KR960015744B1 - 핵산을 증폭시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 핵산 증폭 방법을 일반적으로 설명한 것이다.
제2도는 증폭 방법을 시험하는데 사용하는 합성 올리고 뉴클레오티드 DNA 서열을 나타낸다:
제2도 a, gag 시험 서열;
제2도 b, gag 시험 서열.
제3도는 상이한 프라이머 농도를 사용한 증폭 반응을 PAGE 분석한 자동방사선 사진이다.
제4도는 상이한 주형 농도를 사용한 증폭 반응을 PAGE 분석한 자동방사선 사진이다.
제5도는 증폭 반응 상의 도트-블라트(Dot-blot) 혼성화의 자동방사선 사진이다.
제6도는 주형으로서 제한 단편을 사용한 증폭 반응을 PAGE 분석한 자동방사선 사진이다.
제7도는 간접적 핵산 증폭 공정을 일반적으로 설명한 것이다.
본 발명은 특이적 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
시료에 존재하는 특이적 핵산 서열을, 핵산의 상보적 서열을 가진 시료를 프로빙(probing)하여 탐지하는 것은 공지된 진단 기술이다. 핵산은 상보성 핵산과 결합함에 있어서 고도로 특이적이므로 특이적 핵산이 시료 중에 존재하는 지 여부를 결정하는데 유용하다. 연구자는 탐지하려는 특이적 핵산 서열을 알고 나서 특이적 핵산 서열에 상보적인 핵산을 갖는 프로브(probe)를 제조해야 한다.
본 출원에 있어서, "특이적 핵산 서열"은 증폭시키려는 단일 또는 이중 스트랜드의 핵산을 의미한다. "시료"는 핵산을 함유한 혼합물을 의미한다. "충분히 상보적인"은 프라이머와 주형인 두 핵산이 주어진 이온 강도 및 온도하에서 효과적인 프라이머 의존성 및 주형 의존성인 DNA 합성을 가능하게 하는 특이적 상호작용을 할 수 있다는 것을 의미한다.
핵산 프로브는 매우 특이적이기 때문에, 어떤 상황에 있어서는 핵산 서열에 의해 생성된 단백질보다 핵산 서열 그 자체를 프로빙하는 것이 적합하다. 특별한 예로서, 단백질 탐지만을 기초로 한 진단 방법은 B형 간염 바이러스의 감염성 입자의 존재 여부를 검출하는데 있어서 DNA 게놈이 결핍된 중요한 농도의 비감염성 항원 입자 때문에 비현실적일 것이다. 또다른 예로서, 전암의 종양 또는 양성의 경부 종양에서 발견되는 여러가지 아형(亞型)의 인체 유두종 바이러스는 핵산 프로브 혼성화의 방법으로만 구별할 수 있다. 또한, AIDS의 미생물학은 AIDS 특이 핵산 서열의 존재에 기인한 분석법이 진단법으로서 보다 우수함을 확신시킨다.
현재의 핵산 프로브 기술을 응용하는 최대의 난점 및 현재의 프로브 기술의 응용이 한정된 이유는 복제수에 관한 문제이다. 예를 들면, 바이러스 또는 세포에는 통상 특이한 유전자의 단일 복제 수가 존재한다. 이 단일 복제 수는 다수의 복제 수를 갖는 유전자 산물(즉, RNA 또는 단백질)을 생성한다. 이러한 이유 때문에, 탐지하려는 핵산의 특이적 서열이 단백질의 수천 복제 수를 초래하기 때문에 진단 기술은 때로 단백질을 프로브하는 것을 포함시켜 왔다.
복제 수가 세포 당 100,000 이하인 다수의 천연 리보솜 RNA는 핵산 프로브를 사용한 레지오넬라(Legionlla) 및 마이코플라즈마(Mycoplasma) 같은 특정 세균성 병원체의 진단을 용이하게 하는 유전자 프로브로서 사용하여 왔다. 그러나, 이러한 바이러스 같은 비세포성 병원체로서 사용할 수 없다. 병합된 프로바이러스(provirus)가 주변 혈액 임파구의 만분의 한개 미만으로 존재할 경우, 복제 수는 AIDS 바이러스를 탐지하기 위한 핵산 프로브 방법의 개발에 있어서 특별한 문제이다. 따라서, 만일 시료 중에 존재하는 것으로 보이는 특별한 핵산 서열이 증폭될 수 있다면, 복제 수 문제는 극복할 수 있으며, 프로브 분석은 보다 쉽게 사용할 수 있다.
적은 수의 세포 및 이로 인한 특이한 유전자의 적은 복제 수를 함유한 정상적인 생물학적 시료에 있어서, 복제 수 문제를 극복하기 위해서는 증폭 방법을 이용하는 것이 필요하다.
증폭하는 한 방법은 시료를 과대 성장시키는 것이다. 즉, 조건을 배열해서 시료내에 존재하는 살아있는 생물학적 물질이 저절로 복제할 수 있게 하는 것이다. 복제는 핵산 서열의 양을 탐지가능한 농도로 증가시킨다. 식품 산업에 있어서, 예를 들면, 식품에 해독을 끼치는 세균인 살모넬라에 대해 가공 식품을 시험하기 위해서, 식품 시료를 핵산의 양이 증가하는 날까지 배양해야 한다. 임상적인 시료에 있어서, 병원체 역시 상당한 시간 동안 성장시켜서 이들의 수가 증가하도록 해야 한다.
1987년 7월 28일 시투스 코포레이션(Cetus Corporation)에 특허된 미합중국 특허 제4,680,195호 및 1987년 7월 28일 시투스 코포레이션에 특허된 미합중국 특허 제4,683,202호 각각은 시료 중에 함유된 목적 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 미합중국 특허 제4,683,195호는 목적 핵산 서열을 함유하는 것으로 여겨지는 시료를 올리고뉴클레오티드 프라이머로 처리하여 프라이머 신장 생성물이 합성되고, 이어서 주형으로서 작용시켜 목적 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 프라이머 신장 생성물은 바람직한 실시 태양에서 주형으로부터 열변성을 이용하여 분리한다. 이와 유사하게, 미합중국 특허 제4,683,202호는 두개의 분리된 상보성 스트랜드를 갖는 목적 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 신장 생성물을 합성하기 위해 이들 스트랜드를 프라이머로 처리하고, 주형으로부터 프라이머 신장 생성물을 분리하고 나서 주형으로서 프라이머 신장 생성물을 이용하는 것이 포함되어 있다.
상기 두 미합중국 특허는 증폭 방법에 있어 수공 또는 기계적 참여 및 사용자에 의한 다단계 조작을 요한다. 이러한 특허에 포함된 단계는 사용자로 하여금 시료를 가열하고, 시료를 냉각시키고, 적절한 효소를 첨가한 후, 이들 단계를 반복하는 것을 요한다. 온도 변화는 효소의 활성을 잃게 한다. 따라서, 사용자는 증폭 과정 동안 적절한 효소의 정제수(aliquots)로 반복해서 증폭 혼합물을 보충하는 것이 요구된다.
또한, 미합중국 특허 제4,683,195호 및 제4,863,202호에 있어서, 증폭 과정의 각 주기는 제1주형으로부터 제2주형을 합성함으로써 일어나며, 제2주형은 제1주형을 합성하는데 사용된다. 이 과정이 반복되고, 따라서, 증폭 과정의 각 주기는 한 기질로부터 한 생성물을 합성하는 것을 기초로 한다.
선행 기술에 개시된 증폭 방법에도 불구하고, 증폭 방법을 개선해야 할 필요성이 요구되고 있다. 만일 증폭 방법에서 사용자가 보다 덜 참여하고 보다 적은 조작을 한다면, 바람직할 것이다. 또한, 증폭이 상대적으로 일정한 주변 온도에서 일어나서 증폭 과정에 수반되는 효소의 활성이 영향을 받지 않는다면 유리할 것이다. 주형이 증폭 과정의 각 주기에 있어서 하나의 기질에서 하나 이상의 생성물을 생성시키는데 사용될 수 있다면 보다 편리할 것이다.
본 발명은 통상의 증폭 공정 보다 편리하며 방법을 사용시 사용자의 더 적은 참여 및 보다 적은 조작을 요하는 증폭 방법에 관한 것이다. 증폭은 비교적 일정한 주변 온도에서 일어난다. 게다가, 과정의 각 주기는 하나의 기질로부터 다수의 복제 수를 갖는 생성물을 발생시킨다. 본 발명의 증폭 방법은 특이적 핵산의 양을 증가시킴으로써 복제 수 문제를 극복하는데 사용할 수도 있다. 따라서, 프로브 분석을 보다 용이하게 행할 수 있다. 또한, 증폭 방법은 통상의 클로닝 방법론을 대체한 것으로서 다수의 특이적 핵산 서열을 증가시키는데 사용할 수 있다.
본 발명에 한 측면에 의하면, 특이적 핵산 서열을 증폭하는 방법을 사용하였다. 이 방법은 단일 스트랜드 RNA, 단일 스트랜드의 DNA 및 이중 스트랜드의 DNA의 합성을 수반한다. 단일 스트랜드의 RNA는 제1프라이머에 대한 제1주형이다. 단일 스트랜드의 DNA는 제2프라이머에 대한 제 2주형이다. 이중 스트랜드 DNA는 다수 복제 수의 제1주형을 합성하는 제3주형이다. 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 대해 충분히 상보적이며, 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 대해 충분한 상동성을 갖는다. 제1프라이머의 3' 말단은 상보성 스트랜드 상의 제2프라이머의 3' 말단을 향해 배향되어 있다.
본 발명의 또다른 측면에 의하면, 특이적 핵산 서열을 증폭하는 방법을 사용하였다. 이 방법은 (a) 제1프라이머를 제1주형에 혼성화하는 것(제1프라이머는 제1주형의 RNA 서열에 대해 충분히 상보적인 RNA 서열을 가지고 있다), (b) 제1프라이머에 공유적으로 결합되고 제1주형의 DNA 서열에 상보적인 제1DNA 서열을 합성하는 것(제1DNA 서열 및 제1프라이머는 제2주형을 구성한다), (c) 제2프라이머가 혼성화되도록 제2주형에서 제1주형을 분리하고, (d) 제2프라이머를 제2주형에 혼성화하는 것(제2프라이머는 제2주형의 DNA 서열에 대해 충분히 상보적이며, 제2프라이머 역시 프로모터의 안티센스(antisense) 서열 및 RNA 폴리머라제의 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 가지고 있다), (e) 제2프라이머에 공유 결합되고 제2주형의 DNA 서열에 상보적인 제2 DNA 서열을 합성하고, 제2주형에 공유 결합되고 제2프라이머의 DNA에 상보적인 제3 DNA 서열을 합성하는 것(제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열, 제2프라이머 및 제2주형은 제3주형을 구성한다), (f) 제3주형에서 제1주형의 RNA 다수의 복제 수를 갖는 서열로 합성하는 것을 포함한다. 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열에 대해 충분히 상보적이며, 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 충분한 상동성을 갖는다. 제1프라이머의 3' 말단은 상보성 스트랜드 상이 제2프라이머의 3' 말단을 향해 배향된다.
본 발명의 다른 별법에 있어서, DNA의 제2프라이머는 그의 3' 말단에 제2주형의 DNA 서열에 충분히 상보적인 서열을 가지고 있다. 제2프라이머는 그의 5' 말단에 프로모터의 안티센스 서열 및 RNA 폴리머라제에 대한 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 가지고 있다.
본 발명의 다른 별법에 있어서, 제2주형에 공유 결합된 제3 DNA 서열은 그의 5' 말단에서 제2프라이머의 DNA 서열에 상보적이다.
본 발명의 또다른 별법에 있어서, 특이적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 사용하였다. 이 방법은 제1프라이머, 제2프라이머, 리보뉴클레아제 H, RNA 의존성 DNA 폴리머라제, DNA 의존성 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 시료와 결합하는 것을 수반한다. DNA의 제1프라이머는 RNA의 제1주형에 충분히 상보적인 서열을 가지고 있다. DNA의 제2프라이머는 DNA의 제2주형에 대해 충분히 상보적인 DNA 서열, 프로모터의 안티센스 서열, 및 RNA 폴리머라제에 의해 기질로서 인식되는 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 갖는다. 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 충분한 상보적이며 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산의 서열에 충분히 상동성을 갖는다. 제1프라이머의 3' 말단은 상보성 스트랜드상의 제2프라이머의 3' 말단을 향해 배향된다.
본 발명의 또 다른 방법에 있어서, 특이적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 사용하였다. 이 방법은 제1프라이머, 제2프라이머, 조류의 근아세포 분해 바이러스의 폴리머라제, 이.콜리(E. coli) 리보뉴클레아제 H, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스 페이트를 시료에 첨가하는 것을 수반한다. DNA의 제1프라이머는 RNA의 제1주형에 충분히 상보적인 서열을 가지며, DNA의 제2프라이머는 DNA의 제2주형에 충분히 상보적인 서열, 프로모터의 안티센스 서열, 및 T7 RNA 폴리모라제에 의해 기질에 인식되는 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 가진다. 제1프라이머의 서열 및 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 대해 충분히 상보적이며, 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 충분한 상동성을 갖는다. 제1프라이머의 3' 말단은 상보성 스트랜드 상의 제2프라이머의 3' 말단을 향해 배향된다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 특이적 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 증폭은 별도의 DNA 및 RNA의 합성을 수반하며, 제1도에 일반적으로 설명하였다. 이 과정에 있어서, 단일 스트랜드 RNA는 단일 스트랜드 DNA로 전환되고, 이어서 원래의 단일 스트랜드 RNA을 다수의 복제 수로 합성하는 기능적인 주형으로 전환시킨다. 제1프라이머 및 제2프라이머가 증폭 과정에 사용된다. 제1프라이머 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 충분히 상보적이며, 제1 또는 제2프라이머의 서열은 특이적 핵산 서열의 서열에 충분한 상동성을 갖는다. 몇가지 경우에 있어서, 제1프라이머 및 제2프라이머 모두는, 예컨대, 특이적 핵산 서열이 이중 스트랜드 DNA일 때, 특이적 핵산 서열에 대해 충분히 상보적이며 충분한 상동성을 갖는다.
RNA는 올리고뉴클레오티드 프라이머(제1프라이머)를 RNA(제1주형)에 혼성화하고 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 제1프라이머(제1 DNA 서열)로부터 상보성 스트랜드를 합성함으로써 단일 스트랜드 DNA로 전환시킨다. 생성된 단일 스트랜드 DNA(제2주형)를, 예를 들면 제1 주형을 가수분해시키고, RNA-DNA 하이브리드에 특이적인 리보뉴클레아제(예, 리보뉴클레아지 H)를 사용함으로써 제1주형으로부터 분리하였다. 제2주형은 제2주형의 3' 말단에 충분히 상보적이고 프로모터의 안티센스 스트랜드 및 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 함유한 서열의 5' 말단을 향한 서열을 그의 3' 말단에 함유한 합성 올리고 뉴클레오티드(제2프라이머)를 혼성화하고, 주형으로서 제2주형을 사용한 제2프라이머의 3' 말단에 공유 결합한 제2 DNA 서열을 DNA 의존성 DNA 폴리모라제를 사용하여 합성하고, 주형으로서 제2프라이머를 사용한 제2주형의 3' 말단에 공유 결합된 제3 DNA 서열을 DNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 합성함으로써 RNA 합성을 할 수 있는 형태로 전환하였다.
생성된 제2주형의 기능적 유도체인 제3주형은 제2프라이머에 의해 한정된 프로모터 및 전사 개시 부위에 특이적인 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 RNA인 제1 주형의 다수의 복제물을 합성하는데 사용하였다. 새로 합성된 제1주형은 주기를 반복함으로써 제2주형 및 제3주형의 또다른 복제물로 전환시킬 수 있다. 또한, 주기의 반복은 사용자의 참여 또는 조작을 필요로 하지 않는다.
증폭 과정은 적절한 반응 조건하에서 적절한 효소, 프라이머 및 보조인자를 적절한 주형에 첨가함으로써 시작한다. 이 주형 핵산은 동형이며 연속적인 증폭을 할 수 있는 형태로 되어 있고 제1도에 제시된 주기에 있어서 중간체로서 작용할 수 있다. 증폭 과정은 전체 전구 물질(프라이머, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트)의 순 소비 및 생성 물질(RNA 및 DNA)의 순 축적을 수반한다. RNA 및 DNA 합성의 과정은 충분한 농도의 핵산이 탐지가능한 농도로 합성될 때까지 비동시적으로 진행될 것이다. 증폭 과정은, 예컨대, 방사표지된 전구물질로부터 방사표지된 생성물을 합성함으로써 확인할 수 있다.
증폭은 제1도에 일반적으로 설명한 방법을 첨가하거나 대체한 또다른 방법을 수반할 수도 있다. 또한, 특정 허용가능하게 낮은 속도로 일어나는 역생산성 효소 반응이 가능하다. 가능한 비 생산성 부반응 중에는 첨가한 주형 핵산이 없이 RNA 및 (또는) DNA의 합성이 포함된다. 이러한 RNA 및(또는) DNA 산물은 특이적 핵산 서열에 프라이머가 결합하는 두 부위 사이에서만 발견되는 특이한 서열이 존재하는지를 결정함으로써 목적하는 산물로부터 분별할 수 있다.
제1주형의 3' 말단에 대해 충분히 상보적인 서열을 그의 3' 말단에 가진 제1프라이머는 올리고데옥시 뉴클레이티드이다. 제1프라이머의 서열은 3' 말단에 주어진 이온 강도 및 온도 조건하에서, 제1 DNA 서열이 특이적이고 충분한 합성을 할 수 있는 특정한 길이 및 염기 조성을 가지고 있다. 제1프라이머는 제1주기에 있어서 제1주형의 3' 말단의 내부 영역에 대해 충분히 상보적일 수 있다. 후속 주기에 있어서, 제1프라이머의 5' 말단은 제1주형의 3' 말단에 대해 상보적이다. 제1프라이머는 천연 데옥시뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사물로 부분적으로 또는 완전히 구성될 수 있다. 제1프라이머의 5' 말단은 제1주기의 제1주형에 대해 상보적이 아닌 서열을 함유할 수도 있다. 이 비상보적 서열은 고정될 수 있는 핵산 또는 탐지를 촉진하는 리포터(reporter)같은 유용한 비핵산 성분에 결합될 수 있는 핵산에 대해 상보적일 수 있다. 별법으로, 비상보적 서열은 프로모터의 안티센스 서열 및 RNA 합성에 사용될 수 있는 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 함유할 수 있다. 이 RNA는 제1주형에 대해 상보적일 수 있으며 또다른 증폭 주기에 있어서 중간체로서 사용할 수 있다.
제2프라이머는 제2주형의 3' 말단에 대해 충분히 상보적인 서열을 그의 3' 말단에 함유한 올리고데옥시리 보뉴클레오티드이다. 제2프라이머는 주어진 이온 강도 및 온도 조건하에서 제2 및 제3 DNA 서열이 특이적이고 기능적인 합성을 하게 하는 특정한 길이 및 염기 조성을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 제2프라이머는 기능적인 프로모터의 안티센스 서열 및 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 함유한다. 제3 DNA 서열을 합성하기 위한 주형으로 사용할 때, 이 서열은 특이적이고 기능적인 RNA 폴리모라제의 결합 및 목적하는 부위에서 전사의 개시를 하게 하는 충분한 정보를 가지고 있다. 프로모터 서열은 기능적인 프로모터의 안티센스 스트랜드로부터 유도될 수 있다. 전사 개시 부위는 천연 RNA 전사물의 5' 말단 서열로부터 유도될 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 제2프라이머의 5'- 말단 .서열은 AATTCTAATACGACTCACTATA GGGAG이다. 이 서열은 프로모터의 안티센스 서열 및 T7 RNA 폴리머라제의 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 함유한다. 별법으로는, 다른 파지 RNA 폴리머라제의 전사 개시 부위 및 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 프로모터 기능과 무관한 서열은 제2프라이머의 5' 말단, 또는 전사 개시 부위와 제2주형과 혼성화하는 3' 말단의 서열 사이에 포함될 수 있다. 제2프라이머는 천연 데옥시리보뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사물로 부분적으로 또는 완전히 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용한 모든 효소는 특정의 실질적인 요건을 갖추어야 한다. 각 효소 및 효소 제제는 때로 특정 DNA 폴리머라제 및 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드에 특이적인 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제와 연관된 5' 또는 3' 엑소뉴클레아제 활성화 같은 해로운 데옥시리보뉴클레아제("DNase")가 없어야 한다. 각 효소 및 효소 제제는 RNA 및 DNA의 하이브리드에 특이적인 리보뉴클레아제(예를 들면, 리보뉴클레아제 H) 활성의 바람직한 첨가를 제외하고, 해로운 리보뉴클레아제("RNase") 활성이 없어야 한다. 게다가, 각 효소는 다른 효소적 방법 및 올리고뉴클레오티드 프라이머를 RNA 또는 뉴클레아제 주형에 혼성화시키는 것과 같은 비효소적 공정에 사용되는 통상의 반응 조건하에서 적합한 활성을 지녀야 한다.
본 발명에 사용한 DNA 의존성 RNA 폴리머라제는 프로모터로 칭해지는 특정 DNA 서열에 결합할 수 있고 프로모터에 아주 근접하여 한정된 개시 부위에서 시험관내 RNA 합성을 특이적으로 개시할 수 있는 효소이면 어느것이라도 좋다. 프로모터 및 개시 부위는 제2프라이머의 일부를 구성한다. 또한, RNA 폴리머라제는 적당한 시간내에 주형의 기능적인 복제물 당 수개의 RNA의 복제물을 합성할 수 있어야 한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 사용하였다. 또한, 파지 T3, 파지 φⅡ,살모넬라(Salmonella) 파지 sp6 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 파지 gh-1과 같은 다른 박테리오파지 RNA 폴리머라제를 사용할 수도 있다. 별도의 RNA을 사용할 경우, 특정 RNA 폴리머라제의 주형 특이성에 따라 프로모터 및 제2프라이머의 개시 부위에 대한 적절한 변형을 시켜줘야 함을 이해해야 할 것이다.
본 발명에서 사용한 RNA 의존성 DNA 폴리머라제는 올리고데옥시뉴클레티드 프라이머 및 RNA 주형으로부터 DNA를 합성할 수 있는 것이면 어떠한 효소라도 좋다. 또한, 이 효소는 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 및 RNase H에 대한 활성을 함유해도 좋다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 조류의 근아세포 분해 바이러스성 폴리머라제("AMV 역전사 효소")를 사용하였다. 또한, RNA 의존성 DNA 폴리머라제는말로니(Maloney) 쥐의 백혈병 바이러스 같은 다른 레트로바이러스의 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용할 수도 있다. 별법으로는, 다른 진핵성 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용한 DNA 의존성 RNA 포리머라제는 올리고데옥시뉴클레오티드 프라이머 및 DNA 주형으로부터 DNA를 합성할 수 있는 것이면 어떠한 효소라도 좋다. 이 효소는 많은 유형의 DNA 폴리머라제와 연관된 5'- 또는 3'-엑소뉴클레아제 활성중의 하나를 포함해서는 안된다. 바람직한 실시 태양에 있어서, AMV 역전사 효소를 사용하였다. 그러나, 자연적으로 5'- 또는 3'-엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 다른 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 이것들은 소의 흉선과 같은 포유동물의 조직으로부터 분리할 수 있는 DNA 폴리머라제인 DNA 포리머라제 α 또는 β와 같은 진핵성 DNA 폴리머라제를 함유할 수 있다. 이와는 별도로, 비적합한 DNA 폴리머라제는 바람직하지 않은 엑소뉴클레아제 활성을 제거하고, DNA 폴리머라제 유전자를 변경시켜서 적절한 숙주 세포내에서 변경시킨 폴리머라제를 발현시키거나 DNA 폴리머라제 단백질을 화학적으로 변형시킴으로써 유용하게 할 수 있다. DNA 폴리머라제의 변형은 이.콜리 DNA 폴리머라제Ⅰ또는 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제의 클레나프(klenow) 단편으로부터 행할 수 있다. 이러한 별법의 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성은, 바람직한 실시 태양에 있어서, RNA 의존성 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 모두의 활성이 동일한 효소에 의해 공급되기 때문에 RNA 의존성 DNA 폴리머라제에 의해 제공되는 활성을 보충하기 위해 첨가됨을 이해해야 한다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 RNase H는 상보성 DNA에 어니일링(annealing)될 수 있는 RNA 가수분해할 수 있는 것이면 어느 효소라도 좋다. 이 효소는 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드 RNA 또는 임의의 DNA도 가수분해 할 수 없어야 한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 이. 콜리 RNase H를 사용하였다. 또한 소의 흉선 RNase H 같은 다른 RNase H 효소를 사용할 수 있다. RNase H는 AMV 역전사 효소의 고유한 활성이 있기 때문에, 이.콜리 RNase H는 , 바람직한 실시 태양에 있어서, AMV 역전사 효소의 RNase H를 보충해야 할 것이다. 별법으로서, 제1주형으로부터 제2주형을 분리할 수 있는 다른 임의의 효소를 사용할 수 있다.
상기한 효소 및 프라이머들은 DNA 및 RNA 모두의 합성을 위한 필요한 완충액 및 보조인자를 함유한 반응 용기에서 함께 혼합할 수 있다. 또한, 이온 강도 및 반응 온도는 당업계에 숙련된 자들에게는 공지된 바와 같이 프라이머를 DNA 및 RNA 주형에 특이적으로 혼성화에 상용할 수 있어야 한다. 반응 혼합물은 특히 효소 활성을 크게 억제하거나, 프라이머 및 주형의 혼성화를 방해하거나, 또는 비생산적으로 핵산 매개체 및 산물을 분해하는 물질같은, 증폭 공정을 방해하는 시약이 없어야 한다.
가능한 탐지 방법의 설명은 증폭 방법을 응용하는데 유용할 수도 있다. 증폭 과정에서 합성된 핵산을 탐지하는데 사용되는 방법은 본 명세서에 기재된 내용에 국한되지 않음을 이해해야 하며, 이것은 다른 방법도 사용할 수 있는 것으로 고려해야 된다.
한 실시 태양에 있어서, 방사 표지된 전구 물질을 반응 혼합물에 첨가해도 좋다. 증폭 과정은 당업계에서 공지된 방법을 사용함으로써 표지된 생성물을 정량적 또는 정성적으로 분석함으로써 결정된다. 표지된 전구 물질로부터 분리될 수 있는 표지된 전구 물질은 RNA 합성을 탐지하기 위한 리보뉴클레오티드 트리포스페이트이거나, 또는 DNA 합성을 탐지하기 위한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 올리고뉴클레오시드 프라이머일 수 있다. 표지의 형태는 방사성 동위 원소이거나, 또는 바이오틴, 크로모 포어, 플루오로포어, 또는 항체 또는 가능하게는 단백질이나 효소와 결합할 수 있는 합텐 같은 유용한 화학적 기일 수 있다. 표지된 생성물은 용해도, 전하 또는 크기를 기초로 하여 표지된 전구 물질로부터 분리할 수 있다. 또한, 표지된 DNA 또는 RNA는 상보적인 서열을 함유하고 고정화시킬 수 있는 핵산에 혼성화시킬 수 있다.
또다른 실시 태양에 있어서 증폭 과정의 생성물은, 상보적인 서열을 함유한 핵산 프로브에 혼성화되고 용액 중에 남아 있는 비혼성화된 핵산 프로브로부터 분리된 고정된 지지체에 결합시킬 수 있다. 생성물인 DNA 또는 RNA는 친수성, 정전 또는 공유 결합 같은 모든 안정된 상호 작용에 의해 고체 지지체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 생성물은 예컨대, 아비딘 또는 스트렙토아비딘 같은 고정된 단백직에 결합할 수 있는 증폭 과정 동안 생성물에 혼입될 수 있는 바이오틴 같은 특정 화학적 기를 함유할 수도 있다. 또한, 생성물은 상보적 서열을 함유하고 고정화될 수 있는 핵산에 혼성화 될 수 있다. 핵산 프로브는 혼성화 조건하에서 결합 및 비혼성화된 핵산 프로브를 제거하는데 사용한 조건하에서 지지된 결합을 하게 하도록 증폭 공정의 생성물과 충분히 안정된 상호 작용을 형성하는 상보적 서열을 함유할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상보적 서열은 제1프라이머 및 제2프라이머의 서열 사이에 있는 특이적 핵산 서열의 일부로부터 유도할 수 있다. 핵산 프로브는 단일 스트랜드 DNA 또는 RNA, 또는 단일 스트랜드로 될 수 있는 이중 스트랜드의 DNA 또는 RNA, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 (또는)리보뉴클레오티드로 구성될 수 있는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 핵산 프로브는 적절한 조건하에서 DNA 또는 RNA 생성물과 공유 결합할 수 있는 화학적 기를 함유할 수 있다. 핵산 프로브는 바이오틴, 크로모포어, 플루오로포어, 또는 항체와 결합할 수 있는 합텐과 같은 유용한 화학적 기로 표지시켜도 좋다. 뿐만 아니라, 핵산 프로브는 단백질 또는 예컨대, 포스파타제 및 퍼옥시다제 같은 효소에 접합시킬 수 있다. 또한, 핵산 프로브는 시험관 내에서 프로브를 복제하게 하는 서열을 함유할 수도 있다.
이는 분자 클로닝 기술에 의해 증강되어온 핵산에 전형적으로 사용된 방법으로 분석할 수 있다. 한가지 별법에 있어서, 특이적 DNA 서열의 합성은 합성한 DNA를 제한 효소로 절단하고, 이어서 전기영동 분리를 행한 후, 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 탐지할 수 있다. 또다른 벌법으로는, 증폭된 RNA의 서열을 RNA 의존성 DNA 폴리머라제, 제1프라이머 및 디데옥시뉴클레로시드 트리포스페이트를 사용한 DNA 합성에 의해 탐지할 수 있다(스토플랫(stoflet)등., 1988년). 또다른 별법으로는, 증폭된 제3주형의 서열을 증폭 과정에서 사용된 DNA 의존성 RNA 폴리머라제 및 3'-디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하는 RNA 합성에 의해 결정할 수 있다(악셀로드(Axelrod)와 크래머(Kramer, 1985년). 또다른 별법으로는, 증폭된 RNA는 시험관 내에서 해독될 수 있는 펩티드를 코팅할 수 있다. 시험관 내에서 해독된 폴리펩티드 생성물은 항체를 사용함으로써 분석할 수 있다. 특이적 핵산 서열을 함유한 것으로 여겨지거나 함유한 것으로 알려진 시료는 동형일 수 있고 계속적인 증폭을 할 수 있으며 제1도에 나타낸 주기에 있어서 하나의 중간체일 수 있는 주형 핵산의 형태로 혼합물에 첨가시킨다. 특히, 주형 핵산은 그의 5' 말단에 제2프라이머의 3' 말단에 대해 충분히 상보적인 서열을 함유하고 제1프라이머에 대해 충분히 상보적인 서열을 함유한 단일 스트랜드의 RNA일 수도 있다. 이 형태의 주형 핵산은 증폭 과정에서 제2주형으로 작용할 것이다. 별법으로서, 주형 핵산은 이것의 3' 말단에 제2프라이머의 적어도 3' 말단에 충분히 상보적인 서열을 함유하며 제1프라이머의 3' 말단에 충분히 동형인 서열을 함유한 단일 스트랜드 DNA일 수 있다. 이 형태의 주형 핵산은 증폭 과정에서 제2주형으로 작용할 것이다. 별법으로, 주형 핵산은 하나의 스트랜드가 5' 말단에 제2프라이머의 전체 서열을 함유하고, 제1프라이머에 대해 충분히 상보적인 서열을 함유한 이중 스트랜드 DNA일 수도 있다. 이중 스트랜드 DNA는 증폭 공정에 있어서, 제3주형으로 작용한다. 주형 핵산 제조가 증폭 과정의 일부는 아니나, 주형 핵산을 생성하는 가능한 반응의 기재는 증폭 방법을 응용하는데 유용할 것이다. 주형 핵산을 얻는데 사용될 수 있는 반응은 상기한 별법에 제한되지 않고, 다른 방법을 사용할 수도 있다는 점을 숙지해야 할 것이다.
한 별법에 있어서, 제1주형으로서 기능하는 주형 핵산은 천연 RNA 또는 당업계에서 공지된 부위 특이적 가수 분해 방법(site apecific hydrolysis methods)을 사용하여 보다 큰 RNA 분자로부터 발생시킬 수 있는 RNA 단편일 수 있다(시바하라(shibahara)등., 1987년).
또다른 별법에 있어서, 제2주형으로 기능하는 주형 핵산은 제2프라이머의 3' 말단에 대해 충분히 상보적인 서열은 즉시 플랭킹(flanking)하는 부위를 가진 이중 스트랜드 DNA를 제한 효소로 절단함으로써 생성할 수 있다. 이어서, 생성된 이중 스트랜드 DNA 단편은 화학적 또는 열 변성 방법을 사용하여 단일 스트랜드로 만들 수 있다.
또다른 별법에 있어서, 제2주형으로 기능하는 주형 핵산은 단일 스트랜드 DNA 또는 DNA 합성을 차단할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼성한 단일 스트랜드 DNA 또는 RNA로부터 생성할 수 있다. 이러한 차단 올리고뉴클레오티드는 적절한 조건하에서 주형과 공유 결합할 수 있는 화학적 기를 함유할 수 있다. 제1프라이머를 사용한 이 차단된 주형으로부터 DNA를 합성하는 것은 제2주형으로서 동일한 3' 말단을 가진 합성된 DNA를 생성한다. 만약 원래 주형이 RNA일 경우, 생성된 DNA-RNA 하이브리드는 주형 핵산으로서 직접 사용할 수 있다. 만약 원래의 주형이 DNA일 경우, 이어서 생성된 제2주형의 복제물을 화학적 또는 열 변성법을 사용함으로서 원래의 주형으로부터 분리시킬 수 있다.
또다른 별법에 있어서, 제3주형으로서 기능하는 주형 핵산은 제2프라이머를 사용한 DNA 또는 RNA 주형으로부터 DNA를 합성함으로써 단일 스트랜드의 DNA 또는 RNA로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 생성되는 합성 DNA는 화학적 또는 열 변성법을 사용하여 원래의 주형으로부터 분리할 수 있다. 또한, RNA 주형은 화학적 또는 효소적 방법을 사용함으로서 가수 분해시킬 수 있다. 생성된 단일 스트랜드 DNA는 그의 5' 말단에 공유 결합된 제2프라이머의 서열을 가지며 제1프라이머에 충분히 상보적인 서열을 함유한다. 이 단일 스트랜드 DNA는 제1프라이머를 단일 스트랜드 DNA에 혼성화하고, 제1프라이머에 공유 결합하고 한 가닥 DNA에 상보적인 DNA 서열을 합성함으로써 전사적으로 기능하는 이중 스트랜드 DNA로 전환시킬 수 있다.
또다른 별법에 있어서, 단일 스트랜드 DNA 또는 RNA 주형은 화학적, 열 또는 가능하게는 효소적 방법을 사용함으로써 이중 스트랜드 DNA, 이중 스트랜드 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드로부터 얻을 수 있다. 따라서, 상기 별법 중의 한 방법을 사용함으로써 생성된 단일 스트랜드 DNA 또는 RNA는 제1, 제2 또는 제3주형으로서 작용할 수 있는 주형 핵산을 발생시키는데 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, 제1프라이머 및 하나의 스트랜드의 핵산을 수반하는 별법, 및 제2프라이머 및 다른(상보적인) 핵산 스트랜드를 수반하는 또 다른 별법은 현재 핵산 주형을 생성하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 사용한 재료 및 방법은 하기와 같다.
재료 및 방법
재료
올리고뉴클레오티드는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 합성에 사용한 컬럼, 포스포라미디트 및 시약들은 테크니컬 마켓팅 어소시에이트츠(Technical Marketing Associates)를 통하여 어플라이드 바이오시스템사로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 DEAE 셀룰로오즈 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 방사성 동위원소 [α-32p] UTP(800ci/nmol)은 아머샴(Amersham)으로부터 구입했다. DNA를 절단하고 결찰하는 효소들은 뉴우 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사로부터 구입하였으며 공급자의 지시에 의하여 사용하였다. 큰 단편의 폴리머라제 1(클레나프)를 함유한 제제들 역시 뉴 잉글랜드 바이오랩스사로부터 구입했다. 프로메가 바이오텍(Promega Biotec)사의 RNasin 및 T7 RNA 폴리머라제는 바이오/칸 사이언티픽 인크(Bio/can Scientific Inc.)를 통하여 구입하였다. 역전사 효소 및 RNase H는 파마시아(Pharmacia)사로부터 구입하였다. 프로테이나제 K의 공급사는 뵈링거 만헤임 캐나다(Boehringer Mannheim Canada)였다. 이.콜리 균주 HB101(ATCC 33694)는 모든 형질전환에 사용하였다. 폴리스미드 pUC19[노란더(Norrander)등, 1983년]은 베테스다 리써치 레버러토리즈(Bethesda Reseach Laboratories)사로부터 구매하였다.
DNA의 분리 및 서열화
이.콜리 형질전환체를 50㎛/ml 앰피실린을 함유한 YT 배지(밀러 Miller, 1972년)에서 성장시켰다. 플라스미드 DNA는 신속한 가열법[rapid boiling Method][홀메즈(Holmes)와 퀴글레이(Quigley), 1981년]에 의해 정제하였다. 모든 구조물에 사용한 DNA 단편 및 벡터들은 저융점 아가로즈 상에서 전기영동에 의해 분리하고, 페놀 추출 및 에탄올 침전법에 의해 용융된 아가로즈로부터 정제하였다.[마니아타스(Maniatis)등., 1982년] 플라스미드 DNA는 디데옥시법[생거(sanger)등, 1977년]의 변형법[하토리(Hattori) 등., 1985년]을 사용하여 서열화 하였다. 반응은 -20 일반적인 프라이머(뉴잉글랜드 바이오랩스에서 구입했음)를 사용하여 진행시켰다.
TCA 침전
증폭 반응액의 부분 표본 5㎕를 10mM EDTA 20㎕중에 급냉시키고, 모든 시료가 수집될 때까지 얼음위에 방치하였다. 이어서 급냉된 시료들을 유리 여과 디스크에 걸고, 즉시 빙냉 5% 트리클로로아세트산("TCA")-1% 소듐 피로포스페이트에 10분 동안 간헐적으로 혼합시키면서 적가하였다. 빙냉 5% TCA로 5분간 세척을 2회 행한 후, 95% 에탄올로 추가로 2회 세척하고 동결건조시켜 건조시켰다. 방사 활성은 리퀴드 신틸레이션 카운터에서 결정하였다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동
시료 1 내지 6㎕를 포름아미드 염료(90% 탈이온된 포름아미드, 10mM 트리스 HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 크실렌 시아놀 및 브로모페놀블루] 4 sowl 5μl로 혼합시켜 미리 가동시킨 12cm 길이의 7%의 변성 폴리아크릴 아미드 겔에 걸었다. 브로모페놀 블루 염료가 바닥에 도달할 때까지 이들 겔을 350V에서 이동시켰다. 몇몇 경우에 있어서, 겔들을 자동 방사선 분석에 앞서 고정한 후, 건조시켰다. 고정은 10% 메탄올-7% 아세트산 중에서 15분간 세척을 수반했다. 이 방법에 의해 분리된 RNA 생성물의 프로파일은 실온에서 자동 방사선 사진법으로 관찰하였다.
실시예 1
gag 시험 시스템을 위한 올리고뉴클레오티드의 설계 및 합성
합성 DNA 서열(제2도 A)은 EcoRI 부위, T7 파지 프로모터, T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시에 필요한 서열 및 19 bp 혼성화 영역(혼성화 영역 1)을 함유하도록 디자인하였다. 이러한 요소들을 크로닝하는데 있어서 수반되는 47염기의 안티센스 스트랜드 올리소뉴클레오티드(T7H1, GAG) 역시 제1프라이머로 작용한다. 혼성화 영역 2는 혼성화 영역 1에서 53bp 떨어진 곳에 위치하며, 길이는 20염기쌍이다. 이 영역(H2, GAG)에 만들 프라이머는 센스 스트랜드의 20염기 올리고뉴클레오티드 복제물이며 클로닝에는 사용하지 않았다. 혼성화 영역을 함유하는 서열은 HTLV-Ⅲ 게놈(AIDS의 유발제)의 gag 부위의 92 염기쌍의 세그먼트이다. 프라이머는 기능적으로 혼성화하는 것으로 여겨지며, 이들 두 혼성화 영역 사이의 거리가 비교적 짧기 때문에 이 특정 유전자 세그먼트를 선택하였다. 또한, 클로닝을 용이하게 하기 위해 XbaI 부위를 서열의 말단에 위치시켰다. gag 시험 서열은 또한 재조합체를 선별하는데 보조할 수 있는 SphI 및 PstI 부위를 포함하였다.
전체 4개의 올리고뉴클레오티드를 이 단편의 클로닝에 사용하였다. gag1 시험 및 gag2 시험 서열 모두의 구조화에 사용된 N1.GAG는 아티센스 스트랜드를 완성하며 클로닝 과정에서만 사용하였다. 이와 유사하게, T74.PRO는 T7 프로모터의 센스 스트랜드 성분이다. 그러나, N2.GAG를 두 테스트의 단편의 구조화에 사용하였으며, 또한 증폭 주기의 두 단계에서 중간체(제2주형)로서 사용하였다. 전체 클로닝된 gag 시험 단편은 또한 증폭 주기의 중간체(제3주형)를 나타낼 수 있다. 일단 적절한 벡터 내로 클로닝되면, DNA는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 전사되어 세단계에 수반되는 증폭 중간체로서 유용한 RNA 단편(제1주형)을 생성할 수 있다. 뿐만 아니라, T7HI.GAG 및 H2.GAG는 이 시험 시스템에 있어서 프라이머로 작용한다.
gag2 시험 합성 DNA 단편(제2도 B)은 T7 프로모터를 포함하지 않으나, 나머지 서열은 gag 시험 서열과 동일하므로 이들 두 NI.GAG 및 N2.GAG를 이들의 구조화에 포함시켰다. 안티센스 스트랜드를 완성하는데 필요한 올리고뉴클레오티드는 H1.GAG이다. 일단 클로닝되면, gag2 시험 단편은 주형 핵산으로서 DNA 제한 단편을 사용하여 증폭을 확인하기 위한 주형으로서 사용할 수 있다.
실시예 2
gag 시험 플라스미드의 구조화
올리고뉴클레오티드 T74.PRO 및 N1.GAG(각각 2㎍)를 70mM 트리스 HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM APT 및 5단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나이제를 함유한 반응물 20㎕중에서 37℃에서 30분 동안 독립적으로 인산화시켰다. 인산화된 T74.PRO 및 N1.GAG(각각 10㎕)를 gag 시험 어셈 블리에 대해 최종 용적 29㎕중에 각각 비인산화된 T7H1.GAG 및 N2GAG 1㎕, 및 100mM 트리스 HCl(pH 7.8)-500mM NaCl 3㎕과 함께 혼합하였다. gag2 시험 혼합물은 최종 용적 18㎕중에 인산화된 N1.GAG 10㎕ 각 비인산화된 된 H1.GAG 및 N2.GAG 1㎍, 및 100mM 트리스 HCL(pH 7.8)-500mM NaCl 1.8㎕을 함유했다. 올리고뉴클레오티드 혼합물을 90℃에서 10분간 방치한 후, 10 내지 16시간 동안 천천히 실온까지 온도를 낮춤으로써 혼성화시켰다. 50mM 트리스 HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 20mM DTT, 1mM ATP 및 50㎍/ml BSA를 함유한 반응액 60㎕을 혼성화된 올리고뉴클레오티드들을 함께 결찰시키는데 사용하였다. 400단위의 T4 DNA 리가제를 gag 시험 반응액에 첨가하였고, gag2 시험 반응액을 200 단위의 T4 DNA 리가제로 14 내지 16 시간 동안 배양시키는 동안 이것을 15℃에서 2시간 동안 배양시켰다.
단리하여 정제한 합성 DNA 세그먼트를 폴리링커 영역 내의 제한 효소 부위에서 절단시킴으로써 선형화한 플라스미드 pUC19와 혼합하였다. T4 DNA 리가제는 gag 시험 서열을 pUC19의 EcoRI-XbaI 단편에 결찰시키는데 사용한 반면, gag2 시험 서열은 SmaI-XbaI 단편에 결찰시켰다. 이.콜리를 형질전환시키는데 이러한 반응을 사용하여 얻은 형질전환체의 플라스미드를 DNA 제한 분석법으로 선별하였으며, 최정 플라스미드(pGAG.TEST 및 pGAG2.TEST)를 서열 분석법으로 정확하게 결정하였다.
실시예 3
DNA 증폭에 있어서 프라이머 농도의 영향
gag 시험 올리고뉴클레오티드로부터 전사된 RNA를 증폭시키는데 사용한 반응 혼합물 25㎕를 50mM 트리스 HCl(pH 8.45), 6mM MgCl2, 40mM KCl, 10mM 디티오트레이톨, 0.5mM NTP(ATP, CPT, GTP, UTP), 1mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 20단위 RNasin., 10단위 T7 RNA 폴리머라제, 10단위 역전사 효소, 0.4단위 RNase H 및 10㎕Cl[α-32p]UTP를 함유했다. 두 반응액은 0.5ng(0.015피코몰) N2.GAG를 함유한 반면, 다른 두 반응액은 어떤 주형도 함유하지 않았다. 프라이머 T7H1.GAG 및 H2.GAG는 N2.GAG을 함유하거나 또는 주형을 함유하지 않은 용액에 각각 3.4㎕M 또는 0.34㎕M의 최종 농도에서 첨가하였다. 반응액을 42℃에서 2시간 동안 배양 하였다. RNA의 전체적인 합성은 30분 간격의 cpm당 용해하지 않은 TCA의 혼입 정도를 측정함으로써 확인하였다. 주형 의존성 RNA 합성에 있어서 프라이머 농도의 영향을 표 1에 나타냈다. 등량의 합성 RNA를 함유한 각 반응액의 부분 표본을 PAGE 및 자동방사선 사진법으로 분석하였다(제3도, 레인 1 내지 4는 반응액과 동일하게 번호를 표시했다).
[표 1]
본 발명자들은 반응액 1이 동위원소를 최대로 혼입한 결과를 초래한 반면, 주형을 함유하지 않은 대조 반응액 2도 역시 높았으며(반응액 1의 73%), 매우 유사한 전기영동 형태를 나타냄을 발견하였다. 따라서, 높은 농도의 프라이머의 존재하에서, 증폭시 예측되는 크기의 RNA 전사물이 주형이 없이도 생성되는 것으로 보인다. 프라이머 농도를 10배 감소시킨 시료를 사용한 결과를 극적으로 상이하였다. 반응액 3에서 생성된 RNA의 양은 반응액 4의 양의 2.6배 였으나, 궁극적으로 모든 전사물은 반응액 3의 예측된 크기의 단일 밴드로 발견된 반면, 반응액 4에 있어서 60 내지 70b 이상의 단편은 발견되지 않았다. 따라서, 프라이머 농도는 RNA 증폭의 정확도 및 효율성에 있어서 중요한 작용을 한다.
증폭 시스템에 의해 발생된 것으로 예측되는 단편의 크기를 나타내는데 사용한 대조용 RNA 전사물(제3도의 레인 0)은 시험 플라스미드의 전사에 의해서 제조되었다. pGAG.TEST을 XbaI으로 절단하여 선형화하고, 프로테이나제 K처리한 후(마니아티스 등, 1982), 페놀 추출 및 에탄올 침전시켰다. 이어서, T7 RNA 폴리머라제를 공급자의 지시에 따라 10μCi[α-32p] UTP를 함유한 25㎕ 반응 혼합물 중에서 생성된 단편 0.5g을 전사시키는데 사용하였다.
실시예 4
RNA 증폭에 미치는 기질 농도의 영향
gag 시험 올리고뉴클레오티드로부터 전사된 RNA를 증폭시키는데 사용된 표준 혼합물 50㎕은 0.34μM T7H1.GAG, 0.34μM H2.GAG, 50mM 트리스 HCl(pH 8.45). 6mM MgCl2, 40mM KCl, 10mM DTT, 0.5mM NTP, 1mM dNTP, 40단위 RNasin, 20단위 T7 RNA 폴리머라제, 20단위 역전자 효소, 0.8단위 RNase H 및 10 내지 20μCi[α-32p] UTP를 함유하였다. 반응액은 1ng에서 1fg에 이르는 다양한 양의 주형(N2.GAG)를 함유했다. 한 반응액은 주형을 함유하지 않았다. 이 반응물을 42℃에서 3시간 동안 행하였으며, 그동안 전체의 RNA 합성은 30분 간격의 cpm당 용해되지 않은 TCA의 혼입을 측정함으로써 조사하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 전체 RNA 합성은 시험된 모든 주형 농도에 비해 주형을 함유하지 않은 것보다 더 높았다. 전체 RNA의 합성은 주형 농도가 감소함에 따라 줄어들긴 했으나 합성에 있어서 이러한 감소는 양적인 의미가 없는 것이다. 따라서, 출발 주형 당 RNA의 증폭 정도는 일반적으로 주형 농도가 감소함에 따라 증가하였다. N2.GAG 1fg으로부터 0.8μg RNA를 합성함으로써 8×108배가 증폭되었다. 102 염기의 N2.GAG 올리고뉴클레오티드 1fg는 대략 2×104몰을 나타낸다.
[표 2]
3시간의 반응 후 합성된 RNA는 각 주형 농도에 대해 pGAG로 분석하였다(제4도의 레인 1 내지 8은 반응액과 동일하게 번호를 표시하였다). 약 100염기의 RNA를 나타내는 주 밴드는 1fg 주형을 함유한 것과 주형을 함유하지 않는 것을 제외한 모든 반응액에서 존재하였다. 1fg 주형을 함유한 반응액은 3시간 후에 이 100 염기 산물을 다량으로는 갖지 못했으나 전체 RNA 합성은 주형이 없는 반응액보다 높고 정량적으로 상이하였다.
실시예 5
RNA 산물의 혼성화 분석
1pg에서부터 0.1fg에 이르는 다양한 양의 N2.GAG를 함유한 증폭 반응을 방사성 표지된 UTP를 제외하고는 실시예 4의 지시에 따라 행하였다. 반응액을 42℃에서 3시간 동안 배양하였다. 각각의 반응액으로부터 30분 간격으로 부분 표본을 뽑아내어 나일론 멤브레인[아머샴(Amersham) 제품]에 걸었다. 이러한 반응액의 부분 표본에 함유된 핵산을 자외선 광에 노출시켜 고정하였다. 멤브레인을 최종 농도 50% v/v 포름아미드, 5×SSC 및 5×덴하르트(Denhardt's)의 용액(마니아티스 등, 1982년; 서던(Southern)등, 1975)으로 구성된 전혼성화 완충액중에서 100㎠당 5ml의 용액에 상당하는 용적에서 50℃, 1시간 동안 미리 혼성화시키고 혼성화 용액의 106cpm/ml의 특이적 활성을 갖는 방사성 표지한 프로브로 혼성화하였다. 혼성화는 50% 포름 아미드, 5×SSC 및 5×덴하르트의 용액(마이나티스 등, 1982년; 서던 등, 1975년)중에서 50℃에서 16시간 동안 행하였다. 방사성 표지한 프로브는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 (α-32p) ATP를 사용하여 5' 말단에 표지시킨 합성 올리고뉴클레오티드 5' GATCTGGGATAGAGTACATCCA 3'이다. 후에, 멤브레인을 50℃에서 2×SSC, 0.1% v/v SDS 및 0.2×SSC, 0.1% 용적비 SDS로 이루어지는 세척액(서던 등, 1975; 마니아티스 등, 1982; 스조스탁(Szostak) 등, 1979)중에서 2,3분 주기로 세척하였다.
제5도는 다른 배양 시간에서 시료를 모은 다양한 양의 N2.GAG 주형을 함유한 증폭 반응액 상에서 수행된 혼성화 분석의 결과를 나타낸다.
제5도를 세로줄 각각은 다른 시점(1, 30분 ; 2, 40분 ; 3, 90분 ; 4, 120분; 5, 150분 ; 6, 180분)을 나타내며 가로줄 각각은 첨가된 다른 양의 N2.GAG 주형(1,1pg ; 2,100fg ; 3,10fg ; 4,1fg ; 5.01fg ; 6, 주형이 없음)을 나타낸다. 표지시킨 프로브에 혼성화된 핵산의 증폭은 가로줄 1 내지 3(1pg 내지 10fg)에서 발견되었으나, 가로줄 4 내지 5(1fg,0.1fg)에 있어서 특이적 핵산에 대한 혼성화는 가로줄 6(주형이 없음) 보다 높지 않았다. 가로줄 6의 표지된 프로브의 뚜렷한 비특이적 결합은 혼성화 시그날이 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 DNA 또는 RNA 합성과 연관된 것으로 보인다.
실시예 6
주형으로서 DNA 제한 단편의 사용
플라시미드 pGAG2.TEST를 MspI으로 절단하고, 프로테이나제 K로 처리한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전하여 정제하고, 5분 동안 가열하여 변성시켰다. 증폭 반응은, MspI 절단시킨 pGAG2.TEST를 N2.GAG 올리고뉴클레오티드 대신에 주형으로 사용하는 것을 제외하고는 표 4의 지시에 따라 행하고 분석하였다. 각각의 반응액에 첨가한 플라스미드의 양은 55ng에서부터 5.5pg 및 주형이 없는 것까지 다양했다. 실제의 시료에 존재할 수 있는 추가의 DNA를 자극시키기 위해, 별도의 반응액은 유사 방법으로 절단하고 정제한 후 변성시킨 소의 흉선 DNA 1μg을 함유했다. 3시간 동안 42℃에서 배양시킨 후, RNA의 합성은 TCA 침전 및 PAGE 분석에 의해 결정하였다. 표 3에 나타냈듯이, 전체 RNA 합성은 시험된 모든 주형의 농도에 대해 주형이 없는 대조물보다 높았다. 증폭 정도는 1.8%의 전체 플라스미드 DNA인 실제의 주형으로부터 RNA 합성을 기초로 하여 계산하였다. 주형의 특정 초기 농도로부터의 전체 RNA 합성(증폭의 정도)은 합성 올리고뉴클레오티드 주형(표 2)의 농도에 비하여 제한 단편(표 3)에서는 일정하게 보다 낮았다. 이는 사용된 조건하에서 제한 단편 주형이 상보적 스트랜드와의 경쟁에 기인할 수 있다.
[표 3]
* 괄호의 수는 동량의 N2.GAG를 나타낸다.
** 대괄호의 수는 1㎍ MSPI-절단시킨 소의 흉선 DNA의 존재 하에서 RNA 합성을 나타낸다.
3시간의 반응후에 합성된 RNA를 PAGE법으로 분석하였다(제6도, 레인 1 내지 6, 11 및 12는 반응액과 동일한 번호로 표시하였다). 약 100염기의 RNA를 나타내는 주 밴드는 반응액(레인) 1 내지 6에는 존재하지만, 주형이 없는 반응액(레인 11 및 12)에서는 존재하지 않는다. 레인 0의 RNA는 실시예 3의 지시에 따라 제조한 표준액이다. 추가의 MstI'절단한 소의 흉선 DNA 1㎍을 가지거나(레인 2,4 및 6) 또는 갖지 않는(레인 1,3 및 5) 합성 RNA에 있어서 뚜렷한 정성적인 차이는 없었다.
실시예 7
주형으로서 RNA 단편의 사용
플라스미드 pGAG.TEST를 XbaI으로 절단하고, 프로테이나제 K를 처리한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전시켜 정제하였다. N2.GAG에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 T7 DNA 폴리머라제를 사용하여 선형화시킨 pGAG.TEST로부터 전사시켰다. 생성된 RNA는 DNase[프로메가 바이오텍(Pro Mega Biotec)사 제품]로 처리한 후, 페놀 추출 및 에탄올을 침전시켜 정제하였다. 정제한 RNA는 실시예 5의 지시에 따라 증폭 반응에 대한 주형으로 사용하였다. RNA의 양을 각 반응 용액에 첨가하였으며 55ng 내지 5.5pg, 및 주형이 없는 것까지 다양했다. 42℃에서 3시간 동안 배양시킨 후, 특이적 RNA의 합성은 실시예 5이 지시에 따라 표지시킨 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화시킴으로써 결정하였다.
실시예 8
주형으로서 리보솜 RNA의 사용 ; 내부 서열의 증폭
2개의 두 프라이머를, 이.콜리 16S 리보솜 RNA(rRNA)의 부분적으로 상보적인 RNA 서열을 증폭시키는데 사용하였다. 이들 프라이머중 하나인 T7HIRIB3.PR2(AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGTATTACCGCGGCTGCTG)는 T7 프로모터의 안티센스 스트랜드, 개시 부위, 16S rRNA에 상보적인 서열을 함유했다. 다른 RIB8.PR(AATACCTTTGCTC ATTGACG)은 프라이머로서 T7HIRB2.PR2 및 주형으로서 16S rRNA를 사용하여 합성된 DNA에 상보적이다. 증폭을 탐지하게 하는 세번째의 합성 올리고뉴클레오티드인 RIB5.PR(AGAAGCACCGGCTAAC)은 증폭 반응의 RNA 생성물에 상보적이며 이것은 원래의 rRNA 주형에 대해 상보적이다.
반응 혼합물 25㎕는 50mM 트리스 HCl(pH 8.45), 6mM MgCl2, 40mM KCl, 10mM DTT, 0.5mM NTP, 1mM dNTP, 20단위 RNasin, 10단위 T7 RNA 폴리머라제, 10단위 AMV 역전사 효소, 0.4단위 RNase H,0.34㎛ T7HIRB3.PR2 및 0.34㎛ RIB8.PR을 함유한다.
50ng 내지 50fg에 이르는 다양한 양의 이.콜리 rRNA를 반응액에 첨가하였다. 한 반응액은 rRNA를 함유하지 않았다. 반응액은 42℃에서 3시간 동안 배양시키는 동안 부분 표본을 30분, 60분, 120분 및 180분에 결쳐 뽑아내었다. 반응액 부분 표본을 급냉하여, 나일론 멤브레인 고정시킨 후, 실시예 5의 지시에 따라32P5'-말단에 표지시킨 RIB5.PR 프로브에 혼성화시켰다.
실시예 9
주형으로서 리보솜 RNA의 사용 ; 5'-말단 서열의 증폭
이.콜리 16S rRNA의 일부에 상동인 RNA 서열을 증폭시키는데 두개의 프라이머를 사용하였다. 이들 프라이머중 하나인 RIB12.PR(TTACTCACCCGTCCGCC)은 16S rRNA에 상보적이다. 다른 T7H1RIB5.PR(AATTCTAATACGACCACTATA GGGAGAAATTGAAGAGTTTGATCAT)은 프라이머로서 RIB12.PR 및 주형으로서 16S rRNA를 사용함으로써 합성된 DNA의 3' 말단에 대해 상보적이다. 증폭을 탐지할 수 있게 하는 세번째 16S rRNA를 사용함으로써 합성된 DNA의 3' 말단에 대해 상보적이다. 증폭을 탐지할 수 있게 하는 세 번째 합성 올리고뉴클레오티드 RIB11.PR(GTTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCC)는 증폭의 RNA 생성물 및 원래의 rRNA 주형의 모두에 대해 상보적이다. rRNA에 대한 증폭 반응 및 합성 RNA의 탐지는 프라이머로서 T7HIRIB3. PR2 및 RIB8.PR 대신에 T7H1RIB5.PR 및 RIB12.PR를 사용하고 올리고뉴클레오티드 프로브로서 RIB5.PR 대신에 RIB11.PR을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8에서 지시한 대로 행하였다.
실시예10
간접적 증폭 방법
재료 및 방법
(a) 박테리아 균주 및 플라스미드
pGEM.4-gag 플라스미드 및 M13-Mp18-gag 플라스미드[각각은 HIVI(균주 BH10)으로부터의 1422염기쌍인 XbaI-EcoRI 제한 단편을 함유함]는 캐나다 적십자회(Canadian Red Cross Society)의 회장인 피이. 길(P. Gill) 박사의 선물로서 얻은 SacI-BalⅡ로부터 구조화시켰다. 이 제한 단편은 다수의 HIVI gag 유전자를 함유하고 있다(Ratner, L.). 이.콜리 균주 HB101은 pGEM4-gag 플라스미드로 형질전화시키고, 이.콜리 균주 TGI M13ㅡgag 플라스미드로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA는 마니아티스(Maniatis) 등의 저서에 기재된 방법에 의해 제조하였다(Maniatis, I., Fritsch, E.F. and Sambrook, J.).
(b) RNA 주형의 합성
gag-RNA 주형을 얻기 위해, pGEM.gag 플라스미드를 XbaI으로 선형화하고, 페놀-클로로포름으로 추출하여 에탄올 중에 침전시켰다. 정제한 DNA는 멜톤(Melton)의 방법에 의해 SP6 RNA 폴리머라제[프로메가(Promega)사 제품]를 사용하여 전사시켰다. RNAase 없는 DNase 1(프로메가사 제품)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. RNA 생성물을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. RNA 수율은 분광측광법으로 측정하였다.
(c) 올리고뉴클레오티드의 합성 및 말단-표지시킨 프로브의 제조
올기고뉴클레오티드는 어플라이드 바이오시스템즈 모델 380-A DNA 합성기에서 합성하였다. DNA 올리고머는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 DE 52 컬럼 크로마토 그래피에 의해 정제하였다. 합성 수율은 40㎍/A260 단위의 전환 인자를 사용하여 분광측광법으로 측정하였다.
제1프라이머는 20단위체이고, 제2프라이머는 길이가 45염기이고(T7 프로모터 서열은 밑줄 그었음) 이 프라이머는 53단위체였다. 이러한 서열들은 하기와 같다.
제1프라이머 : 5' ACA TCA AGC CAT GCA AA 3'
제2프라이머 : 5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAA AGG GAG TAG TTC CTG CTA TGT CAC 3'
프로브 : 5' TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA GAG TAC ATC CA 3'
53 염기 올리고뉴클레오티드 프로브는 증폭 생성물의 서열에 상보적이었고, X-32p ATP(아머샴사 제품)의 존재하에서 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 표지되었다.
증폭반응
RNA 표적은 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 6mM MgCl2, 40mM KCl, 10mM DTT, 1mM 데옥시리보뉴클레오티드(파마시아사 제품), 0.5mM 리보뉴클레오티드(파마시아사 제품), AMV-역전사 효소 40단위(세이가꾸사 제품), RNase H 0.4단위(파마시아사 제품), T7 RNA 폴리머라제 TM 20단위(파마시아사 제품) 및 RNA-Guard 0.5단위/㎕(파마시아사 제품)을 함유하는 환경 중에서 간접적 증폭 반응을 유발시켰다. 각 프라이머의 농도는 0.35μM이었고 최종 반응 용적은 25㎕이었다. 표준 반응은 42℃에서 3시간 동안 행하였으며, 최종 농도가 5mM이 되도록 EDTA를 첨가하여 종결지었다.
DNA 표적은 RNA에 대해서 하기의 변형을 가한 바와 같이 증폭을 유발하였다. 이중 스트랜드 DNA를 완충액, 뉴클레오티드 및 프라이머와 혼합하고, 95℃까지 3분 동안 가열한 후, 이어서 얼음 위에 정치시켰다. T7-DNA 폴리머라제(유나이티드 스테이트스 바이오케미컬사로부터의 SequenaseTM를 첨가하여 0.5단위/㎕의 최종 농도가 되게 하여 37℃에서 15분 동안 배양시켰다. 이 혼합물을 95℃까지 3분 동안 가열하고, 이어서 냉각시키고, 여기에 DTT, 역전사 효소, RNase H, T7 RNA 폴리머라제 및 RNA-GuardTM을 첨가하고, 42℃에서 3시간 동안 반응을 행하였다.
증폭 산물의 혼성화 반응
각 반응 용액의 시료 5㎕를 마니아티스 등이 권장한 방법으로 글리옥실화하고(Maniatis, I., Fritsch, E. F. Sambrook, J.), 6×SSC 200㎕과 혼합한 후, 슬롯-블라트 기구(바이오-라드TM사 제품)를 사용하여 나일론 멤브레인(아머샴사 제품)에 결합시켰다. 이 핵산을 0.1N NaOH 중에서 8분 동안 여과처리하여 멤브레인에 고정시켰다. 필터를 50% 포름아미드, 3× SSC 및 5× 덴하르트의 용액(Denhardt, D. T.)중에서32P-말단 표지시킨 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켰다. 혼성화한 필터를 10분 동안 실온에서 2× SSC 및 0.5% SDS 중에서 세척하고, 이어서 0.1% SSC, 0.5% SDS 중의 50℃에서 1시간 동안 세척하였다. 자동 방사선 사진은 코닥 XAR-5 필름을 사용하여 행하였다.
증폭 생성물의 서열 분석
증폭 반응물은 37℃에서 30분 동안 RNase 없는 DNaseI 2단위로 처리하고, 이어서 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 정제된 RNA는32P말단-표지시킨 프라이머로 혼성화하고, 디데옥시뉴클레오티드의 존재 하에서 역전사 효소를 사용하여 서열화하였다(Lane, D.J., Pace, B., Olsen, C. J., Stahl, D.A., Sogin, M.L. 및 Pace, N.R)
결과
간접적 증폭 방법은 제7도에 나타냈다. 천연 RNA 표적(mRNA, nRNA, tRNA 등)을 사용하여 간접적 증폭 반응을, 그의 5' 말단에 T7-RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 함유하는 제2프라이머를 어니일링시켜 진행시켰다(19,20). 반응 혼합물 중에 존재하는 역전사 효소는 제2프라이머의 3' 말단으로부터 상보적인 DNA 스트랜드를 생성시켰다. RNA/DNA 복합체의 RNA 스트랜드-천연 RNA 표적은 혼합물 중에 존재하는 RNase H에 의해 분해된다. 제1프라이머는 생성된 cDNA의 단일 스트랜드에 어니일링되고, 제2스트랜드의 합성이 일어나 프로모터 서열이 이중 스트랜드로 된다. 이 기능적인 프로모터로부터, 혼합물 중에 존재하는 T7-RNA 폴리머라제는 원래의 표적에 안티센스 스트랜드인 RNA의 다중 복제물을 발생시키고, 이것은 간접적 증폭 반응의 주기적 국면(cyclic phase)에 있어서 cDNA 합성을 위한 새로운 주형으로서 작용한다. 이 주기적 국면은 비 주기적 국면(non-cyclic phase)에 대해 역순으로 프라이머를 어니일링시키고(즉, 제1프라이머는 먼저 어니얼링됨), 역전사 효소와 RNase H의 반응을 개시하고, 이어서 제2프라이머가 이중 스트랜드의 DNA 합성을 출발시키고, 재차 기능적으로 활성인 T7 프로모터를 생성하는 것을 특징으로 한다.
제7도는 또한 간접적 증폭 방법에 있어서 DNA 중간체들이 어디에서 발생하고, 따라서 DNA 표적들이 어떻게 간접적 증폭반응을 거쳐서 증폭을 할 수 있는가의 여부를 설명한다. 이중 스트랜드의 표적 DNA를 제한 효소로 절단하고 변성시켜 제한된 말단을 가진 분자를 생성하였고, 여기에서 제2프라이머를 어니일링시켜 cDNA 합성을 개시함으로써 간접 증폭 방법의 주기적 국면의 일부를 유발시키기에 충분한 RNA를 발생시키는 기능적으로 활성인 T7 프로모터를 생성한다. 만약 ㅣ제한된 이중 스트랜드 DNA를 표적으로 사용할 경우, 제7도에서 설명한 바와 같이, 제1프라이머와 제2프라이머는 기능적으로 활성인 T7 프로모터를 발생시키는 것이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 동일한 간접적 증폭 방법은 RNA가 표적이든 또는 DNA가 표적이든지 간에 증폭된 생성물을 발생시킨다.
이러한 간접적 증폭 방법의 기능성을 입증하기 위하여, RNA 및 DNA 주형 모두를 시험하였다. pGEM-gag 플라스미드를 이중 스트랜드 DNA 주형의 원천으로서 사용하였다. RNA 주형을 얻기 위해, pGEM-gag 플라스미드를 인서트된 DNA의 말단에서 절단하는 XbaI을 사용하여 선형화 하였다. 선형화된 플라스미드를 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 전사시켜 길이가 1422 염기인 RNA 생성물을 얻었다. DNA 또는 RNA 표적으로부터의 증폭 생성물의 길이가 140 염기가 되도록 프라이머 부위를 선별하였다.
증폭 반응의 역학을 표준 반응 조건(재료 및 방법 참조)하의 여러가지 RNA 주형의 농도에 대해 측정하였다. 표 4는 간접적 증폭 반응에서 RNA 또는 DNA 표적으로부터 생성물이 지수 형식으로 발생되는 것을 나타낸다.
[표 4]
간접적 증폭 반응의 특이성 또한 시험하였다. 1ng 및 1pg의 RNA 또는 DNA는 표준 조건 하에서 1㎍의 이형 RNA 또는 DNA의 존재 또는 부재 중의 간접적 증폭 반응에 있어서 표적 핵산이었다. 아가로스 겔전기 영동 후, 반응 생성물은 브롬화에티듐 염색에 의해 시험하였다. 길이가 약 140 염기인 단일 증폭 생성물만을 이들 반응에서 얻었고, 이는 선택한 프라이머 서열이 gag 유전자의 올바른 세그먼트에 대해 특이적 임을 나타낸다. HL60 세포로부터 단리된 전체의 이형 RNA의 존재는 간접적 증폭 반응의 특이성에 대해 아무런 영향을 미치지 않았다. 140 염기를 농도계 주사(走査)하여 주형을 1000배 감소시킴으로써 생성물의 수율에 있어서 50%만의 감소를 초래함을 나타냈다. HL60 RNA의 존재는 수율을 약 5배 감소시켰다. 소의 흉선 DNA 1㎍ 존재 하에서 증폭시킨 gag-RNA를 사용한 유사 실험은 gag-RNA만의 경우에 비하여 생성물에 있어서 2배 이하의 감소를 나타냈다. 반응 생성물을 혼성화에 의해 분석하였을때 유사한 정량적인 결과를 얻었다. 생성물에 있어서 5배의 감소는 HL60 RNA에 기인하였고, 시료 1fg은 혼성화에 의해 쉽게 탐지할 수 있었다. 간접적 증폭 반응의 감도(sensitivity)는 DNA 및 RNA 표적 모두에 대해서 측정하였다. 각 표적의 원액을 RNase 없는 이.콜리 tRNA 20μ/ml을 함유하는 살균수에 순차적으로 희석하였다. 이 회석액의 부분 표본을 42℃에서 3시간 동안 표준 간접적 증폭 조건하에 있게 하였다.32P-말단 표지시킨 올레고뉴클레오티드 프로브는 나일론 멤브레인에 결합된 증폭 생성물을 탐지하는데 사용하였다. DNA 및 RNA 표적 모두는 초기 분자 보다 10배 적은 양으로 시작하여 탐지가능하였다.
표준 간접적 증폭 반응으로부터 RNA 생성물의 뉴클레오티드 서열을 검사하였다. DNA 또는 RNA 표적 중의 1pg를 42℃에서 3시간 동안 간접 증폭 조간하에 있게 하고, 산물은 디데옥시 뉴클레오티드의 존재하에서32P- 표지시킨 P2 프라이머로부터 연장시킴으로써 서열화하였다. 서열화 반응의 생성물은 8% 아크릴아미드 겔 중에서 분리하였다. 얻어진 서열의 분석물은 정확한 길이(140 염기)의 생성물이었을 뿐만 아니라 얻어진 서열은 gag 유전자의 정확한 세그먼트와 동일하였다.
이 간접적 증폭 방법은 소수의 핵산 분자를 100만배 이상의 이형 핵산의 존재하에서 3시간 이내에 108배 이상으로 증폭시킨다.
하기에 간접적 핵산 증폭 방법의 특징을 나타내었다.
첫째, 전체의 간접적 증폭 반응은 균일하다. 즉, 반응이 일단 시작되면 반응물에 더 이상의 첨가를 하지 않는다.
둘째, 간접적 증폭 방법은 단일 온도에서 일어난다.
셋째, 간접적 증폭 반응의 주요 생성물은 원래 표적에 상보적인 RNA이다. 이 단일 스트랜드의 생성물은 더 이상의 조작없이 용이하게 탐지할 수 있다.
넷째, 다수의 반응 생성물이 RNA일 경우, 간접적 증폭 반응 동안 이 방법에 필수적인 이중 스트랜드 DNA 분자가 형성된다. 충분한 DNA는 반응물로부터 직접적으로 클로닝할 수 있도록 발생되었다.
다섯째, 간접적 증폭 반응의 벡터적 국면에 있어서, 제2프라이머는 cDNA 합성을 개시하는데 사용한 반면, 간접적 증폭 반응의 주기적 국면에 있어서 cDNA 합성은 제1프라이머로 개시하였다(제7도 참조).
여섯째, 간단한 간접적 증폭 형태는 전사적으로 기능적인 DNA가 축적되는 방법으로 DNA의 동시적인 효소적 합성 및 분해에 의해서 수행된다.
전체적인 간접적 증폭 반응 방법은 수학적으로 정량화하기 어려우며, 이는 3차 다항식의 전개를 수반하는 것으로 생각된다.
본 명세서에 기재된 간접적 증폭 반응은 표준 세시간 기간 동안 진행하였으나, 이 시간은 진단 목적으로 30분까지 줄일 수 있다. 반응 시간은 존재하는 핵산의 측정된 양, 사용한 탐지 시스템 및 백그라운드율에 대해 중요한 시그날을 나타내는 탐지가능한 생성물의 양에 따라 다르다.
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Claims (44)
- (A) (i) 제1올리고뉴클레오티드 프라이머, (ii) RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 안티센스(antisense) 서열로 이루어지는 제2올리고뉴클레오티드 프라이머, (iii) 상기 프로모터를 인식하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, (iv) RNA 의존성 DNA 폴리머라제, (v) DNA 의존성 DNA 폴리머라제, (vi) 단일 또는 이중 스트랜드 RNA 또는 DNA를 가수분해함이 없이 RNA-DNA 하이브리드(hybrid) RNA를 가수분해하는 리보뉴클레아제, 및 (vii) 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트로 이루어지는 시약을 함유하는 단일 반응 매질을 제공하는 단계, (B) (i) 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 RNA 제1주형에 혼성화하고, (ii) 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라제가 상기 RNA 제1주형을 사용하여 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장에 의해 DNA 제2주형을 합성시킴으로써 RNA-DNA 하이브리드 중가체를 형성하고, (iii) 상기 리보뉴클레아제가 상기 RNA-DNA 하이브리드 중간체로 이루어지는 RNA를 가수분해하고, (iv) 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 DNA 제2주형에 혼성호하고, (v) 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 주형으로서 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 DNA 제2주형의 신장에 의해 상기 RNA 폴리모라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 합성하고, (vi) 상기 DNA 의존성 RNA 폴리모라제가 상기 기능적 프로모터를 인식하고, 상기 DNA 제2주형을 전사함으로써 상기 RNA 제1주형의 복제물을 제공하는 싸이클이 연속적으로 일어나는 조건하에서, 상기 특이적 핵산 서열 또는 상기 특이적 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA 제1주형으로 이루어지는 RNA를 상기 반응 매질 중에 제공하는 단계, 및 (C) 상기 조건을 상기 특이적 핵산 서열의 목적하는 증폭을 수행하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계로 이루어지는, 비교적 일정한 온도에서 시약들의 연속적인 첨가없이 특이적 핵산 서열을 증폭시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA 제1주형이 상기 특이적 핵산 서열로 이루어지고, 단계 (B)가 (i) 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 단일 스트랜드 RNA에 혼성화하고, (ii) 상기 RNA 의존성 DNA 폴리모라제가 주형으로서 상기 단일 스트랜드 RNA를 사용하여 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 DNA 제2주형을 합성함으로써 RNA-DNA 하이브리드를 형성하고, (iii) 상기 리보뉴클레아제가 상기 RNA-DNA 하이드리드를 이루는 RNA를 가수분해시키고, (iv) 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 DNA 제2주형에 혼성화하고, (v)상기 DNA 의존성 DNA 폴리모라제가 주형으로서 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 DNA 제2주형을 신장시켜 상기 DNA 의존성 RNA 폴리모라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 합성하고, (vi) 상기 DNA 의존성 RNA 폴리모라제가 상기 기능적 프로모터를 인식하고, 상기 DNA 제2주형을 전사하여 상기 RNA 제1주형의 복제물을 제공하도록, 단일 스트랜드 RNA를 상기 반응 매질에 제공하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제2항에 있어서, 단계(B)가 상기 반응 매질에 단일 스트랜드 RNA를 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA 제1주형이 상기 특이적 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지고, 단계 (B)가, (i) 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 단일 스트랜드 RNA에 혼성화하고, (ii) 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라제가 주형으로서 상기 RNA를 사용하여 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 상보적 DNA를 합성함으로써 RNA-DNA 하이브리드를 형성하고, (iii) 상기 리보뉴클레아제가 상기 RNA-DNA 하이브리드를 이루는 RNA를 가수분해시키고, (iv) 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 상보적 DNA에 혼성화하고, (v) 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 주형으로서 상기 상보적 DNA를 사용하여 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 상기 DNA 제2주형 및 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 합성하고, (vi) 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 상기 기능적 프로모터를 인식하고, 상기 DNA 제2주형을 전사하여 상기 RNA 제1주형의 복제물을 제공하도록, 단일 스트랜드 RNA를 상기 반응 매질에 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제4항에 있어서, 단계(B)가 상기 반응 매질에 단일 스트랜드 RNA를 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(B)가 (i) 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 단일 스트랜드 DNA에 혼성화하고, (ii) 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 주형으로서 상기 단일 스트랜드 DNA를 사용하여 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 상기 DNA 제2주형 및 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 합성하고, (iii) 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 상기 기능적 프로모터를 인식하고, 상기 DNA 제2주형을 전사시킴으로써 상기 RNA 제1주형의 복제물을 제공하도록, 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 안티센스 서열로 이루어지는 단일 스트랜드 DNA를 상기 반응 매질에 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계(B)가 상기 리보뉴클레아제가 상기 RNA-DNA 하이브리드를 이루는 RNA를 가수분해하도록 상기 단일 스트랜드 DNA로 이루어지는 RNA-DNA 하이브리드를 상기 반응 매질에 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(B)가 (i) 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 단일 스트랜드 DNA에 혼성화하고, (ii) 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 주형으로서 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 상기 DNA 제2주형을 신장시켜 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는, 기능적 프로모터를 합성하고, (iii) 상기 DNA 의존 RNA 폴리머라제가 상기 기능적 프로모터를 인식하고, 상기 DNA 제2주형을 전사시킴으로서 상기 RNA 제1주형의 복제물을 제공하도록, 상기 DNA 제2주형으로 이루어지는 단일 스트랜드 DNA를 상기 반응 매질에 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제8항에 있어서, 단계(B)가 , 상기 리보뉴클레아제가 상기 RNA-DNA 하이브리드를 이루는 RNA를 가수분해하도록, 상기 단일 스트랜드 DNA를 이루는 RNA-DNA 하이브리드를 상기 반응 매질에 첨가하는 것으로 이루어진 방법.
- 제2항에 있어서, 단계(B)가, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 상기 DNA를 전사하도록 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터로 이루어지는 DNA를 상기 반응 매질에 첨가함으로써 상기 단일 스트랜드 RNA를 합성하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제4항에 있어서, 단계(B)가, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 상기 DNA를 전사하도록 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터로 이루어지는 DNA를 상기 반응 배지에 첨가함으로써 상기 단일 스트랜드 RNA를 합성하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 추가로 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 대한 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 포함하고, 여기서, 상기 전사 개시 부위의 안티센스 서열이 상기 프로모터의 안티센스 서열에 기능적으로 결합되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제이고, 전사 개시 부위의 상기 안티센스 서열 및 상기 프로모터의 안티센스 서열이 함께 핵산 서열 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG로 이루어지는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(B)가 추가로, 시료가 상기 특이적 핵산 서열 또는 상기 특이적 핵산 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA 제1주형으로 이루어지는 RNA를 제공하고 싸이클이 연속적으로 일어나도록 하는 조건하에서 상기 반응 매질에 시료를 첨가하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 방법이 추가로 단계(C) 뒤에 상기 시약 (i),(ii) 및 (vii)중 어느 하나의 소모 또는 싸이클중 임의의 생성물의 축적에 대해 상기 반응 매질을 모니터하는 단계(D)를 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 단계(D)가 상기 싸이클의 핵산 생성물을 탐지하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 핵산 프로브를 사용하여 상기 핵산 생성물을 검출하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 제한 엔도뉴클레아제 및 전기 영동 분리법을 사용하여 상기 핵산 생성물을 검출하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 상기 RNA 제1주형의 축적을 모니터하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 상기 DNA 제2주형의 축적을 모니터하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 상기 DNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 함유하는 DNA를 모니터하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제15항에 있어서, 단계(D)가 상기 RNA-DNA 하이브리드 중간체의 축적을 조사하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제14항에 있어서, 단계(D)가 추가로 단계(A)의 상기 시약(i),(ii) 및 (vii)중 임의의 시약의 소모 또는 상기 싸이클의 임의의 생성물의 축적을, 상기 특이적 핵산 서열 및 그에 상보적인 상기 서열의 부재시 상기 반응 매질 중의 상기 시약의 소모 또는 상기 생성물의 축적을 나타내는 값과 비교하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 리보뉴클레아제가 이.콜리(Escherichia coli) 리보뉴클레아제 H로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 리보뉴클레아제가 송아지 흉선 리보뉴클레아제 H로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 상기 제2올리고뉴클레오티드 프라이머가 고정된 지지체에 가역적으로 결합되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 RNA 폴리머라제인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T3 폴리머라제인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 φⅡ 폴리머라제인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 살모넬라(Salmonella) 박테리오파지 sp6 폴리머라제인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리오파지 gh-1 폴리머라제인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라제가 레트로바이러스 역전사 효소인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 레트로바이러스 역전사 효소가 조류의 근아세포 분해 바이러스 역전사 효소인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 레트로바이러스의 역전사 효소가 몰로니(Moloney) 쥐의 백혈병 바이러스 역전사 효소인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 반응 매질 중의 모든 DNA 폴리머라제가 DNA 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 조류의 근아세포 분해 바이러스 폴리머라제인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 α 또는 β인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 의존성 DNA 폴리머라제가 송아지 흉선 DNA 폴리머라제인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(C)가 30분 내지 3시간 동안 상기 조건을 유지시키는 것으로 이루어지는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 싸이클의 DNA 생성물을 클로닝 벡터에 결찰시키고, 이어서 상기 DNA 생성물을 클로닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제41항에 있어서, 발현계내에서 상기 싸이클의 상기 DNA 생성물에 의해 코딩된 생성물을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (A) 증폭되는 제1주형의 RNA 서열에 충분히 상보적인 DNA 서열을 갖는 제1올리고뉴클레오티드 프라이머, (B) RNA 폴리머라제에 대한 기질로서 인식되는 프로모터의 안티센스 서열로 이루어지고 제1주형의 DNA 서열에 충분히 상보적인 DNA 서열을 갖는 제2올리고뉴클레오티드 프라이머, (C) 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드 RNA 또는 DNA를 공격함이 없이 RNA/DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해시키는 리보뉴클레아제, (D) RNA 의존성 DNA 폴리머라제, (E) DNA 의존성 DNA 폴리머라제, (F) DNA 의존성 RNA 폴리머라제, (G) 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 (H) 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트의 어셈블리로 이루어지고, 여기서, 제2주형의 DNA 서열이 제1주형의 RNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 핵산 분자를 증폭시키기 위한 키트.
- (A) 증폭되는 제1주형의 RNA 서열에 충분히 상보적인 DNA 서열을 갖는 제1올리고뉴클레오티드 프라이머, (B) RNA 폴리머라제에 대한 기질로서 인식되는 프로모터의 안티센스 서열로 이루어지고 제2주형의 DNA 서열에 충분히 상보적인 DNA 서열을 갖는 제2올리고뉴클레오티드 프라이머, (C) 이.콜리의 리보뉴클레아제 H,(D) 조류의 근아세포 분해 바이러스 역전사 효소, (E) 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제, (F) 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 (G) 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트로 이루어지고, 여기서, 제2주형의 DNA 서열이 제1주형의 RNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 특이적 핵산을 증폭시키기 위한 키트.
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