KR20200068749A - 림프구 활성화 유전자-３ (ｌａｇ-３)에 결합하는 인간 항체, 및 그의 용도 - Google Patents

림프구 활성화 유전자-３ (ｌａｇ-３)에 결합하는 인간 항체, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 LAG-3에 고친화도로 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 항체는 인간 LAG-3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 및 원숭이 LAG-3에 결합하지만, 마우스 LAG-3에 결합하지 않는다. 본 발명은 MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제할 수 있고 항원-특이적 T 세포 반응을 자극할 수 있는 항-LAG-3 항체를 제공한다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현시키는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체, 이중특이적 분자 및 제약 조성물을 또한 제공한다. 본원은 또한 본 발명의 항-LAG-3 항체를 사용하여 LAG-3을 검출하는 방법, 및 자극성 면역 반응을 치료하는 방법을 제공한다. 항-LAG-3 항체가 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체와 동시-투여되는 조합 요법을 또한 제공한다.

Description

림프구 활성화 유전자-３ (ＬＡＧ-３)에 결합하는 인간 항체, 및 그의 용도{HUMAN ANTIBODIES THAT BIND LYMPHOCYTE ACTIVATION GENE-3 (LAG-3), AND USES THEREOF}
림프구 활성화 유전자-3, 또는 LAG-3 (CD223으로도 공지됨)은 면역글로불린 수퍼유전자 (supergene) 패밀리의 구성원이고, CD4에 구조적으로 및 유전적으로 관련된다. LAG-3은 휴지기 말초 혈액 림프구에서 발현되지 않지만, 활성화된 T 세포 및 NK 세포 상에서 발현된다. LAG-3은 CD4 유전자 가까이, 염색체 12의 짧은 아암 (arm)의 원위 (distal) 부분에 위치하는 유전자에 의해 코딩되는 막 단백질이고, 이것은 LAG-3 유전자가 유전자 복제를 통해 진화할 수 있음을 제안한다 (Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405).
CD4와 유사하게 LAG-3은 MHC 클래스 II 분자와 상호작용하는 것으로 나타났지만, CD4와는 달리 LAG-3은 인간 면역결핍 바이러스 gp120 단백질과 상호작용하지 않는다 (Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176:327-337). 가용형 LAG-3 면역글로불린 융합 단백질 (sLAG-3 Ig)를 사용한 연구에서는 세포 표면 상에서 MHC 클래스 II에 대한 LAG-3의 직접적 및 특이적 결합을 입증하였다 (Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1180-1186).
항원-특이적 T 세포 반응의 시험관 내 연구에서, 항-LAG-3 항체의 첨가는 T 세포 증식의 증가, CD25와 같은 활성화 항원의 보다 큰 발현, 및 보다 고농도의 인터페론-감마 및 인터루킨-4와 같은 시토킨을 생성시켰고, 이것은 CD4+ T 림프구의 항원-의존성 자극을 하향-조절하는데 있어서 LAG-/MHC 클래스 II 상호작용에 대한 역할을 지지한다 (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:3216-3221). LAG-3의 세포질내 영역은 CD3/TCR 활성화 경로의 하향-조절에 관여하는 신호전달 분자인 것으로 생각되는 LAP로 명명된 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다 (Iouzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:2885-2891). 또한, CD4+CD25+ 조절성 T 세포 (Treg)는 활성화 시에 LAG-3을 발현하는 것으로 나타났고, LAG-3에 대한 항체는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 유도된 Treg 세포에 의한 억제를 방해하고, 이것은 LAG-3이 Treg 세포의 서프레서 (suppressor) 활성에 기여함을 제안한다 (Huang, C. et al. (2004) Immunity 21:503-513). 또한, LAG-3은 T 세포-의존 및 비의존 메카니즘 모두에서 조절성 T 세포에 의한 T 세포 항상성을 음성으로 조절하는 것으로 나타났다 (Workman, C.J. and Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174:688-695).
특정 상황에서, LAG-3은 또한 면역자극 효과를 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, 동계 (syngeneic) 마우스 내로 이식된 LAG-3 형질감염된 종양 세포는 형질감염되지 않은 종양 세포에 비해 현저한 성장 감소 또는 완전한 회귀를 보였고, 이것은 종양 세포 상의 LAG-3 발현이 MHC 클래스 II 분자를 통해 항원 제시 세포를 촉발함으로써 항-종양 반응을 자극하였음을 제안한다 (Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:3867-3876). 추가로, 가용형 LAG-3 Ig 융합 단백질은 항원과 함께 마우스에 투여될 때 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 자극하는 것으로 나타났고, 이것은 가용형 LAG-3 Ig가 백신 어쥬번트 (adjuvant)로서 기능을 할 수 있음을 나타낸다 (El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. 164:5583-5589). 또한, 가용형 인간 LAG-3 Ig는 타입 I 종양-특이적 면역성의 시험관 내 생성을 증폭시키는 것으로 나타났다 (Casati et al. (2006) Cancer Res. 66:4450-4460). LAG-3의 기능적 활성은 문헌 [Triebel (2003) Trends Immunol. 24:619-622]에서 더욱 검토되었다. 상기 사실에 비추어, LAG-3의 활성을 조정하기 위한 추가의 물질은 중요하다.
<발명의 개요>
본원은 LAG-3에 특이적으로 결합하고 바람직한 기능적 특성을 갖는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 이들 특성은 인간 LAG-3에 대한 고친화도 결합, 마우스 LAG-3에는 결합하지 않으면서 인간 및 원숭이 LAG-3 (예를 들어, 사이노몰거스 및/또는 붉은털 원숭이 LAG-3)에 결합하는 능력, 주요 조직적합 (MHC) 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 종양 보유 대상체 또는 바이러스 보유 대상체에서와 같이, LAG-3 단백질을 검출하기 위해 또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 LAG-3에 결합하며, 하기 특성:
(a) 원숭이 LAG-3에 결합하는 특성;
(b) 마우스 LAG-3에 결합하지 않는 특성;
(c) 주요 조직적합 (MHC) 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 특성; 및
(d) 면역 반응을 자극하는 특성
중의 적어도 하나를 나타내는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다.
바람직하게는, 항체는 특성 (a), (b), (c) 및 (d) 중 적어도 2개의 특성을 나타낸다. 보다 바람직하게는, 항체는 특성 (a), (b), (c) 및 (d) 중 적어도 3개의 특성을 나타낸다. 훨씬 더 바람직하게는, 항체는 4개의 특성 (a), (b), (c) 및 (d)를 모두 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 항원-특이적 T 세포 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응에서 인터루킨-2 (IL-2) 생산을 자극한다. 다른 실시양태에서, 항체는 면역 반응, 예를 들어 항-종양 반응 (예를 들어, 생체 내 종양 이식 모델에서 종양 성장을 억제한다) 또는 자가면역 반응 (예를 들어, NOD 마우스에서 당뇨병의 발생을 촉진한다)을 자극한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 PGHPLAPG (서열 76)를 포함하는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 HPAAPSSW (서열 77) 또는 PAAPSSWG (서열 78)를 포함하는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 인간 LAG-3에 1 x 10-7 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 LAG-3에 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 LAG-3에 5 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 LAG-3에 1 x 10-9 M 이하의 KD로 결합한다. 한 실시양태에서 항체는 면역조직화학에 의해 뇌하수체 조직을 염색하지만, 다른 실시양태에서 항체는 면역조직화학에 의해 뇌하수체 조직을 염색하지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이고, 여기서 항체는 인간 LAG-3에 대한 결합을 위해 참조 항체와 교차경쟁하며, 참조 항체는
(a) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 참조 항체는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 VH 3-20 유전자, 인간 VH 4-34 유전자, 인간 VH 3-33 유전자 또는 인간 VH 1-24 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VK L18 유전자, 인간 VK L6 유전자 또는 인간 VK A27 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 인간 VH 4-34 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역;
(b) 인간 VH 3-33 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK A27 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역;
(c) 인간 VH 3-20 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L18 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역;
(d) 인간 VH 1-24 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 인간 VH 3-33 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은
(a) 서열 37-42로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 43-48로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다.
바람직한 조합은
(a) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은
(a) 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은
(a) 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은
(a) 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은
(a) 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은
(a) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형의 전장 항체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG4 이소형이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 중쇄 내 디술피드 다리 불균일성이 감소되거나 폐지되도록, 중쇄 불변 영역 힌지 영역 내에 (문헌 [Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108)]에 기재된 바와 같이 위치 241에 대응하는 위치에서) 세린에서 프롤린으로의 돌연변이가 존재하는 IgG4 이소형이다. 별법으로, 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 또는 Fab'2 단편, 또는 단일쇄 항체일 수 있다.
또한, 본원은 치료제, 예를 들어, 세포독소 또는 방사성 동위원소에 연결된 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본원은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부과 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능성 모이어티 (moiety)에 연결된 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 이중특이적 분자를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본원에 포함된다. 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 항-LAG-3 항체를 제조하는 방법을 또한 제공하고, 이는 (i) 숙주 세포에서 항체를 발현시키고, (ii) 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-LAG-3 항체를 사용하여 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 상기 T 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 항원-특이적 T 세포에 의한 인터루킨-2 생산이 자극된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)이 자극되도록 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 종양 보유 대상체이고, 종양에 대한 면역 반응이 자극된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상체는 바이러스 보유 대상체이고, 바이러스에 대한 면역 반응이 자극된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 바이러스 감염이 치료되도록 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 종양 성장을 억제하기 위해 또는 항바이러스 반응을 자극하기 위해 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-PD-1 항체를 투여한다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-PD-L1 항체를 투여한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-CTLA-4 항체를 투여한다. 한 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 인간 항체, 예를 들어 본원에 개시된 항체이다. 별법으로, 항-LAG-3 항체는 예를 들어 키메라 (chimeric) 또는 인간화 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체 (예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체)는 인간 항체이다. 별법으로, 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체는 예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) (i) 서열 1-6으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 7-12로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열, 및/또는 서열 13-14, GGY 및 16-18로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 19-24로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 25-30으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열, 및/또는 서열 31-36으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성시키고;
(c) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 것
을 포함하는, 항-LAG-3 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본원의 다른 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 자명할 것이고, 이들은 본 발명을 제한하는 것을 해석되지 않아야 한다. 본원 전체에서 인용되는 모든 참고문헌, Genbank 기탁 번호, 특허 및 공개된 특허 출원은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
도 1a는 25F7 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 49) 및 아미노산 서열 (서열 37)을 보여준다. CDR1 (서열 1), CDR2 (서열 7) 및 CDR3 (서열 13) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 1b는 25F7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 55) 및 아미노산 서열 (서열 43)을 보여준다. CDR1 (서열 19), CDR2 (서열 25) 및 CDR3 (서열 31) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 2a는 26H10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 50) 및 아미노산 서열 (서열 38)을 보여준다. CDR1 (서열 2), CDR2 (서열 8) 및 CDR3 (서열 14) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 2b는 26H10 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 56) 및 아미노산 서열 (서열 44)을 보여준다. CDR1 (서열 20), CDR2 (서열 26) 및 CDR3 (서열 32) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 3a는 25E3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 51) 및 아미노산 서열 (서열 39)을 보여준다. CDR1 (서열 3), CDR2 (서열 9) 및 CDR3 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 3b는 25E3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 57) 및 아미노산 서열 (서열 45)을 보여준다. CDR1 (서열 21), CDR2 (서열 27) 및 CDR3 (서열 33) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 4a는 8B7 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 52) 및 아미노산 서열 (서열 40)을 보여준다. CDR1 (서열 4), CDR2 (서열 10) 및 CDR3 (서열 16) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 4b는 8B7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 58) 및 아미노산 서열 (서열 46)을 보여준다. CDR1 (서열 22), CDR2 (서열 28) 및 CDR3 (서열 34) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 5a는 11F2 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 53) 및 아미노산 서열 (서열 41)을 보여준다. CDR1 (서열 5), CDR2 (서열 11) 및 CDR3 (서열 17) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 5b는 11F2 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 59) 및 아미노산 서열 (서열 47)을 보여준다. CDR1 (서열 23), CDR2 (서열 29) 및 CDR3 (서열 35) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 6a는 17E5 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 54) 및 아미노산 서열 (서열 42)을 보여준다. CDR1 (서열 6), CDR2 (서열 12) 및 CDR3 (서열 18) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 6b는 17E5 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 60) 및 아미노산 서열 (서열 48)을 보여준다. CDR1 (서열 24), CDR2 (서열 30) 및 CDR3 (서열 36) 영역이 라인으로 표시되어 있고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되어 있다.
도 7은 인간 생식계열 VH 4-34 및 JH5b 아미노산 서열 (각각 서열 61 및 62)과 25F7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 37)의 정렬을 보여준다.
도 8은 인간 생식계열 Vk L6 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열 63 및 64)과 25F7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 43)의 정렬을 보여준다.
도 9는 인간 생식계열 VH 3-33 및 JH6B 아미노산 서열 (각각 서열 65 및 66)과 26H10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 38)의 정렬을 보여준다.
도 10은 인간 생식계열 Vk A27 및 JK3 아미노산 서열 (각각 서열 67 및 68)과 26H10의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 44)의 정렬을 보여준다.
도 11은 인간 생식계열 VH 3-20 및 JH4b 아미노산 서열 (각각 서열 69 및 70)과 25E3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 39)의 정렬을 보여준다.
도 12는 인간 생식계열 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열 71 및 64)과 25E3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 45)의 정렬을 보여준다.
도 13은 인간 생식계열 VH 4-34 및 JH5b 아미노산 서열 (각각 서열 61 및 62)과 8B7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 40)의 정렬을 보여준다.
도 14는 인간 생식계열 Vk L6 및 JK4 아미노산 서열 (각각 서열 63 및 72)과 8B7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 46)의 정렬을 보여준다.
도 15는 인간 생식계열 VH 1-24 및 JH4b 아미노산 서열 (각각 서열 73 및 70)과 11F2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 41)의 정렬을 보여준다.
도 16은 인간 생식계열 Vk L6 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열 63 및 74)과 11F2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 47)의 정렬을 보여준다.
도 17은 인간 생식계열 VH 3-33 및 2-2 아미노산 서열 (각각 서열 65 및 70)과 17E5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 42)의 정렬을 보여준다.
도 18은 인간 생식계열 Vk L6 아미노산 서열 (각각 서열 63 및 75)과 17E5의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 48)의 정렬을 보여준다.
도 19는 Genbank에 기탁된 붉은털 원숭이 LAG-3 단백질 서열 (서열 94) (Genbank 기탁 번호 XM_001108923)과 원숭이 LAG-3 cDNA 클론 pa23-5에 의해 코딩되는 단백질 서열 (서열 93)의 정렬을 보여준다. 엑스트라 (extra) 루프 펩티드 영역 및 막횡단 (transmembrane) 도메인을 밑줄친다. 2개의 서열 사이의 하나의 아미노산 차이 (아미노산 위치 419)를 굵게 강조한다.
본원은 인간 LAG-3에 결합하고 바람직한 기능적 특성을 갖는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열로부터 유도되고/되거나 특정 구조적 특징, 예를 들어 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역을 포함한다. 본원은 단리된 항체, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중특이적 분자, 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 또한, 본원은 LAG-3 단백질을 검출하고, 단독으로 또는 다른 면역자극성 항체와 조합으로 면역 반응을 자극하기 위해 본 발명의 항-LAG-3 항체를 사용하는 방법과 같은 항체의 사용 방법에 관한 것이다. 따라서, 본원은 또한 예를 들어 종양 성장을 억제하거나 바이러스 감염을 치료하기 위해 본 발명의 항-LAG-3 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해서는 특정 용어에 대한 정의를 먼저 제시한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시되어 있다.
용어 "LAG-3"은 림프구 활성화 유전자-3을 의미한다. 용어 "LAG-3"은 변이체, 이소형, 상동체, 오르토로그 (ortholog) 및 파라로그 (paralog)를 포함한다. 예를 들어, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는 특정 경우에 인간 이외의 다른 종으로부터의 LAG-3 단백질과 교차반응할 수 있다. 다른 실시양태에서, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는 인간 LAG-3 단백질에 완전히 특이적일 수 있고 종 또는 다른 종류의 교차반응을 보이지 않을 수 있거나, 또는 모든 다른 종이 아니라 특정 다른 종으로부터의 LAG-3과 교차반응할 수 있다 (예를 들어, 원숭이 LAG-3과는 교차반응하지만 마우스 LAG-3에는 교차반응하지 않는다). 용어 "인간 LAG-3"은 인간 서열 LAG-3, 예를 들어 Genbank 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3의 완전한 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "마우스 LAG-3"은 마우스 서열 LAG-3, 예를 들어 기탁 번호 NP_032505의 마우스 LAG-3의 완전한 아미노산 서열을 의미한다. 또한, LAG-3은 예를 들어 CD223으로서 당업계에 공지되어 있다. 인간 LAG-3 서열은 예를 들어 보존된 돌연변이 또는 비-보존 영역 내의 돌연변이를 갖는다는 점에서 Genbank 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3과 상이할 수 있고, LAG-3은 Genbank 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 본원의 항체에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프를 LAG-3의 세포외 도메인에 갖는다는 것이거나 또는 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합이다.
용어 "원숭이 LAG-3"은 사이노몰거스 원숭이 LAG-3 및 붉은털 원숭이 LAG-3을 포함하고 이로 제한되지 않는 구세계 및 신세계 원숭이에 의해 발현되는 LAG-3 단백질을 포함하고자 의도된다. 원숭이 LAG-3의 대표적인 아미노산 서열은 Genbank 기탁 번호 XM_001108923로 기탁된, 도 19 및 서열 85에 제시된 붉은털 원숭이 LAG-3 아미노산 서열이다. 원숭이 LAG-3의 다른 대표적인 아미노산 서열은 실시예 3A, 하위섹션 3에 설명된 바와 같이 단리된, 도 19 및 서열 84에 제시된 클론 pa23-5의 다른 붉은털 원숭이 서열이다. 상기 다른 붉은털 원숭이 서열은 Genbank-기탁 서열에 비해 위치 419에서 단일 아미노산 차이를 나타낸다.
특정 인간 LAG-3 서열은 일반적으로 Genbank 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3에 아미노산 서열이 적어도 90% 동일할 것이고, 다른 종 (예를 들어, 쥐)의 LAG-3 아미노산 서열에 비교할 때 아미노산 서열을 인간의 것으로서 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 LAG-3은 Genbank 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3에 아미노산 서열이 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 LAG-3 서열은 기탁 번호 NP_002277의 LAG-3 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다. 특정 실시양태에서, 인간 LAG-3은 기탁 번호 NP_002277의 LAG-3 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 보일 수 있다. % 동일성은 본원에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 제거를 초래하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토킨, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"항원-특이적 T 세포 반응"은 그에 대해 T 세포가 특이적으로 반응하는 항원으로 T 세포를 자극함으로써 발생하는 T 세포에 의한 반응을 의미한다. 항원-특이적 자극시에 T 세포에 의한 반응의 비-제한적인 예는 증식 및 시토킨 생산 (예를 들어, IL-2 생산)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합부") 또는 단일쇄를 포함한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의하여 상호 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, "VH"라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, "VL"이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있으며, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단의 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원 결합부" (또는 간단히 "항체부")는 본원에서 사용되는 바와 같이 항원 (예를 들어, LAG-3 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합부"에 포함되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편 ([FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993)] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역인 나노바디 (nanobody). 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 이루어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 또한, 상기 단일쇄 항체는 용어 항체의 "항원 결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 의미하는 것이다 (예를 들어, 특이적으로 LAG-3에 결합하는 단리된 항체에는 LAG-3을 제외한 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 그러나, LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어, 다른 종으로부터 유래한 LAG-3 분자와의 교차반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 실질적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 존재하지 않을 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 의미이다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유할 경우, 이러한 불변 영역도 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 의미는 아니다.
"인간 모노클로날 항체"라는 용어는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 무한 증식 세포에 융합된, 인간 중쇄 도입유전자 (transgene) 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의하여 생산된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들어, (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대하여 트랜스제닉이거나, 이에 대한 트랜스염색체 (transchromosome)를 갖는 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 생산된 하이브리도마로부터 단리된 항체 (아래에서 상세히 설명함), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합된 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간의 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내에서 돌연변이가 유발될 수 있고 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이가 유발될 수 있고), 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련된 서열이지만 천연적으로는 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 의미한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체와 다른 물질 또는 항체의 접합체를 의미한다.
"인간화 항체"란 용어는 다른 포유동물 종, 예를 들어, 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체를 의미한다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 일어날 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종에서 유래되고 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 LAG-3 단백질 (및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 LAG-3 단백질)에 결합하지만 비-LAG-3 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 의미하는 것이다. 바람직하게는, 항체는 인간 LAG-3 단백질에 "고친화도"로, 즉 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 3 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 단백질 또는 세포"에 실질적으로 결합하지 않는"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 고친화도로 결합하지 않음을, 즉, 단백질 또는 세포에 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD로 결합함을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "K회합" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것인 반면, 본원에 사용된 "K해리" 또는 "Kd"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것이다. 본원에 사용된 "KD"란 용어는, Kd 대 Ka의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 의미하는 것으로서, 몰 농도 (M)로서 표시한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 측정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예를 들어 비아코어(Biacore)® 시스템을 사용하는 방법이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대한 KD값이 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 훨씬 더 바람직하게 1 x 10-9 M 이하인 항체를 지칭하는 것이다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 있어서 다양할 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 항체의 KD 값이 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 10-7 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 경우를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등을 포함하지만, 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하다.
본 발명의 각종 측면은 하기 하위섹션에서 보다 상세하게 설명된다.
특정 기능적 특성을 갖는 항-LAG-3 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 특성에 의해 특징지을 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하고, 다른 특정 종으로부터의 LAG-3, 예를 들어, 원숭이 LAG-3 (예를 들어, 사이노몰거스 원숭이, 붉은털 원숭이)에 결합할 수 있지만, 다른 특정 종으로부터의 LAG-3, 예를 들어, 마우스 LAG-3에는 실질적으로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 LAG-3에게 고친화도로 결합한다.
면역 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 항체의 능력은 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응에서 인터루킨-2 (IL-2) 생산을 자극하는 항체의 능력에 의해 표시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 LAG-3에 결합하고, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 LAG-3에 결합하지만, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 나타내지 않는다. 면역 반응을 자극하는 항체의 능력을 평가하기 위한 다른 수단은 예를 들어 생체 내 종양 이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 항체의 능력 (예를 들어, 실시예 6 참조) 또는 자가면역 반응을 자극하는 항체의 능력, 예를 들어 자가면역 모델에서 자가면역 질병의 발생을 촉진하는 능력, 예를 들어 NOD 마우스 모델에서 당뇨병의 발생을 촉진하는 능력 (예를 들어, 실시예 7 참조)을 포함한다.
LAG-3에 대한 본 발명의 항체의 결합은 당업계에 잘 확립된 하나 이상의 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 항체는 항체가 인간 LAG-3을 발현하는 세포주, 예를 들어 LAG-3 (예를 들어, 인간 LAG-3, 또는 원숭이 LAG-3 (예를 들어, 붉은털 또는 사이노몰거스 원숭이) 또는 마우스 LAG-3)을 그들의 세포 표면 상에 발현하도록 형질감염된 CHO 세포와 반응하는 유동 세포 측정 분석에 의해 시험될 수 있다 (예를 들어, 적합한 분석에 대해서는 실시예 3A 참조). 유동 세포 측정 분석에 사용하기 적합한 다른 세포는 천연 LAG-3을 발현하는 항-CD3-자극된 CD4+ 활성화된 T 세포를 포함한다. 추가로 또는 별법으로, 결합 동역학 (예를 들어, KD 값)을 포함하여 항체의 결합은 비아코어 결합 분석에서 시험될 수 있다 (예를 들어, 적합한 분석에 대해서는 실시예 3B 참조). 또 다른 적합한 결합 분석은 예를 들어 재조합 LAG-3 단백질을 사용하는 ELISA 분석을 포함한다 (예를 들어, 적합한 분석에 대해서는 실시예 1 참조).
바람직하게는, 본 발명의 항체는 LAG-3 단백질에 5 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 2 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 5 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 4 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 3 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 2 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 1 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 5 x 10-10 M 이하의 KD로 결합하거나, LAG-3 단백질에 1 x 10-10 M 이하의 KD로 결합한다.
일반적으로, 본 발명의 항체는 림프 조직, 예를 들어 편도선, 비장 또는 흉선에서 LAG-3에 결합하고, 이것은 면역조직화학에 의해 검출할 수 있다. 추가로, 실시예 8에서 추가로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 특정 항-LAG-3 항체는 면역조직화학에 의해 측정할 때 뇌하수체 조직을 염색하는 (예를 들어, 뇌하수체 내에 보유된다) 반면, 본 발명의 다른 항-LAG-3 항체는 면역조직화학에 의해 측정할 때 뇌하수체 조직을 염색하지 않는다 (예를 들어, 뇌하수체 내에 보유되지 않는다). 따라서, 한 실시양태에서 본 발명은 면역조직화학에 의해 뇌하수체 조직을 염색하는 인간 항-LAG-3 항체를 제공하고, 다른 실시양태에서는 본 발명은 면역조직화학에 의해 뇌하수체 조직을 염색하지 않는 인간 항-LAG-3 항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 예를 들어 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체일 수 있다.
모노클로날 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5
본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특성화된 인간 모노클로날 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5이다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VH 아미노산 서열은 각각 서열 37-42에 제시되어 있다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VK 아미노산 서열은 각각 서열 43-48에 제시되어 있다.
각각의 상기 항체가 인간 LAG-3에 결합할 수 있다면, VH 및 VL 서열은 "혼합 및 매치되어 (mixed and matched)" 본 발명의 다른 항-LAG-3 결합 분자를 생산할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬이 혼합 및 매치되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 유사하게, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되는 것이 바람직하다.
따라서, 한 측면에서, 본원은
(a) 서열 37-42로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 43-48로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은
(a) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VH CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 37-42에 제시된다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VH CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 43-48에 제시된다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VH CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 13-14, GGY 및 16-18에 제시된다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VK CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 19-24에 제시된다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VK CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 25-30에 제시된다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 VK CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 31-36에 제시된다. CDR 영역은 카바트 (Kabat) 시스템을 사용하여 라인으로 표시한다 [Kabat et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242].
각각의 상기 항체가 인간 LAG-3과 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공될 경우, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매치"되어 (즉, 각각의 항체는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유해야 하지만, 상이한 항체로부터 유래된 CDR은 혼합 및 매치될 수 있음), 본 발명의 다른 항-LAG-3 결합 분자를 생산할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 LAG-3 결합은 상기하고 실시예에서 설명되는 결합 분석 (예를 들어, ELISA, 비아코어 분석법)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 유사하게, VL CDR 서열이 혼합 및 매치될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VL 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 모노클로날 항체인 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5에 대해 본원에 개시되어 있는 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생산될 수 있다는 사실은 당업자에게 자명할 것이다.
따라서, 다른 측면에서, 본원은
(a) 서열 1-6으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 7-12로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 13-14, GGY 및 16-18로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 19-24로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 25-30으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 31-36으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 25를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 GGY를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 29를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
(a) 서열 6을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열 30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족 (cognate) 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 여러 항체들을 예측가능하게 생성할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)]; [Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)]; [Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)]; [Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)]; [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)]; [Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996)]; [Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001)]; [Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995)]; [Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998)]; [Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993)]; [Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)] 및 [Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)]을 참조한다. 또한, 미국 특허 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 및 5,760,185을 참조한다. 이들 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
따라서, 본 발명은 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래된 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하고, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 비-인간 항체, 예를 들어, 마우스 또는 래트 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하고, LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 본 발명의 항체는 상응하는 모 비-인간 항체와 (a) 결합을 위해 경쟁할 수 있고/있거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/하거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 항체, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 수득한 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체와 같은 제1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서, 제1 인간 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 제1 인간 항체로부터의 CDR3 도메인은 LAG-3에 대한 결합 특이성이 결여되어 있는 인간 항체 내 CDR3 도메인을 대체함으로써 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 인간 항체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 본 발명의 항체는 상응하는 모 제1 인간 항체와 (a) 결합을 위해 경쟁할 수 있고/있거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/하거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
특정 생식계열 서열을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 3-20 유전자, 인간 VH 4-34 유전자, 인간 VH 3-33 유전자 또는 인간 VH 1-24 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VK L18 유전자, 인간 VK L6 유전자 또는 인간 VK A27 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 3-20 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 인간 VK L18 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 4-34 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 3-33 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 인간 VK A27 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 1-24 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원은 인간 VH 3-33 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.
또한, 상기 항체는 상기 상세하게 설명된 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 인간 LAG-3에 대한 고친화도 결합, 원숭이 LAG-3에 대한 결합, 마우스 LAG-3에 대한 결합의 결여, MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 보유할 수 있다.
각각 VH 3-20 및 VK L18의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는 25E3 항체이다. 각각 VH 4-34 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는 25F7 및 8B7 항체이다. 각각 VH 3-33 및 VK A27의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는 26H10 항체이다. 각각 VH 1-24 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는 11F2 항체이다. 각각 VH 3-33 및 VK L6의 VH 및 VL을 갖는 항체의 예는 17E5 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 항체는 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 특정 생식계열 서열의 "산물"이거나 또는 "그로부터 유도되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지 상에 제시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심있는 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "그로부터 유도되는" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교한 후, 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열을 갖는 (즉, 최대 동일성 %) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "그로부터 유도되는" 인간 항체는 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인하여, 생식계열 서열과 비교하였을 때, 아미노산에 차이가 있을 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 일반적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 쥐 생식계열 서열)에 비교할 때 인간 항체를 인간의 것으로서 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 아미노산 서열이 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일반적으로, 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 보일 수 있다.
상동성 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에서 설명되는 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 항체는 본 발명의 항-LAG-3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공하고, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역은 서열 37-42로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역은 서열 43-48로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;
(c) 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합한다.
추가로 또는 별법으로, 항체는 상기 상세하게 설명된 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 인간 LAG-3에 대한 고친화도 결합, 원숭이 LAG-3에 대한 결합, 마우스 LAG-3에 대한 결합의 결여, MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 보유할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 제시한 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 제시한 서열의 VH 및 VL 영역에 대해서 높은 (즉, 80% 이상의) 상동성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 서열 49-54 또는 55-60을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 코딩되는 변경된 항체를 본원에서 설명되는 기능 분석을 사용하여 보유된 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해서 시험함으로써 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 %는 2개의 서열 사이의 동일성 %와 동등한 것이다. 2개의 서열 사이의 동일성 %는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, 상동성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)로서, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 서열 비교와 2개 서열 사이의 동일성 %의 결정은 아래의 비-제한적인 예에 설명되어 있는 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 이. 메이어 (E. Meyer) 및 더블유. 밀러 (W. Miller)의 알고리즘 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]을 사용하여 결정될 수 있는데, PAM120 가중치 잔기표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 이용한다. 추가로, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 니들만 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch) [J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)] 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 통합되고, 블로섬 (Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용한다.
추가로 또는 별법으로, 본 발명의 단백질 서열은 또한 예를 들어, 관련 서열들을 확인하기 위해 공공 데이타베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 통하여 이루어질 수 있다 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 단어 길이 = 3)을 통하여 수행되고, 이에 의해 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위한 갭 형성 정렬을 얻기 위해서는, 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재되어 있는 바와 같이, Gapped BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에서 설명되는 바람직한 항체 (예를 들어, 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5)에 기초하여 특정 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변형을 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-LAG-3 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 항원 결합능을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형을 형성할 수 있음이 당업계에서 이해된다. 예를 들어, 문헌 [Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8]; [de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41]; [Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870]; [Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12]; [Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35]; [Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6] 및 [Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43]을 참조한다. 따라서, 본원은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 제공하고, 여기서,
(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 13-14, GGY 및 16-18의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 31-36의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고;
(c) 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합한다.
추가로 또는 별법으로, 항체는 상기 상세하게 설명된 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 인간 LAG-3에 대한 고친화도 결합, 원숭이 LAG-3에 대한 결합, 마우스 LAG-3에 대한 결합의 결여, MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 보유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 7-12의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 25-30의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 1-6의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 19-24의 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함한다.
여러 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나, 이를 유의하게 변형시키지 않는 아미노산의 변형을 지칭하는 것이다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규명되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 비대전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 변경된 항체는 본원에서 설명되는 기능 분석을 사용하여 보유하고 있는 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험될 수 있다.
항-LAG-3 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항-LAG-3 모노클로날 항체에 의해 인식되는, 인간 LAG-3 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 (즉, 인간 LAG-3에 대한 결합을 위해 본 발명의 임의의 모노클로날 항체와 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체)를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체는 모노클로날 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5일 수 있다.
그러한 교차-경쟁 항체는 표준 LAG-3 결합 분석에서 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및/또는 17E5과 교차-경쟁하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 LAG-3 단백질이 플레이트 상에 고정되고, 항체 중의 하나가 형광 표지되고, 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 비-표지된 항체의 능력이 평가되는 표준 ELISA 분석이 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 비아코어 분석이 교차-경쟁하는 항체의 능력을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 시험 항체가 예를 들어 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및/또는 17E5의 인간 LAG-3에 대한 결합을 억제하는 능력은, 시험 항체가 인간 LAG-3에 대한 결합을 위해 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및/또는 17E5과 경쟁할 수 있고, 따라서 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및/또는 17E5과 동일한, 인간 LAG-3 상의 에피토프와 결합함을 입증한다. 바람직한 실시양태에서, 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5에 의해 인식되는 것과 동일한, 인간 LAG-3 상의 에피토프와 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 그러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에 설명되어 있는 바와 같이 제조하고 단리할 수 있다.
실시예 3C에 추가로 논의된 바와 같이, 25E3, 25F7 및 8B7의 인간 LAG-3에 대한 결합을 인간 LAG-3의 제1 세포외 도메인 내의 "엑스트라 루프" 영역에 맵핑하였다. 엑스트라 루프 영역은 서열 79에 제시되어 있다. 펩티드 스캔 실험을 사용하여, 25E3의 엑스트라 루프 영역에 대한 결합을 아미노산 서열 PGHPLAPG (서열 76)에 맵핑하고, 25F7의 엑스트라 루프 영역에 대한 결합을 아미노산 서열 HPAAPSSW (서열 77)에 맵핑하고, 8B7의 엑스트라 루프 영역에 대한 결합을 아미노산 서열 PAAPSSWG (서열 78)에 맵핑하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 PGHPLAPG (서열 76)을 포함하는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체를 제공한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 HPAAPSSW (서열 77) 또는 PAAPSSWG (서열 78)을 포함하는 인간 LAG-3의 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체를 제공한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 또한 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 이용하여 제조될 수 있고, 여기서, 변형된 항체는 출발 항체와는 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 2개의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 불변 영역(들) 내에 존재하는 잔기들을 변형시켜 조작함으로써, 예를 들어 항체의 효과기 기능(들)을 변형시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 가변 영역을 조작하기 위해 CDR 그라프팅이 사용될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 존재하는 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 각각의 항체 간에 있어서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 유래된 프레임워크 서열 상에 그라프팅된, 천연에서 생성되는 특정 항체로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조함으로써 천연에서 생성되는 특정 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327]; [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
따라서, 본 발명의 다른 실시양태는 각각 서열 1-6, 서열 7-12, 및 서열 13-14, GGY 및 16-18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 19-24, 서열 25-30, 및 서열 31-36으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는 모노클로날 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하고, 이들 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
상기 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 공개된 참고 문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이타베이스 (인터넷 웹사이트 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능) 및 문헌 [Kabat et al. (1991), 상기 문헌]; [Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836] (이들 각각의 내용은 본원에서 명백하게 참고로 포함된다)에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 Genbank 데이타베이스에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 하기 중쇄 생식계열 서열은 첨부하는 Genbank 기탁 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33 (NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7 (NG_0010109 및 NT_024637). 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 하기 중쇄 생식계열 서열은 첨부하는 Genbank 기탁 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51(NG_0010109 및 NT_024637), 4-34 (NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) 및 3-23 (AJ406678)으로 이용가능하다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 잘 알려진 Gapped BLAST [Altschul et al. (1997), 상기 문헌]로 불리는 서열 유사성 검색 방법 중의 하나를 사용하여 컴파일링된 단백질 서열 데이타베이스에 대해 비교한다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조상 유사한 것, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 사용되는 VH 3-20 (서열 69), VH 4-34 (서열 61), VH 3-33 (서열 65) 또는 VH 1-24 프레임워크 서열 (서열 73) 및/또는 VK L18 (서열 71), VK L6 (서열 63) 또는 VK A27 프레임워크 서열 (서열 67) 프레임워크 서열과 유사한 것이다. VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 그로부터 프레임워크 서열이 유도되는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 항체의 항원 결합능을 유지하거나 향상시키기 위하여 프레임워크 영역 내에서 잔기를 돌연변이시키는 것이 유리하다고 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심있는 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심있는 다른 기능적 특성은 본원에 기술되어 있는 것과 같이, 그리고 실시예에서 제공되는 것과 같이 시험관 내 또는 생체 내 분석으로 평가될 수 있다. 바람직하게는, (상기 논의되어 있는 바와 같은) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 치환이 바람직하다. 또한, 일반적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1-6으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 1-6과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열 7-12로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 7-12와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열 13-14, GGY 및 16-18로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 13-14, GGY 및 16-18과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열 19-24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 19-24와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열 25-30으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 25-30과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 서열 31-36으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 31-36과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-LAG-3 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합부를 제공한다.
본 발명의 조작된 항체는 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기를 변형시켜, 예를 들어 항체의 특성을 개선하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 방법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이 (backmutation)"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 그로부터 유도되는 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 그로부터 유도되는 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
예를 들어, 표 A는 프레임워크 영역 아미노산 위치 (카바트 넘버링 시스템 사용)가 생식계열과 상이한 영역을 보여주고, 상기 위치가 나타낸 치환에 의해 생식계열로 복귀 돌연변이되는 방식을 보여준다.
[표 A]
Figure pat00001
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 방법도 "탈면역화 (deimmunization)"로 불리며, 미국 특허 공개 20030153043에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가로, 또는 그에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 일반적으로 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티를 항체에 부착시킬 수 있다), 그의 글리코실화를 변경시키고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위하여 변형될 수 있다. 각각의 상기 실시양태는 아래에 보다 상세하게 설명된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 내의 위치 228에 대응하는 위치에 세린의 프롤린으로의 돌연변이 (S228P; EU 인덱스)를 포함하는 IgG4 이소형 항체이다. 상기 돌연변이는 힌지 영역 내의 중쇄 내 디술피드 다리의 불균일성을 없애는 것으로 보고되었다 (Angal et al., 상기 문헌; 위치 241은 카바트 넘버링 시스템을 기초로 한다). 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체는 문헌 [Angal et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 위치 241에 대응하는 위치의 세린이 프롤린으로 돌연변이된 인간 IgG4 불변 영역에 연결된 25F7 (서열 37) 또는 26H10 (서열 38)의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 인간 IgG4 불변 영역에 연결된 25F7 및 26H10 중쇄 가변 영역에서, 상기 돌연변이는 EU 인덱스에 의한 S228P 돌연변이에 대응한다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 변형되어 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어, 증가 또는 감소된다. 이러한 방법에 관하여는 미국 특허 5,677,425에 보다 상세히 설명되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 또는 중쇄의 조립을 촉진하거나, 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 돌연변이되어 항체의 생물학적 반감기를 감소시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A (SpA) 결합에 비하여 손상된 SpA 결합을 나타내게 된다. 이러한 방법은 미국 특허 6,165,745에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 변형되어 그의 생물학적 반감기가 증가할 수 있다. 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,277,375에 설명되어 있는 바와 같이, 다음 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 항체는 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022에 기재되어 있는 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 부위 내에서 변형될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대한 친화도는 변경되지만 모 항체의 항원 결합능은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 그에 대한 친화도가 변경된 효과기 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 폐지된 보체 의존 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 6,194,551에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 이러한 방법은 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
추가의 또 다른 예에서, Fc 영역은 항체가 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/시키거나, 다음 위치의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형될 수 있다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 방법은 PCT 공개 WO 00/42072에 추가로 상세하게 설명되어 있다. 게다가, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 위치는 이미 맵핑되어 있으며, 결합이 개선된 변이체가 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서 발생한 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 다음 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 생산될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여된다). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 만드는 하나 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
추가로 또는 별법으로, 글리코실화 유형이 변경된 항체, 예를 들어, 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNAc 구조가 증가한 항체가 생산될 수 있다. 이와 같이 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 글리코실화가 변경된 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (α(1,6)푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체의 탄수화물에 푸코스가 존재하지 않는다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내의 FUT8 유전자를 표적 파괴하여 생산되었다 (미국 특허 공개 20040110704 및 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195에는 FUT8 유전자가 기능상 붕괴된 세포주가 설명되어 있고, 상기 유전자는 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거하여 저푸코실화된다. 또한, EP 1,176,195에는 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮은 세포주, 또는 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)이 기재되어 있다. PCT 공개 WO 03/035835에는 푸코스를 Asn(297)-연결 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 이 숙주 세포에서 발현된 항체를 저푸코실화시키는 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). 또한, 변형된 글리코실화 프로필을 갖는 항체는 PCT 공개 WO 06/089231에 기재된 바와 같이 계란에서 생산될 수 있다. 별법으로, 변형된 글리코실화 프로필을 갖는 항체는 식물 세포, 예를 들어 렘나 (Lemna)에서 생산될 수 있다. 식물계에서 항체를 생산하는 방법은 2006년 8월 11일 출원된 알스톤 & 버드 (Alston & Bird LLP) 대리인 참조 번호 040989/314911에 대응하는 미국 특허 출원에 개시되어 있다. PCT 공개 WO 99/54342에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 세포주를 조작하여, 조작된 세포주 내에서 발현된 항체의 이분화 GlcNAc 구조가 증가하도록 만들고, 이에 의해 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것이 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 별법으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단 제거할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 [Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23].
본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 peg화 (pegylation)가 있다. 항체는 peg화되어, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 peg화하기 위해, 일반적으로 항체 또는 그의 단편을, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서 PEG, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게는, peg화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 의미이다. 특정 실시양태에서, peg화되는 항체는 비리코실화된 항체이다. 단백질을 peg화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
항체 물리적 특성
본 발명의 항체는 그의 상이한 클래스의 검출 및/또는 구별을 위한 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
본원의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에 하나 이상의 글리코실화를 함유할 수 있다. 상기 글리코실화 부위는 항체의 면역원성을 증가시키거나 변경된 항원 결합에 의한 pK의 변경을 야기할 수 있다 ([Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702]; [Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94]; [Wallick et al. (1988) J Exp Med 168:1099-109]; [Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R]; [Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7]; [Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706]). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 일어나는 것으로 알려져 있다. 몇몇 예에서, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-LAG-3 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 가변 영역 내에 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택하거나, 글리코실화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아스파라긴 이성체화 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 나타날 수 있고, 폴리펩티드 사슬 내에 꼬인 구조 (kink)를 도입하고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔기를 생성한다 (이소아스파르트산 효과).
각각의 항체는 특유한 등전점 (pI)을 가질 것이고, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위에 해당한다. IgG1 항체에 대한 pI는 일반적으로 7-9.5의 pH 범위에 해당하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 해당한다. 정상 범위를 벗어난 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에 약간의 언폴딩 (unfolding) 및 불안정성을 가질 수 있는 것으로 추측된다. 따라서, 정상 범위에 해당하는 pI 값을 갖는 항-LAG-3 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택하거나, 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다.
각각의 항체는 특징적인 융점을 가질 것이고, 여기서 보다 높은 융점은 생체 내에서 보다 큰 전체 안정성을 나타낸다 (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 일반적으로, TM1 (초기 언폴딩 온도)이 60℃를 초과하는, 바람직하게는 65℃를 초과하는, 훨씬 더 바람직하게는 70℃를 초과하는 것이 바람직하다. 항체의 융점은 시차 주사 열량분석법 ([Chen et al. (2003) Pharm Res 20: 1952-60]; [Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52]) 또는 원편광 이색성 (circular dichroism) (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 이용하여 측정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 빠르게 분해하지 않는 항체가 선택된다. 항체의 분해는 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정할 수 있다 (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 불리한 약동학적 특성을 촉발할 수 있는 응집 효과가 최소인 항체가 선택된다. 일반적으로, 응집이 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 15% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5% 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기 배제 컬럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 광 산란을 포함한 몇 가지 기술에 의해 측정할 수 있다.
항체의 조작 방법
상기 논의한 바와 같이, 본원에 개시되는 VH 및 VL 서열을 갖는 항-LAG-3 항체는 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 항-LAG-3 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체, 예를 들어 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5의 구조적 특징은 인간 LAG-3에 대한 결합과 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조상 관련된 항-LAG-3 항체를 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5, 또는 그의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 결합되어, 상기 논의한 바와 같이 추가의 재조합 방식으로 조작된 본 발명의 항-LAG-3 항체를 생성할 수 있다. 다른 종류의 변형은 선행 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 (즉, 단백질로서 발현하는) 것은 필요하지 않다. 대신에, 서열(들)에 함유된 정보는 원래의 서열(들)로부터 유래되는 "제2 세대" 서열(들)을 생성하기 위해 출발 물질로서 사용되고, 이어서 "제2 세대" 서열(들)이 제조되고 단백질로서 발현된다.
따라서, 다른 실시양태에서, 본원은
(a) (i) 서열 1-6으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 7-12로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열, 및/또는 서열 13-14, GGY 및 16-18로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 19-24로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 25-30으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열, 및/또는 서열 31-36으로 구성되는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성시키고;
(c) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 것
을 포함하는, 항-LAG-3 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열을 제조하고 발현시키기 위해 표준 분자 생물학 기술이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에서 설명되는 항-LAG-3 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 갖는 것이고, 상기 기능적 특성은 (i) 인간 LAG-3에 대한 고친화도 결합, (ii) 원숭이 LAG-3에 대한 결합, (iii) 마우스 LAG-3에 대한 결합의 결여, (iv) MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 (v) 면역 반응 (항원-특이적 T 세포 반응)을 자극하는 능력을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에서 이용가능하고/하거나 본원에서 설명되는 표준 분석, 예를 들어 실시예에 기재된 것을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체를 조작하는 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-LAG-3 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-LAG-3 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 설명되는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에서 설명되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 및 WO 03/074679 참조).
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포 내에, 세포 용해물 내에, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼린/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법을 포함한 표준 기술에 의해 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게" 된다 ([Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조). 본 발명의 핵산은 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 아래에 더욱 설명하는 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체에 대해, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체에 대해 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 이용하여), 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 및 17E5 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것이다. 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 및 17E5의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 서열 49-54에 제시한다. 25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2 및 17E5의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 서열 55-60에 제시한다.
일단 VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 수득하면, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 본 측면에서 사용될 때 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인 프레임 (in-frame)으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat et al. (1991), 상기 문헌] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat et al., 상기 문헌] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL 서열이 인접한 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554] 참조).
본 발명의 모노클로날 항체의 생산
본 발명의 모노클로날 항체 (mAb)는 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 공지의 체세포 혼성화 (하이브리도마) 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 모노클로날 항체 생산을 위한 다른 실시양태는 B 림프구의 바이러스 또는 종양유전자 형질전환 및 파지 디스플레이 기술을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 구체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 인간 LAG-3에 대해 작용하는 그러한 인간 모노클로날 항체는 마우스계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®로 칭하는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로서 총칭한다.
HuMAb 마우스® (메다렉스®, 인크. (Medarex®, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 사슬 로커스를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니로커스를 함유한다 (예를 들어, [Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입유전자가 클래스 스위칭 (switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날 항체를 생성한다 ([Lonberg et al. (1994), 상기 문헌]; [Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93] 및 [Harding and Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스®의 제조 및 용도, 및 그러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 ([Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; [Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591]; 및 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] (이 모두의 내용은 전체가 본원에 참고로 구체적으로 포함된다)에 추가로 설명된다. 추가로, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429; 및 5,545,807; PCT 공개 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884, WO 99/45962 및 WO 01/14424를 참조한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 도입유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 도입유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이 마우스는 본원에서 "KM 마우스®"로 칭하고, PCT 공개 WO 02/43478에 상세히 기재되어 있다. 내인성 FcγRIIB 수용체 유전자의 동형접합 파괴 (homozygous disruption)를 추가로 포함하는 상기 마우스의 변형된 형태도 PCT 공개 WO 02/43478에 기재되어 있고, 본원에서 "KM/FCGR2D 마우스®"로 언급된다. 또한, HCo7 또는 HCo12 중쇄 도입유전자 또는 둘 모두를 갖는 마우스도 사용될 수 있다.
추가의 트랜스제닉 동물 실시양태는 제노마우스 (Xenomouse) (압제닉스 인크. (Abgenix, Inc.), 미국 특허 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963)를 포함한다. 추가의 실시양태는 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 모두 보유하는 "TC 마우스" (Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727) 및 소 (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894; PCT 공개 WO 02/092812)를 포함한다. 상기 특허 및 공개문의 내용은 그 전문이 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908; 5,580,717; 5,969,108;6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 및 6,593,081을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시에 인간 항체 반응이 일어날 수 있도록 인간 면역 세포를 그 내부로 재구성시킨 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,476,996 및 5,698,767을 참조한다.
다른 실시양태에서, 인간 항-LAG-3 항체는 파지가 사전에 LAG-3으로 면역화된 트랜스제닉 동물에서 생성되는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 파지 디스플레이를 사용하여 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 HuMab, KM, 또는 키린 (Kirin) 마우스이다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,794,132을 참조한다.
인간 Ig 마우스의 면역화
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 Ig 마우스는 LAG-3 항원, 재조합 LAG-3 단백질, 또는 LAG-3 단백질을 발현하는 세포의 정제된 또는 농축된 제제로 면역화시킬 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Lonberg et al. (1994), 상기 문헌]; [Fishwild et al. (1996), 상기 문헌]; 및 PCT 공개 WO 98/24884 및 WO 01/14424를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 6-16주령의 마우스를 5-50 ㎍의 LAG-3 단백질로 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 비-LAG-3 폴리펩티드에 융합된 LAG-3의 부분을 사용한다.
한 실시양태에서, 트랜스제닉 마우스는 처음에 완전 프로인트 (Freund) 어쥬번트 (adjuvant) 중의 LAG-3 항원을 사용하여 복강 내로 (IP) 또는 정맥 내로 (IV) 면역화시킨 후, 불완전 프로인트 어쥬번트 중의 항원을 사용하여 IP 또는 IV 면역화시킨다. 다른 실시양태에서, 프로인트 이외의 다른 어쥬번트 또는 어쥬번트의 부재 하의 전체 세포가 사용된다. 혈장은 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있고, 충분한 역가의 항-LAG-3 인간 면역글로불린을 갖는 마우스로부터의 세포를 융합을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 무한 증식 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 하이브리도마의 생성은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York]을 참조한다.
본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]). 한 실시양태에서, 표준 분자 생물학 기술에 의해 얻은 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 하나 이상의 발현 벡터 내로 삽입한다. 본 문맥에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하도록 의도된다.
용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 (enhancer) 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기재되어 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한 추가로, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복으로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원으로부터의 서열들로 이루어진 조절 요소 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)를 사용할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일한 또는 별개의 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 가변 영역은, VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인 프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 일반적으로, 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 대해 약물, 예를 들어 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위해)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA의 도입을 위해 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포 내에서 항체 발현이 가장 바람직하고, 이는 그러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩된 (folded) 면역학상 활성 항체를 조립하고 분비하기가 더 쉽기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재되어 있는 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기 위해 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
항원에 대한 항체 결합의 특징화
본 발명의 항체는 예를 들어, 표준 ELISA에 의해 인간 LAG-3에 대한 결합에 대해 시험할 수 있다. 항-LAG-3 인간 IgG은 웨스턴 블로팅에 의해 LAG-3 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 결합 특이성은 LAG-3 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을, 예를 들어, 유동 세포 측정에 의해 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988), 상기 문헌]을 참조한다.
면역접합체
본 발명의 항체는 치료제에 접합되어 면역접합체, 예를 들어 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항대사물질, 알킬화제, DNA 소구 (minor groove) 결합제, DNA 삽입체 (intercalator), DNA 가교결합제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵외 유출 (nuclear export) 억제제, 프로테아좀 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 쇼크 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항-유사분열제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 절단가능한 링커, 예를 들어 펩티딜, 디술피드, 또는 히드라존 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 펩티딜 링커, 예를 들어 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열 15), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu이다. ADC는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공개 20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
이중특이적 분자
다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하는 항-LAG-3 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 따라서 본원에서 사용되는 바와 같이 "이중특이적 분자"는 3 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 분자는 LAG-3에 대한 제1 결합 특이성 및 LAG-3 발현 표적 세포를 발현하는 사멸시킬 수 있는 세포독성 효과기 세포를 동원하는 촉발 분자에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 적합한 촉발 분자의 예는 CD64, CD89, CD16, 및 CD3이다. 예를 들어, 문헌 [Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004)]을 참조한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-LAG-3 결합 특이성에 추가로 제3 특이성을 갖는다. 제3 특이성은 항-증진 인자 (EF), 예를 들어, 세포독성 활성에 관여되는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자에 대한 것이다. 예를 들어, 항-증진 인자는 세포독성 T-세포 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 또는 ICAM-1를 통해), 또는 다른 면역 세포에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
이중특이적 분자는 많은 상이한 형식 및 크기로 존재할 수 있다. 크기 범위의 한 한계치에서, 이중특이적 분자는 전통적인 항체 형식을 유지하되, 동일한 특이성의 두 결합 아암을 갖는 대신에, 각각 상이한 특이성의 두 결합 아암을 갖는다. 다른 극단에는, 펩티드 사슬에 의해 연결된 2개의 단일쇄 항체 단편 (scFv)으로 구성된 이중특이적 분자, 즉 Bs(scFv)2 구성체가 존재한다. 중간 크기의 이중특이적 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 2개의 상이한 F(ab) 단편을 포함한다. 상기 형식 및 다른 형식의 이중특이적 분자는 유전공학, 체세포 혼성화, 또는 화학적 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kufer et al., 상기 문헌]; [Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998)]; 및 [van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000)], 및 여기에 인용된 참고문헌 참조).
제약 조성물
다른 측면에서, 본원은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된 본원의 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 임의로 하나 이상의 추가의 제약상 활성 성분, 예를 들어 또 다른 항체 또는 약물을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어 다른 면역자극제, 항암제, 항바이러스제, 또는 백신 (항-LAG-3 항체가 백신에 대한 면역 반응을 증진시키도록)과 조합 요법으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 농후제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 조제, 가용화제, 착색제, 방향제, 코팅, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장성 물질, 및 그의 조합물을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 개시되어 있다.
바람직하게는, 제약 조성물은 정맥내, 근내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여를 위해 적합하다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해). 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질 내에 코팅될 수 있다. 구문 "비경구 투여"는 본원에서 사용될 때 대체로 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 별법으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로로, 예를 들어, 비내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소로 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 제약상 허용되는 염의 형태일 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 나타내지 않는 염을 나타낸다. 그러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 무독성 무기산, 예를 들어, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래하는 것과 무독성 유기산, 예를 들어, 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래하는 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래하는 것과 무독성 유기 아민, 예를 들어, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래하는 것을 포함한다
제약 조성물은 멸균 수성 용액 또는 분산액 형태로 존재할 수 있다. 이들은 또한 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 (ordered) 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이고, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 제약상 허용되는 담체와 조합될 때 100% 중의 상기 양은 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분일 것이다.
투약 방법은 최적 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스 (bolus)가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 치료 상황의 응급성이 나타내는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여 용이함 및 투약의 균일성을 위해 투약 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 투약 단위형은 본원에서 사용될 때 치료할 대상체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 단위를 나타내고; 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 요구되는 제약학적 담체와 함께 함유한다. 별법으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다.
항체의 투여를 위해, 용량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 대체로 0.01 내지 5 mg/kg (숙주 체중) 범위이다. 예를 들어, 용량은 0.3 mg/kg (체중), 1 mg/kg (체중), 3 mg/kg (체중), 5 mg/kg (체중) 또는 10 mg/kg (체중)일 수 있거나, 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 방식은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 매달 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 항-LAG-3 항체에 대한 바람직한 투여 방식은 정맥내 투여를 통해 1 mg/kg (체중) 또는 3 mg/kg (체중)로 투여하는 것을 포함하고, 여기에서, 항체는 다음 투여 스케줄 중 하나를 이용하여 제공된다: (i) 4주마다 6회 용량에 대해, 이어서, 3개월마다; (ii) 3주마다 투여; (iii) 3 mg/kg (체중)으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg (체중). 일부 방법에서, 용량은 약 1-1000 ㎍/ml, 일부 방법에서는 약 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
본 발명의 항-LAG-3 항체의 "치료 유효 용량"은 바람직하게는 질병 증상의 심도 감소, 질병 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속 기간 증가, 또는 질병 이환으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 일으킨다. 예를 들어, 종양 보유 대상체의 치료를 위해, "치료 유효 용량"은 바람직하게는 비처리 대상체에 비해 종양 성장을 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 치료 유효량의 치료 화합물은 일반적으로 인간이거나 다른 포유동물일 수 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 달리 증상을 개선할 수 있다.
제약 조성물은 제어 방출 제형, 예를 들어 임플란트 (implant), 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달계일 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
치료 조성물은 (1) 무바늘 피하 주사 장치 (예를 들어, US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프 (US 4,487,603); (3) 경피 장치 (US 4,486,194); (4) 주입 장치 (US 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 장치 (US 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료 장비를 통해 투여될 수 있고, 상기 언급된 특허의 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로지르도록 보장하기 위해, 이들을 리포좀 내에 제형화할 수 있고, 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로의 선택적 수송을 향상시키는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]; [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]; [Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134]; [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]; [Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; 및 [Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조).
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 예를 들어 LAG-3의 검출 또는 LAG-3의 차단에 의한 면역 반응의 향상을 포함하는, 많은 시험관내 및 생체내 효용성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 이들 분자는 다양한 상황에서 면역원을 향상시키기 위해 배양액 내에서, 시험관 내에서 또는 생체 외에서 세포에, 또는 인간 대상체에게, 예를 들어, 생체 내에서 투여될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합부를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 반응은 향상되거나, 자극되거나 또는 상향조절된다.
바람직한 대상체는 면역 반응의 향상을 필요로 하는 인간 환자를 포함한다. 방법은 면역 반응 (예를 들어, T-세포 매개된 면역 반응)을 증진시킴으로써 치료될 수 있는 질환이 있는 인간 환자를 치료하기 위해 특히 적합하다. 특정 실시양태에서, 방법은 생체 내에서 암의 치료에 특히 적합하다. 면역성의 항원-특이적 향상을 달성하기 위해서, 항-LAG-3 항체는 목적하는 항원과 함께 투여될 수 있거나 또는 항원이 이미 치료할 대상체 (예를 들어, 종양 보유 또는 바이러스 보유 대상체)에 존재할 수 있다. LAG-3에 대한 항체를 다른 물질과 함께 투여할 때, 2가지 물질은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 항체 또는 그의 일부와 인간 LAG-3 사이에서 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 샘플 및 대조 샘플을 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 인간 LAG-3 항원의 존재를 검출하거나 인간 LAG-3 항원의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공한다. 이어서, 복합체 형성이 검출되고, 여기서 대조 샘플에 비해 샘플 사이의 복합체 형성 차이는 샘플 내에 인간 LAG-3 항원의 존재를 표시한다. 또한, 본 발명의 항-LAG-3 항체는 면역친화도 정제를 통해 인간 LAG-3을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
또한, MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하고 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 본 발명의 항-LAG-3 항체의 능력을 고려할 때, 본 발명은 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하거나 향상시키거나 상향조절하기 위해 본 발명의 항체를 시험관 내에서 및 생체 내에서 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 상기 T 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 항원-특이적 T 세포 반응의 임의의 적합한 표지자는 항원-특이적 T 세포 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 적합한 표지자의 비-제한적인 예는 항체의 존재 하의 T 세포 증식 및/또는 항체의 존재 하의 시토킨 생산의 증가를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항원-특이적 T 세포에 의한 인터루킨-2 생산이 자극된다.
또한, 본 발명은 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)이 자극되도록 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 종양 보유 대상체이고, 종양에 대한 면역 반응이 자극된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상체는 바이러스 보유 대상체이고, 바이러스에 대한 면역 반응이 자극된다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양의 성장이 대상체에서 억제되도록 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염이 대상체에서 치료되도록 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 방법은 아래에서 보다 상세하게 논의된다.
암
항체에 의한 LAG-3의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 암성 종양의 성장이 억제되도록 항-LAG-3 항체를 사용하여 생체 내에서 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 항-LAG-3 항체는 단독으로 암성 종양의 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 항-LAG-3 항체는 아래에서 설명되는 바와 같이 다른 면역원성 물질, 표준 암 치료제, 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 항-LAG-3 항체 또는 그의 항원 결합부를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-LAG-3 항체 (예를 들어 본원에 기재된 임의의 인간 항-인간 LAG-3 항체)이다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항-LAG-3 항체일 수 있다.
그의 성장이 본 발명의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 바람직한 암은 일반적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위해 바람직한 암의 비-제한적인 예는 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암 (예를 들어 투명세포 암종), 전립선암 (예를 들어 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장암 및 폐암 (예를 들어 비-소세포 폐암)을 포함한다. 추가로, 본 발명은 그의 성장이 본 발명의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 불응성 또는 재발성 악성종양을 포함한다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위 암, 위암, 고환암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 (Hodgkin) 병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 아동의 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관의 암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추축 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 선종, 카포시 (Kaposi) 육종, 표피양 암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경 유발암, 예를 들어 석면에 의해 유발되는 암, 및 상기 암의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).
임의로, LAG-3에 대한 항체는 면역원성 물질, 예를 들어 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 시토킨을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적인 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예를 들어 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토킨 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다 (아래에서 추가로 논의됨).
인간에서, 일부 종양, 예를 들어 흑색종은 면역원성인 것으로 밝혀졌다. LAG-3 차단에 의해 T 세포 활성화의 역치를 상승시킴으로써, 숙주에서의 종양 반응이 활성화될 수 있다.
LAG-3 차단은 백신 접종 프로토콜과 조합될 때 보다 효과적인 것으로 보인다. 종양에 대한 백신 접종을 위한 많은 실험상 전략이 고안되었다 ([Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62]; [Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302]; [Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428]; [Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738] 참조; 또한 [Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition] 참조). 상기 전략 중의 하나에서, 백신은 자가 또는 동종이계 종양 세포를 사용하여 제조된다. 상기 세포 백신은 GM-CSF를 발현하도록 종양 세포가 형질도입될 때 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. GM-CSF는 종양 백신 접종을 위한 항원 제시의 잠재적인 활성제로 밝혀졌다 (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).
다양한 종양에서 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구를 통해 소위 종양 특이적 항원에 대한 정의를 확립하였다 (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). 많은 경우에, 이들 종양 특이적 항원은 종양 및 그로부터 종양이 발생한 세포에서 발현되는 분화 항원, 예를 들어 멜라닌세포 항원 gp100, MAGE 항원, 및 Trp-2이다. 보다 중요하게는, 많은 상기 항원은 숙주에서 발견되는 종양 특이적 T 세포의 표적인 것으로 밝혀질 수 있다. LAG-3 차단은 단백질에 대한 면역 반응을 생성시키기 위해서 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 컬렉션 (collection)과 함께 사용될 수 있다. 상기 단백질은 자가 항원으로서 면역계에 의해 정상적으로 인식되고, 따라서 이들에 대해 관용성이다. 종양 항원은 단백질 텔로머라제를 포함할 수 있고, 이것은 염색체의 텔로미어 (telomere)의 합성에 필요하고 85% 초과의 인간 암에서 및 단지 제한된 수의 체세포 조직에서 발현된다 (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013) (상기 체세포 조직은 다양한 수단에 의해 면역 공격으로부터 보호될 수 있다). 또한, 종양 항원은 단백질 서열을 변경하거나 또는 2개의 관련되지 않은 서열 사이의 융합 단백질 (즉, 필라델피아 (Philadelphia) 염색체 내의 bcr-abl), 또는 B 세포 종양으로부터의 개별특이형을 생성시키는 체세포 돌연변이 때문에 암 세포에서 발현되는 "신생-항원"일 수 있다.
다른 종양 백신은 인간 암에 관련되는 바이러스, 예를 들어 인간 유두종 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스 (KHSV)로부터의 단백질을 포함할 수 있다. LAG-3 차단과 함께 사용될 수 있는 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체로부터 단리된 정제된 열 쇼크 단백질 (HSP)이다. 상기 열 쇼크 단백질은 종양 세포로부터의 단백질의 단편을 함유하고, 상기 HSP는 종양 면역성을 유발하기 위해 항원 제시 세포로의 전달시에 매우 효율적이다 ([Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588]; [Tamura et al. (1997) Science 278:117-120]).
수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 반응을 촉발하기 위해 사용될 수 있는 효능있는 항원 제시 세포이다. DC는 생체 외에서 생산되고, 다양한 단백질 및 펩티드 항원 및 종양 세포 추출물이 부가될 수 있다 (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). 또한, DC는 상기 종양 항원을 발현하기 위해서 유전적 수단에 의해 형질도입될 수 있다. 또한, DC는 면역화를 위해 종양 세포에 직접 융합되었다 (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신 접종 방법으로서, DC 면역화는 보다 효능있는 항-종양 반응을 활성화하기 위해 LAG-3 차단과 효과적으로 조합될 수 있다.
LAG-3 차단은 또한 표준 암 치료와 조합될 수 있다. LAG-3 차단은 화학치료 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이 경우에, 투여되는 화학치료 시약의 투여량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 그러한 조합의 예는 항-LAG-3 항체와 흑색종의 치료를 위한 데카르바진의 조합이다. 그러한 조합의 다른 예는 항-LAG-3 항체와 흑색종의 치료를 위한 인터루킨-2 (IL-2)의 조합이다. LAG-3 차단과 화학요법제의 조합 사용을 위한 과학적인 근거는 세포 사멸, 즉 대부분의 화학치료 화합물의 세포독성 작용의 결과가 항원 제시 경로 내의 종양 항원의 수준을 증가시켜야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통해 LAG-3 차단과 상승작용을 보일 수 있는 다른 조합 요법은 방사선 조사, 수술 및 호르몬 제한이다. 각각의 상기 프로토콜은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성시킨다. 또한, 혈관신생 억제제가 LAG-3 차단과 조합될 수 있다. 혈관신생을 억제하면, 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로 내로 공급할 수 있는 종양 세포 사멸이 유도된다.
LAG-3 차단 항체는 또한 Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 효과기 세포를 종양 세포에 대해 표적화하는 이중특이적 항체와 조합으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체는 2개의 별개의 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 수용체/항 종양 항원 (예를 들어, Her-2/neu) 이중특이적 항체가 포식세포를 종양 부위에 대해 표적화하기 위해 사용되었다. 상기 표적화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화시킬 수 있다. 상기 반응의 T 세포 아암은 LAG-3 차단의 사용에 의해 증가할 것이다. 별법으로, 항원은 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중특이적 항체의 사용에 의해 DC에 직접 전달될 수 있다.
종양은 매우 다양한 메카니즘에 의해 숙주 면역 감시를 피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 불활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들 단백질은 특히 TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 각각의 상기 엔티티 (entity)에 대한 항체는 면역억제제의 효과를 상쇄하고 숙주에 의한 종양 면역 반응에 도움을 주기 위해 항-LAG-3과 조합으로 사용될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키는 다른 항체가 항-LAG-3과 조합으로 사용될 수 있다. 이들은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화시키는 수지상 세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대체할 수 있고 (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478), LAG-3 항체와 함께 사용될 수 있다 (Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). T 세포 동시자극 분자, 예를 들어 CTLA-4 (예를 들어, 미국 특허 5,811,097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)), 및 ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)에 대한 활성화 항체도 증가된 수준의 T 세포 활성화를 제공할 수 있다.
골수 이식은 조혈 기원의 다양한 종양의 치료를 위해 현재 사용되고 있다. 이식편 대 숙주 질병이 상기 치료의 결과로 발생하지만, 치료 이익을 이식편 대 종양 반응으로부터 얻을 수 있다. 공여체의 그라프팅된 종양 특이적 T 세포의 효과를 증가시키기 위해 LAG-3 차단이 사용될 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포의 생체외 활성화 및 팽창 및 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위한 상기 세포의 수여체 내로의 입양 (adoptive) 전달을 수반하는 몇몇 실험적 치료 프로토콜이 존재한다 (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). 또한, 상기 방법은 감염성 물질, 예를 들어 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 항-LAG-3 항체의 존재 하에서의 생체외 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 수 있다.
감염성 질병
본 발명의 다른 방법은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 대상체가 감염성 질병에 대해 치료되도록 대상체에게 항-LAG-3 항체 또는 그의 항원 결합부를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염성 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-인간 LAG-3 항체 (예를 들어 본원에 기재된 임의의 인간 항-LAG-3 항체)이다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 논의된 바와 같이 종양에 대한 그의 적용에 유사하게, 항체 매개된 LAG-3 차단은 병원체, 독소 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 단독으로 또는 어쥬번트로서 백신과 조합으로 사용될 수 있다. 상기 치료 방법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 그에 대해 통상적인 백신이 완전한 효과 미만의 효과를 나타내는 병원체를 포함한다. 이들은 HIV, 간염 (A, B & C), 인플루엔자, 헤르페스 (Herpes), 지아르디아 (Giardia), 말라리아, 리슈만편모충 (Leishmania), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. LAG-3 차단은 감염 과정에 걸쳐 변경된 항원을 제시하는 HIV와 같은 물질에 의한 확립된 감염에 대해 특히 유용하다. 이들 신규한 에피토프는 항-인간 LAG-3 투여 시에 외래물질로서 인식되고, 따라서 LAG-3을 통한 음성 신호에 의해 약화되지 않는 강한 T 세포 반응을 일으킨다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염 (A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 세균의 일부 예는 클라미디아, 리케차 세균, 항산성균, 포도구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 수막구균 및 임질구균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 간균, 콜레라, 파상풍, 보툴리눔독소증, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증 및 라임 (Lymes) 병 세균을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다 (Candida) (알비칸스 (albicans), 크루세이 (krusei), 글라브라타 (glabrata), 트로피칼리스 (tropicalis) 등), 크립토코커스 네오프르만스 (Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스 (Aspergillus) (푸미가투스 (fumigatus), 니게르 (niger) 등), 게누스 무코랄레스 (Genus Mucorales) (무코르 (mucor), 압시디아 (absidia), 리조푸스 (rhizopus)), 스포로트릭스 센키이 ( Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 코시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 감염을 일으키는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이 (Balantidium coli), 나에글레리아포울레리 (Naegleriafowleri), 아칸타모에바 (Acanthamoeba) 종, 지아르디아 람비아 (Giardia lambia), 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 종, 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 니포스트롱길루스 브라실리엔시스 (Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 모든 방법에서, LAG-3 차단은 다른 형태의 면역요법, 예를 들어 시토킨 치료 (예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 향상된 제시를 제공하는 이중특이적 항체 요법과 조합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
자가면역 반응
항-LAG-3 항체는 자가면역 반응을 일으키고 증폭시킬 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩티드 백신을 사용한 항-종양 반응의 유도로 많은 항-종양 반응이 항-자가 반응성을 수반함을 밝혔다 ([van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489]; [Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987]; [Hurwitz, (2000) 상기 문헌]; [Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1):81-4]). 따라서, 질병 치료를 위해 이들 자가 단백질에 대한 면역 반응을 효과적으로 생성하도록 백신 접종 프로토콜을 고안하기 위해 항-LAG-3 차단을 다양한 자가 단백질과 함께 사용하는 것을 고려하는 것이 가능하다. 예를 들어, 알츠하이머 (Alzheimer) 병은 뇌에서 아밀로이드 침적물 내에 Aβ 펩티드의 부적절한 축적을 수반하고; 아밀로이드에 대한 항체 반응은 이들 아밀로이드 침적물을 제거할 수 있다 (Schenk et al. (1999) Nature 400: 173-177).
알레르기 및 천식의 치료를 위한 IgE, 및 류마티스성 관절염을 위한 TNFα와 같은 다른 자가 단백질이 또한 표적으로서 사용될 수 있다. 마지막으로, 다양한 호르몬에 대한 항체 반응이 항-LAG-3 항체의 사용에 의해 유도될 수 있다. 생식 호르몬에 대한 중화 항체 반응은 피임을 위해 사용될 수 있다. 특정 종양의 성장을 위해 요구되는 호르몬 및 다른 가용형 인자에 대한 중화 항체 반응이 또한 가능한 백신 접종 표적으로서 간주될 수 있다.
항-LAG-3 항체의 사용을 위한 상기한 바와 유사한 방법은 아밀로이드 침적물, 예를 들어 알츠하이머병에서 Aβ, 시토킨, 예를 들어 TNFα, 및 IgE와 같은 다른 자가-항원의 부적절한 축적이 있는 환자를 치료하기 위해 치료적 자가면역 반응의 유도를 위해 사용될 수 있다.
백신
항-LAG-3 항체는 관심있는 항원 (예를 들어, 백신)과 항-LAG-3 항체의 동시투여에 의해 항원-특이적 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응이 향상되도록 대상체에게 (i) 항원; 및 (ii) 항-LAG-3 항체 또는 그의 항원 결합부를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-인간 LAG-3 항체 (예를 들어 본원에 기재된 임의의 인간 항-LAG-3 항체)이다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 항원은 예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 세균 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 상기 항원의 비-제한적인 예는 상기 문단에서 논의된 것, 예를 들어 상기 논의된 종양 항원 (또는 종양 백신), 또는 바이러스, 세균 또는 상기한 다른 병원체로부터의 항원을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 생체 내에서 및 시험관 내에서 투여하는 적합한 경로는 당업계에 잘 공지되어 있고, 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 용량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 결정될 것이다.
앞서 설명된 바와 같이, 본 발명의 인간 항-LAG-3 항체는 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제와 동시-투여될 수 있다. 항체는 상기 물질에 연결될 수 있거나 (면역-복합체로서), 상기 물질과 별개로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개의 투여), 항체는 상기 물질의 투여 전에, 후에 또는 상기 물질과 동시에 투여될 수 있거나, 다른 공지의 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어, 방사선 조사와 동시-투여될 수 있다. 그러한 치료제는 특히 단독으로는 환자에게 독성 또는 아독성인 수준에서만 효과적인 항신생물질제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 다카르바진 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함한다. 시스플라틴은 100 mg/ml 투여량으로서 4주마다 1회 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 60-75 mg/ml 투여량으로 21일마다 1회씩 정맥내 투여된다. 화학치료제와 본 발명의 인간 항-LAG-3 항체 또는 항원 결합 단편의 동시 투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 일으키는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 2가지 항암제를 제공한다. 이러한 동시-투여는 항체에 비반응성이 되도록 할 약물에 대한 내성의 발달 또는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용지시서를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 추가의 시약, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가의 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와 구분되는 LAG-3 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 지시하는 라벨 (label)을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 제공되거나 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.
조합 요법
다른 측면에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체가 면역 반응을 자극하여 대상체에서 면역 반응을 추가로 향상시키거나, 자극하거나, 상향조절하는데 효과적인 하나 이상의 추가의 항체와 동시투여되는 조합 요법의 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예를 들어 종양 성장을 억제하기 위해 또는 항-바이러스 반응을 자극하기 위해 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 하나 이상의 추가의 면역자극성 항체, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-PD-1 항체를 투여한다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-PD-L1 항체를 투여한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 항-CTLA-4 항체를 투여한다. 한 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 인간 항체, 예를 들어 본원의 항체이다. 별법으로, 항-LAG-3 항체는 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다 (예를 들어, 마우스 항-LAG-3 mAb로부터 제조된). 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체 (예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체)는 인간 항체이다. 별법으로, 적어도 하나의 추가의 면역자극성 항체는 예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다 (예를 들어, 마우스 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체로부터 제조된).
한 실시양태에서, 본 발명은 LAG-3 항체 및 CTLA-4 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질병 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 항-CTLA-4 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 둘 모두가 치료 투여량 이하량으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체 및 치료 투여량 이하량의 항-CTLA-4 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용한 과다증식성 질병의 치료와 연관된 유해 사례를 변경시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 인간 서열 모노클로날 항체 10D1 (PCT 공개 WO 01/14424에 기재됨)이고, 항-LAG-3 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예를 들어 본원에 기재된 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5이다. 본 발명의 방법에 포함되는 다른 항-CTLA-4 항체는 예를 들어 WO 98/42752; WO 00/37504; 미국 특허 6,207,156; 문헌 [Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17): 10067-10071]; [Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206)]; 및 [Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304]에 개시된 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 인간 CTLA-4에 5 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 CTLA-4에 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 CTLA-4에 5 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 CTLA-4에 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 LAG-3 항체 및 PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질병 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 항-PD-1 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 둘 모두가 치료 투여량 이하량으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체 및 치료 투여량 이하량의 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용한 과다증식성 질병의 치료와 연관된 유해 사례를 변경시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 항-LAG-3 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예를 들어 본원에 기재된 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5이다. 인간 서열 항-PD-1 항체의 예는 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 및 4A11을 포함하고, 이들은 PCT 공개 WO 06/121168에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 5 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-1에 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-1에 5 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-1에 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 LAG-3 항체 및 PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질병 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 항-PD-L1 항체는 치료 투여량 이하량으로 투여되거나, 둘 모두가 치료 투여량 이하량으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체 및 치료 투여량 이하량의 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용한 과다증식성 질병의 치료와 연관된 유해 사례를 변경시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 항-LAG-3 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예를 들어 본원에 기재된 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5이다. 인간 서열 항-PD-L1 항체의 예는 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 및 13G4를 포함하고, 이들은 PCT 공개 WO 07/005874에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 5 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-L1에 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-L1에 5 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하거나, 인간 PD-L1에 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 결합한다.
항체에 의한 LAG-3 및 하나 이상의 제2 표적 항원, 예를 들어 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본원의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 암은 면역요법에 일반적으로 반응성인 암을 포함한다. 본원의 조합 요법을 사용한 치료를 위한 암의 대표적인 예는 항-LAG-3 항체를 사용한 단제요법의 논의에서 상기 구체적으로 나열된 암을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 논의된 치료 항체들의 조합물은 제약상 허용되는 담체 내의 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있거나, 제약상 허용되는 담체 내의 각각의 항체를 갖는 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료 항체의 조합물은 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있고, 예를 들어 항-CTLA-4 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-CTLA-4 항체가 두 번째로 투여될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항-PD-1 항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있고, 예를 들어 항-PD-1 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-PD-1 항체가 두 번째로 투여될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항-PD-L1 항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있고, 예를 들어 항-PD-L1 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-PD-L1 항체가 두 번째로 투여될 수 있다.
또한, 1회 추가의 투여량의 조합 요법이 순차적으로 투여되면, 순차적인 투여의 순서는 역전되거나 각각의 투여 시점에 동일한 순서로 지켜질 수 있거나, 순차적인 투여가 동시 투여와 조합될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 조합물 항-CTLA-4 항체 및 항-LAG-3 항체의 제1 투여는 동시일 수 있고, 제2 투여는 먼저 항-CTLA-4 및 두 번째로 항-LAG-3을 사용하여 순차적일 수 있고, 제3 투여는 먼저 항-LAG-3 및 두 번째로 항-CTLA-4 등을 사용하여 순차적일 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 조합물 항-PD-1 항체 및 항-LAG-3 항체의 제1 투여는 동시일 수 있고, 제2 투여는 먼저 항-PD-1 및 두 번째로 항-LAG-3을 사용하여 순차적일 수 있고, 제3 투여는 먼저 항-LAG-3 및 두 번째로 항-PD-1 등을 사용하여 순차적일 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 조합물 항-PD-L1 항체 및 항-LAG-3 항체의 제1 투여는 동시일 수 있고, 제2 투여는 먼저 항-PD-L1 및 두 번째로 항-LAG-3을 사용하여 순차적일 수 있고, 제3 투여는 먼저 항-LAG-3 및 두 번째로 항-PD-L1 등을 사용하여 순차적일 수 있다. 다른 대표적인 투약 계획은 먼저 항-LAG-3 및 두 번째로 항-CTLA-4 (및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1)을 사용하여 순차적인 제1 투여를 포함할 수 있고, 후속적인 투여는 동시일 수 있다.
임의로, 항-LAG-3 및 하나 이상의 추가의 항체 (예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체)의 조합물은 면역원성 물질, 예를 들어 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 시토킨을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 추가로 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적인 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예를 들어 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토킨 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다 (아래에서 추가로 논의됨). 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 항-LAG-3 항체를 사용한 단제요법에 관하여 상기 상세히 논의된 임의의 백신 접종 프로토콜과 같은 백신 접종 프로토콜과 추가로 조합될 수 있다.
조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 또한 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 화학치료 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에, 본원의 조합물과 함께 투여되는 다른 화학치료 시약의 투여량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 그러한 조합물의 예는 흑색종의 치료를 위한 데카르바진과 추가로 조합한 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합물이다. 다른 예는 흑색종의 치료를 위한 인터루킨-2 (IL-2)와 추가로 조합한 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합물이다. LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단과 화학요법제의 조합 사용을 위한 과학적 근거는 대부분의 화학치료 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제시 경로 내의 종양 항원의 수준을 증가시켜야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통한 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단과 상승작용을 보일 수 있는 다른 조합 요법은 방사선 조사, 수술 및 호르몬 제한을 포함한다. 각각의 이들 프로토콜은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성시킨다. 또한, 혈관신생 억제제가 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단과 조합될 수 있다. 혈관신생을 억제하면, 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로 내로 공급할 수 있는 종양 세포 사멸이 유도된다.
LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단 항체의 조합물은 또한 Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 효과기 세포를 종양 세포에 대해 표적화하는 이중특이적 항체와 조합으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체는 2개의 별개의 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 이들 반응의 T 세포 아암은 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단의 사용에 의해 증가될 것이다.
다른 예에서, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합물은 항신생물질 항체, 예를 들어 리툭산 (Rituxan)® (리툭시맙), 헤르셉틴 (Herceptin)® (트라스트주맙), 벡사르 (Bexxar)® (토시투모맙), 제발린 (Zevalin)® (이브리투모맙), 캄파쓰 (Campath)® (알렘투주맙), 림포사이드 (Lymphocide)® (에프르투주맙), 아바스틴 (Avastin)® (베바시주맙) 및 타르세바 (Tarceva)® (에를로티닙) 등과 함께 사용될 수 있다. 이론에 매이기를 바라지 않으면서 한 예로서, 항암 항체 또는 독소에 접합된 항암 항체를 사용한 치료는 암 세포 사멸 (예를 들어, 종양 세포)를 일으킬 수 있고, 이는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 LAG-3에 의해 매개되는 면역 반응을 증강시킬 것이다. 예시적인 실시양태에서, 과다증식성 질병 (예를 들어, 암 종양)의 치료는 항암 항체를 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체와 조합으로, 동시에 또는 순차적으로 또는 그의 임의의 조합으로 포함할 수 있고, 이것은 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
종양은 매우 다양한 메카니즘에 의해 숙주 면역 감시를 피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 불활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들 단백질은 특히 TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 다른 예에서, 각각의 이들 엔티티에 대한 항체는 면역억제제의 효과를 상쇄하고 숙주에 의한 항-종양 면역 반응에 도움을 주기 위해 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체 조합물과 추가로 조합될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키기 위해 사용될 수 있는 다른 항체는 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체 조합물과 조합으로 추가로 사용될 수 있다. 이들은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화시키는 수지상 세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체 (Ridge et al., 상기 문헌)는 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 조합물과 함께 사용될 수 있다 (Ito et al., 상기 문헌). T 세포 동시자극 분자 ([Weinberg et al., 상기 문헌], [Melero et al., 상기 문헌], [Hutloff et al., 상기 문헌])에 대한 다른 활성화 항체도 증가된 수준의 T 세포 활성화를 제공할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 골수 이식은 조혈 기원의 다양한 종양의 치료를 위해 현재 사용되고 있다. 공여체의 그라프팅된 종양 특이적 T 세포의 효과를 증가시키기 위해 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단이 사용될 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포의 생체외 활성화 및 팽창과 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위한 이들 세포의 수여체 내로의 입양 전달을 수반하는 몇몇 실험적 치료 프로토콜이 존재한다 (Greenberg & Riddell, 상기 문헌). 또한, 이들 방법은 감염성 물질, 예를 들어 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체의 존재 하에 생체외 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 것으로 예상될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항-LAG-3 항체 및 치료 투여량 이하량의 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용한 과다증식성 질병 (예를 들어, 암)의 치료와 연관된 유해 사례를 변경시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 비-흡수성 스테로이드를 환자에게 투여함으로써 면역자극성 치료 항체-유도 결장염 또는 설사의 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다. 면역자극성 치료 항체를 투여할 임의의 환자는 상기 항체에 의해 유도되는 결장염 또는 설사를 발생할 위험이 있기 때문에, 상기 전체 환자 집단이 본 발명의 방법에 따른 치료법에 적합하다. 스테로이드는 염증성 장 질병 (IBD)을 치료하고 IBD의 악화를 예방하기 위해 투여되었지만, IBD로 진단되지 않은 환자에서 IBD를 예방하기 (그의 발병률을 감소시키기) 위해 사용되지는 않았다. 스테로이드, 심지어 비-흡수성 스테로이드는 그와 연관된 심각한 부작용으로 인해 예방 용도로 사용되지 않았다.
추가의 실시양태에서, 조합물 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단 (즉, 면역자극성 치료 항체 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체)는 임의의 비-흡수성 스테로이드의 사용과 추가로 조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "비-흡수성 스테로이드"는 광범한 초회 통과 대사를 보여서, 간에서 대사 후에, 스테로이드의 생체이용률이 낮은, 즉, 약 20% 미만인 글루코코르티코이드이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드는 부데소니드이다. 부데소니드는 국소-작용성 글루코코르티코스테로이드이고, 이것은 경구 투여 후에 주로 간에 의해 광범하게 대사된다. 에토코르트 이씨 (ENTOCORT EC)® (아스트라-제네카 (Astra-Zeneca))는 회장으로 및 결장 전체로 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소니드의 pH- 및 시간-의존적 경구 제형이다. 에토코르트 이씨®는 회장 및/또는 상행 결장을 포괄하는 경증 내지 중등도 크론 (Crohn) 병의 치료를 위해 미국에서 승인받았다. 크론병의 치료를 위한 에토코르트 이씨®의 통상의 경구 용량은 6 내지 9 mg/일이다. 에토코르트 이씨®는 창자에서 방출된 후, 장 점막에서 흡수되고 보유된다. 일단 장 점막 표적 조직을 통해 통과하면, 에토코르트 이씨®는 간에서 사이토크롬 P450 시스템에 의해 무시가능한 글루코코르티코이드 활성을 갖는 대사물질로 광범하게 대사된다. 따라서, 생체이용률은 낮다 (약 10%). 부데소니드의 낮은 생체이용률로 인해 덜 광범한 초회 통과 대사를 갖는 다른 글루코코르티코이드에 비해 치료비가 개선된다. 부데소니드는 전신-작용성 코르티코스테로이드보다 더 적은 시상하부-뇌하수체 억제를 포함하여 유해 사례가 보다 적다. 그러나, 에토코르트 이씨®의 만성 투여는 과다부신호르몬증 (hypercorticism) 및 부신 억제와 같은 전신 글루코코르티코이드 효과를 일으킬 수 있다 (PDR 58th ed. 2004; 608-610 참조).
추가의 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드와 함께 조합물 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단 (즉, 면역자극성 치료 항체 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체)은 살리실레이트와 추가로 조합될 수 있다. 살리실레이트는 5-ASA 물질, 예를 들어: 술파살라진 (아줄피딘 (AZULFIDINE)®, 파마시아 앤 업죤 (Pharmacia & UpJohn)); 올살라진 (디펜툼 (DIPENTUM)®, 파마시아 앤 업죤); 발살라지드 (콜라잘 (COLAZAL)®, 살릭스 파마슈티칼스, 인크. (Salix Pharmaceuticals, Inc.)); 및 메살라민 (아사콜 (ASACOL)®, 프록터 앤 갬블 파마슈티칼스 (Procter & Gamble Pharmaceuticals); 펜타사 (PENTASA)®, 샤이어 유에스 (Shire US); 카나사 (CANASA)®, 액스칸 스캔디팜, 인크. (Axcan Scandipharm, Inc.); 로와사 (ROWASA)®, 솔베이 (Solvay))를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체와 조합으로 투여된 살리실레이트, 및 비-흡수성 스테로이드는 면역자극성 항체에 의해 유도되는 결장염의 발생률을 감소시킬 목적으로 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드의 임의의 겹치는 또는 순차적인 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명에 따른 면역자극성 항체에 의해 유도되는 결장염의 발생률을 감소시키는 방법은 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드를 동시에 또는 순차적으로 (예를 들어, 살리실레이트는 비-흡수성 스테로이드의 6시간 후에 투여된다), 또는 그의 임의의 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 추가로, 본 발명에 따르면, 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드는 동일한 경로에 의해 (예를 들어, 둘 모두 경구로 투여된다), 또는 상이한 경로에 의해 (예를 들어, 살리실레이트는 경구로 투여되고, 비-흡수성 스테로이드는 직장으로 투여된다) 투여될 수 있고, 상기 경로는 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 투여하기 위해 사용된 경로(들)과 상이할 수 있다.
본원은 다음 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 본 발명을 더욱 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원 전체에서 인용되는 모든 도면 및 모든 참고문헌, Genbank 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다. 특히, PCT 공개 WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546 및 WO 09/054863의 개시문은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1 : LAG-3에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성
항-LAG-3 인간 모노클로날 항체는 다음과 같이, 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성하였다.
항원
항-인간 LAG-3 항체를 생성시키기 위해 면역원으로서 재조합 인간 LAG-3 융합 단백질을 사용하였다. 특정 면역화에서, 인간 면역글로불린 Fc 도메인 (알앤디 시스템즈, 카탈로그 #2319-L3) (D1-D4 hFc) 또는 마우스 면역글로불린 Fc 도메인 (D1-D4 mFc)에 융합된 인간 LAG-3의 전체 세포외 영역 (도메인 1-4)을 포함하는 융합 단백질을 면역원으로서 사용하였다. 다른 면역화를 위해, 마우스 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 인간 LAG-3의 처음 2개의 세포외 도메인 (D1-D2 mFc)만을 포함하는 융합 단백질을 면역원으로서 사용하였다. LAG-3 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조하였다.
트랜스제닉 트랜스염색체 KM 마우스™ 및 KM/FCGR2D 마우스™ 동물주
인간 LAG-3에 대한 완전 인간 모노클로날 항체는 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 트랜스염색체 KM 마우스™ 및 KM/FCGR2D 마우스™ 동물주의 마우스를 사용하여 제조하였다.
KM 마우스™ 동물주에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 PCT 공개 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되었다. 또한, 상기 마우스 동물주는 문헌 [Fishwild et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 도입유전자, KCo5를 보유한다. 동물주는 또한 PCT 공개 WO 02/43478에 기재된 바와 같이, 인간 Ig 중쇄 로커스를 보유하는 SC20 트랜스염색체를 함유한다. KM/FCGR2D 마우스™ 동물주는 그의 게놈이 또한 내인성 FcγRIIB 유전자의 동형접합 파괴를 포함하는 것을 제외하고는 KM 마우스™ 동물주와 동일하다. KM 마우스™ 및 KM/FCGR2D 마우스™ 동물주는 또한 미국 특허 출원 공개 20020199213에 상세히 설명되어 있다.
KM 마우스™ 및 KM/FCGR2D 마우스™ 면역화:
LAG-3에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, KM 마우스™ 및 KM/FCGR2D 마우스™ 동물주의 마우스를 상기한 3개의 상이한 재조합 LAG-3 융합 단백질 (D1-D4 hFc, D1-D4 mFc, D1-D2 mFc) 중 하나로 면역화시켰다. 일반적인 면역화 계획은 문헌 ([Lonberg et al. (1994) 상기 문헌]; [Fishwild et al., 상기 문헌]) 및 PCT 공개 WO 98/24884에 기재되어 있다. 항원의 제1 주입 시에 마우스는 6-16주령이었다. 마우스를 복강내 (IP) 및/또는 피하 (SC)로 면역화시켰다. 마우스를 격주로 10 ㎍의 재조합 LAG-3 융합 단백질로 4회 면역화시킨 후, 어쥬번트로서 Ribi 내의 20 ㎍의 동일한 면역원으로 2회 면역화시켰다. 면역 반응은 후안와 채혈에 의해 모니터링하였다. 혈장은 ELISA (아래 설명됨)에 의해 스크리닝하고, 충분한 역가의 항-LAG-3 인간 면역글로불린을 갖는 마우스를 융합을 위해 사용하였다. 희생 및 비장의 제거 전에, 마우스에게 20 ㎍의 항원을 정맥내 및 복강내로 추가접종한 후, 20 ㎍의 항원을 후속적으로 정맥내 추가접종하였다.
항-LAG-3 항체를 생산하는 KM 및 KM/FCGR2D 마우스의 선택
LAG-3 단백질에 결합된 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해, D1-D4 hFc 융합 단백질로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 혈청을 원래 문헌 [Fishwild et al. (1996)]에 기재된 바와 같이 변형된 ELISA에 의해 시험하였다. 간단히 설명하면, 미세적정 플레이트를 PBS 중 1 ㎍/ml의 정제된 재조합 LAG-3 융합 단백질로 50 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅한 후, PBS 중 5% BSA 200 ㎕/웰로 차단시켰다. LAG-3-면역화시킨 마우스로부터의 혈장의 희석액을 각각의 웰에 첨가하고, 1-2시간 동안 주변 온도에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소-항-인간 카파 경쇄 폴리클로날 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세척한 후, 플레이트를 ABTS 기질로 발색시키고, OD 405에서 분광광도계로 분석하였다.
D1-D4 mFc 또는 D1-D2 mFc 융합 단백질로 면역화시킨 마우스에 대해, 이들 마우스로부터의 혈청을 마우스 Fc 부분에 대한 비특이적 결합을 제거하기 위해 항원으로 코팅하기 전에 1시간 동안 플레이트를 코팅하기 위해 염소 항-마우스 IgG를 사용하는 간접적 ELISA에 의해 시험하였다. 이어서, 상기한 바와 동일한 ELISA 단계를 수행하였다.
최고 역가의 항-LAG-3 항체를 나타낸 마우스를 융합을 위해 사용하였다. 융합은 아래 설명된 바와 같이 수행하였고, 하이브리도마 상등액은 ELISA에 의해 항-LAG-3 활성에 대해 시험하였다.
LAG-3 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
KM 또는 KM/FCGR2D 마우스로부터 단리된 마우스 비장세포를 사이토 펄스 (Cyto Pulse) 대챔버 세포 융합 전기천공기 (사이토 펄스 사이언시즈, 인크. (Cyto Pulse Sciences, Inc., 미국 매릴랜드주 글렌 버니))를 사용하는 전기장 기반 전기융합에 의해 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 이어서, 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝하였다. 면역화시킨 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) 비분비형 마우스 골수종 세포의 수의 1/4에 융합시켰다. 세포를 약 1 x 105/웰로 평저 미세적정 플레이트에 플레이팅한 후, 10% 태소 혈청 (RPMI 중 오리겐 (origen) (IGEN)을 보충함), L-글루타민, 나트륨 피루베이트, HEPES, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 1x HAT, 및 β-머캅토에탄올을 함유하는 선택 배지 중에서 약 2주 인큐베이팅하였다. 1-2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지 중에서 세포를 배양하였다. 이어서, 개별 웰을 ELISA (상기 설명함)에 의해 인간 항-LAG-3 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 대체로 10-14일 후에 배지를 모니터링하였다. 항체-분비 하이브리도마를 재플레이팅하고 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면 항-LAG-3 모노클로날 항체를 제한 희석에 의해 적어도 2회 서브클로닝하였다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 추가의 특징화를 위해 조직 배양 배지 내에 소량의 항체를 생성하였다.
하이브리도마 클론 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5를 추가의 분석 및 서열 결정을 위해 선택하였다.
실시예 2 : 인간 항-LAG-3 모노클로날 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5의 구조적 특징화
실시예 1에 기재된 바와 같이 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5 클론에 의해 발현된 mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열은 다음 프로토콜을 이용하여 서열 결정하였다. 총 RNA는 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 이용하여 5 x 106 하이브리도마 세포로부터 제조하였다. cDNA는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크 래보래토리스, 인크. (Clontech Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 마운튼 뷰) 및 수퍼스크립트(Superscript) II 역전사효소 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 5'-RACE 프로토콜에 의해 제조하였다. 각각의 항체의 V-영역은 5' RACE 범용 (universal) 프라이머 믹스와 짝을 이룬 3' 인간-특이적 불변 영역 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. V-영역을 함유하는 PCR 생성물을 pCR4-TOPO 벡터 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 (E. coli) 균주 TOP10 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내로 형질전환시켰다. 미니프렙 (miniprep) DNA 또는 템플리피 (Templiphi) (GE Healthcare Biosciences, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이) 샘플을 제조하고, DNA 서열 결정하였다 (시퀴테크 (Sequetech), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰). 생성되는 DNA 서열을 인 프레임 재배열 및 다른 항체 특성에 대해 분석하였다. 발현된 단백질을 표준 단백질 화학 분석에 의해 특징화하였다. 25E3, 25F7 및 26H10 클론은 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 것으로 밝혀진 반면, 8B7 및 17E5 클론은 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 것으로 밝혀졌고 11F2 클론은 IgG2 중쇄 및 카파 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
25F7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1a에 및 각각 서열 49 및 37에 제시한다. 25F7의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1b에 및 각각 서열 55 및 43에 제시한다. 25F7 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 7), 25F7 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34 (서열 61)로부터 VH 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH5b (서열 62)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 25F7 VH 서열을 추가로 분석하면 도 1a에 및 각각 서열 1, 7 및 13에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 25F7 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 8), 25F7 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6 (서열 63)으로부터 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK2 (서열 64)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 25F7 VK 서열을 추가로 분석하면 도 1b에 및 각각 서열 19, 25 및 31에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
26H10의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 2a에 및 각각 서열 50 및 38에 제시한다. 26H10의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 2b에 및 각각 서열 56 및 44에 제시한다. 26H10 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 9), 26H10 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-33 (서열 65)로부터 VH 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH6B (서열 66)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 26H10 VH 서열을 추가로 분석하면 도 2a에 및 각각 서열 2, 8 및 14에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 26H10 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 10), 26H10 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK A27 (서열 67)로부터 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK3 (서열 68)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 26H10 Vk 서열을 추가로 분석하면 도 2b에 및 각각 서열 20, 26 및 32에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
25E3의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 3a에 및 각각 서열 51 및 39에 제시한다. 25E3의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 3b에 및 각각 서열 57 및 45에 제시한다. 25E3 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 11), 25E3 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-20 (서열 69)으로부터 VH 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH4b (서열 70)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 25E3 VH 서열을 추가로 분석하면 도 3a에 및 각각 서열 3, 9 및 GGY에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 25E3 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 12), 25E3 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L18 (서열 71)로부터 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK2 (서열 64)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 25E3 Vk 서열을 추가로 분석하면 도 3b에 및 각각 서열 21, 27 및 33에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
8B7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 4a에 및 각각 서열 52 및 40에 제시한다. 8B7의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 4b에 및 각각 서열 58 및 46에 제시한다. 8B7 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 13), 8B7 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-34 (서열 61)로부터 VH 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH5B (서열 62)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 8B7 VH 서열을 추가로 분석하면 도 4a에 및 각각 서열 4, 10 및 16에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 8B7 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 14), 8B7 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6 (서열 63)로부터 Vk 세그먼트 및 인간 생식계열 JK4 (서열 72)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 26H10 Vk 서열을 추가로 분석하면 도 4b에 및 각각 서열 22, 28 & 34에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
11F2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 5a에 및 각각 서열 53 및 41에 제시한다. 11F2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 5b에 및 각각 서열 59 및 47에 제시한다. 11F2 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 15), 11F2 중쇄가 인간 생식계열 VH 1-24 (서열 73)로부터 VH 세그먼트, 인간 생식계열 2-15로부터 D 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH4B (서열 70)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 11F2 VH 서열을 추가로 분석하면 도 13a에 및 각각 서열 5, 11 및 17에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 11F2 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 16), 11F2 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6 (서열 63)로부터 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK1 (서열 74)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 11F2 Vk 서열을 추가로 분석하면 도 5b에 및 각각 서열 23, 29 및 35에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
17E5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 6a에 및 각각 서열 54 및 42에 제시한다. 17E5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 6b에 및 각각 서열 60 및 48에 제시한다. 17E5 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 비교하면 (도 17), 17E5 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-33 (서열 65)로부터 VH 세그먼트, 인간 생식계열 2-2로부터 D 세그먼트, 및 인간 생식계열 JH4B (서열 70)로부터 JH 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 17E5 VH 서열을 추가로 분석하면 도 6a에 및 각각 서열 6, 12 및 18에 제시된 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다. 17E5 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 비교하면 (도 18), 17E5 카파 경쇄가 인간 생식계열 VK L6 (서열 63)로부터 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK5 (서열 75)로부터 JK 세그먼트를 이용함을 보여주었다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용하여 17E5 Vk 서열을 추가로 분석하면 도 6b에 및 각각 서열 24, 30 및 36에 제시된 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역이 도시된다.
25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5 가변 영역은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 임의의 요구되는 이소형의 전장 항체로 전환될 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA는 가변 영역이 불변 영역에 작동가능하게 연결되도록 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 보유하는 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 별법으로, 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 발현을 위해 별개의 벡터가 사용될 수 있다. 전장 항체를 생성하는데 사용하기에 적합한 발현 벡터의 비-제한적인 예는 미국 특허 공개 20050153394에 기재된 pIE 벡터를 포함한다.
실시예 3 : LAG-3 모노클로날 항체의 결합 특성의 특징화
본 실시예에서, 세포 표면 LAG-3 (인간, 원숭이 및 마우스 LAG-3)에 대한 인간 항-LAG-3 항체의 결합을 유동 세포 측정에 의해 검사하였다. 또한, LAG-3에 대한 결합 동역학을 비아코어 분석에 의해 분석하였다. 펩티드 스캔 실험을 이용하여 또한 추가의 에피토프 맵핑 (mapping)을 수행하였다.
A. 유동 세포 측정 연구
1. CHO-인간 LAG-3 세포 결합
세포 표면 LAG-3 단백질에 결합하는 항체의 능력을 시험하기 위해, 항체를 세포 표면 상에 인간 LAG-3을 발현하도록 형질감염된 CHO 세포주와 함께 인큐베이팅하였다. 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5 모노클로날 항체를 냉 1x PFAE 버퍼 (1x PBS + 2% FBS, 0.02% 나트륨 아지드, 2 mM Na EDTA) 내에 연속 희석시켰다. 결합 반응을 위해, 50 ㎕의 희석시킨 항체 용액을 2 x 105개의 세포를 함유하는 50 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 1x PFAE 버퍼로 2회 세척하였다. FITC-표지된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체 (베틸 래보래토리스, 인크. (Bethyl Laboratories, Inc.), Cat. # A80-115F)의 1:100 희석액을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 냉 1x PFAE 버퍼로 2회 세척하였다. 최종 세척 후에, 10 ㎍/mL 프로피듐 요오다이드 (로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science), Cat #1_348_639)를 함유하는 150 ㎕의 냉 1x PFAE를 각각의 용액에 첨가하고, 항체 결합의 분석을 FACScalibur 유동 세포 측정기 (비디 바이오사이언스 (BD Bioscience))를 사용하는 유동 세포 측정에 의해 수행하였다.
유동 세포 측정 분석의 결과를 CHO-인간 LAG-3에 대한 EC50을 보여주는 아래 표 1에 요약하고, 이것은 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 및 17E5가 세포-표면 인간 LAG-3에 효과적으로 결합하고 여기서 25F7는 25E3보다 약 20배 더 낮은 EC50을 갖지만 8B7 및 26H10과 대략 동일한 EC50을 가짐을 입증한다. 11F2 및 17E5에 대한 EC50 결과는 25E3에 대한 것과 동일한 범위에 있었다.
[표 1]
Figure pat00002
2. 활성화된 인간 CD4 + T 세포 결합
활성화된 인간 T 세포의 표면 상의 천연 인간 LAG-3에 결합하는 항체의 능력을 시험하기 위해, 휴지기 CD4+ T 세포를 정제된 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리하고, 폴리스티렌 비드에 고정된 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합물로 3일 자극하였다. 25F7, 8B7 및 26H10 모노클로날 항체를 냉 1x PFAE 버퍼 (1x PBS + 2% FBS, 0.02% 나트륨 아지드, 2 mM Na EDTA)로 연속 희석하였다. 결합 반응을 위해, 50 ㎕의 희석된 항체 용액을 50 ㎕의 PE-표지된 항-인간 CD4 (비디 바이오사이언스, Cat # 555347)와 혼합하였다. 활성화된 T 세포를 상기한 바와 동일한 프로토콜에 의해 처리하였다. 항체 결합의 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다.
유동 세포 측정 분석의 결과를 활성화된 인간 CD4+ T 세포에의 결합에 대한 EC50을 보여주는 아래 표 2에 요약하고, 이것은 3가지 모든 항체가 세포-표면 인간 LAG-3에 유사하게 결합함을 입증한다.
[표 2]
Figure pat00003
3. 원숭이 LAG-3 항원 결합
항-LAG-3 항체가 원숭이 LAG-3과 교차반응하는지 결정하기 위해, cDNA 서열을 사이노몰거스 및 붉은털 원숭이 조직 샘플의 컬렉션으로부터의 RNA의 역전사에 의해 제조되어 함께 모은 cDNA의 제제로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 서열을 cDNA 풀 (pool)로부터 프라이머 (5' 정방향 프라이머: 5Mcyn1408; 5'-atgtgggaggctcagttcctg-3' (서열 91) & 3' 역방향 프라이머: 3Mcyn1408a; 5'-gtcagagctgctccggctc-3' (서열 92))를 사용하여 GC-풍부 PCR 증폭 시스템 (로슈)을 이용하여 먼저 증폭시키고, 서열 분석을 위해 수여체 TOPO 클로닝 벡터 (인비트로겐) 내로 클로닝하였다. 참조 Genbank 붉은털 원숭이 LAG-3 서열 (Genbank 기탁 번호 XM_001108923)에 일치하는 클론을 포유동물 세포 발현 벡터 내에서 방향적 (directional) 클로닝을 위한 제한 효소 부위를 포함하는 제2 세트의 프라이머를 이용하는 TOPO-클로닝 벡터 DNA로부터 후속적으로 재증폭시켰다.
원숭이 LAG-3 클론 pa23-5를 단리하고 서열 결정하였다. 단리된 원숭이 서열은 참조 Genbank 붉은털 원숭이 LAG-3 서열에 99.6%의 동일성을 보였다. cDNA 클론 pa23-3의 아미노산 서열 (서열 93)과 Genbank (기탁 번호 XM_001108923)로부터의 붉은털 원숭이 LAG-3 (서열 94)의 비교를 도 19에 제시한다. 2가지 서열은 위치 419에서 하나의 아미노산 차이 (클론 pa23-5에서 아르기닌 대 Genbank 붉은털 원숭이 서열에서 트레오닌)를 제외하고는 동일하였고, 이를 기초로 cDNA 클론 pa23-5는 붉은털 원숭이 LAG-3 유전자 서열을 나타내는 것으로 결론지어진다.
클론 pa23-5의 cDNA를 발현 구성체 내로 삽입하였고, 이를 뉴클레오펙션 (nucleofection) (아막사 (Amaxa))에 의해 CHO-S 현탁 세포 내로 형질감염시켰다. 분류된 선택 약물-내성 클론에 의한 붉은털 원숭이 LAG-3 발현을 FACS 분석에 의해 확인하였다. 붉은털 원숭이 LAG-3을 과다발현하는 상기 클론 CHO 세포주를 원숭이 단백질에 대한 항체 교차 반응성을 측정하기 위해 상기한 것과 유사한 FACS 분석에서 사용하였다. 간단히 설명하면, 25F7, 8B7 및 26H10 모노클로날 항체를 냉 1x PFAE 버퍼 (1x PBS + 2% FBS, 0.02% 나트륨 아지드, 2 mM Na EDTA)로 연속 희석하였다. 결합 반응을 위해, 50 ㎕의 희석된 항체 용액을 2 x 105개의 세포를 함유하는 50 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 상기한 것과 동일한 프로토콜로 처리하였다. 항체 결합의 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다.
별개의 실험에서, 항체를 활성화된 사이노몰거스 원숭이 T 세포를 사용하여 사이노몰거스 원숭이 LAG-3에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이들 원숭이 T 세포의 시험관 내 활성화는 인간 T 세포의 시험관 내 활성화에 대해 상기한 것과 실질적으로 동일한 프로토콜에 의한 T 세포의 항-CD3/항-CD28 처리에 이어, 시험관 내 활성화된 인간 CD4+ T 세포의 염색을 위해 상기한 바와 같이 수행된 유동 세포 측정 분석을 통해 달성하였다.
CHO-붉은털 원숭이 LAG-3 세포 및 활성화된 사이노몰거스 T 세포를 사용하는 유동 세포 측정 분석의 결과를, 원숭이 LAG-3을 발현하는 2가지 상이한 종류의 세포에의 결합에 대한 EC50을 보여주는 아래 표 3에 요약한다. 이들 결과는 모든 항체가 활성화된 사이노몰거스 T 세포 상의 LAG-3 및 CHO 세포 내로 형질감염된 붉은털 원숭이 LAG-3 (서열 93)에 모두 효과적으로 결합함을 보여주었다. 그러나, 결합 친화도의 체계가 존재하고, 여기서 클론 26H10이 최고 친화도를 나타내고, 이는 클론 8B7 및 25F7보다 각각 약 2.5 및 6배 더 우수하다. 2가지 세포 종류 사이의 결합 체계의 차이는 붉은털 및 사이노몰거스 원숭이 LAG-3 단백질 사이의 아미노산 서열 차이를 반영할 수 있다.
[표 3]
Figure pat00004
4. 마우스 LAG-3 항원 결합
항체가 마우스 LAG-3과 교차반응하는지 결정하기 위해, 표적 세포로서 그의 세포 표면 상에 마우스 LAG-3을 발현하도록 형질감염된 마우스 T 세포 하이브리도마 세포주 (3A9)를 사용하여 상기한 것과 유사한 유동 세포 측정 연구를 수행한 후, 항체 결합을 검출하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. 결과는 강한 염색을 보인 대조군 항-마우스 LAG3 대조군 항체와는 반대로, 인간 항체 25E3, 25F7, 8B7 또는 26H10 중 어느 것도 세포 표면 마우스 LAG-3에 대해 배경 수준을 넘는 결합을 나타내지 않음을 알려주며, 이는 상기 항체 중 어느 것도 마우스 LAG-3과 교차반응하지 않음을 입증한다.
B. 비아코어 분석
재조합 LAG-3 단백질에 대한 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 및 17E5 항체의 결합을 포획 방법을 이용하여 비아코어™에 의해 검사하였다. 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 및 17E5 항체를 각각 항-CH1 (인간 항체의 중쇄 불변 영역 1에 특이적인 시약 항체 (자이메드 (Zymed), 클론 HP6045, 원액 농도 1.0 mg/mL)를 사용하여 포획시켰다. 항-CH1을 CM5 칩 (BR-1000-14, Research Grade) 상에 고밀도 (9700-11500RU)로 코팅하였다. 코팅은 제조자가 권장하는 표준 고정화 절차에 기초하여 수행하였다. 이어서, 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 또는 17E5 정제된 항체 (농도 범위 0.5-3 ㎍/mL)를 항-CH1 코팅된 표면 상에 10 ㎕/min의 유속에서 1분 동안 포획시켰다. 단일 농도의 재조합 인간 LAG-3 융합 단백질 (20 nM)을 포획된 항체 위로 3분 동안 25 ㎍/mL의 유속으로 주입시켰다. 항원을 7.5분 동안 해리시켰다. 칩 표면은 각각의 사이클 후에 25 ㎕의 25 mM NaOH에 이어 30 ㎕의 HBS-EP 세척에 의해 재생시켰다. 이소형 대조군을 칩 상에 실행시켰고, 데이타를 비-특이적 결합을 공제하기 위해 사용하였다. 모든 실험은 비아코어 콘트롤 소프트웨어 v 3.2를 사용하여 비아코어 3000 표면 플라즈몬 공명 기기 상에서 수행하였다. 데이타 분석은 비아이밸류에이션 v3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 결과를 아래 표 4에 제시한다. 25E3, 25F7, 8B7, 26H10 및 17E5에 대한 비아코어 결과는 5가지 모든 항체가 인간 LAG-3에 고친화도로 결합할 수 있다는 유동 세포 측정 결과를 확인한다.
[표 4]
Figure pat00005
C. 에피토프 맵핑
LAG-3 단백질에서, 세포외 영역의 면역글로불린-유사 제1 도메인은 아미노산 서열 GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (서열 79)을 갖는 노출된 "엑스트라 루프"를 함유한다. LAG-3의 상기 영역에 대한 25E3, 25F7, 8B7 및 26H10의 결합을 검사하고 각각의 항체에 의해 결합된 에피토프를 맵핑하기 위해, 펩티드 스캔 실험을 상기 영역을 가로질러 수행하였다. 엑스트라 루프 서열의 전체 길이를 가로질러 스캐닝된 일련의 10개의 겹치는 펩티드를 제조하고 비오틴에 접합하였다. ELISA 분석을 위해, 스트렙타비딘 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), Cat# M5432)으로 예비-코팅된 미세적정 플레이트를 사용하여, 100 ㎕ 부피 내에 2 ㎍/mL의 농도로 적용된 비오티닐화된 루프 펩티드-접합체를 포획하고 18시간 동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 플레이트를 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼 (1x PBS + 10% FBS)로 차단시켰다. 이어서, 10 ㎍/mL로부터 차단 버퍼 내에 3배 연속 희석시킨 인간 항-LAG-3 항체를 적용하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후 3회 세척하였다. 결합된 인간 항체를 검출하기 위해, HRP-접합된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체 (베틸 래보래토리스, Cat #A80-115P)를 차단 버퍼 내에 1 ㎍/mL로 희석하고 분석 웰에 1시간 동안 적용한 후 3회 세척하고 TMB 기질 (이바이오사이언스 (eBioscience), Cat #00-4201-56)을 적용하였다. 650 nm 파장에서 광학 밀도 판독을 Spectramax 340PC 분광광도계 (몰레큘라 다이나믹스, 인크. (Molecular Dynamics, Inc.)) 상에서 수행하였다. 펩티드 스캔 실험의 결과를 아래 표 5에 요약한다.
[표 5]
Figure pat00006
상기 결과에 기초하여, 25E3 항체는 아미노산 서열 PGHPLAPG (서열 76)을 포함하는 세포외 루프 내의 영역을 인식하는 반면, 25F7 항체는 아미노산 서열 HPAAPSSW (서열 77)을 포함하는 엑스트라 루프 내의 영역을 인식하고 8B7은 아미노산 서열 PAAPSSWG (서열 78)을 포함하는 세포외 루프 내의 영역을 인식하는 것으로 나타난 것으로 결정되었다. 이와 달리, 26H10 항체에 의한 전장 엑스트라 루프 펩티드 또는 임의의 보다 짧은 스캐닝 펩티드의 결합은 검출될 수 없었다.
상기 연구에서 확인된 영역은 전장 엑스트라 루프 서열에서 밑줄로 표시된다:
Figure pat00007
따라서, 펩티드 스캔 결과는 25E3, 25F7 및 8B7 항체가 인간 LAG-3 내의 밀접하게 위치하지만 상이한 에피토프에 결합함을 나타낸다.
엑스트라 루프 펩티드 영역에 대한 이들 항체의 결합을 추가로 조사하기 위해서, 추가의 ELISA 분석을 수행하였다. 인간 전장 엑스트라 루프 펩티드 (서열 79)를 사용하는 ELISA 분석에서, 25E3, 25F7 및 8B7에 대해 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 추가로, 서열 GPPAPAPGHPPAPGHRPAAP YSWGPRPRRY (서열 90)을 갖는 붉은털 원숭이 LAG-3로부터의 전장 엑스트라 루프 펩티드 서열을 사용하여 유사한 펩티드 ELISA를 수행하고, 25F7 및 8B7에 대해 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 결과를 아래 표 6에 요약한다. 결과는 항체 25E3, 25F7 및 8B7이 인간 LAG-3 엑스트라 루프 펩티드 영역을 인식할 수 있음을 확인한다. 또한, 항체 25F7 및 8B7은 또한 인간 서열에 비해 덜하기는 하지만 붉은털 원숭이 LAG-3 엑스트라 루프 펩티드 영역에 결합하고, 이것은 상기 폴리펩티드에서 종 서열 분기 (divergence)로 인한 것일 수 있다. 결과는 또한 26H10 항체가 LAG-3 엑스트라 루프 펩티드를 인식할 수 없음을 확인한다.
[표 6]
Figure pat00008
실시예 4 : 항-LAG-3 mAb에 의한 MHC 클래스 II에 대한 LAG-3의 결합의 억제
MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 항-LAG-3 항체의 능력을 시험하기 위해, 시험관 내 결합 분석을 수행하였고, 여기서 마우스 Fc (hLAG-3-mIg)에 융합된 인간 LAG-3 세포외 도메인을 포함하는 LAG-3 융합 단백질을 인간 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 Daudi 세포와 반응시켰다.
MHC 클래스 II에 대한 LAG-3 결합의 항체 억제를 시험하기 위해, 25E3, 25F7, 8B7 및 26H10을 20 ㎍/mL로부터 PFAE 버퍼 내에 연속 희석하고, 상기 연속 희석액에 1 ㎍/ml의 hLAG-3-mIg 융합 단백질을 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후 2x105개의 1x PFAE-세척된 Daudi 세포에 첨가하였다. 혼합물을 Daudi 세포에 적용하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 펠렛화하고 (3분, 400xg), 1x PFAE 버퍼로 1회 세척하고 재-펠렛화하고, 재조합 PE-표지된 항-mIgG Fcγ 2차 시약을 사용하여 Daudi 세포에 대한 hLAG-3-mIg의 결합을 검출하였다. LAG-3-mIg 결합의 분석은 FACScalibur 유동 세포 측정기 (비디 바이오사이언스)를 사용하여 수행하였다. 결과를 IC50 값 (nM)을 보여주는 아래 표 7에 요약한다.
[표 7]
Figure pat00009
결과는 4가지 모든 항체가 MHC 클래스 II 항체에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는데 효과적임을 입증하고, 여기서 25F7, 8B7 및 26H10은 25E3보다 약 7 내지 13배 더 낮은 IC50 값을 나타낸다.
실시예 5 : 항-LAG-3 mAb에 의한 항원-특이적 T 세포 반응의 자극
항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 항-LAG-3 항체의 능력을 시험하기 위해, 3A9 T 세포 펩티드 자극 분석 (예를 들어, [Workman et al. (2003) J. Immunol. 169:5392-5395]; [Workman et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2255-2263])을 이용하였다.
본 분석에서, 펩티드 HEL48-62에 특이적인 마우스 T 세포 하이브리도마, 3A9를 응답자 (responder) T 세포로서 사용하였다. 응답자 3A9 T 세포를 그의 세포 표면 상에 인간 LAG-3 또는 마우스 LAG-3을 발현하도록 레트로바이러스에 의해 전달하였다. 3A9 세포에 HEL48-62 펩티드 항원을 제시하도록 사용된 항원 제시 세포 (APC)는 마우스 MHC 클래스 II 양성 세포주 LK35.2이었다. 별개의 연구에서는 인간 LAG-3 융합 단백질이 마우스 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있어서, 본 분석에서 LK35.2 마우스 APC의 용도를 입증하는 것으로 결정하였다. 3A9 세포의 항원-특이적 자극은 인터루킨-2 (IL-2)의 생산에 의해 나타내어지고, 그의 분비는 ELISA (마우스 IL-2 OptEIA 키트, 비디 바이오사이언스, Cat #555148, 제조자의 권장사항에 따라)에 의해 측정하였다.
3A9 T 세포 상에서 인간 또는 마우스 LAG-3의 이소성 발현은 임의의 항체의 부재 하에, 형질감염된 T 세포를 HEL48-62 펩티드 항원을 제시하는 LK35.2 APC와 함께 인큐베이팅할 때, 대조군 3A9 T 세포의 펩티드 용량 반응 프로필에 비해 3A9 세포에 의한 IL-2 생산을 자극하기 위해 필요한 펩티드 항원의 양의 증가에 의해 나타내어지는 바와 같이 항원-특이적 반응에 대해 억제 효과를 일으켰다.
항원-특이적 T 세포 반응의 항체 자극을 시험하기 위해, APC (2.5x104 세포)를 먼저 항원 펩티드 (200 nM)와 함께 30분 동안 37℃에서 예비-인큐베이팅하고, 3A9 T 세포 (5.0x104개의 mLAG-3, hLAG-3을 발현하는 세포 또는 대조군 세포)를 25 ㎍/mL로부터 3배 희석액으로 연속 희석시킨 항-hLAG-3 항체 (25E3, 25F7, 8B7, 26H10, 11F2, 17E5)와 함께 15분 동안 37℃에서 예비-인큐베이팅하였다. 이어서, 3A9 T 세포를 항원-펄싱된 APC에 첨가하고, 배양액을 24시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 상등액을 수거하고 마우스 IL-2의 생산에 대해 측정하였다. 인간 LAG-3을 발현하는 3A9 T 세포에 대한 결과를 IC50 값 (nM)을 보여주는 표 8에 제시한다.
[표 8]
Figure pat00010
결과는 항체 25F7, 8B7 및 26H10, 및 보다 적은 정도로 25E3이 항원-특이적 T 세포 반응 분석에서 IL-2 생산을 자극할 수 있는 반면, 본 분석에서 항체 11F2는 최소의 억제 능력을 보였고 항체 17E5는 기능적이지 않았음을 보여준다. 어떠한 항체도 대조군 3A9 T 세포 또는 마우스 LAG-3 단백질로 형질감염된 3A9 T 세포에 의한 측정된 IL-2 생산을 변경시키지 않았고, 이것은 자극 효과의 특이성을 입증한다.
실시예 6 : 항-LAG-3 mAb 단독 또는 조합에 의한 종양 성장 억제
단독으로 또는 다른 면역자극성 항체와 조합으로, 생체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 항-LAG-3 항체의 능력을 시험하기 위해, 2가지 상이한 동계 마우스 종양 이식 모델을 사용하였다. 제1 모델은 쥐 Sa1N 섬유육종 세포를 사용하였다. 제2 모델은 쥐 MC38 결장암 세포주를 사용하였다.
제1 실험에서, 마우스 (A/J 동물주)에게 각각 제0일에 2 x 106개의 Sa1N 섬유육종 세포를 이식하고, 종양 세포를 7일 동안 성장시켰다. 이식 후 제7일, 제10일 및 제12일에, 마우스를 10 mg/kg의 항-LAG-3 mAb 단독 (래트 항-마우스 LAG-3 mAb C9B7W; 이바이오사이언스, Cat. No. 14-2231), 항-PD-L1 항체 단독 (항-마우스 PD-L1 mAb 14D8), 항-LAG-3 및 항-PD-L1 항체 조합으로, 또는 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 14D8 mAb는 마우스 IgG1 및 마우스 카파 불변 영역을 함유하도록 키메라화된 래트 항-마우스 PD-L1 항체이다.
마우스 내의 종양 부피를 이식 후 50일에 걸쳐 측정하고, 평균 및 중간 종양 부피를 결정하였다. 평균 종양 성장 억제를 계산하였다 (이소형 대조군 IgG1 항체를 사용한 처리가 0% 억제인 것에 기초하여). 이식 후 제24일에 대한 결과를 아래 표 9에 요약한다.
[표 9]
Figure pat00011
따라서, 항-LAG3 항체 단독 또는 항-PD-L1 항체 처리 단독은 종양 성장 억제를 일으키고, 두 항체의 조합물은 훨씬 더 큰 종양 성장 억제를 일으켰다. 처리군에 대하여, 실험의 끝에, 결과는 항-LAG3 단독으로 처리한 10마리의 마우스 중 4마리가 종양이 없어진 한편, 대조군 IgG1 항체로 처리한 10마리의 마우스 중 단지 1마리가 종양이 없어졌다는 것이다. 이와 유사하게, 항-PD-L1 단독으로 처리한 11마리의 마우스 중 4마리가 종양이 없게 되었다. 항-LAG3 및 항-PD-L1의 조합물을 사용하여 마우스를 처리하면 10마리의 마우스 중 9마리가 종양이 없어졌고; 무종양 상태가 아닌 나머지 마우스에서는 연구 전체 동안 작게 유지된, 진행이 더딘 종양이 있었다.
2가지의 추가 연구에서는 쥐 MC38 결장암 세포주의 세포를 이식한 마우스를 사용하였다. 제1 실험에서, C57Bl/6 마우스에게 각각 제0일에 2 x 106개의 MC38 세포를 이식하고, 이식 후 제7일, 제10일 및 제12일에 200 ㎍/용량의 항-LAG-3 단독 (C9B7W mAb), 항-PD-1 단독 (4H2 mAb) 또는 항-LAG-3 및 항-PD-1을 조합으로 처리하였다. IgG1 이소형 매칭된 항체 400 ㎍/용량을 대조군으로서 사용하였다. 4H2 mAb는 마우스 IgG1 및 마우스 카파 불변 영역을 함유하도록 키메라화된 래트 항-마우스 PD-1 항체이다.
평균 종양 부피, 중간 종양 부피 및 % 생존을 이식의 80일 후에 결정하였다. 결과는 상기 종양 모델 (MC38)에서 LAG-3 단제요법이 종양 성장을 억제하는데 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았고 처리된 마우스는 어느 것도 실험 지속 기간 동안 생존하지 않았음을 보여주었다. 이와 달리, 항-PD-1 단제요법은 유의한 활성을 보였고, 여기서 10마리의 마우스 중 4마리가 실험의 끝에 종양이 없었다. 또한, Sa1N 모델을 사용한 결과와 유사하게, 항-LAG-3 + 항-PD-1의 조합 요법은 2가지 처리 단독보다 더 효과적이었고, 여기서 8마리의 마우스 중 7마리가 실험의 끝에 종양이 없었다.
MC38 모델을 사용한 제2 실험에서, C57Bl/6 마우스에게 각각 제0일에 2 x 106개의 MC38 세포를 이식하고, 이식 후 제5일, 제8일 및 제11일에 200 ㎍/용량의 시험 항체 및/또는 400 ㎍/용량의 대조군 IgG 항체를 다음과 같이 처리하였다: (i) 항-IgG1 대조군 항체; (ii) 항-LAG-3 mAb (C9B7W mAb)를 대조군 IgG1과 함께; (iii) 항-PD-1 항체 (4H2)를 대조군 IgG1과 함께; (iv) 항-CTLA-4 항체 (9D9 마우스 항-마우스 CTLA-4 mAb)를 대조군 IgG1과 함께; (v) 항-LAG-3 mAb를 항-PD-1 mAb와 함께; 또는 (vi) 항-LAG-3 mAb를 항-CTLA-4 mAb와 함께. 9D9 mAb는 내인성 마우스 CTLA-4를 녹아웃시킨 마우스에서 생성시킨 마우스 항-마우스 CTLA-4 항체이다.
평균 종양 부피, 중간 종양 부피 및 % 생존을 이식 후 100일에 걸쳐 결정하였다. 결과는 LAG-3 단제요법이 MC38 종양 성장을 억제하는데 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았고 처리된 마우스는 어느 것도 실험 지속 기간 동안 생존하지 않았음을 보여주는 제1 실험과 유사하였다. CTLA-4 단제요법도 또한 MC38 종양 성장을 억제하는데 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았고, 처리된 마우스는 어느 것도 실험 지속 기간 동안 생존하지 않았다. 이와 달리, 항-PD-1 단제요법은 다시 유의한 활성을 보였고, 여기서 10마리의 마우스 중 4마리가 실험의 끝에 종양이 없었다. 또한, 다시 조합 요법은 단제요법보다 더 효과적이었다. 항-LAG-3 및 항-CTLA-4의 조합물로 처리한 마우스에 있어서 10마리의 마우스 중 3마리가 실험의 끝에 종양이 없었고, 항-LAG-3 및 항-PD-1의 조합물로 처리한 마우스에 있어서 10마리의 마우스 중 8마리가 실험의 끝에 종양이 없었다.
따라서, 상기한 생체 내 종양 이식 연구에서는 적어도 특정 종양 모델에 대해, 항-LAG 항체 치료가 단독으로 생체 내에서 종양 성장의 유의한 억제를 일으켰음을 입증하였다. 또한, 다수의 종양 모델에 대해, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체와 함께 항-LAG-3 항체의 조합 요법이 단제요법 단독으로보다 훨씬 더 큰 항-종양 활성을 생성시켰다.
실시예 7 : 항-LAG-3 mAb에 의한 억제에 의한 NOD 마우스에서 자가면역의 촉진
자가면역의 발달에 의해 나타내어지는 바와 같이, 면역 반응을 자극하는 항-LAG-3 항체의 능력을 시험하기 위해 당뇨병의 NOD 마우스 모델을 이용하였다. NOD 마우스는 자가면역 당뇨병을 발병하는 경향이 있는 것으로 알려져 있다. 당뇨의 진행은 혈당을 측정함으로써 암컷 NOD 마우스에서 추적할 수 있다. 따라서, 암컷 NOD 마우스에서 당뇨병 발병에 대한 항-LAG-3 처리 단독으로 또는 면역자극성 항체와 조합으로의 효과를 검사하였다.
암컷 NOD 마우스를 제0일, 제2일 및 제5일에 250 ㎍/용량의 다음 물질로 처리하였다: (i) IgG1 이소형 대조군 항체; (ii) 항-LAG-3 mAb 단독 (C9B7W mAb); (iii) 항-PD-1 mAb 단독 (4H2 mAb); (iv) 항-CTLA-4 mAb 단독 (9D9 mAb); (v) 항-LAG-3 mAb를 항-PD-1 mAb와 함께; 또는 (vi) 항-LAG-3 mAb를 항-CTLA-4와 함께. 결과는 항-LAG-3 처리 단독 또는 항-PD-1 처리 단독이 당뇨 표현형으로 전환하는 마우스의 수를 증가시켰음 (그러나 항-CTLA-4 치료 단독은 그렇지 않음)을 입증하였다. 또한, 항-LAG-3 + 항-PD-1, 또는 항-LAG-3 + 항-CTLA-4의 조합 처리가 마우스를 당뇨 표현형으로 전환시키는데 훨씬 더 효과적이었다.
따라서, 이들 결과는 그의 수용체와 LAG-3 상호작용을 차단하면 NOD 마우스에서 보다 큰 면역학적 활성을 허용하는 음성 면역조절 신호를 저해하였음을 입증하고, LAG-3 처리된 마우스에서 상기 보다 큰 면역학적 활성은 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 항체를 사용한 조합 처리에 의해 향상될 수 있다.
실시예 8 : 항-LAG-3 mAb를 사용한 면역조직화학
본 실험에서, 형광-표지된 항-LAG-3 인간 항체를 면역조직화학 실험에 사용하였다. 다음 FITC-표지된 인간 항-LAG-3 항체를 사용하였다: 25F7-FITC (F:P = 2.9; IgG1 버전); 25F7-G4-FITC (F:P = 2.7; IgG4 버전); 8B7-FITC (F:P = 2.6) 및 26H10-FITC (F:P = 3.4). 림프 조직의 패널 (panel), 구체적으로 편도선 (2개의 샘플), 비장 (2개의 샘플) 및 흉선 (2개의 샘플)을 뇌하수체 조직 (4개의 샘플)과 함께 검사하였다. LAG-3 형질감염된 CHO 세포를 또한 대조군으로서 사용하였다. 아세톤-고정된 냉동미세 (cryostat) 절편을 사용하였다. 절편을 FITC-표지된 항-LAG-3 항체 (0.2-5 ㎍/ml)로 염색한 후, 다리 항체로서 토끼 항-FITC 항체로 염식한 후 토끼 EnVision™+ System 키트 (다코 유에스에이 (Dako USA, 미국 캘리포니아주 카르핀테리아))를 사용하여 가시화하였다. 결과를 아래 표 10에 요약한다.
[표 10]
Figure pat00012
예상된 바와 같이, 림프 조직의 패널에서 LAG-3 발현이 검출되었다. 추가로, 검사한 3가지 항-LAG-3 항체 중 2개, 즉, 25F7 (IgG1 및 IgG4 버전) 및 26H10은 뇌하수체 조직 내에 저류를 보인 한편, 검사된 하나의 항체, 즉, 8B7은 뇌하수체 조직 내에 이러한 저류를 보이지 않았다. 따라서, 면역조직화학 실험에서 항-LAG-3 항체의 2개의 하위세트를 확인하였고, 여기서 하나의 하위세트는 뇌하수체 조직 내에 저류되고, 다른 하위세트는 뇌하수체 조직 내에 저류되지 않는다.
서열 목록의 개요
Figure pat00013
Figure pat00014
SEQUENCE LISTING <110> Thudium, Kent B. Selby, Mark Korman, Alan J. LeBlanc, Heidi N. Zens, Kyra D. Yamanaka, Mark <120> Human Antibodies That Bind Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3), And Uses Thereof <130> 0221PC1 <140> WO 00/000000 <141> 2009-08-11 <150> US 61/188548 <151> 2008-08-11 <160> 94 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Ser Met His 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Cys Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Trp Ala Val Ala Ser Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Val Gly Val Val 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Phe Val Val Val Val Ala Ala Ser Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Pro His Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asn Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Trp Ala Val Ala Ser Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Thr Asn Cys Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ala Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Ser Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Thr His Asp Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 20 25 30 Thr Glu Val Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 50 55 60 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Phe Val Val Val Val Ala Ala Ser Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro His Cys Ser Ser Thr Asn Cys Tyr Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattactact ggaactggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata atggaaacac caactccaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccctatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt tggatatagt 300 gactacgagt acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 50 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaatgg 300 gcagtggcct cctgggacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 51 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gaggtgcagt tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacatattat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccggagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtac cactgggggc 300 tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctca 336 <210> 52 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc catcggaaac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaacac caactgcaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca ggagatacgt ccaagaaaca gttcgccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtctatt actgtgcgag aggatacgat 300 attttgactg gttattatga ggactcctgg ggcccgggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 53 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 acccacgacc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcctca 60 gtgaaggtct cctgcaaggt ttccggatac accctcactg aagtatccat gcactgggtg 120 cgacaggctc ctggaaaagg gcttgagtgg atgggaggtt ttgatcctga agatggtgaa 180 acaatctacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccgaggacac atctacagac 240 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgca 300 acagcctttg tagtggtggt agctgcttct gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 54 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccc 300 cattgtagta gtaccaactg ctaccttttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 55 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac ttttggccag 300 gggaccaacc tggagatcaa a 321 <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaa 324 <210> 57 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagg agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctataat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 59 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Residue 98 is presented only in a subset of figures. <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> Residues 1-3 are presented only in a subset of figures. <400> 62 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 63 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Residue 1 is presented only in a subset of figures. <400> 64 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 65 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 67 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Residues 1-2 are only presented in a subset of figures. <400> 70 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 73 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 20 25 30 Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 50 55 60 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Thr 100 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly 1 5 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His 1 5 10 15 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 20 25 30 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly 1 5 10 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His 1 5 10 <210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala 1 5 10 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly 1 5 10 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg 1 5 10 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 30 <212> PRT <213> Macaca sp. <400> 90 Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro Ala Pro Gly His Arg 1 5 10 15 Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr 20 25 30 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5Mcyn1408 primer <400> 91 atgtgggagg ctcagttcct g 21 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3Mcyn1408a primer <400> 92 gtcagagctg ctccggctc 19 <210> 93 <211> 532 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 93 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro 65 70 75 80 Ala Pro Gly His Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Thr Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Thr Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Gln Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro His Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Val Tyr Ala Gly 260 265 270 Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val Gly 275 280 285 Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly Pro 290 295 300 Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu 305 310 315 320 Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg Leu 325 330 335 Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val 340 345 350 Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys 355 360 365 Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro Leu 370 375 380 Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln 385 390 395 400 Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln Gly 405 410 415 Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro 420 425 430 Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly His 435 440 445 Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu Val 450 455 460 Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg 465 470 475 480 Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln Ser 485 490 495 Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu 500 505 510 Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro Glu 515 520 525 Pro Glu Gln Leu 530 <210> 94 <211> 533 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 94 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val 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Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val 275 280 285 Gly Thr Gln Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg 325 330 335 Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro 370 375 380 Leu Asn Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln 405 410 415 Gly Glu Thr Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly 435 440 445 His Leu Pro Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Pro Glu Pro Glu Pro Gly Pro Glu Pro 515 520 525 Glu Pro Glu Gln Leu 530

Claims (1)

  1. 인간 LAG-3에 결합하며, 하기 특성:
    (a) 원숭이 LAG-3에 결합하는 특성;
    (b) 마우스 LAG-3에 결합하지 않는 특성;
    (c) 주요 조직적합 (MHC) 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 결합을 억제하는 특성; 및
    (d) 면역 반응을 자극하는 특성
    중의 적어도 하나를 나타내는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합부를 종양의 성장이 대상체에서 억제되도록 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
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