MC1821A1 - Expression prononcee d'interleukin-2-humain dans des cellules de mammiferes - Google Patents

Description

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Le développement des procédures de recombinaison d'ADN, qui sont souvent appelées manipulations génétiques ou ingénierie génétique ont rendu possible la production d'une grande variété de produits biolo-5 giques. Dans les procédures courantes de recombinaison d'ADN,des séquences spécifiques d'ADN sont insérées dans un véhicule ADN approprié, ou vecteur, pour former des molécules d'ADN recombinantes qui peuvent se reproduire dans des cellules hôtes. Des molécules d'ADN cir-10 culaires à double brin appelées plasmides sont souvent utilisées comme vecteurs, et la préparation de telles formes d'ADN recombinant impose l'utilisation d'enzymes endonucléases de restriction qui peuvent couper l'ADN en des sites spécifiques de la séquence de base. Des 15 procédés généraux de préparation de telles molécules d'ADN recombinantes ont été décrits par Cohen et al. (Brevet US n° 4 257 224), Collins et al. (Brevet US n° 4 J04 863) et Maniatis et al (Clonage Moléculaire : Un manuel de laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor 20 Laboratory).

Des molécules d'ADN recombinantes peuvent être utilisées pour produire le produit pour le—quel elles sont codées par insertion de la séquence du gène seulement si un certain nombre de conditions sont rem-25 plies. Il y a tout d'abord la nécessité que la molécule

Wa/24.4.1987

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recombinante soit compatible avec la cellule hôte, et soit ainsi capable de réplication autonome en elle. Beaucoup de travaux récents ont utilisé la bactérie Escherichia coli (E. coli) comme organisme hôte parce 5 qu'elle est compatible avec une large gamme de plasmides recombinants. En fonction du système vecteur/cellule hôte utilisé, la molécule d'ADN recombinant est introduite dans l'hôte par transformation, transduction ou transfection.

10 La simple insertion d'un vecteur recombinant dans une cellule hôte n'assurera pas elle-même que des quantités significatives du produit du gène désiré seront produites. Pour que cela se produise, il faut que la séquence de .gène étranger soit soudée en relation 15 correcte avec une région de signal du vecteur appelée un promoteur. En alternative, l'ADN étranger peut apporter avec lui son propre promoteur, dans la mesure où il est reconnu par l'hôte. Quelle que soit son origine, le promoteur est une séquence d'ADN qui est "en amont" de, 20 ou en d'autres termes en 5' avant le gène étranger qui doit être exprimé. Cette séquence dirige la fixation de la polymérase ARN et "provoque" ainsi la transcription de 1'ADN en AEN messager (ARNm).

Pour une initiation forte donnée qui peut 25 fournir de grandes quantités d'ARNm, la production ultime du produit de gène souhaité dépendra de l'efficacité du transfert d'ARNm en protéine. Ceci, à son tour dépendra de l'efficacité de la liaison du ribosome à l'AENm et de la stabilité de l'AENm dans la cellule hôte. 30 Dans les cellules eucaryotes on comprend mal les facteurs gouvernant l'efficacité de transfert, mais il semble qu'ils comprennent une séquence favorable d'acide nucléique entourant un codon AUG qui initie le transfert [Kozak, Cell 44 : 283 (1986)]. Des facteurs affec-35 tant la stabilité de l'AENm, qui sont mal compris, à la

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fois dans les cellules procaryotes et eucaryotes, sont aussi critiques du point de vue quantité de protéine produite qui peut être obtenue.

La plupart des travaux dans le domaine de 5 d'ADN recombinant s'est focalisé Jusqu'à présent sur l'utilisation de systèmes d'expression bactériens tels que E. coli. Maintenant, l'utilisation de cellules bactériennes présente un certain nombre d'aspects indésirables. Par exemple, la plupart des protéines 10 et polypeptides produits dans E. coli s'accumulent dans l'espace périplasmique. La récupération de ces produits de gène nécessite ainsi la rupture des cellules, un processus qui est inefficace et conduit à un sérieux . problème de purification, puisqu'il faut séparer le pro-15 duit souhaité des nombreux autres constituants cellulaires d'E. coli. Ainsi la bactérie ne peut réaliser la glycosylation iqui est nécessaire pour compléter la synthèse de nombreux produits génétiques intéressants. De plus les bactéries peuvent être incapables de former 20 les liaisons spécifiques disulfure qui sont essentielles à la conformation correcte et à l'activité biologique de nombreuses protéines eucaryotes.

Pour surmonter ces défauts dans les systèmes d'expression bactériens, l'attention des ingénieurs gé-25 néticiens s'est tournée de plus en- plus vers l'utilisation de cellules hôtes eucaryotes pour l'expression de molécules d'ADN recombinantes. Des cellules telles que levure et cellules de mammifère peuvent sécréter les produits génétiques souhaités dans le milieu de culture 30 et peuvent réaliser aussi bien les processus essentiels de glycosylation. Maintenant l'utilisation de cellules de mammifère pour le clonage et l'expression de molécules d'ADN recombinantes pose aussi un grand nombre d'obstacles techniques qu'il faut surmonter. Par exem-35 pie* les plasmides endogènes qui se sont révélés si

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utiles dans les "bactéries ne sont pas répliqués par les cellules eucaryotes supérieures. En conséquence, il faut avoir d'autres approches.

Une approche a été d'utiliser la levure 5 eucaryote inférieure, Saccharomyces cerevisiae, qui peut être cultivée et manipulée avec la même facilité que E. coli. Des systèmes de clonage de levure existent. Grâce à l'utilisation de tels systèmes on a obtenu l'expression efficace dans la levure d'un gène de 10 l'interféron humain [Hitzeman et al., Nature, (Londres) 293:717 (1981)]. Cependant les gènes de l'interféron ne possèdent pas d'introns. Puisqu'il a été trouvé que les cellules de levure ne transcrivent pas correctement au moins un gène de mammifère hétérologue qui contient 15 des introns, à savoir le gène de (3-globine du lapin [Beggs et al., Nature (Londres) 283:835 (1980)], il faut prendre en considération la présence ou l'absence d'introns quand la levure est utilisée comme hôte pour l'expression d'un gène de mammifère.

20 Dans une autre approche , des gènes étrangers ont été incorporés dans des cellules de mammifères au moyen d'une absorption directe. Ceci a été obtenu, par exemple, par coprécipitation par le phosphate de calcium de gènes clonés, ce procédé permettant à 1-2 % des 25 cellules d'absorber l'ADN. Un tel faible niveau d'absorption, cependant, produit seulement un très faible niveau d'expression du produit génétique souhaité. Lorsqu'on peut trouver des cellules de mammifères avec absence de gène thimidine kinase (cellules tk~), de 30 meilleurs résultats peuvent être obtenus en utilisant une co-transformation avec le gène tk suivie d'une crois sance dans des conditions sélectives. Les cellules tk" ne peuvent pas se développer dans un milieu HAT (hypo-xanthine-aminoptérine-thymidine). Elles peuvent regagner 35 leur activité enzymatique perdue par absorption d'un

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ADN exogène contenant le gène tk (tel que l'ADN viral simplex de l'herpès) par co-précipitation de phosphate de calcium. D'autres molécules d'ADN liées pa:* covalen-ce à l'ADN tk ou simplement mélangées à lui seront aus-5 si absorbées par les cellules et seront souvent co-exprimées (voir Scangos et al., Gene 14 : 1 (1981)],.

Dans une troisième approche, des génomes viraux ont été utilisés comme vecteurs de l'introduction de gènes étrangers dans des cellules de mammifère. Des 10 vecteurs basés sur les génomes de virus Simien 40, de papilloma-virus et d'adénovirus ont été décrits [voir P.W.J. Rigby, "Expression de Gènes Clonés dans les Cellules Eucaryotes Utilisant des Systèmes Vecteurs Dérivés de Répicons Viraux" in Genetic Engineering, 15 Vol. 3, R- Williamson, ed. Academic Press, New York, pp. 83-141 (1982) pour une synthèse]. Ces systèmes de vecteurs cependant, souffrent de l'inconvénient d'un dimaine limité de cellules hôtes. De plus la réplica-tion virale dans ces systèmes conduit à la mort de la 20 cellule hôte. Seule l'utilisation d'éléments de contrôle d'ADN retroviral évite de nombreux inconvénients de ces systèmes de vecteur viral. Gorman et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777 (1982)] ont montré, par exemple, que la longue terminaison répétitive (LTE) 25 du virus du sarcome de Eous est un promoteur efficace et qu'il peut être introduit dans une grande variété de cellules, y compris les cellules CV-1 de rein de singe, les fibroblastes d'embryon de poulet, les cellules d'ovaire de hamster chinois, les cellules HeLa et les cel-30 Iules NIH/3T5 de souris par transfection au moyen d'un ADN.

L'évidence de la régulation de l'expression de gène par les séquences non codantes 5' et 3'» ce qui signifie les séquences directement avant, respective-35 ment après la séquence codante d'un gène vient de l'é

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tude d'encogènes et d'ABJSfm de cellules eucaryotes supérieures. Les effets de l'élimination ou de la modification de ces séquences sur l'expression de gène dans ces cellules ont été observés. Par exemple, Treisman [Cell 5 42 : 889 (1985)] a étudié l'accumulation ABU c-fos après la stimulation par du sérum de fibroblastes de souris dans lesquels un gène humain cloné c-fos (l'homologue cellulaire de l'oncogène porté par le virus de l'ostéo-

✓ H

sarcome murin FBJ désigne par c-fos ) a été transfecté.

10 D'ordinaire, la stimulation par du sérum de telles cellules provoque une augmentation forte mais transitoire d'AENm c-fos qui atteint un maximum pendant 10 à 15 minutes et décroît rapidement après, atteignant les niveaux d'avant la stimulation en 1 à 2 heures à cause

15 de la dégradation rapide de l'AENm.

' H

Quand les séquences 5' contiguës de c-fos sont liées aux gènes hétérologues en l'absence des

* H

séquences contiguës normales 3' de c-fos , cependant,

les gènes résultant sont encore induits par des fac-20 teurs du sérum mais l'AENm ainsi produit persiste encore pendant 4 heures après la stimulation par le sérum. Des expériences avec des unités de transcription hybrides montrent que seulement les gènes contenant

✓ / H

l'extrémité 3' du gène c-fos et les régions non co-

25 dantes 3' présentent la dégradation rapide typique d'AENm qui suit la stimulation. Il se peut en sorte que les séquences c-fos 3' agissent pour déstabiliser un AEN qui les contient. L'élimination ou la modification de ces séquences peut avoir un effet positif sur 30 l'expression du gène.

Une autre évidence du rôle régulateur des séquences non ,codantes 3' vient des études de Simcox et al. [Mol. Cell. Biol. 5 : 3397 (1985)] sur le système de protéine choc thermique de Drosophila melano-35 gaster. Quand on déplace Drosophila melanogaster de

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son lieu de croissance à température ambiante à 37°C, : elle produit rapidement un certain nombre de protéines "choc thermique", parmi lesquelles il y a une protéine majeure appelée hsp 70» L'augmentation de température 5 induit une production accrue d'ABNs. Après un retour aux températures normales de croissance, la transcription du gène hsp 70 est rapidement freinée et le niveau d'ARNm correspondant décline rapidement, arrêtant ainsi rapidement toute autre production de la protéine hsp 70. 10 Simcox et al. trouvent cependant que le freinage rapide de la synthèse de la protéine hsp 70 après suppression du choc thermique est retardé quand les séquences 3' ont été supprimées, ce qui suggère que les séquences 3' agissent normalement pour déstabiliser l'AENm de hsp 70 15 après la chute de température .

L'évidence d'un rôle de régulation d'AKNm a été aussi déterminée pour des séquences 5' non codantes. Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 3 : 3009 (1985)] ont montré qu'une séquence non codante 5' contenant en-20 viron 550 nucleotides (désignée par exon 1) du gène humain c-myc (l'homologue cellulaire du virus oncogène aviaire de myelocytomatose) affecte l'expression de plasmides portant ce gène dans des cellules CV1 de rein de singe transformées avec un virus Simien 40 défec-25 tueux d'origine (désignées par cellules COS). Des transcriptions à partir de plasmides dans lesquels les séquences 51 non codantes du gène c-myc ont été supprimées ont été trouvées présentes à un niveau d'équilibre plus élevé que les transcriptions à partir de plasmides 30 portant le gène intact, ce qui suggère que les séquences non codantes 5' d'une certaine manière agissent en déstabilisant l'AENm correspondant.

Dans une autre étude, Eabbitts et al. [EMBO J. 4 : 3727 (1985)] ont montré que l'amputation de 35 l'exon 1 du gène c-myc provoque une augmentation de la

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stabilité de l'ABN c-myc dans les cellules COLO 320. De manière similaire, Eick et al. [EMBO J. 4 : 37^7 (1985)] ont démontré que les ARNm c-myc produits dans les cellules de lymphome de Burkitt sont beaucoup plus 5 stables quand le gène c-myc correspondant contient une translocation dans l'exon 1.

Les références ci-dessus suggèrent toutes que les régioiis non-codantes 5' et 3' d'une grande variété de gène peuvent d'une certaine mesure produire 10 de l'instabilité dans les ABNm transcrits à partir de ces gènes. La suppression ou l'altération de ces régions non-codantes produisent une stabilité augmentée de l'AENm, et donc, un niveau général accru d'expression de gène.

15 Actuellement l'effet de la modification ou de la suppression de telles séquences non codantes sur l'expression du gène ne peut être prévue avec sécurité.

Par exemple, Johansen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA -- 81_ : 7698 (1984)] ont fait varier la 20 longueur de la région de tête non codante dans un système vecteur recombinant contenant les éléments de contrôle du gène lié au gène galactokinase (gaLK) d'Escherichia coli. La variation en longueur de la région non codante n'a pas d'effet sur l'expression de 25 galK. De manière similaire, Katz et al. [Mol. Cell. Biol. 6 : 372 (1986)] on introduit à la fois des suppressions et des substitutions dans le leader 5' non décalé des ABNm rétroviraux aviaires. En général, ces suppressions et substitutions ont causé une diminution 30 sensible dans l'expression du gène env. Ces diminutions dans l'expression, cependant, n'ont pas été dues à des réductions dans le nombre de molécules d'AENm. Il apparaît, par contre que les changements dans les régions non codantes ont causé une déficience en transfert 35 qui a conduit à la réduction globale de l'expression.

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j-1'int erleukine-2 (IL-2) est une protéine so-luble qui est capable de moduler la ré activité de lymphocyte et de promouvoir la culture in-vitro à long terme de lymphocytes T antigènes spécifiques. Dans le 5 passé, IL-2 a tout d'abord été isolée du liquide surnageant de cultures de cellules de mammifères stimulées par mitogène. Par exemple, Morgan et al. [Science 195 : 1007 (1976)] et Ruscetti et al. [J. Immunol. 11_9: 131 (1977)] ont isolé l'IL-2 de liquides surnageants 10 réunis sur des lymphocytes humains normaux stimulés par la phytohémagglutinine (PHA), tandis que Gillis et al. LNature 268 : 154 (1977)] ont utilisé des cellules de rate normales de souris DBA/2 stimulées avec de la concanavaline A comme source de protéine. Plus 15 récemment, Stern [Brevet des Etats-Unis n° 4 490 289] a décrit l'utilisation de cellules malignes stimulées comme source de IL-2.

On s'est aussi efforcé de produire de l'IL-2 à l'aide de la méthodologie d'ADN recombinant. 20 Par exemple, Taniguchi et al. [Nature, 302 : 305 (1983)] ont décrit l'analyse de la séquence, le clonage et l'expression d'un ADN complémentaire (C-ADN). codant pour l'IL-2 humaine préparé à partir de l'AEN messager de la lignée de cellules leucémiques de Jurkat. L'ex-25 pression d'IL-2 a été réalisée par Taniguchi et al.

dans des cellules COS de singe cultivées bien que les auteurs affirment que le travail sur l'expression d'IL-2 utilisant un vecteur ADN recombinant dans E.

coli était en cours, et qu'à partir du système E. coli 30 il serait bientôt possible de produire IL-2 en grandes quantités. IL-2 est synthétisée dans la cellule sous forme d'un précurseur polypeptide avec 153 amino-acides. Lors de la sécrétion par la cellule,une séquence de peptide signal longue de 20 amino-acides est amputée. 35 L'IL-2 mature est sécrétée par la cellule sous forme

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d'un polypeptide avec aminoacides. Pour l'expres sion de l'IL-2 mature dans E. coli^la sous-séquence codant la séquence peptide signal du gène codant pour l'IL-2 doit être éliminée par la méthodologie d'ADN 5 recombinant, puisque E. coli n'est pas capable d'amputer des séquences peptide signal eucaryote.

Rosenberg et al. (Science 223:1412 (19S4~) ont aussi exprimé l'IL-2 chez E. coli, en utilisant un gène isolé à partir de la lignée de cellule Jurkat. 10 Plus récemment, Souza et al (Demande de Brevet Européen n° A1 136 489) ont décrit le clonage et l'expression dans des microorganismes de séquences ADN synthétisées chimiquement comprenant des gènes structuraux codant pour un polypeptide ayant la séquence d'amino-acides 15 et les propriétés de l'IL-2 mature. Souza et al décrivent aussi l'utilisation de gènes synthétiques pour produire des analogues d'IL-2 qui diffèrent dans la séquence des amino-acides de l'IL-2 naturelle. Dans les exemples fournis dans la demande de brevet de Souza 20 et al., E. coli est l'organisme hôte.

Barr et al [Demande de Brevet International n° 85/02200] ont décrit récemment le clonage et l'expression d'un gène humain synthétisé chimiquement d'IL-2 dans la levure.

25 La présente invention concerne une séquence d'ADN codant pour 1'interleukine-2 humaine HIL-2) et une séquence peptide signal comprenant un gène codant pour HIL-2 et une séquence peptide signal dans lesquels les séquences 5' non codantes du gène ont été rempla-30 cées par des séquences 51 non-codantes hétérologues, par exemple par celles d'un gène d'insuline de rat, de préférence par celles du gène de rat preproinsuline II. C'est dans le cadre de l'invention de remplacer en plus les nucléotides adjacents de la sous-séquence codant 35 pour la séquence peptide signal par des séquences hété-

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rologues correspondantes, c'est-à-dire par les nucléo-tides de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal adjacente aux séquences 5' non-codantes hétérologues mentionnées ci-dessus. Dans le cas où des 5 nucléotides de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal sont remplacés il faut faire attention,

à ce que le cadre de lecture du gène HIL-2 soit maintenu.De plus l'invention concerne des vecteurs recombinants comprenant une séquence ADN comme définie ci-10 dessus et une cellule de mammifère contenant une telle séquence d'ADN ou un vecteur recombinant la contenant.

L'invention concerne en plus un procédé de production d'interleukine-2 humaine, une interleukine-2 humaine en soi obtenue -par ce procédé et l'utilisation de 15 1'interleukine-2 humaine pour le traitement et la prévention de maladies. De plus l'invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant une telle interleukine-2 humaine.

De manière surprenante des niveaux élevés 20 d'expression du gène HIL-2 sont obtenus grâce à l'utilisation de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans lesquels les séquences 5' non codantes naturelles et les quatre premiers nucléotides ATG T de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal du gène 25 HIL-2 ont été remplacées par des séquences hétérologues correspondantes du gène insuline de rat, à savoir par les nucléotides ATG GCC CTGTGGATC G de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal de préproinsuline II de rat. Les modifications résultantes à la terminai-30 son N du peptide signal HIL-2 n'a pas d'effet sur le polypeptide HIL-2 mature sécrété par les cellules de production puisque le peptide signal est coupé pendant le processus de maturation.

La présente invention peut être plus facile-35 ment comprise en faisant référence aux figures suivantes o

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(non dessinées à l'échelle) dans lesquelles

FIG 1 est une représentation schématique du plasmide pBC12MI, le vecteur de départ pour la construction du vecteur d'expression de la HIL-2;

5 FIG 2 représente la structure de la termi naison N du nouveau peptide signal dans le plasmide pBC12/RSV/IL-2 et les séquences insuline et HIL-2 utilisées pour constnire le plasmide. Les sites spécifiques de restriction et de ligation sont soulignées; 10 FIG 3 est une représentation schématique du vecteur final d'expression de IL-2, pBC12/RSV/IL-2/ dhfr; et

FIG 4 représente la séquence de nucléotide enlevée du plasmide pBC40 par mutagénèse spécifique 15 de site pour la construction de pBC40AT. Les segments soulignés délimitent le primer à 24-mères utilisé pour réaliser la suppression, qui crée un nouveau site HindIII.

Le procédé selon l'invention comprend les 20 étapes suivantes en séquence logique : (1) préparation d'une séquence d'ADN codant pour HIL-2 et d'une séquence peptide signal, (2) remplacement de séquences 5' non codantes et si possible des nucléotides adjacents de la sous-séquence codant pour la séquence 25 peptide signal par des séquences .correspondantes, de préférence par celles du gène de rat préproinsuline II, de telle manière que le cadre de lecture de la région codant pour HIL-2 soit maintenu (3) transfert du vecteur recombinant comprenant la nouvelle séquence d'ADN 30 dans une cellule hôte de mammifère appropriée, (4) reproduction du nouveau gène HIL-2 et sélection des cellules hôte de mammifère modifiées, et (5) identification et purification de la HIL-2 produite.

Comme il est utilisé ici, le terme "inter-35 leukine-2 humaine" ou "HIL-2'' représente une protéine

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glycosylée qui est produite par une cellule de mammifère qui a été transformée ou transfectée avec une séquence ADN ci-dessus ou par une de ses modifications. La séquence ADN code une protéine ayant : (a) une sé-5 quence amino-acide qui est au moins sensiblement identique à la séquence amino-acide d'une interleukine-2 humaine naturelle et (b) a une activité biologique qui est celle de 1'interleukine-2 humaine naturelle. Une identité sensible des séquences amino-acide signifie 10 que les séquences sont identiques ou diffèrent par une ou plusieurs altérations d'amino-acide (suppressions, additions ou substitutions) qui ne causent aucune différence fonctionnelle contraire entre la protéine synthétique et 1'interleukine-2 humaine. 15 Des exemples de telles protéines sont les molécules d'interleukine-2 décrites dans les Demandes de Brevet Européen n° 82 30 7036.2 et 83 101035.0 et les Brevets US 4 5^8 584 et 4 569 790. Ces polypeptides interleukine-2 sont produits dans des systèmes bacté-20 riens sous forme mature.

Une séquence ADN codant pour 1'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal peut être préparée par l'un quelconque des procédés utilisés habituellement dans la technique. Par exemple, une lignée 25 de cellule humaine capable de synthétiser HIL-2 peut être stimulée pour faire HIL-2 ARNm qui peut servir de gabarit pour faire HIL-2 ADNc. Rosenberg et al. (Science 223:1412 (1984)] ont utilisés une lignée de cellule-T leucémique et de lymphocytes de sang périphérique pour 30 préparer un tel ADNc. Taniguchi et al. [Nature 302 : 305 (1983)] ont utilisé une cellule-T leucémique humaine dans ce but.

En alternative puisque Taniguchi et al. ont décrit la séquence de nucléotides, la séquence ADN co-35 dant pour HIL-2 et une séquence de peptide signal

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peuvent être synthétisées chimiquement en utilisant la méthode au phosphotriester ou une autre, de préférence dans un système à phase solide. Une telle synthèse chimique a été décrite par Souza et al. [Demande de 5 Brevet Européen N° A1 136 489]. En synthétisant des nucléotides relativement petits et en les liant ensemble, Barr et al. [ Demande de Brevet International N° WO 85/02200] ont aussi préparé un gène HIL-2. Par un autre procédé , un ADN de génome pourrait être isolé 10 à partir d'une cellule humaine capable de produire HIL-2. Le gène HIL-2 pourrait être identifié par des procédés standard d'hybridation en utilisant une sonde ADN marquée basée sur la séquence publiée du gène HIL-2.

15 Dans lin mode de réalisation de l'invention le plasmide pIL-2-2b, qui contient une copie ADNc de toute la région codante 459"bp de HIL-2 contiguë à 31 bp de la séquence 5' non décalée et à 309 bp de la séquence 31 non décalée, a été utilisé comme source de la séquence 20 ADN codant pour 1'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal. Le clonage de cette copie de HIL-2 ADNc dans le plasmide pIL-2-2b a été décrit par Smith et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 8404 (1985)]. A cause du procédé utilisé pour cloner le gène HIL--2, 25 l'ADNc est encadré par des séquences homopolymères G-C suivies de sites BamHI.

Le remplacement de séquences 5' non codantes et si possible des nucléotides adjacents de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal de 30 HIL-2 et l'insertion de la séquence ADN résultante dans un vecteur d'expression approprié sont facilement réalisés quand les séquences requises d'ADN et le vecteur cloné ont été coupés avec la (ou les) même(s) enzymefe) de restriction, puisqu'on obtient ainsi des fragments 35 avec des groupes terminaux complémentaires de l'ADN, qui

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peuvent être facilement liés l'un à l'autre. Si cela ne peut pas être réalisé, il peut être nécessaire de modifier les extrémités coupées, par exemple en faisant digérer à nouveau l'ADN monobrin pour produire des ex-5 trémités rognées. Le même résultat peut être obtenu en complétant les groupes terminaux monobrins avec une ADN polymérase appropriée tel que le fragment Klenow de l'ADN polymérase I. Les extrémités rognées peuvent alors être liées enzymatiquement, par exemple en utili-10 sant la ligase enzyme ADN T4-.

Pour l'insertion du gène HIL-2 dans un vecteur, un quelconque site de combinaison souhaité pourrait aussi être produit en liant des séquences de nu-cléotide (liens) sur les groupes terminaux d'ADN. De 15 tels liens peuvent comprendre des séquences d'oligo-nucléotides spécifiques qui codent des séquences de reconnaissance de site de restriction. Le vecteur coupé et la séquence ADN modifiée codant HIL-2 peut aussi être modifiée par addition d'homopolymère, comme décrit 20" par Morrow [Methods in Enzymology 68:3 (1979)]*

En pratique pour l'invention, il faut rempla cer toutes les séquences 5' non codantes avec les séquences correspondantes du gène pré proinsuline II de rat. Il peut aussi être possible de supprimer quelques 25 nucléotides des séquences codantes adjacentes au gène

HIL-2, puisque ces séquences codent le polypeptide

!

signal qui est coupé à la fin pendant la maturation à l'intérieur de la cellule hôte dans laquelle le gène HIL-2 sera inséré et exprimé. Evidemment, la suppres-30 sion d'une région trop large des séquences codantes pourrait abolir la fonction polypeptide signal, interférant ainsi avec la sécrétion correcte du produit HIL-2 par les cellules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, 35 un vecteur d'expression eucaryote désigné par pBC12MI

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a été utilisé à la fois comme véhicule d'expression et comme source des séquences de gène préproinsuline II de rat. La substitution des régions 5' non codantes a eu ainsi lieu après qu'un gène HIL-2, dans lequel la ré-5 gion 5' non codante naturelle et les quatre premiers nucléotides de la séquence codante aient été supprimée, ait été inséré dans le vecteur pBC12MI en juxtaposition avec des séquences correspondantes du gène préproinsuline II de rat.

10 Le vecteur pBC12MI est similaire au vecteur pBC12BI d'expression eucaryote, qui a été décrit en détail par Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5, : 3009 (1985)]» Ce vecteur est "basé sur le vecteur pXf^ dérivé . du plasmide p-BR322 [Hanahan, J. Mol. Biol. 166:357 15 (^983)] et contient aussi une région SV40 ori et la longue terminaison répétitive (LTE) efficace promoteur du virus du sarcome de Rous [Cullen et al., Nature 307, 241 (1984)] et une copie génomique du gène insuline II du rat [Lomedico et al., Cell 18 : 545 (1979)]. Le vec-20 teur pBC12MI utilisé dans les constructions décrites ci-dessous est identique au pBC12BI sauf que le fragment LTE contenu ici prolonge un 70 bp additionnel dans la direction 31 (voir Fig. 1). Cette différence n'a pas d'effet sur le niveau de l'expression des gènes codés 25 par le vecteur.

Evidemment un gène IL-2 dans lequel les régions 5* non codantes et le codon d'initiation ont déjà été remplacés par ceux d'un gène d'insuline de rat pourraient être produits d'abord, soit par recombinaison 30 d'ADN, soit par synthèse chimique directe et être introduit dans une deuxième étape dans un vecteur approprié.

Des vecteurs d'expression convenables pour être utilisés dans des cellules de mammifère et qui pourraient être utilisés dans cette invention compren-35 nent mais ne sont pas limités à pBC12MI, pBC12BI,

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pSV2dhfr, p91023(B), pcD71 et pBSVcat. Ces vecteurs peuvent être introduits dans des cellules hôte de mammifère appropriées par transformation, transdvction ou transfection.

5 De nombreux vecteurs de clonage qui peuvent

être utilisés dans cette invention contiennent des gènes (gènes sélectionnables) qui codent une ou plusieurs activités marqueur qui peuvent être utilisées pour choisir des mutants tels que la résistance à 10 11ampicilline dans pBCl2B1 et pBC12MI et l'activité dihydrofolate reductase dans pSV2dh.fr. La sélection des cellules hôte dans lesquelles de tels vecteurs ont été insérés est grandement simplifiée quand les cellules hôtes-sont privées par ailleurs de l'activité 15 apportée par le vecteur. Dans de tels cas les cellules peuvent être cultivées dans des conditions restrictives dans lesquelles seules les mutants abritant le plasmide, et ainsi l'activité, peuvent être multipliés.

Dans un mode de réalisation préféré, le plas-20 mide produisant la HIL-2 fournit l'activité dihydrofolate reductase aux cellules d'ovaire de hamster chinois auxquelles manque par ailleurs une telle activité (cellules CHO-dhfr""). Des mutants sont facilement sélectionnés à partir de cellules non transformées en les culti-25 vant dans un milieu manquant d'hypoxanthine et de thy-midine.

La présence dans un plasmide,d'une activité qui est manquante dans les cellules hôte peuvent fournir un autre avantage pour la sélection des mutants. Dans 30 des conditions de croissance restrictive,les cellules transformées qui contiennent et forment des copies multiples du gène dhfr croîtront plus vite que des cellules avec une ou peu de copies sécrétant de faibles quantités de dhfr. De telles conditions sélectionneront donc les 35 cellules qui ont augmenté ou "amplifié" le nombre de

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copies des gènes dhfr qu'elles expriment. Lorsqu'un gène qui doit être exprimé est présent dans le plasmide près du gène sélectionné, le gène souhaité peut être co-amplifié ce qui à son tour peut conduire à une 5 expression accrue de ce gène. Dans la présente invention, la culture de mutants en présence de niveaux accrus d'améthoptérine. Un inhibiteur de la synthèse de purine de novo, a provoqué la production de niveaux accrus à la fois de dihydrofolate reductase et de 10 HIL-2. Ce processus est appelé "co-amplification".

Tout système de gène sélectionnable similaire pourrait être utilisé dans la présente invention "bien que tous les systèmes ne produiront pas d'amplifi cation de gène. Un autre système qui pourrait être uti 15 lisé mais qui ne produira pas d'amplification, par exemple, est basé sur le gène gpt d'E.coli, qui code pour la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase. Mulligan et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 : 2072 (1981)] ont sélectionné des cellules de singe et 20 de souris transfectées avec des plasmides portant le gène gpt en cultivant les cellules en présence d'acide mycophénolique (un inhibiteur de la synthèse de l'acide guanylique de novo), adénine et xanthine. La sélection dans ce système est encore accrue par l'addi-25 tion d'aminoptérine (un analogue de 1'améthoptérine) au milieu de sélection.

Un autre système implique le gène d'amino-glycoside 3'-phosphotransférase bactérienne, dont le produit rend la bactérie résistante à la néomycine et 30 la kanamycine. Colbere-Garapin et al. [J. Mol. Biol. 150 : 1 (1981)] ont sélectionné des cellules de mammifère transfectées avec des plasmides portant le gène de phosphotransférase sous le contrôle du promoteur de gène thymidine kinase (HSV tk) du virus simplex de 35 l'Herpès en cultivant les cellules en présence de

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.G—418, un antibiotique 2-désoxystreptamine qui inhibe la synthèse de protéine eucaryote. Berg (Science 215 : 296 (1981)] a obtenu le même résultat avec toute une série de vecteurs pSV dans lesquels le gène de phospho-5 transférase a été sous le contrôle d'un promoteur SV40.

La HIL-2 sécrétée par les cellules productrices peut être identifiée dans le milieu de culture par l'une quelconque des méthodes connues dans la technique. Par exemple un essai biologique basé sur l'uti-10 lisation de cellule qui dépendent de la HIL-2 pour leur prolifération. De plus un essai radio-immunologique ou un essai d1immunoadsorbant lié à un enzyme pourrait être réalisé en utilisant des anticorps contre la HIL-2. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide suivie d'un 15 Westerm Blot [Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350 (1979)] ou une méthode similaire pourrait aussi être utilisée. En alternative, une analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pourrait aussi être réalisée comme décrit par Stern 20 [brevet des Etats Unis n° 4 490 289]*

La HIL-2 de l'invention peut être concentrée par précipitation avec des sels tels que le sulfate de sodium ou d'ammonium, par ultrafiltration ou par l'utilisation d'autres procédés bien connus des hommes de 25 la technique. Une purification supplémentaire peut être obtenue par les techniques conventionnelles de purification de protéine, y compris mais non limité à la filtration sur gel, la chromatographie d'échange ionique, l'électrophorèse préparâtive sur gel, la fo-50 calisation isoélectrique, le fractionnement à basse température dans un solvant organique, HPLC ou répartition à contre-courant. Les procédés décrits plus haut par Stern sont utilisés de préférence.

La HIL-2 purifiée comme mentionné ci-dessus 55 selon cette invention peut être utilisée pour des objec

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tifs similaires à ceux des autres composés immunomodu- : lateurs connus pour le traitement et la prévention de maladies, par exemple comme moyen de traiter des conditions immunosuppressives. Elle peut être administrée 5 à l'aide de moyens et compositions pharmaceutiquement acceptables,oraux, injectablés ou topiques. Le dosage et la posologie peuvent être parallèles à ceux d'usage courant dans les applications cliniques de composés immunomodulateurs connus, typiquement environ 10 1-200 x 10^ unités par jour. Ces compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent cette HIL-2 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible. Tout véhicule classique peut être utilisé. Le véhicule peut être un véhicule inerte orga-15 nique ou minéral convenant à une administration paren-térale, percutanée ou entérale. Des véhicules adaptés comprennent l'eau, la gélatine, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles comestibles, les polyalkylène-glycols, spé-20 cialement les polyéthylène-glycols, vaseline et analogue. De plus, les préparations pharmaceutiques peuvent contenir d'autres agents pharmaceutiquement actifs. Des additifs supplémentaires tels qu'agents aromatiques, conservateurs, stabilisants, émulsifiants, tampons et 25 analogues peuvent être ajoutés selon la pratique acceptée en composition pharmaceutique.

Les préparations pharmaceutiques peuvent être réalisées sous toute forme de dosage pharmaceutique adaptée comprenant : a) une forme solide pour 30 l'administration orale telle que comprimés, capsules, pilules, poudres, granulés et analogue; b) une forme liquide pour l'administration orale telle que solutions, sirops, suspensions, élixir et analogue; c) préparations pour l'administration parentérale telles que so-35 lutions stériles, suspensions ou émulsions; et d) prépa

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rations pour administrations topiques telles que solutions, suspensions, onguents, crèmes, gels, poudres micronisées, aérosol et analogue. Les préparations pharmaceutiques peuvent être stérilisées et/ou peuvent 5 contenir des adjuvants tels que des conservateurs, stabilisants, agerits mouillants, émulsifiants, sels pour modifier la pression osmotique et/ou tampon.

Les formes de dosage parentéral peuvent être des perfusions ou des solutions injectables qui peuvent 10 être injectées par voie intraveineuse ou intramusculaire. Les préparations peuvent aussi conteni-r d'autres substances pharmaceutiquement actives. D'autres additifs tels que des conservateurs, stabilisants, agents émulsi-fiants, tampons-et analogues peuvent être ajoutés selon 15 la pratique acceptée de la formulation pharmaceutique.

EXEMPLE

L'exemple suivant doit illustrer d'une manière non limitative les procédés par lesquels le clonage et l'expression de HIL-2 dans des cellules de mammi-20 fère a été réalisée. Il apporte la preuve de l'amélioration substantielle dans l'expression de gène qui peut être attribuée au remplacement des régions 5' normales non codantes du gène de la HIL-2 par celles du gène de 1'insuline de rat.

25 PREPARATION D'ADN

L'isolation à petite échelle d'ADN plasmide-à partir de cultures saturées pendant la nuit a été réalisée selon la procédure de Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7, : 1513 (1979)]- Cette procédure permet 30 l'isolation d'une petite quantité d'ADN à partir d'une culture bactérienne dans des buts analytiques. Sauf autres indications, de plus grandes quantités d'ADN plasmide ont été préparées comme décrit par Clewell et al.. [J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972)]. Des fragments 35 d'enzyme de restriction spécifique dérivés par coupure

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de l'ADN plasmide ont été isolés par électrophorèse préparative sur plaque à 1 % d'agarose à bas point de fusion (Seaplaque, FMC Inc., Rockland, HE). L'ADN a d'abord été séparé sur un gel de 9 x 5 1/2 cm (50 mA, 5 1 heure) dans un tampon Tris-Acétate [Maniatis et al. Clonage Moléculaire, un manuel de laboratoire, 1982,

Cold Srping Harbor Laboratory p. 454] et ensuite visualisé par coloration avec 1 /4g/l de bromure d'éthi-dium. Des sections de gels contenant le fragment ADN 10 souhaité ont été découpées et fondues à 65°C pendant 10 minutes et ensuite diluées avec 5 ml de 20 mM Tris/ HC1 (pH 7,4), 0,2 MNaCl, 1 mM EDTA. L'ADN a été ensuite concentré en utilisant une colonne Elutip-D (Schleicher et Schuell Inc., Keen, NH) ensuivant les instructions 15 du fabricant et précipité à -20°C avec de l'éthanol en présence de 10 jug de ARNt de levure (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD).

REACTIONS ENZYMATIQUES

Les enzymes de restriction, ADN polymerase 20 I (fragment Klenow) et ligase ADN T4 étaient des produits de New England Biolabs, MA. Les méthodes et conditions d'utilisation de ces enzymes ont été essentiellement celles préconisées par le fabricant.

Pour les endonucléases de restriction, une 25 unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une digestion complète de 1,0^ag d'ADN en 60 minutes dans un volume total de réaction de 0,05 ml, avec une digestion réalisée à 37°C. Le tampon utilisé pour toutes ces enzymes (appelé ci-30 après tampon d'enzyme de restriction) est constitué de 100 mM de NaCl, 10 mM de,Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM de MgC^ et 1 mM de 2-mercaptophénol.

La ligation par ADN T4 a été réalisée pendant 16 heures à 4°C (appelé ci-dessous tampon de li-35 gation) contenant 60 mM de Tris/HCl (pH 7,5), 10 mM de

3K

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MgC^, 10 mM de dithiothréitol et 0,1 mil d'ATP. Une unité d'activité de ligase ADN T4 est définie comme la quantité nécessaire pour donner 50 % de liaison de fragments de HindiII d'ADN lambda en 30 minutes à 16°C 5 dans 20^ul de mélange d'incubation et une concentration de groupes terminaux 5' d'ADN de 0,12yuM (300 ^ug/ml).

Le rognage d'extrémités d'ADN monobrin en utilisant le fragment Klenow d'ADN polymérase I a été 10 réalisé dans le tampon d'enzyme de restriction qui a été ajusté pour contenir 1 mM de dGTP, dATP, dCTP et dTTP. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme transformant 10 nmoles de désoxyribonu-cléotides en une forme acide insoluble en 30 minutes à 15 37°C.

MILIEUX DE CULTURE

Le Milieu d'Eagle Modifié Iscove (IMEM) [iscove et al., J. Exp. Med. 147 : 923 (1978)] a été obtenu chez Grand Island Biological Co., Grand Island, 20 N.Y.

Le Bouillon Luria (LB) a contenu 5 g d'extrait de bactolevure, 10 g de bacto-tryptone et 10 g de NaCl par litre, ajusté à un pH de 7,5- L'ampicilline antibiotique a été ajoutée à une concentration finale 25 de 50/».g/ml là où c'est indiqué.

TRANSFORMATION ET TRANSFECTION

Des souches d'Escherichia coli ont été transformées par le procédé de Peacock et al. [Biochim. Biophys. Acta 655 : 243 (1981)] essentiellement comme 30 suit. Les cellules ont été récoltées sur le milieu LB et préparées à la transformation par le procédé de Norgard et al. [j. Biol. Chem. 255 : 7665 (1980)] sauf que le tampon CaC^ a été modifié et a contenu 70 mM de MnCl^, 40 m,M de NaOAc et 30 mM de CaCl^, pH 5,6. 35 Un échantillon de 100yul de cellules mises

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en suspension dans le tampon CaC^ a été combiné avec 50 jal d'échantillon de plasmide contenant entre 50 et 1000 ng d'ADN. Le mélange a été conservé sur de la glace pendant 1 heure et ensuite chauffé à 37°C pendant 5 2 minutes. Les cellules ont été déposées sur des plaques d'Agar LB à 4°C avec de 11ampicilline et incubées pendant 16 heures à 37° pour sélectionner les mutants.

Des cellules d'ovaire de hamster chinois ont été transfectées par le procédé de Graham et al. 10 [Virology 52 : 456 (1973)] comme suit. Cinq dixièmes de ml d'un mélange contenant 8 g/1 de NaCl, 0,37 g/1 de KC1, 0,125 g/1 de Na2HP0^_.2H20, 1 g/1 de dextrose, 3 g/1 de Tris et 125 biM de CaC^ avec 10^ug de quantité _ totale d'ADN ont été ajoutés à 5 x 10^ cellules dans

15 une boîte de culture de 6 cm contenant 4 ml d'IMEM

—4 -S

additionné de 10 M d'hypoxanthine et 10 ^ M de thy-

midine (HT). L'ADN dans le mélange a consisté en 5^Ug de véhicule ADN de thymus de veau de haut poids moléculaire et 5yug de pBCl2/RSV/IL-2/dhfr ADN qui avait été 20 linéarisé avec Pvul. La culture a été incubée pendant une nuit à 37°C dans un incubateur à 5 % de CO2 humidifié, après quoi le milieu a été enlevé et remplacé avec 5 ml d'IMEM frais additionné de 10"^ M d'hypoxanthine et 10"5 M de thymidine (HT). Après un jour d'incubation 25 supplémentaire les cellules ont été détachées de la boîte en utilisant une solution de trypsine-EDTA (GIBCO) et placées dans deux boîtes de 10 cm dans 20 ml d'IMEM avec 10 % de sérum foetal de veau dialysé (ECS) mais sans HT. Des colonies transfectées ont été isolées en 30 utilisant une technique standard de clonage à la micropipette après 10 jours d'incubation supplémentaire.

Des cellules de rein de singe vert d'Afrique (COS) ont été transfectées en utilisant les procédés décrits par Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5 : 3009 35 (1985)]» Des boîtes de culture de tissus de 10 cm ont a -

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été ensemencées avec 5 x 10^ cellules COS dans 10 ml d'IMEM additionné de 10 % de ECS et 50^ug/ml de genta-mycine et incubés pendant une nuit dans un incubateur à 37°» humidifié et avec 5 % de CO2. Les cellules ont 5 alors été lavées une fois avec une solution saline tampon de phosphate à 37°C (PBS) et 2 ml de PBS à 37°C contenant 500^ug/ml de DEAE-dextrane (Pharmacia).

L'ADN à transfecter a alors été ajouté aux cellules. Les cellules COS ont alors été incubées tandis que les 10 boîtes de culture ont été agitées doucement à intervalles de 5 minutes pendant une période de 30 minutes. Après cette incubation, 20 ml d'IMEM contenant 10 % de ECS, 50^ug/ml de gentamycine et 80^uM de chloroquine ont été ajoutés à chaque boîte. Après 2,5 heures 15 d'incubation supplémentaire, le milieu a été remplacé par du milieu IMEM frais avec 10 % de ECS et 50^ug/ml de gentamycine. L'incubation a été poursuivie à 37°C pendant 72 heures, et les cellules et les milieux ont alors été analysés comme décrit ci-dessous.

20 CULTURES DE CELLUIES

Deux souches d'Escherichia coli ont été utilisées dans le travail décrit ici. E. coli souche GM 119, qui a été décrite par Marinus et al. [J. Bacte-riol. 114 : 1143 (1973)]. Cette souche a été déposée 25 le 26 Novembre 1985 sans restriction à 1'"American Type Culture Collection" sous le n° matricule ATCC 53339. E. coli souche MC 1061 a été décrite par Casadaban et al. [J. Mol. Biol. 158 : 179 (1980)].

Cette souche a été déposée aussi le 26 Novembre 1985 30 sans restriction à 1'"American Type Culture Collection" (ATCC); son numéro matricule étant ATCC N° 55558.

On a utilisé trois lignées de cellule de mammifère. Une lignée de cellule a été la lignée d'ovaire de hamster chinois (CH0/dhfr~) qui manque de di-55 hydrofolate réductase. La lignée de cellule a été

i

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isolée au départ par Urlaub et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 : 4216 (1980)]. Des cultures de cette lignée de cellule ont été déposées le 7 mai 1986 à 1'"American Type Culture Collection" avec attribution 5 du numéro matricule n° CRL 9096 . Une lignée de cellule de rein de singe vert d'Afrique (COS) qui a été transfor niée par un génome viral SV40 moins original [Gluzman, Cell 23 : 175 0981)] est disponible à l'ATCC sous le numéro matricule CRL 1651. Une lignée de cellules mu-10 rine IL-2 dépendante (CTLL) qui a été décrite par Rob.b [Méthodes en enzymologie 116 : 493 (1985) peut être obtenue à l'ATCC sous le n° matricule TIB 214. MUTAGSNESE DIRIGEE PAR LE "PRIMER" (ou amorce)

La mutagénèse sur site spécifique dirigée 15 par le "primer" a été réalisée suivant les procédés décrits par Morinaga et al. [Bio/Technology 2 : 636 (1984)]. L'oligonucléide synthétique utilisé pour réaliser la procédure de mutagénèse a été préparé par le procédé à support solide de phosphoramidite [J. Am. 20 Chem. Soc. 103 : 3185 (1981)].

HYBRIDATION DE COLONIE

L'hybridation de colonie a été réalisée en utilisant un procédé décrit par Maniatis et al. [Clonage moléculaire : Un manuel de laboratoire, 1982, 25 Cold Spring Harbor Laboratory, pp 312-315]* Le même oligonucléotide utilisé pour la mutagénèse dirigée sur le primer a été utilisé comme sonde pour les hybridations après l'extrémité 5' en marquant avec Y-^P-ATP et en utilisant la polynucléotide kinase selon le pro-30 cédé de Maniatis et al, [Supra, p 396]. Des sondes ADN plus grandes pour localiser les gènes d'IL-2 et dhfr ont été marqués en utilisant un kit de transfert par insertion (Amersham) selon les instructions du fabricant.

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CONSTRUCTION DU VECTEUR pBC12/RSV/IL-2/dhfr I) 'EXPRESSION DE L'INTERLEUKINE-2

La préparation du secteur final d'expression de l'invention a été réalisée en plusieurs étapes, 5 comprenant successivement (1) la préparation d'un vecteur dans lequel un gène humain modifié HIL-2 pourrait être inséré, (2) modification du gènp HIL-2 pour supprimer la plupart de la région 3' non-codante, toutes les séquences 51 non codantes et les quatre premiers 10 nucléotides de la séquence codant pour la séquence peptide signal, et (3) l'insertion du gène modifié HIL-2 dans le vecteur préparé.

PREPARATION DU VECTEUR DE CLONAGE

Unyug d'ADN plasmide pBC12MI (voir Fig. 1) 15 a été traité avec 20 unités de BamHI dans 100^ul de tampon d'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37°C. Un échantillon de E-coli MC 1061 contenant le plasmide pBC12l"II a été déposé le 7 Mai 1986 à 1'"American Type Culture Collection" avec le numéro matricule n° ATCC 20 67109. Le plasmide digéré par BamHI a été ensuite traité avec 4- unités de fragment Klenow de l'ADN polymérase I pendant 2 heures à 15°C, après quoi la réaction a été arrêtée en chauffant à 65°C pendant 5 minutes. Deuxjal du mélange ont été dilués ensuite à 1:10 avec du tampon 25 de ligation. Le mélange a été refroidi sur de la glace. On a ajouté une unité de ligase ADN T4-, et le mélange réactionnel a été incubé pendant 16 heures à 4-°C.

Le mélange de réaction de ligation a été utilisé ensuite directement pour transformer la souche 30 E.coli GM 119» Des mutants ont été sélectionnés sur agar LB avec de 1'ampicilline. L'ADN de colonies résistantes à 1'ampicilline ainsi obtenu a été séparé par coupure par 1'endonucléase de restriction. L'ADN plasmide isolé a d'abord été digéré avec BamHI ou Clal et 35 les fragments d'ADN résultants ont été séparés par

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électrophorèse sur un gel à 1 % d'agarose et visualisés par 10^ug/ml de bromure d'éthidium. Un plasmide qui a perdu le site BamHI mais acquis un site Clal à sa place a ainsi été identifié et appelé plasmide pBC12CI.

Le plasmide pBC12CI a été ensuite préparé en plus grande quantité par le procédé de lyse détergente de Clewell et al. [J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972)]. La préparation finale du vecteur de clonage a été réalisée en coupant 1 yug de pBC12CI avec 20 unités de Clal et par rognage des terminaisons du produit de digestion avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase I. PREPARATION DU FRAGMENT DE GENE INTERLEUKINE-2

Le plasmide pIL-2-2b, contenant une copie d'ADNc de toute la région codante 4-59 bp de IL-2 humaine flanquée de 31 "bp de la séquence 5* non transférée et de 309 bp de la séquence 3' non transférée [Taniguchi et al., Nature 502 : 305 (1985)] a été utilisé comme source du gène IL-2. Puisque la séquence des nucléotides du gène HIL-2 a été déterminée par Taniguchi et al., le fragment de gène contenant le gène HIL-2 peut être aussi synthétisé en utilisant le procédé décrit par Souza et al. [Demande de Brevet Européen n° Al 154- 489]* Dix^ug de pIL-2-2b ont été coupés avec 20 unités de Rsal et de 20 unités de BamHI dans 100^u.1 de tampon d'enzyme de restriction pendant 1 heure à 57°C. Rsal coupe 1'insert ADNc HIL-2 au site unique 1 bp 5' du codon d'initiation de HIL-2. Le mélange réactionnel a été traité ensuite avec le fragment Klenow d'ADN polymérase I et est soumis à l'électrophorèse préparâtive dans un gel à 1 % d'agarose à faible point de fusion. Le fragment souhaité 760 bp Rsal/BamHI HIL-2 ADNc a été identifié et extrait du gel comme décrit ci-dessus.

Cent ng du vecteur pBC12CI préparé ont été mélangés avec 100 ng de fragment Rsal/BamHI HIL-2 dans

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30yul de tampon de ligation contenant 2 unités de li- ' gase ADN T4 et incubés une nuit à 4°C. L'ADN soudé a alors été utilisé pour transformer la souche E. coli MC 1061 et des mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec de l'ampicilline.

Deux cents ng du fragment HIL-2 isolé ont

été utilisés pour former une sonde transférée par

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insertion marquée au P en utilisant le kit de transfert par insertion selon les instructions du fabricant. Les colonies des plaques ont été récupérées sur des filtres de nitrocellulose (Schleicher et Schuell Inc.) et ensuite sélectionnées selon la présence de 1'insert HIL-2 en utilisant la sonde marquée et en suivant les procédures de Maniatis et al. [Clonage moléculaire : Un manuel de laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor Laborator^-] . Les colonies positives d'hybridation ont été prélevées et des minipréparations d'ADN ont été faites selon le procédé de Birnboim et al. Les préparations d'ADN résultantes ont été coupées avec HindIII et StuI et analysées par électrophorèse sur gel pour trouver la présence d'un fragment caractéristique 690 bp qui indique que le vecteur a été correctement construit. Cette construction a été désignée par pBC10.

Une plus grande quantité d'ADN pBC10 a été préparée et 10 ^ug ont été coupés avec 20 unités de HindIII et 16 unités de StuI dans le tampon de l'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37°C. Le fragment résultant 690 bp d'ADN HIL-2 a été isolé par électrophorèse préparative sur gel d'agarose comme décrit antérieurement.

Un yig de plasmide pBC12MI a été coupé avec BamHI et ensuite traité avec l'ADN polymérase Klenow comme décrit ci-dessus. Après incubation à 65°C, l'ADN a été coupé avec HindIII, extrait avec une solution

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aqueuse de phénol et de chloroforme et précipité par l'addition d'un demi-volume d'acétate d'ammonium 7,3 M et 2 volumes d'éthanol, suivie par une incubation à -70°C. L'ADN pBC12MI précipité a été recueilli par 5 centrifugation, lavé avec de l'éthanol et remis en suspension dans l'eau.

Cent ng du vecteur pBC12HI préparé ont été soudés à 200 ng du fragment isolé IL-2 HindlII/'StuI dans 30^ul du tampon de ligation comme décrit ci-10 dessus. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche E. coli MC1061, et les mutants ont été sélectionnés sur plaque d'agarose LB avec de 1'ampicilline. Les colonies individuelles ont été sélectionnées comme ci-dessus selon la présence d'un 15 fragment 690 bp HindlII/'BamHI et un assemblage correspondant à ce critère a été appelé pBC12/RSV/IL-2.

Ainsi construit, le plasmide pBC12/RSV/IL-2 contient un gène chimère HIL-2 dans lequel la région 5' non codante et les quatre premiers nucléotides ATG T 20 de la séquence codant pour la séquence peptide signal de HIL-2 aussi bien que presque toute la région 3' non codante ont été remplacés par des séquences correspondantes du gène préproinsuline II de rat présent dans le vecteur pBC12MI. En partie cette construction a été 25 faite pour produire une région 31 non codante définie.

Mais c'est la substitution de la région 5' non codante qui, comme on va le montrer ci-dessous, qui produit une augmentation marquée dans le niveau d'expression du gène HIL. La structure résultant de la terminaison N 30 du peptide signal de HIL-2 est présentée sur la Fig. 2.

Comme c'est montré sur la Fig. 2 cette construction a pour résultat la formation d'un peptide signal chimère dans lequel les deux premiers aminoacides de IL-2 (Met-Tyr) sont remplacés par les cinq premiers 35 aminoacides du peptide signal de l'insuline de rat a

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Met-Ala-Leu-Trp-Ile), et un sixième aminoacide (Asp)

qui est codé par la nouvelle séquence de nucléotide créée au point de ligation. Ce changement n'a pas d'effet sur la fonction du peptide signal, qui est 5 coupé du gène IL-2 pendant la maturation comme d'habitude.

INSERTION DES SEQUENCES DU GENE DIHYDROFOLATE REDUCTASE

Un^ug de pBC12/RSV/IL-2 a été coupé avec StuI. L'ADN a été extrait par le mélange phénol/chloro-10 forme, précipité avec de l'éthanol et remis en suspension dans l'eau. Dixyug d'ADN pSV2dhfr [Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1_ : 854 (1981)] ont été coupés avec PvuII et BamHI. Le plasmide pSV2dhfr a été déposé " le 7 Mai 1986 sous forme d'un échantillon de E. coli 15 MC 106H (pSV2dhfr) à 1'"American Type Culture Collection"

avec le numéro matricule N° ATCC 67110. Le fragment de gène SV40/dhfr du plasmide pSV2dhfr a été isolé dans un gel de préparation à 1 % d'agarose, après quoi 100 ng du vecteur pBCl2/RSV/IL-2 ont été soudés à 400 ng du 20 fragment SY40/dhfr isolé, dans 40 ^ul de tampon de ligation pendant une nuit à 4°C. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer directement la souche E. coli MC 1061. Les mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec ampicilline. 25 Les colonies transformées ont été reprises sur filtres de nitrocellulose et sélectionnées en utilisant une sonde de transfert par insertion marquée au préparée contre le fragment de gène SV40/dhfr isolé. La sonde a été préparée par marquage de 200 ng 30 du fragment PvuII/BamHI SV40/dhfr isolé en utilisant le kit de transfert par insertion d'Amersham décrit ci-dessus. En utilisant la procédure de Birnboim et al (supra) l'ADN plasmide a été isolé à partir des colonies positives d'hybridation et on a recherché la 35 présence de deux fragments BamHI par analyse par élec-

c

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trophorèse sur gel. La présence des fragments de BamHI confirme la présence du fragment de SV40/dhfr et établit l'orientation du fragment. Le fragment de gène SV40/dhfr cloné dans pBC12/R£'V/IL-2 contient un gène 5 dhfr murin entier sous le contrôle de la région promoteur précoce du virus SV40. Un clone a été choisi dans lequel les gènes HIL-2 et dhfr dans le plasmide ont été positionnés dans la même orientation, et le plasmide de ce clone a été appelé pBC12/RSV/IL-2/dhfr 10 (voir Fig. 3)»

EXPRESSION FORTS DU GENE HIL-2

Pour exprimer le gène HIL-2, un jour avant la transfection,ona placé 5 x 10^ cellules CH0/dhfr~

dans une boîte de culture à tissu, de 6 cm dans 4ml d'IMEM

, -4 -S

15 additionne de 10 M d'hypoxanthine et de 10 ^ M de thymidine (HT)'. Après incubation une nuit dans un incubateur à 37°0 humidifié et avec 5 % de CO2, les cellules ont été transfectées avec pBC12/RSV/'IL-2/dhfr. Les colonies transfectées ont été isolées comme décrit ci-20 dessus.

Les colonies clonées désignées par d51-d56 ont ainsi été obtenues, chacune d'entre elles étant cultivée dans l'IKEM et séparée des autres et des cultures dhfr+ non clonées mélangées (désignées par d5) 25 pour la production de HIL-2. La production de HIL-2 a été mesurée en utilisant un essai biologique quantitatif basé sur la lignée CTLL de cellules IL-2 murine dépendantes. Cet essai qui a été décrit par Robb [Methods in Enzymology 116 : 493 (1985)] comprend de 30 mélanger une série de dilution de moitié des milieux surnageants de différents clones de cellules dhfr+

avec la lignée CTLL de cellules IL-2 murine dépendantes. Puisque la lignée CTLL ne se développera qu'en présence d'IL-2, le degré de prolifération de ces cellules, dé-35 terminé par le taux d'incorporation de ^H-dT, est une

-33-

mesure précise du niveau de IL-2 sécrété par les clones dhfr+. En alternative, des blastes humains >■ PHA peuvent être utilisés'pour mesurer la production de HIL-2 (Robb et al., supra). Des blastes-PHA'humains peuvent 5 être obtenus par stimulation de lymphocyte de sang périphérique humain pendant 48 heures par de la phyto-hémagglutinine (PHA). Les résultats de cette analyse des colonies clonées sont présentés dans le Tableau I, dans lequel les données sont exprimées en activité

10 d'IL-2 en terme à la fois d'unités par ml de milieu

6

et unités/10 cellules. Une unité d'activité IL-2 est définie comme l'inverse de la dilution correspondant à la moitié de la réponse de prolifération maximale étalonnée par la réponse de standard d'IL-2 fourni par le 15 "Biological Response Modifiers Programme" de l'Institut National du Cancer, Frederick, MD [Thurman, Lymphokine Res. 3:276 (1984)] comme décrit par Robb, supra.

TABLEAU 1

Comparaison de la Production d'IL-2 par des Clones isolés Clone

Concentration d ' améthoptérine (Molaire)

Activité d unités/ml

'interleukine-2

g unités/10 cellules d5

0

640

456

d5l

0

1.920

1.370

d52

0

1.920

N.D.

d53

0

1.920-

1.580

d54

0

820

N.D.

d55

0

. 550

N.D.

d51

5

X

10't

51.200

60.160

d51

2.

X

10~g

51.200

80.210

d51

8

X

10"?

76.800

150.400

d51

2

X

10 ~l

76.800

156.900

d51

5

X

10 4

153.600

401.000

N.D. =

non déterminé.

C

-34-

Dans le Tableau 1 011 peut voir que les clones d^1 et d53 ont été les plus forts producteurs d'activité IL-2. Four démontrer l'effet d'amplification de gène sélectionnable mentionné ci-dessus des cellules de clone d51 ont été cultivées pendant des périodes de 7 à 14 jours en présence de taux croissant d'améthoptérine jusqu'à ce qu'on obtienne une lignée

% -4-

résistante a une concentration de 5 x 10 M d'inhibiteur. Comme c'est montré dans le tableau 1, cette lignée de cellule a sécrété des quantités élevées de HIL-2. Comme attendu, l'analyse des cellules par Southern analysis [Maniatis et al., Clonage Moleculaire Un Manuel de Laboratoire, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory pp 382-389] a montré que chacune contenait environ 100 copies du plasmide. Les queues homopolymère G-C ajoutées à l'origine à la copie HIL-2 ADNc pour faciliter son insertion dans le plasmide pIL-2-2b ont un effet inhibiteur sur l'expression du gène IL-2. Pour pouvoir comparer correctement les taux d'expression de IL-2 entre les séquences de gène ayant les régions 5* non codantes humaines normales et les séquences dans lesquelles ces régions ont été remplacées par celles du gène d'insuline de rat un plasmide a ainsi été préparé dans lequel les queues homopolymères inhibitrices ont été supprimées. Ce plasmide a été appelé pBC40AT. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBC40AT '

Un vecteur coupé dans lequel le gène HIL-2 pourrait être cloné a été préparé en coupant 1yug de PBC12M1 avec 20 unités de BamHI et 20 unités de HindIII dans le tampon d'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37°C. Le fragment résultant a ensuite été traité avec le fragment Klenow de l'ADN polymerase I, extrait avec du mélange phénol/chloroforme et précipité comme décrit ci-dessus.

Un fragment d'ADN HIL-2 a été préparé en

-35-

coupant 10yug d'ADN pIL-2-2b avec 20 unités de BamHI et 8 unités de StuI et rogné les terminaisons avec l'ADN'polymerase de Klenow. Un fragment approximativement 550 "bp HIL-2 a alors été isolé à partir du gel de 5 préparation à 1 % d'agarose comme décrit ci-dessus.

Cent ng du vecteur pBC12MI préparé ont alors été soudés à 150 ng du fragment HIL-2 BamHI/StuI dans 25ju.1 de tampon de ligation comme décrit ci-dessus. Le mélange de ligation a été utilisé directement pour 10 transformer la souche E. coli MC 1061 et les mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec ampicilline. Les colonies résistantes à l'ampicil-line ont été enlevées des plaques et placées sur filtre de nitrocellulose et sélectionnées selon la présence 15 de 1'insert HIL-2 par hybridation de colonies avec des

-zn sondes .transférées par insertion et marquées au P préparé en présence de 200 ng de fragment BamHI/StuI purifié, avec le kit d'Amersham.

Les colonies positives d'hybridation ont été 20 prélevées et sélectionnées selon la présence d'un fragment d'approximativement 560 bp BstEII/BamHI selon le procédé de Birnboim et al (analyse par enzyme de restriction d'ADN plasmide). Une construction contenant ce fragment a été identifiée et appellée pBC40. Le 25 plasmide pBC4-0 est identique à pBC12/RSV/IL-2 sauf qu'il lui manque la région 51 non codante de l'insuline et qu'à la place il a la région naturelle 32 bp HIL-2 51 non transférée. Le plasmide conserve aussi le codon d'initiation naturel de HIL-2 et a la queue 17 bp homo-30 polymère qui est située dans la région 5' non codante. Une plus grande quantité d'ADN pBC4-0 a été préparée par le procédé de Clewell et al. [J. Bacteriol. 110 : 1135 (1972)].

Le segment de queue homopolymère du gène 35 HIL-2 a été supprimé par le procédé de mutagénèse diri-

C

-36-

gée sur le primer de Morinaga et al [Bio. Technology 2 : 6361 (1984)]. Pour réaliser ce procédé un primer descxy-oligonucléotide à 24-mères phosphorylé a été préparé par le procédé du support solide phosphorami-5 dite comme décrit ci-dessus qui a contenu 12 désoxy-nucléotides qui sont en séquence complémentaire des bases de chaque côté de la région homopolymère à éliminer sur l'un des brins de l'ADN. La séquence nucléo-tide de ce primer à 24-mères et celle de l'ADN conte-10 nant la région homopolymère à exciser sont représentés sur la Fig. 4. Les régions qui subissent l'hybridation pendant le processus de mutagénèse sont soulignées. La suppression de la région homopolymère crée un nouveau site HindIII dans l'ADN résultant. 15 Pour réaliser la procédure de mutagénèse,

1yug d'ADN pBC40 a été linéarisé avec Pvul, extrait avec du mélange phénol/chloroforme, précipité dans l'é-thanol et repris dans 20^ul d'eau. Dixyug de pBC40 supplémentaires ont été coupés avec EcoKI, et le plus grand 20 fragment de vecteur produit, appelé le "vecteur à lacune" a été isolé dans un gel de préparation à 1 % d'agarose. Des quantités égales à 200 ng des plasmides linéarisé et à lacune ont alors été mélangés avec un excès 20 fois molaire de 11oligonucléotide phosphorylé 25 dans 10^ul d'eau, et 2yul de 10 x tampon Klenow [1 M NaCl, 65 mM Tris/HCl (pH 7,4), 45 mM MgCl2 et 10 mM 2-mercaptoéthanol]ont été ajoutés. Le mélange a été traité pour des durées successives de 5, 30, 30 et 5 minutes à 100°C, température ambiante, 4°C et sur la 30 glace, respectivement, après quoi l'échantillon a été porté à un volume de 20yul par addition de 2^,ul de 10 mM ATP, 4jul d'un mélange de 2,5 mM de dCTP, dATP,

dGTP et dTTP, 0,5^1 de Klenow polymerase I (2,5 unités d'activité) et 1yul de ligase ADN T4 (0,8 unité d'ac-35 tivité).

C

-37-

Le mélange a été incubé pendant 16 heures à 15°C et utilisé alors directement pour transformer la souche E. coli MC 1061. Les mutants ont été sélectionnés sur des plaques d'agarose LB avec ampicilline, et les 5 colonies des plaques ont été recueillies sur filtre de nitrocellulose et triées selon la présence d'une séquence homologue du primer à 24-mères utilisé dans le procédé de mutagénèse en utilisant 1'oligonucléotide synthétique marqué avec l'a ^P-ATP comme sonde. 10 Les colonies positives ont encore été triées selon le procédé de Birnboim et al. selon la présence d'un fragment attendu 530 bp HindIII/BamHI. Puisque les colonies obtenues selon ce procédé sont mélangées (Morinaga et al. supra), un échantillon positif d'ADN 15 a été utilisé pour retransformer E. coli MC 1061, et les colonies résultantes ont été retriées pour le fragment 530 bp HindIII/3amHI. Une colonie positive ainsi identifiée, qui a été appelée pBC40AT, était identique à pBC40 sauf la suppression d'un segment 20 22 bp dans la séquence de tête non transférée constitué principalement de la séquence 17 "bp homopolymère G-C. COMPARAISON FONCTIONNELLE DES VECTEURS pBC12/RSV-IL-2,

pBC40 et pBC40AT

Les trois constructions décrites ci-dessus 25 ont été comparées du point de vue de leur capacité à diriger la synthèse de 1'HIL-2 humaine en utilisant le test d'expression rapide quantitatif avec des cellules COS transfectées, de Butnick et al. [Mol. Cell. Biol. 5 : 3009 (1985)]. Dans ce procédé des quantités équimolaires 30 des préparations d'ADN à comparer sont introduites par transfection dans des cellules de rein de singe vert Africain de lignée COS décrites par Gluzman [Cell 23 : 175 (1981)] qui est transformée par un génome viral SV40 moins d'origine. Les acides désoxyribonucléiques 35 contenant une origine de réplication SV40 (telle que

C

-38-

le test des plasmides) et qui sont introduits dans ces cellules sont répliqués pour donner un grand nombre de copies et sont ainsi efficacement exprimés par la machine de réplication ADN dépendant de SY40 présente dans les cellules.

Les quantités de HIL-2 produites par les cellules COS transformées ont été déterminées en utilisant l'essai biologique quantitatif de Robb (supra) avec la lignée de cellules CTLL, avec les résultats présentés dans le Tableau 2 pour quatre expériences différentes.

TABLEAU 2

Influence des séquences 5' non codantes sur l'expression d'interleukine-2

Production relative d'IL-2 (unités/ml)

Clone 1 2 5 4 Moyenne pBC12/RSV/IL-2 1.024 512 1.536 6.144 100

pBC40 24 8 32 192 2,8

pBC40AT 128 96 128 768 12,1

Comme le montre le Tableau 2, le plasmide pBC12/RSV/IL-2 induit la synthèse de quantités de IL-2 considérablement plus grandes que ce que font les plasmides pBC40 et pBC40AT. Bien que la présence d'une région homopolymère dans la région 5' non codante de pBC40 le rende moins efficace que pBC40AT, la principale différence entre les trois plasmides repose sur le fait que l'ensemble des séquences 5' non transférées de p3C40 et de pBC40AT sont des séquences humaines naturelles, tandis que dans le plasmide pBC12/'RSV/IL-2 existent les séquences correspondantes du gène prépro-insuline II de rat.

Le remplacement des séquences 5' non codantes

-39-

humaines naturelles par celle du gène d'insuline de rat augmente nettement l'expression de HIL-2 pour des raisons qui ne sont pas claires. Une compréhension du mécanisme de cette expression accrue n'est pas indis-5 pensable à l'invention. Il se peut que la stabilité accrue de l'AEITm soit responsable de cet effet- Inversement, il est possible que le remplacement par le codon AUG initiateur d'insuline du codon naturel IL-2 AUG (Fig. 2) confère une efficacité de transfert supé-10 rieure à cause de la présence de la séquence la plus idéale adjacente au codon initiateur d'insuline [Kozak Cell 44 : 283 (1986)].

De nombreuses modifications et variations de cette invention peuvent être faites sans s'écarter 15 de son esprit et étendue, comme cela est évident aux hommes de la technique. Les modes de réalisation spéci fiques décrits ici sont présentés comme exemple seulement, et l'invention n'est limitée que par les termes des revendications en annexe.

t

40

Claims (1)

1. REVENDICATIONS

   1 - Procédé de production d'interleukine-2 humaine, caractérisé par a) la culture d'une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant comprenant un vecteur et une séquence d'ADN codant pour 1'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal comprenant un gène codant pour 1'interleukine-2 humaine et une séquence peptide signal dans lesquels les séquences 5' non codantes du gène ont été remplacées par des séquences 5' non-codantes hétérologues, dans laquelle le vecteur recombinant est capable de diriger l'expression de la séquence d'ADN ; et b) l'isolation de 1'interleukine-2 humaine à partir de la culture.

   2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant, dans lequel les séquences hétérologues correspondantes sont celles du gène d'insuline de rat. '

   3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN comme définie dans la revendication 1, dans la séquence ADN duquel en plus, les nucléotides adjacents de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal ont été remplacés par des séquences hétérologues correspondantes .

   4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant, comprenant une séquence ADN comme définie dans la revendication 1, dans la séquence ADN duquel, les quatre premiers nucléotides ATG T de la sous-séquence codant pour la séquence peptide signal ont été remplacés par les nucléotides ATG GCC CTG TGG

   41

   ATC G de la sous-séquence codant pour le peptide signal de préproinsuline II de rat.

   5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant comprenant une région SV40 ori et un promoteur à longue terminaison répétitive du virus du sartome de Rous.

   6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant sélectionné dans le groupe de pBC12/RSV/IL-2 et pBC12/RSV/IL-2/dhfr.

   7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère, dans la--quelle ledit vecteur recombinant a été introduit par transfection.

   8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on cultive une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant comprenant un gène sélectionnable dans un milieu de sélection, dans lequel des copies multiples du gène sélectionnable et la séquence d'ADN codant pour 1 *interleukine-2 humaine sont produits par co-ampli-;fication.;9 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise une cellule de mammifère contenant un vecteur recombinant contenant un gène sélectionnable codant pour la dihydrofolate réductase, ladite cellule de mammifère manquant par ailleurs d'activité dihydrofolate réductase et est cultivée dans un milieu manquant d'hypo-xanthine et de thymidine et contenant de 1'améthoptérine.;10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite cellule de mammifère est une cellule CHO/dhfr".;11 - Procédé de préparation d'une cellule de mammifère capable d'exprimer 1'interleukine-2 humaine, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'un;I;42;vecteur recombinant comme défini dans la revendication 1 dans une cellule de mammifère.;12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit vecteur recombinant est;5 introduit dans la cellule de mammifère par transfection.;13 - Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique contenant une interleukine-2-humaine obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend;10 l'opération de mélange de ladite interleukine-2 humaine avec un véhicule compatible pharmaceutiquement acceptable.;14 - Composition pharmaceutique contenant une interleukine-2 humaine obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.;15 15 - Utilisation d'une interleukine-2 humaine qui peut être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour le traitement et la prévention de maladies.;16 - Utilisation d'une interleukine humaine;20 qui peut être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en tant que composé immuno-modulateur.;17 - Utilisation d'une interleukine-2 humaine obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendi-;25 cations 1 à 10 pour le traitement de conditions immuno-suppressives.;18 - Interleukine-2 humaine qui peut être obtenue à partir d'une culture de cellules de mammifère transfectées avec un plasmide sélectionné dans le groupe constitué;30 • de pBCl2/RSV/IL-2 et pBC12/RSV/IL-2/dhfr.;19 - Interleukine-2 humaine qui peut être obtenue à partir d'une culture de cellules de mammifère transfectées avec un plasmide sélectionné dans le groupe constitué de pBC40 et pBC40AT.;35 20 - Interleukine-2 humaine produite par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.;Qfî;43;21 - Interleukine-2 humaine selon la revendication 20 qui est glycosylée.;22 - Interleukine-2 humaine selon l'une quelconque des revendications 20 et 21 qui est essentiel-;5 lement sous forme pure.;23 - Cellule de mammifère capable d'exprimer de 11interleukine-2 humaine, préparée suivant un procédé selon la revendication 11 ou 12.;24 - Cellule de mammifère contenant un vec-10 teur recombinant comme défini dans la revendication 1;capable d'exprimer de 1'interleukine-2 humaine.;25 - Vecteur recombinant comme défini dans la revendication 1 capable d'exprimer de 1'interleukine-2 humaine.;0 R « G INAL;$?Qnvoi$;~înai rsyé nul CURAU ail en Propriété Industrielle;26bt», Boul. Princesse Charlotte;MONTE-CARLO;R* procuration dei

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