분석법 (생화학적 또는 면역학적 기초 분석법), 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 ELISA 분석, 표면 플라스몬 공명 분석, 면역침전 분석을 사용하여 초기에 측정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 분자의 결합 특성은 또한 아래 단원 4.2에서 설명되는 것과 같이, 하나 또는 그 이상의 FcγR 중재자 이펙터 세포 기능을 측정하기 위한 시험관 내 기능성 분석에 의해 특성확인된다. 가장 바람직한 구체예에서, 발명의 분자는 시험관 내 기초 분석에서의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 생체 내 모델 (예컨대 설명되고 본원에 개시된 것들)에서도 나타낸다. 그러나 본 발명은 시험관 내 기초 분석에서는 원하는 표현형을 나타내지 않지만 생체 내에서는 원하는 표현형을 나타내는 발명의 분자들을 배제하지 않는다.

어떤 구체예에서 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 분자를 선별하고 확인하는 것은 기능성 기초 분석, 바람직하게는 대용량 방식으로 이루어진다. 기능성 기초 분석은 아래의 단원 4.2 및 4.3에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 FcγR 중재된 이펙터 세포를 특성확인하기 위해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 분석법일 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 이펙터 세포 기능의 비-제한 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 항체-의존성 세포 중재된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 식세포 작용, 식세포 작용, 옵소닌화, 옵소닌화된 식세포작용, 세포 결합, 로세팅, C1q 결합, 및 보체 의존성 세포 중재된 세포독성이 있다.

바람직한 구체예에서, BIAcore 동역학 분석법은 항원 또는 FcγR에 대한 본 발명의 분자의 결합 및 오프 레이트를 측정하기 위해 사용된다. BIAcore 동역학 분석법은 고정된 분자 (예컨대 각각 에피토프 결합 도메인 또는 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 분자)를 포함한 칩으로부터 칩의 표면에서 항원 또는 FcγR의 결합 및 분해를 분석하는 것을 포함한다. BIAcore 분석법은 아래 단원 4.3에서 설명된다.

바람직하게는, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)는 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 기법 중 하나를 사용하며 본 발명의 분자를 특성확인하기 위한 면역학적 또는 기능성 기초 분석을 위해 사용된다. 유동 선별기는 본 발명의 분자에 의해 결합된, 예컨대 옵소닌화된 대다수의 개별 세포를 신속하게 조사할 수 있다 (예컨대 10 내지 10⁸ 세포/시간) (Shapiro et al., (1995) Practical Flow Cytometry). 추가로 이중체 행동의 최적화를 위해 사용된 특수한 변수들로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 항원 농도 (즉 FcγR 사량체 복합체, 단원 4.1), 동역학적 경합 시간, 또는 FACS 엄격성이 있고, 그것들은 각각 특이한 결합 특성, 예컨대 다중 에피토프에 대한 동시 결합을 나타내는 발명의 분자를 포함하는 이중체 분자에 대해 선택하기 위해 달라질 수 있다. 생물학적 세포를 분류하고 조사하기 위한 유동세포 분석기는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 공지된 유동세포 분석기는 예를 들면 미국 특허 4,347,935호; 5,464,581호; 5,483,469호; 5,602,039호; 5,643,796호; 및 6,211,477호에 기술되어 있다. 다른 공지된 유동세포 분석기는 Becton Dickinson and Company에서 제작된 FACS Vantage^TM 시스템, 및 Union Biometrica에서 제작된 COPAS^TM 시스템이다.

표적 항원 결합 친화성 또는 Fc-FcγR 결합 친화성의 특성확인, 및 세포 표면에서의 표적 항원 또는 FcγR 밀도의 평가는 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 Scatchard 분석에 의해 또는 제조업체의 지시대로 키트, 예컨대 Quantum^TM Simply Cellular® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN)를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 하나 또는 그 이상의 기능성 분석법은 해당 기술분야에 숙련된 사람에게 공지되었거나 본원에 기술된 것과 같이 하나 또는 그 이상의 FcγR 중재된 이펙터 세포 기능을 특성확인하기 위해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 분석법일 수 있다. 특정 구체예에서, 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 본 발명의 분자는 하나 또는 그 이상의 표적 항원 또는 하나 또는 그 이상의 FcγR, 예컨대 FcγRIIIA, FcγRIIA, FcγRIIA에 대한 결합에 대한 ELISA 분석법으로 분석된 후, 하나 또는 그 이상의 ADCC 분석법으로 분석된다. 어떤 구체예에서 발명의 분자는 추가로 표면 플라스몬 공명-기초 분석, 예컨대 BIAcore를 사용하여 분석된다. 표면 플라스몬 공명-기초 분석법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 추가로 아래의 단원 4.3에서 논의되고, 하기 실시예 1에서 예시된다.

가장 바람직한 구체예에서, 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 본 발명의 분자는 추가로 표적 항원 (예컨대 FcγR)과의 상호작용 또는 Fc-FcγR 상호작용에 대한 동물 모델에서 특성확인된다. Fc-FcγR 상호작용이 평가되어야 하는 경우, 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 동물 모델은 예를 들면 사람 FcγR을 발현하는 유전자도입 동물, 예컨대 미국 특허 5,877,397호 및 6,676,927호에서 설명된 어떠한 마우스 동물 모델이다. 그런 방법에 사용하기 위한 추가의 유전자도입 마우스로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 것을 포함한다: 사람 FcγRIIIA를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA 마우스; 사람 FcγRIIA를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA 마우스; 사람 FcγRIIB와 사람 FcγRIIIA를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA 마우스; 사람 FcγRIIB와 사람 FcγRIIA를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA 마우스; 사람 FcγRIIIA와 사람 FcγRIIA를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA 및 FcγRIIA 마우스; 및 사람 FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRIIB를 운반하는 누드 녹아웃 FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRIIB 마우스.

3.1 Fc γR을 포함하는 결합 분석

Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 및/또는 FcγR에 특이한 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자에 의한 FcγR에 대한 결합의 특성확인은, 그것에 한정되는 것은 아니지만 FcγR의 다형태 변이체를 포함하여 어떠한 FcγR를 사용하여 이루어질 수 있다. 어떤 구체예에서, 위치 158에 페닐알라닌을 함유한 FcγRIIIA의 다형태 변이체가 사용된다. 다른 구체예에서, 특성확인은 위치 158에 발린을 함유하는 FcγRIIIA의 다형태 변이체를 사용하여 이루어진다. FcγRIIIA 158V는 158F보다 더 높은 IgG1에 대한 친화성과 증가된 ADCC 활성을 나타내고 (Koene et al . (1997) " Fc gammaRIIIa -158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa , Independently Of The Fc gammaRIIIa -48L/R/H Phenotype", Blood, 90:1109-14; Wu et al . (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa ( CD16 ) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease", J. Clin. Invest. 100: 1059-70); 이 잔기는 실제로 IgG1-FcγRIIIA 공동 결정화 연구에 의해 최근에 밝혀진 것과 같이 IgG1의 하부 힌지 영역과 직접 상호작용한다 (Sondermann et al . (2000) " The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment - Fc gammaRIII complex ", Nature, 406(6793):267-273). 연구는 어떤 경우에 치료 항체가 FcγRIIIA-158V 동형접합성 환자에서 효능을 개선하였음을 밝혀냈다. 예를 들어 인간화된 항-CD20 단클론성 항체 리툭스맵은 FcγRIIIA 158V 동형접합성 환자에서 FcγRIIIA 158F 동형접합성 환자에 비교하여 치료적으로 더 효과적이었다 (Cartron et al . (2002) " Therapeutic Activity Of Humanized Anti - CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene ", Blood, 99(3):754-758). 다른 구체예에서 이 영역을 포함하는 치료 분자는 또한 FcγRIIIA-158V 및 FcγRIIIA-158F에 대한 동형접합성 환자에 대해, 그리고 FcγRIIA-11H 환자에서 보다 효과적일 수 있다. 특별한 작용 메커니즘에 의해 구속되는 것을 의도하지는 않지만, 대체 알로타입을 포함하는 발명의 분자를 선택함으로써 일단 치료적 이중체에 공학적으로 도입되면 상기 알로타입에 대해 동형접합성인 환자들에 대해 임상적으로 보다 효과적일 변이체를 제공할 수 있다.

FcγR 결합 분석법은 발명의 분자의 FcγR에 대한 결합을 측정하기 위해 및, 특히 Fc 도메인의 FcγR에 대한 결합을 측정하기 위해 개발되었다. 그 분석법으로 Fc-FcγR 상호작용의 검출 및 정량이, 비록 수용체의 리간드에 대한 친화성이, 예컨대 FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 대해 마이크로몰 범위로 본질적으로 약하지만 가능해졌다. 그 방법은 국제 출원 WO 04/063351 및 미국 특허 출원 공보 2005/0037000 및 2005/0064514에서 상세하게 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 그 방법은 해당 기술분야에 공지된 어떠한 표준 면역분석법, 예컨대 FACS, ELISA, 표면 플라스몬 공명 등으로 제기될 수 있는 FcγR 복합체의 형성을 포함한다. 추가로 FcγR 복합체는 복합체를 형성하지 않은 FcγR에 비교하여, Fc 영역에 대해 개선된 결합능력을 가진다. 본 발명에 따르면, 바람직한 분자 복합체는 다음: (a) FcγR의 가용성 영역 (예컨대 FcγRIIIA, FcγRIIA 또는 FcγRIIB의 가용성 영역); (b) FcγR의 가용성 영역 (예컨대 FcγRIIIA, FcγRIIA 또는 FcγRIIB의 가용성 영역)의 C-말단에 작동가능하게 연결된 비오티닐화된 15 아미노산 AVITAG 서열 (AVITAG); 및 (c) 스트렙트아비딘-피코에리트린 (SA-PE)을 몰 비율 (바람직하게는 5:1 몰비)로 포함하여 사량체 FcγR을 형성하는 사량체 면역 복합체이다. 융합 단백질은 예를 들면 15 아미노산 AVITAG 서열에서 라이신 잔기를 특이적으로 비오티닐화하는 비오틴 결찰효소인 대장균 Bir A 효소를 사용하여 효소적으로 비오티닐화된다. 그런 다음 비오티닐화된 가용성 FcγR 단백질은 SA-PE와 1X SA-PE:5X 비오티닐화된 가용성 FcγR 몰비로 혼합되어 사량체 FcγR 복합체가 형성된다.

Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 사량체 FcγR 복합체에, 단량체의 복합체 형성이 되지 않은 FcγR보다 최소한 8배 더 높은 친화성으로 결합하는 것으로 나타났다. Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 사량체 FcγR 복합체에 대한 결합은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 표준 기법, 예를 들면 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성 면역분석법, ELISA 분석, 등을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 Fc 영역을 포함하는 분자의 기능성을 세포-기초 또는 세포-유리 분석법으로 측정하기 위해 사용되는, 발명의 분자를 포함하고, 상기에서 설명된 방법을 따라 형성된 면역 복합체의 용도를 포함한다.

편리의 목적으로, 시약은 분석 키트, 즉 Fc 영역을 포함하는 분자의 FcγR 사량체 복합체에의 결합 능력을 분석하기 위한 시약들의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. Fc-FcγR 상호작용을 측정하는 데 사용하기 위한 분자 복합체의 다른 형태는 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위해 고려되는데, 예를 들면 미국 임시 출원 60/439,709 (2003. 1. 13. 출원)에 설명된 것과 같은 융합 단백질이 있다.

3.2 변이체 중쇄를 포함하는 분자의 기능성 분석

본 발명은 다중 에피토프 결합 도메인과, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 발명의 분자를, 분자의 이펙터 세포 기능을 확인하기 위해 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 분석법을 사용하여 특성확인하는 것을 포함한다. 특히 본 발명은 FcγR-중재된 이펙터 세포 기능에 대해 발명의 분자를 특성확인하는 것을 포함한다. 추가로 발명의 이중체 분자의 최소한 하나의 표적 항원이 FcγR인 경우, 이중체 분자에 의한 FcγR의 결합은 FcγR-Fc 결합에 의해 활성화된 것과 유사한 FcγR-중재된 경로를 활성화하는 작용을 할 것이다. 그러므로 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인이 FcγR을 인식하는 경우, 이중체 분자는 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 함유하지 않으면서, 또는 부수적인 Fc-FcγR 결합 없이 FcγR-중재된 이펙터 세포 기능을 유도할 수 있다. 본 발명에 따라 분석될 수 있는 이펙터 세포 기능의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 항체-의존성 세포 중재된 세포독성, 식세포 작용, 옵소닌화, 옵소닌성 식세포 작용, C1q 결합, 및 보체 의존성 세포 중재된 세포독성이 있다. 이펙터 세포 기능 활성을 측정하기 위해 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 어떠한 세포-기초 또는 세포 유리 분석법이든지 사용될 수 있다: 이펙터 세포 분석에 대해; Perussia et al . (2000) " Assays For Antibody - Dependent Cell - Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC ( Redirected Cytotoxicity ) In Human Natural Killer Cells", Methods Mol. Biol. 121:179-92; Baggiolini et al . (1988) " Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity ", Experientia, 44(10):841-848; Lehmann et al . (2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry ", J. Immunol. Methods, 243(1-2):229-42; Brown (1994) " In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes : Receptor Modulation And Signal Transduction ", Methods Cell Biol., 45:147-64; Munn et al . (1990) " Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony -Stimulating Factor ", J. Exp. Med., 172:231-237, Abdul-Majid et al . (2002) " Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis ", Scand. J. Immunol. 55:70-81; Ding et al . (1998) " Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA -A2/ Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids ", Immunity 8:403-411.

한 구체예에서, 발명의 분자는 사람 단핵세포에서 FcγR-중재된 식세포작용에 대해 분석될 수 있다. 또는 달리 본 발명의 분자의 FcγR-중재된 식세포작용은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지된 표준 과정을 사용하여 얻어질 수 있는 다른 식세포, 예컨대 호중구 (다형핵 백혈구; PMN); 사람 말초혈 단핵세포, 단핵세포-유도된 대식세포에서 분석될 수 있다 (Brown (1994) " In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes : Receptor Modulation And Signal Transduction", Methods Cell Biol., 45:147-164). 한 구체예에서, 발명의 분자의 기능은 THP-1 세포가 플루오레세인화 IgG-옵소닌 처리된 양 적혈구 (SRBC)를 식세포작용하는 능력을 이전에 기술된 방법 (Tridandapani et al . (2000) " The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor - Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells", J. Biol. Chem. 275: 20480-20487)에 의해 측정함으로써 특성확인된다.

발명의 분자의 식세포 작용을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석법은 항체-의존성 옵소닌성 식세포작용 분석 (ADCP)인데, 그것은 다음을 포함할 수 있다: 대장균-표지된 FITC (분자 프로브) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스-FITC와 같은 표적 생물입자를 (i) FcγR-의존성 ADCP에 대한 대조 항체로서 플루오레세인에 대한 항체인 야생형 4-4-20 항체 (Bedzyk et al . (1989) " Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti - Fluorescein Idiotype Family ", J. Biol. Chem, 264(3):1565-1569); 또는 (ii) FcγR-의존성 ADCP에 대한 바탕 대조표준으로서, FcγRIII에 대한 결합을 탈락시키는 D265A 돌연변이를 은닉하는 4-4-20 항체, (iii) 4-4-20의 에피토프 결합 도메인과 Fc 도메인 및/또는 FcγRIII에 특이적인 에피토프 결합 도메인을 포함하는 이중체로 코팅하는 단계; 그리고 옵소닌 처리된 입자를 형성하는 단계; 상기에서 (i-iii) 기술된 옵소닌 처리된 입자 중 어느 것을 THP-1 이펙터 세포 (ATCC로부터 활용할 수 있는 단핵 세포 셀라인)에 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 또는 100:1의 비율로 첨가하여 FcγR-중재된 식세포작용이 일어나도록 허용하는 단계; 바람직하게는 그 세포와 대장균 FITC/항체를 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하는 단계; 인큐베이션 후에 (바람직하게는 실온에서 2 내지 3분 동안) 트립판 블루를 세포에 첨가하여 내재화되는 일 없이 세포 표면에 부착된 박테리아의 형광을 퀀칭하는 단계; 세포를 FACS 완충액 (예컨대 PBS 중의 0.1% BSA, 0.1%, 아지드화 나트륨)에 옮기고, THP1 세포의 형광을 FACS (예컨대 BD FACS 칼리버)를 사용하여 분석하는 단계. 바람직하게는 분석에 사용된 THP-1 세포는 세포 표면에서의 FcγR 발현에 대해 FACS에 의해 분석된다. THP-1 세포는 CD32A와 CD64를 둘 다 발현한다. CD64는 본 발명의 방법에 따라 ADCP 분석을 수행할 때 차단되는 고친화성 FcγR이다. THP-1 세포는 바람직하게는 100㎍/mL의 가용성 IgG1 또는 10% 사람 혈청으로 차단된다. ADCP의 정도를 분석하기 위하여, 게이트는 바람직하게는 THP-1 세포상에 설정되고 중간 형광 세기가 측정된다. 개별적인 돌연변이에 대한 ADCP 활성이 계산되고 얻어진 야생형 chMab 4-4-20에 대해 표준화된 값으로 기록된다. 옵소닌 처리된 입자는 THP-1 세포에, 옵소닌 처리된 입자 대 THP-1 세포의 비율이 30:1 또는 60:1이 되도록 첨가된다. 가장 바람직한 구체예에서 ADCP 분석은 대조표준, 예컨대 배지 중의 대장균-FITC, 대장균-FITC와 THP-1 세포 (FcγR-무관한 ADCP 활성으로서 작용하기 위해), 대장균-FITC, THP-1 세포 및 야생형 4-4-20항체 (FcγR-의존성 ADCP 활성으로서 작용하기 위해), 대장균-FITC, THP-1 세포, 4-4-20 D265A (FcγR-의존성 ADCP 활성에 대한 바탕 대조표준으로서 작용하기 위해)를 사용하여 수행된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 이펙터 세포, 예컨대 천연 킬러 세포에서, 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지된 표준 방법 중 어느 것을 사용하여 FcγR-중재된 ADCC 활성에 대해 분석될 수 있다 (Perussia et al . (2000) " Assays For Antibody-Dependent Cell - Mediated Cytotoxicity ( ADCC ) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity ) In Human Natural Killer Cells ", Methods Mol. Biol. 121:179-92; Weng et al . (2003) " Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma ", J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Ding et al . (1998) " Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids ", Immunity 8:403-411). 발명의 분자의 ADCC 활성을 측정하기 위한 예시적인 분석법은 ⁵¹Cr 방출 분석을 토대로 하며, 그것은 다음의 단계들을 포함한다: 표적 세포를 [⁵¹Cr]Na₂CrO₄ (이 세포막 투과성 분자는 보통 표지화에 사용되는데, 왜냐하면 그것이 세포질 단백질과 결합하고, 세포로부터 느린 동역학으로 자발적으로 방출되긴 하지만, 표적 세포 괴사 후에 다량으로 방출되기 때문이다)로 표지화하는 단계; 표적 세포를 변이체 중쇄를 포함하는 발명의 분자로 옵소닌화하는 단계; 옵소닌화된 방사성 표지된 표적 세포를 이펙터 세포와 미소역가 플레이트에서 적절한 비율의 표적 세포 대 이펙터 세포로 조합하는 단계; 그 세포 혼합물을 16 내지 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계; 상층액을 수집하는 단계; 그리고 방사능을 분석하는 단계. 그런 다음 발명의 분자의 세포독성은 예를 들면 다음 식: % 용해 = (실험 cpm - 표적 누출 cpm)/(계면활성제 용해 cpm - 표적 누출 cpm)x100%를 사용하여 측정될 수 있다. 또는 달리 % 용해 = (ADCC-AICC)/(최대 방출-자발적인 방출)을 사용할 수 있다. 특정 용해는 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다: 비용해 = 발명의 분자로 이루어진 % 용해 - 발명의 분자의 부재시 % 용해. 그래프는 표적:이펙터 세포 비율 또는 항체 농도를 다르게 함으로써 생성될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 ADCC 분석에 사용된 이펙터 세포는 바람직하게도 정상인 혈액에서 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 표준 방법, 예컨대 피콜-파크 밀도 구배 원심분리를 사용하여 정제된 말초혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 이펙터 세포는 상이한 FcγR 활성화 수용체를 발현한다. 본 발명은 중쇄 항체 돌연변이가 야생형 IgG1 항체에 비하여 증가된 ADCC 활성 및 식세포 작용을 나타내는 지를 측정하기 위하여, FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIB를 발현하는 이펙터 세포, THP-1, 및 FcγRIIIA와 FcγRIIB를 둘 다 발현하는 전체 사람 혈액으로부터 유도된 단핵세포 유도된 일차 대식세포를 포함한다.

사람 단핵세포 셀라인, THP-1은 고친화성 수용체 FcγRI 및 저친화성 수용체 FcγRIIA의 발현을 통해 식세포작용을 활성화한다 (Fleit et al . (1991) " The Human Monocyte - Like Cell Line THP -1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII ", J. Leuk. Biol. 49: 556-565). THP-1 세포는 본질적으로 FcγRIIA 또는 FcγRIIB를 발현하지 못한다. 이들 세포를 사이토킨으로 자극하는 것은 FcR 발현 패턴에 영향을 미친다 (Pricop et al . (2001) " Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines ", J. of Immunol., 166: 531-537). 사이토킨 IL4의 존재하에 THP-1 세포의 성장은 FcγRIIB 발현을 유도하고 FcγRIIA와 FcγRI 발현의 감소를 유발한다. FcγRIIB 발현은 또한 증가된 세포 밀도에 의해 증강될 수 있다 (Tridandapani et al . (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells ", J. Biol. Chem., 277(7):5082-5089). 대조적으로 IFNγ는 FcγRIIIA의 발현을 유도할 수 있다고 보고되었다 (Pearse et al . (1993) " Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High - Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91- kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3 ", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:4314-4318). 세포 표면상의 수용체의 존재 또는 부재는 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 FACS에 의해 측정될 수 있다. 세포 표면상에서 사이토킨 유도된 FcγR 발현은 FcγRIIB의 존재의 활성화 및 억제를 둘 다 시험하기 위한 시스템을 제공한다. 만약 THP-1 세포가 FcγRIIB를 발현할 수 없다면, 발명은 또한 다른 사람 단핵세포 셀라인, U937을 포함한다. 이들 세포는 IFNγ와 TNF의 존재하에 마지막에 대식세포로 분화하는 것으로 밝혀졌다 (Koren et al . (1979) " In Vitro Activation Of A Human Macrophage - Like Cell Line ", Nature 279:328-331).

FcγR 의존성 종양 세포 사멸은 마우스 종양 모델에서 대식세포와 NK 세포에 의해 중재된다 (Clynes et al . (1998) " Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma ", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656). 본 발명은 식세포 작용 및 ADCC 분석 둘 다에서 표적 세포의 세포독성을 야기하는 Fc 돌연변이의 효능을 분석하기 위한 이펙터 세포로서 공여체로부터 현탁 분리된 단핵 세포의 사용을 포함한다. FcγRI, FcγRIIIA, 및 FcγRIIB의 발현 패턴은 상이한 성장 조건에 의해 영향을 받는다. 냉동된 현탁 분리된 단핵 세포, 새롭게 현탁 분리된 단핵 세포, 10% FBS에서 유지된 단핵 세포, 및 FBS+GM-CSF에서 배양된 단핵 세포로부터의 및 또는 사람 혈청에서의 FcγR 발현은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 통상적인 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 세포는 FcγR 특이적 항체로 염색되고 FACS에 의해 분석되어 FcR 프로필이 측정될 수 있다. 그런 다음 대식세포 생체 내 FcγR 발현을 가장 잘 모방하는 조건이 본 발명의 방법에 사용된다.

어떤 구체예에서 본 발명은 바른 FcγR 프로필을 가지는 사람 세포가 얻어질 수 없을 때 특히 마우스 세포의 사용을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 사람 FcγRIIIA로 형질전환될 수 있고 안정한 형질전환체가 해당 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 분리되는 마우스 대식세포 셀라인 RAW264.7(ATCC)를 포함한다 (Ralph et al . (1977) " Antibody - Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage - Related Cell Lines : Enhancement By PPD And LPS ", J. Immunol. 119:950-4). 형질전환체는 기본적인 실험을 사용하여 FACS 분석에 의해 FcγRIIIA 발현에 대해 정량될 수 있고, 고발현은 발명의 ADCC에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 것과 같은 녹아웃 유전자도입 마우스로부터 사람 FcγR을 발현하는 비장 복강 대식세포의 분리를 포함한다.

림프구는 피콜-파크 구배 (Pharmacia)를 사용하여 공여체의 말초혈 (PBM)로부터 수득될 수 있다. 세포의 분리된 단핵 세포 집단 내에서 대부분의 ADCC 활성은 그것의 표면에 FcγRIIIA를 함유하지만 FcγRIIB를 함유하지 않는 천연 킬러 세포 (NK)를 통하여 일어난다. 이들 세포를 사용했을 때의 결과는 NK 세포 ADCC를 야기하는 데 미치는 돌연변이의 효능을 가리키며, 현탁 분리된 단핵세포로 시험하기 위한 시약을 수립한다.

본 발명의 ADCC 분석에 사용된 표적 세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유방암 셀라인, 예컨대 ATCC 승인 번호가 HTB-30인 SK-BR-3 (Tremp et al . (1976) " Human Breast Cancer In Culture ", Recent Results Cancer Res. 33-41); B-림프구; 버킷 림프종으로부터 유도된 세포, 예컨대 ATCC 승인 번호가 CCL-86인 Raji 세포 (Epstein et al . (1965) " Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain ( EB1 ) Of Human Lymphoblasts From Burkitt ? Lymphoma ", J. Natl. Cancer Inst. 34:231-240); 및 ATCC 승인 번호 CCL-213인 다우디 세포 (Klein et al . (1968) " Surface IgM - Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines ", Cancer Res. 28:1300-1310)가 있다. 표적 세포는 분석하고자 하는 이중체 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되어야 한다.

ADCC 분석은 아폽토시스 경로를 통해 세포 사멸을 중재하는 NK 세포의 능력을 토대로 한다. NK 세포는 세포 표면의 항원에 결합된 IgG Fc 도메인의 FcγRIIIA의 인식에 의해 부분적으로 세포 사멸을 중재한다. 본 발명의 방법에 따라 사용된 ADCC 분석은 방사능 기초 분석 또는 형광 기초 분석일 수 있다. 변이체 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자를 특성확인하기 위해 사용된 ADCC 분석은 표적 세포, 예컨대 SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, 다우디 세포를 표지하는 단계, 표적 세포를 표적 세포 상의 세포 표면 수용체를 그것의 항원 결합 부위를 통해 인식하는 항체로 옵소닌화하는 단계; 표지된 옵소닌화된 표적 세포와 이펙터 세포를 기본적인 실험에 의해 측정될 수 있는 적절한 비율로 조합하는 단계; 세포를 수득하는 단계; 사용된 표지를 토대로 한 적절한 검출 개략도를 사용하여 용해된 표적 세포의 상층액에서 표지를 검출하는 단계를 포함한다. 표적 세포는 방사성 표지 또는 형광 표지 중 하나로, 해당 기술분야에 공지되어 있는 표준 방법을 사용하여 표지될 수 있다. 예를 들어 표지로는 그것에 한정되는 것은 아니지만, [⁵¹Cr]Na₂SO₄, 및 형광 증강 리간드, 2,2':6',2''-테르피리딘-6-6''-디카르복실레이트의 아세톡시메틸 에스테르 (TDA)가 있다.

바람직한 특정 구체예에서, 형광 증강 리간드, 2,2':6',2''-테르피리딘-6-6''-디카르복실레이트의 아세톡시메틸 에스테르 (TDA)로 표지되어 있는 표적 세포에 대해 ADCC 활성을 측정하기 위해 시분해 형광측정 분석이 사용된다. 그러한 형광측정 분석은 해당 기술분야에 알려져 있다 (Blomberg et al . (1996) " Time -Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand ", Journal of Immunological Methods, 193:199-206). 간단히 설명하면, 표적 세포는 TDA의 막투과성 아세톡시메틸 디에스테르 (비스(아세톡시메틸) 2,2':6',2''-테르피리딘-6-6''-디카르복실레이트, (BATDA)로 표지되는데, 그것은 생존 세포의 세포막을 가로질러 신속하게 확산된다. 세포 내 에스테라제는 에스테르 기를 분리하고, 재생된 막 불투과성 TDA 분자는 세포 내부에 갇히게 된다. 이펙터와 표적 세포가 예컨대 최소한 2시간 동안, 최대 3.5시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 하에서 인큐베이션된 후, 용해된 표적 세포로부터 방출된 TDA는 Eu3+와 킬레이트를 형성하고, 형성된 유로퓸-TDA 킬레이트의 형광은 시분해 형광측정기에서 정량된다 (예컨대 Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac).

다른 특정 구체예에서, 다중 에피토프 결합 부위와, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 본 발명의 분자를 특성확인하기 위하여 사용된 ADCC 분석은 다음의 단계들을 포함한다: 바람직하게는 4 내지 5×10⁶ 표적 세포 (예컨대 SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji 세포)가 비스(아세톡시메틸) 2,2':6',2''-테르피리딘-6-6''-디카르복실레이트 (DELFIA BATDA 시약, Perkin Elmer/Wallac)로 표지된다. 최적의 표지화 효율을 위해서 ADCC 분석에 사용된 많은 표적 세포는 바람직하게는 5×10⁶을 초과하지 않아야 한다. BATDA 시약은 세포에 첨가되고 그 혼합물은 37℃에서, 바람직하게는 5% CO₂ 하에서, 최소한 30분 동안 인큐베이션된다. 그런 다음 세포는 생리 완충액, 예컨대 PBS로, 0.125mM 술핀피라졸로, 및 0.125mM 술핀피라졸을 함유한 배지로 세척된다. 표지된 표적 세포는 그런 다음 FcγRIIA에 특이한 에피토프 결합 도메인과, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 본 발명의 분자로 옵소닌화된다 (코팅된다). 바람직한 구체예에서, ADCC 분석에 사용된 분자는 또한 세포 표면 수용체, 종양 항원, 또는 암 항원에 대해 특이적이다. 발명의 이중체 분자는 어떠한 암 또는 종양 항원, 예컨대 단원 6.1에 열거된 것들에 특이하게 결합할 수 있다. ADCC 분석에서 표적 세포는 발명의 이중체에 공학적으로 도입된 에피토프 결합 부위에 따라 선택되어서 이중체가 표적 세포의 세포 표면 수용체에 특이하게 결합할 수 있게 된다.

표적 세포는 이펙터 세포, 예컨대 PBMC에 첨가되어, 대략 1:1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1, 또는 100:1의 이펙터:표적 비율을 생성한다. 이펙터 및 표적 세포는 최소한 2시간 동안, 최대 3.5시간 동안, 37℃에서 5% CO₂ 하에서 인큐베이션된다. 세포 상층액이 수득되고 산성 에로퓸 용액 (예컨대 DELFIA 유로퓸 용액, Perkin Elmer/Wallac)에 첨가된다. 형성된 유로퓸-TDA 킬레이트의 형광은 시분해 형광측정기 (예컨대 Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac)에서 정량된다. 최대 방출 (MR) 및 자발적 방출 (SR)이 각각 1% TX-100 및 배지 단독과 표적 세포가 인큐베이션됨으로써 측정된다. 항체에 무관한 세포의 세포독성 (AICC)은 표적과 이펙터 세포가 시험 분자, 예컨대 발명의 이중체의 부재하에 인큐베이션됨으로써 측정된다. 각각의 분석은 바람직하게 삼중으로 수행된다. 평균 백분율 비용해는 다음과 같이 계산된다: 실험 방출 (ADCC)-AICC)/(MR-SR)x100.

본 발명은 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)을 포함하는 발명의 분자에 의해 C1q의 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 중재를 특성확인하기 위하여 해당 기술분야에 공지되고 본원에 예시된 분석법을 포함한다. C1q 결합을 측정하기 위하여, C1q 결합 ELISA가 수행될 수 있다. 예시적인 분석은 다음을 포함한다: 분석 플레이트는 4℃에서 밤새 발명의 분자 또는 출발 폴리펩티드 (대조표준)를 코팅 완충액 중에 포함하는 폴리펩티드로 코팅될 수 있다. 그런 다음 플레이트는 세척되고 차단된다. 세척 후에 일정액의 사람 C1q가 각 웰에 첨가되고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 추가의 세척 후에 100μL의 양 항-보체 C1q 페록시다제 포합된 항체가 각 웰에 첨가되고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 플레이트는 다시 세척 완충액으로 세척되고, OPD (O-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (Sigma))를 함유하는 100㎕의 기질 완충액이 각 웰에 첨가될 수 있다. 황색의 출현에 의해 관찰되는 산화 반응이 30분 동안 진행되고, 100㎕의 4.5 NH2SO가 첨가됨으로써 중지된다. 그런 다음 흡광도가 492 내지 405nm에서 판독된다.

보체 활성화를 평가하기 위하여, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 분석이 문헌에 기술된 것과 같이 수행될 수 있다 (Gazzano-Santoro et al . (1997) "A Non -Radioactive Complement - Dependent Cytotoxicity Assay For Anti - CD20 Monoclonal Antibody", J. Immunol. Methods 202:163-171). 간단하게 설명하면, (변이체) Fc 도메인 (또는 그것의 일부) 및 사람 보체를 포함하는 분자의 다양한 농도는 완충액으로 희석될 수 있다. 그것에 이중체 분자가 결합하는 항원을 발현하는 세포는 약 1×10⁶ 세포/ml의 밀도로 희석될 수 있다. (변이체) Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 이중체 분자, 희석된 사람 보체 및 항원을 발현하는 세포의 혼합물은 평평한 바닥 조직 배양 96 웰 플레이트에 첨가되고 2시간 동안 37℃에서 및 5% CO2에서 인큐베이션됨으로써 보체 중재된 세포 용해가 촉진된다. 그런 다음 50μL의 알라마르 블루 (Accumed International)가 각 웰에 첨가되고, 밤새 37℃에서 인큐베이션된다. 흡광도는 530nm에서 여기하고 590nm에서 방출되는 96-웰 형광계를 사용하여 측정된다. 그 결과는 상대 형광 유닛 (RFU)으로서 표시될 수 있다. 샘플 농도는 표준 곡선으로부터 산출될 수 있고, % 활성은 비변이체 분자, 즉 Fc 도메인을 포함하지 않거나 비-변이체 Fc 도메인을 포함하는 분자와 비교되고, 관심의 변이체에 대해 기록된다.

3.3 다른 분석법

다중 에피토프 결합 도메인과, 임의로 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자는 항원-결합 도메인 또는 Fc-FcγR 결합의 동역학적 변수들을 특성확인하기 위해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 표면 플라스몬 공명 기초 분석법을 사용하여 분석될 수 있다. 상업적으로 활용할 수 있는 어떠한 SPR 기기, 이를테면 그것들에 한정되지는 않지만 Biacore AB (Uppsala, Sweden) 제품인 BIAcore 기기; Affinity Sensors (Franklin, MA) 제품인 IAsys 기기; Windsor Scientific Limited (Berks, UK) 제품인 IBIS 시스템; Nippon Laser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan) 제품인 SPR-CELLIA 시스템; 및 Texas Instruments (Dallas, TX) 제품인 SPR Detector Spreeta가 본 발명에 사용될 수 있다. SPR-기초 기술에 대한 개관은 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Mullet et al . (2000) " Surface Plasmon Resonance - Based Immunoassays", Methods 22: 77-91; Dong et al . (2002) " Some new aspects in biosensors", Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivash et al . (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction ", Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al . (2000) " Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis", Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61). 추가로, 미국 특허 6,373,577호, 6,289, 286호, 5,322,798호, 5,341,215호, 6,268,125호에서 설명된 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 SPR 기기 및 SPR 기초 방법 중 어느 것이든지 본 발명의 방법에서 고려된다.

간단히 설명하면, SPR 기초 분석법은 표면상의 결합 쌍의 구성원을 고정시키는 것과, 결합 쌍의 다른 구성원과 그것의 용액 중에서의 상호작용을 실시간으로 모니터하는 것을 포함한다. SPR은 복합체 형성 또는 분해시에 발생하는 표면 가까이의 용매의 굴절률의 변화를 측정하는 것을 토대로 한다. 그 위에서 고정화가 일어나는 표면은 센서 칩인데, 그것이 SPR 기술의 핵심부이며, 얇은 층의 금으로 코팅된 유리 표면으로 구성되고, 분자의 표면에의 결합을 최적화하기 위해 디자인된 다양한 특수한 표면에 대한 기초를 형성한다. 다양한 센서 칩이 특히 상기에서 열거된 회사들로부터 상업적으로 활용가능한데, 그것들은 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 센서 칩의 예를 들면 BIAcore AB, Inc.로부터 활용할 수 있는 것들, 예컨대 센서 칩 CM5, SA, NTA, 및 HPA가 있다. 본 발명의 분자는 센서 칩의 표면에, 해당 기술분야에 공지되어 있는 고정화 방법 및 화학, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 아민 기를 경유한 직접 공유 결합, 술프히드릴 기를 경유한 직접 공유 결합, 아비딘 코팅된 표면에의 비오틴 부착, 탄수화물 기에의 알데하이드 결합, 및 NTA 칩을 사용한 히스티딘 태그를 통한 부착 중 어느 것이든지 사용하여 고정될 수 있다.

어떤 구체예에서, 다중 에피토프 결합 부위 및, 임의로 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 분자의 항원 또는 FcγR에의 결합의 동역학적 변수들은 BIAcore 기기 (예컨대 BIAcore 기기 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 측정될 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같이 (단원 4.1 참조), 어떠한 FcγR이든지 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 부위가 FcγR을 면역특이적으로 인식하는 경우이거나, 및/또는 이중체 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 경우에 본 발명의 분자의 결합을 평가하는 데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, FcγR은 FcγRIIIA, 바람직하게는 가용성 단량체 FcγRIIIA이다. 예를 들어 한 구체예에서, 가용성 단량체 FcγRIIIA는 링커-AVITAG 서열에 결합된 FcγRIIIA의 세포외재성 영역이다 (2003. 1. 9.에 출원된 미국 임시 출원 60/439,498 및 2003. 3. 19에 출원된 미국 임시 출원 60/456,041 참조). 다른 특정 구체예에서, FcγR은 FcγRIIB, 바람직하게는 가용성 이량체 FcγRIIB이다. 예를 들어 한 구체예에서, 가용성 이량체 FcγRIIB 단백질은 2003. 1. 13에 출원된 미국 임시 출원 60/439,709에 설명된 방법론을 따라 제조된다.

모든 면역학적 분석의 경우, 본 발명의 분자에 의한 FcγR 인식/결합은 다중 도메인에 의해 영향을 받을 수 있다: 어떤 구체예에서, 발명의 분자는 다중 에피토프 결합 도메인 중 하나를 경유하여 FcγR을 면역특이적으로 인식한다; 다른 구체예에서 발명의 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 경우에, 이중체 분자는 Fc-FcγR 상호작용을 경유하여 FcγR을 면역특이적으로 인식할 수 있다; 또 다른 구체예에서, 발명의 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)과 FcγR을 면역특이적으로 인식하는 에피토프 결합 부위를 둘 다 포함하는 경우, 이중체 분자는 에피토프 결합 도메인과 Fc 도메인 (또는 그것의 일부) 중 하나 또는 둘 다를 경유하여 FcγR을 인식할 수 있다. 다중 에피토프 결합 도메인과, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 분자의 항원 및/또는 FcγR에 대한 동역학적 변수들을 BIAcore 기기를 사용하여 측정하기 위한 예시적인 분석법은 다음을 포함한다: 첫 번째 항원은 센서 칩 표면의 4개의 흐름 세포 중 하나 위에, 바람직하게는 아민 결합 화학을 통해 고정됨으로써 약 5000 반응 유닛 (RU)의 상기 첫 번째 항원이 표면상에 고정된다. 일단 적당한 표면이 제조되면, 상기 첫 번째 항원을 면역특이적으로 인식하는 본 발명의 분자들이, 바람직하게는 5μL/mL의 유속으로 20㎍/mL 용액의 1분 주입에 의해 표면 위를 통과한다. 이 단계에서 표면에 결합된 발명의 분자 수준은 전형적으로 400 내지 700 RU이다. 다음에 HBS-P 완충액 (20mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 7.5) 중의 일련의 희석된 두 번째 항원 (예컨대 FcγR) 또는 FcγR 수용체가 100μL/mL로 표면 위에 주입된다. 상이한 두 번째 항원 또는 수용체 사이의 분자의 재생은 바람직하게는 100mM의 NaHCO₃ pH 9.4; 3M NaCl의 5초 단일 주입에 의해 수행된다. 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 재생 기법이든지 본 발명의 방법에서 고려된다.

일단 전체 데이터 세트가 수집되면, 그 결과 생성된 결합 곡선은 SPR 기기 제조업체 (BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ)에 의해 공급된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 전역적으로 맞춰진다. 이들 알고리즘은 K_on과 K_off를 둘 다 계산하고, 그것으로부터 외관상 평형 결합 상수 K_d가 두개의 속도 상수의 비율로서 추론된다 (즉 K_off/K_on). 개별적인 속도 상수가 어떻게 유도되는지에 대한 보다 상세한 처치는 BIAevaluation Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)에서 알 수 있다. 생성된 데이터의 분석은 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법이든지 사용하여 이루어질 수 있다. 생성된 동역학 데이터를 해석하는 다양한 방법에 대한 검토를 위해서는 다음의 문헌들을 참조한다: Myszka (1997) " Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors ", Current Opinion in Biotechnology 8:50-7; Fisher et al . (1994) " Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions ", Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy (1994) " Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions : A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature ", Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et al . (1992) " Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands ", Analytical Biochemistry, 201:197-210; Morton et al . (1995) " Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors : A Comparison Of Analysis By Linearization , The Integrated Rate Equation , And Numerical Integration ", Analytical Biochemistry 227:176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83.

바람직한 구체예에서, SPR 분석, 예컨대 BIAcore를 사용하여 측정된 동역학적 변수들은 발명의 분자가 기능성 분석, 예컨대 ADCC에서 어떻게 기능할 것인지에 대한 예측 척도로서 사용될 수 있다. SPR 분석으로부터 얻어진 동역학적 변수를 토대로 한 본 발명의 분자의 효과를 예측하기 위한 예시적인 방법은 다음을 포함할 수 있다: FcγRIIIA 및 FcγRIIB에 대한 발명의 분자의 결합에 대한 K_off를 측정하는 단계 (에피토프 결합 도메인 및/또는 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 통해); ADCC 데이터에 대해 (1) FcγRIIIA에 대한 K_off(야생형)/K_off(돌연변이); (2) FcγRIIB에 대한 K_off(돌연변이)/K_off(야생형)을 도표화하는 단계. 1보다 큰 수는 야생형에 비하여 FcγRIIIA에 대한 감소된 분해속도와 FcγRIIB에 대한 증가된 분해속도를 나타내고; ADCC 기능을 가지며 증강된 기능을 나타낸다.

4. 본 발명의 이중체 분자의 제조 방법

본 발명의 이중체 분자는 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법, 이를테면 드노보 단백질 합성 및 결합 단백질을 코드화하는 핵산의 재조합 발현을 사용하여 제조될 수 있다. 원하는 핵산 서열은 재조합 방법 (예컨대 원하는 폴리뉴클레오티드의 앞서 제조된 변이체의 PCR 돌연변이생성)에 의하여 또는 고체상 DNA 합성에 의하여 제조될 수 있다. 통상적으로 재조합 발현 방법이 사용된다. 한 측면으로, 본 발명은 CD16A VH 및/또는 VL을 코드화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고; 다른 측면으로 본 발명은 CD32B VH 및/또는 VL을 코드화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다양한 핵산 서열은 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 코드화하고, 본 발명은 본원에 기술된 결합 단백질을 코드화하는 모든 핵산을 포함한다.

4.1 본 발명의 분자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 폴리펩티드 및 항체를 포함하여, 본 발명의 분자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 발명의 분자를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어질 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서든지 측정될 수 있다.

일단 발명의 방법에 의해 확인된 분자들의 뉴클레오티드 서열이 측정되면, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 발생시킴으로써 상이한 아미노산 서열을 가지는 항체를 생성하기 위하여 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 재조합 DNA 기법, 부위 특정 돌연변이생성, PCR 등을 사용하여 조작될 수 있다 (예를 들어 다음 문헌에 기술된 기법들 참조: Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 및 Ausubel et al ., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

한 구체예에서, 해당 기술분야에서 활용가능한 사람 라이브러리 또는 어떠한 다른 라이브러리는 해당 기술분야에서 발명의 분자를 코드화하는 핵산을 클론하기 위한 표준 기법에 의해 선별될 수 있다.

4.2 발명의 분자의 재조합 발현

일단 발명의 분자 (즉 항체)를 코드화하는 핵산 서열이 얻어지면, 분자 제조를 위한 벡터가 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 기법들을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들이 발명의 분자에 대한 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들면 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다 (예를 들면 다음 문헌에 기술된 기법 참조: Sambrook et al ., 1990, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 및 Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

본 발명의 방법에 의해 확인된 분자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 종래의 기법 (예컨대 일렉트로포레이션, 리포솜성 형질전환, 및 칼슘 포스페이트 침전)에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 형질전환된 세포는 그런 다음 발명의 분자를 생성하기 위해 종래 기법에 의해 배양된다. 특정 구체예에서, 발명의 분자의 발현은 본질적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.

본 발명의 방법에 의해 확인된 분자를 발현하기 위해 사용된 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 대장균이거나, 또는 특히 전체 재조합 면역글로불린 분자의 발현을 위해서는 바람직하게는 진핵 세포일 수 있다. 특히 포유류 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)가, 사람 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간체 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 조합하여 사용될 때 면역글로불린에 대해 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al . (1986) " Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors ", Gene 45:101-106; Cockett et al . (1990) " High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification ", Biotechnology 8:662-667).

본 발명의 방법에 의해 확인된 분자를 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 활용될 수 있다. 그러한 숙주-발현 시스템은 그것에 의해 본 발명의 분자의 코딩 서열이 제조되고 계속해서 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 뿐 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환될 때 제자리에서 본 발명의 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 그러한 것의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 미생물, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 확인된 분자에 대한 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예컨대 대장균 및 고초균); 본 발명의 방법에 의해 확인된 분자를 코드화하는 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예컨대 사카로마이세스 피치아); 본 발명의 방법에 의해 확인된 분자를 코드화하는 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 및 토바코 모자이크 바이러스 (TMV)로 감염되거나 본 발명의 방법에 의해 확인된 분자를 코드화하는 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예컨대 Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 (예컨대 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터의 프로모터 (예컨대 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성물을 은닉하는 포유류 세포 시스템 (예컨대 COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프액을 분비하는 세포 (US 5,807,715) Per C.6 세포 (Crucell에 의해 개발된 사람 신장 세포)가 있다.

박테리아 세포에서, 많은 발현 벡터가 발현시키고자 하는 분자의 의도된 용도에 따라 유익하게 선택될 수 있다. 예를 들어 항체의 약제학적 조성물을 제조하기 위해 다량의 그런 단백질이 제조되기를 원한다면, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물의 고수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 것이다. 그런 벡터로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 그 안에서 항체 코딩 서열은 lac Z 코딩 영역을 포함한 프레임에서 벡터 안에 개별적으로 결찰될 수 있어서 융합 단백질이 제조되는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al . (1983) " Easy Identification Of cDNA Clones", EMBO J. 2:1791-1794); pIN 벡터 (Inouye et al . (1985) " Up - Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli ", Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al . (1989) " Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli ", J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등이 있다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트란스페라제 (GST)를 포함하는 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 그런 융합 단백질은 가용성이고, 흡착 및 매트릭스 글루타티온-아가로오스 비즈에 대한 결합과 이어서 유리 글루타티온의 존재하에 용출됨으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인되어서 클론된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출될 수 있다.

곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 (Autogrpha californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)는 외래 유전자를 발현하기 위해 벡터로서 사용된다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 개별적으로 바이러스의 비-필수 영역 (예컨대 폴리헤드린 유전자)에 클론될 수 있고, AcNPV 프로모터 (예컨대 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓이게 된다.

포유류 숙주 세포에서, 많은 바이러스-기초 발현 시스템이 활용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심의 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대 후기 프로모터 및 3가지 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 키메릭 유전자는 그런 다음 아데노바이러스 게놈에 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예컨대 E1 또는 E3)에의 삽입은 생존가능하고, 감염된 숙주에서 면역글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 유발할 것이다 (Logan et al . (1984) " Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). 특이한 개시 신호가 또한 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역에 필요할 것이다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈과 인접한 서열을 포함한다. 나아가, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 상(phase)에 있어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원을 가질 수 있는데, 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결제, 등을 포함시킴으로써 증강될 수 있다 (Bitter et al . (1987) " Expression And Secretion Vectors For Yeast ", Methods in Enzymol. 153:516-544).

또한, 숙주세포 스트레인은 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형하고 프로세스하는 것이 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 그런 변형 (예컨대 글리코실화) 및 프로세싱 (예컨대 절단)은 단백질의 기능에 중요하다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 발명의 이중체 분자를 포함하는 폴리펩티드는 발명의 이중체 분자의 별도의 폴리펩티드를 형성하기 위하여 천연 또는 재조합 세포 메커니즘에 의한 단백질 가수분해성 절단을 필요로 하는 단일 유전자 생성물 (예컨대 단일 폴리펩티드 사슬, 즉 다단백질 전구체로서)로서 발현될 수 있다. 그러므로 본 발명은 발명의 폴리펩티드를 포함하는 다단백질 전구체 분자를 코드화하도록 핵산 서열을 공학적으로 조작하는 것을 포함하며, 그것은 상기 다단백질 전구체의 후번역 절단을 지시할 수 있는 코딩 서열을 포함한다. 다단백질 전구체의 후-번역 절단은 발명의 폴리펩티드를 유발한다. 발명의 폴리펩티드를 포함하는 전구체 분자의 후번역 절단은 생체 내에서 일어나거나 (즉 천연 또는 재조합 세포 시스템/메커니즘에 의해 숙주 세포 내에서, 예컨대 적절한 부위에서의 퓨린 절단) 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다 (예컨대 상기 폴리펩티드 사슬을 공지된 활성의 프로테아제 또는 펩티다제를 포함하고 있는 조성물 중에서 및/또는 원하는 단백질 가수분해성 작용을 조성하는 것으로 알려져 있는 조건이나 시약을 포함하는 조성물 중에서 인큐베이션하는 것). 재조합 단백질의 정제 및 변형은 해당 기술분야에 잘 알려져 있어서 다단백질 전구체의 디자인은 숙련된 실시자에 의해 쉽게 인지되는 많은 구체예를 포함할 것이다. 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 공지된 프로테아제 또는 펩티다제든지 전구체 분자의 기술된 변형을 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 다음과 같다: 트롬빈 (아미노산 서열 LVPR＾GS (SEQ ID NO:89)를 인식한다), 또는 인자 Xa (아미노산 서열 I(E/D)GR＾ (SEQ ID NO:90)을 인식한다)(Nagai et al . (1985) " Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli ", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255, 및 이것에 대한 검토문헌인 Jenny et al . (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa ", Protein Expr. Purif. 31:1-11), 엔테로키나아제 (아미노산 서열 DDDDK＾ (SEQ ID NO:91)을 인식한다)(Collins-Racie et al . (1995) " Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA ", Biotechnology 13:982-987), 퓨린 (아미노산 서열 RXXR＾을 인식하며, RX(K/R)R＾를 선호한다 (각각 SEQ ID NO:92와 SEQ ID NO:93)), 및 AcTEV (아미노산 서열 ENLYFQ＾G (SEQ ID NO:94)를 인식한다)(Parks et al . (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase ", Anal. Biochem. 216:413-417) 및 수족구 바이러스 프로테아제 C3 (실시예 4 참조).

상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 후-번역 프로세싱과 변형에 대한 특징 및 특이한 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 셀라인 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이 목적을 위해, 일차 전사물의 적절한 프로세싱, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기계를 가지고 있는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 그런 포유류 숙주 세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst가 있다.

재조합 단백질의 장기간, 고수율 생성을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 발명의 항체를 안정하게 발현하는 셀라인이 공학적으로 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에 공학적으로 조작된 세포는 1 내지 2일 동안 풍부화 배지에서 성장된 후 선택적 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그것의 염색체 안에 안정하게 통합하고 성장하여 병소(foci)를 형성하는 것을 가능하게 하고, 그것은 계속해서 셀라인에 클론되고 팽창된다. 이 방법은 발명의 항체를 발현하는 셀라인을 공학적으로 조작하기 위해 유익하게 사용될 수 있다. 그렇게 공학적으로 조작된 셀라인은 특히 발명의 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 선별 및 평가에 유용할 것이다.

많은 선택 시스템, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 (Wigler et al . (1977) " Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells ", Cell 11:223-232), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스페라제 (Szybalska et al . (1992) " Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA - Mediated Transformation Of Mammalian Cells : First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy", Bioessays 14: 495-500), 및 아데닌 포스포리보실트란스페라제 (Lowy et al. (1980) " Isolation Of Transforming DNA : Cloning The Hamster aprt Gene ", Cell 22:817-823) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있다. 또한 대사 길항적 내성이 다음 유전자들에 대한 선택의 토대로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al . (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant - Acting Gene ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al . (1981) " Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527-1531); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan et al . (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Tolstoshev (1993) " Gene Therapy , Concepts , Current Trials And Future Directions ", Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) " The Basic Science Of Gene Therapy ", Science 260:926-932; 및 Morgan et al . (1993) " Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem. 62:191-217); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al . (1984) " Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant - Selection Markers In Mouse L Cells", Gene 30:147-156). 해당 기술분야에 통상적으로 알려져 있는, 본 발명에서 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술적 방법들은 문헌에 설명되어 있다 (Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al . (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al . (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells", J. Mol. Biol. 150:1-14).

발명의 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해서는 Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭가능한 것일 때, 숙주세포의 배양 중에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복사물 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 이중체 분자의 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열과 결합되기 때문에, 폴리펩티드의 생성도 또한 증가할 것이다 (Crouse et al . (1983) " Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes ", Mol. Cell. Biol. 3:257-266).

숙주세포는 발명의 두 개의 발현 벡터로 공-형질전환될 수 있는데, 첫 번째 벡터는 이중체 분자의 첫 번째 폴리펩티드를 코드화하고, 두 번째 벡터는 이중체 분자의 두 번째 폴리펩티드를 코드화한다. 두 개의 벡터는 두 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 또는 달리 두 개의 폴리펩티드를 모두 코드화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 분자의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.

일단 발명의 분자 (즉 이중체)가 재조합적으로 발현되고 나면, 그것은 폴리펩티드, 다단백질 또는 이중체의 정제에 대해 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서든지 (예컨대 항원 선택성을 토대로 한 항체 정제 개략도와 유사하게), 예를 들면 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환, 친화성, 특히 특이한 항원에 대한 친화성에 의한 (이중체 분자가 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 경 우 임의로 단백질 A 선택 후에), 및 크기 분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 폴리펩티드, 다단백질 또는 이중체의 정제를 위한 어떠한 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다.

5. 예방 및 치료 방법

본 발명의 분자는 특히 FcγR에 의해 중재되는 이펙터 세포 기능 (예컨대 ADCC)이 요구되는 경우인 질병, 장애 또는 감염 (예컨대 암, 감염성 질병)의 치료 및/또는 방지에 유용하다. 상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 이중체는 그 이중체 분자가 Fc 도메인을 포함하지 않음에도 불구하고 이펙터 기능을 유도함에 있어 항체-유사 기능성을 나타낼 수 있다. FcγR을 면역특이적으로 인식하는 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함함으로써, 이중체 분자는 FcγR 결합 및 Fc-FcγR 상호작용과 유사한 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어 발명의 분자는 면역 이펙터 세포 (예컨대 NK 세포) 상에서 세포 표면 항원 및 FcγR (예컨대 FcγRIIIA)에 결합할 수 있어서 상기 세포에 대해 이펙터 기능 (예컨대 ADCC, CDC, 식세포 작용, 옵소닌화 등)을 자극할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 이중체 분자는 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함한다. 그런 구체예에서, Fc 도메인은 추가로 야생형 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하거나 및/또는 하나 또는 그 이상의 IgG 이소타입 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)으로부터의 도메인을 포함할 수 있다. 변이체 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자는 야생형 Fc 기능을 포함하는 분자와 비교하여 부여받은 또는 변경된 표현형, 예컨대 변경된 또는 부여받은 이펙터 기능 활성 (예컨대 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석에서 분석되는 바)을 나타낼 수 있다. 상기 구체예에서, 부여받은 또는 변경된 이펙터 기능 활성을 가지는 발명의 분자는, 이펙터 기능 활성의 증강된 효능이 요구되는 질병, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 방지에 유용하다. 어떤 구체예에서, Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 발명의 이중체 분자는 보체 의존성 캐스케이드를 중재한다. 이펙터 기능을 변경시키는 것으로 확인된 Fc 도메인 변이체는 본 발명자들의 동시 출원인 국제 출원 WO04/063351, 미국 특허 출원 공보 2005/0037000 및 2005/0064514, 미국 임시 출원 60/626,510 (2004. 11. 10에 출원됨), 60/636,663 (2004. 12. 15에 출원됨), 및 60/781,564 (2006. 3. 10에 출원됨), 및 미국 특허 출원 11/271,140 (2005. 11. 10에 출원됨), 및 11/305,787 (2005. 12. 15에 출원됨)에 개시된다.

본 발명은 대상에서 암의 치료, 방지 또는 관리를 위한 방법 및 조성물을 포함하는데, 그 방법은 대상에게 하나 또는 그 이상의 에피토프 결합 부위와, 임의로 발명에 따라 공학적으로 조작된 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 분자의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하며, 상기 분자는 추가로 암 항원에 결합한다. 발명의 분자는 특히 일차 종양의 성장 또는 진전, 암세포 전이, 및 감염성 질병의 방지, 억제, 감소에 유용하다. 특별한 작용 메커니즘에 의해 구속되기를 의도하지는 않지만, 발명의 분자는 이펙터 기능을 중재하여 종양 제거, 종양 감소 또는 그것들의 조합을 유발한다. 대체 구체예에서 발명의 이중체는 세포 표면 항원 및/또는 수용체의 교차 결합 및 증강된 아폽토시스 또는 네거티브 성장 조절 신호화에 의해 치료 활성을 중재한다.

특별한 작용 메커니즘에 의해 구속되기를 의도하지는 않지만, 본 발명의 이중체 분자는 해당 기술분야에 공지되어 있는 치료 항체와 비교하여, 부분적으로는 감소된 수준으로 특별한 항원 (예컨대 FcγR)을 발현하는 표적 세포에 면역특이적으로 결합하는 이중체의 능력으로 인해, 예를 들면 이중체-에피토프 상호작용의 개선된 결합능력으로 인해 표적 세포상에 더 오래 유지되는 이중체의 능력에 의하여 증강된 치료 효능을 나타낸다.

항원 (예컨대 FcγR)에 대한 친화성 및 결합 능력이 증강되어 있는 본 발명의 이중체는 특히 FcγR이 표적 세포 집단에서 저수준으로 발현되는 경우, 대상의 암, 또는 다른 질병 또는 장애의 치료, 방지 또는 관리에 유용하다. 본원에서 사용되는, 세포에서의 FcγR 발현은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 측정되는 바, 세포당 그런 분자들의 밀도의 관점에서 정의된다. 다중 에피토프 결합 부위와, 임의로 FcγR (또는 그것의 일부)를 포함하는 발명의 분자는 바람직하게는 또한 표적 항원, 예컨대 암 항원을 30,000 내지 20,000 분자/세포의 밀도로, 20,000 내지 10,000 분자/세포의 밀도로, 10,000 분자/세포 또는 그 미만의 밀도로, 5000분자/세포 또는 그 미만의 밀도로, 또는 1000분자/세포 또는 그 미만의 밀도로 발현하는 세포에서 부여받은 또는 증강된 결합능력 및 친화성 및/또는 이펙터 기능을 가진다. 본 발명의 분자는 특히 하위집단에서의 암과 같은 질병 또는 장애의 치료, 방지 또는 관리에 유용하고, 이때 표적 항원은 표적 세포 집단에서 저수준으로 발현된다.

본 발명의 분자는 또한 암, 자가면역 질병, 염증성 장애, 및 감염성 질병과 같은 질병의 치료 또는 방지를 위해 해당 기술분야에서 공지되어 있는 다른 치료제와 조합하여 유익하게 활용될 수 있다. 특정 구체예에서, 발명의 분자는 단클론성 또는 키메릭 항체, 림포카인, 또는 조혈 성장 인자 (예컨대 IL-2, IL-3 및 IL-7)와 조합하여 사용될 수 있고, 그것들은 예를 들면 분자와 상호작용하는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키고, 면역 반응을 증가시키는 작용을 한다. 발명의 분자는 또한 유익하게도 질병, 장애, 또는 감염을 치료하기 위해 사용되는 하나 또는 그 이상의 약물, 예컨대 항암제, 항염증제 또는 항바이러스제, 예를 들면 하기 단원 7에서 상세하게 설명된 것들과 조합하여 활용될 수 있다.

5.1 암

본 발명은 다중 에피토프 결합 도메인을 포함하는 하나 또는 그 이상의 분자의 치료적으로 효과적인 양을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암의 치료 또는 방지를 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 FcγR 다형성, 예컨대 FcγRIIIA-158V 또는 FcγRIIIA-158F 대립형질에 대해 동형접합성인 것들로 대상의 암을 치료 또는 방지하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 어떤 구체예에서 본 발명은 FcγRIIIA (158F)에 면역특이적으로 결합하기 위해 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 공학적으로 조작하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 FcγRIIIA (158V)에 면역특이적으로 결합하기 위해 이중체 분자의 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 공학적으로 조작하는 것을 포함한다.

표준 단클론성 항체 치료법의 효능은 대상의 FcγR 다형성에 좌우된다 (Cartron et al . (2002) " Therapeutic Activity Of Humanized Anti - CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene ", Blood 99:754-758; Weng et al . (2003) " Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma ", J Clin Oncol. 21(21):3940-3947). 이들 수용체는 이펙터 세포의 표면에 발현되고 ADCC를 중재한다. 저친화성 활성화 수용체의 고친화성 대립형질은 ADCC를 중재하는 이펙터 세포의 능력을 개선한다. 이펙터 기능을 이루기 위해 Fc-FcγR 상호작용에 의존하는 것과 대조적으로, 본 발명의 방법은 저친화성 활성화 수용체를 면역특이적으로 인식하도록 분자를 공학적으로 조작하여 분자가 특이한 다형성에 대해 디자인되는 것을 가능하게 하는 것을 포함한다. 또는 달리 또는 추가로, 발명의 분자는 이펙터 세포 상의 FcγR에 대해 증강된 친화성 (야생형 Fc 도메인에 비해)을 나타내는 변이체 Fc 도메인을 포함하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 발명의 공학적으로 조작된 분자는 그것들의 FcγR 다형성에 관계없이 환자에 대해 더 좋은 면역치료 시약을 제공한다.

본 발명에 따라 공학적으로 조작된 이중체 분자는 배양된 셀라인 또는 환자 유도된 PBMC 세포를 사용하여 ADCC에 의해 시험되어 ADCC를 증강시키는 Fc 돌연변이의 능력이 측정된다. 표준 ADCC는 본원에 기술된 방법을 사용하여 수행된다. 림프구는 말초혈로부터 피콜-파크 구배 (Pharmacia)를 사용하여 말초혈로부터 수득된다. 표적 세포, 즉 배양된 셀라인 또는 환자 유도된 세포는 유로퓸 (PerkinElmer)과 함께 부하되고 이펙터와 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 방출된 유로퓸은 형광 플레이트 판독기 (Wallac)를 사용하여 검출된다. 그 결과의 ADCC 데이터는 NK 세포 중재된 세포독성을 야기하고 그 분자가 환자 샘플 및 현탁 분리된 단핵세포로 시험될 수 있는 지를 수립하기 위한 본 발명의 분자의 효능을 가리킨다. 그런 다음 ADCC 활성을 유도하는 것에 대해 가장 큰 잠재력을 나타낸 이중체 분자가 환자로부터의 PBMC를 사용하는 ADCC 분석에서 시험된다. 건강한 공여자로부터의 PBMC가 이펙터 세포로서 사용된다.

따라서 본 발명은 암 항원을 특징으로 하는 암을 방지 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 상기 암 항원을 면역특이적으로 인식하고, 하나 또는 그 이상의 이펙터 기능 (예컨대 ADCC, 식세포작용)을 중재하도록 이중체 분자를 공학적으로 조작하여 이중체 분자가 그 자체로 세포독성이 되고 (예컨대 증가된 아폽토시스 또는 증식성 신호의 하향조절을 유도하는 표면 수용체의 교차결합을 통해) 및/또는 본 발명에 따라 Fc 도메인을 포함하게 된다. 본 발명에 따라 공학적으로 조작된 이중체는, 그것이 세포독성 활성 (예컨대 증강된 종양 세포 사멸 및/또는 증강된, 예컨대 ADCC 활성 또는 CDC 활성)을 가지기 때문에 암의 방지 또는 치료에 유용하다.

암 항원과 관련된 암은 암 항원과 결합하고 세포독성인 이중체의 투여에 의해 치료 또는 방지될 수 있고, 및/또는 본 발명의 방법에 따라 이펙터 기능을 나타내도록 공학적으로 조작되었다. 예를 들어 그것에 한정되는 것은 아니지만, 다음의 암 항원과 관련된 암은 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료 또는 방지될 수 있다: KS 1/4 pan-암종 항원 (Perez et al . (1989) " Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1 /4 Epithelial Carcinoma Marker ", J. Immunol. 142:3662-3667; Moller e al . (1991) " Bispecific - Monoclonal - Antibody - Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes ", Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216), 난소 암종 항원 (CA125)(Yu et al . (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants", Cancer Res. 51(2):468-475), 전립선산 포스페이트 (Tailor et al . (1990) " Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full - Length cDNA Clone ", Nucl. Acids Res. 18(16):4928), 전립선 특이 항원 (Henttu et al . 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Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal , Gastric , And Pancreatic Carcinoma ", J. Clin. Immunol. 2:135-140), CTA-1 및 LEA, 버킷 림프종 항원-38.13, CD19 (Ghetie et al . (1994) " Anti - CD19 Inhibits The Growth Of Human B- Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest ", Blood 83:1329-1336), 사람 B-림프종 항원-CD20 (Reff et al . (1994) " Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20 ", Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al . (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 ( Anti - CD33 ) In Acute Myelogenous Leukemia ", J. Nucl. Med. 34:422-430), 흑색종 특이 항원, 예컨대 강글리오시드 GD2 (Saleh et al . (1993) " Generation Of A Human Anti - Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen ", J.Immunol., 151, 3390-3398), 강글리오시드 GD3 (Shitara et al . (1993) "A Mouse / Human Chimeric Anti -( Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities ", Cancer Immunol. 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Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade ( Ab1 , Ab2 , and Ab3 )", J. Immunol. 141:1398-1403), 네오당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원, 예컨대 EGFR (상피 성장 인자 수용체), HER2 항원 (p185^HER2), 다형성 상피 뮤신 (PEM) (Hilkens et al . (1992) " Cell Membrane - Associated Mucins And Their Adhesion - Modulating Property ", Trends in Biochem. Sci. 17:359-363), 악성 사람 림프구 항원-APO-1 (Trauth et al . (1989) " Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis ", Science 245:301-304), 분화항원 (Feizi (1985) " Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco -Developmental Antigens ", Nature 314:53-57), 예컨대 태아 적혈구 및 일차 내피에서 발견된 I 항원, 위 선암종에서 발견된 I(Ma), 유방 상피에서 발견된 M18 및 M39, 골수종 세포에서 발견된 SSEA-1, 결장암에서 발견된 VEP8, VEP9, My1, VIM-D5, 및 D₁56-22, TRA-1-85 (혈액 그룹 H), 결장 선암종에서 발견된 C14, 폐 선암종에서 발견된 F3, 위암에서 발견된 AH6, Y 합텐, 배아 암종 세포에서 발견된 Le^y, TL5 (혈액 그룹 A), A431 세포에서 발견된 EGF 수용체, 췌장암에서 발견된 E₁ 시리즈 (혈액 그룹 B), 배아 암종 세포, 위 선암종에서 발견된 FC10.2, 선암종에서 발견된 CO-514 (혈액 그룹 Le^a), 선암종에서 발견된 NS-10, CO-43 (혈액 그룹 Le^b), G49, EGF 수용체, 결장 선암종에서 발견된 (혈액 그룹 ALe^b/Le^y), 결장암에서 발견된 19.9, 위암 뮤신, 골수종 세포에서 발견된 T₅A₇, 흑색종에서 발견된 R₂₄, 배아 암종 세포에서 발견된 4.2, G_D3, D1.1, OFA-1, G_M2, OFA-2, G_D2, M1:22:25:8 및 4-8-세포 단계 배에서 발견된 SSEA-3, SSEA-4. 다른 구체예에서, 항원은 피부의 T 세포 림프종으로부터 유래된 T 세포 수용체 유도된 펩티드이다 (Edelson (1998) " Cutaneous T- Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy ", Cancer J Sci Am. 4:62-71).

본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료 또는 방지될 수 있는 암 및 관련 장애로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 백혈병, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 예컨대 골수아세포성, 전골수성, 골수 단핵세포성, 단핵세포성, 적백혈병성 백혈병 및 골수 이형성 증후군, 만성 백혈병, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 만성 골수성 (과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 낫세포 백혈병; 진성 다혈구증; 림프종, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 호지킨 질병, 비-호지킨 질병; 다발성 골수종, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 무증상 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화성 골수종, 형질 세포 백혈병, 고립성 형질세포종 및 골수외 형질세포종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 중요도가 측정되지 않은 단클론성 감마글로불린병증; 양성 단클론성 감마글로불린병증; 중쇄 질병; 뼈 및 연결조직 육종, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 뼈 육종, 골육종, 연골 육종, 유윙 육종, 악성 거대 세포 종양, 뼈의 섬뮤육종, 척색종, 골막 육종, 연조직 육종, 혈관 육종, 섬유육종, 카포시 육종, 평활근 육종, 지방 육종, 림프관 육종, 신경초종, 횡문근 육종, 활액막 육종; 뇌종양, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 신경교종, 성상 세포종, 뇌간 신경교종, 상의세포종, 희돌기교종, 비신경교종, 청신경 초종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 송과체세포종, 송과체아세포종, 일차 뇌 림프종; 유방암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 선암종, 소엽성 (작은 세포) 암종, 도관 내 암종, 수질성 유방암, 점액성 유방암, 관상 유방암, 유두상 유방암, 파제트병, 및 염증성 유방암; 부신암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 크롬 친화성 및 부신피질 암종; 갑상선 암, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유두상 또는 여포성 갑상선암, 수질성 갑상선암 및 악성 갑상선암; 췌장암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마 (vipoma), 소마토스타틴-분비 종양, 및 암양종 또는 샘세포 종양; 뇌하수체 암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 쿠싱병, 프로락틴-분비 종양, 말단비대증, 및 요붕증; 안암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 안구 흑색종, 예컨대 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 및 모양체 흑색종 및 망막모세포종; 질암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 세포 암종, 선암종, 및 흑색종; 외음부암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 세포 암종, 흑색종, 선암종, 기저세포 암종, 육종, 및 파제트병; 자궁경부암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 세포 암종, 및 선암종; 자궁암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 자궁내막 암종 및 자궁 육종; 난소암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 난소 상피암종, 경계선상 종양, 생식세포 종양, 및 기질 종양; 식도암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 암, 선암종, 선양낭포 암종, 점막표피양 암종, 선상피 암종, 육종, 흑색종, 형질 세포종, 우상암종, 및 귀리 세포 (작은 세포) 암종; 위암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 선암종, 균상 (폴립모양), 궤양화, 표재 확장성, 분산성 확장성, 악성 림프종, 지방 육종, 섬유 육종, 및 암육종; 결장암; 직장암; 간암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 간세포 암종 및 간아세포종, 담낭암, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 선암종; 담관 암종, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유두상, 결절성, 및 분산성; 폐암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비-작은 세포 암종 및 작은 세포 폐암; 고환암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 생식세포 종양, 정상 피종, 악성의, 고전적 (전형적), 정모 세포성, 비정상 피종, 배아 암종, 기형 암종, 융모막 암종 (난황낭 종양), 전립성 암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 선암종, 평활근 육종, 및 횡문근 육종; 패널 암 (panel cancer); 구강암, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 세포 암종; 기저암; 침샘암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 선암종, 점막표피양 암종, 및 선양낭포암; 인두암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 비늘모양 세포 암, 및 사마귀모양; 피부암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 기저세포 암종, 비늘모양 세포 암종 및 흑색종, 표재성 확산성 흑색종, 결정성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종; 신장암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 신장세포암, 선암종, 부신종, 섬유육종, 이행세포 암 (신우 및/또는 요관); 윌름 종양; 방광암, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 이행세포 암종, 비늘모양세포 암, 선암종, 암육종. 또한 암은 점액육종, 골원성 육종, 내피 육종, 림프관 내피 육종, 중피종, 활액막종, 혈관아세포종, 내피 암종, 낭선암종, 기관지원성 암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종 및 유두상 선암종 (Fishman et al . (1985) Medicine , 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia; and Murphy et al . (1997) Informed Decisions : The Complete Book of Cancer Diagnosis , Treatment , and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

따라서 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 다양한 암 또는 다른 비정상적인 증식성 질병, 이를테면 (그것들에 한정되는 것은 아니지만) 다음의 치료 또는 방지에 유용하다: 암종, 이를테면 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 전립선, 경부, 갑상선 및 피부의 암종; 이를테면 비늘모양 세포 암종; 림프성 계통의 조혈 종양, 이를테면 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아세포 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종; 골수성 계통의 조혈 종양, 이를테면 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병; 간엽 기원의 종양, 이를테면 섬유육종 및 횡문근 육종; 다른 종양, 이를테면 흑색종, 정상 피종, 기형 암종, 신경아세포종 및 신경교종; 중추 및 말초 신경계 종양, 이를테면 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 및 신경초종; 간엽 기원 종양, 이를테면 섬유육종, 횡문근 육종, 및 골육종; 및 기타 종양, 이를테면 흑색종, 색소성 건피증, 각질극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암 및 기형암종. 또한 아폽토시스의 일탈에 의해 유발된 암 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있을 것으로 여겨진다. 그러한 암으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 여포성 림프종, p53 돌연변이가 포함된 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 전암성 병변, 예컨대 가계성 대장플립증, 및 골수이형성 증후군이 있다. 특정 구체예에서 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장 또는 자궁의 악성 또는 이상증식성 변화 (예컨대 화생 및 이상형성), 또는 과증식성 장애가 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료 또는 방지된다. 다른 특정 구체예에서 육종, 흑색종, 또는 백혈병이 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료 또는 방지된다.

특정 구체예에서, 발명의 분자 (예컨대 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 이중체)는 암세포 성장을, 발명의 상기 분자의 부재시 암세포 성장과 비교하여 최소한 99%, 최소한 95%, 최소한 90%, 최소한 85%, 최소한 80%, 최소한 75%, 최소한 70%, 최소한 60%, 최소한 50%, 최소한 45%, 최소한 40%, 최소한 35%, 최소한 30%, 최소한 25%, 최소한 20%, 또는 최소한 10% 억제 또는 감소시킨다.

특정 구체예에서, 발명의 분자 (예컨대 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 이중체)는 원래의 분자보다 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 100% 더 낫게 세포를 사멸하거나 암세포 성장을 억제 또는 감소시킨다.

5.2 자가면역 질병 및 염증성 질병

어떤 구체예에서, 발명의 분자는 본 발명의 방법에 따라 공학적으로 조작된, FcγRIIB에 특이한 에피토프 결합 도메인 및/또는 변이체 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는데, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비하여 FcγRIIB에 대해 더 큰 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 그런 결합 특성을 가지는 발명의 분자는 면역반응을 조절하는데, 예컨대 자가면역 질병 또는 염증성 질병과 관련된 면역 반응을 억제하는 데 유용하다. 어떠한 작용 메커니즘에 구속되는 것을 의도하지는 않지만, FcγRIIB에 대한 친화성을 가지고 및/또는 FcγRIIB에 대해 증가된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대해 감소된 친화성을 가지는 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자는 FcγR에 대한 활성화 반응의 완충 및 세포 반응성의 억제를 유도할 수 있고, 그로써 자가면역 장애의 치료 및/또는 방지에 치료적 효과를 나타낸다.

본 발명은 또한 대상에서 염증성 장애와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 방지, 치료, 또는 관리하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 하나 또는 그 이상의 항염증제의 치료적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 자가면역 질병과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 방지, 치료, 또는 관리하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 하나 또는 그 이상의 면역조절제의 치료적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 아래의 단원 7은 항염증제 및 면역조절제의 비-제한적인 실례를 제공한다.

본 발명의 분자를 투여함으로써 치료될 수 있는 자가면역 장애의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루우-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판상 루푸스, 혼합형 한랭 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 귈랑-바레병, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소증 자반병 (ITP), IgA 신경병증, 청소년 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합형 연결조직 질환, 다발성 경색, 타입 1 또는 면역-중재된 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발성 동맥염, 다발성 연골염, 다선증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성 근염 및 피부근육염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙산 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류머티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇠그렌 증후군, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염, 예컨대 포진성 피부염, 혈관염, 백반증, 및 베게너 육아종증. 염증성 장애의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 알레르기성 질환, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염으로부터 유발된 만성 염증. 상기 단원 2.2에서 설명된 것과 같이, 어떤 자가면역 장애는 염증 상태와 관련된다. 그러므로 자가면역 장애와 염증성 장애 사이에는 겹치는 부분이 있는 것으로 여겨진다. 그러므로 어떤 자가면역 장애는 또한 염증성 장애에서 특성확인될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 방지, 치료 및 관리될 수 있는 염증성 장애의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 알레르기성 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염으로부터 유발된 만성 염증이 있다.

FcγRIIB에 특이한 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인 및/또는 FcγRIIB에 대해 증가된 친화성 및 FcγRIIIA에 대해 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자는 또한 동물, 특히 포유류가 염증성 장애로 경험하는 염증을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서 발명의 분자는 동물의 염증을, 상기 분자가 투여되지 않은 동물에서의 염증에 비교하여 최소한 99%, 최소한 95%, 최소한 90%, 최소한 85%, 최소한 80%, 최소한 75%, 최소한 70%, 최소한 60%, 최소한 50%, 최소한 45%, 최소한 40%, 최소한 35%, 최소한 30%, 최소한 25%, 최소한 20%, 또는 최소한 10% 감소시킨다.

FcγRIIB에 특이한 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인 및/또는 FcγRIIB에 대해 증가된 친화성 및 FcγRIIIA에 대해 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자는 또한 이식 거부를 방지하기 위해 사용될 수 있다.

5.3 감염성 질병

본 발명은 또한 대상에서 감염성 질병을 치료 또는 방지하기 위한 방법을 포함하는데, 그 방법은 상기 감염성 질병과 관련된 감염성 병원체에 특이한 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 발명의 하나 또는 그 이상의 분자의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 발명의 분자는 감염성 병원체에 독성이고, 상기 분자가 없을 때의 면역 반응에 비교하여 상기 병원체에 대한 면역반응을 증강시키거나 상기 병원체에 대한 이펙터 기능을 증강시킨다. 발명의 분자에 의해 치료되거나 방지될 수 있는 감염성 질병은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 바이러스, 박테리아, 진균류, 원생동물, 및 바이러스를 포함하는 감염성 병원체에 의해 유발된다.

본 발명의 방법과 결합하여 본 발명의 분자를 사용하여 치료되거나 방지될 수 있는 바이러스 질병으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노 바이러스, 단순 포진 유형 I (HSV-I), 단순 포진 유형 II (HSV-II), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스, 사이토메갈로 이러스, 에키노 바이러스, 아르보 바이러스, 한타바이러스, 코사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 소아마비 바이러스, 천연두, 엡스타인 바르 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 타입 I (HIV-I), 사람 면역결핍 바이러스 타입 II (HIV-II), 및 바이러스성 수막염, 뇌염, 뎅그열 또는 천연두와 같은 바이러스성 질병의 병원체에 의해 유발된 것들을 포함한다.

박테리아에 의해 유발되고, 본 발명의 방법과 결합하여 본 발명의 분자를 사용하여 치료되거나 방지될 수 있는 박테리아성 질병은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 미코박테리아 리케차, 미코플라스마, 나이지리아, S. 뉴모니아, 보렐리아 버그도르페리 (라임병), 바실루스 안트라시스 (탄저병), 파상풍, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 미코박테리아, 테타누스, 퍼티수스, 콜레라, 플라그, 디프테리아, 클라미디아, 녹농균 및 레지오넬라에 의해 유발되는 것들이다.

원생동물에 의해 유발되고, 본 발명의 방법과 결합하여 본 발명의 분자를 사용하여 치료되거나 방지될 수 있는 원생동물 질병은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 레슈마니아, 코크지디오아, 트리파노소마 또는 말라리아에 의해 유발되는 것들이다.

기생충에 의해 유발되고, 본 발명의 방법과 결합하여 본 발명의 분자를 사용하여 치료되거나 방지될 수 있는 기생충 질병은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 클라미디아 및 리케차에 의해 유발되는 것이다.

발명의 한 측면에 따라서, 감염성 병원체에 특이한 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 발명의 분자는 상기 병원체, 예컨대 병원성 단백질을 향한 항체 이펙터 기능을 나타낸다. 감염성 병원체의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 박테리아 (예컨대 대장균, 클라브시엘라 뉴모니아에, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에시알스, 칸디다 알비칸스, 프로테우스 불가리스, 스타필로코쿠스 비리단스, 및 슈도모나스 아에루기노사), 병원균 (예컨대 B-림프친화성 파포바바이러스 (LPV); 보르다텔라 페르투시스; 보르나병 바이러스 (BDV); 소 코로나 바이러스; 맥락수막염 바이러스; 뎅기열 바이러스; 바이러스, 대장균; 에볼라; 에코바이러스 1; 에코바이러스-11 (EV); 내독소 (LPS); 장내 박테리아; 장내 오오펀 바이러스; 엔테로바이러스; 고양이 백혈병 바이러스; 수족구 바이러스; 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GALV); 그람-음성균; 헬리코박터 파일로리; B형 간염 바이러스 (HBV); 단순 포진 바이러스; HIV-1; 사람 사이토메갈로 바이러스; 사람 코로나바이러스; 인플루엔자 A, B & C; 레지오넬라; 레이슈마이나 멕시카나; 리스테리아 모노사이토게네스; 홍역 바이러스; 뇌척수막염균; 모르빌리바이러스; 마우스 간염 바이러스; 쥐 백혈병 바이러스; 쥐 감마 포진 바이러스; 쥐 레트로바이러스; 쥐 코로나바이러스; 마우스 간염 바이러스; 미코박테리움 아비움-M; 나이지리아 고노르호에아; 뉴캐슬병 바이러스; 파보바이러스 B19; 플라스모디움 팔시파룸; 매독 바이러스; 슈도모나스; 로타바이러스; 살모넬라 타이피뮤리움; 시겔라; 스트렙토코쿠스; T-세포 림프친화성 바이러스 1; 백시니아 바이러스.

5.4 독성 제거

본 발명은 또한 독소 (예컨대 독성 약물 분자)에 노출된 대상에서 독성을 제거하는 방법을 포함하는데, 그 방법은 독성 약물 분자에 특이한 최소한 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 발명의 하나 또는 그 이상의 분자의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 독소에 대한 발명의 분자의 결합은 상기 독소의 해로운 생리적 효과를 감소 또는 제거한다. 다른 구체예에서, 독소에 대한 발명의 이중체의 결합은 상기 이중체가 없을 때의 제거, 분해 또는 중화와 비교하여 독소의 제거, 분해 또는 중화를 증가시키거나 증강시킨다. 본 발명의 방법에 따른 면역독소요법은 디곡신, PCP, 코카인, 콜히친, 및 삼환식 항우울제를 포함한 약물에 대한 과다복용 또는 노출을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

조합 치료법

본 발명은 나아가 발명의 분자를 암, 자가면역 질병, 감염성 질병 또는 중독의 치료 또는 방지에 대해 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 다른 치료법, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 현재의 표준 및 실험적 화학요법, 호르몬 치료법, 생물학적 치료법, 면역치료법, 방사선 요법, 또는 수술과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서 발명의 분자는 암, 자가면역 질병, 감염성 질병 또는 중독의 치료 및/또는 방지에 대해 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 하나 또는 그 이상의 제제, 치료 항체 또는 다른 제제의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양과 조합하여 투여될 수 있다.

어떤 구체예에서, 발명의 하나 또는 그 이상의 분자는 포유류, 바람직하게는 사람에게, 암의 치료에 유용한 하나 또는 그 이상의 다른 치료제와 함께 동시에 투여된다. 용어 "동시에"는 예방제 또는 치료제를 정확히 동일한 시간에 투여하는 것에 한정되는 것이 아니라, 오히려 발명의 분자와 다른 제제가 포유류에서 차례로, 및 시간 간격을 두고 투여되어서 발명의 분자가 다른 제제와 함께 그것들이 다르게 투여되는 경우보다 증가된 유익을 제공할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어 각각의 예방 또는 치료제 (예컨대 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법 또는 생물학적 요법)는 동일한 시간에 또는 상이한 시간 지점에서 어떤 순서든지 차례로 투여될 수 있지만; 만약 동시에 투여되지 않는다면, 그것들은 충분히 가깝게 투여되어서 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있어야 한다. 각각의 치료제는 별도로, 어떠한 적절한 형태로 및 어떠한 적당한 경로에 의해 투여될 수 있다. 다양한 구체예에서, 예방 또는 치료제는 1시간 미만 간격으로, 약 1시간 간격으로, 약 1시간 내지 약 2시간 간격으로, 약 2시간 내지 약 3시간 간격으로, 약 3시간 내지 약 4시간 간격으로, 약 4시간 내지 약 5시간 간격으로, 약 5시간 내지 약 6시간 간격으로, 약 6시간 내지 약 7시간 간격으로, 약 7시간 내지 약 8시간 간격으로, 약 8시간 내지 약 9시간 간격으로, 약 9시간 내지 약 10시간 간격으로, 약 10시간 내지 약 11시간 간격으로, 약 11시간 내지 약 12시간 간격으로, 24시간 이내의 간격으로 또는 48시간 이내의 간격으로 투여된다. 바람직한 구체예에서, 둘 또는 그 이상의 성분들은 환자가 방문할 때 한꺼번에 투여된다.

다른 구체예에서, 예방 또는 치료제는 약 2 내지 4일 간격으로, 약 4 내지 6일 간격으로, 약 1주일 간격으로, 약 1 내지 2주일 간격으로, 또는 2주 이상의 간격으로 투여된다. 바람직한 구체예에서, 예방 또는 치료제는 두 가지 제제가 여전히 활성일 수 있는 시간 틀 안에서 투여된다. 숙련자는 그런 시간 틀을 투여된 제제의 반감기를 측정함으로써 결정할 수 있을 것이다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 대상에게 주기적으로 투여된다. 사이클링 요법은 첫 번째 제제를 일정 시간 주기 동안 투여한 다음, 두 번째 제제 및/또는 세 번째 제제를 일정 시간 주기 동안 투여하고, 이런 순서의 투여를 반복하는 것을 포함한다. 사이클링 요법은 하나 또는 그 이상의 치료제의 내성의 발달을 감소시키고, 치료제의 부작용을 피하거나 감소시키며, 및/또는 치료 효능을 개선시킬 수 있다.

어떤 구체예에서, 예방 또는 치료제는 약 3주 미만, 매 2주에 1회, 매 10일마다 1회 또는 매주 1회의 사이클로 투여된다. 한 사이클은 매 사이클마다 약 90분 이상, 매 사이클마다 약 1시간 이상, 매 사이클마다 약 45분 이상의 주입에 의해 치료 또는 예방제를 투여하는 것을 포함한다. 각 사이클은 최소한 1주의 휴식기, 최소한 2주의 휴식기, 최소한 3주의 휴식기를 포함할 수 있다. 투여되는 사이클의 수는 약 1 내지 약 12 사이클이며, 보다 전형적으로는 약 2 내지 약 10 사이클이고, 보다 전형적으로는 약 2 내지 약 8 사이클이다.

다른 구체예에서, 발명의 치료 및 예방제는 규칙적인 투약 처방으로, 연속적인 주입 또는 연장된 휴식 기간 없이 빈번한 투여에 의해 투여된다. 그런 기계적 투여는 휴식 기간 없이 일정한 간격으로 투약하는 것을 포함할 수 있다. 전형적으로 치료제, 특히 세포독성제는 보다 낮은 용량으로 사용된다. 그런 투약 처방은 연장된 시간 동안 상대적으로 낮은 용량의 만성적인 매일 투여를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 더 낮은 용량의 사용은 독성 부작용을 최소화할 수 있고, 휴식 기간을 제거한다. 어떤 구체예에서, 치료제 또는 예방제는 만성 저용량 또는 약 24시간 내지 약 2일, 약 1주일, 약 2주일, 약 3주일 내지 약 1개월 내지 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월까지의 범위로 연속적인 주입에 의해 전달된다. 그런 용량 처방 계획은 숙련된 암 연구자에 의해 최적화될 수 있다.

다른 구체예에서, 치료 과정은 포유류에게 동시에 투여된다. 즉 개별적인 용량의 치료제가 시간 간격 내에 별도로 투여되어 발명의 분자가 다른 제제 또는 제제들과 함께 작동할 수 있다. 예를 들어 한 성분은 일주일에 1회 투여되고 그것과 조합되는 다른 성분은 2주일에 1회 또는 매 3주마다 1회 투여될 수 있다. 달리 표현하면, 치료제들의 투약 처방은 그 치료제들이 동시에 또는 환자 방문시 한꺼번에 투여되지 않아도 동시에 수행된다.

다른 예방 및/또는 치료제와 조합하여 사용될 때, 발명의 분자 및 예방 및/또는 치료제는 추가로 또는, 보다 바람직하게는 상조적으로 작용할 수 있다. 한 구체예에서, 발명의 분자는 동일한 약제학적 조성물로 하나 또는 그 이상의 치료제와 함께 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 발명의 분자는 별도의 약제학적 조성물로 하나 또는 그 이상의 다른 치료제와 함께 동시에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 발명의 분자는 또 다른 예방 또는 치료제가 투여되기 전에 또는 투여 후에 투여된다. 본 발명은 본 발명의 분자를 동일한 또는 상이한 투여경로에 의해, 예컨대 경구 및 비경구 투여에 의해 다른 예방 또는 치료제와 조합하여 투여하는 것을 고려한다. 어떤 구체예에서, 발명의 분자가 잠재적으로 해로운 부작용, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 독성을 유발하는 다른 예방 또는 치료제와 동시에 투여될 때, 예방 또는 치료제는 유익하게도 해로운 부작용이 유발되는 한계치 아래로 떨어지는 용량으로 투여될 수 있다,

본원에서 제공되는 단위용량의 양 및 투여횟수는 치료적으로 효과적이고 예방적으로 효과적인 관점에서 포함된다. 단위용량 및 빈도는 추가로 투여되는 특정 치료제 또는 예방제, 암의 심각성 및 유형, 투여 경로, 및 환자의 연령, 체중, 반응, 및 과거 병력에 따라 각 환자에 특이한 요인들에 따라 전형적으로 달라질 것이다. 적당한 처방은 해당 기술분야의 숙련자에 의해 그런 요인들과 다음, 예컨대 문헌에 기록되고 의사용 편람 (Physician's Desk Reference, 56^th ed., 2002)에 권장된 단위용량을 고려하여 선택될 수 있다.

5.5 항암제

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 암을 치료 및/또는 방지하기 위해 사용된 하나 또는 그 이상의 치료제와 본 발명의 하나 또는 그 이상의 분자를 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 혈관형성 억제제는 발명의 분자와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 혈관형성 억제제는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 안지오스타틴 (플라스미노겐 단편); 혈관형성 항트롬빈 III; 안지오자임; ABT-627; Bay 12-9566; 베네핀; 베바시주맵; BMS-275291; 연골-유도된 억제제 (CD1); CAI; CD59 보체 단편; CEP-7055; Col3; 콤브레타스타틴 A-4; 엔도스타틴 (콜라겐 XVIII 단편); 피브로넥틴 단편; Gro-베타; 할로퓨기논; 헤파리나아제; 헤파린 6당체 단편; HMV833; 사람 융모성 고나도트로핀 (hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도성 단백질 (IP-10); 인터류킨-12; 크링글 5 (플라스미노겐 단편); 마리마스타트; 메탈로프로테이나제 억제제 (TIMP); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트; NM-3; 판젬; PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 혈소판 인자-4 (PF4); 프리노마스타트; 프로락틴 16kDa 단편; 프로리페린-관련 단백질 (PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드; 솔리마스타트; 스쿠알라민; SS 3304; SU 5416; SU 6668; SU 11248; 테트라히드로코르티솔-S; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도미드; 트롬보스폰딘-1 (TSP-1); TNP-470; 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-b); 바스큘로스타틴; 바소스타틴 (칼레티쿨린 단편); ZD6126; ZD 6474; 파르네실 트란스페라제 억제제 (FTI); 및 비스포스포네이트.

발명의 다양한 구체예에서 발명의 약제학적 조성물과 단위용량 형태 및 키트를 포함하여 발명의 분자와 함께 사용될 수 있는 항암제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 염산염; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스로이킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나아제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비스안트렌 염산염; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부술판; 카크티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 염산염; 카르젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 염산염; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아자퀴온; 독세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 염산염; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 염산염; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 염산염; 에르불로졸; 에소루비신 염산염; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 염산염; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리신 나트륨; 젬시타빈; 젬시타빈 염산염; 히드록시우레아; 이다루비신 염산염; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II (재조합 인터류킨 II, 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴; 이리노테칸 염산염; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 염산염; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로소크산트론 염산염; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민 염산염; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미토크산트론 염산염; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 술페이트; 페르포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피로크산트론 염산염; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 염산염; 퓨로마이신; 퓨로마이신 염산염; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핑골; 사핑골 염산염; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르조마이신; 스피로게르마늄 염산염; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔로크산트론 염산염; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 네스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린; 튜불로졸 염산염; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈로이로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 염산염. 다른 항암제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 20-에피-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스로이킨; ALL-TK 길항체; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-등화결정 (dorsalizing) 형태형성 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절제; 아폽토시스 조절제; 아퓨린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 탈아민효소; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 아시나스타틴 1; 아시타스타틴 2; 아시나스타틴 3; 아자세트론; 아자독소; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; pFGF 억제제; 비칼루타미드; 비스안트렌; 비스아지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 술폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복시아미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유도된 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나아제 억제제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로를른스; 클로로퀴녹살린 술폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레다스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜탄트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 오크포스페이트; 시톨리틱 인자; 시토스타틴; 다클릭시맵; 데시타빈; 데히드로디뎀닌 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맵; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 아고니스트; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 염산염; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나아제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 히페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리도네스; 이미퀴모드; 면역자극 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 아고니스트; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할라리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 술페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 2당 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소크산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루트로테칸; 류테티움 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나아제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 짝짓기 오류된 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토독소 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미토크산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론성 항체, 사람 융모성 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A+미오박테리아 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기저 요법; 머스타드 항암제; 미카페록시드 B; 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 질산 옥사이드 조절제; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 오라신; 경구용 사이토킨 인듀서; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 페르플루브론; 페르포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 염산염; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트리아민 복합체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 억제제; 단백질 A-기초 면역 조절제; 단백질 키나아제 C 억제제, 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 포합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모스테론; ras 파르네실 단백질 트란스페라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로뷔니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핑골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방물; 세무스틴; 세네센스 유도된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 변환 억제제; 신호 변환 조절제; 단일 사슬 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기세포 억제제; 줄기세포 분할 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술피노신; 과잉 활성 혈관작용성 장펩티드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오디드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방물; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 아고니스트; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 전능성 줄기세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트라아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나아제 억제제; 티로포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 요생식동-기원 성장 억제 인자; 유로키나아제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 b; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머. 바람직한 추가의 항암 약물은 5-플루오로우라실 및 류코보린이다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 치료 항체의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 것들이 있다; ZENAPAX® (다클리주맵)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland), 급성 신장 이식 거부반응의 방지를 위한 면역억제성, 인간화된 항-CD25 단클론성 항체; PANOREX^TM, 쥐 항-17-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체 (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2, 쥐 항-이디오타입 (GD3 에피토프) IgG 항체 (ImClone System); IMC-C225, 키메릭 항-EGFR IgG 항체 (ImClone System); VITAXIN^TM, 인간화된 항-αVβ3 인티그린 항체 (Applied Molecular Evolution/MedImmune); Smart M195, 인간화된 항-CD33 IgG 항체 (Protein Design Lab/Kanebo); LYMPHOCIDE^TM, 인간화된 항-CD22 IgG 항체 (Immunomedics); ICM3, 인간화된 항-ICAM3 항체 (ICOS Pharm); IDEC-114는 영장류 항-CD80 항체이다 (IDEC Pharm/Mitsubishi); IDEC-131은 인간화된 IDEC-CD40L 항체이다 (IDEC/Eisai); IDEC-151은 영장류 항-CD4 항체이다 (IDEC); IDEC-152는 영장류 항-CD23 항체이다 (IDEC/Seikagaku); SMART 항-CD3은 인간화된 항-CD3 IgG이다 (Protein Design Lab); 5G1.1은 인간화된 항-보체 인자 5 (C5) 항체이다 (Alexion Pharm); D2E7은 인간화된 항-TNF-α 항체이다 (CAT/BASF); CDP870은 인간화된 항-TNF-α Fab 단편이다 (Celltech); IDEC-151은 영장류 항-CD4 IgG1 항체이다 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4는 사람 항-CD4 IgG 항체이다 (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571은 인간화된 항-TNF-α IgG4 항체이다 (Celltech); LDP-02는 인간화된 항-α4β7 항체이다 (LeukoSite/Genetech); OrthoClone OKT4A는 인간화된 항-CD4 IgG 항체이다 (Ortho Biotech); ANTOVA^TM은 인간화된 항-CD40L IgG 항체이다 (Biogen); ANTEGREN^TM은 인간화된 항-VLA-4 IgG 항체이다 (Elan); 및 CAT-152는 사람 항-TGF-β₂ 항체이다 (Cambridge Ab Tech). 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 치료 항체의 실례는 아래 표 8에 나타낸다.

표 8. 항암 치료 항체

5.6 면역조절제 및 항- 염증제

본 발명은 발명의 분자를 다른 치료제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질병과 염증성 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 자가면역조절제의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, ENBREL, REMICADE^TM, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 및 마크로라이드 항생물질 (예컨대 FK506 (타크로리무스)), 메틸프레드니솔론 (MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 미코페놀레이트 모페틸, 라파마이신 (시로리무스), 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민 (예컨대 레플루나미드), T 세포 수용체 조절제, 및 사이토킨 수용체 조절제가 있다.

항염증제는 염증성 및 자가면역 장애의 치료에 성공적인 것으로 나타났고, 현재 그런 장애에 대한 통상적인 표준 치료제이다. 해당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 어떠한 항염증제든지 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 항염증제의 비-제한적인 실례로는 비-스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID), 스테로이드성 항염증성 약물, 베타-아고니스트, 항콜린작용성 제제, 및 메틸 크산틴이 있다. NSAID의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 아스피린, 이부프로펜, 셀리콕시브 (CELEBREX^TM), 디클로페낙 (VOLTAREN^TM), 에토돌락 (LODINE^TM), 페노프로펜 (NALFON^TM), 인도메타신 (INDOCIN^TM), 케토랄락 (TORADOL^TM), 옥사프로진 (DAYPRO^TM), 나부멘톤 (RELAFEN^TM), 술린닥 (CLINORIL^TM), 톨멘틴 (TOLECTIN^TM), 로페콕시브 (VIOXX^TM), 나프록센 (ALEVE^TM, NAPROSYN^TM), 케토프로펜 (ACTRON^TM) 및 나부메톤 (RELAFEN^TM)이 있다. 그러한 NSAID는 시클로옥사게나아제 효소 (예컨대 COX-1 및/또는 COX-2)를 억제함으로써 기능한다. 스테로이드성 항-염증성 약물의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 글루코코르티코이드, 덱사메타손 (DECADRON^TM), 코르티손, 히드로코르티손, 프레드니손 (DELTASONE^TM), 프레드니솔론, 트리암시놀론, 아줄피딘, 및 에이코사노이드, 예컨대 프로스타글란딘, 트롬복산, 및 류코트리엔이 있다.

발명의 분자와 함께 염증성 장애의 치료 또는 방지를 위해 사용될 수 있는 항체의 비-제한적인 실례는 아래의 표 9에 제공되고, 자가면역 장애의 치료 또는 방지에 사용될 수 있는 항체의 비-제한적인 실례는 아래의 표 10에 제공된다.

표 9. 염증성 질병의 치료를 위한 치료 항체

표 10. 자가면역 장애의 치료를 위한 치료 항체

5.7 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한 제제

어떤 구체예에서, 발명의 분자는 감염성 질병의 치료 및/또는 방지를 위해 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 하나 또는 추가의 치료제의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명은 감염성 질병의 치료 및/또는 방지를 위해 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 항생물질과 조합하여 발명의 분자를 사용하는 것을 고려한다. 발명의 분자와 조합하여 사용될 수 있는 항생물질의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 것들이 있다: 마크로라이드 (예컨대 토브라마이신 (Tobi®)), 세팔로스포린 (예컨대 세팔렉신 (Keflex®), 세프라딘 (Velosef®), 세프록심 (Ceftin®), 세프로질 (Cefzil®), 세파클로르 (Ceclor®), 세픽심 (Suprax®) 또는 세파드록실 (Duricef®)), 클라리트로마이신 (예컨대 클라리트로마이신 (Biaxin®)), 에리트로마이신 (예컨대 에리트로마이신 (EMycin®)), 페니실린 (예컨대 페니실린 V (V-실린 K® 또는 Pen Vee K®)) 또는 퀴놀론 (예컨대 오플록사신 (Floxin®)), 시프로플록사신 (Cipro®) 또는 노르플록사신 (Noroxin®)), 아미노글리코시드 항생물질 (예컨대 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 운데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 및 스펙티노마이신), 암페니콜 항생물질 (예컨대 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생물질 (예컨대 리파미드 및 리팜핀), 카르바세펨 (예컨대 로라카르베프), 카르바페넴 (예컨대 비아페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린 (예컨대 세파클로르, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세피미졸, 세피라미드, 및 세피로몌, 세파마이신 (예컨대 세프부페라존, 세프메타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐 (예컨대 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세펨 (예컨대 플로모세프, 및 목살락탐), 페니실린 (예컨대 암디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린 나트륨, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트 요오드화 수소산염, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피사이클린, 및 펜시히실린 칼륨), 린코사미드 (예컨대 클린다마이신, 및 린코마이신), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔듀라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린 (예컨대 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메클로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘 (예컨대 브로디모프림), 니트로퓨란 (예컨대 푸랄타돈, 및 푸라졸륨 클로라이드), 퀴놀론 및 그것의 유사체 (예컨대 시녹사신, 클리나플록사신, 플루메퀸, 및 그레파글록사신), 술폰아미드 (예컨대 아세틸 술파메톡시피라진, 벤질술파미드, 노프릴술파미드, 프탈릴술파세트타미드, 술파크리소이딘, 및 술파시틴), 술폰 (예컨대 디아티모술폰, 글루코술폰 나트륨, 및 솔라술폰), 시클로세린, 뮤피로신 및 튜베린.

어떤 구체예에서, 발명의 분자는 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 항진균제와 함께 투여될 수 있다. 발명의 분자와 함께 사용될 수 있는 항진균제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 암포테리신 B, 이트라코나졸, 케토코나졸, 플루코나졸, 인트라테칼, 플루시토신, 미코나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 니스타틴, 테르코나졸, 티오코나졸, 시클로피록스, 에코나졸, 할로프로그린, 나프티핀, 테르비나핀, 운데실레네이트, 및 그리세오풀딘이 있다.

어떤 구체예에서, 발명의 분자는 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 항바이러스제와 함께 투여될 수 있다. 발명의 분자와 함께 사용될 수 있는 유용한 항바이러스제는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 프로테아제 억제제, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 및 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 항바이러스제의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 지도부딘, 아시클로비어, 강시클로비어, 비다라빈, 이독스우리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린과, 뿐만 아니라 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비어, 인디나비어, 암프레나비어, 로피나비어, 리토나비어, 알파-인터페론, 아데포비어, 클레바딘, 엔테카비어, 플레코나릴이 있다.

6. 백신 치료법

본 발명은 추가로 항원성 또는 면역원성 제제, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 암 항원 및 감염성 질병 항원 (그것의 실례는 앞에서 설명되었다)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 그것에 대해 면역 반응이 요구되는 하나 또는 그 이상의 항원성 또는 면역원성 제제를 포함하고, 이때 하나 또는 그 이상의 항원성 또는 면역원성 제제는 FcγRIIIA에 대해 증강된 친화성을 나타내는 본 발명의 변이체 항체로 코팅된다. 본 발명의 백신 조성물은 특히 면역 반응, 바람직하게는 항원성 또는 면역원성 제제에 대해 보호성 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물 중의 항원성 또는 면역원성 제제는 그것에대한 면역 반응이 바람직한 바이러스를 포함한다. 바이러스는 재조합 또는 키메릭의 것일 수 있고, 바람직하게는 약화될 수 있다. 재조합, 키메릭, 및 감쇠된 바이러스의 생성은 해당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따라 제형될 살아있는 재조합 바이러스 백신 또는 비활성화된 재조합 바이러스 백신을 포함한다. 살아있는 백신은 숙주에서의 증식이 유사한 종류 및 크기의 연장된 자극으로 인해 천연 감염이 발생하도록 유발하고, 따라서 실질적인 장기 지속성 면역력을 부여하기 때문에 바람직할 수 있다. 그러한 살아있는 재조합 바이러스 백신 제형의 제조는 세포 배양물에서 또는 닭배아의 요막에서 바이러스의 증식과 이어서 정제를 포함하는 종래 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.

특정 구체예에서, 재조합 바이러스는 그것이 투여되는 대상에 대해 비-병원성이다. 이런 관점에서 백신 목적에 대해 유전자 공학적으로 조작된 바이러스의 사용은 이들 스트레인에서 감쇠 특성의 존재를 필요로 할 것이다. 형질전환을 위해 사용된 주형 안에 적절한 돌연변이 (예컨대 결실)를 도입시키는 것은 감쇠 특성을 가지는 신규한 바이러스를 제공할 수 있다. 예를 들어 온도 민감성 또는 한랭 적응력과 관련된 특정 미스센스 돌연변이는 결실 돌연변이 안에 이루어질 수 있다. 이들 돌연변이는 저온 또는 온도 민감성 돌연변이와 관련된 점 돌연변이보다 더 안정해야 하고, 복귀 빈도는 현저하게 낮아야 한다. 재조합 바이러스를 공학적으로 조작하기 위한 재조합 DNA 기술은 해당 기술분야에 알려져 있고, 본 발명에 포함된다. 예를 들어 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 변형시키기 위한 기술은 해당 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 5,166,057호를 참조한다.

또는 달리 "자살" 특성을 가지는 키메릭 바이러스는 발명의 피내 백신 제형에 사용하기 위해 구성될 수 있다. 그런 바이러스는 숙주 내에서 단지 1회 또는 수회 복제를 통과할 수 있다. 백신으로서 사용될 때 재조합 바이러스는 제한된 복제 사이클(들)을 통과할 것이고, 충분한 수준의 면역 반응을 유도하겠지만, 사람 숙주에서는 더 이상 통과하지 못하고 질병을 유발할 것이다. 또는 달리 비활성화된 (사멸된) 바이러스가 본 발명에 따라 제형될 수 있다. 비활성화된 백신 제형은 키메릭 바이러스를 "사멸"하기 위한 종래 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 비활성화된 백신은 그것의 감염성이 파괴되었다는 점에서 "죽은" 것이다. 이상적으로, 바이러스의 감염성은 그것의 면역원성에 영향을 미치지 않으면서 파괴되어야 한다. 비활성화된 백신을 제조하기 위하여, 키메릭 바이러스는 세포 배양물이나 닭배아의 요막에서 성장되고, 구역 초원심분리에 의해 정제되고, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤에 의해 비활성화된 후 모아진다.

어떤 구체예에서, 다른 바이러스 또는 비-바이러스 병원체로부터 유도된 항원을 포함하여 완전히 외래의 에피토프는 본 발명의 피내 백신 제형에 사용하기 위해 바이러스 안에 공학적으로 도입될 수 있다. 비-관련 바이러스의 항원, 예컨대 HIV (gp160, gp120, gp41), 기생충 항원 (예컨대 말라리아), 박테리아 또는 진균 항원 또는 종양 항원은 감쇠된 스트레인 안에 공학적으로 도입될 수 있다.

실제로 어떠한 이종성 유전자 서열이든지 피내 백신 제형에 사용하기 위해 본 발명의 키메릭 바이러스 안에 구성될 수 있다. 바람직하게는 이종성 유전자 서열은 생물학적 반응 변형제로서 작용하는 부분 및 펩티드이다. 바람직하게는 다양한 병원체, 또는 중화 항체와 결합하는 항원 중 어느 것에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 에피토프가 키메릭 바이러스에 의해 또는 그것의 일부로서 발현될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 키메릭 바이러스 안에 구성될 수 있는 이종성 유전자 서열은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 인플루엔자 및 파라인플루엔자 헤마글루티닌 뉴라미니다제 및 융합 당단백질, 예컨대 사람 PIV3의 HN 및 F 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 키메릭 바이러스 안에 공학적으로 도입될 수 있는 이종성 유전자 서열은 면역-조절 활성을 가지는 단백질을 코드화하는 것들을 포함한다. 면역-조절 단백질의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 사이토킨, 인터페론 타입 1, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터류킨-1, -2, -4, -5, -6, -12 및 이들 제제의 길항제를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 병원성 세포 또는 바이러스, 바람직하게는 그것의 표면에 변이체 항체를 발현하는 감쇠된 바이러스를 포함한다.

대체 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 융합 폴리펩티드를 포함하고, 그 안에서 항원성 또는 면역원성 제제는 FcγRIIIA에 대해 증강된 친화성을 가지는 본 발명의 변이체 항체에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 공학적으로 조작된 융합 폴리펩티드는 기본적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 수행되고 통상적인 기술 수준 범위 내에 있다.

본 발명은 추가로 발명의 조성물을 투여함으로써 대상에서 내성을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 바람직하게는 대상에서 내성을 유도하기에 적당한 조성물은 본 발명의 변이체 항체로 코팅된 항원성 또는 면역원성 제제를 포함하고, 이때 변이체 항체는 FcγRIIB에 대해 더 높은 친화성을 가진다. 비록 특별한 작용 메커니즘에 구속되기를 의도하지는 않지만, 그런 조성물은 FcγRIIB 중재된 억제 경로를 활성화시킴으로써 내성을 유도하는 데 효과적이다.

7. 조성물 및 투여 방법

본 발명은 다중 에피토프 결합 도메인 및, 임의로 Fc 도메인 (또는 그것의 일부)를 포함하는 발명의 분자 (예컨대 이중체)를 포함하는 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 대상에게 효과적인 양의, 본 발명의 융합 단백질 또는 포합된 분자, 또는 본 발명의 융합 단백질 또는 포합된 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 질병, 장애 또는 감염과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 치료, 예방, 및 개선하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면으로, 항체, 융합 단백질, 또는 포합된 분자는 실질적으로 정제된다 (즉 실질적으로 그것의 효과를 제한하거나 원하지 않는 부작용을 유발하는 물질이 없다). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게는 포유류, 예컨대 비-영장류 (예컨대 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 및 영장류 (예컨대 원숭이, 예컨대 붉은털 원숭이 및 사람)이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 사람이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 대상과 동일한 종으로부터 유래된다.

다양한 전달 시스템은 공지되어 있고, 본 발명의 분자를 포함하는 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-중재된 세포내 섭취 (Wu et al . (1987) " Receptor - Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System ", J. Biol. Chem. 262:4429-4432), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구성 등을 들 수 있다. 발명의 분자를 투여하기 위한 방법으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 비경구 투여 (예컨대 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막외, 및 점막 (예컨대 비강 내 및 경구 경로) 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, 발명의 분자는 근육 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여된다. 조성물은 어떠한 편리한 경로에 의해, 예를 들면 융합 또는 대량 급속 주사에 의해, 내피 또는 점액피부 라이닝을 통해 (예컨대 경구 점막, 직장 및 장 점막 등) 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로 활성인 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성이거나 국소적일 수 있다. 또한, 폐의 투여 또한 사용될 수 있는데, 예를 들면 흡입기 또는 분무기, 및 에어로솔화제가 들어있는 제형을 사용하여 투여된다 (미국 특허 6,019,968호; 5,985,320호; 5,985,309호; 5,934,272호; 5,874,064호; 5,855,913호; 5,290,540호; 및 4,880,078호; 및 PCT 공보 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903 참조).

본 발명은 또한 밀폐 밀봉된 용기, 예컨대 항체의 양을 표시하는 앰플 또는 봉지에 포장된다. 한 구체예에서, 발명의 분자는 밀폐 밀봉된 용기에 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 수분 없는 농축물로서 공급되고 예컨대 물 또는 식염수로 적절한 농도로 재구성되어 대상에게 투여된다. 바람직하게는 발명의 분자는 밀폐 밀봉된 용기 중의 건조 멸균된 동결건조 분말로서, 최소한 5mg, 보다 바람직하게는 최소한 10mg, 최소한 15mg, 최소한 25mg, 최소한 35mg, 최소한 45mg, 최소한 50mg, 또는 최소한 75mg의 단위 용량으로 공급된다. 발명의 동결건조된 분자는 그것의 본래 용기에 2 내지 8℃에서 보관되어야 하고, 분자는 재구성된 후 12시간 내에, 바람직하게는 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대체 구체예에서, 발명의 분자는 분자, 융합 단백질, 또는 포합된 분자의 양과 농도를 표시하는 밀폐 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 발명의 분자의 액체 형태는 밀폐 밀봉된 용기에 최소한 1mg/ml, 보다 바람직하게는 최소한 2.5mg/ml, 최소한 5mg/ml, 최소한 8mg/ml, 최소한 10mg/ml, 최소한 15mg/ml, 최소한 25mg/ml, 최소한 50mg/ml, 최소한 100mg/ml, 최소한 150mg/ml, 최소한 200mg/ml의 분자로 공급된다.

장애와 관련된 하나 또는 그 이상의 증상의 치료, 방지 또는 개선에 효과적일 본 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 제형에 사용된 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각성에 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

발명에 포함된 이중체의 경우, 환자에게 투여되는 단위용량은 전형적으로 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg 환자 체중이다. 바람직하게는 환자에게 투여되는 단위용량은 0.0001mg/kg 내지 20mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 10mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 5mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 2mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 1mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 0.75mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 0.5mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 0.25mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 0.15mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 0.10mg/kg, 0.001mg/kg 내지 0.5mg/kg, 0.01mg/kg 내지 0.25mg/kg 또는 0.01mg/kg 내지 0.10mg/kg 환자 체중이다. 발명의 이중체의 투여의 단위용량 및 빈도는 변형, 예컨대 지질화에 의해 이중체의 흡수 및 조직 투과를 증강시킴으로써 감소 또는 변경될 수 있다.

한 구체예에서, 환자에게 투여되는 발명의 분자의 단위용량은 단일 제제요법으로서 사용될 때 0.01mg/kg 내지 1000mg/kg이다. 다른 구체예에서, 발명의 분자는 다른 치료 조성물과 조합하여 사용되고, 환자에게 투여되는 단위용량은 상기 분자가 단일 제제요법으로서 사용될 때보다 더 낮다.

특정 구체예에서, 발명의 약제학적 조성물은 치료가 필요한 구역에 국소적으로투여되는 것이 바람직할 것이다; 이것은 예를 들면, 제한적인 것이 아니라, 주사에 의해, 또는 이식에 의해 이루어질 수 있고, 상기 이식은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질, 이를테면 막, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막, 또는 섬유로 만들어진다. 바람직하게는 발명의 분자가 투여될 때, 그 분자를 흡수하지 않는 물질을 사용하는 주의가 필요하다.

다른 구체예에서, 조성물은 소포체, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) " New Methods Of Drug Delivery ", Science 249:1527-1533); Treat et al ., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327).

또 다른 구체예에서, 조성물은 조절 방출 또는 지속성 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 어떠한 기법이든지 하나 또는 그 이상의 발명의 분자를 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다 (미국 특허 4,526,938호; PCT 공보 WO 91/05548; PCT 공보 WO 96/20698; Ning et al . (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained - Release Gel ", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al . (1995) " Antibody Mediated Lung Targeting Of Long - Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al . (1997) " Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application ", Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al . (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery ", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760). 한 구체예에서, 펌프가 조절 방출 시스템에서 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) " Implantable Pumps ", CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al . (1980) " Long - Term , Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis ", Surgery 88:507-516; and Saudek et al . (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery ", N. Engl. J. Med. 321:574-579). 다른 구체예에서, 중합체 물질이 항체의 조절 방출을 이루기 위해 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al . (1985) " Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled - Release Diphosphonate ", Science 228:190-192; During et al . (1989) " Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization ", Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al . (1989) " Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion - Induced Memory Deficits", J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 5,679,377호; 5,916,597호; 5,912,015호; 5,989,463호; 5,128,326호; PCT 공보 WO 99/15154; 및 PCT 공보 WO 99/20253). 지속성 방출 제형에 사용된 중합체의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 다가무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드 (PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜리드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적 (예컨대 폐)과 근접한 곳에 위치할 수 있어서 단지 전신적 용량의 일부만이 필요하다 (Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 구체예에서, 조절 방출 이식편으로서 유용한 중합체 조성물은 던 등을 따라 사용된다 (Dunn et al. U.S. 5,945,155). 이 특별한 방법은 중합체 시스템으로부터 생체 활성 물질이 제자리에서 조절된 방식으로 방출되어 치료적 효과를 나타내는 것을 기초로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 처리가 필요한 환자의 신체 내 어느 곳에서든지 일어날 수 있다. 다른 구체예에서, 비-중합체 지속성 전달 시스템이 사용되는데, 그로써 대상의 신체의 비-중합체 이식편은 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에서 이식될 때, 이식편의 유기 용매는 조성물로부터 주변 조직액으로 소멸되거나, 분산되거나 누출되며, 비-중합체 물질은 점차적으로 응고되거나 침전되어 고형의 미세다공성 물질이 형성된다 (U.S. 5,888,533).

지속성 방출 시스템은 랑거에 의해 검토되고 논의되었다 (Langer, 1990, "Nee Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533). 해당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 어떠한 기법이든지 본 발명의 하나 또는 그 이상의 치료제를 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다 (미국 특허 4,526,938호; 국제 공보 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al . (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained -Release Gel ", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al . (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long - Circulating Emulsions ", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al . (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al . (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery ", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760).

본 발명의 조성물이 본 발명의 이중체를 코드화하는 핵산인 특정 구체예에서, 핵산은 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 레트로바이러스 벡터를 사용함으로써 (미국 특허 4,980,286호), 또는 직접 주입에 의해, 또는 미소입자 폭발을 사용함으로써 (예컨대 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포표면 수용체 또는 형질전환제로 코팅함으로써, 또는 그것을 핵을 유입시키는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩티드에 연결시켜 투여함으로써 (Joliot et al. (1991) " Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) 세포 내에 있도록 투여함으로써 그것이 코드화하는 이중체의 발현을 생체 내에서 촉진하도록 투여될 수 있다. 또는 달리 핵산은 동종 재조합에 의해 발현을 위해 세포 내로 도입되고 숙주 세포 DNA 안에 통합될 수 있다.

치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양의 본 발명의 분자로 대상을 치료하는 것은 단일 치료, 또는 바람직하게는 연속적인 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 실례에서, 대상은 약 0.1 내지 30mg/kg 체중의 범위로, 약 1 내지 10주 동안 바람직하게는 2 내지 8주 동안, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주 동안, 그리고 보다 더욱 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안 일주일에 1회 본 발명의 분자로 치료된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하루에 1회, 하루에 2회, 또는 하루에 3회 투여된다. 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 일주일에 1회, 일주일에 2회, 매 2주마다 1회, 1개월에 1회, 매 6주마다 1회, 매 2개월에 1회, 1년에 2회 또는 1년에 1회씩 투여된다. 또한 치료를 위해 사용된 분자의 효과적인 단위용량은 특별한 치료 과정 동안 증가하거나 감소한다.

7.1 약제학적 조성물

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물 (예컨대 불순물이 섞였거나 비멸균 조성물) 및 유닛 단위용량 형태의 제조에 사용될 수 있는 약제학적 조성물 (즉 대상 또는 환자에게 투여하기에 적당한 조성물)을 포함한다. 그런 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 효과적인 양의 본원에 개시된 예방 및/또는 치료제 또는 그런 제제와 약제학적으로 허용되는 담체와의 조합을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 발명의 분자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명은 또한 발명의 이중체 분자와 특별한 암 항원에 특이한 치료 항체 (예컨대 종양 특이적 단클론성 항체), 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 관리기관에 의해 승인되거나 동물, 및 보다 특별하게는 사람에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에서 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대 프로이드 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 그런 약제학적 담체는 멸균액, 예컨대 물과 오일, 이를테면 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것으로, 예컨대 땅콩 기름, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액과 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액에 대한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적당한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코오스, 락토오스, 슈크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 조성물은 또한 필요에 따라 극소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환, 캡슐, 분말, 지속성 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다.

일반적으로 본 발명의 조성물의 성분들은 별도로 또는 함께 혼합되어 유닛 단위용량 형태, 예를 들면 건조 동결건조된 분말 또는 수분 없는 농축물로서 밀폐 밀봉된 용기, 예컨대 활성 제제의 양을 가리키는 앰플 또는 봉지로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하고 있는 주입 병에 나누어 담길 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플이 제공되어서 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 있다.

7.2 유전자 요법

특정 구체예에서, 본 발명의 분자를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산은 유전자 요법에 의해, 질병, 장애 또는 감염과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 치료, 방지 또는 개선하기 위해 투여된다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현가능한 핵산을 대상에게 투여함으로써 수행되는 요법을 말한다. 발명의 이 구체예에서, 핵산은 치료적 또는 예방적 효과를 중재하는 그것의 코드화된 항체 또는 융합 단백질을 생성한다.

해당 기술분야에서 활용가능한 유전자 요법에 대한 어떠한 방법이든지 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 다음과 같다: 일반적인 유전자 요법의 방법에 대한 검토, Goldspiel et al . (1993) " Human Gene Therapy ", Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al . (1991) " Delivery Systems For Gene Therapy ", Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) " Gene Therapy , Concepts , Current Trials And Future Directions ", Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) " The Basic Science Of Gene Therapy ", Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) " Human Gene Therapy ", Ann. Rev. Biochem. 62:191-217. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 대해 해당 기술분야에 통상적으로 알려져 있는 방법은 다음 문헌에 설명되어 있다: Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

바람직한 측면으로, 본 발명의 조성물은 발명의 이중체를 코드화하는 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 적당한 숙주에서 항체를 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 특히 그런 핵산은 항체 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터, 바람직하게는 이종성 프로모터를 가지며, 그 프로모터는 유도성이거나 본래적이고, 임의로 조직-특이적이다. 다른 특별한 구체예에서, 핵산 분자는 항체 코딩 서열과 어떠한 다른 원하는 서열이 게놈의 원하는 부위에서 동종 재조합을 촉진하는 영역의 양 옆에 있도록 사용되고, 그로써 항체를 코드화하는 핵산이 염색체 내에서 발현될 수 있다 (Koller et al . (1989) " Inactivating The Beta 2- Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; 및 Zijlstra et al . (1989) " Germ - Line Transmission Of A Disrupted Beta 2- Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells ", Nature 342:435-438).

바람직한 다른 측면으로, 본 발명의 조성물은 융합 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는데, 그 핵산은 적당한 숙주에서 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 특히 그런 핵산은 융합 단백질의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터, 특히 이종성 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 유도성 또는 본래적이고, 임의로 조직-특이적이다. 다른 특별한 구체예에서, 핵산 분자는 융합 단배질의 코딩 서열과 어떠한 다른 원하는 서열이 게놈의 원하는 부위에서 동종 재조합을 촉진하는 영역의 양옆에 있도록 사용되고, 그로써 융합 단백질의 염색체 내 발현이 이루어진다.

대상으로의 핵산의 전달은 대상이 직접 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 노출되는 직접적인 방식이거나, 또는 세포가 먼저 핵산으로 시험관 내에서 형질전환된 후 대상 안으로 이식되는 간접적인 방식일 수 있다. 이들 두 가지 접근법은 각각 생체 내 또는 생체 외 유전자 요법으로서 알려져 있다.

특정 구체예에서, 핵산 서열은 생체 내에서 직접 투여되는데, 이때 그것은 코드화된 생성물을 생산하도록 발현된다. 이것은 해당 기술분야에 공지되어 있는 많은 방법 중 어느 것에 의해서든지, 예를 들면 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 그것이 세포 내에 있을 수 있도록 예컨대 결핍성 또는 감쇠된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터 (미국 특허 4,980,286호)를 사용한 감염에 의해, 또는 네이키드 DNA를 직접 주사함으로써, 또는 미소입자 폭발 (예컨대 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 사용함으로써, 또는 지질 또는 세포표면 수용체 또는 형질전환 제제로 코팅함으로써, 리포솜, 미소입자, 또는 미소캡슐로 캡슐화함으로써, 또는 그것을 핵 안으로 들어가는 것으로 알려져 있는 펩티드와의 연결을 통해 투여됨으로써, 수용체-중재된 세포내 섭취에 대한 대상 항원과 연결하여 투여함으로써 이루어질 수 있다 (Wu et al. (1987) " Receptor - Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System ", J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (그것은 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는 데 사용될 수 있다). 다른 구체예에서, 항원이 엔도솜을 파괴하기 위해 융해성 바이러스 펩티드를 포함함으로써 핵산이 리소솜성 분해되는 것을 피할 수 있는 핵산-항원 복합체가 형성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 흡수 및 발현에 대해 생체 내에서 표적화될 수 있다 (PCT 공보 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316, WO 93/14188; WO 93/20221). 또는 달리 핵산은 동종 재조합에 의해 세포 내로 도입되고 발현을 위해 숙주 세포 DNA 안에 통합될 수 있다 (Koller et al . (1989) " Inactivating The Beta 2- Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; 및 Zijlstra et al . (1989) " Germ - Line Transmission Of A Disrupted Beta 2- Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells ", Nature 342:435-438).

특정 구체예에서, 발명의 분자 (예컨대 이중체 또는 융합 단백질)을 코드화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (Miller et al . (1993) " Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression ", Meth. Enzymol. 217:581-599). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패키징 및 숙주 세포 DNA 안으로의 통합에 필요한 성분들을 함유한다. 유전자 요법에 사용될 수 있는 항체 또는 융합 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 벡터에 클론되어 뉴클레오티드 서열의 대상 안으로의 전달을 촉진한다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 문헌을 참조하는데 (Boesen et al . (1993) " Circumvention Of Chemotherapy -Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1 Gene ", Biotherapy 6:291-302), 상기 문헌에는 줄기세포를 화학요법에 대해 더욱 내성으로 만들기 위해 조혈 줄기세포에 mdr 1 유전자를 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 사용에 대해 설명되어 있다. 다른 참고문헌들도 유전자 요법에서 사용되는 레트로바이러스 벡터에 대해 설명하고 있다: Clowes et al . (1994) " Long - Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes ", J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) " Retrovirus - Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells ", Blood 83:1467-1473; Salmons et al . (1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy ", Human Gene Therapy 4:129-141; 및 Grossman et al . (1993) " Retroviruses : Delivery Vehicle To The Liver ", Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114.

유전자 요법에 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 특히 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위한 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피를 자연적으로 감염시키며, 그곳에서 경미한 질병을 일으킨다. 아데노바이러스-기초 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 분할되지 않은 세포를 감염시킬 수 있는 장점이 있다. 코잘스키 등은 아데노바이러스-기초 유전자 요법에 대해 검토한 바 있다 (Kozarsky et al ., 1993, " Gene Therapy : Adenovirus Vectors ", Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503). 보우트 등은 붉은털 원숭이의 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위해 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것을 증명하였다 (Bout et al ., 1994, " Lung Gene Therapy : In Vivo Adenovirus -Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium ", Human Gene Therapy, 5:3-10). 유전자 요법에 아데노바이러스를 사용하는 다른 경우들은 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Rosenfeld et al . (1991) " Adenovirus - Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1- Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo ", Science 252:431-434; Rosenfeld et al . (1992) " In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium", Cell 68:143-155; Mastrangeli et al . (1993) " Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus - Mediated Gene Transfer", J. Clin. Invest. 91:225-234; PCT 공보 W094/12649; 및 Wang et al . (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene - Region Deletions ", Gene Therapy 2:775-783). 바람직한 구체예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다.

아데노-관련 바이러스 (AAV) 또한 유전자 요법에 사용하도록 제안되었다 (Walsh et al . (1993) " Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies ", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 및 미국 특허 5,436,146호).

유전자 요법에 대한 다른 접근법은 유전자를 조직 배양물의 세포에, 예컨대 일렉트로포레이션, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 중재된 형질전환, 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 전달하는 것을 포함한다. 통상적으로, 전달 방법은 선택가능한 마커의 세포로의 전달을 포함한다. 그런 다음 세포는 전달된 유전자를 흡수하고 그것을 발현하는 그런 세포를 분리하기 위한 선택 단계에 놓인다. 그런 세포들은 다음 단계로 대상에게 전달된다.

이 구체예에서, 핵산은 결과적으로 생성되는 재조합 세포의 생체 내 투여 전에 세포에 도입된다. 그런 도입은 해당 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서든지, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 형질전환, 일렉트로포레이션, 마이크로주사, 핵산 서열을 함유하고 있는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-중재된 유전자 전달, 미세 세포 중재 유전자 전달, 스페로플라스트 융합, 등에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자를 세포 안에 도입시키기 위한 많은 기법들이 해당 기술분야에 공지되어 있고 (Loeffler et al . (1993) " Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA ", Meth. Enzymol. 217:599-618, Cotten et al . (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells ", Meth. Enzymol. 217:618-644), 수용체 세포의 필요한 발달상 및 생리적 기능들이 파괴되지 않는다면 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 기법은 세포에 핵산의 안정한 전달을 제공하여 핵산이 세포에 의해 발현가능하고, 바람직하게는 그것의 세포 자손에 의해 유전가능하고 발현가능해야 한다.

그 결과의 재조합 세포는 해당 기술분야에 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 대상에게 전달될 수 있다. 재조합 혈액 세포 (예컨대 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포)는 바람직하게는 정맥 내로 투여된다. 사용하려고 구상하는 세포의 양은 원하는 효과, 환자 상태 등에 좌우되고, 해당 기술분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.

유전자 요법의 목적으로 그 안에 핵산이 도입될 수 있는 세포는 어떠한 원하는, 활용가능한 세포 유형을 포함하고, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 상피세포, 내피세포, 각질 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈구, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 호산성 백혈구, 거핵세포, 과립구; 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 조혈 줄기 또는 전구 세포, 예컨대 골수, 탯줄 혈액, 말초혈, 태아 간 등으로부터 얻어진 것과 같은 세포를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 유전자 요법을 위해 사용된 세포는 대상에 대해 자가조직의 것이다.

재조합 세포가 유전자 요법에서 사용되는 구체예에서, 항체 또는 융합 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 세포 안으로 도입되어 그것이 세포 또는 그것의 자손에 의해 발현가능하고, 재조합 세포는 치료 효과를 위해 생체 안으로 투여되어야 한다. 특정 구체예에서, 줄기 또는 전구 세포가 사용된다. 분리되고 시험관 내에서 유지될 수 있는 어떠한 줄기 및/또는 전구 세포든지 본 발명의 구체예에 따라 잠재적으로 사용될 수 있다 (PCT 공보 WO 94/08598; Stemple et al . (1992) " Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest ", Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) " Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes", Meth. Cell Bio. 21A:229-254; 및 Pittelkow et al . (1986) " New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns ", Mayo Clinic Proc. 61:771-777).

특정 구체예에서 유전자 요법을 목적으로 도입될 수 있는 핵산은 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함함으로써, 핵산의 발현이 적절한 전사 인듀서의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절가능하다.

7.3 키트

본 발명은 발명의 분자로 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질병의 치료에 유용한 하나 또는 그 이상의 다른 예방적 또는 치료적 제제는 또한 그 약제학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 발명의 약제학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 성분으로 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로 그런 용기에는 제약회사 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 주의사항이 첨부될 수 있고, 그런 주의사항은 제조기관에 의한 승인, 사람 투여를 목적으로 한 용도 또는 판매를 반영한다.

본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 추가로 암과 관련된 하나 또는 그 이상의 암 항원에 결합하는 하나 또는 그 이상의 세포독성 항체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 다른 예방적 또는 치료적 제제는 화학요법제이다. 다른 구체예에서, 예방적 또는 치료적 제제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.

8. 치료적 활용성의 특성확인 및 증명

본 발명의 약제학적 조성물, 예방적, 또는 치료적 제제의 여러 측면은 바람직하게는 시험관 내에서, 즉 세포 배양 시스템에서, 그리고 동물 모델 유기체에서, 예컨대 설치류 동물 모델 시스템에서, 사람에게 사용되기 전에 원하는 치료 활성에 대해 시험된다. 예를 들어 특이한 약제학적 조성물의 투여가 바람직한지의 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있는 분석법은, 환자 조직 샘플이 배양 중에 성장되고, 발명의 약제학적 조성물에 노출되거나 또는 달리 접촉되고, 그러한 조성물이 조직 샘플에 미치는 효과가 관찰되는 세포 배양 분석을 포함한다. 조직 샘플은 환자로부터 생검에 의해 얻어질 수 있다. 이 시험으로 각각의 개별적인 환자에 대해 치료적으로 가장 효과적인 예방적 또는 치료적 분자(들)이 확인될 수 있다. 다양한 특정 구체예에서, 시험관 내 분석은 자가면역 또는 염증성 장애에 포함된 세포 유형의 대표적인 세포 (예컨대 T 세포)를 사용하여, 발명의 약제학적 조성물이 그런 세포 유형에 대해 원하는 효과를 나타내는 지를 측정하기 위해 수행될 수 있다.

예방 및/또는 치료제의 조합은 사람에게 사용되기 전에 적당한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다. 그러한 동물 모델 시스템으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 쥐, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 개, 토끼 등이 있다. 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 어떠한 동물 시스템이든지 사용될 수 있다. 발명의 특정 구체예에서, 예방 및/또는 치료제의 조합은 마우스 모델 시스템에서 시험된다. 그런 모델 시스템은 광범위하게 사용되고 숙련된 기술자들에게 잘 알려져 있다. 예방 및/또는 치료제는 반복적으로 투여될 수 있다. 과정의 여러 측면은 달라질 수 있다. 상기 측면에는 예방 및/또는 치료제의 일시적인 투여처방, 및 그런 제제들이 별도로 또는 혼합물로서 투여되어야 하는지의 여부가 포함된다.

본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 동물 모델은 예를 들면 마우스 이펙터 세포 상에서 사람 FcγR을 발현하는 유전자 도입 마우스, 예를 들면 미국 특허 5,877,396호에 설명되어 있는 어떠한 마우스 모델이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 유전자 도입 마우스로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 사람 FcγRIIIA를 운반하는 마우스; 사람 FcγRIIA를 운반하는 마우스; 사람 FcγRIIB 및 사람 FcγRIIIA를 운반하는 마우스; 사람 FcγRIIB 및 사람 FcγRIIA를 운반하는 마우스가 있다. 바람직하게는, 상기에서 설명된 기능성 분석에서 가장 높은 수준의 활성을 보이는 돌연변이가 사람에게 사용되기 전에 동물 모델 연구에서 사용에 대해 시험될 것이다. 상기에서 설명된 방법을 사용하여, 예를 들면 포유류 발현 시스템 및 본원에 개시되고 예시된 정제 방법을 사용하여 동물 모델에서 사용하기 위한 충분한 양의 항체가 제조될 수 있다.

마우스 이종이식 모델은 본 발명의 이중체 분자의 에피토프 결합 도메인의 친화성 및 특이성과 면역 반응을 유도하는 이중체의 능력을 토대로 종양 특이적 항원에대해 생성된 마우스 항체의효능을 조사하기 위해 사용될 수 있다 (Wu et al . (2001) " Mouse Models For Multistep Tumorigenesis ", Trends Cell Biol. 11:S2-9). 마우스 이펙터 세포 상에서 FcγR을 발현하는 유전자 도입 마우스는 사람 Fc-FcγR 상호작용의 효능을 시험하기 위한 독특하고 맞춤형 동물 모델이다. FcγRIIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIA 유전자 도입 마우스 라인의 쌍은 Jeffrey Ravetch 박사 실험실에서 생성되었고 (록펠러 대학과 Sloan Kettering 암센터와의 라이선스 계약을 통해), 아래의 표 11에 열거된 것과 같이 사용될 수 있다.

표 11. 마우스 스트레인

본 발명의 조합 치료법의 항-염증 활성은 해당 기술분야에 알려져 있고, 문헌에 설명된 염증성 관절염의 다양한 실험 동물 모델을 사용함으로써 측정될 수 있다 (Crofford L.J. and Wilder R.L., " Arthritis and Autoimmunity in Animals ", in Arthritis and Allied Conditions : A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)). 염증성 관절염 및 자가면역 류머티스성 질병의 실험 및 자발적 동물 모델은 또한 본 발명의 조합 치료법의 항-염증 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 다음은 제한하는 것이 아닌, 실례로서 제공된 몇 가지 분석법이다.

해당 기술분야에 공지되어 있고 광범위하게 사용되는 관절염 또는 염증성 질병에 대한 기본적인 동물 모델은 다음을 포함한다: 보조제-유도된 관절염 쥐 모델, 콜라겐-유도된 관절염 쥐 및 마우스 모델 및 항원-유도된 관절염 쥐, 토끼 및 햄스터 모델, 이것들은 모두 문헌에서 설명된다: Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals ", in Arthritis and Allied Conditions : A Textbook of Rheumatology, McCarty et al .(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993.

발명의 조합 치료법의 항-염증성 활성은 카라기닌-유도된 관절염 쥐 모델을 사용하여 평가될 수 있다. 카라기닌-유도된 관절염은 또한 만성 관절염 또는 염증의 연구에서 토끼, 개 및 돼지에서 사용되어 왔다. 정량적 조직형태 계측적 평가는 치료 효능을 측정하기 위해 사용된다. 그런 카라기닌-유도된 관절염 모델을 사용하는 방법은 문헌에 소개되어 있다 (Hansra P. et al . (2000) " Carrageenan - Induced Arthritis In The Rat , Inflammation, 24(2): 141-155). 또한 통상적으로 사용되는 것은 해당 기술분야에 알려지고 설명된 것과 같은 자이모산-유도된 염증 동물 모델이다.

본 발명의 조합 치료법의 항-염증성 활성은 또한 쥐에서, 문헌에 설명된 방법을 변용하여 카라기닌-유도된 발 부종의 억제 정도를 측정함으로써 평가될 수 있다 (Winter C. A. et al . (1962) " Carrageenan - Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti - Inflammatory Drugs' Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547). 이 분석은 대부분의 NSAID의 항-염증성 활성에 대한 일차 생체 내 선별로서 사용되어 왔고, 사람 효능을 예측하는 것으로 여겨진다. 시험 예방 또는 치료제의 항-염증 활성은 비히클 투약된 대조 그룹에 비교하여 시험 그룹의 뒷발 체중의 증가의 % 억제로서 표시된다.

추가로, 염증성 장 질병에 대한 동물 모델은 또한 발명의 조합 치료법의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다 (Kim et al . (1992) " Experimental Colitis In Animal Models ", Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) " Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease -- An Overview ", Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S). 궤양성 대장염 및 크론병은 동물에서 유도될 수 있는 사람 염증성 장 질병이다. 염증성 장 질환을 유도하기 위해 동물에게 술페이트화된 다당류, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 아밀로펙틴, 카라기닌, 아밀로펙틴 술페이트, 및 덱스트란 술페이트 또는 화학적 자극제, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 및 아세트산이 경구 투여될 수 있다.

자가면역 장애에 대한 동물 모델은 또한 발명의 조합 치료법의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역 장애, 예컨대 유형 1 당뇨병, 갑상선 자가면역, 전신성 홍반성 루푸스, 및 사구체신염에 대한 동물 모델이 개발되었다 (Flanders et al . (1999) " Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health ", Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al . (1999) " Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity ", Biochimie 81:511-515; Foster (1999) " Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease ", Semin. Nephrol. 19:12-24).

나아가 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 어떠한 분석법이든지 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대해 본원에 개시된 조합 치료법의 예방적 및/또는 치료적 활용성을 평가하기 위해 사용될 수 있다

본 발명의 예방적 및/또는 치료적 프로토콜의 독성 및 효능은 세포 배양물에서 또는 실험 동물에서, LD₅₀ (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한 표준 약제학적 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 그것은 LD₅₀/ED₅₀의 비율로 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 예방 및/또는 치료제가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 예방 및/또는 치료제가 사용될 수 있긴 하지만, 미감염 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고, 그로써 부작용을 감소시키기 위해 영향을 받은 조직의 부위에 그러한 제제를 표적화하는 전달 시스템을 디자인하기 위해 주의가 기울여져야 한다.

세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 사람에서 사용하기 위한 예방 및/또는 치료제의 단위용량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 그런 제제의 단위용량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 단위용량은 사용된 단위용량 형태 및 활용된 투여경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 어떠한 제제에 대해, 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물 중에서 측정되는 바 IC₅₀ (즉 증상의 최대 절반의 억제를 이루는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 이루기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 그런 정보는 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 치료법의 항암 활성은 또한 암 연구를 위해 해당 기술분야에 공지되어 있고 문헌에서 설명되는 다양한 실험 동물 모델, 예컨대 SCID 마우스 모델 또는 유전자 도입 마우스 또는 사람 이종이식편을 포함하고 있는 누드 마우스, 동물 모델, 예컨대 햄스터, 토끼 등을 사용함으로써 측정될 수 있다 (Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd); 및 Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)).

발명의 분자의 치료 효능을 측정하기에 바람직한 동물 모델은 마우스 이종이식 모델이다. 이종이식 종양에 대한 공급원으로서 사용될 수 있는 종양 셀라인은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 유방 선암종을 포함한 환자로부터 유도될 수 있는 SKBR3와 MCF7이다. 이들 세포는 erbB2와 프로락틴 수용체를 둘 다 가지고 있다. SKBR3 세포는 해당 기술분야에서 ADCC 및 이종이식 종양 모델로서 기본적으로 사용되어 왔다. 또는 달리 사람 난소 선암종으로부터 유도된 OVCAR3 세포가 이종이식 종양에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 프로토콜 및 조성물은 사람에서 사용되기 전에 바람직하게는 시험관 내에서 및, 그런 다음에는 생체 내에서 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험된다. 치료제 및 방법은 종양 세포 또는 악성 셀라인을 사용하여 선별될 수 있다. 해당 기술분야의 많은 표준 분석법들이 그러한 생존 및/또는 성장을 평가하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 세포 증식은 ³H-티미딘 통합을 측정함으로써, 직접 세포를 계수함으로써, 프로토-발암유전자 (예컨대 fos, myc)와 같은 공지된 유전자의 전사 활성의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있고; 세포 생존율은 트립판 블루 염색에 의해 평가될 수 있으며, 분화는 형태의 변화, 연 아가에서의 감소된 성장 및/또는 콜로인 형성 또는 삼차원 기저막 또는 세포외 매트릭스 제제 중에서의 관상 네트워크 형성 등을 토대로 육안으로 평가될 수 있다.

치료법에서 사용하기 위한 화합물은 사람에서 시험하기 전에 적당한 동물 모델 시스템, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 쥐, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼, 햄스터 등, 예를 들면 상기에서 설명된 동물 모델에서 시험될 수 있다. 그런 다음 화합물은 적절한 임상 시도에서 사용될 수 있다.

나아가 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 어떠한 분석법이든지 암, 염증성 장애, 또는 자가면역 질병의 치료 또는 방지를 위해 본원에서 개시된 조합 치료법의 예방적 및/또는 치료적 활용성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

도 1A-B: 사람 IgG CH1 , 힌지 및 Fc 영역의 아미노산 서열
도 1(A) 및 (B)는 사람 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지 (A) 및 Fc (B) 도메인의 아미노산 서열을 제공한다. (IgG1 힌지 도메인 (SEQ ID NO:1); IgG2 힌지 도메인 (SEQ ID NO:2); IgG3 힌지 도메인 (SEQ ID NO:3); IgG4 힌지 도메인 (SEQ ID NO:4); IgG1 Fc 도메인 (SEQ ID NO:5); IgG2 Fc 도메인 (SEQ ID NO:6); IgG3 Fc 도메인 (SEQ ID NO:7); IgG1 Fc 도메인 (SEQ IDNO:8)). 도 1A 및 1B에 도시된 아미노산 서열은 Kabat EU의 넘버링 시스템을 따라 넘버링된다. 이소타입 서열은 각각의 힌지 영역의 처음과 마지막 시스테인 잔기를 대체함으로써 IgG1 서열과 나란히 배열되는데, 그것은 동일한 위치에서 중쇄간 S-S 결합을 형성한다. 도 1B에 대해서는, CH2 도메인의 잔기는 +로 표시되고, CH3 도메인의 잔기는 ~로 표시된다.
도 2: 공유 이중기능성 이중체의 폴리펩티드 사슬의 개략적 표시
공유, 이중기능성 이중체의 폴리펩티드는 짧은 펩티드 링커에 의해 분리된 항체 VL 및 항체 VH 도메인으로 구성된다. 8개의 아미노산 잔기 링커는 단일 폴리펩티드의 scFv 구성물로의 자체 어셈블리를 방지하고, 대신 상이한 폴리펩티드 사슬의 VL과 VH 도메인 사이의 상호작용이 두드러진다. 4개의 구성물이 생성되었다 (각각의 구성물은 구성물 좌측의 아미노 말단 ("n")으로부터 도면 우측의 카르복시 말단 ("c")쪽으로 설명된다): 구성물 (1) (SEQ ID NO:9)은 n - VL 도메인 Hu2B6 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 서열 (LGGC)-c로 구성되었다; 구성물 (2)(SEQ ID NO:11)는 n - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 및 C-말단 서열 (LGGC)-c로 구성되었다; 구성물 (3)(SEQ ID NO:12)은 n - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 서열 (LGGC)-c로 구성되었다; 구성물 (4)(SEQ ID NO:13)는 n - VL 도메인 Hu2B6 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 및 C-말단 서열 (LGGC)-c로 구성되었다.
도 3: 친화성 정제된 이중체의 SDS - PAGE 분석
친화성 정제된 이중체는 환원 (레인 1-3) 또는 비-환원 (레인 4-6) 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 받았다. 표준의 대략적인 분자량 (레인 3과 4 사이에서)이 표시된다. 레인 1 및 4, h3G8 CMD; 레인 2와 5, h2B6 CMD; 및 레인 3과 6, h2B6-h3G8 CBD.
도 4 A-B: 친화성 정제된 이중체의 SEC 분석
친화성 정제된 이중체는 SEC 분석을 받았다. (A) 공지 표준의 용출 프로필: 전길이의 IgG (~150 kDa), IgG의 Fab 단편 (~50 kDa), 및 scFv (~30 kDa); (B) h2b6 CMD, h3G8 CMD, 및 h2B6-h3G8 CBD의 용출 프로필.
도 5: h2B6 - h3G8 CBD 의 sCD32B 및 sCD16A 에의 결합
h2B6-h3G8 CBD의 sCD32B 및 sCD16A에의 결합은 샌드위치 ELISA로 분석되었다. sCD32B는 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 HRP 포합된 sCD16A였다. CD16A에 결합하는 h3G8 CMD가 대조표준으로서 사용되었다.
도 6A-C: sCD16A , sCD32B 및 sCD32A 에 대한 이중체 결합의 BIACORE 분석
h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD 및 h3G8 CMD의 sCD16A, sCD32B 및 sCD32A (네거티브 대조표준)에의 결합은 SPR 분석에 의해 분석되었다. h3G8 scFv는 또한 대조표준으로서 시험되었다. (A) sCD16에의 결합; (B) sCD32B에의 결합 및 (C) sCD32A에의 결합. 이중체는 100NM의 농도로, scFv는 200nM의 농도로, 60초 동안 50ml/분의 유속으로 수용체 표면 위로 주입되었다.
도 7A-C: sCD16A 및 sCD32B 에 대한 이중체 결합의 BIACORE 분석
h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD 및 h3G8 CMD의 sCD16A , 및 sCD32B에의 결합은 SPR 분석에 의해 분석되었다. h3G8 scFv는 또한 대조표준으로서 시험되었다. (A) sCD16A에 대한 h3G8 CMD의 결합; (B) sCD16A에 대한 h2B6-h3G8 CBD의 결합; (C) sCD16A에 대한 h3G8 scFv의 결합; (D) sCD32B에 대한 h2B6 CMD의 결합; 및 (E) sCD32B에 대한 h2B6-h3G8 CBD의 결합. 이중체는 6.25 내지 200nM의 농도로 180초 동안 70ml/분의 유속으로 수용체 표면 위로 주입되었다.
도 8: 공유 이중특이성 이중체 분자를 형성하기 위한 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 상호작용에 대한 개략적인 설명
NH₂와 COOH는 각각, 각 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단과 카르복시 말단을 나타낸다. S는 각 폴리펩티드 사슬 상의 C-말단 시스테인 잔기를 나타낸다. VL 및 VH는 각각 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 가리킨다. 점선과 쇄선은 두 폴리펩티드 사슬 사이를 구별하기 위한 것이고, 특히 상기 사슬들의 링커 부분을 나타낸다. h2B6 Fv 및 h3G8 Fv는 각각 CD32B와 CD16에 특이한 에피토프 결합 부위를 나타낸다.
도 9: 공유 이중특이성 이중체의 Fc 도메인을 함유하는 폴리펩티드 사슬의 개략적인 표시
본 발명의 이중체 분자의 폴리펩티드 구성물을 도시한다 (각 구성물은 구성물 좌측의 아미노 말단 ("n")으로부터 도면의 우측 카르복시 말단 ("c") 방향으로 기술된다). 구성물 (5)(SEQ ID NO:14)는 n - VL 도메인 Hu2B6 - 첫 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 두 번째 링커 (LGGC) - 및 사람 IgG1의 C-말단 Fc 도메인 - c로 구성되었다; 구성물 (6)(SEQ ID NO:15)은 n - VL 도메인 Hu3G8 - 첫 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 두 번째 링커 (LGGC) - 및 사람 IgG1의 C-말단 Fc 도메인 - c로 구성되었다; 구성물 (7)(SEQ ID NO:16)은 n - VL 도메인 Hu2B6 - 첫 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 서열 (LGGCFNRGEC)(SEQ ID NO:17) - c로 구성되었다; 구성물 (8)(SEQ ID NO:18)은 n - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 두 번째 링커 (LGGC) - 및 사람 IgG1의 C-말단 힌지/Fc 도메인 (아미노산 치환 A215V 포함) - c로 구성되었다.
도 10: Fc 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A 에 대한 결합
Fc 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A에 대한 결합은 샌드위치 ELISA로 분석되었다. 분석된 이중체는 3가지의 재조합 발현 시스템에 의해 제조되었다: 각각 구성물 1과 6을 발현하는 pMGX669와 pMGX674의 공형질전환; 각각 구성물 2와 5를 발현하는 pMGX667과 pMGX676의 공형질전환; 및 각각 구성물 5와 6을 발현하는 pMGX674와 pMGX676의 공형질전환. sCD32B는 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 HRP 포합된 sCD16A였다.
도 11: 이가의 공유 이중체를 형성하기 위한, 각각 Fc 도메인을 포함하는 두 개의 폴리펩티드 사슬의 상호작용에 대한 개략적인 설명
NH₂와 COOH는 각각, 각 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단과 카르복시 말단을 나타낸다. S는 각 폴리펩티드 사슬의 두 번째 링커 서열의 시스테인 잔기 사이의 최소한 하나의 이황화 결합을 나타낸다. VL과 VH는 각각 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 가리킨다. 점선과 쇄선은 두 폴리펩티드 사슬 사이를 구별하기 위한 것이고, 특히 상기 사슬들의 첫 번째 링커 부분을 나타낸다. CH2와 CH3은 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 불변 도메인을 나타낸다. h2B6 Fv 및 h3G8 Fv는 각각 CD32B와 CD16에 특이한 에피토프 결합 부위를 나타낸다.
도 12: 힌지 / Fc 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A 에 대한 결합
Fc 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A에 대한 결합은 샌드위치 ELISA로 분석되었다. 분석된 이중체는 4가지의 재조합 발현 시스템에 의해 제조되었다: 각각 구성물 1과 6을 발현하는 pMGX669+pMGX674의 공형질전환; 각각 구성물 2와 8을 발현하는 pMGX669+pMGX678의 공형질전환; 각각 구성물 7과 6을 발현하는 pMGX677+pMGX674의 공형질전환; 각각 7과 8을 발현하는 pMGX677+pMGX678의 공형질전환. sCD32B는 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 HRP 포합된 sCD16A였다.
도 13: 사량체 이중체 분자를 형성하기 위한 폴리펩티드 사슬의 상호작용에 대한 개략적인 설명
NH₂와 COOH는 각각, 각 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단과 카르복시 말단을 나타낸다. S는 Fc를 포함하는, '더 무거운' 폴리펩티드 사슬의 두 번째 링커 서열의 시스테인 잔기와 Fc를 포함하지 않는, '더 가벼운' 폴리펩티드 사슬의 C-말단 서열의 시스테인 잔기 사이의 최소한 하나의 이황화 결합을 나타낸다. VL과 VH는 각각 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 가리킨다. 점선과 쇄선은 두 폴리펩티드 사슬 사이를 구별하기 위한 것이고, 특히 상기 더 무거운 사슬의 첫 번째 링커 부분 또는 더 가벼운 사슬의 링커를 나타낸다. CH2와 CH3은 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 불변 도메인을 나타낸다. h2B6 Fv 및 h3G8 Fv는 각각 CD32B와 CD16에 특이한 에피토프 결합 부위를 나타낸다.
도 14: 공유 이중특이성 이중체를 형성하는, Fc 도메인을 함유하는 폴리펩티드 사슬의 개략적인 표시
본 발명의 이중체 분자를 형성하는 폴리펩티드 구성물의 표시 (각 구성물은 구성물 좌측의 아미노 말단 ("n")으로부터 도면의 우측 카르복시 말단 ("c") 방향으로 기술된다). 구성물 (9) (SEQ ID NO:19)는 n - 사람 IgG1의 힌지/Fc 도메인 - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 및 C-말단 LGGC 서열 - c로 구성되었다; 구성물 (10) (SEQ ID NO:20)은 n - 사람 IgG1의 Fc 도메인 - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 및 C-말단 LGGC 서열 - c로 구성되었다; 구성물 (11) (SEQ ID NO:21)은 n - VL 도메인 Hu2B6 (G105C) - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 및 아미노산 치환 A215V가 포함된 사람 IgG1의 C-말단 힌지/Fc 도메인 - c로 구성되었다; 구성물 (12) (SEQ ID NO:22)는 n - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 (G44C) - 및 C-말단 FNRGEC (SEQ ID NO:23) 서열 - c로 구성되었다.
도 15A-B: 친화성 사량체 이중체의 SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
구성물 10과 1, 구성물 9와 1, 및 구성물 11과 12를 발현하는 벡터로 공동형질전환된 재조합 발현 시스템에 의해 제조된 이중체는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석받고 (A), 프로브로서 염소 항-사람 IgG1 H+L을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 받았다 (B). SDS-PAGE 겔의 단백질은 심플리 블루 세이프스테인 (Invitrogen)으로 가시화되었다. 패널 A와 B에 대해서는, 구성물 10과 1, 구성물 9와 1, 및 구성물 11과 12A를 포함하는 이중체 분자가 각각 레인 1, 2 및 3에 있다.
도 16: Fc 도메인과 공학적으로 조작된 사슬간 이황화 결합을 포함하는 이중체의 sCD32B 및 sCD16A 에 대한 결합
Fc 도메인과, '더 가벼운' 폴리펩티드 사슬과 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬 사이의 공학적으로 조작된 이황화 결합을 포함하는 이중체의 sCD32B와 sCD16A에 대한 결합은 샌드위치 ELISA에 의해 분석되었다. 분석된 이중체는 3가지의 재조합 발현 시스템에 의해 제조되었다: 각각 구성물 1과 10을 발현하는, 각각 구성물 1과 9를 발현하는, 그리고 각각 구성물 11과 12를 발현하는 시스템. sCD32B는 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 HRP 포합된 sCD16A였다. h3G8의 결합은 대조표준으로서 사용되었다.
도 17: 이중체 분자의 다단백질 전구체의 개략적인 표시 및 람다 경쇄 및/또는 힌지 도메인을 함유하는 폴리펩티드 사슬의 개략적인 표시
본 발명의 이중체 분자를 포함하는 폴리펩티드 구성물의 표시 (각 구성물은 구성물 좌측의 아미노 말단 ("n")으로부터 도면의 우측 카르복시 말단 ("c") 방향으로 기술된다). 구성물 (13) (SEQ ID NO:95)은 n - VL 도메인 3G8 - 첫 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 2.4G2VH의 VH 도메인 - 두 번째 링커 (LGGC) - 퓨린 인식 부위 (RAKR (SEQ ID NO:93)) - 2.4G2의 VL 도메인 - 세 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 LGGC 도메인으로 구성되었다 (SEQ ID NO:95를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:96으로 제공된다). 구성물 (14) (SEQ ID NO:97)은 n - VL 도메인 3G8 - 첫 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 2.4G2VH의 VH 도메인 - 두 번째 링커 (LGGC) - 퓨린 인식 부위 (RAKR (SEQ ID NO:93)) - FMD (아구창 바이러스 프로테아제 C3) 부위 - 2.4G2의 VL 도메인 - 세 번째 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - 3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 LGGC 도메인으로 구성되었다 (SEQ ID NO:97을 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:98로 제공된다). 구성물 (15) (SEQ ID NO:99)는 n - VL 도메인 Hu2B6 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu3G8의 VH 도메인 - 및 C-말단 FNRGEC (SEQ ID NO:23) 도메인으로 구성되었다 (SEQ ID NO:99를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:100으로 제공된다). 구성물 (16) (SEQ ID NO:101)은 n - VL 도메인 Hu3G8 - 링커 (GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)) - Hu2B6의 VH 도메인 - 및 C-말단 VEPKSC (SEQ ID NO:77) 도메인으로 구성되었다 (SEQ ID NO:101을 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:102로 제공된다).
도 18: 다단백질 전구체 분자로부터 유도된 이중체 분자의 mCD32B 및 sCD16A 에 대한 결합
다단백질 전구체 분자 구성물 13 (SEQ ID NO:95)으로부터 유도된 이중체 분자의 쥐 CD32B (mCD32B) 및 가용성 CD16A (sCD16A)에 대한 결합은 샌드위치 ELISA로 분석되었다. mCD32B가 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 비오틴 포합된 sCD16A였다.
도 19: 람다 사슬 및/또는 힌지 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A에 대한 결합
IgG의 사람 람다 경쇄 및/또는 힌지 도메인의 C-말단으로부터 유도된 도메인을 포함하는 이중체 분자의 sCD32B 및 sCD16A에 대한 결합이 샌드위치 ELISA로 분석되었고, 구성물 1과 2를 포함하는 이중체 (도 5)와 비교되었다. 분석된 이중체는 구성물 15와 16 (각각 SEQ ID NO:99 및 SEQ ID NO:101)을 발현하는 재조합 발현 시스템에 의해 제조되었다. sCD32B가 표적 단백질로서 사용되었다. 이차 프로브는 HRP 포합된 sCD16A였다. 작은 박스를 포함한 막대는 구성물 15/16 조합을 나타내는 한편, 큰 박스를 포함한 막대는 구성물 1/2 조합을 나타낸다.
도 20: 세포의 표면에 위치한 CD32B 에 결합된 2B6/4420 DART 및 플루오레세인-포합된 분자의 개략적인 표시
이 도면은 DART의 "보편적 어댑터" 항-플루오레세인 아암의 가요성 뿐 아니라 2B6 아암에 대한 다른 특이성을 치환할 수 있는 가능성을 도시한다. V-영역은 박스로 표시되고, GGGSGGGG (SEQ ID NO:10) 링커는 라인으로 표시되며, 이황화 결합은 두 개의 사슬을 연결하는 것으로 나타난다. 한 사슬의 구성요소들은 푸른색으로 표시된 한편, 다른 것은 분홍색을 띤다. N, 아미노 말단; C, 카르복시 말단; FL, 플루오레세인; VL, 경쇄 가변 영역; VH, 중쇄 가변 영역.
도 21 (패널 A 및 B): 2B6/4420 DART 는 플루오레세인- 포합된 분자에 특이하게 결합하고 동시에 CD32B 에 결합할 수 있다.
(A) 2B6/4420 또는 2B6/3G8은 FITC-S 단백질로 코팅된 ELISA 플레이트에 결합되었다. 2B6 아암의 결합 및 기능은 가용성 CD32B의 결합과, 이어서 CD32B에 특이한 항체 및 HRP에 포합된 이차 검출 항체의 결합에 의해 검출되었다. (B) 2B6/4420 또는 2B6/3G8은 HuIgG 또는 FITC-HuIgG (플루오레세인-포합됨)로 코팅된 ELISA 플레이트에 결합되었다. 결합은 2B6 Fv에 특이한 다클론성 혈청과의 결합과 이어서 HRP-포합된 이차 항체의 결합에 의해 검출되었다.
도 22 (패널 A 및 B): 항-사람 CD97B 항체를 사용한 정제된 B 세포의 활성화
정제된 B 세포는 항-사람 VD97b 항체 FITC-포합된 CB3.1-FITC (A) 또는 CB3.2-FITC (B) 및 50㎍/ml의 GAM IgG Fc 특이적(x-축)의 F(ab')₂ 단편의 농도를 증가시켜가면서 활성화되었다. B 세포는 PBS (하얀색 막대) 또는 5㎍/ml의 αFITCαCD32BDART (검은색 막대) 또는 αCD16αCD32BDART (회색 막대)의 존재하에 활성화된다. 반응은 삼중으로 수행되었고, 표준편차가 계산되었다.
도 23 (패널 A 및 B): 정제된 B 세포의 활성화
두 번째 건강한 공여자로부터의 정제된 B 세포가 도 22, 패널 B에서 설명된 것과 같이 활성화되었다. 항 CD79b 항체 FITC-포합된 CB3.2-FITC의 존재하에 활성화된 세포에서 증식 지수가 측정되었고 (A), 미표지 CB3.2 항체의 존재하에 활성화된 세포의 증식 지수 (B)와 비교되었다.
도 24 (상부 및 하부 패널): MGD261 을 사용한 HCD16A /B 유전자도입 마우스에서 생체 내 마우스 B 세포 소모
MacroGenics 채혈 집단으로부터의 mCD32_/_ hCD16A+ C57Bl/6, mCD32_/_ hCD32B+ C57Bl/6 및 mCD32_/_ hCD16A+ hCD32B+ C57Bl/6 마우스에 0, 3, 7, 10, 14 및 17일에 MGD261 (10, 3, 1 또는 0.3mg/kg) 또는 무관한 항체 (hE16 10mg/kg)가 IV로 주사되었다. FACS 분석을 위해 혈액이 -19 (채혈 전), 4, 11, 18, 25 및 32일에 수집되었다. 동물 건강과 활성은 일주일에 3회 기록되었다. 상부 패널: h2B6-3G8 및 WNV mAb; 하부 패널: h2B6-3G8 -hCD16A 또는 -hCD32B 마우스 및 WNV mAb -hCD16A 또는 -hCD32B 마우스.
도 25: 2.4 G2 -3 G8 DB 를 사용한 HCD16A /B 유전자도입 마우스에서 생체 내 마우스 B 세포 소모
MacroGenics 채혈 집단으로부터의 mCD16_/_, mCD16_/_ hCD16A+ C57Bl/6, mCD16_/_ hCD16B+ 및 mCD16_/_ hCD16A+ hCD16B+ 마우스에 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 및 18일에 2.4G2-3G8 DB (75㎍/마우스), 또는 PBS가 IP 주사되었다. FACS 분석을 위해 혈액dl -10 (채혈 전), 4, 11 및 18일에 수집되었다. 동물 건강과 활성은 일주일에 3회 기록되었다.
도 26: 사람 종양 셀라인 Raji 의 정맥 내 ( IV ) 모델을 사용한 MGD261 의 항-종양 활성의 증명
MacroGenics 채혈 집단으로부터의 12 내지 20주령의 mCD16_/_, hCD16A+, RAG1_/_ C57Bl/6마우스에 0일에 5×10⁶ Raji 세포가 IV 주사되었다. 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 및 30일에 마우스는 또한 250, 25 또는 2.5㎍의 MGD261로 또는 PBS (네거티브 대조표준)로 복강 내 (IP) 처리되었다. 그런 다음 마우스는 매일 관찰되고 체중이 일주일에 2회 기록되었다. 뒷다리 마비를 보인 마우스가 희생되었다.
도 27: 비-포유류 숙주에서 DART 발현
BL21DE3 세포 (Novagen)가 pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 플라스미드로 형질전환되고 amp-내성 콜로니를 사용하여 육즙 배양액에 시딩되었다. 배양이 0.5 OD600 유닛에 도달되었을 때 0.5mM의 IPTG가 첨가되어 발현이 유도되었다. 배양물을 30℃에서 2시간 동안 성장시키고, 세포-유리 배지가 수집되었다.
도 28: DART ELISA
h3G8-h3G8 DART 결합 ELISA가 96-웰 Maxisorp 플레이트를 사용하여 수행되었다. 반응 후에 플레이트는 PBS-T로 3회 세척되고, 80㎕/웰의 TMB 기질로 전개되었다. 5분 동안 인큐베이션된 후에 반응은 40㎕/웰의 1% H₂SO₄로 중단되었다. 96-웰 플레이트 판독기와 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 450nm가 판독되었다. 판독값은 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화되었다.
도 29: DART -유도된 사람 B-세포 사멸
사람 PBMC가 밤새 표시된 분자와 함께 인큐베이션되었다. 아폽토시스가 FACS 분석에 의해 총 FSC/SSC 게이트화되지 않은 집단 상에서 B 세포 (CD20+ 세포)의 PI+아넥신-V+ 집단의 백분율로서 분석되었다.
도 30: 8B5- CB .1 DART 구성물
본 발명을 예시하기 위하여 다중 8B5-CB.1 DART 구성물이 제조되었다. 구성물 5와 6, 또는 6과 7, 또는 8과 9, 또는 9와 10으로 코드화된 발현 플라스미드는 HEK-293 세포 안에 공-형질전환되어 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하는 항 flag 태그가 있거나 없는 8B5-CB3.1 DART를 발현하였다. 조건 배지가 매 3일마다 3회 수득되었다. 그럼 다음 조건 배지는 CD32B 친화성 칼럼을 사용하여 정제되었다.
도 31: 8B5- CB3 .1 DART ELISA
8B5-CB3.1 DART/ch8B5 경합 ELISA가 96-웰 Maxisorp 플레이트를 사용하여 수행되었다. 반응 후에 플레이트는 PBS-T로 3회 세척되고, 80㎕/웰의 TMB 기질로 전개되었다. 5분 동안 인큐베이션된 후에 반응은 40㎕/웰의 1% H₂SO₄로 중단되었다. OD450 nm가 96-웰 플레이트 판독기와 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 판독되었다. 판독값은 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화되었다.
도 32: 4가 DART 구조의 개략적인 설명
이 도면은 4개의 폴리펩티드 사슬의 어셈블리를 통해 생성된 DART 종의 일반적 구조를 설명한다. Ig-유사 DART의 4개의 항원-결합 도메인은 줄무늬의 진한 회색 타원으로 도시된다.
도 33: Ig -유사 4가 DART
이 도면은 Ig-유사 4가 DART의 에피토프 결합 부위를 개략적으로 도시한다.
도 34: mCD32 - hCD16A 결합 ELISA
이 도면은 실시예 10의 Ig-유사 4가 DART 종이 대조 (ch-mCD32mAb) 항체 또는 다른 DART 종보다 큰 친화성으로 항원과 결합하는 것을 증명하는 ELISA 결과를 도시한다.
도 35: Ig DART 분자의 개략적인 설명
이 도면은 Ig DART 분자의 개략도를 제공한다. 특이성은 음영이 있는, 무늬가 있거나 흰색 영역으로서, 불변 영역은 검은 색으로, 그리고 이황화 결합은 검은 색 점선으로 표시된다. 모든 단백질 사슬의 N-말단은 도면의 상부를 향해 있는 반면, 모든 단백질 사슬의 C-말단은 도면의 아래쪽을 향하고 있다. A-E로 표시된 것은 이중특이성을 나타내고 F-J로 표시된 것은 삼중특이성을 나타낸다. 표시 A와 E는 4가이다. 표시 B, C, F, I 및 J는 6가이다. 표시 D, G 및 H는 8가이다. 개별적인 도메인의 상세한 설명에 대해서는 도 1, 2, 9, 14 및 17과 상기 '발명의 개요' 단원을 참조한다.
도 36: HU2B6 4.5- HU3G8 5.1 이중특이성 이중체의 결합 능력
도 36은 Hu2B6 4.5 또는 Hu3G8 5.1 이중체 (삼각형)에 비교하여 CD32b 및 CD16a에 결합하는 Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 이중특이성 이중체 (사각형)의 결합 능력을 도시한다.
도 37: E-코일 및 K-코일 DART 유도체의 개략도
도 37은 E-코일 및 K-코일 DART 유도체의 일반적인 형태를 도시한다.
도 38: 바람직한 E-코일 및 K-코일 분리기의 나선 배열
도 38은 바람직한 "E-코일" 서열 (EVAALEK)₄ (SEQ ID NO:299) 및 바람직한 "K-코일" 서열 (KVAALKE)₄ (SEQ ID NO:300)의 나선 배열을 도시한다.
도 39: E-코일 및 K-코일 Fc -함유 DART 유도체
도 39는 사슬 교환을 통해 형성될 수 있는 E-코일 및 K-코일 Fc-함유 DART 유도체의 상이한 종을 예시한다.
도 40: h2B6YAhCB3 DART 의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc -함유 DART 유도체에 대한 크기 축출 크로마토그래피
도 40은 h2B6YAhCB3 DART의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc-함유 DART 유도체에 대한 크기 축출 크로마토그래피의 결과를 도시한다. 4개의 그런 분자 종이 분석되었고; 모든 분자는 E-코일 및 K-코일을 가졌다: EK (Fc 영역 없음), 2.1mg; EFc/K (Fc는 E-코일에 연결됨), 2.7mg; E/KFc (Fc는 K-코일에 연결됨), 1.8mg; EFc/KFc (Fc는 동일한 DART의 K-코일과 E-코일에 연결됨), 2.0mg.
도 41: 제조된 이량체 분자의 구조
도 41은 도 40의 크기 축출 크로마토그래피에서 확인된 제조된 이량체 분자의 가능한 구조를 도시한다.
도 42: h2B6YAhCB3 DART 의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc -함유 DART 유도체의 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석
도 42는 h2B6YAhCB3 DART의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc-함유 DART 유도체의 크기 축출 크로마토그래피 (도 40)로부터 얻어진 분획의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석 결과를 도시한다. 측면 레인: 분자 마커 대조표준; 레인 1: EK (Fc 영역 없음); 레인 2: EFc/K, 응집체 분획; 레인 3: EFc/K, 단량체 분획; 레인 4: E/KFc, 응집체 분획; 레인 5: E/KFc, 단량체 분획; 레인 6: EFc/KFc, 응집체 분획; 레인 7: EFc/KFc, 이량체 분획; 레인 8: EFc/KFc, 단량체 분획.
도 43: 이중특이성 결합 ELISA 분석
도 43은 E-코일 / K-코일 Fc-함유 h2B6YAhCB3 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc), h2B6YAhCB3 DART 대조표준 및 EFc/KFc h2B6YAhCB3 DART 유도체를 비교하는 이중특이성 결합 ELISA의 결과를 도시한다.
도 44: h2B6YAhCB3 DART 의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc -함유 DART 유도체의 T-세포 증식을 억제하는 능력
도 44는 h2B6YAhCB3 DART의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc-함유 DART의 T-세포 증식을 억제하는 능력을 도시한다.
도 45: hCD16 - hCD32B ABD - DART
도 45는 hCD16 및 hCD32B 항원과 면역학적으로 반응하는 재조합 이중특이성 DART에 융합된 스트렙토코쿠스 단백질 G의 ABD3 도메인으로 구성된 재조합 항체 분자, hCD16-hCD32B ABD-DART의 개략도를 도시한다.
도 46A-46J: hCD16 - hCD32B ABD - DART 의 결합 친화성
ELISA 플레이트는 2㎍/mL 농도의 CD16 항원 (도 46A) 또는 사람 혈청 알부민 (도 46B)으로 코팅되었다. 2㎍/mL로부터 시작하여 다양한 농도의 hCD16-hCD32B ABD-DART (■) 및 대조표준 hCD16-hCD32B DART (○)가 결합되었다. 비오티닐화된 sCD32B 항원이 플레이트에 첨가된 후 HRP 포합된 스트렙트아비딘이 검출을 위해 첨가되었다. 도 46C는 ABD-DART 분자가 CD32B, CD16A 및 HSA에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다. 도 46D-46I는 hCD16-hCD32B ABD-DART와 그것의 ABD 융합 유도체가 가용성 CD32B (sCD32B)와 가용성 CD16A (158F)(sCD16A)에 동등하게 결합할 수 있는 것으로 나타났음을 증명한다. 도 46J는 DART ABD 융합물이 그것의 원래의 DART의 이중 특이성 결합을 보유하고, 사람 혈청 알부민의 존재에 의해서 영향을 받지 않은 sCD16A와 CD32B에 결합하는 것으로 나타난 것을 보여준다.
도 47A/47B: DART 단백질의 세포독성
도 47A는 DART 단백질의 PBMC 중재된 세포독성을 증명한다. ADCC 분석이 사람 B-셀라인, 이펙터 세포로서 PBMC와 함께 인큐베이트된 Daudi를 표적 세포로 사용하여 수행되었다. 개별적인 분석은 20:1의 이펙터-대-표적 비율로 삼중으로 수행되었고 항체가 적정되었다: hCD16A-hCD32B DART (●) 및 hCD16A-hCD32B ABD-DART (■). 세포 중재된 세포독성은 LDH 방출 분석에 의해 측정되었다. 10⁰의 하부 곡선은 hCD16A-hCD32B ABD-DART (■)이다. 도 47B는 CD16xCD32B DART가 CD16B-발현 이펙터 세포에 결합하고, 그로써 그런 세포를 모아서 CD32B를 발현하는 세포들을 사멸 (재지시된 사멸을 통해)하는 것을 보여준다.
도 48: C57Bl /6 마우스에서 hCD16 - hCD32B ABD - DART 의 개선된 약물동역학적 특성
마우스 (n=3)에 (A) hCD16-hCD32B ABD-DART (●) 및 (B) hCD16-hCD32B DART (▲)를 5mg/kg으로 1회 정맥 내 주사하였다. 마우스 혈청은 다양한 시간 점에서 수집되었고, 혈청 중의 단백질 농도는 ELISA에 의해 정량되었다. 약물동역학적 계산은 WinNonlin Professional 5.1을 사용하여 수행되었다.
도 49A-49C: ABD - DART 의 생체 내 생물학적 활성
도 49A-49C는 마우스에 투여된 후 생체 내에서, hCD16-hCD32B ABD-DART가 생물학적 활성을 보유하고 나타내는 것을 보여준다. Tg(mCD16_/_hCD16A+32B+) 마우스에 주입된 단일 용량의 ABD-DART 또는 그것의 원래의 DART는 T 세포 (도 49B) 또는 PM 세포 (도 49C)의 농도에 영향을 미치지 않으면서 B 세포의 농도를 선택적으로 저하시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 49A).
도 50A-50E: Her2 저 발현 셀라인의 패널 상의 Her2xTCRb DART 활성
Her2 및 T-세포 수용체 (TCR) 결합 도메인을 가지는 DART 분자가, 이전에 저수준의 HER2 발현을 나타내는 (따라서 항-Her2/neu 항체, Herceptin®으로 치료하기 어려운) 것으로 특성확인된 바 있는 다발성 유방암, 결장암 및 방광암의 세포독성을 중재할 수 있는 능력에 대해 시험되었다. 시험된 유방암 셀라인은 ZR75-1 (HER2 2+)(도 50A), MCF-7 (HER2 1+)(도 50B) 및 MDA-MB468 (HER2-ve)(도 50C)였다. 시험된 비-방광암 셀라인은 HT-29 (결장암 셀라인)(도 50D) 및 SW780 (방광암 셀라인) (도 50E)이다.
도 51A-51B: KYK2VL -4420 VH - GFNRGEC ( SEQ ID NO :313)-E 코일 및 4420 VL -KYK2VH-GVEPKSC ( SEQ ID NO :314) 폴리펩티드의 정제
도 51A와 51B는 KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEQ ID NO:313)-E 코일 및 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEQ ID NO:314) 폴리펩티드의 정제를 도시한다.
도 52: KYK2 -4420 VF DART 의 결합 특이성
도 52는 KYK2-4420 VF DART의 결합 특이성을 도시한다.
도 53: 플라스미드 pPAL7 K코일- ABD 의 구성
도 53은 플라스미드 pPAL7 K코일-ABD의 구성을 개략적으로 도시한다.
도 54: PROFINITY EXACT ^TM 정제 수지에 의해 정제된 K코일 ABD 단백질의 웨스턴 블롯 분석
도 54는 PROFINITY EXACT^TM 정제 수지에 의해 정제된 K코일 ABD 단백질의 웨스턴 블롯 분석 (10ml 배양으로부터의 소규모)을 도시한다. 레인 1과 5: 미정제 용해물; 레인 2와 6: 관통하는 흐름; 레인 3, 4, 8 및 9: 정제 단백질; 레인 7: 마커. 일차 항체: 토끼 다클론성 항-EK 항체; 이차 항체: 항-토끼 HRP.
도 55: PROFINITY EXACT ^TM 정제 수지에 의해 정제된 K코일 ABD 단백질의 SDS-PAGE 분석
도 55는 PROFINITY EXACT^TM 정제 수지로부터 용출된 분획에 대한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시한다. L: 미정제 대장균 용해물; FT: 관통하는 흐름; W: 세척; M: 마커.
도 56A-56C: 이중 친화성 ELISA 에 의한 KYK2 4420 EK ABD DART 결합
도 56A-56C는 KYK2-4420 VF DART 복합체가 K Coil-ABD 분자와 함께 개선된 특성을 가지는 E 코일-K 코일 ABD DART를 형성하는 것을 증명하는 ELISA 결과를 도시한다. 도 56A: NKG2D Fc로 포획되고 비오티닐화된 단클론성 항-EK 항체로 검출된 DART. 도 56B: 단클론성 항-EK 항체로 포획되고 HRP-사람 알부민으로 검출된 DART. 도 56C: NKG2D Fc로 포획되고 비오티닐화된 항-FITC 항체로 검출된 DART. ELISA 결과는 복합체의 모든 도메인이 그것의 각각의 리간드에 결합할 수 있음을 보여준다.
도 57: 탈면역화된 ABD ELISA
도 57은 알부민 빈딘 포마인의 순서로 변형에 의해 유발된 결합 변화를 증명하는 ELISA 결과를 도시한다.
도 58: 알부민 결합 분석
도 58은 ABD 변이체 Y61A/I65A, Y61A/N66D, L64A/I65A* 및 L64A/N66D 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 59: 알부민 결합 분석
도 59는 ABD 변이체 L64G/N66D, I65A/N66D, N66S/T70S* 및 Y61A/N66S/T70S 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 60: 알부민 결합 분석
도 60은 ABD 변이체 Y60A/Y61A, Y60T/Y61A, I65A/N66D/V71A, Y61A/I65A/V71A, L64A/N66D/V71A 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 61: 알부민 결합 분석
도 61은 ABD 변이체 Y60A/Y61A/V71A, Y60T/Y61A/V71A, L64A/I65A/V71A 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 62: 알부민 결합 분석
도 62는 ABD 변이체 L64G/I65A/V71A, L64G/N66D/V71A, Y61A/T70S, N66S, T70S, Y61A/N66S, L65A/I65A 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.
도 63: C57BL /6 마우스에서 CD16xCD32B ABD - DART 및 ABD - DART 변이체의 개선된 약물동역학적 특성
도 63은 C57Bl/6 마우스에서 CD16 x CD32B ABD-DART 및 ABD-DART 변이체의 개선된 약물동역학적 특성을 도시한다. 마우스 (n=3)에 5mg/kg의 ABD-DART 단백질이 1회 정맥내 주입으로 주사되었다. 마우스 혈청은 다양한 시간 지점에서 수집되었고, 혈청 중의 단백질 농도는 ELISA에 의해 정량되었다. 약물동역학적 계산은 WinNonlin Professional 5.1을 사용하여 수행되었다.
도 64A 및 64B: 다가의 ABD DART 단백질
도 64A와 64B는 두 개의 사슬 (hCD16xhCD32B E ABD/K ABD DART)의 단부에 ABD를 융합함으로써 (도 64A) 또는 한 사슬 (hCD16xhCD32B E ABD ABD/K DART)의 단부에 ABD를 융합함으로써 (도 64B) 구성된 다가의 ABD를 함유하는 DART의 구조를 예시한다.
도 65(A-C): hCD16xhCD32B ABD DART 의 이중특이성 활성
도 65A-65C는 이중 특이성 ELISA를 사용하여 hCD16xhCD32B ABD DART의 이중특이성 활성을 예시한다. ELISA 플레이트는 2㎍/ml의 CD16 항원으로 코팅되었다. 달라지는 농도의 ABD DART와 Fc DART가 플레이트에 결합되었다. 마지막으로 비오티닐화된 sCD32B 항원이 플레이트에 첨가된 후 HRP 포합된 스트렙트아비딘이 검출을 위해 첨가되었다.
도 66: ABD DART 와 Fc DART 의 혈청 반감기
도 66은 C57Bl/6 마우스가 혈청 반감기를 평가하기 위해 ABD DART 또는 Fc DART (5mg/kg)를 단일 IV 주입으로 받게 되는 생체 내 PK 연구의 결과를 도시한다.

실시예

실시예 1. 공유 이중특이성 이중체의 디자인 및 특성확인

단일특이성 공유 이중체와 이중특이성 공유 이중체를 각각의 재조합 제조, 정제 및 결합 특성을 평가하기 위하여 구성하였다. 본원에서 설명된 재조합 발현 시스템에 의해 제조된 친화성 정제된 이중체는 SDS-PAGE 및 SEC 분석에 의해 단일 이량체 종으로 구성되는 것으로 밝혀졌다. ELISA 및 SPR 분석으로 인해, 공유 이중특이성 이중체가 두 가지의 표적 항원에 모두 친화성을 나타냈고, 두 가지의 항원에 동시에 결합할 수 있는 것으로 나타났다.

재료 및 방법:

폴리펩티드 분자의 구성 및 디자인: 핵산 발현 벡터를 도 2에 개략적으로 도시된 4개의 폴리펩티드 구성물을 제조하기 위하여 디자인하였다. 구성물 1 (SEQ ID NO:9)는 FcγRIIB를 인식하는 인간화된 2B6 항체의 VL 도메인과, FcγRIIIA를 인식하는 인간화된 3G8 항체의 VH 도메인으로 구성되었다. 구성물 2 (SEQ ID NO:11)은 Hu3G8의 VL 도메인과 Hu2B6의 VH 도메인을 포함하였다. 구성물 3 (SEQ ID NO:12)는 Hu3G8의 VL 도메인과 Hu3G8의 VH 도메인을 포함하였다. 구성물 4 (SEQ ID NO:13)은 Hu2B6의 VL 도메인과 Hu2B6의 VH 도메인을 포함하였다.

PCR 및 발현 벡터 구성: VL 또는 VH 도메인의 코딩 서열을, 초기 PCR 생성물이 중첩하는 서열을 함유함으로써 중첩 PCR이 원하는 폴리펩티드 구성물의 코딩 서열을 생성하는 것이 가능해지도록 전방 및 역 프라이머를 사용하여 주형 DNA로부터 증폭시켰다.

주형 DNA 의 초기 PCR 증폭: 대략 35ng의 주형 DNA, 예컨대 관심의 항체의 경쇄 및 중쇄; 1㎕의 10μM 전방 및 역 프라이머; 2.5㎕의 10x pfuUltra 완충액 (Stratagene, Inc.); 1㎕의 10mM dNTP; 1㎕의 2.5유닛/㎕의 pfuUltra DNA 중합효소 (Stratagene, Inc.); 및 25㎕의 총 부피를 만들 수 있는 증류수를 원심분리 튜브에서 부드럽게 혼합하고, 마이크로원심분리기에서 간단하게 회전시켜서 투브 바닥에 반응 혼합물을 수집하였다. PCR 반응을 GeneAmp PCR 시스템 9700 (PE Applied Biosystems)과 다음의 세팅을 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분; 94℃에서 15초씩 25회; 58℃에서 30초; 그리고 72℃에서 1분.

Hu2B6의 VL을 Hu2B6의 경쇄로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:56을 사용하여 증폭시켰다. Hu2B6의 VH는 Hu2B6의 중쇄로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:57과 SEQ ID NO:58을 사용하여 증폭시켰다. Hu3G8ML VL은 Hu3G8의 경쇄로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:59를 사용하여 증폭시켰다. Hu3G8의 VH는 Hu3G8의 중쇄로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:60과 SEQ ID NO:61을 사용하여 증폭시켰다.

PCR 생성물을 1% 아가로오스 겔 상에서 30분 동안 120볼트에서 전기영동하였다. PCR 생성물을 겔로부터 절단하여 MinElute 겔 추출 키트 (Qiagen, Inc.)를 사용하여 정제하였다.

중첩하는 PCR: 초기 PCR 생성물을 아래에서 설명하는 것과 같이 조합하고 주형 DNA의 초기 증폭에 대해 설명한 것과 같은 PCR 조건을 사용하여 증폭시켰다. 중첩하는 PCR의 생성물을 또한 상기에서 설명한 것과 같이 정제하였다.

구성물 1, SEQ ID NO:9 (도 2에 개략적으로 도시됨)를 코드화하는 핵산 서열을 VL Hu2B6과 VH Hu3G8의 증폭 PCR 생성물과 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:61과 조합함으로써 증폭시켰다. 구성물 2, SEQ ID NO:11 (도 2에 개략적으로 도시됨)을 코드화하는 핵산 서열을 VL Hu3G8과 VH Hu2B6의 증폭 PCR 생성물과 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:58과 조합함으로써 증폭시켰다. 구성물 3, SEQ ID NO:12 (도 2에 개략적으로 도시됨)를 코드화하는 핵산 서열을 VL Hu3G8과 VH Hu3G8의 증폭 PCR 생성물과 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:61과 조합함으로써 증폭시켰다. 구성물 4, SEQ ID NO:13 (도 2에 개략적으로 도시됨)을 코드화하는 핵산 서열을 VL Hu2B6과 VH Hu2B6의 증폭 PCR 생성물과 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:58을 조합함으로써 증폭시켰다.

VL 도메인의 전방 프라이머 (즉 SEQ ID NO:55) 및 VH 도메인의 역 프라이머 (즉 SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:61)은 독특한 제한 부위를 함유하였고, 그로 인해 발현 벡터 안에 최종 생성물을 클로닝하는 것이 가능하였다. 정제된 중첩 PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 NheI와 EcoRI으로 소화시키고, pCIneo 포유류 발현 벡터 (Promega, Inc.) 안에 클론하였다. 구성물을 코드화하는 플라스미드를 아래의 표 12에서 나타낸 것과 같이 표시하였다.

표 12. 플라스미드 구성물

폴리펩티드/ 이중체 발현: 구성물 1을 코드화하는 pMGX0669를 구성물 2를 코드화하는 pMGX0667과 함께 HEK-293 세포에, 제조업체의 지시 (Invitrogen)를 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 공-형질전환시켰다. 이들 두 개의 플라스미드의 공-형질전환을, FcγRIIB 및 FcγRIIIA 둘 다에 대해 면역특이적인 공유 이중특이성 이중체 (CBD)(h2B6-h3G8 이중체)의 발현을 유도하도록 디자인하였다. 각각 구성물 3과 4를 코드화하는 pMGX0666과 pMGX0668은, 각각 FcγRIIIA (h3G8 이중체) 및 FcγRIIB (h2B6 이중체)에 면역특이적인 공유 단일특이성 이중체 (CMD)의 발현을 위해 별도로 HEK-293세포에 형질전환시켰다. 그것을 3일 동안 배양한 후, 분비된 생성물을 조건 배지로부터 정제하였다.

정제: 이중체를 조건 배지로부터 CNBr 활성화된 세파로오스 4B에 결합된 관련 항원을 사용하여 포획하였다. 친화성 세파로오스 수지를 부하 전에 20mM Tris/HCl, pH 8.0으로 평형화하였다. 부하 후에 수지를 평형 완충액으로 세척한 후 용출하였다. 이중체를 세척된 수지로부터 50mM 글리신 pH 3.0을 사용하여 용출하였다. 용출된 이중체를 즉시 1M Tris/HCl pH 8.0으로 중화시키고, 원심분리형 농축기를 사용하여 농축하였다. 농축된 이중체를 PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 칼럼을 사용하여 크기 축출 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.

SEC: 크기 축출 크로마토그래피를 사용하여 칼럼으로부터 용출된 이중체의 대략적인 크기와 이종성을 분석하였다. SEC 분석을 PBS로 평형화된 GE 헬스케어 슈퍼덱스 200HR 10/30 칼럼 상에서 수행하였다. 전체 길이의 IgG (~150kDa)의 용출 프로필과 비교하였고, Fab 단편 (~50kDa) 및 단일 사슬 Fv (~30kDa)을 대조표준으로서 사용하였다.

ELISA: 용출되고 정제된 이중체의 결합을 상기 단원 4.2에서 설명된 것과 같이 ELISA 분석에 의해 특성확인하였다. 50㎕/웰의 sCD32B-Ig의 2㎍/ml 용액을 탄산염 완충액 중에서 4℃에서 밤새 96-웰 Maxisorp 플레이트 상에서 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T (PBS, 0.1% 트윈 20)로 3회 세척하고, 0.5% BSA에 의해 30분 동안 실온에서 차단하였다. 계속해서 h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD, 또는 h3G8 CMD를 차단 완충액으로, 0.5㎍/ml 내지 0.001㎍/ml의 이중체 농도 범위를 생성하기 위하여 연속적인 2-배 희석액을 만들었다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후, 50㎕/웰의 0.2㎍/ml의 sCD16A-비오틴을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후, 50㎕/웰의 1:5000 희석의 HRP 포합된 스트렙트아비딘 (Amersham Pharmacia Biotech)을 검출을 위해 사용하였다. HRP-스트렙트아비딘을 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 80㎕/웰의 TMB 기질을 사용하여 전개하였다. 10분 동안 인큐베이션한 후, HRP-TMB 반응을 40㎕/웰의 1% H₂SO₄를 첨가함으로써 중단하였다. OD450nm를 96-웰 플레이트 판독기와 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 판독하였고, 그 결과를 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다.

BIAcore 분석: 용출되고 정제된 이중체의 결합의 동역학적 변수를 BIAcore 분석 (BIAcore 기기 1000, BIAcore Inc., Piscataway,N.J.)과 관련된 소프트웨어를 사용하여 상기 단원 4.3에 설명된 것과 같이 분석하였다.

sCD16A, sCD32B 또는 sCD32A (네거티브 대조표준)을 센서 칩 표면의 4개의 흐름 세포 중 하나 (흐름 세포 2)에, 아민 결합 화학을 통하여 (NHS/EDC의 혼합무로 카르복시메틸기를 변형함으로써) 고정시킴으로써 어느 수용체든지 약 1000 반응 유닛 (RU)이 표면에 고정되도록 하였다. 그 다음으로, 미반응 활성 에스테르를 1M Et-NH2를 주사하여 "모자를 벗겼다". 일단 적당한 표면이 준비되면, 공유 이중특이성 이중체 (h2B6-h3G8 CBD) 또는 공유 단일특이성 이중체 (h2B6 CMD 또는 h3G8 CMB)를 6.25 내지 200nM 용액을 180초 동안 70mL/분의 유속으로 주입함으로써 그 표면 위를 통과시켰다. 비교를 위해 h3G8 scFv를 또한 시험하였다.

일단 전체 데이터 세트가 수집되면, 그 결과의 결합 곡선을 제조업체인 BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ)에 의해 공급된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 전역적으로 조정하였다. 이들 알고리즘은 K_on과 K_off를 계산하고, 그것으로부터 외관상 평형 결합 상수, KD를 두 개의 속도 상수의 비율로서 추론한다 (즉 K_off/K_on). 개별적인 속도 상수가 유도되는 방법에 대한 보다 상세한 처리는 BIAevaluation Software Handbook (BIAcore Inc., Piscataway,NJ)에서 알 수 있다.

결합 및 분해 상은 별도로 맞추었다. 분해 속도 상수를 180초의 분해 상 중 32 내지 34초 간격에 대해 얻었고; 결합 상 맞춤은 1:1 Langmuir 모델에 의해 얻었으며, 기저 맞춤을 이중 특이성 이중체와 scFv에 대한 R_max와 chi²를 토대로 선택하였고, 2가 분석물 맞춤을 CMD 결합에 대해 사용하였다.

결과

비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석은 h3G8 CMD, h2B6 CMD 및 h2B6-h3G8 CBD 발현 시스템의 정제된 생성물이, 추정되는 분자량이 대략 50kDa인 각각의 단일 종 (각각 도 3에서 레인 4, 5, 및 6)이었음을 나타냈다. 환원 조건 하에서, CMD 발현 시스템의 어느 하나로부터 정제된 생성물은 단일 밴드로서 나타났고 (레인 1 및 2), 반면 h2B6-h3G8 CBD 시스템으로부터 정제된 생성물은 2개의 별도의 단백질인 것으로 나타났다 (도 3, 레인 3). 발현 시스템으로부터 정제되고 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 가시화된 모든 폴리펩티드는 대략 28kDa에서 이동하였다.

각 발현 시스템 생성믈에 대한 SEC 분석은 또한 단일 분자 종을 나타냈고 (도 4), 그것들은 각각 IgG의 Fab 단편 (~50kDa)으로서 대략 동일한 시간에 용출되었다 (도 4A). 그 결과는 친화성 정제된 생성물이 CMD 발현 시스템의 경우에 동종성 공유 단일이량체였고, h2B6-h3G8 CBD의 경우에 대해서는 단일한 공유 이종이량체였음을 가리킨다.

CD32B 및/또는 CD16A의 어느 하나 또는 둘 다에 대한 특이성에 대해 h2B6-h3G8 CBD의 결합을 시험하기 위해 ELISA 샌드위치 분석을 사용하였다 (도 5). CD32B는 표적 항원으로서 작용하였고, CD16A는 이차 프로브로서 사용하였다. ELISA에서 포지티브 신호는 이종이량체 h2B6-h3G8 CBD가 두 가지 항원에 대해 특이성을 가졌음을 나타냈다. h3G8 CMD (CD32B에 결합하지 않아야 한다)의 유사한 시험으로는 신호를 나타내지 않았다.

SPR 분석은 h3G8 CMD가 sCD16을 면역특이적으로 인식하지만 sCD32B는 그렇지 않았으며, h2B6 CMD는 sCD32B를 면역특이적으로 인식하였지만 sCD16은 그렇지 않았고, h2B6-h3G8 CBD는 sCD16과 sCD32B를 둘 다 면역특이적으로 인식하였음을 가리켰다 (도 6A-B). 시험된 이중체 중 어느 것도 대조 수용체, sCD32A에는 결합하지 않았다 (도 6C).

SPR 분석을 또한 CMD와 h2B6-h3G8 CBD의 sCD16 및/또는 sCD32B에 대한 동역학 및 평형 상수를 추정하는 데 사용하였다. 그 결과를 h3G8 scFv에 대해 계산된 동일한 상수와 비교하였다. 도 7A-E는 SPR 분석의 그래프상 결과를 나타낸다. 도 7에 나타낸 결과로부터 계산된 동역학적 온 및 오프 속도와 평형 상수는 아래의 표 13에 나타낸다.

표 13. BIAcore 데이터로부터 계산된 동역학적 및 평형 상수

ELISA 분석의 결과와 결합시키면, 이 연구는 h2B6-h3G8 공유 이종이량체가 CD32B와 CD16 둘 다에 대한 특이성을 보유하였으며, 두 가지 항원에 동시에 결합할 수 있음을 확인해준다. 그 분자는 도 8에 개략적으로 도시된다.

실시예 2. Fc 도메인을 포함하는 공유 이중특이성 이중체의 디자인 및 특성확인

IgG 유사 분자, 즉 Fc 도메인을 포함하는 분자를 제조하기 위한 노력으로, 상기 실시예 1에서 제공된 이종이량체 CBD 분자를 포함하는 폴리펩티드 중 하나를 추가로 Fc 도메인을 포함하도록 (항체 중쇄 및 경쇄와 유사한 '더 무거운' 및 '더 가벼운' 사슬을 생성하기 위하여) 변형하였다. 그러면 이종이량체 이중특이성 분자는 Fc 도메인을 함유할 것이고, 동종성 분자와 이량체를 형성하여 4가의 사량체 IgG-유사 분자를 형성할 것이다 (즉 이종이량체 이중특이성 분자의 Fc 도메인을 통해 이량체화에 의해 형성됨). 흥미롭게도, 그런 사량체 분자는 기능성 분석을 사용하는, 예를 들어 표적 항원에의 면역특이적 결합에 대해 조건 배지를 시험해도 재조합 발현 시스템의 조건 배지에서 검출되지 않았다. 대신 유일하게 VL, VH 및 Fc 도메인으로 구성된 단량체를 포함하는 이량체 분자만이 그런 기능성 분석에서 검출되었다. 이론적인 사량체 구조의 안정성이 문제가 되는지를 시험하기 위하여, Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 힌지 영역을 포함하도록 공학적으로 조작하였고, 한편으로 '더 가벼운' 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 사람 카파 경쇄의 불변 도메인의 6 개의 C-말단아미노산을 포함하도록 공학적으로 조작하였다. 그렇게 다시 공학적으로 조작된 '더 무거운' 및 '더 가벼운' 사슬들을 재조합 발현 시스템에서 공동 발현시켰고, 그것에 대한 기능성 분석으로 두 가지의 표적 항원 및 항-Fc 항체에 모두 면역특이적으로 결합할 수 있는 이중체 분자가 검출되었다.

재료 및 방법

폴리펩티드 분자의 구성 및 디자인: 핵산 발현 벡터를 상기 실시예 1에서 제공된 구성물 1과 2의 변형된 버전을 생성하도록 디자인하였다. 구성물 5 (SEQ ID NO:14)와 6 (SEQ ID NO:15)를, 구성물 1과 2가 추가로 Fc 도메인을 포함하도록 공학적으로 조작함으로써 만들었다. 구성물 7 (SEQ ID NO:16)은 구성물 1이 그것의 C-말단에 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)를 포함하도록 공학적으로 조작함으로써 만들었다. 구성물 8 (SEQ ID NO:18)은 구성물 2가 힌지 영역과 Fc 도메인 (V215A 돌연변이를 포함함)을 포함하도록 공학적으로 조작함으로써 만들었다. 구성물 5 내지 8의 개략적인 묘사는 도 9에 나타낸다.

PCR 및 발현 벡터 구성: 모든 PCR 및 PCR 생성물 정제 프로토콜은 상시 실시예 1에서 설명된 것과 같았다. 플라스미드 pMGX0669와 pMGX0667은 각각 구성물 1과 2의 코딩 서열에 대한 주형으로서 작용하였다. HuIgG Fc도메인 및/또는 힌지 도메인에 대한 코딩 서열은 각각 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:5였다. 주형 DNA의 코딩 서열을 전방 및 역 프라이머를 사용하여 증폭시켜서 PCR 생성물이 중첩하는 서열을 함유함으로써, 중첩하는 PCR이 원하는 생성물의 코딩 서열을 생성할 수 있도록 하였다.

구성물 1의 코딩 서열을 pMGX0669로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:62를 사용하여 증폭시켰다. 구성물 2의 코딩 서열을 pMGX0667로부터, 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:63을 사용하여 증폭시켰다. HuIgG 힌지-Fc를 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:65 및 SEQ ID NO:66을 사용하여 증폭시켰다. 구성물 7 (SEQ ID NO:16)을 pMGX0669로부터, 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:67을 사용하여 증폭시켰다.

중첩하는 PCR: 초기 PCR 생성물을 아래에서 설명한 것과 같이 조합하고, 상기 실시예 1에서 설명한 것과 같이 증폭시키고 정제하였다.

구성물 5, SEQ ID NO:14 (도 9에 개략적으로 도시됨)를 코드화하는 핵산 서열을, 구성물 1의 증폭된 PCR 생성물과 HuIgG Fc, 및 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:64를 조합시킴으로써 증폭시켰다. 구성물 6, SEQ ID NO:15 (도 9에 개략적으로 도시됨)를 코드화하는 핵산 서열을, 구성물 2의 증폭된 PCR 생성물 및 HuIgG Fc, 및 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:66을 조합함으로써 증폭시켰다. 구성물 8, SEQ ID NO:15 (도 9에 개략적으로 도시됨)를 코드화하는 핵산 서열을, 구성물 2의 증폭된 PCR 생성물 및 HuIgG 힌지-Fc, 및 각각 전방 및 역 프라이머 SEQ ID NO:55와 SEQ ID NO:66을 조합함으로써 증폭시켰다.

최종 생성물을 pVIneo 포유류 발현 벡터 (Promega, Inc.)에 상기에서 설명된 것과 같이 클론하였다. 구성물을 코드화하는 플라스미드를 아래의 표 14에 나타낸 것과 같이 표시하였다.

표 14. 플라스미드 구성물

폴리펩티드/ 이중체 발현: 상기 실시예 1에서 설명된 것과 같이, 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK-293 세포 안으로 4개의 별도의 공형질전환을 수행하였다: 구성물 1과 6을 각각 코드화하는 pMGX0669와 pMGX0674; 구성물 2와 5를 각각 코드화하는 pMGX0667과 pMGX0676; 및 구성물 7과 8을 각각 코드화하는 pMGX0677 및 pMGX0678.

이들 플라스미드의 공-형질전환을, FcγRIIB 및 FcγRIIIA 둘 다에 대해 면역특이적이고, IgG-유사 구조를 가지는 4가의 이중특이성 이중체 (CBD)의 발현을 유도하도록 디자인하였다. 추가의 공형질전환을 또한 수행하였다: 각각 구성물 6과 5를 코드화하는 pMGX0674 및 pMGX0676. 그것들을 3일 동안 배양한 후, 조건 배지를 수득하였다. 조건 배지 중에 분비된 생성물의 양을 표준으로서 정제된 Fc를 사용하여 항 IgG Fc ELISA에 의해 정량하였다. 그런 다음 샘플 중의 생성물의 농도를 정량을 토대로 표준화하고, 표준화된 샘플을 나머지 분석에 사용하였다.

ELISA: 배지로 분비된 이중체 분자의 결합을 상기에서 설명된 것과 같이 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 다른 표시가 없는 한, CD32B를 사용하여 플레이트를 코팅하였다, 즉 표적 단백질로서 사용하였고, HRP-포합된 CD16을 프로브로서 사용하였다.

결과

ELISA 분석을 사용하여 구성물 1과 6 (pMGX669-pMGX674), 구성물 2와 5 (pMGX667-pMGX676) 및 구성물 5와 6 (pMGX674-pMGX676)을 포함하는 재조합 발현 시스템으로부터 표준화된 샘플을 CD32B와 CD16A에 동시에 결합할 수 있는 이중체 분자의 발현에 대해 시험하였다 (도 10). ELISA 데이터는 구성물 1 및 6과의 공-형질전환 또는 구성물 2 및 5와의 공-형질전환이 어느 한 가지 또는 둘 다의 항원에 결합할 수 있는 생성물을 생성하지 못하였음을 나타냈다 (도 10, 각각 □과 ▲). 그러나 구성물 5 및 6의 공-형질전환은 CD32B 및 CD16A 항원 둘 다에 결합할 수 있는 생성물의 분비를 유도하였다. 후자의 생성물은 구성물 5와 6의 이량체였고, 각 항원에 대한 하나의 결합 부위를 함유하였으며, 도 11에 그 구조를 개략적으로 도시하였다.

IgG 유사 이종사량체 구조의 형성을 유도하기 위하여, 6개의 추가 아미노산에 대한 코딩 서열을 구성물 1의 C-말단에 첨부하여 구성물 7을 만들었다 (SEQ ID NO:16, 도 9에 개략적으로 도시됨). 6개의 추가의 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO:23)은 카파 경쇄의 C-말단 단부로부터 유도되었고, 정상적으로 IgG 분자의 중쇄의 상부 힌지 도메인과 상호작용한다. 그런 다음 힌지 도메인을 구성물 6에 공학적으로 도입하여 구성물 8 (SEQ ID NO:18, 도 9)을 만들었다. 구성물 8은 추가로 상부 힌지 영역에 아미노산 돌연변이, A215V를 포함하였다. 그런 다음 구성물 7과 8을 각각 코드화하는 발현 플라스미드, pMGX677과 pMGX678을 HEK-293 세포에 공형질전환시키고, 설명된 것과 같이 발현시켰다.

구성물 7과 8을 포함하는 재조합 발현 시스템 (pMGX0677+pMGX0678)으로부터 생성된 이중체 분자를 ELISA 분석에서, CD32B와 CD16A에 대한 결합에 대해, 구성물 1과 6 (pMGX669+pMGX674), 구성물 2와 8 (pMGX669+pMGX678), 및 구성물 6과 7 (pMGX677+pMGX674)을 포함하는 발현 시스템으로부터 생성된 이중체 분자와 비교하였다 (도 12).

앞에서와 같이, 구성물 1과 6을 포함하는 발현 시스템 (pMGX669+pMGX674)에 의해 생성된 분자는 CD32A와 CD16A 둘 다에 대해 결합할 수 없는 것으로 나타났다 (도 10 및 도 12). 대조적으로, 구성물 6과 7 (pMGX677+pMGX674) 또는 구성물 7과 8 (pMGX0677+pMGX0678) 중 어느 하나의 공동 발현으로부터의 생성물은 CD32B와 CD16A 둘 다에 결합할 수 있었다 (도 12). 구성물 7은 구성물 1과 유사하지만, 구성물 7을 C-말단 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)을 포함하고, 구성물 8은 구성물 6과 유사하지만 구성물 8은 힌지 도메인과 돌연변이 A215V를 포함한다는 것이 주지되어야 한다. 데이터는 C-카파 경쇄의 C-말단으로부터 6개의 추가 아미노산 (FNRGEC; SEQ ID NO:23)을 비-Fc를 포함하는 '더 가벼운' 사슬에 첨가함으로써, 상응하는 더 무거운 사슬이 힌지 도메인을 포함하는지의 여부와 관계없이 사량체 IgG-유사 이중체 분자의 형성 (즉 pMGX0677+pMGX0674 및 pMGX0677+pMGX0678, 도12)을 안정화하는 것이 보조되는 것을 나타낸다. FNRGEC (SEQ ID NO:23) C-말단 서열을 상응하는 '더 가벼운' 사슬에 첨가하는 일 없이 힌지 도메인을 Fc를 포함하는 '더 무거운' 폴리펩티드에 첨가하는 것은 명백하게 유사한 안정화에 영향을 미칠 수 없었다 (즉 구성물 2와 8 (pMGX669+pMGX678)의 공-형질전환의 생성물에 의한 결합의 결핍). 사량체 이중체 분자의 구조는 도 13에 개략적으로 나타낸다.

실시예 3. 사량체 IgG -유사 이중체의 형성에 미치는 도메인 순서와 추가 이 황화 결합의 영향

사량체 IgG-유사 이중체 분자의 '더 가벼운' 및 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬 사이의 추가의 안정화의 영향을, 폴리펩티드 사슬 상의 선택된 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 조사하였다. 추가의 시스테인 잔기는 '더 무거운' 사슬과 '더 가벼운' 사슬 사이에 추가의 이황화 결합을 제공한다. 추가로, 결합 활성에 대한 도메인 순서를, Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인을 폴리펩티드 사슬의 C-말단 단부로부터 N-말단으로 이동시킴으로써 조사하였다. 추가의 이황화 결합을 포함하는 분자의 결합 활성이 그런 결합을 포함하도록 초기에 구성된 이중체 분자에 비교하여 변경되진 않았지만, Fc 또는 힌지-Fc 도메인을 이중체를 포함하는 '더 무거운' 폴리펩티드 사슬의 N-말단으로 옮긴 것은 놀랍게도 이중특이성 분자의 하나 또는 둘 다의 그것의 표적 항원에 대한 결합 친화성 및/또는 결합능력을 개선시켰다.

재료 및 방법

폴리펩티드 분자의 구성 및 디자인: 상기 실시예 2에서 제공된 구성물 5, 6 및 8의 변형된 버전을 생성하도록 핵산 발현 벡터를 디자인하였다. 구성물 9 (SEQ ID NO:19) 및 구성물 10 (SEQ ID NO:20)(둘 다 도 13에 개략적으로 도시된다)은 구성물 8 및 6과 유사하지만, 각각 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인이 폴리펩티드의 C-말단으로부터 N-말단으로 이동되었다. 추가로 사용된 모든 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인이었다. 구성물 11, SEQ ID NO:21 (도 4에 개략적으로 도시됨)은 실시예 1의 구성물 2와 유사하지만, C-말단이 추가로 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)을 포함하도록 디자인되었다. 구성물 12, SEQ ID NO:22 (도 14에 개략적으로 도시됨)는 실시예 2의 구성물 5와 유사하지만, Fc 도메인이 추가로 힌지 영역을 포함한다. 또한 구성물 11 및 12에 대해서, 2B6 VL 도메인과 2B6 VH 도메인이 단일 아미노산 변형 (각각 G105C 및 G44C)을 포함하고 있어서, 각 도메인의 글리신이 시스테인으로 대체되었다.

PCR 및 발현 벡터 구성: 모든 PCR 및 PCR 생성물 정제 프로토콜은 실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같았다.

중첩하는 PCR: 최종 생성물을 실시예 1 및 2에서 설명된 방법을 사용하여 구성하고, 증폭시키고 정제하였다.

최종 생성물을 앞에서 설명한 것과 같이 pCIneo 포유류 발현 벡터 (Promega, Inc.)에 클론하였다. 구성물들을 코드화하는 플라스미드를 아래의 표 15에 나타낸 것과 같이 표시하였다.

표 15. 플라스미드 구성물

폴리펩티드/ 이중체 발현: 실시예 1에서 설명된 것과 같이, 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK-293 세포로의 3개의 별도의 공-형질전환을 수행하였다: 구성물 1과 9을 각각 코드화는 pMGX0669 및 pMGX0719; 구성물 1과 10을 각각 코드화하는 pMGX0669 및 pMGX0718; 및 구성물 11과 12를 각각 코드화하는 pMGX-0617 및 pMGX0717. 이들 플라스미드의 공-형질전환은 FcγRIIB 및 FcγRIIIA 둘 다에 대해 면역특이적이고, IgG-유사 구조를 가지는 4가의 이중특이성 이중체 (CBD)의 발현을 유도하도록 디자인하였다. 3일 동안 배양한 후 조건 배지를 수득하였다. 조건 배지에 분비된 생성물의 양을 표준으로서 정제된 Fc를 사용하여 항 IgG ELISA에 의해 정량하였다. 그런 다음 샘플 중의 생성물의 농도를 정량을 토대로 표준화하고, 표준화된 샘플을 나머지 분석에 사용하였다.

ELISA: 배지에 분비된 이중체 분자의 결합을 상기에서 설명한 것과 같이 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 다른 표시가 없는 한, CD32B를 사용하여 플레이트를 코팅하였고, 즉 표적 단백질로서 사용하였고, HRP-포합된 CD16을 프로브로서 사용하였다.

웨스턴 블롯: 상기에서 설명된 3개의 공형질전환으로부터의 대략 15ml의 조건 배지를 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 하나의 겔을 Simply Blue Safestain (Invitrogen)으로 염색하고, 동일한 겔을 표준 전달 방법을 사용하여 PVDE 막 (Invitrogen)으로 전달하였다. 전달 후에, 막을 1X PBS 중의 5% 탈지분유로 차단하였다. 그런 다음 막을 2% 탈지분유 1X PBS/0.3% 트윈 20 중의 10ml의 1:8,000으로 희석된 HRP 포합된 염소 항 사람 IgG1 H+L중에서 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였다. 1X PBS/0.3% 트윈 20으로, 각각 5분씩 2회 세척한 후, 20분 동안 실온에 두었다가 막을 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템 (Amersham Biosciences)으로 제조업체의 지시를 따라 전개하였다. 필름을 X-선 프로세서로 현상하였다.

결과

구성물 1과 9; 구성물 1과 10; 및 구성물 11과 12를 포함하는 재조합 발현 시스템으로부터의 조건 배지를 SDS-PAGE (비-환원 조건 하에서) 분석 및 웨스턴-블롯팅 (항-IgG를 프로브로서 사용함)에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯은 구성물 11과 12 또는 구성물 9와 1을 포함하는 시스템으로부터의 생성물이 대략 150kDa의 단일 종의 분자를 두드러지게 형성하였음을 나타냈다 (각각 도 14의 레인 3과 2). 이들 생성물은 둘 다 이중체를 포함하는 '더 가벼운' 사슬과 '더 무거운' 사슬 사이에 공학적으로 도입된 내부 이황화 결합을 가지고 있다. 대조적으로, 구성물 10과 1로 형성된, '더 가벼운' 사슬과 '더 무거운' 사슬 사이에 공학적으로 도입된 내부 이황화 결합을 가지고 있지 않은 분자는 분자량이 대략 75 및 100kDa인 최소한 두 개의 분자 종을 형성하였다 (도 14, 레인 1).

웨스턴 블롯의 결과에도 불구하고, 세 가지 생성물은 각각 CD32A와 CD16 둘 다에 결합할 수 있는 것으로 나타났다 (도 15). 놀랍게도, C-말단 힌지-Fc 도메인을 포함하는 생성물 (구성물 11과 12로 형성됨)에 비교하여, Fc (또는 Fc-힌지) 도메인이 Fc 함유 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단에 있는 (즉 '더 무거운' 사슬)(구성물 9+1 및 구성물 10+1) 두 가지 시스템으로부터의 생성물이 그것의 표적 항원 중 하나 또는 둘 다 (즉 CD32B 및/또는 CD16)에 대해 증강된 친화성 및/또는 결합 능력을 증명하였다.

실시예 4. 다단백질 전구체의 프로세싱 및 공유 이중특이성 이중체의 발현에 미치는 내부/외부 절단 부위의 영향; 사람 IgG 람다 사슬 및 힌지 도메인 부분을 포함하는 이중특이성 이중체의 디자인 및 특성확인

본원에서 설명된 것과 같이, 본 발명의 이중체 또는 이중체 분자의 개별적인 폴리펩티드 사슬은 단일 다단백질 전구체 분자로서 발현될 수 있다. 실시예 1 내지 3에서 설명된 재조합 시스템의 적절하게 프로세스되는 능력 및 그런 다단백질 전구체로부터 기능성 CBD를 발현하는 능력을, 내부 절단 부위, 특히 퓨린 절단 부위에 의해 분리된 CBD의 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬을 핵산이 둘 다 코드화하도록 공학적으로 조작함으로써 시험하였다. 기능성 CBD를 다단백질 전구체 분자를 포함하는 재조합 시스템으로부터 분리하였다.

실시예 3에서 설명한 것과 같이, 사람 카파 경쇄로부터의 6개의 C-말단 아미노산, FNRGEC (SEQ ID NO:23)을 첨가하는 것은 이중체 형성을 안정화시키는 것으로 발견되었다 - 그것은 아마도 SEQ ID NO:23을 포함하는 도메인과 Fc 도메인 또는 힌지-Fc 도메인을 포함하는 그런 도메인 사이의 증강된 사슬 내 상호작용을 통해서일 것이다. 이 람다 사슬/Fc 유사 상호작용의 안정화 효과를 폴리펩티드 사슬이 Fc 도메인을 포함하고 있지 않은 CBD에서 시험하였다. 이중체의 한 폴리펩티드 사슬을 그것의 C-말단에서 SEQ ID NO:23을 포함하도록 공학적으로 조작하였고; 대응 폴리펩티드 사슬은 IgG의 힌지 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함하도록 공학적으로 조작하였다. 이 CBD를 구성물 1과 2를 포함하는 것 (실시예 1)과 비교한 결과, 힌지 도메인과 람다 사슬로부터 유도된 도메인을 포함하는 CBD가 그것의 표적 에피토프 중 하나 또는 둘 다에 대해 약간 더 큰 친화성을 나타냈음을 알 수 있었다.

재료 및 방법

폴리펩티드 분자의 구성 및 디자인: 다단백질 전구체: 핵산 발현 벡터를 2개의 다단백질 전구체 분자를 생성하도록 디자인하였다 (두 가지 모두 도 17에 화학적으로 나타낸다). 구성물 13 (SEQ ID NO:95)은 폴리펩티드 사슬의 N-말단, 3G8의 VL 도메인, 2.4G2의 VH 도메인 (mCD32B에 결합한다), 퓨린 절단 부위, 2.4G2의 VL 도메인 및 3G8의 VH 도메인으로 구성되었다. 구성물 13을 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:96으로 제공된다. 구성물 14 (SEQ ID NO:97)(도 17)는 폴리펩티드 사슬의 N-말단, 3G8의 VL 도메인, 2.4G2의 VH 도메인 (mCD32B에 결합한다), 퓨린 절단 부위, FMD (수족구 바이러스 프로테아제 C3) 부위, 2.4G2의 VL 도메인 및 3G8의 VH 도메인으로 구성되었다. 구성물 14를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:98로 제공된다.

실시예 1에서 제공된 구성물 1과 2의 변형된 버전을 생성하도록 핵산 발현 벡터를 디자인하였다. 구성물 15 (SEQ ID NO:99)(도 17)은 실시예 1에서 제공된 구성물 1 (SEQ ID NO:9)과 유사하지만, 구성물 15의 C-말단은 아미노산 서열 FNRGEC (SEQ ID NO:23)을 포함하였다. 구성물 15을 코드화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:100으로 제공된다. 구성물 16 (SEQ ID NO:101)(도 17)은 실시예 1에 제공된 구성물 2와 유사하지만, 구성물 16의 C-말단은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:77)을 포함하였다. 구성물 16을 코드화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:102로 제공된다.

중첩하는 PCR: 최종 생성물을 실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같은 방법을 사용하여 적절한 프라이머를 사용하여 구성하고, 증폭시키고 정제하였다.

최종 생성물을 앞에서 설명한 것과 같이 pCIneo 포유류 발현 벡터 (Promega, Inc.)에 클론하였다. 구성물들을 코드화하는 플라스미드를 아래의 표 16에 나타낸 것과 같이 표시하였다.

표 16. 플라스미드 구성물

폴리펩티드/ 이중체 발현: 실시예 1에서 설명된 것과 같이 HEK-293 세포 안으로의 하나의 형질전환과 하나의 공-형질전환을 수행하였다: 단일: pMGX0750, 구성물 13을 코드화함; 및 공형질전환: pMGX0752 및 pMGX0753, 각각 구성물 15와 16을 코드화함. 3일 동안 배양한 후 조건화된 배지를 수득하고, 설명된 것과 같이 생성물을 분비하고 친화성 정제하였다.

ELISA: 배지로 분비된 이중체 분자의 결합을 상기에서 설명된 것과 같이 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 쥐 CD32B를 사용하여, 즉 표적 단백질로서 사용하여 플레이트를 코팅하였고, HRP-포합된 CD16A를 구성물 15 및 16의 공형질전환의 생성물에대한 프로브로서 사용하였다. mCD32B를 표적 단백질로서 사용하였고, 비오틴-포합된 CD16A를 구성물 13을 포함하는 재조합 시스템에 대한 프로브로서 사용하였다.

결과

구성물 13을 포함하는 재조합 발현 시스템으로부터의 조건 배지를 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. ELISA 분석은 mCD32B 및/또는 CD16 중 어느 하나 또는 둘 다에 대한 특이성에 대해 CBD의 결합을 시험하였다 (도 18). CD32B는 표적 항원으로서 작용하였고, CD16A는 이차 프로브로서 사용하였다. ELISA에서 포지티브 신호는 다단백질 전구체로부터 생성된 이종이량체 h2.4G2-h3G8 CBD가 두 가지 항원에 대해 특이성을 가졌음을 나타냈다.

유사하게, 구성물 15와 16을 코드화하는 벡터의 공형질전환에 의해 생성된 정제된 생성물을 ELISA 분석으로 시험하였고, 구성물 1과 2를 포함하는 생성물 (실시예 1)과 비교하였다. CD32B는 표적 항원으로서 작용하였고, CD16A는 이차 프로브로서 사용하였다. 구성물 1과 2를 포함한 생성물과 같이, 구성물 15와 16의 생성물은 CD32B와 CD16A에 동시에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 실제로 구성물 15와 16의 생성물은 표적 항원, 즉 CD32B 또는 CD16A 중 어느 하나 또는 둘 다에 대해 약간 증강된 친화성을 나타냈다. 이것은 아마도 구성물 1과 2를 포함하는 생성물에는 없는 람다 사슬 영역, FNRGEC (SEQ ID NO:23)과 힌지 영역 VEPKSC (SEQ ID NO:77)의 상호작용에 의해 제공된 사슬 내 결합의 증가된 안정성 및/또는 충실도 (야생형 VH-VL 도메인 상호작용과 비교하여)에 기인한다.

실시예 5. 다중 친화성을 함께 결합시키기 위한 이중 친화성 재표적화 시약 ("DART")의 사용

본 발명의 한 측면은 다중 친화성을 함께 결합시키는 새로운 방법뿐만 아니라 새로운 이중 친화성 재표적화 시약 ("DART")에 관한 것이다. "DART"는 단일특이성, 이중특이서, 삼중특이성 등이어서 동시에 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 상이한 에피토프 (동일하거나 상이한 항원의 것일 수 있다)에 결합할 수 있다. "DART"는 추가로 1가, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가 등이고, 따라서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 또는 그 이상의 분자에 동시에 결합할 수 있다. 도 35에 도시된 것과 같이, 이들 두 가지 덕분에 DART는 예를 들면 4가의 이중특이성 항체를 생성하기 위해 조합될 수 있다.

한 가지 진전은 원형적 면역 수용체, huCD32B에 대한 친화성뿐만 아니라 합텐, 플루오레세인에 대한 친화성을 가지는 DART의 개발일 것이다. 이 DART는 "2B6/4420"으로 명명되었고, 보편적 어댑터로서 작용하며, 플루오레세인-포합된 결합 파트너와 상호작용하는 분자와 huCD32B를 공동결찰시킨다. CD32B는 활성화 신호화 면역 복합체와의 뭉침 (clustering)에 의해 활성화 신호를 급제동하는 능력을 가지고 있는 Fc 수용체이다. 그것의 초기 실행 단계에서, 이 기술로 인해 새로운 DART 구성물을 생성할 필요 없이 huCD32B와의 뭉침을 위해 여러 개의 생물학적 표적을 신속하게 선별하는 것이 가능해진다. 2B6/4420은 세포 표면 수용체에 대한 플루오레세인화된 항체와 간단하게 혼합될 수 있고, 그로써 그 수용체에 대한 친화성을 가지는 DART의 작용을 모방한다 (도 20). 나아가 이 시약은 쉽게 발현되거나 생성되지 않은 친화성 시약의 효과적인 결합을 가능하게 하고, 그로써 기술적 한계를 극복할 수 있게 해준다. 2B6/4420-함유 DART는 분명히 연구 도구로서 유용하며 또는 임상 후보로서도 유용하다. HEK-293 세포로부터 생성된 2B6/4420은 ELISA 분석에서 CD32B와 플루오레세인에 동시에 결합할 수 있다. 추가로, 그것은 CD79와의 결부를 통해 BCR 복합체에 CD32B를 충원함으로써 세포 증식을 억제할 수 있다. DART의 2B6 아암은 상이한 항체 서열 또는 다른 관련된 특이성을 가지는 결합 서열로 대체될 수 있다.

재료 및 방법:

플라스미드 구성: 2B6/4420을 인간화된 2B6 MAb (hu2B6, MGA321)의 서열 및 항-플루오레세인 MAb, 4420의 키메릭 마우스 Fc/사람 Fc 버전으로부터 유도한다. 완전하게 어셈블된 DART는 두 개의 폴리펩티드로 구성되고, 그 결과 두 개의 Fv 영역이 공유 결합된다. 첫 번째 폴리펩티드는 분비 신호 서열과, 이어서 아미노산 잔기 GGGSGGGG으로 구성되는 링커에 의해 분리된 4420VH를 가지는 융합 단백질로서 생성된 hu2B6VL로 구성된다. 카파 경쇄의 C-말단으로부터 유도된 서열 FNRGEC는 이 폴리펩티드의 C-말단에 첨부된다. 다른 폴리펩티드는 서열 VEPKSC를 가지며, 사람 IgG1 Fd 단편의 C-말단으로부터 유도되고, C-말단에 첨부된 신호 서열-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH로 구성된다. 두 사슬 사이의 시스테인은 두 개의 폴리펩티드를 함께 공유 연결해주는 이황화 결합을 형성한다 (도 20). 설명된 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열을 기존의 플라스미드로부터 PCR 증폭하고, 중첩 PCR에 의해 조합하고, pCIneo (Promega) 안에, NheI과 EcoRI 부위 사이에 클론하였다. 마지막으로 상기와 같은 것과 유사한 방법을 사용하여 기존에 구성되어 있는, huCD32B 및 huCD16 (2B6/3G8)에 대해 친화성을 가지는 DART를 대조표준으로서 사용하였다.

항체: 쥐 단클론성 항체 항-사람 CD79b, CB3.1 및 CB3.2 (하이브리도마)를 알라바마 대학 (Birmingham, Birmingham AL)의 Dr. Cooper MD로부터 얻었다. CB3.1과 CB3.2를 제조업체의 지시를 따라 (Pierce, Rockford IL) 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지하였다. Fc-단편-특이적 염소 항-마우스 (GAM) IgG의F(ab')2 단편을 잭슨 실험실 (West Grove, PA)로부터 얻었다. 항-huCD32B 마우스 MAb, 3H7을 제조하고 내부 정제하였다. hu2B6 전체 항체로 염소를 면역화하고 hu2B6의 Fv 영역에 대해 친화성 정제함으로써 염소 항-2B6Fv를 제조하였다. HuIgG, FITC-huIgG, 및 HRP-항-마우스 IgG를 Jackson Immunoresearch로부터 얻었다. HRP-항-염소를 Southern Biotech로부터 얻었다.

DART 발현: 각 사슬을 코드화하는 플라스미드를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 지시를 따라 293H 세포 (Invitrogen)에 공형질전환하였다. 분비된 단백질을 3일 간격으로 3,4회 수득하고 고정된 가용성 형태의 CD32B에 대해 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

ELISA: 2B6/4420 또는 2B6//3G8 DART를 FITC-표지된 단백질 S (Novagen),사람 IgG, 또는 FITC-huIgG로 코팅된 MaxiSorp 플레이트 (NalgeNunc) 상에서 포획하였다. 검출은 가용성 CD32B 엑토도메인을 결합시키고, 이어서 3H7 (CD32B에 특이한 마우스 단클론성 항체), 그리고 마지막으로 항-마우스-HRP를 결합시킴으로써 진행하였다. 또는 달리, 검출을 염소 항-2B6 Fv 다클론성 친화성 정제된 항혈청을 결합시키고, 이어서 항-염소-HRP를 결합시킴으로써 수행하였다. HRP 활성을 비색분석 TMB 기질 (BioFX)을 사용하여 검출하고, VersaMax ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

B 세포 정제 및 증식 분석: 말초혈 단핵세포를 건강한 공여자로부터의 혈액을 사용하여 피콜/파크 플러스 (Amersham Pharmacia Biotech, UK) 구배에 의해 분리하였다. B 림프구를 Dynal B 세포 네거티브 분리 키트 (Dynal Biotechnology Inc., NY)를 제조업체의 지시를 따라 사용하여 분리하였다. 분리된 B 세포 (CD20+)의 순도는 FACS 분석에 의해 추정되는 바 90% 이상이었다. 증식 분석을 위해서는 정제된 B 세포를 평평한 바닥의 96-웰 미소적정 플레이트 중의 완전 RPMI 1640 배지에 1×10⁵ 세포/웰의 세포 밀도로 최종 부피 200㎕에 시딩하고, 48시간 동안 항체 및 이중체의 존재 또는 부재하에 37℃에서 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 1μCi/웰의 [³H]티미딘 (Perkin Elmer, Wellesly, MA)을 첨가하고 추가로 16 내지 18시간 동안 인큐베이션을 계속 한 후 수득하였다. [³H]티미딘 통합은 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다.

결과

2B6/4420 DART가 활성이고 특이적인지를 증명하기 위하여 두 개의 ELISA 실험을 수행하였다. 먼저 2B6/4420 또는 2B6/3G8 (네거티브 대조표준으로서)을 ELISA 플레이트 위에 코팅시켜 놓은 플루오레세인-포합된 단백질 (S-단백질)에 결합시켰다. 다음에 DART의 2B6 아암을 가용성 CD32B에 의해 포함시켰다. 결합은 2B6의 그것과 중첩하지 않는 에피토프를 가지는 CD32B에 대한 다른 항체와, HRP-포합된 이차 항체에 의해 검출하였다. 2B6/4420 DART가 플루오레세인 및 CD32B에 동시에 결합할 수 있는 한편, 2B6/3G8은 그렇지 않았다 (도 21, 패널 A). DART가 가용성 CD32B로 코팅된 플레이트 상에 포획될 때 결합을 hu2B6 Fv에 특이한 항체에 의해 검출하였고, 두 가지 DART가 모두 양호한 결합을 보였다. 2B6/4420 DART가 사람 IgG에 포합된 플루오레세인에 결합할 수 있는 지를 증명하기 위하여 (이것이 이 시약의 초기 실행의 맥락이라는 가정하에), 플루오레세인으로 표지되었거나 표지되지 않은 HuIgG를 ELISA 플레이트에 결합시키고, 2B6/4420을 포획하는 데 사용하였다. 다시, 2B6/3G8을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다. 결합을 Hu2B6 Fv에 특이한 항체를 사용하여 검출하였다. 2B6/4420 DART는 명백하게 FITC-HuIgG에 결합하였지만, 미표지 HuIgG에는 결합하지 않았고, 그것은 이 DART가 항체에 포합된 플루오레세인에 결합할 수 있고, 항체 단독에는 유의할만하게 결합하지 않는다는 것을 증명한다. 예상했던 것과 같이, 이들 맥락의 어느 것에서도 2B6/3G8 DART에 의한 결합은 검출되지 않았다.

2B6/4420 DART가 세포-기저 분석의 맥락에서 신호화에 미치는 영향을 나타낼 수 있는 이중 친화성 시약으로서 기능할 수 있는 지를 증명하기 위하여 실험을 수행하였다. CD32B와 BCR의 공동응집은 B 세포 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. 2B6/4420 DART의 플루오레세인으로 표지된 αCD79b 항체로 코팅된 BCR과 CD32B를 함께 포함시키고 세포 증식의 억제를 야기하는 2B6/4420 DART의 능력을 탐색하였다. B 세포는 사람 혈액으로부터 네거티브하게 선택하였고, 마우스 항-사람-CD79b FITC-표지된 클론 CB3.1 및 CB3.2의 농도를 증가시키면서 처리함으로써 활성화시켰고, BCR을 교차결합시키기 위하여 이차 시약으로서 Fc-특이적 GAM의 F(ab')2 단편을, 플루오레세인을 표적으로 하지 않는 분자인 고정된 농도 (5㎍/mL)의 2B6/4420 DART 또는 동등한 양의 2B6/3G8 DART와 함께 첨가함으로써 대조표준으로서 사용하였다. [³H]-티미딘 통합으로서 측정된 세포 증식은 DART의 부재시에 또는 대조 2B6/3G8 DART의 존재하에 단클론성 항-CD79b-FITC 활성화제의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 2B6/4420 DART의 존재는 항-사람 CD79b-FITC의 모든 농도에서 B-세포 증식의 현저한 감소를 유도하였다 (도 22, 패널 A 및 B 및 도 23, 패널 A).

증식의 억제는 미표지 CB3.2로 코팅되고 동일한 실험 조건을 사용하여 활성화된 B 세포가 2B6/4420 DART로 처리될 때 관찰되었고, 이것은 그것의 표적-특이성을 증명한다 (도 23, 패널 B). 이들 데이터는 2B6/4420 DART가 CD32B 및 BCR에 교차결합할 수 있고, 항원-수용체-유도된 세포 활성화를 차단할 수 있는 억제 신호를 전달할 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 6. CD32B 발현 B 세포 암에 대한 DART 면역요법

현재 B 세포 암은 리툭산® 항-CD20 항체를 사용하여 치료된다. 그러나 일부 B 세포 암은 CD20을 발현하지 않거나 리툭산에 대해 내성이 되고 있다. 본 발명의 DART는 리툭산® 항-CD20 항체와 관련된 문제를 극복할 수 있는 대체 면역요법을 제공한다.

MGD261은 hCD32B (h2B6 항체를 통하여) 및 hCD16A 및 hCD16B (h3G8 항체를 통하여)에 결합하는 이중-특이성 재표적화 (DART) 분자이다.

MGD261의 효능 (B 세포 소모) 및 안전성을 mCD32_/_ hCD16A+ C57Bl/6, mCD32_/_ hCD32B+ C57Bl/6 및 mCD32_/_ hCD16A+ hCD32B+ C57Bl/6에서 시험하였다. 이런 반복 용량 실험에서, 마우스에게는 IV 주사를 6회 실시하였다 (3주 동안 1주에 2회). B 세포 소모를 FACS에 의해 모니터하였다. 안전성을 동물 우리 옆에서 관찰함으로써 모니터하였다.

데이터는 MGD261이 어떠한 유의미한 부작용을 유도하지 않으면서 이중 유전자도입 마우스에서 B 세포를 소모시킬 수 있음을 가리킨다.

데이터: MacroGenics 사육 집단으로부터 얻은 mCD32_/_ hCD16A+ C57Bl/6, mCD32_/_ hCD32B+ C57Bl/6 및 mCD32_/_ hCD16A+ hCD32B+ C57Bl/6 마우스를 0, 3, 7, 10, 14 및 17일에 MGD261로 (10, 3, 1 또는 0.3mg/kg), 또는 무관한 항체 (hE16 10mg/kg)로 IV 주사하였다. 혈액을 -19 (출혈 전), 4, 11, 18, 25 및 32일에 FACS 분석을 위해 수집하였다. 동물의 건강과 활동성을 일주일에 3회 기록하였다.

디자인:

FACS 분석 방법: 전체 혈액 샘플을 h2B6-h3G8을 투여하기 전 18일에, 그리고 처리 후 4, 11, 18, 25 및 32일에 수집하였다. 혈액 샘플을 FACS 기저 분석에 의해 B 세포 수에 미치는 h2B6-h3G8의 효과를 측정하기 위해 분석하였다. 비-세척 프로토콜을, Beckman Coulter로부터 얻은 FlowCount 비즈를 사용함으로써, B 세포, T 세포 및 PMN 카운트에 대해 사용하였다. 분석에 사용된 항체의 패널은 PMN에 대해서는 1A8-FITC였고, T 세포에 대해서는 CD3-PE였으며, B 세포에 대해서는 CD19-APC였고, 총 백혈구에 대해서는 CD45-PerCP였다.

결과

hE16 또는 MGD261 (어떠한 농도에서든지)로 처리된 마우스들은 실험기간 동안 어느 때든지 어떠한 불편함의 신호를 나타내지 않았다.

B 세포 소모는 hCD16A 및 hCD32B 이중 유전자도입 마우스에서 관찰되었다. 이중체 h2B6-3G8은 hCD16A 발현 이펙터 세포와 hCD32B 발현 B 세포를 연합시키고; 그런 연합은 B 세포 사멸에 필요하였다. B 세포 소모는 단일 유전자도입 마우스에서는 관찰되지 않았다 (도 24). T세포와 PMN 수준에 대해서는 연구되는 동안 유의미한 변화가 없었다.

본 발명의 대체 면역요법의 추가의 증거로서, MGD261의 대용물, "2.4G2-3G8 DB"로 명명하는 것을 구성하였다. 2.4G2-3G8 DB는 mCD32B (2.4G2 항체를 통하여) 및 hCD16A 및 hCD16B (h3G8 항체를 통하여)에 결합하는 이중-친화성 재표적화 (DART) 분자이다.

2.4G2-3G8 DB의 효능 (B 세포 소모) 및 안전성을 mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57Bl/6, mCD16-/- hCD16B+ 및 mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ 마우스에서 시험하였다. 이 반복 용량 실험에서 마우스에게 IP주사를 9회 실시하였다 (1주일에 3회씩 3주 동안). B 세포 소모를 FACS에 의해 모니터하였다. 안전성을 동물 우리 옆에서 관찰함으로써 모니터하였다.

데이터는 2.4G2-3G8 DB가 어떠한 유의미한 부작용을 유도하지 않으면서 hCD16 유전자도입 마우스에서 B 세포를 소모할 수 있음을 가리킨다.

데이터: MacroGenics 사육 집단으로부터 얻은 mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57Bl/6, mCD16-/- hCD16B+ 및 mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ 마우스를 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 및 18일에 2.4G2-3G8 DB로 (75㎍/마우스), 또는 PBS로 IP 주사하였다. 혈액을 -10 (출혈 전), 4, 11 및 18일에 FACS 분석을 위해 수집하였다. 동물의 건강과 활동성을 일주일에 3회 기록하였다.

FACS 분석 방법: 전체 혈액 샘플을 2.4G2-3G8을 투여하기 전 10일에, 그리고 처리를 시작한 후 4, 11 및 18일에 수집하였다. 혈액 샘플을 FACS 기저 분석에 의해 B 세포 수에 미치는 2.4G2-3G8의 효과를 측정하기 위해 분석하였다. 비-세척 프로토콜을, BD 면역혈구계산 시스템으로부터 얻은 TruCOUNT 튜브를 사용함으로써, B 세포, T 세포 및 PMN 카운트에 대해 사용하였다. 분석에 사용된 항체의 패널은 PMN에 대해서는 1A8-FITC였고, T 세포에 대해서는 CD3-PE였으며, B 세포에 대해서는 CD19-APC였고, 총 백혈구에 대해서는 CD45-PerCP였다.

결과

hE16 또는 2.4G2-3G8 DB로 처리된 마우스들은 실험기간 동안 어느 때든지 어떠한 불편함의 신호를 나타내지 않았다.

B 세포 소모는 mCD16-/- hCD16A+ 또는 mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ 마우스에서 관찰되었지만 mCD16-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다 (도 25). T세포와 PMN 수준에 대해서는 연구되는 동안 유의미한 변화가 없었다.

정맥 내 (IV) 모델: MGD261의 항-종양 활성을 사람 종양 셀라인 Raji의 정맥 내 (IV) 모델을 사용하여 시험하였다. Raji는 hCD32B를 발현하는 사람 버킷 림프종 셀라인이다. mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- 마우스에 정맥 내 주사될 때, 종양 세포는 척추에 위치하고, 뒷다리 마비를 유발한다.

데이터는 MGD261이 mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- 마우스에서 Raji 종양 세포의 생체 내 성장을 차단할 수 있음을 나타낸다. 데이터는 MGD261이 사람에서 CD32B 발현 B 세포 암의 치료에 사용될 수 있음을 가리킨다.

데이터: MacroGenics 사육 집단으로부터 얻은 mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- C57Bl/6 마우스를 5x10⁶ Raji 세포로 0일에 IV 주사하였다. 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 및 30일에 마우스를 또한 250, 25 또는 2.5㎍의 MGD261로 또는 PBS (네거티브 대조표준)로 복강 내 (IP) 처리하였다. 그런 다음 마우스를 매일 관찰하고, 체중을 일주일에 2회 기록하였다. 뒷다리 마비를 나타내는 마우스를 희생시켰다.

결과: PBS로 처리된 마우스들은 25일 내지 50일 사이에 사망하였다. MGD261로 처리된 마우스는 최소한 90일까지 생존하였다 (도 26). 증가된 생존율은 통계학적으로 유의미하였다. Logrank Test를 사용한 생존 곡선의 비교는 96.46의 χ²을 나타냈다 (df9; P값 <0.0001).

실시예 7. 원핵세포에서 DART 발현

비-포유류 숙주에서 DART를 생성하는 능력을 측정하기 위하여 실험을 수행하였다. 따라서 대장균을 DART-발현 플라스미드로 형질전환하고, DART 발현을 모니터하였다.

재료 및 방법:

플라스미드 구성: 3G8은 HuCD16에 대한 인간화된 단클론성 항체이다. 여기서 설명된 DART는 두 개의 공유 연결된 사슬로 구성되는데, 그것들은 각각 VL과 스페이서, 그리고 VH와 Cys를 양호한 맥락으로 가짐으로써 반대 사슬에 이황화 결합을 형성한다. 3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO:10)-3G8VH-LeuGlyGlyCys를 코드화하는 DART 서열을 기존의 진핵세포 발현 구성물로부터 PCR 증폭시키고, NcoI 및 EcoRI으로 소화시켰다. 표적 벡터는 pET25b (+)(Novagen)였고, 그것은 대장균에서의 분비를 위해 pelB 리더 서열을 함유한다. 3G8/3G8 DART 서열을 삽입하기 전에 벡터를 다음과 같이 변형시켰다: 먼저, T7 프로모터를, 저활성 lac 프로모터에 의해, 비록 그 프로모터의 제어하에 단백질 발현 수준이 더 낮아지더라도 가용성을 높이기 위하여 대체한다. 추가로, pelB 리더의 시작지점에 존재하는 Met에서 개시될 수 있도록 하기 위하여 두 개의 점 돌연변이를 다중 클로닝 부위 (MCS)가 시작하는 곳에 존재하는 두 개의 내부 Met 코돈을 제거하기 위해 도입하였다. 이 구성물에 의해 생성된 DART는 동일한 특이성을 가지는 두 개의 V-영역 아암, 즉 HuCD16으로 구성된다.

발현: BL21DE3 세포 (Novagen)를 pET25b(+)T7- lac+ 3G8/3G8 플라스미드로 형질전환하고, amp-내성 콜로니를 사용하여 영양 배지에 시딩하였다. 배양이 0.5 OD600 유닛에 도달하면, 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 배양을 30℃에서 2시간 동안 성장시키고, 세포-유리 배지를 수집하였다.

정제: 3G8/3G8 DART를 친화성 및 크기 축출 크로마토그래피를 활용하여 2단계 과정으로 정제하였다. DART를 친화성 크로마토그래피를 사용하여 조건 배지로부터 포획하였다. 구체적으로, CD16A는 CNBr 활성화된 세파로오스 4B (GE Healthcare)에 결합하였다. CD16A-세파로오스 수지를 20mM의 트리스/HCl, pH 8.0으로 부하 전에 평형화하였다. 부하를 완료했을 때 수지를 평형 완충액으로 세척한 후에 결합된 DART를 50mM의 글리신 pH 3.0으로 용출하였다. 용출된 DART를 즉시 1M 트리스/HCl pH 8.0으로 중화한 후, 원심분리형 농축기 (Vivaspin 20, 10k MWCO PES, VivaScience, Inc.)를 사용하여 농축하였다. 농축된 DART를 추가로 PBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 축출 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

결과

1.7리터의 대장균 배양된 조건 배지를 CD16A 세파로오스 칼럼을 통해 프로세스하였다. DART의 수율은 0.12mg이었다. SDS-PAGE 및 SEC에 의한 DART의 분석은 포유류 세포 (CHO) 발현된 대조표준 DART에 비교할만한 것임을 증명하였다 (도 27).

대장균 발현된 h3G8 - h3G8 DART 결합 ELISA: 대장균에서 h3G8-h3G8 DART의 발현을 ELISA를 사용하여 측정하였다. 50㎕/웰의 2㎍/ml의 항-h3G8 Fv 특이 항체 2C11을 탄산염 완충액 중에서 4℃에서 밤새 96-웰 Maxisorp 플레이트 위에 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T (PBS, 0.1% 트윈 20)로 3회 세척한 후 PBS-T 중의 0.5% BSA로 30분 동안 실온에서 차단한 후 시험 DART를 첨가하였다. 차단하는 동안 대장균 발현된 h3G8-h3G8 DART, h2B6-h3G8 DART, 및 h2B6-h2B6 DART (네거티브 대조표준)을 1㎍/ml, 및 0.3㎍/ml로 PBST/BSA로 희석하였다. 50㎕/웰의 희석된 DART를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후, 50㎕/웰의 0.1㎍/ml의 비오티닐화된 sCD16-Fc 융합물을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후에 50㎕/웰의 1:5000 희석된 HRP 포합된 스트렙트아비딘 (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 검출하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 80㎕/웰의 TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 5분 동안 인큐베이션한 후에 반응을 40㎕/웰의 1% H₂SO₄에 의해 중단시켰다. OD450nm를 96-웰 플레이트 판독기 및 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 판독하였다. 판독값을 GraphPad Prism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다 (도 28).

실시예 8. DART -유도된 사람 B-세포 사멸

사람 PBMC를 CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6 (상기 설명됨); ch2B6-aglyc-아글리코실화된 키메릭 2B6 항체 (공동 계류중인 미국 특허 출원 일련 번호 11/108,135에 설명됨, US2005/0260213으로 공개됨) 및 CD16-CD79와 함께 밤새 인큐베이션하였다. CD16-CD79의 DNA 및 코드화된 단백질 서열은 다음과 같다:

H3G8VL - CB3 .1 VH

뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :226):

gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50

gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100

atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150

ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200

tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250

ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350

cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400

gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450

tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500

tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550

aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650

agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700

agcccaaatc ttgt 714

아미노산 서열 ( SEQ ID NO :227):

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50

LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100

TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150

YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200

QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238

CB3 .1 VL - h3G8VH

뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :228):

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50

accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100

gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150

cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200

cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250

aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350

aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400

ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450

acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500

agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550

ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600

gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650

tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700

tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732

아미노산 서열 ( SEQ ID NO :229):

DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100

LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150

TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200

VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244

아폽토시스를 FACS 분석에 의해 총 FSC/SSC 게이트화되지 않은 집단 상의 B 세포 (CD20+ 세포)의 PI+Annexin-V+ 집단의 백분율로서 분석하였다 (도 29).

실시예 9. 8B5- CB3 .1 DART

8B5VL- CB .1 VH - VEPKSC

8B5VL을 프라이머로서 H9와 lgh630R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Lc를 사용하여 증폭시켰다. CB3.1VH를 프라이머로서 lgh628F와 lgh629R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Hc를 사용하여 증폭시켰다. 링커 서열을 프라이머 lgh630R과 lgh628F에 통합시켰다. c-말단 링커와 중지 코돈을 lgh629R 프라이머에 통합시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 등몰량의 비율로 함께 혼합한 후, 프라이머로서 H9와 lgh629R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩된 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

CB3 .1 VL -8B5VH- FNRGEC

CB3.1VL을 프라이머로서 FR4에서 8B5VL과 동일한 서열을 공유하는 H9와 lgh630R을 사용하고, 주형으로서 chCB3.1Lc를 사용하여 증폭시켰다. 8B5VH를 프라이머로서 lgh631F와 lgh640R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Hc를 사용하여 증폭시켰다. 링커 서열을 프라이머 lgh630R과 lgh631F에 통합시켰다. c-말단 링커와 중지 코돈을 lgh640R 프라이머에 통합시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 등몰량의 비율로 함께 혼합한 후, 프라이머로서 H9와 lgh640R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩된 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

항- Flag 태그-8B5VL- CB3 .1 VH - VEPKSC

항-Flag 태그를 신호 서열과 8B5VL 사이에 중첩 PCR에 의해 삽입하였다. 신호 서열과 Flag 태그를 프라이머로서 H9와 lgh647R을 사용하고 주형으로서 ch8B5Lc를 사용하여 증폭시켰다. 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC를 프라이머로서 lgh647F와 lgh629R을 사용하고 주형으로서 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC를 사용하여 다시 증폭시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 등몰량의 비율로 함께 혼합한 후, 프라이머로서 H9와 lgh629R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩된 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

8B5VL- CB3 .1 VH - LGGC

8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 구성물에 상이한 C-말단 링커를 생성하기 위하여, 구성물을 프라이머로서 H9와 lgh646R을 사용하여 재증폭시켰다. C-말단 LGGC 링커를 lgh646R 프라이머에 통합시켰다. 그런 다음 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

CB3 .1 VL -8B5VH- LGGC

동일한 전략을 CB3.1VL-8B5VH-LGGC를 생성하기 위하여 사용하였다. C-말단 LGGC 링커를 lgh648R 프라이머에 통합시키고 주형으로서 CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC를 사용하였다. 그런 다음 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

항- Flag 태그-8B5VL- CB3 .1 VH - LGGC

동일한 전략을 또한 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-LGGC를 생성하기 위하여 사용하였다. C-말단 LGGC 링커를 lgh648R 프라이머에 통합시키고 주형으로서 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC를 사용하였다. 그런 다음 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

8B5- CB3 .1- VEPKSC 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :230):

gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50

aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250

cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400

agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550

cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600

ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650

ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700

gt 702

8B5- CB3 .1- VEPKSC 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :231):

DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50

ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100

GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200

LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234

CB3 .1-8B5- FNRGEC 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :232):

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50

accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100

gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150

cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200

cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250

aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600

gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700

tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726

CB3 .1-8B5- FNRGEC 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :233):

DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100

LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150

DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200

VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242

8B5VL- CB3 .1 VH - LGGC

8B5VL을 프라이머로서 H9와 lgh694R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Lc를 사용하여 증폭시켰다. 8B5VH를 프라이머로서 lgh695F와 lgh696R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Hc를 사용하여 증폭시켰다. 링커 서열을 프라이머 lgh694R과 lgh695F에 통합시켰다. HuIgG1Fc를 프라이머로서 lgh355F와 lgh366R을 사용하고, 주형으로서 ch8B5Hc를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 등몰량의 비율로 함께 혼합한 후, 프라이머로서 H9와 lgh366R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩된 PCR 생성물을 NheI/EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, pCIneo 벡터에 클론하였다.

8B5VL- CB3 .1 VH - LGGC 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :234):

gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50

aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250

cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400

agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550

cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600

ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650

ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696

8B5VL- CB3 .1 VH - LGGC 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :235):

DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50

ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100

GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200

LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232

CB3 .1-8B5- LGGC 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :236):

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50

accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100

gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150

cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200

cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250

aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600

gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700

tctcctcgct gggaggctgc 720

CB3 .1-8B5- LGGC 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :237):

DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100

LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150

DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200

VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240

프라이머 :

Lgh628F (SEQ ID NO:238):

ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47

Lgh629R (SEQ ID NO:239):

tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49

Lgh630R (SEQ ID NO:240):

gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45

Lgh631F (SEQ ID NO:241):

ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47

Lgh640R (SEQ ID NO:242):

tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49

Lgh644R (SEQ ID NO:243):

tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48

Lgh646R (SEQ ID NO:244):

tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42

Lgh647F (SEQ ID NO:245):

caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45

Lgh648R (SEQ ID NO:246):

tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43

발현: 구성물 5와 6, 또는 6과 7, 또는 8과 9, 또는 9와 10을 코드화하는 플라스미드 (도 30)를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 HEK-293세포에 공-형질전환시켜서 8B5-CB3.1 DART를 항Flag가 있거나 없는 채로 발현시켰다. 조건 배지를 매 3일마다 3회 수집하였다. 그런 다음 조건 배지를 CD32B 친화성 칼럼을 사용하여 정제하였다.

ELISA: ELISA를 다음과 같이 수행하였다: 50㎕/웰의 2㎍/ml의 CD32B-Fc를 탄산염 완충액 중에서 4℃에서 밤새 96-웰 Maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T (PBS, 0.1% 트윈 20)로 3회 세척한 후 PBS-T 중의 0.5% BSA에 의해 30분 동안 실온에서 차단한 다음, 시험 단일 사슬 Fc 융합 단백질을 첨가하였다. 차단하는 동안 8B5-CB3.1 DART 를 2㎍/ml에서 시작하여 연속적으로 2배 희석하였다. 25㎕/웰의 희석된 DART를 25㎕/웰의 50ng/ml의 ch8B5와 혼합하고 희석 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후에 50㎕/웰의 1:10,000으로 희석된 HRP 포합된 F(ab')₂ 염소 항 사람 IgG F(ab')₂ (Jackson ImmunoResearch)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 80㎕/웰의 TMB 기질로 전개하였다. 그것을 5분 동안 인큐베이션한 후에 반응을 40㎕/웰의 1% H₂SO₄에 의해 중단시켰다. OD450nm를 96-웰 플레이트 판독기와 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 판독하였다. 판독값을 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다 (도 31).

실시예 10. Ig-유사 4가 DART의 디자인 및 특성확인

4개의 폴리펩티드 사슬을 사용하여 4가의 항원 결합 부위를 가지는 Ig-유사 DART 종을 생성하였다 (도 32; 도 33). Ig-유사 DART는 독특한 특성을 가지는데, 왜냐하면 그것의 도메인이 동일한 에피토프에 결합하거나 (4개의 동일한 항원 분자에 결합할 수 있는 4가의 단일-에피토프 특이적 Ig-유사 DART를 형성하기 위하여), 또는 상이한 에피토프 또는 항원에 결합하도록 디자인될 수 있는데, 예를 들어 그것의 도메인은 동일한 항원의 두 개의 에피토프에 결합하도록 디자인될 수 있거나 (4가의 단일-항원 특이적, 이중-에피토프 특이적 Ig-유사 DART), 또는 첫 번째 항원에 특이한 결합 부위의 쌍과 두 번째 항원에 특이한 결합 부위의 두 번째 쌍을 가지는 4가 Ig-유사 DART를 형성하기 위하여 상이한 항원 분자의 에피토프에 결합하도록 디자인될 수 있기 때문이다. 그러한 경향성의 조합을 가지는 하이브리드 분자는 쉽게 생성될 수 있다.

그러한 Ig-유사 DART 종의 특성을 설명하기 위하여, CD32에 특이한 결합 부위의 쌍과 CD16에 특이한 결합 부위의 두 번째 쌍을 가지는 예시적인 4가 Ig-유사 DART 종을 제조하였다. 이 Ig-유사 DART 종을 다음의 4개의 폴리펩티드 사슬을 사용하여 제조하였다:

2.4G2-3G8-h카파 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:247):

gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50

aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100

cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150

gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200

tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250

gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300

gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400

gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450

gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500

catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550

tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600

agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650

cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700

tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800

gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850

tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900

gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950

agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000

gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 1044

2.4 G2 -3 G8 -h 카파 코드화된 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :248):

DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100

GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150

VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200

SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250

IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300

DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350

3 G8 -2.4 G2 - hG1 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :249):

gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50

gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100

atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150

ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200

tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250

aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350

cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400

gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450

tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500

cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550

agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600

caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650

agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700

tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800

tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850

cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950

gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000

atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100

gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150

tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250

tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300

tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400

ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450

catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550

gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600

ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700

cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1734

3 G8 -2.4 G2 - hG1 코드화된 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :250):

DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50

LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100

TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150

YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200

QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250

TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300

FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350

CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 400

DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 450

KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500

KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550

GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 578

상기 서열을 가지는 Ig-유사 DART 분자의 제제를 상이한 플라스미드 분리물로부터 얻었고, 그것을 "Ig DART 1" 및 "Ig DART 2"로 명명하였다. 이들 Ig-유사 DART 종이 ELISA에서 mCD32-hCD16A에 결합하는 능력을 배지 단독, 단일한 CD32 및 단일한 CD16A 결합 부위를 가지는 DART ("DART"), 및 대조표준 항-ch-mCD32 mAb의 그것과 비교하였다 (도 34). 본 발명의 Ig-유사 DART는 DART나 대조표준 항체보다 훨씬 더 큰 항원 결합 친화성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

실시예 11. CD32B-CD79-1 및 CD32B-CD79-2 이중특이성 이중체의 디자인 및 특성확인

CD79VL-CD32BVH (서열 1), CD32BVL-CD79VH-1 (서열 2), 및 CD32BVL-CD79VH-2 (서열 3)를 코드화하는 유전자를 발현 벡터 pEE13에 클론하여 각각 발현 구성물 1, 2 및 3을 제조하였다. 구성물 1 발현 플라스미드를 플라스미드 2 또는 3과 함께 HEK-293 세포에 공-형질전환하여 각각 CD32B-CD79-1 및 CD32B-CD79-2를 제조하였다. 매 3일마다 3회 조건 배지를 수득하였다. 그런 다음 조건 배지를 CD32B 친화성 칼럼을 사용하여 정제하였다.

ELISA를 다음과 같이 수행하였다: 50㎕/웰의 2㎍/ml의 CD32B-Fc를 탄산염 완충액 중에서 4℃에서 밤새 96-웰 Maxisorp 플레이트상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T (PBS, 0.1% 트윈 20)로 3회 세척한 후 PBS-T 중의 0.5% BSA에 의해 30분 동안 실온에서 차단한 다음, 시험 단일 사슬 Fc 융합 단백질을 첨가하였다. 차단하는 동안 CD32B-CD79-1 또는 CD32B-CD79-2 이중특이성 이중체를 2㎍/ml에서 시작하여 연속적으로 2배 희석하였다. 25㎕/웰의 희석된 이중특이성 이중체를 25㎕/웰의 50ng/ml의 항-CD32B 항체와 혼합하고 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS-T로 3회 세척한 후에 50㎕/웰의 1:10,000으로 희석된 HRP 포합된 F(ab')₂ 염소 항 사람 IgG F(ab')₂ (Jackson ImmunoResearch)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고 80㎕/웰의 TMB 기질로 전개하였다. 그것을 5분 동안 인큐베이션한 후에 반응을 40㎕/웰의 1% H₂SO₄에 의해 중단시켰다. OD450nm를 96-웰 플레이트 판독기와 SOFTmax 소프트웨어를 사용하여 판독하였다. 판독값을 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다. 실험으로 CD32B-CD79-1과 CD32B-CD79-2 이중특이성 이중체가 CD32-Fc에, 항-CD32B 대조 항체의 친화성과 동등한 친화성으로 면역특이적으로 결합할 수 있는 것으로 드러났다. 상기 설명된 구성물들의 뉴클레오티드 및 코드화된 아미노산 서열을 아래에 제시한다:

서열 1 - CD79VL - CD32BVH 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :251):

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50

gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100

gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150

cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200

cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250

aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600

gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700

tctcctcgct gggaggctgc 720

서열 2 - CD79VL - CD32BVH 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :252):

DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100

LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150

DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200

LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240

서열 3 - CD32BVL - CD79VH -1 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :253):

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50

tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250

caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400

aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550

ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600

ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650

ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696

서열 4 - CD32BVL - CD79VH -1 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :254):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50

ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200

LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232

서열 5 - CD32BVL - CD79VH -2 뉴클레오티드 서열 ( SEQ ID NO :255):

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50

tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250

caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400

aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550

ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600

ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650

ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696

서열 6 - CD32BVL - CD79VH -2 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :256):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50

ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200

LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232

실시예 12. H8B5 - HBCR 생체기능성 이중체의 구성 및 특성확인

CD32 및 B-세포 수용체 복합체 ("BCRC")에 결합할 수 있는 가변 영역을 함유하는 이중체를 구성하였다.

클로닝. 구성물을 표준 PCR/중첩하는 PCR을 사용하여 구성하였다:

h8B5VL - G3SG4 - hBCRCVH M48I - LGGC :

전체가 인간화된 8B5 VL (CD32를 인식함)을 프라이머로서 lgh321F와 lgh788R을 사용하여 증폭시켰다. hBCRCVH M48I를 프라이머로서 lgh784F와 lgh386R을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 함께 혼합한 후, lgh321F와 lgh386R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩하는 PCR 단편을 pEE6에 XbaI-EcoRI 부위에서 클론하였다. "G3SG4"는 서열: GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)을 가지는 링커이다.

hBCRCVL R45N - G3SG4 - h8B5VH - LGGC :

hBCRCVL R45N을 프라이머로서 lgh321F와 lgh785R을 사용하여 증폭시켰다. h8B5VH를 프라이머로서 lgh787F와 lgh786R을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 겔 정제하고 함께 혼합한 후, lgh321F와 lgh786R을 사용하여 증폭시켰다. 그런 다음 중첩하는 PCR 단편을 pEE13에 XbaI-EcoRI 부위에서 클론하였다.

단일 벡터 구성. pEE6HHBCRCVL R45N-h8B5VH를 BglII-SalI 부위에서 소화시키고, 3.3kb 단편을 정제한 후 pEE13 hHBCRCVL 45N-h8B5VH에 BamHI-SalI 부위에서 삽입하였다. BglII와 BamHI은 경합하는 돌출 단부를 공유한다. DART를 구성하기 위해 사용된 DART 및 프라이머의 서열은 다음과 같다:

hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:257):

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50

gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100

gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150

cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200

cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250

aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600

gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700

tctcctcgct gggaggctgc 720

hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC 아미노산 서열 (SEQ ID NO:258):

DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100

LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150

DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200

LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240

H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:259):

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50

tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250

caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350

tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400

aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550

ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600

ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650

ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696

H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC 아미노산 서열 (SEQ ID NO:260):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50

ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100

GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200

LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232

프라이머 :

Lgh321F 프라이머 (SEQ ID NO:261):

cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36

Lgh386R 프라이머 (SEQ IDNO:262):

tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45

Lgh784F 프라이머 (SEQ ID NO:263):

tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45

Lgh785R 프라이머 (SEQ ID NO:264):

cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38

Lgh786R 프라이머 (SEQ ID NO:265):

tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42

Lgh787F 프라이머 (SEQ ID NO:266):

ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44

Hu3G8VL 1-G3GG4-Hu2B6VH 4-LGGC 발현 플라스미드를 Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGS와 함께 HEK-293 세포에 공-형질전환시켜서 CD32와 CD79를 인식하는 Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 이중특이성 이중체를 만들었다. 동시에 Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGS와 Hu3G8VL 1-G3GG4-Hu3G8VH 5-LGGC를 개별적으로 HEK-293 세포에 형질전환시켜서 Hu2B6 4.5와 Hu3G8 5.1 이중체를 만들었다. 이것들을 3일 동안 배양한 후, 조건 배지를 수득하고 ELISA에 결합시킴으로써 특성을 확인하였다. 이 실험의 결과를 도 36에 도시한다.

실험 디자인: 100ng/웰의 가용성 FcRIIb-G2-Agl를 96-웰 Maxisorp 플레이트 상에 탄산염 완충액 중에서 40℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS/0.1% 트윈 20으로 3회 세척한 후 PBS/0.1% 트윈 20 중의 0.5% BSA에 의해 30분 동안 실온에서 차단한 다음 이중체를 첨가하였다. Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 이중특이성 이중체, Hu2B6 4.5 이중체, 및 hu3G8 5.1 이중체의 조건배지를 25ng/웰에서 시작하여 연속적으로 2배 희석하고 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS/0.1% 트윈 20으로 3회 세척한 후, 10ng/웰의 FcRIIIa-G2-비오틴을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그것을 PBS/0.1% 트윈 20으로 3회 세척한 후, 50㎕의 1:5000으로 희석된 HRP 포합된 스트렙트아비딘 (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 검출하였다. 45분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS/0.1% 트윈 20으로 3회 세척하고, TMB 기질을 사용하여 전개시켰다. 10분 동안 인큐베이션한 후에, 반응을 1% H₂SO₄에 의해 중단시켰다. OD450nm를 SOFTmax 프로그램에 의해 판독하였다. 판독값을 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를 사용하여 도표화하였다.

실시예 13. IgDART 이중체의 구성

CD32 및 B-세포 수용체 복합체 ("BCRC")에 결합할 수 있는 가변 영역을 함유하는 IgDART 이중체를 구성하였다. 첫 번째 이중체는 분자의 VH 서열과 Fc 서열 사이에 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267) 링커를 사용하였다. 두 번째 이중체는 서열: LEIK (SEQ ID NO:268)을 가지는 LEIK 링커 또는 서열 TVSS (SEQ ID NO:269)를 가지는 TVSS 링커를 사용하였다. 이들 이중체 사슬 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다:

H8B5VL - hBCRCVH M48I , M62K _ LGGCG3S _ hKappa ( SEQ ID NO :270):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50

ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100

GTKVEIK GGG SGGGG QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200

LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSS LG GCGGGS RTVA APSVFIFPPS 250

DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300

TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 343

H8B5VL 서열을 위치 108-115에 위치한 링커 GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)에 의해 hBCRCVH 서열에 융합한다. hBCRCVH 서열을 위치 229-236에 위치한 링커 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)에 의해 Fc 서열에 융합한다. H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같다: (SEQ ID NO:271):

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50

tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250

caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa a ggaggcgga tccggaggcg gaggc caggt 350

tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400

aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550

ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600

ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650

ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca ctggga ggctgcggcg 700

gagggagc cg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800

cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850

aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900

acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000

acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050

tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082

이때 링커: GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)과 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)을 코드화하는 서열은 각각 위치 322-345 및 685-708에 위치한다 (둘 다 상기 밑줄로 표시됨).

HBCRCVL R45N - h8B5VH _ LGGCGGGS - hG1 ( SEQ ID NO :272):

DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100

LTFGGGTKLE IK GGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150

DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200

LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSS LGGC GGGS ASTKGP 250

SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300

LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350

HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 400

KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450

SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500

PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550

SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574

hBCRCVL 서열을 위치 113-120에 위치한 링커 GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)에 의해 H8B5VH 서열에 융합한다. H8B5VH 서열을 위치 237-244에 위치한 링커 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)에 의해 Fc 서열에 융합한다 (두 서열 모두 상기에서 밑줄로 표시된다). HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같다: (SEQ ID NO:273):

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50

gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100

gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150

cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200

cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250

aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaa ggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600

ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700

tctccagc ct gggaggctgc ggcggaggga gc gcctccac caagggccca 750

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800

ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 850

cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 950

cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000

gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100

cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150

ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250

gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300

ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400

agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450

agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550

ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600

acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700

cctctccctg tctccgggta aa 1722

이때 링커: GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)과 LGGCGGGS (SEQ ID NO:267)을 코드화하는 서열은 각각 위치 337-360 및 709-732에 위치한다 (둘 다 상기 밑줄로 표시됨).

H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa (SEQ ID NO:274):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50

ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100

GTKVEIK GGG SGGGG QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150

WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200

LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTV LEIK RT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250

ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300

TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335

H8B5VL 서열을 위치 108-115에 위치한 링커 GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)에 의해 HBCRCVH 서열에 융합한다. HBCRCVH 서열을 위치 225-228에 위치한 LEIK (SEQ ID NO:268)에 의해 Fc 서열에 융합한다 (두 서열 모두 상기에서 밑줄로 표시된다). H8B5VL_HBCRC M48I,M62K_(-4)LEIK_hKappa 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같다: (SEQ ID NO:275):

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50

tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100

gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150

gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200

tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250

caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa a ggaggcgga tccggaggcg gaggc caggt 350

tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400

aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500

tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550

ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600

ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650

ctgggggcaa gggaccacgg tc ctggagat caag cgaact gtggctgcac 700

catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 800

acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850

tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950

cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000

agtgt 1005

이때, 링커: GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)과 LEIK (SEQ ID NO:268)을 코드화하는 서열은 각각 위치 322-345 및 673-684에 위치한다 (둘 다 상기 밑줄로 표시됨).

HBCRCVL R45N - h8B5VH _(-4) TVSS - hG1 = HBCRCVL R45N - h8B5VH _- hG1 ( SEQ ID NO :276):

DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50

RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100

LTFGGGTKLE IK GGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150

DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200

LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LV TVSS ASTK GPSVFPLAPS 250

SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300

LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350

PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 400

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450

IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500

ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550

LHNHYTQKSL SLSPGK 566

HBCRCVL 서열을 위치 113-120에 위치한 링커 GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)에 의해 h8B5VH 서열에 융합한다. h8B5VH 서열을 위치 233-236에 위치한 TVSS (SEQ ID NO:269)에 의해 Fc 서열에 융합한다 (두 서열 모두 상기에서 밑줄로 표시된다). HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같다: (SEQ ID NO:277):

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50

gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100

gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150

cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200

cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250

aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaa ggag gcggatccgg 350

aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400

ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450

gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500

ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550

agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600

ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650

ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtg accg 700

tctccagc gc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 750

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 800

ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 850

gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 900

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 950

catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000

ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100

ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150

acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250

cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300

atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1350

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400

gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450

tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550

ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600

gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1698

이때, 링커: GGGSGGGG (SEQ ID NO:10)과 TVSS (SEQ ID NO:269)을 코드화하는 서열은 각각 위치 337-360 및 697-708에 위치한다 (둘 다 상기 밑줄로 표시됨).

실시예 14. 링커의 최적화

상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 IgDART 이중체는 바람직하게는 분자의 VH 서열과 Fc 서열 사이에 링커를 함유한다. 수율 및 활성을 최대화하기 위해 링커를 최적화하기 위한 실험을 수행하였다. 다음의 링커를 사용하였다.

상기 링커를 상이한 링커 조합을 가지는 IgDART 이중체 세트를 만들기 위하여 플라스미드 안에 도입하였다:

생성된 IgDART의 응집 특성을 측정하였다.

데이터는 예상외로, 링커를 가지는 구성물들, 예컨대 901A/901B; 903A/903B; 및 908A/908B에 사용된 것들이 910A/911B와 같은 링커를 가지는 구성물들보다 극적으로 월등한 결과 (더 적은 올리고머화 및/또는 더 적은 단편 생성)를 유발하였음을 보여주었다.

실시예 15. E-코일/K-코일 DART

전술한 설명으로부터 알 수 있는 것과 같이, 이중특이성 DART의 개별적인 폴리펩티드는 2종의 단일이량체와 1종의 이종이량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 대전된 폴리펩티드는 하나, 또는 그 이상, 바람직하게는 두 개의 DART 폴리펩티드 모두의 C-말단에 첨가될 수 있다. 이중특이성 DART의 개별적인 폴리펩티드에 대해 반대 전하로 대전된 폴리펩티드를 선택함으로써, 그런 대전된 폴리펩티드의 포함으로 인해 이종이량체의 형성이 더 선호되고 단일이량체의 형성이 줄어든다. 바람직하게는, 포지티브로 대전된 폴리펩티드가 아르기닌, 글루타민, 히스티딘 및/또는 라이신 (또는 그러한 아미노산들의 혼합물)의 실질적인 함량을 함유할 것이고, 네거티브로 대전된 폴리펩티드는 아스파테이트 또는 글루타메이트 (또는 그런 아미노산의 혼합물)의 실질적인 함량을 함유할 것이다. 실질적인 함량의 라이신을 함유하고 있는 포지티브로 대전된 폴리펩티드와 실질적인 함량의 글루타메이트를 함유하고 있는 네거티브로 대전된 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 그렇게 반대로 대전된 폴리펩티드 사이의 정전기 인력을 최대화하기 위하여, 자연적으로 나선형 형태를 취할 수 있는 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

그러므로 바람직한 구체예에서, 포지티브로 대전된 "E-코일"은 이중특이성 DART를 형성하기 위해 사용되는 폴리펩티드 중 하나에 첨부될 것이고, 네거티브로 대전된 "K-코일"은 DART 폴리펩티드 중 두 번째에 첨부될 것이다 (도 37).

특히 바람직한 E-코일은 서열: (EVAALEK)₄를 가질 것이다:

SEQ ID NO:299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

특히 바람직한 K-코일은 서열: (KVAALKE)₄를 가질 것이다:

SEQ ID NO:300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

그러한 E-코일을 가지는 바람직한 DART 폴리펩티드는 다음의 일반 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(EVAALEK)₄]-GGGNS를 가질 것이고, 이때 VL은 DART의 가변적인 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO:10이며, VH는 DART의 가변적인 무거운 Ig 도메인이고, (EVAALEK)₄는 SEQ ID NO:299이며, GGGNS는 SEQ ID NO:301이다. 그런 K-코일을 가지는 바람직한 DART 폴리펩티드는 다음의 일반 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(KVAALKE)₄]-GGGNS를 가질 것이고, 이때 VL은 DART의 가변적인 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO:10이며, VH는 DART의 가변적인 무거운 Ig 도메인이고, (KVAALKE)₄는 SEQ ID NO:300이며, GGGNS는 SEQ ID NO:301이다.

실시예 16. E-코일/K-코일 Fc -함유 DART

추가의 구체예에서, Fc-영역은 E-코일 또는 K-코일 DART의 E 및/또는 K 코일에 연결될 수 있다.

Fc-함유 DART의 Fc 영역과 DART VH 도메인 사이의 분리를 촉진하는 것은, 그런 도메인들이 덜 분리된 채로 배열됨으로써 그런 도메인들과 그것들의 결합 리간드 사이의 상호작용이 감소되거나 또는 그렇지 않으면 DART 어셈블리를 간섭하게 되는 경우에 바람직하다. 비록 어떠한 아미노산 서열의 분리기든지 사용될 수 있지만, 나선 코일을 형성하는 분리기를 사용함으로써 가변적인 도메인으로부터 Fc 도메인을 최대한 연장하고 돌출시키는 것이 바람직하다 (도 37). 상기 설명된 반대 전하의 코일형 폴리펩티드는 추가로 이종이량체 형성을 촉진하는 기능을 하기 때문에, 그런 분자는 특히 바람직한 분리기이다. 그런 코일-함유 Fc-DART 부자는 Fc-DART의 유익과 유사한 유익을 제공하는데, 이를테면 개선된 혈청 반감기와 이펙터 기능 충원이다. 상기 설명된 E-코일 및 K-코일 폴리펩티드가 이 목적에 대해 특히 바람직하다.

그러므로 바람직한 구체예에서, E-코일 Fc-함유 DART는 D234 (Kabat 넘버링)에서 출발하여 다음의 일반 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(EVAALEK)₄]-GGG-Fc 도메인을 가질 것이고, 이때 VL은 DART의 가변적인 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO:10이며, VH는 DART의 가변적인 무거운 Ig 도메인이고, (EVAALEK)₄는 SEQ ID NO:299이다.

유사하게, 바람직한 구체예에서, K-코일 Fc-함유 DART는 D234 (Kabat 넘버링)에서 출발하여 다음의 일반 서열: [VL 도메인]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인]-[(KVAALKE)₄]-GGG-Fc 도메인을 가질 것이고, 이때 VL은 DART의 가변적인 가벼운 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는 SEQ ID NO:10이며, VH는 DART의 가변적인 무거운 Ig 도메인이고, (KVAALKE)₄는 SEQ ID NO:300이다.

상기에서 나타낸 것과 같이, 코일-함유 DART 분자 또는 코일-함유 Fc-함유 DART 분자는 단지 하나의 그런 코일 분리기를 함유하거나, 하나 이상의 그런 분리기 (예컨대 두 개의, 바람직하게는 반대 전하의 분리기로, 그 중 하나는 DART의 폴리펩티드의 각각의 VH 도메인에 연결된다)를 함유할 수 있다. Fc 영역을 그런 분리기 분자(들)에 연결시킴으로써, 사슬 교환에 의한 2가, 4가, 등의 버전의 Fc-DART 분자를 형성하는 능력이 증강된다 (도 39). 도 39에서 알 수 있는 것과 같이, Fc 도메인이 하나 또는 두 개의 모든 DART VH 도메인에 연결되는지에 따라 단량체 또는 이량체를 형성하는 Fc-DART 분자가 생성될 수 있다.

실시예 17. E-코일/K-코일 Fc -함유 DART 의 기능적 활성

E-코일 및/또는 K-코일 Fc-DART 종은 (1) CD79b (BCR 복합체)-반응성 항체, CB3의 가변적인 가벼운 및 무거운 영역과 (2) CD32B-반응성 항체, 2B6의 저친화성 변이체 ("YA" 변이체로 명명됨)의 가변적인 가벼운 및 무거운 영역을 가지는 이중특이성 DART로부터 제조되었다. 이 항체의 경쇄 가변 영역은 돌연변이: N50Y 및 V51A를 함유하고 있다는 점에서 항체 2B6의 경쇄 가변 영역과 상이하다. 그러므로 항체 YA2B6은 다음의 경쇄 가변 영역을 가진다:

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO : 302).

이 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO : 303)

저친화성 항체를, 그것이 CD79b (B 세포)를 발현하는 세포 상에서 시스로 CD32B에 우선적으로 결합할 것이기 때문에 선택하였다. 그런 형태로 인해 다른 CD32B-발현 세포 (단핵세포, 내피 세포, 간)와의 상호작용뿐 아니라 바람직하지 못한 트란스 상호작용이 감소할 것이다.

그런 h2B6YAhCB3 DART의 E-코일 및/또는 K-코일 유도체 및 E-코일 및/또는 K-코일 Fc-함유 유도체를 만들었다. 크기 축출 크로마토그래피를 사용하여 생성된 분자의 대략적인 크기와 이종성을 분석하였다. 도 40에서 알 수 있는 것과 같이, 이량체는 E-코일 도메인에 연결된 단일 연결된 Fc 영역을 가지는 E-코일/K-코일 DART뿐 아니라, K-코일 도메인에 연결된 단일 연결된 Fc 영역을 가지는 E-코일/K-코일 DART로부터 형성되었다. Fc 영역이 동일한 DART 분자의 E 및 K 코일 둘 다에 연결되어 있고, 단량체가 대부분의 형성된 생성물인 그런 제제로부터 원하는 단량체와, 뿐만 아니라 이량체 분자를 회수하였다. 도 41은 생성된 이량체 부자의 가능한 구조를 나타낸다.

크기 축출 크로마토그래피 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분석함으로써 생성된 분자의 구조를 추가로 분석하였다 (도 42). E-코일/K-코일 DART 유도체 (Fc 영역 없음)는, 각각 대략 28kD인 (KFc-함유 폴리펩티드 및 약간 더 작은 EFc-함유 폴리펩티드에 상응함) 두 개의 우세한 밴드 및 덜 중요한 대략 49kD의 밴드 (E-코일/K-코일 DART에 상응함)로서 이동하였다. 크기 축출 크로마토그래피로부터의 E-코일/K-코일 Fc-함유 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc)의 단량체 분획은 대략 28kD의 더 크거나 더 작은 분자량 밴드 중 하나만을 나타냈다 (DART가 KFc-함유 DART (더 큰 분자량 밴드) 또는 EFc-함유 DART (더 작은 분자량 밴드)인가에 따라 상응함). 재료는 대략 49kD에서 우세하게 이동하였다 (E-코일/K-코일 DART에 상응함). 상당히 더 큰 분자량 밴드도 관찰되었다.

생성된 분자의 특성을 확인하기 위하여 이중특이성 결합 ELISA를 수행하였다. CD79를 ELISA 플레이트 위에 놓았다. 그런 다음 DART를 플레이트에 결합시켰다. DART 결합을 sCD32B-비오틴을 사용하여 검출하고, 이어서 스트렙트아비딘-HRP와 함께 인큐베이션하였다. 도 43에 도시된 것과 같이, E-코일/K-코일 Fc-함유 h2B6YAhCB3 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc)는 h2B6YAhCB3 DART, 또는 EFc/KFc h2B6YAhCB3 DART 유도체에 비교하여 상당한 결합 증강을 나타냈다.

CD79b에 결합된 항체의 교차결합은 B 세포 활성화를 유도한다 (Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells", Clin. Exp. Immunol. 110:509-515). h2B6YAhCB3 DART 분자가 CD79b 또는 CD32B 억제 수용체 둘 다에 결합할 수 있기 때문에, 그것들은 CD32B를 CD79b 결합 부위에 "충원"할 수 있고, 그로써 B 세포 증식을 차단할 수 있다. 이런 능력을 증명하기 위하여, DART를 결합된 항-CD79b 항체와 교차결합할 수 있는 항체에 노출된 B 세포와 인큐베이션하였다. 이 실험의 결과는 도 44에 도시한다. 그 결과는 단독으로 CD79b 또는 CD32B에 대해 지시된 항체 (각각 Ch2B6N297Q 및 ChCB3.1N297Q)가 B 세포 증식을 억제하지 못하였음을 보여준다. EFc/KFc h2B6YA x hCB3 DART 유도체는 B 세포 증식을 억제하는 데 있어서 h2B6YA x hCB3 DART 자체 및 h2B6YA x hCB3 VF 대조표준보다 실질적으로 더 효과적이었다. 단일 연결된 Fc 영역만을 가지고 있는 E-코일/K-코일 DART (E/KFc h2B6YA x hCB3 DART 유도체 및 EFc/K h2B6YA x hCB3 DART 유도체)가 B 세포 증식에 대해 가장 큰 억제력을 발휘하는 것으로 나타났다.

실시예 18. 생체 내 혈청 반감기를 변경시키기 위한 DART 변형

상기에서 논의된 것과 같이, 이중특이성 단일 사슬 분자와 같은 작은 재조합 항체 분자 (예컨대 대략 55kDa의 분자량을 가지는 것들)는 순환계로부터 빠르게 제거된다. 마우스에서 DART 분자에 대한 생체 내 약물동역학적 연구 결과 예상되는 짧은 말단 반감기는 대략 2시간인 것으로 나타났다.

어떤 구체예에서, 예컨대 급성 염증성 질환의 치료에서는 그런 짧은 반감기가 바람직하지만, 다른 구체예, 예컨대 암 및 만성 질병 및 질환의 치료에서는 본 발명의 DART 분자는 더 긴 반감기를 나타내는 것이 바람직하다.

그런 용도를 위해 DART 분자의 생체 내 약물동역학적 특성을 개선하기 위하여, DART 분자는 DART 분자의 하나 또는 그 이상의 말단에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게는, 혈청-결합 단백질의 그런 폴리펩티드 부분은 DART 분자의 C-말단에 위치하는 것일 것이다. 이 목적에 특히 바람직한 그런 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD)이다. 스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)이 특히 바람직하다.

스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 46개의 아미노산 잔기로 구성되고, 안정한 3-나선 뭉치를 형성하고, 광범위한 알부민 결합 특이성을 가진다 (Johansson, M.U. et al. (2002) " Structure , Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin - Binding Modules", J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 알부민은 혈장의 가장 풍부한 단백질이고, 사람에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 여러 개의 작은 분자 결합 부위를 가지고 있어서, 다른 단백질에 비-공유적으로 결합할 수 있고, 그로써 그것들의 혈청 반감기를 연장시킨다.

혈청 단백질의 폴리펩티드 부분이 DART의 반감기를 연장시키는 능력을 증명하기 위하여, 스트렙토코쿠스 단백질 G의 ABD3 도메인을 재조합 이중특이성 DART (hCD16과 hCD32B 항원과 면역학적으로 반응한다)에 융합시켜서 재조합 항체 분자, hCD16-hCD32B ABD-DART를 생성하였다 (도 45). 이 ABD-DART는 두 항원 모두에 대해 특이한 결합을 나타냈을 뿐 아니라 사람 혈청 알부민 (HSA)과도 특이하게 결합하였고, 시험관 내에서 이펙터 세포를 재표적화할 수 있었다. 대조 DART와 비교해볼 때, 이 ABD-DART는 마우스에서 혈청 반감기를 강력하게 증가시키는 것으로 나타났다. 이 접근법은 DART와 같은 잠재적으로 중요한 제약의 반감기를 90분 이상, 2시간 이상, 5시간 이상, 10시간 이상, 20시간 이상, 및 가장 바람직하게는 30시간 이상 증가시키기 위한 실행 경로로서 사용될 수 있다.

재료 및 방법:

ABD DART의 디자인 및 구성: hCD16-hCD32B ABD DART를 사슬 1로서 다음: hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-K 코일 [(KVAALKE)₄]를 사용하고 (이때 CD16VL은 3G8 CD16VL을 나타내고, G3SG4는 SEQ ID NO:10을 나타내며, hCD32BVH는 2B6 CD32BVH를 나타내고, (KVAALKE)₄는 SEQ ID NO:300을 나타낸다), 사슬 2로서 다음: hCD32BVL-G3SG4-hCD16VH-GGCGGG-E 코일 [(EVAALEK)₄]-GGGNS-ABD를 사용하여 (이때 CD32BVL은 CD32BVL을 나타내고, G3SG4는 SEQ ID NO:10을 나타내며, hCD16VH는 CD16VH를 나타내고, GGCGGG는 SEQ ID NO:267의 잔기 2-7을 나타내며, E 코일 [(EVAALEK)₄]는 SEQ ID NO:299를 나타내고, GGGNS는 SEQ ID NO:301을 나타내며, ABD는 LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:304)를 나타낸다) 만들었다.

따라서, 사슬 1 (h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K코일-GGGNS)의 서열은 다음과 같다:

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL

LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY

TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN

YWIHWVRQAP GQGLEWIGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM

ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA

LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS (SEQ ID NO:305)

사슬 1 (h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K코일-GGGNS)을 코드화하는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 다음과 같다 (SEQ ID NO:306):

gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc

atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct

ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc

agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac

acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag

gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc

tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct

ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat

aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg

gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat

tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc

ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag

aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct

따라서, 사슬 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E코일-GGGNS-ABD)의 서열은 다음과 같다:

EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE

VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTWPFTFGG

GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG

VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT

NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA

KTVEGVKALI DEILAALP (SEQ ID NO:307)

사슬 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E코일-GGGNS-ABD)를 코드화하는 바람직한 뉴클레오티드는 다음과 같다 (SEQ ID NO:308):

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc

ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca

gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct

gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga

gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga

gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct

gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag

gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg

aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc

aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt

gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa

gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag

gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc

aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca

aagaccgtgg aaggcgtgaa agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct

각각의 VL 및 VH 절편을 주형으로서 hCD16-hCD32B DART를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 사슬 2에 대해서 E 코일과 ABD를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 이량체에 의해 형성하였고, 그런 다음 hCD16의 VH 영역의 C-말단 단부에 제한 소화 및 결찰을 사용하여 하위클론하였다. 그런 다음 NgoMIV-NheI에서 소화된 사슬1과 BstBI-PmeI에서 소화된 사슬2 발현 카세트를 각각 은닉하고 있는 개별적인 플라스미드를 CHO 안으로의 형질전환을 위한 단일 플라스미드 안에 클론하여 안정한 셀라인을 생성하였다.

단백질의 발현 및 정제: 안정한 형질전환을 위해, CHO-S 세포를 hCD16-hCD32B EK ABD-DART 플라스미드 DNA로 형질전환하였다. ABD-DART 단백질을 CNBr 활성화된 세파로오스 4B에 결합된 FcRIIB 항원의 가용성 버전을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 농축된 단백질을 추가로 슈퍼덱스 200HR 10/30을 사용하여 크기 축출 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

ELISA 에 의한 결합 분석: CD-16 기초 포획을 위해, 플레이트를 2㎍/mL의 농도의 FcRIIB 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T 중의 0.5% 펩톤으로 차단하였다. 연속적으로 2배 희석된 정제 단백질을 1시간 동안 실온에서 플레이트 상에 결합시켰다. 마지막으로 검출은 비오티닐화된 CD32B (50ng/mL)와 이어서 HRP 포합된 스트렙트아비딘 (1/1000, BD-Pharm)을 사용하여 수행하였다. HRP 활성을 TMB를 첨가하여 측정하였고, 플레이트를 플레이트 판독기에서 OD450nm에서 판독하였다.

사람 혈청 알부민 (HSA) 포획을 위해, 플레이트를 2㎍/mL의 농도의 HSA로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음 이중 친화성 ELISA를 수행하기 위하여 동일한 과정을 따랐다.

말초혈 단핵세포 - 중재된 ADCC 분석: 세포독성을 LDH 방출 분석에 의해 측정하였다. 말초혈 단핵세포 (PBMC)를 전체 사람 혈액 (Lonza Walkersville, Inc, Gaitherburg, MD)으로부터, 피콜-하이파크 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 밀도 구배 원심분리에 의해 제조업체의 지시를 따라 정제하였다. 둥근 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 2x10⁴ 표적 세포를 플레이팅하였다. 상이한 DART 또는 항체 분자의 1에서 4배의 연속 희설액을 플레이트의 세포에 첨가한다. 그런 다음, 6x10⁵의 PBMC를 동일한 웰에 첨가한다. 그런 다음 플레이트를 밤새 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 플레이트를 1200rpm에서 5분 동안 회전시킨 후, 50㎕의 상층액을 평평한 바닥의 ELISA 플레이트에 옮긴다. 50㎕의 LDH 기질 용액 (Promega)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션한다. 그런 다음 50㎕의 중지 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 490nm에서 한 시간 이내에 판독한다. 각 웰의 % 세포독성을 원O.D. 판독값으로 다음과 같이 계산한다: (샘플-AICC)/(표적 최대-표적 자발)x100 (식에서 AICC는 항체-무관 세포의 세포독성이다). 용량 반응 곡선을 Prism 소프트웨어를 사용하여 작성한다.

약물동역학적 연구: C57Bl/6 마우스에 hCD16-hCD32B DART를 5mg/kg으로 1회 정맥 내 주사를 주입하였다. 투약 전, 투약 후 2분, 30분; 1, 3, 6, 24 및 72시간 후에 마우스 혈청을 수집하였다. 혈청 중의 hCD16-hCD32B DART 농도를 정량하였다. hCD16-hCD32B DART의 약물동역학적 계산을 약물동역학적 소프트웨어 패키지 WinNonlin Professional 5.1 (Pharsight Corporation, USA)에 의해 수행하였다. 변수들을 비-구획 분석 (NCA)에 의해 측정하였다. 비-구획 분석은 약물의 정맥 내 주사를 필요로 하는 모델 (모델 201)을 토대로 하였다. 선형 사다리꼴 방법을 변수 계산을 위해 사용하였다.

결과

발현 및 ELISA 에 의한 결합 연구: hCD16-hCD32B ABD DART는 포유류 CHO-S 세포에서 0.5mg/l의 농도로 효과적으로 발현되었다. 정제된 ABD-DART 단백질의 각각의 항원에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 그 결과는 hCD16-hCD32B ABD DART가 동시에 두 가지 항원, CD16뿐 아니라 CD32B에도 결합하는 것을 나타냈다 (도 46A). 결합 프로필은 대조 hCD16-hCD32B DART 단백질 결합과 일치한다. 정제된 hCD16-hCD32B ABD-DART의 사람 혈청 알부민 (HSA)에 대한 친화성을 또한 ELISA에 의해 증명하였다 (도 46B). 그 결과는 ABD 융합 DART가 HSA에 대해 강력하게 결합하는 한편, 대조 hCD16-hCD32B DART와는 결합이 관찰되지 않은 것으로 나타났다. ABD-DART 분자가 CD32B, CD16A 및 HSA에 동시에 결합할 수 있음을 증명하기 위하여, HSA가 고정되어 있는 표면에 ABD-DART를 주입한 후, 계속해서 200nM의 CD32B 및 200nM의 CD16A(F158)을 주입하였다 (도 46C, 실선). 대조 실험에서는 (도 46C, 파선) 항원을 완충액으로 대체하였다. 그 결과는 ABD-DART 분자가 CD32B, CD16A 및 HSA에 동시에 결합할 수 있음을 보여주었다.

hCD16-hCD32B ABD-DART와 그것의 ABD 융합 유도체는 동등한 결합 가용성 CD32B (sCD32B) 및 가용성 CD16A(F158)(sCD16A)을 나타내는 것으로 밝혀졌고, DART는 사람 혈청 알부민 (HSA)에 결합하는 DART ABD 융합의 능력에 의해 쉽게 구별될 수 있었다 (도 46D-46I). DART를 CD16A-코팅된 플레이트 위에서 인큐베이션하였고, 비오티닐화된 sCD32B를 사용하여 3mg/ml의 HSA의 존재 또는 부재하에 검출하였다 (차단은 PBS-T 중의 0.5% 펩톤을 사용하여 수행하였다). DART ABD 융합은 원래의 DART의 이중특이성 결합력을 보유하고, 사람 혈청 알부민의 존재에 의해 영향을 받지 않는 sCD16A 및 CD32B에 대한 결합을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 46J).

ABD - DART 의 시험관 내 세포독성: 이런 이중특이성 ABD-DART의, 하나는 이펙터 세포 상에, 다른 하나는 표적 세포 상에 있는 두 개의 항원에 대한 동시 결합을 증명하기 위하여, 재지시된 세포 사멸 분석을 수행하였다. 이펙터 세포로서 사람 PBMC를 사용하여 hCD16-hCD32B ABD-DART는 CD32B 포지티브 B 셀라인, 다우디에 대해 강력하고 용량-의존적인 세포독성을 유도하였다 (도 47A). 그 결과는 ABD-DART의 잠재력이 원래의 DART의 그것과 동등하였음을 나타냈다. CD16xCD32B DART는 CD16B-발현 이펙터 세포에 결합할 수 있고, 그로써 그런 세포를 CD32B를 발현하는 세포를 (재지시된 사멸을 통해) 사멸하기 위해 충원할 수 있다. CD16xCD32B DART는 그러므로 Raji 세포에 대해 강력한 사멸을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 47B).

ABD - DART 의 약물동역학적 특성: hCD16-hCD32B ABD-DART의 약물동역학적 특성은 C57Bl/6 마우스에 i.v. 주사로 1회 투약한 후 혈청 샘플의 ELISA에 의해 분석하였다 (도 48). 단백질, DART 및 ABD-DART는 둘 다 순환계로부터 2단계로 제거되는 것으로 나타났다. ABD-DART의 PK 연구는 연장된 순환 시간을 나타냈는데, 규칙적인 DART의 경우 1.2시간인 것에 비하여 35.1의 증가된 말단 반감기를 보였다 (도 48, 표 17). 약물동역학적 특성의 개선을 또한 곡선 아래의 면적 (AUC)을 비교함으로써 증명하였다. 구성물 ABD-DART에 대해 AUC는 ABD에 융합된 후에 거의 30배 증가하였다 (표 17).

표 17.

ABD - DART 의 생체 내 생물학적 활성: hCD16-hCD32B ABD-DART가 생체 내에서 생물학적 활성을 보유했는지를 증명하기 위하여, 단일 용량의 ABD-DART 또는 그것의 원래 DART를 Tg (mCD16-/-hCD16A+32B+) 마우스에 투여하고, B 세포, T 세포 및 PM 세포의 농도를 모니터하였다. 그 결과는 DART가 B 세포의 농도를 억제할 수 있음을 가리키고 (도 49A), 그것은 표적화된 재지시된 B 세포 사멸이 DART가 마우스 순환계로부터 제거될 때까지 생체 내에서 이루어졌다는 것으로 해석된다. T 세포 (도 49B) 및 PM 세포 (도 49C)의 농도는 DART에 의해 감소되지 않았고, 그것은 그것들의 특이성을 확증해주었다.

종합하여 말하면, 알부민 결합 도메인에 융합된 DART 단백질 (ABD-DART로 명명함)은 성공적으로 디자인되었고 제조되었다. hCD16-hCD32B ABD-DART는 그것의 두 개의 인식된 항원성 결정기: CD16 및 CD32B에 대한 특이성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. ABD-DART는 사람 혈청 알부민과 높은 친화성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. ABD의 융합은 생물학적 활성을 감소시키지 못하였다 (즉 재지시된 종양 세포 사멸에 대한 DART의 잠재력). ABD에 대한 DART 분자의 융합은 그것의 생체 내 반감기의 실질적인 개선 (증가)를 유도하였고, 이 목표를 크기의 극적인 증가 없이 이루었다. 작은 크기를 보유할 수 있는 능력은 중요하며 유익한데, 그것이 DART의 종양 조직으로의 확산 능력을 촉진하기 때문이다.

실시예 19. Her2 /B 세포 수용체 DART

Her2/neu 및 T-세포 수용체 ("TCR")에 결합할 수 있는 가변 영역을 함유한 IgDART 이중체를 구성하였다.

상기에서 논의된 것과 같이, TCR은 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에 의해 천연적으로 발현되고, 그러한 세포가 항원-제공 세포의 부류 I 또는 부류 II MHC 단백질에 의해 결합되고 제공되는 항원성 펩티드를 인식할 수 있도록 한다. pMHC (펩티드-MHC) 복합체의 TCR에 의한 인식은 사이토카인의 생성과 항원-제공 세포의 용해를 유도하는 세포 면역 반응의 전파를 개시한다. ErbB 패밀리의 중요한 구성원인 HER2/neu는 여러 사람 암종 및 포유류 발달에서 차지하는 그것의 역할 때문에 광범위하게 규명되어 왔다 (Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184; and Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). 사람 HER2/neu 유전자 및 HER2/neu 단백질은 Semba 등의 논문에서 설명되었고 (Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501 and Yamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234), 그 서열은 GenBank에서 승인 번호 X03363으로 활용할 수 있다. HER2/neu는 4개의 도메인: 리간드가 결합하는 세포 외 도메인; 친유성 경막 도메인; 보존된 세포 내 티로신 키나아제 도메인; 및 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 은닉하고 있는 카르복실-말단 신호화 도메인을 포함한다 (Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). HER2/neu 세포외재성 (ECD) 도메인은 문헌에서 설명되었고, Protein DataBank Record 1S78 (2004)에서 활용할 수 있다.

HER2/neu는 성장인자 수용체로서 기능하고 자주 유방암, 결장암, 방광 세포암, 난소암 및 폐암과 같은 종양에 의해 발현된다. HER2/neu는 사람 유방암 및 난소암의 25 내지 30%에서 과잉발현되고, 이들 환자에서 공격적인 임상적 진전 및 불량한 예후와 관련된다 (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). HER2/neu의 과잉발현은 또한 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 암종을 포함한 다른 암종에서도 관찰되었다 (King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cancer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cancer Research 51:1034).

HER-1 또는 HER2/neu를 표적으로 하는 많은 단클론성 항체와 작은 분자 티로신 키나아제 억제제들이 개발되었는데, 이를테면, 특히 단백질의 경막 영역에 매우 가까이 자리하고 있는 HER2/neu의 시스테인-풍부 II 도메인의 세포외재성 에피토프 (아미노산 529에서 627)를 인식하는, 4D5로 알려져 있는 쥐과 단클론성 항체의 인간화된 변이체 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.)가 있다. 연구 결과 HER2/neu 과잉발현 유방암 세포에서, 화학요법제 (예컨대 시스플라틴, 독소루비신, 탁솔)와 함께 HER2/neu에 특이한 항체로 치료하면, 화학요법제만으로 치료할 때보다 높은 세포독성 반응을 유도한다 (Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cancer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). HER2/neu 항체가 화학요법제에 대한 반응을 증강시킬 것으로 보이는 한 가지 가능한 메커니즘은 HER2/neu 단백질 발현의 조절을 통해서거나 DNA 수복을 간섭함에 의한 것이다 (Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cancer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cancer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s). 어떤 경우에서든지 항-HER2/neu 항체, 예컨대 HERCEPTIN®은 환자에게 치료적 유익을 제공하지만, 대부분의 유방암 및 다른 환자들은 그런 항체에 대해 내성 반응을 나타낸다. 이들 반응은 부분적으로는 환자의 암세포에 의한 HER2/neu의 과잉발현의 정도의 차이를 반영한다.

HER2/neu 및 T-세포 수용체 ("TCR")에 결합할 수 있는 가변 영역을 함유하는 결과로서 DART는 HER2-발현 세포에 결합하는 능력을 가지게 되고, 그로써 그런 세포에 T-세포 수용체에 결합할 수 있는 도메인을 부착할 수 있게 된다. 그런 T 세포가 이 도메인에 결합할 때, T 세포는 활성화하여 면역 반응을 개시하게 되고, 그것은 HER2-발현 세포의 사멸을 유도한다.

그런 DART에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 아래에 제공하는데, VL과 VH 서열은 평문으로 제시되고, VL-VH 링커는 밑줄로 표시되며, C-말단 이종이량체화 모티프를 코드화하는 서열 (SEQ ID NO:313: GFNRGEC 또는 SEQ ID NO:314: GVEPKSC)은 이탤릭체로 굵게 나타낸다.

TCRVL - HER2VH 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :315)

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR

FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ

SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD

KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS GFNRGE

C

TCRVL - HER2VH -코드화 핵산 서열 ( SEQ ID NO :316)

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc

ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg

aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg

ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa

gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg

accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag

tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc

ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa

tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac

aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg

acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct

atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct cc ggattcaa caggggagag

tgt

HER2VL - TCRVH 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :317)

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD

RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV

QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK

GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSS GVEPK

SC

HER2VL - TCRVH -코드화 핵산 서열 ( SEQ ID NO :318)

gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc

atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca

ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat

cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg

ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg

cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc

ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt

gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa

ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc

ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac

gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctcc ggagt tgagcccaaa

tcttgt

바람직한 구체예에서, 그런 구성물은 이종이량체 (즉 TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH 이량체)의 형성을 용이하게 하는 E 코일 또는 K코일 도메인을 함유하도록 변형된다. 그런 DART의 아미노산 및 핵산 서열은 아래에 제시되는데, 이때 VL 및 VH 서열은 평문으로 제시되고, VL-VH 링커는 밑줄로 표시되며, 이량체화에 대한 Cys-함유 링커 (GGCGGG; SEQ ID NO:267의 잔기 2 내지 7)를 코드화하는 서열은 이탤릭체로 표시된다. E 코일 또는 K 코일 이종이량체화 도메인은 이중-밑줄로 표시된다 (바람직한 "E-코일" 서열은 EVAALEK의 4 헵타머 반복부: SEQ ID NO:299이고; 바람직한 "K-코일" 서열은 KVAALKE의 4헵타머 반복부: SEQ ID NO:300이다). E 코일 또는 K 코일을 따르는 서열에게 할당된 기능은 없다.

TCRVL - HER2VH -E 코일 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :319)

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR

FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ

SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD

KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS GGCGGG

EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS

TCRVL - HER2VH -E 코일-코드화 핵산 서열 ( SEQ ID NO :320)

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc

ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg

aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg

ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa

gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg

accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag

tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc

ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa

tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac

aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg

acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct

atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga

gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa

aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc gggaattct

HER2VL - TCRVH -K 코일 아미노산 서열 ( SEQ ID NO :321)

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD

RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV

QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK

GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG

GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS

HER2VL - TCRVH -K 코일-코드화 핵산 서열 ( SEQ ID NO :322)

gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc

atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca

ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat

cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg

ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg

cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc

ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt

gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa

ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc

ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac

gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt

ggaaaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt

aaggaaaagg tcgcagccct gaaagagggc ggcgggaatt ct

Her2 및 T-세포 수용체 (TCR) 결합 도메인을 가지는 DART 분자를 저수준의 HER2 발현을 나타내는 것으로 기존에 확인되어 있는 (그리고 그로써 항-Her2/neu 항체, Herceptin®로의 치료에 내성을 보이는) 다발성 유방암, 결장암 및 방광암 셀라인에서 세포독성을 중재하는 능력에 대해 시험하였다. 시험된 유방암 셀라인은 ZR75-1 (HER2 2+)(도 50A), MCF-7 (HER2 1+)(도 50B) 및 MDA-MB468 (HER2-ve)(도 50C)이다. 시험된 비-유방암 셀라인은 HT-29 (결장암 셀라인)(도 50D) 및 SW780 (방광암 셀라인)(도 50E)이다. 도 49A-E에서 알 수 있는 것과 같이, 그런 DART 분자는 종양-유도된 셀라인의 세포독성을 중재하는 데 있어서, 동등한 세포독성을 이루기 위해 필요한 농도의 관점에서나 관찰된 세포독성의 최대 수준의 관점에서 모두 HERCEPTIN®보다 실질적으로 더 효과적이었다.

실시예 20. E 및 K 코일을 통한 DART 와 ABD 의 시험관 내 융합

상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 DART 분자는 합텐, 플루오레세인에 대한 친화성으로서 NKG2D 수용체에 대한 이중특이성 결합을 나타내도록 디자인될 수 있어서, 그것들은 NKG2D 수용체를 플루오레세인-포합된 결합 파트너와 상호작용하는 분자와 공동-결찰할 수 있는 보편적 어댑터로서 작용할 수 있다. 추가로 ABD의 용도를 증명하기 위하여, DART를 다음 폴리펩티드 사슬을 사용하여 구성하였다:

(1) KYK2VL -4420 VH - GFNRGEC ( SEQ ID NO :313) - E 코일: 이 폴리펩티드를 상기 설명된 KYK 2.0 항체 (Kwong, KY et al. (2008) " Generation , Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti - Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ", J. Mol. Biol. 384:1143-1156; 및 PCT/US09/54911)의 VL 도메인과 상기에서 설명된 항-플루오레세인 MAb, 4420의 VH 도메인을 사용하여 구성하였다.

(2) 4420 VL - KYK2VH - GVEPKSC ( SEQ ID NO :314): 이 폴리펩티드를 상기 설명된 항-플루오레세인 MAb, 4420의 VL 도메인과 KYK2.0 항체의 VH 도메인을 사용하여 구성하였다. "E코일"은 EVAALEK: SEQ ID NO:299의 4 헵타머 반복부의 E 코일 아미노산 서열을 표시한다.

KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEQ ID NO:313) - E 코일과 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEQ ID NO:314) 폴리펩티드를 CHO 세포에 형질전환하여 "KYK2 4420 VF E코일"로 표시된 DART를 발현하였다. 이들 분자의 정제는 도 51A와 51B에 나타낸다. KYK2 4420 VF E코일 DART의 친화성을 NKG2D Fc 012210을 사용하여 포획된 FITC 항원에 대한 DART의 결합을 검출함으로써 측정하였다. 이 실험의 결과는 DART가 두 분자에 모두 결합할 수 있었음을 증명한다 (도 52).

추가로, K코일-GGGNS (SEQ ID NO:301)-ABD 융합을 만들었는데, 이때 "K코일"은 KVAALKE (SEQ ID NO:300)의 4 헵타머 반복부의 K 코일 아미노산 서열을 표시한다. 도 53은 플라스미드 pPAL7의 제한 지도를 제공하고, PROTEINITY EXACT^TM (Bio-Rad, Hercules, CA) 태그를 사용하여 정제를 촉진하는 K코일-ABD 융합을 발현하는 플라스미드 pPAL7 K코일 ABD의 구성을 도시한다. pPAL7 K코일 ABD 벡터를 대장균 BL21DE3 세포에 형질전환하였다. 태그된 K코일 ABD의 발현을 2mM의 IPTG를 4시간 동안 첨가함으로써 유도하였다. 단백질 발현을 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯에 의해 증명하였다. 간단히 설명하면, PROTEINITY EXACT^TM 융합 태그 시스템은 세포의 용해를 중재하는 단계, 방출된 단백질을 고정된 서브틸리신 프로테아제 친화성 칼럼에 결합시키는 단계, 칼럼을 세척하여 미결합 단백질을 용출하는 단계, 플루오라이드-함유 용출 완충액을 적용하여 서브틸리신이 인식 서열의 절단 후에 빠르고 정확하게 융합 단백질로부터 태그를 절단하는 것을 야기하는 단계, 그런 절단 후에 태그-유리 단백질을 칼럼으로부터 세척하는 단계, 그리고 용출된 단백질을 PBS로 투석하는 단계를 포함한다. 도 54는 PROTEINITY EXACT^TM 정제 수지 (10ml 배야으로부터 소규모)에 의해 정제된 K코일 ABD 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.

PROTEINITY EXACT^TM 정제 수지로부터 얻어진 K코일-ABD 단백질을 추가로 SDS-PAGE를 사용하여 정제하였다 (도 55). 250ml의 대장균 배양은 6.523mg의 정제된 단백질을 생산하였다 ( 표 18).

표 18.

KYK 4420 VF E 코일 DART와 K코일 ABD 단백질을 PBS에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여 개선된 특성을 가지는 E 코일-K 코일 ABD DART를 형성하였다. ELISA 결과는 복합체의 모든 도메인이 각각의 리간드에 결합할 수 있음을 나타낸다 (도 56A-56C). 필요하다면, KYK2 4420 VF E 코일 및 K-ABD 복합체의 추가의 정제를 항-EK 칼럼을 사용하여 이룰 수 있었다.

복합체의 형성이 DART의 특별한 결합 도메인과 무관하기 때문에, 상기 방법을 다른 결합 특성을 가지는 E 코일-K 코일 ABD DART를 생성하기 위해 사용할 수 있다 (예를 들어 CD32B (예컨대 항체 2B6)/CD16A (예컨대 항체 3G8) VF E DART를 K 코일 ABD와 복합체화함으로써).

그러므로 상기에서 나타낸 바와 같이, 발명의 한 구체예에서, DART의 항원 결합 도메인-함유 폴리펩티드는 둘 다 이종이량체 형성 (예컨대 K 코일 또는 E 코일)을 유도하는 작용을 하는 추가의 서열을 포함할 수 있고, 임의로 그런 폴리펩티드중 하나는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유할 수 있다 (예컨대 도 45). 대체 구체예에서, DART의 하나, 및 바람직하게는 오직 하나의 항원 결합 도메인-함유 폴리펩티드는 이종이량체 형성 (예컨대 K 코일 또는 E 코일)을 유도하기 위한 추가의 그런 서열을 포함할 수 있고, DART는 항원 결합 부위를 함유하지 않지만, 이종이량체 형성 (예컨대 DART의 항원 결합 도메인-함유 폴리펩티드가 E 코일을 포함하는 K 코일; 또는 DART의 항원 결합 도메인-함유 폴리펩티드가 K 코일을 포함하는 E 코일)을 유도하기 위한 보완 서열을 가지는 폴리펩티드와 임의로 혈청 단백질에 결합할 수 있는 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 포함하는 추가의 (예컨대 세 번째) 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있다. 그런 추가의 (예컨대 세 번째) 폴리펩티드의 그런 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분은 그런 보완 서열을 가지는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 중 하나에 위치할 수 있다.

실시예 21. 알부민 결합 도메인의 탈면역화

상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 DART 분자는 알부민 결합 도메인 (ABD), 예컨대 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 ABD, 및 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)을 포함하도록 디자인 될 수 있다.

ABD의 면역원성을 감소시키기 위하여, 아미노산 변형을 ABD3의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:304)의 아래의 잔기 60-79에 도입하고, HSA 결합에 미치는 그런 변이의 효과를 측정하였다 (표 19):

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP

41 50 60 70 80 86

표 19.

ABD를 추가로 개선하기 위하여, MHC 부류 II 결합을 감쇠 또는 제거하는 것이 바람직하였다. Y60 및 Y61로부터의 펩티드는 N66에서 공통의 포켓 잔기 (P6/P7)을 공유하고 또한 L64와 I65는 T70에서 P6/P7 포켓 잔기를 공유한다. 그러므로 N66의 D 또는 E로의 돌연변이는 T70D와 함께 MHC 부류 II 결합력을 효과적으로 제거하는 능력을 가지는 것으로 상정되었다. 또는 달리, MHC 부류 II 결합은 4개의 p1 앵커 Y60, Y61, L64 및 I65를 표적화함으로써 제거될 수 있었던 것으로 상정되었다. 따라서 2라운드 과정의 돌연변이 분석을 수행하였다. 아래의 표 20은 돌연변이 분석의 첫 번째 라운드 결과를 나타낸다.

표 20.

결과는 p1 앵커 V71의 A로의 돌연변이는 가장 효과적인 선택이었던 것으로 나타났고, (1+3) 조합 또는 (2+3) 조합을 제시한다. 시험된 모든 조합을 T70D와 Y60G를 제외하고 진행하였다.

돌연변이 분석의 두 번째 라운드의 결과를 아래의 표 21과 22에 나타낸다.

표 21.

표 22. 결과

아래의 표 23은 두 번째 라운드의 돌연변이 분석으로부터 얻어진 결과를 요약한 것이다.

표 23.

조합 돌연변이 결과를 토대로, 탈면역화된 알부민 결합 도메인을 형성하기 위해서 다음의 치환 조합이 바람직한 치환인 것으로 간주된다: 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 별표 ("*")는 위치 71이 P1으로, 위치 79가 P9로 바뀐 것을 나타낸다.

도 57에 도시된 것과 같이, 다음의 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가지는 변이 ABD는 실질적으로 야생형 결합을 나타냈다:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A ₆₄ A ₆₅NNAKT VEGVKALI A ₇₉E ILAALP (SEQ ID NO:323),

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S ₆₆NAK S ₇₀ VEGVKALI A ₇₉E ILAALP (SEQ ID NO:324).

ABD 변이체 61A/65A, 61A/66D, 64A/66D, 64A/65A* 및 64A/66D를 야생형과 함께 알부민에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 그런 분석의 결과는 도 58에 도시된다. ABD 변이체 64G/66D, 65A/66D, 66S/70* 및 61A/66S/70S를 야생형과 함께 알부민에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 그런 분석의 결과는 도 59에 도시된다. 도 60은 ABD 변이체 Y60A/Y61A, Y60T/Y61A, I65A/N66D/V71A, Y61A/I65A/V71A, L64A/N66D/V71A 및 야생형 (SEQ ID NO:304)에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 나타낸다. 도 61은 ABD 변이체 Y60A/Y61A/V71A, Y60T/Y61A/V71A, L64A/I65A/V71A 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다. 도 62는 ABD 변이체 L64G/I65A/V71A, L64G/N66D/V71A, Y61A/T70S, N66S, T70S, Y61A/N66S, L64A/I65A 및 야생형에 대한 알부민 결합 분석의 결과를 도시한다.

실시예 22. 알부민 결합 도메인의 탈면역화의 증거

특히 위치 V71의 변이체 (예컨대 V71A)를 포함하여 ABD 변이체는 감소된 면역원성을 나타낸다. 그런 탈면역화를 증명하기 위하여, 세 개의 펩티드 샘플을 EpiScreenTM 시간 경과 T 세포 분석을 사용하여 면역원성 잠재력에 대해 평가하였다. 평가된 샘플은 야생형 ABD 펩티드의 21-량체 단편 (Y60-E80)였다 (SEQ ID NO:304):

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE

41 50 60 70 80

ABD Y60-E80 야생형 ("샘플 1")(SEQ ID NO:325):

Y YKNLINNAKT VEGVKALIDE

ABD Y60-E80 변이체 N66D/T70S/V71A ("샘플 2") (SEQ ID NO:326):

Y YKNLI D ₆₆NAK S ₇₀ A ₇₁EGVKALIDE 및

ABD Y60-E80 변이체 L64A/I65A/V71A ("샘플 3") (SEQ ID NO:327)

Y YKN A ₆₄ A ₆₅NNAKT A ₇₁EGVKALIDE

말초혈 단핵세포 (PBMC)를 건강한 지역의 공여체 연막 (24시간 이내에 채취한 혈액으로부터)으로부터 분리하였다. PBMC를 Lymphoprep^TM (Axis-shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리에 의해 연막으로부터 분리하였고, CD8⁺ T 세포를 CD8⁺ RosetteSep^TM (StemCell Technologies Inc, London, UK)을 사용하여 소모시켰다. 공여체를 HLA SSP-PCR 기저 조직-유형분류 키트 (Biotest, Solihull, UK)를 사용하여 HLA-DR 일배체형을 확인함으로써 특성확인하였다. 대조 항원 (키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH), [Pierce (Perbio)< Cramlington, UK)]뿐 아니라 인플루엔자 A 및 엡스타인 바르 바이러스로부터 유도된 펩티드에 대한 T 세포 반응을 또한 측정하였다. 그런 다음 PBMC를 냉동하고 액체 질소에 필요할 때까지 보관하였다. 50명의 공여체 집단을 사용하였고, 그들의 알로타입은, 세계의 알로타입의 80% 이상의 차폐가 이루어졌고, 모든 주요 HLA-DR 알로타입 (전 세계 집단에서 5% 이상으로 발현된 빈도를 가지는 개별적인 알로타입)이 제대로 대표되고 있음을 가리켰다.

각 공여체로부터의 PBMC를 해동하고, 계수한 후 생존력을 평가하였다. 세포를 실온의 AIM-V® 배양 배지에서 소생시키고, 세척한 후 AIM-V®에 4 내지 6×10⁶ PBMC/ml로 재현탁하였다. 각 공여자에 대해, 벌크 배양을 1ml의 증식 세포 스톡을 24웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가함으로써 수립하였다. 배양 배지 (0.5ml)와 시험 펩티드 (0.5ml)를 PBMC에 첨가하여 최종 농도를 5μM로 만들었다. 각 공여체에 대해 재생성 대조표준 (100㎍/ml의 KLH와 함께 인큐베이션된 세포)와 "배양 배지 단독" 웰도 또한 포함시켰다. 배양액을 총 8일 동안 37℃에서 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 5, 6, 7 및 8일에 각 웰의 세포를 부드럽게 재현탁하고 3×100㎕의 분배액을 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 배양액을 100㎕의 AIM-V® 배양 배지에서 0.75μCi [³H]-티미딘 (Perkin Elmer®, Beaconsfiels, UK)으로 진동시키고, 추가로 18시간 동안 인큐베이션한 후 TomTec Mach III^TM 세포 수득기를 사용하여 필터 매트 (Perkin Elmer)위에 수득하였다. 각 웰에 대한 분당 카운트 (cpm)를 Meltilex^TM (Perkin Elmer®) 신틸레이션 카운팅에 의해 1450 Microbeta Wallac Trilux 액체 신틸레이션 카운터 (Perkin Elmer®) 상에서 파라룩스, 저바탕값 카운팅으로 측정하였다.

세포 생존력에 미치는 그런 치료의 효과를 평가하기 위하여, 7일에 벌크 배양물을 부드럽게 재현탁하고, 20㎕의 각 샘플을 모든 공여체로부터 제거하고 20㎕의 트립판 블루와 혼합하였다. 그런 다음 이들 샘플을 Countess® 자동 세포 계수기 (Invitrogen)을 사용하여 트립판 블루 염료 축출을 사용하여 생존력에 대해 평가할 수 있다. 생존력은 바람직하게는 축출된 트립판 블루/총 세포수의 백분율로서 표시한다. 샘플 1 (야생형) 및, 샘플 2 또는 샘플 3 이외의 다양한 시험 펩티드로 수행된 실험에서, 배양된 세포는 모든 시험된 공여체에 대해 평균 87%보다 크게 유지되는 것으로 밝혀졌다. 배지 단독과 인큐베이션된 세포의 평균 생존력은 90%로 계산된 반면, 시험 펩티드와 함께 인큐베이션된 세포의 평균 생존력은 각각 88, 88 및 87%였다. KLH 처리된 세포의 생존력은 83%였고, 그것은 펩티드 처리된 세포의 생존력과 유의미하게 다르지 않았다. 그러므로 세포 (PBMC)를 펩티드와 함께 인큐베이션하는 것은 세포 배양기간 동안 어떠한 분명한 독성을 유발하지 않았다고 결론내렸다.

증식 분석에 사용된 것과 동일한 공여체를 또한 IL-2 ELISpot^TM 분석에 대해 사용하였다. 세포를 해동하고 상기에서 설명된 것과 같이 소생시켰다. ELISpot 플레이트 (Milipore, Watford, UK)를 미리 적셔놓고 밤새 PBS중의 100㎕/웰의 IL-2 포획 항체 (R&D Systems, Abingdon, UK))로 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 밤새 차단 완충액 (PBS 중의 1% BSA (소 혈청 알부민, Sigma))중에서 인큐베이션한 후 AIM-V® 배지로 세척하였다. 각 공여체에 대한 세포 밀도를 AIM-V® 배양 배지에서 4 내지 6×10⁶ PBMC/ml로 조정하고, 100㎕의 세포를 각 웰에 첨가하였다. 50㎕의 시험 펩티드와 대조표준을 적절한 웰에 첨가하였다.

펩티드 (ABD Y60-E80 ("샘플 1"), ABD Y60-E80 변이체 N66D/T70S/V71A ("샘플 2")(SEQ IDNO:326) 또는 ABD Y60-E80 변이체 L64A/I65A/V71A ("샘플 3")(SEQ ID NO:327)을 CD8⁺ 소모된 PBMC의 벌크 배양물에 첨가하였다. 샘플과 인큐베이션한 후에 CD4⁺ T 세포 증식을 다양한 시간 지점에 [³H]-티미딘의 통합에 의해 측정하고, 추가로 ELISpot^TM을 사용하여 IL-2 분비를 나란히 측정하였다 (IL-2 ELISpot^TM 분석은 분비된 사이토킨에 결합하는 포획 항체로 사전 코팅된 막을 포함한다). 펩티드를 사용 직전에 AIM-V® 배양 배지 (Invitrogen, Paisley, UK)로 희석하고, 최종 분석 농도는 5μM이었다. KLH를 재생성 대조표준으로서 사용하였고, -20℃에서 물 중의 10mg/ml 스톡 용액으로서 보관하였다. 연구를 위해서 일정액의 KLH를 해동한 후 즉시 AIM-V®로 400㎍/ml로 희석하였다 (최종 농도 100㎍/ml). 파이토헤마글루타닌 (PHA, Sigma, Poole, UK)을 ELISpot^TM에서 포지티브 대조표준으로서 사용하였고, 1mg/ml 스톡을 -20℃에서 보관한 후 세포 배양액으로 최종 농도 2.5㎍/ml로 희석하였다.

시험 펩티드를 6개 한 조의 배양으로 시험하였고, 각 공여체에 대해 네거티브 대조표준 (AIM-V®배지 단독), 세포 대조표준이 없는 경우, 그리고 미토겐 포지티브 대조표준 (2.5㎍/ml의 PHA- ELISpot^TM 기능 및 세포 생존력에 대한 내부 시험용, Sigma)을 또한 각 플레이트에 포함시켰다. 8일의 인큐베이션 기간 후에 ELISpot^TM플레이트를 dH2O와 PBS (x3)로 순차적인 세척에 의해 전개시킨 다음 PBS/1% BSA 중의 100㎕의 여과되고 비오티닐화된 검출 항체 (R&D Systems)를 첨가하였다. 그것을 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후에 플레이트를 추가로 PBS로 3회 세척하고, PBS/1% BSA 중의 100㎕의 여과된 스트렙트아비딘-AP (R&D Systems)을 1.5시간 동안 실온에서 첨가하였다. 스트렙트아비딘-AP를 따라버리고 플레이트를 PBS로 4회 세척하였다. 각 웰에 BCIP/NBT (R&D Systems)(100㎕)를 첨가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반점 전개를 웰과 웰의 후면을 dH2O로 3회 세척함으로써 중지시켰다. 건조시킨 플레이트를 Immunoscan® 분석기 상에서 스캔하고 웰당 반점 (spw)을 Immunoscan® 버전 4 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

증식 및 IL-2 ELISpot^TM 분석을 위해, 자극 지수 (SI)(SI≥2.00)의 실험적 한계치의 두 배이거나 그 이상의 반응을 유도하는 샘플을 포지티브인 것으로 간주하였다. 증식 (n=3)과 IL-2 ELISpot 데이터 (n=6) 세트 둘 다를 위해 포지티브 반응을 통계적이고 실험적인 한계치에 의해 규정하였다: 반응의 유의미도 (p<0.05)를 배지 대조표준 웰에 대한 시험 웰의 cpm 또는 spw를 짝을 이루지 않은 두 샘플의 학생 t-시험을 사용하여 비교함으로써 측정하였고; 자극 지수는 2와 같거나 그것보다 크다 (SI≥2.00), 여기서 SI = 시험 웰의 평균 (cpm 또는 spw)/기준선 (cpm 또는 spw). 이 방법으로 제시된 데이터는 SI≥2.00, p<0.05로서 표시된다. 또한 분석 내 변화는 복제 배양액으로부터의 원래의 데이터의 변화 계수와 표준 편차 (SD)를 계산함으로써 평가될 수 있다.

야생형 팹티드는 CD4+ T 세포 반응의 ELISpot^TM 시간 경과 T 세포 증식 분석에서 포지티브 증식 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌는데, 이때 7개의 공여체에서 SI≥2.00, p<0.05였고, 하나의 경계선 반응 (SI≥1.90 (p<0.05))은 14%의 포지티브 반응을 제공하였다. 야생형 펩티드에 대한 포지티브 (SI≥2.00, p<0.05) T 세포 증식 반응의 평균 크기 (SI)는 SI 2.55였고, 그것은 두 개의 탈면역화된 펩티드보다 약간 더 높았다 (표 24).

표 24.

그러므로, 증식 분석으로부터, 연구 집단에서 T 세포 반응의 크기 (SI)는 반응하는 공여체의 빈도 (%)와 함께 야생형 펩티드의 전체적인 면역원성 잠재력은 중간 정도인 것으로 간주되는 한편, 탈면역화된 펩티드의 면역원성 잠재력은 낮은 것으로 간주주되었음을 나타낸다. 이들 데이터는 야생형 특이적 T 세포 에피토프의 제거가 N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A에서의 돌연변이에 의해 성공적이었음을 지지한다.

증식 반응의 전체적인 타이밍은 T 세포 반응의 잠재적인 유형 (원초적인 것이거나 되돌리는 것)에 관한 표시를 제공할 수 있다. 5일에 검출된 최대 T 세포 증식은 기존의 T 세포 전구체 빈도가 높은 것을 나타낸 반면, 8일의 최대 증식은 낮은 기존의 T 세포 전구체 빈도를 나타낸다. 높은 면역원성 잠재력은 시간 경과의 초기 단계 동안 T 세포의 자극과 일치할 것이다. 시험 펩티드 ABD Y60-E80 변이체 N66D/T70S/V71A ("샘플 2")(SEQ ID NO:326)은 5, 6, 7, 및 8일에 각각 1, 0, 1, 및 1개의 반응을 보였다. 시험 펩티드 ABD Y60-E80 변이체 L64A/I65A/V71A ("샘플 3")(SEQ ID NO:327)은 5, 6, 7, 및 8일에 각각 0, 1, 2 및 1개의 반응을 보였다. N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A에 대해 관찰된 반응하는 공여체의 저조한 수는, 비록 이들 샘플에 대해 관찰되었던 소수의 반응들이 시간 경과시 후기에 발생하긴 했지만, T 세포 증식 반응의 이런 유형의 동역학적 분석을 해석하기 어렵게 만들고, 건강한 개체가 이들 서열의 T 세포 에피토프에 대해 준비되지 않는다는 개념을 지지한다.

증식 분석과 유사하게, 포지티브 반응을 공여체에서 기록하였는데, 공여체는 SI≥2.00을 보였고, 이때 시험 spw와 바탕값 (미처리 배지 대조표준) 사이에 관찰된 유의미도 (p<0.05) 차이가 있었다. N66D/T70S/V71A 펩티드는 IL-2 ELISpot 분석에서 6%의 공여체가 포지티브하게 반응하는 것을 유도하였고, L64A/I65A/V71A 펩티드는 4% 포지티브 반응을 유도하였다. 이것은 20%의 공여체 집단에서 포지티브 IL--2 ELISpot 반응이 검출되었던 야생형 서열에 대해 관찰된 결과와 대조적이다. 두 가지 탈면역화된 펩티드에 대하 포지티브 T 세포 반응의 평균 크기는 각각 2.02 및 2.43으로 낮았고 (표 25), 이것은 야생형 펩티드에 대해 관찰된 것과 유사하였다. 아래의 표 25는 시험 펩티드 및 KLH에 대한 포지티브 T 세포 IL-2 분비 반응 (SI≥2.00, p<0.05)의 크기 (±SD)의 개요를 나타낸다. 평균 SI는 관찰된 모든 포지티브 공여체 반응의 평균으로부터 계산하였다. 데이터는 경계선 증식 반응 (SI≥1.90, p<0.05)을 포함한다.

표 25.

두 개의 시험 펩티드에 대해, 증식과 IL- ELISpot^TM 분석 데이터 사이의 전체적인 상관관계는 높았는데, 증식 분석에서 포지티브로 반응한 공여체의 100% 및 67%가 또한 IL-2 ELISpot 분석에서도 반응하였다. 이렇게 두 분석 사이의 높은 상관관계는 또한 재생성 대조표준 KLH에서도 관찰되었는데, 증식 분석에서 반응한 공여체의 98%가 IL- ELISpot^TM 분석에서도 반응을 보였다 (전형적인 범위는 EpiScreen^TM 시간 경과 T 세포 분석에 대해 85 내지 100%). 그러므로 두 가지 증식 및 IL- ELISpot^TM 분석 둘 다에서, N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A 펩티드에 대한 T 세포 반응의 빈도 및 크기는 그것들이 둘 다 야생형 펩티드의 임상적 면역원성의 고위험에 비교하여, 임상적 면역원성에 대해 낮은 잠재력을 가지는 것으로 간주할 수 있음을 시사한다.

증식 및 IL-2 ELISpot 분석 데이터는 포지티브 T 세포 반응이 많은 공여체에서 시험 펩티드에 대해 검출될 수 있음을 보여준다. 증식과 IL-2 ELISpot 분석 사이의 전체적인 상관관계는 KLH에 대해 98%였고, 야생형 펩티드에 대해 70%였으며, N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A 각각에 대해서는 100% 및 67%였다. 그러므로 반응하는 공여체를 증식과 IL-2 ELISpot 분석 둘 다에서 각 샘플에 대해 포지티브 반응을 갖추고 있는 것으로 규정하였다. 모든 공여체는 PHA에 대해 T 세포 반응을 나타냈는데, 그것은 생체 외 배양중의 세포가 기능적이었음을 가리킨다. 이들 두 분석으로부터의 데이터 세트를 조합하여 분석한 것은, 증식 및 IL-2 ELISpot 분석 둘 다에서 반응의 전체적인 빈도 및 크기는 두 개의 탈면역화된 펩티드에 대해 낮았음을 나타냈는데, N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A 둘 다에 대해 반응하는 공여체는 4%였다. 이것은 야생형 펩티드에 대해 얻어진 연구 결과와 대조적이다 (포지티브 반응의 수는 상당히 더 높았다 (IL-2 ELISpot 및 증식 분석 둘 다에서 반응하는 공여체는 14%임)). HLA 분석은 수행하지 않았는데, 두 개의 시험 펩티드에 대한 반응이 이 유형의 분석에 대해 최소 한계치 아래였기 때문이다.

요약하면, EpiScreen^TM 시간 경과 T 세포 분석을 사용하여 두 개의 시험 펩티드의 임상적 면역원성에 대한 잠재력을 측정하였다. 증식 및 IL-2 ELISpot에 의해 측정된 펩티드가 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 능력을 50 HLA-형 공여체 패널에 대해 시험하였다. 야생형 펩티드의 연구로부터 얻어진 데이터는 야생형 펩티드에 대한 면역원성의 전체적인 잠재적 위험이 중간 정도였고, 증식 및 IL-2 반응의 조합된 빈도는 연구 집단의 14%였음을 가리켰다. 그러나 이 연구에서 두 개의 탈면역화된 펩티드에 대한 증식 및 IL-2 반응의 조합된 빈도는, N66D/T70S/V71A에 대해서는 4%의 공여체가 반응하였고, L64A/I65A/V71A에 대해서는 6%의 공여체가 반응한 정도로 낮았다.

다수의 상업용 생물제제의 EpiScreen^TM 시간 경과 T 세포 분석은 EpiScreen^TM 분석에서 공여체 T 세포 반응의 백분율과 임상에서 관찰된 면역원성 (항-단백질 치료 항체 반응)의 수준 사이에 명백한 상관관계를 나타냈다. 고빈도의 공여체 반응을 Campath와 같은 면역원성 항체에 대한 EpiScreen^TM 분석에서 관찰한 반면, 상대적으로 낮은 빈도 공여체 반응은 Xolair 및 Herceptin과 같은 비-면역원성 항체에 대해 관찰되었다. 일반적으로 EpiScreen^TM 분석에서 10%보다 큰 포지티브 반응을 유도하는 단백질 치료제는 임상에서 상당한 위험의 면역원성과 관련된다. EpiScreen^TM 분석에서 시험된 단백질 치료제와 비교하여, 데이터는 탈면역화된 펩티드 N66D/T70S/V71A 및 L64A/I65A/V71A가 Xolair, Herceptin 및 Avastin과 동일한 범위에 속하는 CD4⁺ T 세포 반응을 나타내고, 그로써 낮은 잠재적 위험의 면역원성을 가지는 것으로 여겨질 것임을 보여준다. 그러므로 탈면역화된 펩티드는 EpiScreen^TM 면역원성 분석에서 선호되는 면역원성 프로필을 나타낸다고 결론지을 수 있다.

실시예 23. ABD - DART 의 개선된 생체 내 약물동역학적 특성

상기에서 논의된 것과 같이, 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD)을 DART의 생체 내 약물동역학적 특성을 개선하기 위하여 DART의 C-말단 (항원 결합 부위로부터 떨어져 있음)에 융합하였다 ("ABD-DART"). 그러한 ABD-DART의 약물동역학적 연구는 연장된 순환 시간을 나타냈는데, 증가된 말단 반감기는 정규 DART (ABD 결핍)에 대해 1.2시간인 것에 비교하여 35.1시간이었다. 가상환경에서의 분석 결과 ABD 서열에 높은 MHC 부류 II 결합 잠재력을 가지는 5개의 p1 앵커 위치가 있는 것으로 드러났다. ABD의 탈면역화된 버전을 생성하기 위하여, 부위 특정 돌연변이를 가상환경 분석에 의해 제공된 예상을 토대로 수행하였다. 여러 라운드의 단일 및 조합 돌연변이 후에 혈청 알부민에 대해 야생형 ABD의 그것과 비교하여 유사하거나 더 낮은 친화성을 가지는 두 개의 ABD 변이체, ""ABD (AAA)" 및 "ABD (DSA)"를 얻었다.

L64A/I65A/V71A ("ABD (AAA)") (SEQ ID NO:328):

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A ₆₄ A ₆₅NNAKT A ₇₁EGVKALIDE ILAALP

N66D/T70S/V71A ("ABD (DSA)") (SEQ ID NO:329):

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D ₆₆NAK S ₇₀ A ₇₁EGVKALIDE ILAALP

이들 두 개의 변이체는 MHC 부류 II 펩티드와의 결합 기록에서 가장 큰 감소를 나타냈다 (표 26).

표 26. 돌연변이 조합의 가상환경 평가

이들 두 개의 변이체의 혈청 반감기를 관찰하기 위하여, 생체 내 PK 연구를 5mg/kg의 단백질을 1회 IV 주사한 C57Bl/6마우스에서 수행하였다. PK 연구는 돌연변이 ABD (DSA)의 야생형 ABD의 그것과 유사한 연장된 순환 시간을 나타냈다 (도 63). 다른 돌연변이, hCD16xhCD32B ABD (AAA) DART는 혈청에서 기본적인 hCD16xhCD32B EK DART보다 수시간 더 길게 유지되었다. 그러므로 연구는 알부민과의 더 낮은 친화성에도 불구하고, ABD의 탈면역화된 버전의 융합물 (즉 ABD (DSA))이 DART 단백질의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킨 것을 증명한다. 그렇게 증가된 혈청 반감기는 면역원성이 적은 이 ABD-DART를 잠재적인 치료제 후보로서, 특히 더 적은 빈도 및/또는 더 낮은 투약 용량으로 사용하는 것을 유익하게 만든다. hCD16xhCD32B ABD DART의 PK 프로필을 표 27에 나타낸다.

표 27. hCD16xhCD32B ABD DART의 PK 프로필

실시예 24. 재조합 ABD - DART 의 생체 내 반감기에 미치는 ABD 의 증가된 결합가의 영향

상이한 ABD DART 단백질을, ABD를 두 사슬의 단부에 융합하거나 (도 64A) 또는 한 사슬의 단부에 융합함으로써 (도 64B) 구성하였다. 한 구성물을 또한 ABD(AAA)를 두 사슬의 C-말단 단부에 융합함으로써 만들어다. 이 연구에서 hCD16xhCD32B Fc DART를 혈청 반감기를 비교하기 위하여 만들었다. 모든 ABD 변이체는 두 항원 모두와 이중특이성 결합을 나타냈다 (도 65). 이들 ABD DART와 Fc DART 모두의 혈청 반감기를 관찰하기 위하여 5mg/kg의 단백질을 1회 IV 주사한 C57Bl/6마우스에서 생체 내 PK 연구를 수행하였다. 그 결과는 ABD의 반감기 연장 특성이 알부민 결합의 결합가에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다 (도 66). 두 ABD와 융합된 DART의 말단 반감기는 예상외로 한 ABD와 융합된 DART의 그것보다 세 배 더 높다 (표 28).

표 28. hCD16xhCD32B ABD 및 Fc DART의 PK 프로필

해당 기술분야의 숙련자들에게 명백할 것과 같이, 본 발명의 많은 변형과 변화가 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다. 본원에 기술된 특정 구체예들은 단지 실시예에 의해 제공되며, 본 발명은 첨부되는 특허청구범위와 그런 청구범위가 표제로 하는 것과 동등한 범주에 의해서만 제한된다. 그런 변형은 첨부되는 특허청구범위의 범주에 속하는 것으로 의도된다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 비-특허는 각각의 개별적인 공보 또는 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 그것의 전체 내용이 모든 목적에 대해 참조로 포함된 것을 나타내는 것과 동일한 정도로 모든 목적에 대해 그리고 그것들의 전체 내용을 참조하는 것으로 본원에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Barat, Bhaswati Huang, Ling Johnson, Leslie Bonvini, Ezio <120> Deimmunized Serum-Binding Domains and their Use for Extending Serum Half-Life <130> 1301.0007P9I <150> US 61/488,725 <151> 2011-05-21 <160> 329 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 50 55 60 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 217 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 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Sequence <220> <223> DNA sequence of SEQ ID NO:97 (covalent diabody polyprotein precursor) <400> 96 gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg cggaggcgag 360 gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactctcg 420 tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca 480 acgacgggtc tggagtgggt cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga 540 gactccgtga agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac agagactacg 660 ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag tttcagtcac tgtctcctca 720 ctgggaggct gcggcgggag agctaagagg gatgtccaga tgacccagtc 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accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag 360 tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc 420 ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa 480 tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac 540 aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg 600 acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct 660 atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggattcaa caggggagag 720 tgt 723 <210> 317 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2VL-TCRVH <400> 317 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 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gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300 ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg 360 cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc 420 ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt 480 gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa 540 ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc 600 ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac 660 gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagt tgagcccaaa 720 tcttgt 726 <210> 319 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCRVL-HER2VH-E coil <400> 319 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 115 120 125 Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 130 135 140 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro 165 170 175 Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 180 185 190 Ala Tyr Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly 225 230 235 240 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 245 250 255 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asn 260 265 270 Ser <210> 320 <211> 819 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCRVL-HER2VH-E coil <400> 320 Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys 65 70 75 80 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr Thr Ala Cys Ala Thr Gly 85 90 95 Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala 100 105 110 Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys 115 120 125 Thr Ala Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr 130 135 140 Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly 145 150 155 160 Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys 165 170 175 Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr 180 185 190 Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Thr 195 200 205 Thr Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala 225 230 235 240 Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly 260 265 270 Thr Ala Gly Thr Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly 275 280 285 Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala 290 295 300 Ala Gly Cys Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly 305 310 315 320 Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 325 330 335 Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys 340 345 350 Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys 355 360 365 Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala 370 375 380 Gly Gly Gly 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Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala 595 600 605 Gly Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Thr 610 615 620 Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Gly Gly Gly 625 630 635 640 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala 645 650 655 Thr Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly 660 665 670 Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Gly Gly 675 680 685 Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly 690 695 700 Ala Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala 705 710 715 720 Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly 725 730 735 Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys 740 745 750 Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys 755 760 765 Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly 770 775 780 Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala 785 790 795 800 Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ala Ala Thr 805 810 815 Thr Cys Thr <210> 321 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2VL-TCRVH-K coil <400> 321 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe 130 135 140 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 His Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 210 215 220 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly 225 230 235 240 Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Gly Gly Gly 260 265 270 Asn Ser <210> 322 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2VL-TCRVH-K coil <400> 322 gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 60 atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 120 ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300 ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg 360 cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc 420 ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt 480 gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa 540 ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc 600 ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac 660 gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt 720 ggaaaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt 780 aaggaaaagg tcgcagccct gaaagagggc ggcgggaatt ct 822 <210> 323 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ABD Construct <400> 323 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 324 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ABD Construct <400> 324 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 325 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial ABD Construct <400> 325 Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ile Asp Glu 20 <210> 326 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ABD Construct (ABD Y60-E80 Variant N66D/T70S/V71A ) <400> 326 Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ile Asp Glu 20 <210> 327 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ABD Construct (ABD Y60-E80 Variant L64A/I65A/V71A) <400> 327 Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ile Asp Glu 20 <210> 328 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic ABD Construct (L64A/I65A/V71A ("ABD (AAA)")) <400> 328 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg 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Claims

혈청 단백질에 결합할 수 있는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 혈청-결합 단백질 부분은 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분이 결핍되어 있는 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교하여 연장시키는 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 추가 부분을 포함하고, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분은 상기 혈청 단백질에 둘 다 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G의 탈면역화된 알부민-결합 도메인 (ABD) 또는 그것의 알부민-결합 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스 단백질 G의 상기 알부민-결합 도메인 (ABD)은 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 4항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
(A) 위치 71, 위치 74, 또는 위치 79에서 발린의 알라닌으로의 변이;
(B) 위치 64에서 류신의 알라닌으로의 변이, 위치 65에서 이소류신의 알라닌으로의 변이, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이; 또는
(C) 위치 66에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 변이, 위치 70에서 트레오닌의 세린으로의 치환, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이.
제 4항에 있어서, 상기 알부민-결합 도메인은 SEQ ID NO:304, SEQ IDNO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, 또는 SEQ ID NO:329의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항원-결합 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 7항에 있어서, 상기 분자는 서로 상호작용하여 두 개의 항원-결합 부위를 형성하는 최소한 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이중체이고, 이때 상기 폴리펩티드 사슬의 최소한 하나는 상기 혈청 단백질과 결합할 수 있는 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분을 포함하는 상기 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원-결합 분자.
제 7항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬은 둘 다 상기 혈청 단백질에 결합할 수 있는 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중체.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 폴리펩티드 사슬은 서로 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 이중체.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중체는
(A) 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체 또는 T-세포 수용체 (TCR); 및
(B) 종양-관련 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 이중체.
제 7항의 항원-결합 분자, 또는 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 이중체 분자로서, 상기 항원은 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 자궁경부암 항원, 췌장 암종 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 결장암 항원, 고환암 항원, 신경교아세포종 암항원, B 세포 암과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비-호지킨성 림프종과 관련된 항원, 또는 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원인 항원-결합 분자, 또는 이중체 분자.
공유 결합된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장하기 위한 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분의 용도로서, 상기 혈청 반감기의 연장은 상기 알부민 결합 단백질이 없는 경우의 항원-결합 분자의 혈청 반감기에 비하여 연장된 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분의 용도.
제 13항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 추가 부분을 포함하고, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분들은 모두 상기 혈청 단백질에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민-결합 도메인 (ABD)의 부분, 또는 그것의 알부민-결합 변이체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스 단백질 G의 상기 알부민-결합 도메인 (ABD)은 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 16항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은
(A) 위치 71, 위치 74, 또는 위치 79에서 발린의 알라닌으로의 변이;
(B) 위치 64에서 류신의 알라닌으로의 변이, 위치 65에서 이소류신의 알라닌으로의 변이, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이; 또는
(C) 위치 66에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 변이, 위치 70에서 트레오닌의 세린으로의 치환, 및 위치 71에서 발린의 알라닌으로의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 16항에 있어서, 상기 알부민-결합 도메인은 SEQ ID NO:304, SEQ IDNO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, 또는 SEQ ID NO:329의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 용도.
제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항원-결합 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 서로 상호작용하여 두 개의 항원-결합 부위를 형성하는 최소한 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이중체이고, 이때 상기 폴리펩티드 사슬의 최소한 하나는 상기 혈청 단백질과 결합할 수 있는 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분을 포함하는 상기 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 20항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 사슬은 둘 다 상기 혈청 단백질에 결합할 수 있는 상기 탈면역화된 혈청-결합 단백질의 상기 부분을 포함하는 두 번째 폴리펩티드 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 폴리펩티드 사슬은 서로 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중체는
(A) 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 수용체 또는 T-세포 수용체 (TCR); 및
(B) 종양-관련 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 자궁경부암 항원, 췌장 암종 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 결장암 항원, 고환암 항원, 신경교아세포종 암항원, B 세포 암과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비-호지킨성 림프종과 관련된 항원, 또는 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원인 것을 특징으로 하는 용도.