MD4578C1 - Anticorpi anti-CD134 (OX40) şi aplicarea acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la anticorpi care se leagă specific la CD134 uman.Anticorpii anti-CD134 umani, conform invenţiei, se leagă specific de domenul extracelular al CD134 uman, inclusiv la alte domene de legare decât cel de legare a ligandului OX40 (OX40L) la CD134 uman, care este exprimat, de exemplu, pe limfocitele T umane efectoare (Teff) CD4 şi/sau CD8 activate convenţional şi pe CD4 reglatoare (Treg) supresoare a limfocitelor T umane activate. Anticorpii anti-CD134 umani din invenţie pot fi utilizaţi (de exemplu, pentru stimularea activităţii anticanceroase a Teff şi/sau inhibarea funcţiei de supresie a Treg) pentru tratamentul cancerului.Secvenţe: 61

Description

Invenţia se referă la anticorpi, în special la anticorpii care se leagă la CD134, şi la utilizarea unor astfel de anticorpi în tratamentul cancerului.

Stimularea funcţiei antitumorale a celulelor T reprezintă o abordare unică în tratamentul cancerului. Există dovezi importante, conform cărora celulele tumorale "evită" sistemul imunitar prin inducerea unei toleranţe imune active, mediate în mare măsură de limfocitele T reglatoare (Tregs Quezda et al. Immunol. Rev. 2011, 241, p.104-118). Prin urmare, echilibrul dintre T-limfocitele efectoare (adică eradicarea directă sau indirectă a celulelor tumorale) Teff şi tolerogene (adică supresia funcţiilor efectoare şi supravieţuirii Teff) Treg pare a fi crucial pentru eficienţa imunoterapiei antitumorale. Cu alte cuvinte, un răspuns imun antitumoral eficient poate fi obţinut prin creşterea funcţiei efectoare a Teff specifice tumorii şi/sau prin atenuarea funcţiei supresoare a Treg specifice tumorii. Un receptor - cheie, care a fost demonstrat să medieze aceste răspunsuri, este receptorul CD134 (OX40) (Sugamura K., Ishii N., Weinberg A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev. Imm. 2004, 4, p. 420-431).

CD134 (de asemenea cunoscut ca OX40, TNFRSF4 şi ACT35) este un membru al superfamiliei receptorului factorului de necroză tumorală. Acest receptor co-stimulator de suprafaţă CD134 este exprimat pe limfocitele T activate şi joacă un rol important în supravieţuirea şi funcţia acestora. Prezenţa limfocitelor T care exprimă CD134 a fost demonstrată în diferite tumori maligne umane şi în ganglionii limfatici regionali ai pacienţilor cu cancer (Ramstad et al. Am. J. Surg. 2000, 179, p. 400-406; Vetto et al.,. Am. J. Surg. 1997, 174, p. 258-265).

Ligarea in vivo a receptorului CD134 la şoareci (fie prin proteine solubile de fuziune ale ligandului OX40 (OX40L) cu imunoglobulina la şoareci, fie prin mimetice OX40L la şoareci, cum ar fi anticorpii specifici anti-CD134 la şoareci) în cazul şoarecilor purtători de tumori sporeşte imunitatea antitumorală, conducând la supravieţuire în lipsa tumorii la modelele murine pe diferite linii celulare tumorale maligne, de exemplu, în caz de limfom, melanom, sarcom, cancer de colon, cancer mamar şi gliom [1].

A fost propusă stimularea răspunsului imun al unui mamifer la un antigen prin implicarea OX40R prin utilizarea unui agent de adeziune pentru OX40R (WO 99/42585). Deşi documentul se referă în general la agenţii de adeziune pentru OX40, accentul se pune pe utilizarea OX40L sau a părţilor de acesta; menţionarea anticorpilor anti-OX40 este în contextul echivalenţei lor cu OX40L. Într-adevăr, atunci când echipa Weinberg a repetat cercetarea într-un studiu cu primate non-umane, din nou, au ales în mod deliberat un anticorp care se leagă la situsul de legare a OX40L şi care, în general, imită OX40L.

S-a mai utilizat un anticorp anti-OX40, numit OX86, care nu a blocat legarea OX40L, în scopul de a cerceta expresia diferenţială a OX40 pe celulele T activate la şoareci [2]; sau în cadrul unui model cu şoareci s-a utilizat OX86 împreună cu ciclofosfamida, în calitate de o chimioimunoterapie potenţială [3]. Cu toate acestea, nu este de aşteptat ca OX86 să se lege la OX40 uman şi, la selectarea unui anticorp care ar fi eficient la oameni, conform opiniei lui Weinberg, ar putea fi selectat un anticorp care s-ar lega la situsul de legare a OX40L.

Ligarea in vivo a receptorului uman CD134 (prin anticorpii umani specifici anti-CD134, care interacţionează cu domeniul de legare al OX40L pe CD134 uman; (US 2009/0214560 A1) la şoarecii cu imunodeficienţă combinată severă (SCID) sporeşte imunitatea antitumorală, ceea ce conduce la inhibarea creşterii tumorale a diferitor linii celulare tumorale maligne la oameni, de exemplu, în limfom, cancer de prostată, cancer de colon şi cancer mamar.

Mecanismul exact al răspunsurilor imune antitumorale, mediate de ligarea CD134 la oameni, nu este încă elucidat, dar se crede că acesta este mediat prin calea transmembranară de semnalizare CD134, care este stimulată de interacţiunea cu OX40L. Această interacţiune este mediată de legarea OX40L trimeric la CD134. În terapiile curente anticanceroase, utilizarea ligandului trimerizat OX40 este propusă în calitate de un agent mai eficient, decât anticorpii anti-OX40 [4].

În prezent, în mod surprinzător s-a relevat că, pentru a induce activitatea antitumorală mediată de celulele T, utilizarea moleculelor izolate de adeziune, care se leagă la CD134 uman, unde molecula de adeziune nu împiedică legarea receptorului uman CD134 (CD134) la ligandul OX40 (OX40L), are drept rezultat un răspuns imun crescut, caracterizat prin intensificarea funcţiei imunostimulatoare/efectoare a celulelor T-efectoare şi/sau prin proliferarea acestor celule, şi/sau prin fenomenul de reglare cu reducere în cazul funcţiei imunosupresoare a celulelor T reglatoare.

Astfel, prezenta invenţie se referă la moleculele izolate de adeziune, care se leagă la CD134 uman, şi molecula de adeziune nu împiedică legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L).

Astfel de molecule de adeziune includ anticorpi potriviţi anti-CD134, fragmente de legare a antigenului ale anticorpilor anti-CD134, şi derivaţi ai anticorpilor anti-CD134. În unele realizări molecula de adeziune se leagă la CD134 uman cu Kd de 1 x 10-7 M sau mai puţin. Molecula de adeziune are activitate agonistă pe CD134 uman de pe celulele T-efectoare şi/sau activitate antagonistă pe CD134 uman de pe celulele T-reglatoare. În unele realizări ulterioare molecula de adeziune este un anticorp monoclonal uman, care leagă specific CD134 uman cu Kd de 100 nM sau mai puţin, preferabil mai puţin de 50 nM, şi mai preferabil mai puţin de 20 nM.

Prezenta invenţie asigură, de asemenea, o compoziţie care conţine una sau mai multe moleculele de adeziune şi un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări molecula de adeziune este un anticorp monoclonal anti-CD134 uman sau un fragment al acestuia de legare a antigenului. Compoziţia ar mai putea cuprinde ulterior agenţi farmaceutici suplimentari, cum ar fi agenţi imunoterapeutici, agenţi chimioterapeutici şi agenţi terapeutici hormonali.

Prezenta invenţie asigură în continuare metode de diagnostic şi de tratament cu utilizarea moleculelor de adeziune. În unele realizări se asigură o metodă de tratament sau de prevenire a cancerului la un mamifer, care prevede administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente de moleculă de adeziune sau de o compoziţie ce conţine o moleculă de adeziune, conform prezentei invenţii. În alte realizări invenţia se referă la o metodă de stimulare a răspunsului imun la un mamifer, care cuprinde administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente de moleculă de adeziune sau de o compoziţie ce conţine o moleculă de adeziune. În anumite realizări molecula de adeziune, utilizată în metode, este un anticorp monoclonal anti-CD134 uman sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, care se leagă la CD134 uman, totodată anticorpul nu împiedică legarea receptorului uman CD134 (OX40) la ligandul OX40 (OX40L).

Prezenta invenţie se referă în continuare la molecule de acid nucleic, care codifică o secvenţă aminoacidă a unei molecule de adeziune, la vectori care conţin asemenea acizi nucleici, la celule gazdă care cuprind vectori şi la metode de preparare a moleculelor de adeziune.

Descrierea prezintă, de asemenea, şi alte aspecte, care vor fi clare din descrierea completă, inclusiv şi din revendicări.

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1…23, care reprezintă:

fig. 1 - efectul dependent de timp şi doză al expunerii la PHA-M asupra expresiei CD134 uman de suprafaţă de către limfocitele T umane.

fig. 2 - expresia CD134 uman pe limfocitele T umane CD4 aflate în repaos şi PHA-M - activate.

fig. 3 - caracteristicile adeziunii clonei clonei 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece pe limfocitele T care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 4 - legarea clonei 12H3 şi clonei 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece pe limfocitele T CD4, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate şi pe limfocitele T CD8.

fig. 5 - competiţia încrucişată a clonei 20E5 nemarcate a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece cu clona ACT35 comercializată a anticorpilor anti-CD134 de şoarece, conjugată cu PE cu sau clona L106 pe limfocitele T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 6 - legarea simultană a clonei 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece cu OX40L uman pe limfocitele T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 7 - efectul dependent de timp al expunerii la particulele sferice stimulatoare ale anticorpilor anti-CD3 uman/ anti-CD28 uman asupra expresiei de CD134 uman de suprafaţă al limfocitelor T efectoare (Teff) şi limfocitelor T reglatoare (Treg) umane.

fig. 8 - efectul dozo-dependent al expunerii la clona 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece, sau la OX40L uman, asupra proliferării de limfocite T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 9 - efectul combinării clonei 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece cu OX40L uman asupra proliferării de limfocite T, ce exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 10 - efectul expunerii la clona 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece, sau la OX40L uman, asupra proliferării de limfocite T efectoare umane, care exprimă CD134 uman, stimulate de particulele sferice stimulatoare ale anticorpilor anti-CD3 uman/anti-CD28 uman.

fig. 11 - efectul expunerii la clona 20E5 a anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece, sau la OX40L uman, asupra proliferării de limfocite T reglatoare umane, care exprimă CD134 uman, stimulate de particulele sferice stimulatoare ale anticorpilor CD3 anti-uman/ CD28 anti-uman.

fig. 12 - efectul comparativ al anticorpului anti-CD134 uman de şoarece asupra proliferării mediate de OX40L uman a limfocitelor T efectoare (A) şi reglatoare (B) umane, care exprimă CD134 uman, stimulate de particulele sferice stimulatoare ale anticorpilor CD3 anti-uman/ CD28 anti-uman.

fig. 13 - efectul expunerii la clona 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece sau la OX40L uman asupra supresiei proliferării limfocitelor T efectoare umane, care exprimă CD134 uman, mediate de limfocitele T reglatoare umane, care exprimă CD134 uman.

fig. 14 - legarea clonei himerice umane 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ pe (minus şi plus IL-2) limfocitele T CD8 şi limfocitele T CD4, care exprimă CD134 uman, stimulate de particulele sferice ale CD3/CD28.

fig. 15 - efectul clonei himerice umane 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau OX40L uman asupra proliferării de limfocite T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 16 - efectul dozo-dependent al expunerii la clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau la OX40L uman asupra proliferării limfocitelor T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 17 - efectul combinării clonei himerice umane 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ cu OX40L uman asupra proliferării limfocitelor T, care exprimă CD134 uman, PHA-M - stimulate.

fig. 18 - efectul clonei himerice umane 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau OX40L uman asupra proliferării de limfocite T, care exprimă CD134 uman, stimulate de (minus şi plus IL-2) particulele sferice ale CD3/CD28.

fig. 19 - legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece cu proteina redusă şi neredusă de fuziune CD134 recombinant uman: Fcγ uman. (A) Condiţiile de examinare fără reducere (a, b) şi cu reducere (c, d). (B) Modelele de migraţie electroforetică a proteinei de fuziune CD134 recombinant uman: Fcγ uman (rhuCD134) în condiţii fără reducere (a, b) şi cu reducere (c, d), utilizând colorarea cu albastru briliant de Coomassie. (C) Western blot în cazul proteinei de fuziune CD134 recombinant uman: Fcγ uman fără (a, b) şi cu reducere (c, d), expuse la anticorpul de control izotip IgG1κ de şoarece (mIgG1) sau la clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece (m20E5).

fig. 20 - reprezentarea schematică a domeniilor bogate în cisteină (CRD), în CD134 uman cu lungime completă (notate ca "CRD1") şi în diferite forme trunchiate de CD134 uman (notate ca "CRD2", "CRD3", "CRD4" şi "CRD4 trunchiat (tc )").

fig. 21 - legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece pe linia de celule 293-F, transfectată tranzitoriu cu structura CD134 uman cu o lungime completă (notată "CRD1"), sau cu diferite structuri trunchiate ale CD134 uman (notate ca "CRD2", "CRD3", "CRD4" şi "CRD4 trunchiat (tc)").

fig. 22 - legarea clonelor himerice umane 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman IgG4κ şi/sau IgG1κ pe linia de celule 293-F, transfectată tranzitoriu cu structura CD134 uman cu o lungime completă (notată "CRD1"), sau cu diferite structuri trunchiate ale CD134 uman (notate ca "CRD2", "CRD3", "CRD4" şi "CRD4 trunchiat (tc)").

fig. 23 - legarea comparativă a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece (A) şi anticorpului anti-CD134 IgG4κ (B) cu peptida derivată din CD134 uman, care corespunde secvenţei de aminoacizi din A1-modulul cu subdomeniu CRD3 - A1-modul-CRD4 trunchiat (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677- 683).

Activarea celulelor T este mediată nu numai prin stimularea cu antigen prin receptorii celulelor T, dar şi prin semnale co-stimulatoare prin moleculele co-stimulatoare. Printre unele molecule co-stimulatoare, membrul familiei de receptori ai factorului de necroză tumorală (TNF), OX40 (CD134), joacă un rol - cheie în supravieţuirea şi homeostazia celulelor T efectoare şi de memorie. Conform acordului convenţional privind co-stimularea OX40, se produce o interacţiune între OX40 şi ligandul OX40 (OX40L), când celulele T activate se leagă la celulele specializate prezentatoare de antigen (CPA). Funcţiile celulelor T, inclusiv producerea de citokine, expansiunea şi supravieţuirea, sunt apoi intensificate prin semnale co-stimulatoare ale OX40. Interacţiunea dintre OX40 şi OX40L are loc în timpul interacţiunii celulă T - celulă dendritică (CD), peste 2…3 zile după recunoaşterea antigenului. Celula T care exprimă OX40 poate, de asemenea, interacţiona cu o celulă ce exprimă OX40L, alta decât CD, şi primi un semnal OX40 de la o celulă, care poate furniza semnale esenţiale pentru generarea celulelor T de memorie, stimularea răspunsului Th2, şi prelungirea răspunsurilor inflamatorii. Astfel, interacţiunea optimă dintre OX40 şi OX40L ar putea fi formată în două etape: OX40L exprimat pe celulele T CD4 activate interacţionează cu OX40 exprimat pe o altă celulă T CD4 responder, ceea ce duce la generarea optimă a celulelor T CD4 de memorie (Soroosh et al. 2006), sau OX40L exprimat pe celulele accesorii CD4+ poate promova supravieţuirea celulei Th2 prin interacţiunea cu OX40 pe celulele Th2 (Kim et al. 2003). În plus, expresia OX40L pe celulele B este necesară pentru dezvoltarea Th2 in vivo, dar nu dezvoltarea Th1 (Linton et al. 2003), şi mastocitele care exprimă OX40L stimulează direct funcţia celulelor T efectoare prin interacţiunea dintre OX40 pe celulele T şi OX40L pe mastocite (Kashiwakura et al. J. Immunol., 2004, 173, p. 5247-5257; Nakae et al. J. Immuno., 2006, 176, p. 2238-2248). Suplimentar la aceasta, deoarece celulele endoteliale exprimă, de asemenea, OX40L (Imura et al. 1996), legarea OX40 la celulele endoteliale ar putea fi implicată în inflamaţia vasculară. Semnalele OX40 în exces, atât la celulele T responder, cât şi la celulele T reglatoare, inhibă supresia imună, mediată de Treg. Semnalele OX40 ce trec la celulele T responder le fac rezistente la suprimarea mediată de Treg. Pe de altă parte, semnalele OX40 ce trec în celulele Treg inhibă direct funcţia supresoare a Treg, deşi este discutabil faptul dacă semnalele OX40 ar putea controla nivelul de expresie a Foxp3 în celulele Treg. În plus, stimularea lentă a OX40 inhibă diferenţierea dependentă de TGF-beta a celulelor iTreg (celule Treg inductibile). Inhibiţia poate fi mediată în parte de către citokinele efectoare, cum ar fi IL - 4 şi IFN - gamma, produse de celulele T efectoare, stimulate cu OX40. Este important faptul că blocarea OX40L promovează semnificativ diferenţierea iTreg şi induce toleranţa la grefă, care ar putea fi mediată prin celulele Treg. Prin urmare, OX40 ar putea prezenta o posibilă ţintă moleculară pentru controlul autoimunităţii mediate de celulele T. În plus, studiile recente au raportat faptul că interacţiunea dintre OX40L exprimat de celulele mastocitare şi OX40 exprimat de celulele Treg poate suprima reciproc funcţia mastocitelor şi funcţia de supresie a celulelor Treg (Gri et al. 2008; Piconese et al. 2009).

Şoarecii sunt un instrument experimental de elecţie pentru imunologi, şi studiul asupra răspunsurilor lor imune a oferit o înţelegere considerabilă cu privire la modul de funcţionare a sistemului imunitar uman. Structura generală a şoarecelui şi a sistemului uman par a fi destul de asemănătoare; cu toate acestea, există, de asemenea, diferenţe semnificative. De exemplu, la şoareci, CD134 este exprimat pe Teff la activare, în timp ce Treg exprimă CD134 în mod permanent (Piconese et al. J. Exp. Med. 2008, 205, p. 825-839). La oameni, CD134 este exprimat atât pe Teff, cât şi pe Treg, dar numai la activare (a vedea, de exemplu, exemplul 2 (g), "Expresia CD134 pe limfocitele T efectoare şi reglatoare umane după stimularea cu particule sferice stimulatoare a anticorpului CD3 anti-uman/anticorpului CD28 anti-uman"). Mai mult decât atât, Treg de şoarece induc apoptoza Teff de şoarece pentru obţinerea supresiei (Pandiyan et al. Nat. Immunol. 2007; 8, p. 1353; Scheffold et al. Nat. Immunol. 2007, 8, p. 1285-1287), în timp ce Treg umane nu induc apoptoza în Teff umane pentru obţinerea supresiei (Vercoulen et al. Plos ONE, 2009; 4, p. 7183). Împreună, aceste date indică diferite roluri ale CD134 în funcţia de supresie a Treg în sistemul imunitar uman şi cel murin.

Termenul “moleculă de adeziune” cuprinde (1) un anticorp, (2) un fragment de legare a antigenului al unui anticorp şi (3) un derivat al unui anticorp, cum este definit aici. Termenul "se leagă la CD134" sau "legare la CD134" se referă la legarea unei molecule de adeziune, aşa cum este definită aici, de receptorul CD134 într-un test in vitro, cum ar fi un test BIAcore sau Octet (rezonanţa plasmonică de suprafaţă). Molecula de adeziune are, de preferinţă, o afinitate de legare (Kd) de 1x10-6 M sau mai puţin, mai preferată fiind de cel mult 50x10-7 M şi mai preferată fiind de cel mult 1x10-7 M.

Termenul "anticorp izolat" sau "moleculă de adeziune izolată" se referă la un anticorp sau la o moleculă de adeziune care: (1) nu este asociată cu componente asociate în mod natural, care o însoţesc în starea sa nativă; (2) nu conţine alte proteine din aceeaşi specie; (3) este exprimată de o celulă dintr-o specie diferită; sau (4) nu apare în natură. Exemplele de anticorpi izolaţi includ un anticorp anti-CD134, care a fost purificat de afinitate prin utilizarea CD134, un anticorp anti-CD134, care a fost generat de hibridoame sau alte linii celulare in vitro, şi un anticorp anti-CD134 uman, derivat de la un animal transgenic.

Termenul "agonist" se referă la o moleculă de adeziune, aşa cum este definit aici, care, la legarea de CD134, (1) stimulează sau activează CD134, (2) stimulează, promovează, induce, creşte sau prelungeşte activitatea, prezenţa sau funcţia CD134, sau (3) stimulează, promovează, creşte sau induce expresia CD134. Termenul "antagonist" se referă la o moleculă de adeziune, conform prezentei invenţii, care la legarea de CD134, (1) inhibă sau suprimă CD134, (2) inhibă sau suprimă o activitate, prezenţa sau funcţia CD134, sau (3) inhibă sau suprimă expresia CD134.

Termenul "anticorp" se referă la o moleculă de imunoglobulină, care este, de obicei, compusă din două perechi identice de catene polipeptidice, fiecare pereche având o catenă "grea" (H) şi o catenă "uşoară" (L). Catenele uşoare umane sunt clasificate în kappa (κ) şi lambda (λ). Catenele grele sunt clasificate: mu, delta, gamma, alfa sau epsilon, şi definesc izotipul anticorpului ca IgM, IgD, IgG, IgA şi IgE, respectiv. Fiecare catenă grea cuprinde o regiune variabilă a catenei grele (abreviată aici ca HCVR sau VH) şi o regiune constantă a catenei grele. Regiunile constante ale catenei grele din IgD, IgG şi IgA sunt constituite din trei domenii - CH1, CH2 şi CH3, iar regiunile constante ale catenei grele din IgM şi IgE sunt constituite din patru domenii - CH1, CH2, CH3 şi CH4. Fiecare catenă uşoară este constituită dintr-o regiune variabilă a catenei uşoare (abreviată aici ca LCVR sau VL) şi o regiune constantă a catenei uşoare. Regiunea constantă a catenei uşoare cuprinde un domeniu - CL. Regiunile constante ale anticorpilor pot media legarea imunoglobulinei la ţesuturile sau factorii gazdă, incluzând diferite celule ale sistemului imun (de exemplu, celulele efectoare). Regiunile VH şi VL pot fi subdivizate în continuare în regiuni de hipervariabilitate, definite ca regiuni de determinare a complementarităţii (CDR), intercalate cu regiuni care sunt mai conservate, denumite regiuni suport (FR). Fiecare regiune VH şi VL este compusă din trei CDR şi patru FR, aranjate de la capătul amino-terminal până la capătul carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiunile variabile ale fiecărei perechi de catene grele/uşoare (VH şi VL), respectiv, formează situsul de legare a anticorpului. Distribuirea de aminoacizi pentru fiecare regiune sau domeniu este în conformitate cu definiţiile din Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nationals Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 şi 1991)) sau în conformitate cu definiţiile Chothia et al. (Chothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions). Termenul "anticorp" cuprinde un anticorp care este o formă multimerică de anticorpi, cum ar fi dimerii, trimerii sau multimerii de ordin superior ai anticorpilor monomerici. Acesta cuprinde, de asemenea, un anticorp care este legat sau ataşat la un fragment care nu este anticorp. În plus, termenul "anticorp " nu este limitat de nici o metodă specială de producere a anticorpului. De exemplu, acesta include anticorpi monoclonali, anticorpi recombinanţi şi anticorpi policlonali.

Termenul "derivat de anticorp" sau "derivat" al unui anticorp se referă la o moleculă care este capabilă să se lege la acelaşi antigen (de exemplu, CD134 uman), la care se leagă anticorpul, şi care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a anticorpului, corelată cu o structură moleculară suplimentară. Secvenţa de aminoacizi a anticorpului, care se conţine în derivatul de anticorp, poate fi un anticorp cu o lungime completă, sau poate fi orice porţiune sau porţiuni de anticorp cu o lungime completă. Structura moleculară suplimentară poate fi o moleculă biologică sau chimică. Exemplele de entităţi moleculare suplimentare includ grupe chimice, peptide, proteine (cum ar fi enzime, anticorpi), aminoacizi şi compuşi chimici. Structura moleculară suplimentară poate fi utilizată ca un agent de detecţie, semn de marcaj, agent terapeutic sau farmaceutic. Secvenţa de aminoacizi a unui anticorp poate fi ataşată sau legată de structura suplimentară prin asociere necovalentă, cuplare chimică, fuziune genetică, sau într-un alt mod. Termenul "derivat de anticorp" cuprinde, de asemenea, anticorpi himerici, anticorpi umanizaţi şi molecule derivate din modificările secvenţelor de aminoacizi ale unui anticorp CD134, cum ar fi substituţiile, inserţiile şi adiţiile de aminoacizi pentru conservare.

Termenul "fragment de legare a antigenului" al unui anticorp se referă la una sau mai multe porţiuni ale unui anticorp cu o lungime completă, care păstrează capacitatea de a se lega la acelaşi antigen (de exemplu, CD134 uman), la care se leagă anticorpul. Termenul "fragment de legare a antigenului" cuprinde, de asemenea, o porţiune dintr-un anticorp, care face parte dintr-o moleculă mai mare, formată prin asociere necovalentă sau covalentă, sau dintr-o porţiune de anticorp cu una sau mai multe structuri moleculare. Exemplele de structuri moleculare suplimentare includ aminoacizi, peptide sau proteine, cum ar fi regiunea nucleului streptavidinei, care poate fi utilizată pentru a produce o moleculă tetramerică scFv (Tregs, Quezda et al. Immunol. Rev., 2011, 241, p. 104-118).

Termenul "anticorp himeric" se referă la un anticorp care cuprinde secvenţe de aminoacizi, derivate de la doi sau mai mulţi anticorpi diferiţi. Cei doi sau mai mulţi anticorpi diferiţi pot fi de aceeaşi specie, sau din două, sau din mai multe specii diferite.

Termenul "epitop" se referă la acea parte a unui antigen, care este capabilă de legare la un anticorp specific sau la receptorul celulei T, sau de un alt fel de interacţiune cu o moleculă. "Epitopul" este, de asemenea, menţionat în domeniu ca "determinant antigenic". Un epitop constă, în general, din grupe de suprafaţă chimic active ale moleculelor, cum ar fi aminoacizii, glucidele sau catenele laterale de glucoză. Un epitop poate fi "liniar" sau "neliniar/conformaţional". Odată ce epitopul dezirabil este determinat (de exemplu, prin cartografierea epitopului), la acest epitop pot fi generaţi anticorpi. Generarea şi caracterizarea anticorpilor poate furniza, de asemenea, informaţii despre epitopii dezirabili. Pe baza acestor informaţii, este posibil screening-ul anticorpilor pentru cei care se leagă la acelaşi epitop, de exemplu, prin efectuarea de studii competiţionale încrucişate pentru a găsi anticorpi care se leagă în mod competitiv unul cu altul, de exemplu, anticorpii concurează pentru legarea la antigen.

Termenul "celulă gazdă" se referă la o celulă, în care a fost introdus un vector de expresie. Termenul cuprinde nu doar celula subiectului respectiv, ci şi descendentul unei astfel de celule. Deoarece pot apărea anumite modificări în generaţiile succesive, determinate fie de influenţele mediului sau de mutaţii, un astfel de descendent poate să nu fie identic cu celula-mamă, dar este încă inclus în limitele termenului "celulă gazdă".

Termenul "anticorp uman" se referă la un anticorp care constă din secvenţe de aminoacizi doar din secvenţe de imunoglobulină umană. Un anticorp uman poate conţine lanţuri de hidrocarburi murine, în cazul în care este produs la şoareci, într-o celulă de şoarece sau într-un hibridom derivat dintr-o celulă de şoarece. Anticorpii umani pot fi produşi printr-o varietate de metode cunoscute în domeniu.

Termenul "anticorp umanizat" se referă la un anticorp himeric, care conţine resturi de aminoacizi, derivate de la secvenţe de anticorp uman. Un anticorp umanizat poate cuprinde o parte sau toate regiunile CDR de la un anticorp animal non-uman, în timp ce regiunile suport şi regiunile constante ale anticorpului conţin resturi de aminoacizi, derivate de la secvenţe de anticorp uman.

Termenul "mamifer" se referă la orice specie de animale din clasa Mamiferelor. Exemple de mamifere sunt: oamenii; animalele de laborator, cum ar fi şobolanii, şoarecii, maimuţele şi cobaii; animalele domestice, cum ar fi iepurii, vitele, oile, caprele, pisicile, câinii, caii, porcii şi altele similare.

Termenul "acid nucleic izolat" se referă la o moleculă de acid nucleic de origine genomică, ADNc sau sintetică, sau o combinaţie a acestora, care este separată de alte molecule de acid nucleic, prezente în sursa naturală de acid nucleic. De preferinţă, un acid nucleic "izolat" este lipsit de secvenţele localizate la capetele 5' şi 3' ale acidului nucleic de interes în ADN genomic al organismului, de la care derivă acidul nucleic.

Termenul "constantă de disociere" sau "Kd" se referă la constanta de disociere a echilibrului unei interacţiuni anumite anticorp-antigen şi este folosit pentru a descrie afinitatea de legare dintre un ligand (cum ar fi un anticorp) şi o proteină (cum ar fi CD134). Cu cât este mai mică constanta de disociere a echilibrului, cu atât este mai strâns legat ligandul, sau cu atât mai mare este afinitatea dintre ligand şi proteină. Kd poate fi măsurată prin rezonanţa plasmonică de suprafaţă, de exemplu folosind sistemul BIACORE 1 sau Octet. Termenul "anticorp anti-CD134" se referă la un anticorp, aşa cum este definit aici, capabil de legare la CD134 uman.

Termenii "receptorul OX40" şi "receptorul CD134" sunt folosiţi alternativ în prezenta invenţie şi includ CD134 uman, precum şi variantele, izoformele, şi speciile omoloage acestuia. Corespunzător, moleculele umane de adeziune, descrise aici, pot să se lege, de asemenea, în anumite cazuri, la CD134 de la alte specii decât cea umană. În alte cazuri, moleculele de adeziune pot fi complet specifice pentru CD134 uman şi pot să nu prezinte specii sau alte tipuri de reactivitate încrucişată. În special, ele nu se vor lega la CD134 de şoarece sau de şobolan.

Termenul "se leagă în mod specific la CD134 uman" înseamnă că Kd a unei molecule de adeziune pentru legarea la CD134 uman, este, de preferinţă, mai mare de 10 ori, de 50 ori sau, cel mai preferabil, mai mare de 100 de ori decât Kd pentru legarea sa, de exemplu, la CD40 uman, aşa cum este determinat utilizând un test descris aici sau cunoscut de o persoană de specialitate în domeniu (de exemplu, testul BIAcore).

Determinarea legării specifice a unui anumit agent la receptorul OX40 poate fi alternativ realizată cu uşurinţă prin utilizarea sau adaptarea metodelor de rutină. Un test corespunzător in vitro se utilizează în metoda Western blot (descrisă în numeroase publicaţii de specialitate, de exemplu, (Sugamura K., Ishii N., Weinberg A. Therapeutic targeting of the effector T- cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev. Imm. 2004, 4, p. 420-431). Pentru a determina dacă un agent de legare pentru receptorul OX40 se leagă specific la proteina umană OX40, este extrasă proteina celulară totală din celulele de mamifere, care nu exprimă antigenul OX40, cum ar fi celula nelimfocitară (de exemplu, o celulă COS sau o celulă CHO), transformată cu o moleculă de acid nucleic, care codifică OX40. În calitate de control negativ, proteina celulară totală este, de asemenea, extrasă din celulele corespunzătoare netransformate. Aceste preparate de proteine sunt apoi supuse electroforezei pe un gel de poliacrilamidă fără denaturare sau cu denaturare (PAGE). Ulterior, proteinele sunt transferate pe o membrană (de exemplu, nitroceluloză) prin Western blot şi agentul de testat este incubat cu membrana. După spălarea membranei pentru a elimina agentul legat nespecific, prezenţa agentului legat este detectată prin utilizarea unui anticorp produs împotriva agentului testat, conjugat cu un agent de detectare, cum ar fi enzima fosfataza alcalină; aplicarea substratului de 5-brom-4-clor-3-indolilfosfat/nitrotetrazoliu albastru are drept rezultat producerea unui compus dens albastru de către fosfataza alcalină imuno - localizată. Agenţii care se leagă specific la OX40 uman vor fi demonstraţi, prin această tehnică, să se lege la banda OX40 umană (care va fi localizată într-o anumită poziţie pe gel, determinată de masa sa moleculară) în extractul de celule transformate OX40, în timp ce, în extractul de celule netransformate, va fi observată o legare nesemnificativă sau va lipsi orice legare. Legarea nespecifică a agentului la alte proteine poate să apară şi poate fi detectă ca un semnal slab pe Western blot. Natura nespecifică a acestei legări va fi recunoscută de către un specialist în domeniu prin semnalul slab remarcat în Western blot, comparativ cu semnalul primar puternic, care rezultă din legarea agentului specific/proteina umană OX40. În mod ideal, un agent de legare a receptorului OX40 nu se va lega la proteinele extrase din celulele netransformate. Suplimentar la testele de legare cu utilizarea proteinelor extrase, agenţii presupuşi de legare a receptorului OX40 pot fi testaţi pentru a confirma capacitatea lor de a lega în mod substanţial numai receptorul OX40 in vivo prin conjugarea agentului la un marcaj fluorescent (cum ar fi FITC) şi analiza legării sale de populaţiile de celule T CD4+ antigen activate şi neactivate prin Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Un agent care leagă în mod substanţial numai receptorul OX40 va colora doar celulele T CD4+ activate.

Termenul "vector" se referă la o moleculă de acid nucleic, capabilă să transporte o altă moleculă de acid nucleic într-o celulă gazdă. Exemplele de vectori includ plasmide, vectori virali, cosmide sau vectori fagi şi vectori liberi de expresie a ADN sau ARN. Unii vectori sunt capabili de replicare autonomă în celula gazdă, în care aceştia au fost introduşi. Unii vectori pot fi integraţi în genomul unei celule gazdă la introducerea în celula gazdă, şi, astfel, sunt reproduşi împreună cu genomul gazdă. Alţi vectori sunt capabili să dirijeze expresia genelor la care sunt legaţi operaţional, şi, prin urmare, pot fi menţionaţi ca "vectori de expresie".

În prezenta invenţie cei douăzeci de aminoacizi convenţionali şi abrevierile acestora sunt conforme definiţiilor uzuale.

Prezenta invenţie se referă la molecule de adeziune izolate, care se leagă la CD134 uman, inclusiv anticorpii anti-CD134, fragmente de legare la antigen ale anticorpilor anti-CD134, şi derivaţi ai anticorpilor anti-CD134. Moleculele de adeziune sunt caracterizate prin cel puţin una dintre următoarele proprietăţi funcţionale: (a) se leagă la CD134 uman cu o Kd de 1 x 10-6 M sau mai puţin şi (b) nu împiedică legarea receptorului CD134 uman (OX40) de ligandul OX40 (OX40L); (c) posedă activitate agonistă asupra CD134 uman pe celulele T efectoare şi/sau activitate antagonistă pe CD134 uman pe celulele T-reglatoare; (d) nu se leagă de receptorul CD40 la concentraţii de până la 500 nM; (e) nu se leagă de receptorul CD137 la concentraţii de până la 500 nM; (f) nu se leagă de receptorul CD271 la concentraţii de până la 500 nM; (g) sunt capabile de creştere a producţiei de IL-2 de către celulele T umane izolate; (h) sunt capabile de stimularea răspunsului imun; (i) sunt capabile să inhibe creşterea celulelor tumorale; şi (j) au un efect terapeutic în cazul cancerului. În unele variante, molecula de adeziune se leagă la CD134 uman cu o Kd de 1x10-7 M sau mai puţin, sau 1x10-8 M ori mai puţin, sau 5x1x 10- 9 M, ori mai puţin.

Anticorpii şi alte molecule de adeziune ale invenţiei pot fi produse prin metode uzuale şi apoi analizate pentru a identifica şi pentru a obţine molecule de adeziune, care nu împiedică legarea OX40L la CD134. De exemplu, pot fi selectate molecule de adeziune, care se leagă la CD134 chiar şi atunci când CD134 a fost expus la o concentraţie de saturaţie de OX40L.

Într-o variantă de realizare a prezentei invenţii este prezentat un anticorp uman care se leagă la CD134 uman. În unele variante, anticorpul uman este un anticorp monoclonal, care se leagă specific la CD134 uman cu o Kd de 100 nM sau mai puţin, preferabil de 10 nM sau mai puţin, şi/sau are activitate agonistă pe CD134 uman al celulelor T-efectoare şi/sau activitate antagonistă pe CD134 uman al celulelor T-reglatoare. Un exemplu de astfel de anticorp uman este clona 20E5 a anticorpului monoclonal uman. Secvenţa de aminoacizi a întregii regiuni variabile a catenei grele şi secvenţele de aminoacizi ale celor trei CDR ale regiunii variabile a catenei grele (VH) din clona 20E5 a anticorpului sunt prezentate în SEQ ID NO 4 şi 6…8, respectiv. Secvenţa de aminoacizi a întregii regiuni variabile a catenei uşoare şi secvenţele de aminoacizi ale celor trei CDR ale regiunii variabile a catenei uşoare (VL) din clona 20E5 a anticorpului sunt prezentate în SEQ ID NO 5 şi 9…11, respectiv.

Anticorpii din prezenta invenţie cuprind una sau mai multe dintre aceste regiuni CDR, sau una ori mai multe dintre aceste CDR cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi pe o regiune CDR. Substituţiile sunt de preferinţă cele "conservative". Substituţiile conservative, care produc aminoacizi similari din punct de vedere funcţional, sunt bine cunoscute în domeniu (Ramstad et al. Am. J. Surg. 2000, 179, p. 400-406).

Moleculele care conţin doar una sau două regiuni CDR (în unele cazuri, chiar şi numai o singură regiune CDR sau o parte a acesteia, în special CDR3) sunt capabile să reţină activitatea de legare la antigen a anticorpului din care sunt derivate CDR. (Vetto et al. Am. J. Surg. 1997, 174, p. 258-265; Sugamura et al. Nature Rev. Imm. 2004, 4, p. 420-431; WO 99/42585; Al-Shamkhani et al. Eur. J. Chem. 1996, 26, p. 1695-1699; Hirschhorn-Cymerman et al. J. Exp. Med. 2009, 206, p. 1103-1116; US 2009/0214560 A1; Morris et al. Mol. Immunol. 2007, 44, p. 3,112-3,121; Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683; Soroosh et al. 2006; Kim et al. 2003; Linton et al. 2003).

Într-o altă variantă, conform invenţiei, este prevăzută o moleculă izolată de adeziune CD134, care cuprinde: (a) o regiune variablă a catenei grele, care conţine secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 4; (b) o regiune variabilă a catenei uşoare, care conţine secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 5.

Într-un alt exemplu de realizare, conform invenţiei, este prevăzută o moleculă izolată de adeziune CD134, care cuprinde: (a) o catenă grea CDR1, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 6; şi/sau (b) o catenă grea CDR2, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 7; şi/sau (c) o catenă grea CDR3, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 8.

Într-un alt exemplu de realizare, conform invenţiei, este prevăzută o moleculă izolată de adeziune CD134, care cuprinde: (a) o catenă uşoară CDR1, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 9; şi/sau (b) o catenă uşoară CDR2, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 10; şi/sau (c) o catenă uşoară CDR3, ce cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 11.

Clasa (de exemplu, IgG, IgM, IgE, IgA sau IgD) şi subclasa (de exemplu, lgG1, lgG2, lgG3 sau lgG4) anticorpilor anti-CD134 poate fi determinată prin orice metodă potrivită, cum ar fi prin ELISA sau Western Blot, precum şi prin alte tehnici. În mod alternativ, clasa şi subclasa pot fi determinate prin secvenţierea tuturor sau a unei părţi dintre domeniile constante ale catenelor grele şi/sau uşoare ale anticorpilor, comparând secvenţele lor de aminoacizi cu secvenţele cunoscute de aminoacizi din diferite clase şi diferite subclase de imunoglobuline, şi determinând clasa şi subclasa anticorpilor. Anticorpii anti-CD134 pot fi molecule de IgG, IgM, IgE, IgA sau IgD. De exemplu, anticorpul anti-CD134 poate fi o IgG, care este din subclasa IgG1, lgG2, lgG3 sau IgG4. Astfel, un alt aspect al invenţiei propune o metodă pentru transformarea clasei sau subclasei unui anticorp anti-CD134 într-o altă clasă sau subclasă.

Moleculele de adeziune, în conformitate cu o variantă de realizare a invenţiei, includ anticorpi monoclonali, fragmente ale acestora, peptide şi alte structuri chimice. Anticorpii monoclonali pot fi creaţi prin metoda convenţională de imunizare a unui mamifer, urmată de izolarea celulelor B plasmatice, care produc anticorpii monoclonali de interes si fuziunea cu o celulă de mielom.

În diverse variante, în loc să fie un anticorp real, fragmentul de legare poate mima un anticorp (de exemplu, pe bază de schelet neanticorp), un aptamer ARN, o moleculă mică sau un CovX-corp.

Se va aprecia că mimeticele anticorpilor (de exemplu, structuri de schelet neanticorp, care au un grad înalt de stabilitate şi, totuşi, permit introducerea variabilităţii în anumite poziţii) pot fi utilizate pentru a crea biblioteci moleculare, din care pot fi derivate aceste resturi de legare. Specialiştii în domeniul biochimiei vor cunoaşte mai multe de astfel de molecule. Aceste molecule pot fi utilizate ca fragment de legare la agentul din prezenta invenţie.

Sunt discutate numeroase exemplele de mimetice ale anticorpilor şi includ: afficorpi (de asemenea numiţi Trinectine; (Kashiwakura et al. J. Immunol. 2004, 173, p. 5247-5257); CTLD (de asemenea numiţi Tetranectine; (Nakae et al. J. Immunol. 2006, 176, p. 2238-2248); adnectine (de asemenea numite monocorpi; (Imura et al. 1996); anticaline (Gri et al. 2008); DARPine (ankirine; (Piconese et al. 2009); avimeri (Piconese et al. J. Exp. Med. 2008, 205, p. 825-839); microcorpi (Pandiyan et al., Nat Immunol 2007, 8, p. 1353); aptameri peptidici (Scheffold et al., Nat Immunol 2007, 8, p. 1285-1287); domenii Kunitz (Vercoulen et al. Plos ONE 2009 4 e7183); affiline (Chothia et al.,. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (Nature 1989, 342 (6252), p. 877-83)).

Prin urmare, este de preferat ca anticorpul mimic să fie selectat din grupa ce cuprinde sau constă din: afficorpi, tetranectine (CTLD), adnectine (monocorpi), anticaline, DARPine (ankirine), avimeri, iMab, microcorpi, aptameri peptidici, domenii Kunitz, aptameri şi affiline.

Prin "moleculă mică" se defineşte un compus organic cu o greutate moleculară mică de 900 de Daltoni sau mai puţin. Deşi biopolimerii mari, cum ar fi acizii nucleici, proteinele şi polizaharidele (cum ar fi amidonul sau celuloza) nu sunt incluse ca "molecule mici", sunt incluşi monomerii constitutivi ai acestora (ribo- sau dezoxiribonucleotidele, aminoacizii şi monozaharidele, respectiv) şi oligomerii (adică polimerii scurţi, cum ar fi dinucleotidele, peptidele, cum ar fi glutationul antioxidant, şi dizaharidele, cum ar fi zaharoza). Producerea de molecule mici este descrisă în literatura de specialitate (Kipriyanov et al. Hum Antibodies Hybridomas. 1995, 6 (3), p. 93-101; "Antibodies, A Laboratory manual" by Harlow and Lane).

CovX-Corpii sunt creaţi prin legare covalentă a unui farmacofor printr-o legătură cu situsul de legare al unui anticorp special proiectat, reprogramând eficient anticorpul (WO 2010/019702). Rezultatul este o nouă clasă de structuri chimice, care se formează, în care fiecare component contribuie cu trăsături dorite la CovX-Corpul intact - în special, structura posedă acţiunile biologice ale peptidei şi timpul prelungit de înjumătăţire al anticorpului.

Anticorpii umani pot fi obţinuţi prin mai multe metode diferite, inclusiv prin utilizarea bibliotecilor de expresie a imunoglobulinelor umane (Laune et al. JBC. 1997, 272, p. 30937-44; Monnet et al. JBC. 1999, 274, p. 3789-96) pentru a produce fragmente de anticorpi umani (VH, VL, Fv , Fd, Fab, sau (Fab')2), şi de a utiliza aceste fragmente pentru a construi anticorpi umani întregi prin fuziunea porţiunii respective în acest sens, folosind tehnici similare cu cele pentru producerea de anticorpi himerici. Anticorpii umani pot fi de asemenea produşi la şoarecii transgenici cu un genom de imunoglobulină umană. Astfel de şoareci sunt disponibili, de exemplu, de la Abgenix, Inc., Fremont, California, şi Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Pe lângă conectarea regiunilor Fv ale catenei grele şi ale celei uşoare pentru a forma un singur lanţ peptidic, Fab pot fi construite şi exprimate prin tehnici similare (Qiu et al. Nature Biotechnology. 2007, 25, p. 921-9).

Anticorpii DelmmunizedTM reprezintă anticorpi, la care au fost eliminaţi epitopii celulelor T potenţial imunogene (Ladner et al. Nature Biotechnology. 2007,25, p. 875-7). Prin urmare, se aşteaptă că imunogenitatea la oameni va fi eliminată sau redusă substanţial, atunci când aceştia vor fi aplicaţi in vivo. Moleculele de adeziune, conform invenţiei, pe bază de imunoglobuline, pot avea epitopii lor imunogeni T celulari (dacă sunt prezenţi), eliminaţi prin astfel de metode.

Toţi anticorpii în întregime şi parţial umani, descrişi mai sus, sunt mai puţin imunogeni decât anticorpii integral murini sau non-uman-derivaţi, cum sunt fragmentele şi anticorpii cu o singură catenă. Este mai puţin probabil, prin urmare, ca toate aceste molecule (sau derivaţi ai acestora) să evoce un răspuns imun sau alergic. Ca rezultat, ele sunt mai potrivite pentru administrarea in vivo la oameni decât anticorpii non-umani în totalitate, în special atunci când este necesară administrarea repetată sau pe termen lung.

Anticorpii bispecifici pot fi utilizaţi în calitate de agenţi de legare încrucişată între CD134 umani din aceeaşi celulă ţintă umană, sau CD134 umani de pe două celule ţintă umane diferite. Astfel de anticorpi bispecifici au o specificitate pentru fiecare din cei doi epitopi diferiţi de pe CD134 uman. Aceşti anticorpi şi metoda de producere a lor sunt descrise în literatura brevetară (Heap et al. J. Gen. Virol. 2005, 86, p. 1791-1800) (Creative Biomolecules, Inc). Diferite variante de anticorpi bispecifici, descrise în brevet, includ legarea lanţului unic Fv cu cuplatorii de peptide, incluzând Ser-Cys, (Gly)4-Cys, (His)6-(Gly)4-Cys, agenţi de chelatizare, şi cuplaje chimice sau disulfidice, inclusiv bismaleimidohexan şi bismaleimidocaproil.

Moleculele non-anticorpi pot fi izolate sau sortate de bibliotecile chimice prin metode uzuale. Un sistem automat pentru formarea şi analiza unei biblioteci chimice este deja descris (Nicaise et al. Protein Science. 2004, 13, p. 1882-91; Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Thoughput Screening. 2001, 4, p. 417-430). O abordare mai concentrată implică modelarea tridimensională a situsului de legare, şi, ulterior, producerea unei familii de molecule care se potrivesc modelului. Acestea sunt apoi sortate pentru identificarea celor cu caracteristici optime de legare.

O altă abordare ar consta în formarea bibliotecilor de peptide recombinante şi, ulterior, analiza acestora pentru a identifica peptidele care se leagă la epitopul CD134 uman, ce prezintă interes (Quiocho Nature. 1993, 362, p. 293-4). Acest epitop este acelaşi cu cel legat de anticorpii monoclonali, descrişi în exemplele în continuare. Moleculele pot, de fapt, să fie generate sau izolate cu o facilitate relativă în conformitate cu metodeşe bine cunoscute din domeniu, odată ce epitopul este cunoscut.

O altă variantă de realizare prevede derivaţii oricăruia dintre anticorpii anti-CD134, aşa cum este descris mai sus. Într-un aspect particular, derivatul anticorpului îşi are originea din modificările secvenţelor de aminoacizi ale clonei 20E5. Secvenţele de aminoacizi din oricare regiuni ale lanţurilor de anticorpi pot fi modificate, cum ar fi regiunile suport, regiunile CDR sau regiunile constante. Modificările pot fi introduse prin metode standard cunoscute în domeniu, cum ar fi mutageneza direcţionată pe situs şi mutageneza aleatorie, mediată de PCR, şi pot cuprinde aminoacizi naturali, precum şi nenaturali. Tipurile de modificări includ inserţiile, deleţiile, substituţiile sau combinaţii ale acestora, ale unuia sau mai multor aminoacizi dintr-un anticorp anti-CD134. În unele variante, derivatul anticorpului cuprinde 1, 2, 3 sau 4 substituţii de aminoacizi în regiunile CDR ale catenelor grele şi/sau o substituţie de aminoacid în regiunile CDR ale catenei uşoare. În unele variante aplicate, un derivat al unui anticorp anti-CD134 cuprinde una sau mai multe substituţii de aminoacizi în raport cu secvenţa de aminoacizi a liniei germinale din gena umană. Într-o variantă particulară, una sau mai multe dintre aceste substituţii ale liniei germinale se află în regiunea CDR2 a catenei grele. Într-un alt model particular de realizare, substituţiile de aminoacizi în raport cu linia germinală se află în una sau mai multe dintre aceleaşi poziţii, ca şi substituţiile în raport cu linia germinală din clona 20E5. Într-o altă variantă de realizare, substituţia de aminoacizi va modifica una sau mai multe cisteine dintr-un anticorp la un alt rest, cum ar fi, fără limitare, alanina sau serina. Cisteina poate fi o cisteină canonică sau una necanonică. Substituţia poate fi făcută într-o regiune CDR sau într-o regiune suport a unui domeniu variabil, sau în domeniul constant al unui anticorp. Un alt tip de substituţie aminoacidică va elimina perechile asparagină-glicină, care formează situsuri potenţiale de dezaminare, prin modificarea unuia sau a ambelor resturi. În alte variante, substituţia aminoacidului este o substituţie conservativă de aminoacid. Într-o variantă de realizare, derivatul anticorpului are 1, 2, 3 sau 4 substituţii conservative de aminoacizi în regiunile CDR ale catenei grele în raport cu secvenţele de aminoacizi ale clonei 20E5. Un alt tip de modificare a unui anticorp anti-CD134 este modificarea modelului iniţial de glicozilare a anticorpului. Termenul de "modificare" se referă la eliminarea uneia sau mai multor părţi de carbohidrat, găsite în anticorp, si/sau adiţia unuia sau mai multor situsuri de glicozilare, care nu sunt prezente în anticorp.

Glicozilarea anticorpilor este, de obicei, N-legată. N-legat se referă la ataşarea fragmentului carbohidrat la catena laterală a unui rest de asparagină. Exemplele de alte modificări includ acilarea, amidarea, acetilarea, legarea încrucişată, ciclizarea, formilarea, hidroxilarea, iodurarea, metilarea, miristoilarea, formarea legăturilor disulfidice, demetilarea, formarea de legături încrucişate covalente, formarea de cisteină, oxidarea, fosforilarea, prenilarea, pegilarea, procesarea proteolitică şi sulfatarea.

O altă variantă de realizare propune un derivat de anticorp, care cuprinde un anticorp anti-CD134, sau fragmentul de legare a antigenului acestuia, aşa cum este descris aici, legat la o structură moleculară suplimentară. Exemplele de structuri moleculare suplimentare includ agenţi farmaceutici, peptide sau proteine, şi agenţi de detectare sau de marcaj. Exemplele specifice de agenţi farmaceutici, care pot fi legaţi la un anticorp anti-CD134, includ agenţi citotoxici sau alţi agenţi anticanceroşi şi izotopi radioactivi. Exemplele specifice de peptide sau proteine care pot fi legate la un anticorp anti-CD134 includ anticorpi, care pot fi reprezentaţi de acelaşi anticorp anti-CD134 sau de un anticorp diferit. Exemplele specifice de agenţi de detectare sau marcaj, care pot fi legaţi de un anticorp anti-CD134 includ: (1) compuşi fluorescenţi, cum ar fi fluoresceina, izotiocianatul de fluoresceină, ficoeritrina, rodamina, 5-dimetilamina-l-naftalensulfonil clorura şi fosfor lantanidele; (2) enzime, cum ar fi peroxidaza extrasă din hrean, fosfataza alcalină, luciferaza, şi glucozooxidaza; (3) biotina; (4) un epitop polipeptidic predeterminat, recunoscut de un reporter secundar, cum ar fi secvenţele de perechi fermoar de leucină, domeniile de legare a metalelor, vârfuri de epitopi şi situsuri de legare pentru anticorpi secundari. O altă variantă de realizare propune un derivat de anticorp, care este o formă multimerică a unui anticorp anti-CD134, cum ar fi dimeri, trimeri de anticorpi sau multimeri de ordin superior ai anticorpilor monomerici. Monomerii individuali din cadrul unui multimer de anticorp pot fi identici sau diferiţi, adică, ei pot fi multimeri heteromerici sau homomerici de anticorpi. Multimerizarea anticorpilor poate fi realizată prin agregare naturală. De exemplu, un anumit procentaj de preparate purificate de anticorpi (de exemplu, molecule IgG1 purificate) formează spontan agregate de proteine, care conţin homodimeri de anticorpi şi alţi multimeri de anticorpi de ordin superior. Alternativ, homodimerii de anticorp pot fi formaţi prin metode de legare chimică, cunoscute în domeniu. Agenţii de reticulare corespunzători includ pe cei care sunt heterobifuncţionali, cum ar fi esterul m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidă, N-succinimidil-S-acetiltio-acetat şi succinimidil 4 - (maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilat) sau homobifuncţionali (cum ar fi disuccinimidil suberatul). Astfel de linkeri sunt accesibili comercial. Anticorpii pot fi, de asemenea, multimerizaţi prin metode de ADN recombinant, cunoscute în domeniu.

O altă variantă de realizare propune un derivat de anticorp, care este un anticorp himeric, cuprinzând o secvenţă de aminoacizi a unui anticorp anti-CD134 uman, descris aici mai sus. Într-un alt exemplu, toate regiunile CDR ale anticorpului himeric sunt derivate de la anticorpi anti-CD134 uman. Într-un alt exemplu, CDR de la mai mult de un anticorp CD134 anti-uman sunt combinate într-un anticorp himeric. Mai mult, un anticorp himeric poate cuprinde regiunile suport, derivate de la un anticorp anti-CD134 uman, şi una sau mai multe regiuni CDR de la unul sau mai mulţi anticorpi umani diferiţi. Anticorpii himerici pot fi generaţi, folosind metode convenţionale, cunoscute în domeniu. În unele variante particulare, anticorpul himeric cuprinde una, două sau trei regiuni CDR din regiunea variabilă a catenei grele sau din regiunea variabilă a catenei uşoare a unui anticorp selectat din clona 20E5 a anticorpului.

Exemplele de alţi derivaţi de anticorpi, propuse de prezenta invenţie, includ anticorpii cu un singur lanţ, diacorpii, anticorpii de domeniu, nanocorpii şi unicorpii. În variantele de preferat, anticorpii monoclonali pot fi anticorpi himerici, anticorpi umanizaţi, anticorpi umani, anticorpi DelmmunizedTM, anticorpi cu un singur lanţ, fragmente, inclusiv Fab, F(ab')2, Fv sau alte fragmente care păstrează funcţia de legare la antigen a anticorpului sursă. Anticorpii cu un singur lanţ ("ScFv") şi metoda de construcţie este cunoscută (Pessi et al. Nature .1993, 362, p. 367-9).

Un "anticorp cu un singur lanţ" (scFv) constă dintr-un singur lanţ polipeptidic, care cuprinde un domeniu VL legat de un domeniu VH, unde domeniul VL şi VH sunt împerecheate pentru a forma o moleculă monovalentă. Anticorpii cu un singur lanţ pot fi produşi în conformitate cu metoda cunoscută în domeniu (Bianchi et al. J. Mol. Biol. 1994, 236, p. 649-59; Gao et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, p. 32389-93). Un "diacorp" constă din două lanţuri, fiecare lanţ cuprinzând o regiune variabilă a catenei grele, conectată la o regiune variabilă a catenei uşoare pe acelaşi lanţ polipeptidic, cuplat printr-o peptidă scurtă de legătură, în care cele două regiuni de pe acelaşi lanţ nu se cuplează una cu alta, dar cu domenii complementare de pe celălalt lanţ, pentru a forma o moleculă bispecifică. Metodele de preparare a diacorpilor sunt cunoscute în domeniu (Nygren. 2008, FEBS J, 275, p. 2668-2676; Innovations Pharmac. Technol. 2006, p. 27-30). Anticorpii de domeniu (dAc) sunt unităţi funcţionale mici de legare a anticorpilor, care corespund regiunilor variabile ale catenelor grele sau uşoare ale anticorpilor. Anticorpii de domeniu sunt bine exprimaţi în sistemele de celule ale bacteriilor, drojdiilor şi mamiferelor. Detaliile suplimentare despre anticorpii de domeniu şi metodele de producere ale acestora sunt cunoscute în domeniu (Meth. Mol. Biol., 352, 2007, p. 95-109; Drug Discovery Today, 2005, 10, p. 23-33; Nat. Biotechnol. 2004, 22, p. 575-582; Nat. Biotechnol. 2005, 23, p. 1556-1561; FEBS J. 2007, 274, p. 86-95). Nanocorpii îşi au originea din catenele grele ale unui anticorp. Un nanocorp cuprinde în mod tipic un singur domeniu variabil şi două domenii constante (CH2 şi CH3), şi păstrează capacitatea de legare a antigenului de la anticorpul original. Nanocorpii pot fi produşi prin metode cunoscute în domeniu (Expert. Opin. Biol. Ther. 2005, 5, p. 783-797; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006, 318, p. 803-809; Trends. Biotechnol. 2005, 23, p. 514-522). Unicorpii sunt alcătuiţi dintr-o catenă uşoară şi o catenă grea al unui anticorp IgG4. Unicorpii pot fi creaţi prin înlăturarea regiunii balama a anticorpilor lgG4. Detalii suplimentare despre unicorpi şi metodele de preparare sunt prezentate în literatura brevetară (Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57, p. 1742-78).

Suplimentar la fragmentul de legare, moleculele din invenţie mai pot conţine un rest pentru creşterea timpului de înjumătăţire in vivo al moleculei, cum ar fi, dar nu numai, cel de polietilenglicol (PEG), albumină serică umană, grupurile de glicozilare, acizii graşi şi dextranul. Astfel de fragmente suplimentare pot fi conjugate sau combinate în alt mod cu fragmentul de legare, folosind metode bine cunoscute în domeniu.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de acid nucleic, care codifică o secvenţă de aminoacizi a unei molecule de adeziune, ce leagă CD134, conform primului aspect al invenţiei. Secvenţa de aminoacizi, codificată de către molecula de acid nucleic, poate fi orice porţiune a unui anticorp intact, cum ar fi o regiune CDR, o secvenţă care cuprinde una, două sau trei regiuni CDR, sau o regiune variabilă a unui lanţ greu sau uşor, sau aceasta poate fi o catenă grea sau uşoară cu o lungime completă. În unele variante, molecula de acid nucleic codifică o secvenţă de aminoacizi, care cuprinde: (1) o regiune CDR3, în special o regiune CDR3 a unui lanţ greu al clonei 20E5 a anticorpului; (2) o regiune variabilă a unui lanţ greu sau o regiune variabilă a unui lanţ uşor de clonă 20E5 a anticorpului; sau (3) o catenă grea sau o catenă uşoară de clonă 20E5 a anticorpului. În alte variante, molecula de acid nucleic codifică o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi, selectată din grupul constând din SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sau 11.

Moleculele de acid nucleic, propuse în prezentare, pot fi obţinute din orice sursă, care produce un anticorp CD134, în conformitate cu invenţia. ARNm de la celulele producătoare de anticorpi anti-CD134 poate fi izolat prin tehnici standard, clonat şi/sau amplificat prin PCR şi tehnici de construcţie ale bibliotecilor chimice, şi sortat folosind protocoale standard pentru a obţine molecule de acid nucleic, care codifică o secvenţă de aminoacizi a unui anticorp anti-CD134. ARNm poate fi utilizat pentru a produce ADNc pentru utilizarea acestuia în reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) sau clonarea ADNc a genelor de anticorpi. Într-o variantă, molecula de acid nucleic este obţinută dintr-un hibridom care exprimă un anticorp anti-CD134, aşa cum este descris mai sus, de preferinţă, un hibridom care are ca unul dintre partenerii săi de fuziune o celulă non-umană de animal transgenic, care exprimă gene de imunoglobulină umană. Într-o altă variantă, hibridomul este derivat de la un animal non-transgenic, non-uman.

O moleculă de acid nucleic, care codifică lanţul greu al unui anticorp anti-CD134, poate fi construită prin fuzionarea unei molecule de acid nucleic, care codifică regiunea variabilă a catenei grele, cu o moleculă de acid nucleic, care codifică o regiune constantă a unui lanţ greu. În mod similar, o moleculă de acid nucleic, care codifică lanţul uşor al unui anticorp anti-CD134 poate fi construită prin fuzionarea unei molecule de acid nucleic, care codifică regiunea variabilă a catenei uşoare, cu o moleculă de acid nucleic, care codifică o regiune constantă a unui lanţ uşor. Moleculele de acid nucleic, care codifică lanţul VH şi VL, pot fi transformate în gene de anticorpi cu lungime completă prin inserarea acestora în vectori de expresie, care deja codifică regiunile constante ale catenei grele şi regiunile constante ale catenei uşoare, respectiv, astfel încât segmentul VH este legat operaţional la segmentul (-ele) regiunii constante a catenei grele (CH) din vector şi segmentul VL este legat operaţional la segmentul regiunii constante a catenei uşoare (CL) din vector. În mod alternativ, moleculele de acid nucleic, care codifică lanţurile VH sau VL, sunt transformate în gene de anticorpi cu lungime completă prin unirea, de exemplu, ligarea, moleculei de acid nucleic, care codifică un lanţ VH la o moleculă de acid nucleic, care codifică un lanţ CH, folosind tehnici standard de biologie moleculară. Acelaşi lucru se poate realiza folosind molecule de acid nucleic, care codifică lanţuri VL şi CL. Moleculele de acid nucleic, care codifică lanţurile grele şi/sau uşoare cu lungime completă, pot fi apoi exprimate dintr-o celulă în care au fost introduce, iar anticorpul anti-CD134 izolat.

Moleculele de acid nucleic pot fi folosite pentru expresia recombinantă a unei cantităţi mari de anticorpi anti-CD134, aşa cum este descris mai jos. Moleculele de acid nucleic pot fi, de asemenea, utilizate pentru a produce alte molecule de adeziune, propuse în prezentare, cum ar fi anticorpii himerici, anticorpii cu un singur lanţ, imunoadezinele, diacorpii, anticorpii mutanţi şi derivaţii de anticorpi, aşa cum este descris aici. Într-o variantă, o moleculă de acid nucleic este utilizată ca marker sau primer PCR pentru secvenţe specifice de anticorpi. De exemplu, o moleculă marker de acid nucleic poate fi utilizată în metode de diagnostic sau o moleculă PCR primer de acid nucleic poate fi utilizată pentru a amplifica regiuni ale ADN-ului, care ar putea fi utilizate, printre altele, pentru a izola secvenţe de acid nucleic pentru a fi folosite în producerea de regiuni variabile ale anticorpilor anti-CD134.

Odată ce sunt obţinute moleculele de ADN, care codifică segmentele VH şi VL ale unui anticorp anti-CD134, aceste molecule de ADN pot fi manipulate în continuare prin tehnici de ADN recombinant, de exemplu, pentru a transforma genele regiunii variabile în genele lanţului anticorpului cu lungime completă, în gene ale fragmentului Fab, sau într-o genă scFv.

Un alt aspect al invenţiei propune un vector, care cuprinde o moleculă de acid nucleic, descrisă aici mai sus. Molecula de acid nucleic poate codifica o porţiune dintr-o catenă uşoară sau dintr-o catenă grea(cum ar fi o regiune CDR sau o regiune variabilă), o catenă grea sau unul uşor cu lungime completă, o polipeptidă care cuprinde o porţiune sau lungimea completă a unui lanţ greu sau uşor, sau o secvenţă de aminoacizi a unui derivat de anticorp sau fragment de legare a antigenului.

Un exemplu de vector de expresie corespunzător este unul care codifică o secvenţă, completă din punct de vedere funcţional, de imunoglobulină CH sau CL umană, cu situsuri de restricţie corespunzătoare, proiectate astfel, încât orice secvenţă VH sau VL poate fi inserată şi exprimată. Vectorul de expresie, de asemenea, poate codifica o peptidă de semnalizare, care facilitează secreţia secvenţei de aminoacizi a lanţului anticorpului dintr-o celulă gazdă. ADN-ul care codifică secvenţa de aminoacizi a unui lanţ de anticorpi poate fi clonat în vector, astfel încât peptida de semnalizare este legată în cadru la capătul amino-terminal al secvenţei de aminoacizi din lanţul anticorpului. Peptida de semnalizare poate fi o peptidă de semnalizare imunoglobulinică sau o peptidă de semnalizare heteroloagă (adică, o peptidă de semnalizare dintr-o proteină neimunoglobulinică). Suplimentar la secvenţa de acid nucleic, care codifică o secvenţă de aminoacizi a unui anticorp anti-CD134 (genele lanţului anticorpului), vectorii de expresie poartă secvenţe reglatoare, care controlează expresia genelor lanţului anticorpului într-o celulă gazdă. Proiectarea vectorului de expresie, inclusiv selecţia secvenţelor reglatoare, poate depinde de astfel de factori, precum alegerea celulei gazdă care urmează să fie transformată, nivelul de expresie a proteinei dorite, şi aşa mai departe. Secvenţele reglatoare pentru expresia celulelor gazdă la mamifere includ elemente virale, care direcţionează nivelurile ridicate de expesie proteică în celulele de mamifere, cum ar fi promotorii şi/sau enhancerii derivaţi din LTR retrovirale, citomegalovirus (CMV) (cum ar fi promotorul/enhancerul CMV), Virusul Simian 40 (SV40) (cum ar fi promotorul/enhancerul SV40), adenovirus, (de exemplu, promotorul tardiv principal al adenovirusului (AdMLP)), promotorii de Poliomavirus şi cei puternici de mamifer, cum ar fi promotorii nativi de imunoglobulină şi actină.

Celula gazdă poate fi o celulă de mamifer, insectă, plantă, bacterie sau o celulă de drojdie. Exemplele de linii celulare de mamifere, potrivite ca celule gazdă, includ celulele ovarului de hamster chinezesc (CHO), celulele NSO, celulele PER-C6, celulele SP2, celulele HEK-293T, celulele NIH-3T3, celulele HeLa, celulele rinichilor de pui de hamster (BHK), celulele rinichilor de maimuţe verzi africane (COS), celulele umane de carcinom hepatocelular (de exemplu, Hep G2), celulele pulmonare umane, celulele A549 şi un număr de alte linii celulare. Exemplele de linii celulare de insecte includ celulele Sf9 sau Sf21.

Exemplele de celule gazdă de plante includ pe cele de Nicotiana, Arabidopsis, lintiţă, porumb, grâu, cartof, etc. Celulele gazdă bacteriene includ specii de E. coli şi Streptomyces.

Exemplele de celule gazdă de drojdie includ Saccharomyces cerevisiae şi Pichia pastoris. Secvenţele de aminoacizi ale unei molecule de adeziune, exprimate de diferite linii celulare sau la animale transgenice, pot avea diferite tipuri de glicozilare. Cu toate acestea, toate moleculele de adeziune, codificate de moleculele de acid nucleic, prezentate aici, sau care cuprind secvenţele de aminoacizi prezentate aici, sunt parte a prezentei invenţii, indiferent de glicozilarea moleculelor de adeziune.

Un alt aspect al invenţiei prezintă o metodă de producere a unei molecule de adeziune la CD134, după cum a fost definită mai sus, folosind prezentarea în fagi. Metoda cuprinde: (a) sintetizarea unei biblioteci de anticorpi umani pe fag, (b) screening-ul bibliotecii cu CD134 sau unei porţiuni a acesteia, (c) izolarea fagului care se leagă la CD134 sau la o porţiune a acestuia, şi (d) obţinerea anticorpului de la fag. O metodă exemplară de preparare a bibliotecii de anticorpi cuprinde etapa de: (a) imunizare a unui animal non-uman, cuprinzând locusuri de imunoglobulină umană cu CD134 sau o porţiune antigenică a acestuia pentru a crea un răspuns imun; (b) extragerea celulelor producătoare de anticorpi de la animalul imunizat; (c) izolarea ARN care codifică lanţurile grele şi uşoare ale anticorpilor anti-CD134 din celulele extrase; (d) transcrierea inversă a ARN-ului pentru a produce ADNc; (e), amplificarea ADNc; şi (f) inserarea ADNc într-un vector de prezentare a fagului, astfel încât anticorpii sunt exprimaţi pe fag. Anticorpii recombinanţi CD134 anti-uman sau fragmentele de legare la antigen ale acestora pot fi izolaţi prin screening-ul unei biblioteci combinatorii de anticorpi recombinanţi. Biblioteca poate fi o bibliotecă de prezentare a fagilor scFv, generată folosind ADNc al VL şi VH uman, preparate din ARNm izolat din celulele B. Metodele de preparare şi examinare în astfel de biblioteci sunt cunoscute în domeniu. Seturile pentru generarea de biblioteci de prezentare a fagilor sunt disponibile comercial.

Într-un exemplu de realizare, preferat conform invenţiei, se propune o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, care conţine una sau o combinaţie de molecule de adeziune, aşa cum este descris aici, şi, optional, un purtător farmaceutic acceptabil. Compoziţiile pot fi preparate prin metode convenţionale, cunoscute în domeniu. În unele variante, compoziţia cuprinde un anticorp anti-CD134 sau un fragment de legare a antigenului acestuia. Într-o variantă particulară, compoziţia cuprinde clona 20E5 a anticorpului, sau un fragment de legare a antigenului al oricărui anticorp. În alte exemple, compoziţia conţine un derivat de clonă 20E5 a anticorpului. Termenul "purtător farmaceutic acceptabil" se referă la orice substanţă inactivă, care este potrivită pentru utilizarea într-o formă de livrare a unei molecule de adeziune. Un purtător poate fi un antiadeziv, liant, agent de acoperire, agent de dezintegrare, umplutură sau diluant, conservant (cum ar fi un agent antioxidant, antibacterian, sau agent antifungic), edulcorant, agent de întârziere a absorbţiei, agent de umectare, agent de emulsifiere, tampon, şi altele similare.

Moleculele nepeptidice ale invenţiei pot fi administrate pe cale orală, inclusiv ca suspensie, tablete şi altele similare. Formele lichide pot fi administrate prin inhalarea de microcapsule liofilizate sau aerosolizate. Ar putea fi, de asemenea, utilizate supozitoarele. Excipienţii farmaceutici adiţionali pot fi folosiţi pentru a controla durata de acţiune a moleculelor, conform invenţiei. Dozarea şi regimul de administrare a formei selectate pot fi determinate prin metode standard, bine cunoscute în domeniu. Aceste metode implică extrapolarea unui regim estimat de dozare de la modele animale, iar apoi determinarea dozei optime într-un studiu variaţional cu doze clinice umane.

Compoziţiile pot fi sub orice formă corespunzătoare, cum ar fi formele de dozare lichide, semisolide şi solide. Diferite forme de dozare ale compoziţiilor pot fi preparate prin metode uzuale, cunoscute în domeniu.

Cantitatea relativă de o moleculă de adeziune, inclusă în compoziţie, va varia în funcţie de o serie de factori, cum ar fi eliberarea dezirabilă şi caracteristicile farmacodinamice, molecula de adeziune specifică şi purtătorii utilizaţi, şi forma de dozare. Cantitatea de moleculă de adeziune într-o singură formă de dozare va fi, în general, acea cantitate, care produce un efect terapeutic, dar poate fi, de asemenea, o cantitate mai mică. În general, această cantitate va varia de la aproximativ 0,001% până la aproximativ 99%, de la aproximativ 0,1% la aproximativ 70%, sau de la circa 1 până la circa 30%, în raport cu greutatea totală a formei de dozare.

Suplimentar la molecula de adeziune, în compoziţie pot fi incluşi unul sau mai mulţi agenţi terapeutici, sau în mod separat, ca parte din acelaşi regim de tratament. Exemplele de agenţi terapeutici suplimentari sunt descrise aici mai jos. Cantitatea necesară de agent terapeutic suplimentar pentru a fi inclus în compoziţie poate fi uşor selectată de către o persoană de specialitate în domeniu, şi va varia în funcţie de o serie de factori, cum ar fi agentul special şi purtătorii utilizaţi, forma de dozare, şi eliberarea dezirabilă, şi caracteristicile farmacodinamice. Cantitatea de agent terapeutic suplimentar, inclus într-o singură formă de dozare, va fi, în general, acea cantitate de agent, care produce un efect terapeutic, dar poate fi şi în cantitate mai mică, de asemenea.

Moleculele de adeziune şi compoziţiile farmaceutice, ce conţin o moleculă de adeziune, propuse în prezenta invenţie, sunt utile pentru scopuri diagnostice, terapeutice sau de alt tip, cum ar fi creşterea unui răspuns imun, tratarea cancerului, sporirea eficacităţii altor tratamente anticanceroase sau stimularea eficacităţii vaccinurilor, şi prezintă o serie de aplicaţii, cum ar fi pentru utilizarea în scop de medicament sau de diagnostic. Astfel, în aspectul preferat, conform invenţiei, sunt prevăzute metode de utilizare a moleculelor de adeziune sau a compoziţiilor farmaceutice.

Un alt aspect al invenţiei propune o metodă de modulare a răspunsurilor imune antitumorale, mediate de CD134 uman, inclusiv stimularea funcţiei efectoare a Teff umane, cu expresia CD134 uman, şi/sau atenuarea funcţiei supresoare a Treg umane, cu expresia CD134 uman, folosind molecule de adeziune, care se leagă la CD134 uman, inclusiv anticorpi anti-CD134 uman, care: (1) împiedică interacţiunea naturală a OX40L uman cu receptorul uman CD134, şi/sau (2) nu blochează semnalizarea celulară, mediată de CD134 uman, după ocuparea cu apariţia naturală a OX40L uman.

Un alt aspect al invenţiei prezintă o metodă de modulare a răspunsurilor imune antitumorale, mediate de CD134 uman, în care respectiva metodă nu include molecule de adeziune, care se leagă la CD134 uman, inclusiv anticorpi anti-CD134 uman, cum ar fi mimeticele umane OX40L, care interacţionează cu domeniul de legare a OX40L uman pe receptorul uman CD134 şi/sau blochează semnalizarea celulară CD134 uman - OX40L uman.

Prezenta invenţie descrie molecule de adeziune, care se leagă la CD134 uman, incluzând anticorpi anti-CD134 uman, în scopuri terapeutice antitumorale. Anticorpii CD134 anti-uman se leagă la domeniul extracelular al CD134 uman. Mai specific, anticorpii CD134 anti-uman se leagă la regiuni de non-legare a OX40L (adică, anticorpii CD134 anti-uman nu blochează complet legarea OX40L uman la CD134 uman) pe domeniul extracelular al CD134 uman pe Teff umane şi Treg umane activate.

Într-un aspect particular, sunt prezentate metodele de creştere a răspunsului imun la un mamifer, cuprinzând administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente dintr-o moleculă de adeziune, aşa cum este descris aici. În unele variante, molecula de adeziune este un anticorp anti-CD134 sau un fragment de legare a antigenului acestuia şi mamiferul este omul. Într-o altă variantă, molecula de adeziune este clona 20E5 a anticorpului, sau un fragment de legare a antigenului din oricare anticorp. Termenul "creşterea răspunsului imun" înseamnă stimularea, evocarea, mărirea, ameliorarea sau sporirea oricărui răspuns al sistemului imunitar al unui mamifer. Răspunsul imun poate fi un răspuns celular (adică mediat de celule, cum ar fi mediat de limfocitele T citotoxice) sau un răspuns umoral (adică răspuns mediat de anticorpi), şi poate fi un răspuns imun primar sau secundar. Exemplele de creştere a răspunsului imun includ creşterea activităţii celulelor T helper CD4+ şi generarea de celule T citolitice. Creşterea răspunsului imun poate fi evaluată, folosind o serie de teste in vitro sau in vivo, cunoscute specialiştilor în domeniu, incluzând, dar nu numai, testele limfocitelor T citotoxice, eliberarea de citokine (de exemplu, producţia de IL-2), regresia tumorilor, supravieţuirea animalelor care poartă tumori, producerea de anticorpi, proliferarea celulelor imune, expresia markerilor celulari de suprafaţă şi citotoxicitatea. Într-o variantă, metoda creşte răspunsul imun celular, în special, un răspuns al celulelor T citotoxice.

Un aspect al invenţiei prezintă o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, unde, la concentraţia de saturaţie sau depăşind concentraţia de saturaţie a respectivei molecule de adeziune, efectul asupra legării OX40L la CD134 este redus cu nu mai mult de 70% pe celulele T care exprimă CD134 uman, la măsurarea printr-un test de citometrie în flux pe bază de fluorescenţă, aşa cum este descris în exemplul 2(f). Mai preferabil, efectul asupra legării OX40L la CD134 este redus cu nu mai mult de aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, sau, de preferat, cu nici o reducere a legării.

Un alt aspect al invenţiei prezintă o moleculă de adeziune, în care la o concentraţie de 70 nM a moleculei de adeziune efectul asupra legării OX40L la CD134 este redus cu cel mult 70% pe celulele T care exprimă CD134 uman, la măsurarea printr-un test de citometrie în flux pe bază de fluorescenţă, aşa cum este descris în exemplul 2(f). Mai preferabil, efectul asupra legării OX40L la CD134 este redus cu cel mult circa 60%, sau circa 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10%, sau, de preferinţă, în lipsa reducerii legării.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care concurează pentru legarea CD134 uman cu un anticorp, şi care cuprinde: (1) o regiune variabilă a catenei grele, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 4 şi (2) o regiune variabilă a catenei uşoare, care cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO 13, aşa cum este demonstrat prin competiţie încrucişată dintre o moleculă respectivă nemarcată de adeziune şi un anticorp respectiv marcat fluorescent pe T-limfocitele cu expresia CD134 uman, stimulate cu PHA, măsurarea fiind efectuată prin citometrie în flux (descrisă mai departe în exemplul 2(e)). Preferabil, legarea anticorpului respectiv, la concentraţia sa de saturaţie sau depăşind concentraţia sa de saturaţie, este redusă cu cel puţin aproximativ 50%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 70%, sau aproximativ 80%, sau aproximativ 90% sau mai mult, şi este, în mod preferabil, abolită, la testarea prin competiţie încrucişată împotriva moleculei respective de adeziune.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, unde efectul asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult aproximativ 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi în care molecula respectivă de adeziune nu împiedică ulterior răspunsurile imunostimulatoare şi/sau proliferative ale OX40L uman pe celulele T efectoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care nu împiedică ulterior răspunsurile imunostimulatoare şi/sau proliferative ale OX40L uman pe celulele T efectoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, unde efectul asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult circa 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi în care molecula respectivă de adeziune stimulează răspunsurile imunostimulatoare şi/sau proliferative ale OX40L uman pe celulele T efectoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care stimulează răspunsurile imunostimulatoare şi/sau proliferative ale OX40L uman pe celulele T efectoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, efectul căreia asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult aproximativ 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi care nu împiedică ulterior răspunsurile funcţiei supresoare ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care nu împiedică ulterior răspunsurile funcţiei supresoare ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, efectul cărei asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult circa 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi care stimulează răspunsurile funcţiei supresoare ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care stimulează răspunsurile funcţiei supresoare ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, efectul cărei asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult circa 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi care nu împiedică ulterior răspunsurile proliferative ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu inhibă sau previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care nu împiedică răspunsurile proliferative ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, efectul căreia asupra legării OX40L la CD134 pe celulele T care exprimă CD134 uman este redus cu cel mult circa 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10% ori mai puţin, şi care inhibă răspunsurile proliferative ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman. Un alt aspect al invenţiei propune o moleculă de adeziune, care se leagă la CD134 uman, care nu inhibă sau previne legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L) şi care inhibă răspunsurile proliferative ale OX40L uman pe celulele T reglatoare, care exprimă CD134 uman.

O metodă adecvată de măsurare a legării simultane a OX40L şi a anticorpului anti-CD134 este descrisă în continuare. Semnalul fluorescent FITC (media geometrică sau media intensităţii fluorescente (MFI)) al legării OX40L uman pe PBMC (celulele mononucleare ale sângelui periferic) PHA- stimulate, care exprimă CD134 uman, în absenţa anticorpului anti-CD134 uman, se stabileşte la 100%. Semnalul fluorescent PE (MFI) al legării anticorpului anti-CD134 uman pe PBMC PHA-stimulate, care exprimă CD134 uman, în absenţa OX40L uman, se stabileşte la 100%. Reducerea acestui semnal fluorescent FITC şi a semnalului fluorescent PE atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul CD134 anti-uman, se adaugă simultan la PBMC PHA-stimulate, care exprimă CD134 uman, de preferinţă nedepăşind aproximativ 70%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10%, ori mai puţin.

O metodă adecvată de măsurare a lipsei impedimentului asupra răspunsurilor proliferative ale Teff, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Teff care exprimă CD134 uman după tratamentul cu OX40L uman se stabileşte la 100%. Modificările (adică reducere sau creşterea) acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Teff activate, care exprimă CD134 uman, (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28) de preferinţă nu depăşesc aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10%, ori mai puţin.

O metodă adecvată de măsurare a stimulării răspunsurilor proliferative ale Teff, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Teff care exprimă CD134 uman după tratamentul cu OX40L uman se stabileşte la 100%. Stimularea acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Teff activate, care exprimă CD134 uman (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28), de preferinţă depăşeşte aproximativ 30%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 70%, ori mai mult.

O metodă adecvată de măsurare a lipsei impedimentului asupra funcţiei supresoare a Treg, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Teff care exprimă CD134 uman, care sunt co-cultivate cu Teff care exprimă CD134 uman (de exemplu, raportul Teff/Treg = 1:1), după tratamentul cu OX40L uman, se stabileşte la 100%. Modificările (adică reducere sau creşterea) acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Teff activate, care exprimă CD134 uman (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28), care sunt co-cultivate cu Teff care exprimă CD134 uman (de exemplu, raportul Teff/Treg = 1:1), de preferinţăl nu depăşesc aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10%, ori mai puţin.

O metodă adecvată de măsurare a stimulării funcţiei supresoare a Treg, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Teff care exprimă CD134 uman, care sunt co-cultivate cu Teff care exprimă CD134 uman (de exemplu, raportul Teff/Treg = 1:1), după tratamentul cu OX40L uman, se stabileşte la 100%. Stimularea acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Teff activate, care exprimă CD134 uman (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28), care sunt co-cultivate cu Teff care exprimă CD134 uman (de exemplu, raportul Teff/Treg = 1:1), de preferinţă depăşeşte aproximativ 30%, sau aproximativ 40%, sau aproximativ 50%, sau aproximativ 60%, sau aproximativ 70%, ori mai mare.

O metodă adecvată de măsurare a lipsei impedimentului asupra răspunsurilor proliferative ale Treg, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Treg care exprimă CD134 uman după tratamentul cu OX40L uman se stabileşte la 100%. Modificările (adică reducere sau creşterea) acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Treg activate, care exprimă CD134 uman (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28), de preferinţă nu depăşesc aproximativ 30%, sau aproximativ 20%, sau aproximativ 10%, ori mai puţin.

O metodă adecvată de măsurare a inhibiţiei răspunsurilor proliferative ale Treg, mediate de OX40L, este descrisă în continuare. Incorporarea timidinei tritiate sau BrdU în Treg care exprimă CD134 uman după tratamentul cu OX40L uman se stabileşte la 100%. Reducerea acestei incorporări a timidinei tritiate sau BrdU, atunci când atât OX40L uman, cât şi anticorpul anti-CD134 uman, sunt adăugaţi simultan la Treg activate, care exprimă CD134 uman (de exemplu, PHA-stimulate sau stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28), de preferinţă depăşeşte nivelul de aproximativ 30%, sau de aproximativ 40%, sau de aproximativ 50%, sau de aproximativ 60%, sau de aproximativ 70%, ori mai mult.

Un alt aspect al invenţiei prezintă o metodă de tratare a cancerului la un mamifer, care cuprinde administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente de o moleculă de adeziune, conform prezentei invenţii.

Într-o variantă ulterioară preferată a invenţiei, molecula de adeziune este clona 20E5 a anticorpului, sau un fragment de legare a antigenului oricărui anticorp. Într-o altă variantă, mamiferul este omul.

Într-o altă variantă preferată a invenţiei, se prezintă o metodă de prevenire a cancerului la un mamifer, care cuprinde administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente de o moleculă de adeziune, conform prezentei invenţii.

Termenul "profilaxia cancerului" sau "prevenirea cancerului" se referă la întârzierea, inhibarea sau prevenirea instalării unui cancer la un mamifer, la care debutul oncogenezei sau tumorigenezei nu este dovedit, dar este identificată o predispoziţie pentru cancer, fie determinată de screening-ul genetic, de exemplu, sau într-un alt mod. Termenul cuprinde, de asemenea, tratarea unui mamifer cu stări precanceroase pentru a stopa progresia, sau pentru a produce regresia stărilor precanceroase spre malignitate. Exemplele de stări precanceroase includ hiperplazia, displazia şi metaplazia. În unele variante, molecula de adeziune este un anticorp anti-CD134 sau un fragment al acestuia, conform prezentei invenţii. Într-un alt exemplu al invenţiei, este prezentată o moleculă de adeziune, selectată din clona 20E5 a anticorpului, sau un fragment de legare a antigenului oricărui anticorp. Într-o altă variantă, mamiferul este omul.

O varietate de tipuri de cancer, inclusiv malign sau benign, şi/sau primar ori secundar, pot fi tratate sau prevenite printr-o metodă, conform prezentei invenţii. Exemplele de astfel de tipuri de cancer sunt cunoscute specialiştilor în domeniu şi sunt enumerate în manualele standard, cum ar fi Merk Manual of Disgnosis and Therapy (publicat de Merck).

Într-o altă variantă a invenţiei, moleculele de adeziune pot fi administrate separat în calitate de monoterapie sau pot fi administrate în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici sau terapii. Astfel, într-o altă variantă a invenţiei, se prezintă o metodă de tratare sau prevenire a cancerului printr-o terapie combinată, metodă care cuprinde administrarea unei molecule de adeziune, conform prezentei invenţii, în combinaţie cu una sau mai multe terapii suplimentare sau agenţi terapeutici. Termenul "tratament suplimentar" se referă la o terapie care nu utilizează o moleculă de adeziune, propusă în prezentare în calitate de agent terapeutic. Termenul "agent terapeutic suplimentar" se referă la orice agent terapeutic, cu excepţia moleculei de adeziune, propuse în prezentare. În unele variante, molecula de adeziune este clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman, sau un fragment de legare a antigenului oricărui anticorp. Într-un aspect particular, prezenta descriere propune o terapie combinată pentru tratarea cancerului la un mamifer, care cuprinde administrarea la mamifer a unei cantităţi terapeutic eficiente dintr-o moleculă de adeziune, conform prezentei invenţii, în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari. Într-o altă variantă, mamiferul este omul.

O mare varietate de agenţi terapeutici anticanceroşi pot fi utilizaţi în combinaţie cu o moleculă de adeziune. Un specialist în domeniu va recunoaşte prezenţa şi dezvoltarea altor terapii anticanceroase, care pot fi utilizate în combinaţie cu metodele şi moleculele de adeziune din prezenta descriere, şi nu se va limita la acele forme de terapie, stabilite aici. Exemplele de categorii ale agenţilor terapeutici suplimentari, care pot fi utilizaţi în terapia combinată pentru tratarea cancerului, includ: (1) agenţi chimioterapeutici, (2) agenţi imunoterapeutici şi (3) agenţi terapeutici hormonali.

Termenul "agent chimioterapeutic" se referă la o substanţă chimică sau biologică, care poate provoca moartea celulelor canceroase, sau interferează cu diviziunea, reparaţia, creşterea şi/sau funcţia celulelor canceroase (Root-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14, p. 55-62; Tryder et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, p. 501-6; Stratagene Corp, La Jolla, California).

Termenul "agenţi imunoterapeutici" se referă la substanţe chimice sau biologice, care pot ameliora un răspuns imun al unui mamifer. Exemplele de agenţi imunoterapeutici includ: bacilul Calmette-Guerin (BCG); citokine, cum ar fi interferonii; vaccinuri, cum ar fi imunoterapia personalizata MyVax, Onyvax-P, Oncophage, GRNVACl, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX şi NeuVax; şi anticorpi, cum ar fi alemtuzumab (CAMPATH), bevacizumab (AVASTIN), cetuximab (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicin (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX), rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), tremelimumab, CAT-3888, şi anticorpi agonişti ai receptorului CD40 (Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England).

Termenul "agent terapeutic hormonal" se referă la o substanţă chimică sau biologică, care inhibă sau elimină producerea unui hormon, sau inhibă ori contracarează efectul unui hormon asupra creşterii şi/sau supravieţuirii celulelor canceroase. Sunt cunoscute exemple de astfel de agenţi potriviţi pentru metodele descrise aici (M. J. Evans et al. J. Immunol. Meth. 1995, 184, p. 123-138). Exemplele de agenţi terapeutici hormonali particulari includ: tamoxifenul (NOLVADEX), toremifenul (Fareston), fulvestrantul (FASLODEX), anastrozolul (ARIMIDEX), exemestanul (AROMASIN), letrozolul (FEMARA), acetatul de megestrol (MEGACE), goserelinul (ZOLADEX) şi leuprolida (LUPRON). Moleculele de adeziune, conform prezentei invenţii, pot fi, de asemenea, utilizate în combinaţie cu terapii hormonale nemedicamentoase, cum ar fi: (1) metode chirurgicale, care elimină toate sau o parte din organele sau glandele care participă la producerea de hormoni, cum ar fi ovarele, testiculele, glanda suprarenală şi glanda pituitară, şi (2) tratamentul radioterapeutic, în care organele sau glandele pacientului sunt supuse radiaţiei într-o cantitate suficientă pentru a inhiba sau elimina producerea de hormon vizat.

Într-o altă variantă a invenţiei, se prezintă o metodă de tratare sau prevenire a cancerului printr-o terapie combinată, metodă care cuprinde administrarea unei molecule de adeziune, conform prezentei invenţii, şi tratamentul chirurgical pentru a înlătura o tumoare. Molecula de adeziune poate fi administrată mamiferului până la, în timpul sau după intervenţiile chirurgicale menţionate.

Terapia combinată pentru tratarea cancerului cuprinde, de asemenea, combinarea unei molecule de adeziune, conform prezentei invenţii, cu tratamentul radioterapeutic, cum ar fi radioterapia ionizantă (electromagnetică) (de exemplu, cu raze X sau raze gamma) şi radioterapia cu fascicul de particule (de exemplu, radiaţii cu energie liniară înaltă). Sursa de radiaţie pentru mamifer poate fi externă sau internă. Molecula de adeziune poate fi administrată mamiferului până la, în timpul sau după tratamentul radioterapeutic.

Moleculele de adeziune şi compoziţiile, conform prezentei invenţii, pot fi administrate pe orice cale enterală sau parenterală potrivită de administrare. Termenul "cale enterală" de administrare se referă la administrarea prin orice parte a tractului gastrointestinal. Exemplele de căi enterale includ calea orală, la nivelul mucoasei, bucală şi calea rectală, sau calea intragastrică. "Calea parenterală" de administrare se referă la toate căile de administrare, cu excepţia căii enterale. Calea şi metoda de administrare corespunzătoare poate varia în funcţie de o serie de factori, cum ar fi anticorpul specific utilizat, viteza de absorbţie dezirabilă, forma specifică sau forma de dozare utilizată, tipul sau severitatea tulburării care este tratată, locul specific de acţiune, precum şi starea pacientului, şi pot fi uşor selectate de către o persoană de specialitate în domeniu.

Termenul "cantitate terapeutic eficientă" de o moleculă de adeziune se referă la o cantitate care este eficientă pentru un scop terapeutic dezirabil. De exemplu, în contextul creşterii unui răspuns imun, o "cantitate terapeutic eficientă" este orice cantitate, care este eficientă pentru stimularea, evocarea, creşterea, ameliorarea sau sporirea oricărui răspuns al sistemului imun al unui mamifer. În contextul de tratare a cancerului, o "cantitate terapeutic eficientă" este orice cantitate, care este suficientă pentru a cauza un efect benefic sau dezirabil la mamiferul care este tratat, cum ar fi inhibarea creşterii sau răspândirii în continuare a celulelor canceroase, moartea celulelor canceroase, inhibarea reapariţiei cancerului, reducerea durerii asociate cu cancerul sau ameliorarea supravieţuirii mamiferului. Într-o metodă de prevenire a cancerului, o "cantitate terapeutic eficientă" este orice cantitate, care este eficientă în întârzierea, inhibarea sau prevenirea instalării unui cancer la un mamifer, la care se administrează molecula de adeziune.

Cantitatea terapeutic eficientă de o moleculă de adeziune, de obicei, variază de la aproximativ 0,001 până la aproximativ 500 mg/kg, şi, mai frecvent, de la aproximativ 0,05 la aproximativ 100 mg/kg din greutatea corporală a mamiferului. De exemplu, cantitatea poate fi de aproximativ 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg sau de 100 mg/kg greutate corporală a mamiferului. În unele variante, cantitatea terapeutic eficientă de un anticorp CD134 anti-uman este în intervalul de la aproximativ 0,1 până la 30 mg/kg greutate corporală a mamiferului. Nivelul precis de dozare, care trebuie administrat, poate fi uşor determinat de către o persoană de specialitate în domeniu şi va depinde de o serie de factori, cum ar fi tipul şi severitatea tulburării care trebuie tratată, molecula respectivă de adeziune implicată, calea de administrare, timpul de administrare, durata tratamentului, terapia suplimentară specială folosită, vârsta, sexul, greutatea, starea generală, starea de sănătate şi istoricul medical anterior al pacientului tratat, şi alţi factori similari, bine cunoscuţi în domeniu.

O moleculă de adeziune sau compoziţie este, de obicei, administrată de mai multe ori. Intervalele dintre prizele unice pot fi, de exemplu, săptămânale, lunare, o dată la trei luni sau anuale. Un regim de tratament exemplar implică administrarea o dată pe săptămână, o dată la fiecare două săptămâni, o dată la trei săptămâni, o dată la fiecare patru săptămâni, o dată pe lună, o dată la 3 luni sau o dată la fiecare trei până la 6 luni. Regimurile de dozare tipice pentru un anticorp CD134 anti-uman includ 1 mg/kg greutate corporală sau 3 mg/kg greutate corporală prin administrare intravenoasă, utilizând una dintre următoarele scheme de dozare: (i) la fiecare patru săptămâni pentru şase doze, apoi la fiecare trei luni; (ii) fiecare trei săptămâni; (iii) 3 mg/kg greutate corporală o dată, urmată de 1 mg/kg greutate corporală la fiecare trei săptămâni.

Această invenţie este ilustrată în continuare prin următoarele exemple, care nu trebuie considerate în nici un caz ca impunând restricţii în domeniul de aplicare a acesteia. Dimpotrivă, trebuie să fie clar înţeles că se poate recurge la diverse alte variante, modificări şi echivalenţi ai acestora care, după citirea descrierii de faţă, ar putea fi sugerate specialiştilor în domeniu fără a ne îndepărta de caracterul prezentei invenţii şi/sau scopul revendicărilor anexate.

Exemple

Exemplul 1 Generarea anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman la şoareci (=OX40)

(a) Generarea celulelor Sf9 de insecte, care exprimă CD134 de suprafaţă ADNc care codifică proteinele CD134 umane (GenBank ref CAB96543.1; a se vedea SEQ ID NO 1) a fost optimizat pentru expresia celulelor Sf9 la insecte (Spodotera frugiperda) şi sintetizat de GENEART, Regensburg, Germania (a se vedea SEQ ID NO 2). Acest ADNc a fost subclonat în plasmida de transfer a baculovirusului pVL1393 (setul de transfecţie BD cat NO 560129; BD Biosciences). Ulterior, celulele Sf9 de insecte (ATCC) au fost co-transfectate cu plasmida de transfer pVL1393, care conţine ADNc, ce codifică CD134 uman împreună cu BaculoGold Baculovirus ADN (set de transfecţie BD), şi apoi incubate la 27°C, timp de 4…5 zile. După această etapă de co-transfecţie, supranatantul a fost colectat şi depozitat la 4°C, şi utilizat pentru a infecta mai multe celule Sf9 de insecte pentru amplificarea virusului. Cu acest scop, celulele Sf9 de insecte au fost transfectate cu baculovirus recombinant amplificat, şi apoi incubate la 27°C timp de 3…5 zile. Aceste celule Sf9 de insecte au fost recoltate, spălate cu PBS (soluţie-tampon fosfat) sterilă, şi alicotate în cantitate de 5x106 celule/250 µl în PBS şi păstrate la -80°C pentru a obţine lizate celulare. Înainte de depozitare, expresia de suprafaţă a CD134 uman pe celulele transfectate Sf9 de insecte a fost confirmată cu ajutorul CD134 anti-uman de şoarece, conjugat cu ficoeritrină (PE) (clona ACT35, BD Biosciences) şi citometrie în flux.

(b) Imunizarea şi generarea anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece.

Şoarecii BALB/c (femele, vârsta de 6 săptămâni; Laboratoarele Charles River) au fost injectaţi subcutanat cu ≈ 400 µl lizate celulare Sf9 de insecte, transfectate cu CD134 uman (250 µl lizat celular din proba de analizat + 250 µl de Adjuvant Complet Freund; Sigma) în ziua 0. Injecţii subcutanate similare cu lizate celulare Sf9 de insecte, transfectate cu CD134 uman şi Adjuvant Incomplet Freund (Sigma) au fost administrate în ziua 21 şi ziua 42. Injecţii de rapel intraperitoneale cu lizate celulare Sf9 de insecte, transfectate cu CD134 uman (250 µl/şoarece), fără adjuvant s-au dat în ziua 61 şi în ziua 62. În ziua 65, splenocitele de la şoarecii imunizaţi au fost fuzionate cu celulele mielomice SP2/0 (ATCC), folosind tehnologia hibridomului standard, descrisă iniţial de Kohler şi Milstein (Nature. 1975, 256, p. 495-497). Hibridoamele, care au produs anticorpi (clasa IgG de şoarece) împotriva CD134 uman (sortat cu testul convenţional ELISA şi tehnici de citometrie în flux, folosind o proteină de fuziune CD134 recombinant uman: Fcγ uman (R&D Systems) şi celulele T blaste CD4, PHA-stimulate, ce exprimă CD134 uman (Roche) (a se vedea Exemplul 2 de mai jos) ca ţinte, respectiv) au fost extinse, crioconservate şi clonate prin limitarea diluţiei. Anticorpii monoclonali specifici anti-CD134 uman au fost purificaţi, folosind coloane de proteină G (GE Healthcare), şi au avut ca rezultat clona clona 20E5 (izotipul IgG1κ de şoarece; determinat cu Setul Izotipului Anticorpului Monoclonal de Şoarece IsoStripTM de la Roche).

Exemplul 2 Caracterizarea citometrică în flux a clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman la şoareci

(a) Expresia CD134 pe limfocitele T umane, PHA-stimulate.

Celulele umane mononucleare din sângele periferic (PBMC) de la donatori sănătoşi (consimţământ informat), au fost izolate prin centrifugare de densitate pe Lymphoprep (1,077 g/ml; Nycomed). Ulterior, 1-2x106 PBMC/ml în mediu de cultură RPMI-1640 (Gibco), conţinând 10% de ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml de gentamicină (Gibco), au fost suplimentate cu 0; 0,1; 1,0 sau 10,0 µg/ml de fitohemaglutinină-M (PHA-M; Roche) la temperatura de 37°C/5% CO2, timp de 1…3 zile. După cultivare, PBMC au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie salină tamponată cu fosfat refrigerată, conţinând 0,1% albumină serică bovină (Sigma)/0,05% NaN3 (PBS/BSA/NaN3), suplimentată cu 10% rezervă de ser uman (HPS; blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 10 µg/ml clonă ACT35 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, disponibilă comercial (şoarece izotip lgG1, BD Biosciences, Alphen aan de Rijn, Olanda), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost ulterior incubate cu 1:200 anticorpi IgG anti-şoarece de capră, PE-conjugaţi şi diluaţi (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate cu 1:20 anticorp anti-CD3 uman de şoarece, conjugat cu izotiocianat diluat de fluoresceină (FITC) (BD Biosciences) pentru a detecta limfocitele T, timp de 30 de min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

Aşa cum este arătat în figura 1 (n = 1 de la fiecare donator), limfocitele T umane nestimulate/în repaus, derivate din sângele periferic, nu au exprimat nici un CD134, cu toate acestea, PHA a stimulat în funcţie de doză limfocitele T umane CD3pozitive pentru a exprima CD134 de suprafaţă. La expunerea la 10 µg/ml PHA, nivelurile de expresie ale CD134 asupra limfocitelor T umane CD3pozitive activate a părut să ajungă la un platou între "ziua 1" şi "ziua 2", cu toate acestea, procentul de limfocite T umane CD134pozitive/CD3pozitive a crescut în funcţie de timp pe parcursul experimentării.

(b) Expresia CD134 pe subpopulaţia de limfocite T CD4 umane, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 0 şi 10 µg/ml, timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3, suplimentată cu 10% HPS (blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 1:10 anticorp anti-CD4 uman de şoarece diluat, conjugat cu FITC (BD Biosciences) sau cu 1:10 anticorp anti-CD8 uman de şoarece diluat, conjugat cu FITC (BD Biosciences), în combinaţie cu 1:10 clonă ACT35 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, diluată, PE-conjugată, disponibilă comercial (BD Biosciences), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 2, expresia CD134 a fost observată pe limfocitele T umane CD4pozitive, PHA-stimulate şi nu pe limfocitele T umane CD4pozitive, aflate în repaus. Expresia scăzută a CD134 a fost găsită pe limfocitele T umane CD8pozitive, activate cu PHA, şi nu pe limfocitele T umane CD8pozitive, aflate în repaus (datele nu sunt prezentate).

(c) Legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T care exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml, timp de 2 zile; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3, suplimentată cu 10% HPS (blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 0; 0,007; 0,02; 0,07; 0,2; 0,6; 1,9; 5,6; 16,7; 50,0 µg/mL clonă ACT35 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, disponibilă comercial (izotip IgG1 de şoarece; BD Biosciences), şi cu clonele 20E5 ale anticorpului anti-CD134 uman, generată intern, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:200 anticorpi anti-IgG de şoarece, diluaţi şi PE-conjugaţi, de capră (Jackson ImmunoResearch) timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate cu 1:20 anticorp anti-CD3 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), pentru a detecta limfocitele T, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 3 (media ± DS, rezultatele observate la doi donatori), clona ACT35, clonele 20E5 ale anticorpului anti-CD134 uman de şoarece au saturat moleculele de suprafaţă CD134 umane pe limfocitele T CD3pozitive, PHA-stimulate, la aproximativ 5,0…10,0 µg/mL. Folosind aceşti doi donatori, legarea pe jumătate maximală a fost observată la ≈ 2,5 µg/ml pentru clona ACT35 şi clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece.

(d) Legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece pe limfocitele T CD4 pozitive şi CD8 pozitive, ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 20 µg/ml, timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3, suplimentată cu 10% HPS (blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 20,0 µg/ml control izotip IgG1κ de şoarece (BD Biosciences) sau cu 20,0 µg/ml clone 20E5 ale anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:100 anticorpi anti-IgG de şoarece, diluaţi şi PE-conjugaţi, de capră (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate, timp de 30 min la 4°C cu 1:20 anticorp anti-CD4 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), sau cu 1:20 anticorp anti-CD8 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), pentru a detecta subpopulaţiile limfocitelor T. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 4, clonele 20E5 ale anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece au demonstrat o colorare pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T CD4 pozitive umane activate, şi o colorare slab pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T CD8 pozitive umane activate.

(e) Competiţia încrucişată a clonelor 20E5 nemarcate ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece cu anticorpii comerciali anti-CD134 de şoarece, PE-conjugaţi, pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml sau la 20 µg/ml timp de 4 zile sau timp de 1 zi, respectiv; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3, suplimentată cu 10% HPS (blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 10 µg/ml clonă 20E5 nemarcată, timp de 30 min la 4°C. Celulele au fost incubate ulterior cu 1:20 clonă ACT35 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, diluată şi PE-conjugată, disponibilă comercial (BD Biosciences) sau cu clona L106 (BD Biosciences; a se vedea, de asemenea, brevetul lui Godfrey), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor anti-CD134 PE-conjugaţi, disponibili comercial, a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

Pre-incubarea cu clona nemarcată 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece a blocat uşor legarea clonei comerciale L106, PE-conjugate, a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece la CD134 uman pe limfocitele T stimulate cu PHA. Pre-incubarea cu clonele 20E5 nemarcate ale anticorpului anti-CD134 uman de şoarece nu a arătat nici un efect asupra legării clonei comerciale ACT35, PE-conjugate, a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece la CD134 uman pe limfocitele T stimulate cu PHA.

Aceste rezultate au demonstrat că clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece (i) a recunoscut în mod specific CD134 uman (blocarea uşoară a legării clonei L106) pe limfocitele T stimulate cu PHA, şi (ii) s-a legat la un epitop non-identic, care a fost recunoscut de clona comercială L106 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece. Mai mult decât atât, aceste rezultate au demonstrat că clonele 20E5 ale anticorpului anti-CD134 uman de şoarece păreau să recunoască epitopii CD134 umani pe limfocitele T stimulate cu PHA, care au fost diferiţi de epitopul recunoscut de clona comercială ACT35 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece.

(f) Legarea simultană a ligandului recombinant uman OX40 şi a clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T care exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3, suplimentată cu 10% HPS (blocarea receptorilor Fcγ; BioWhittaker). Celulele au fost incubate cu 10,0 µg/ml ligand recombinant uman OX40, marcat cu polihistidină (IgG1 de şoarece, clona AD1.1.10; R&D Systems), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:100 anticorpi anti-IgG de şoarece, diluaţi şi PE-conjugaţi, de capră (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate cu 10,0 µg/ml clonă clonă 20E5 biotinilată (cu utilizarea N-hidroxisuccinimidobiotinei de la Pierce) ale anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate cu 1:100 streptavidină diluată şi PE-conjugată (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea OX40L uman şi a anticorpilor anti-CD134 uman a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 6, clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece s-au legat simultan cu OX40L uman pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Acest fapt a indicat că clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece nu interacţionează cu epitopi în cadrul regiunii de legare a OX40L pe receptorii CD134 umani. Această constatare vine în contrast cu clona L106, disponibilă comercial, a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece (Universitatea Stanford/brevetul Godfrey EP 0726952 B1), care a recunoscut un epitop din regiunea de legare a OX40L uman a receptorilor CD134 umani (Taylor şi Schwarz. J Immunol Methods 2001, 255, p. 67-72; Institutul Kirin & La Jolla/ Croft WO 2007/062235 A2).

(g) Expresia CD134 pe limfocitele T umane efectoare şi reglatoare după stimularea cu particule sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman/anti-CD28 uman

Limfocitele T CD4 umane au fost purificate din PBMC prin selecţie pozitivă, utilizând anticorpi anti-CD4 uman de şoarece, conjugaţi cu microparticule sferice (Miltenyi Biotec) şi coloane VarioMACSTM Magnet/LS (Miltenyi Biotec). Ulterior, aceste limfocite T CD4 au fost colorate cu anticorpi anti-CD4 uman de şoarece, conjugaţi cu FITC (Dako), şi anticorpi anti-CD25 uman de şoarece, PE-conjugaţi (BD Biosciences). Limfocitele T efectoare (Teff) CD4pozitive/CD25negative convenţionale şi limfocitele T reglatoare (Treg) CD4pozitive/CD25înalt au fost sortate, folosind un sortator celular de citometrie în flux Altra (Beckman Coulter). Aceasta a dus la creşterea a > 95% Teff şi a > 95% Treg. Teff şi Treg au fost introduse în cantitate de 2,5x105 celule/ml în mediul de cultură RPMI-1640/glutamax (Gibco), suplimentat cu 0,02 mM piruvat (Gibco), 100 U/ml penicilină (Gibco), 100 µg/ml streptomicină (Gibco), şi 10% HPS inactivat termic (HPSi; de la LMI). Apoi, celulele au fost însămânţate cu 2,5x104 celule/200 µl/godeu în plăci cu 96 de godeuri cu fund rotund (Greiner), şi stimulate cu particule sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman de şoarece/anti-CD28 uman de şoarece (particule sferice CD3/CD28; Invitrogen) în cantitate de 1 particulă sferică/2 celule în prezenţa a 25 U/ml de interleukină-2 recombinantă umană (Proleukin® de la Novartis Pharmaceuticals UK Ltd) la 37°C/5% CO2, timp de 2…8 zile. După cultivare, celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în PBS/0,2% BSA refrigerat, şi au fost colorate simultan cu 1:50 anticorp anti-CD4 uman de şoarece, diluat şi conjugat cu FITC (Dako), 1:10 anticorp anti-CD25 uman de şoarece, diluat şi PE-conjugat (BD Biosciences), 1:50 anticorp anti-CD3 uman de şoarece, diluat, ECDTM-conjugat (Beckman-Coulter), 1:10 anticorp CD134 anti-uman de şoarece, diluat, PE-CyTM5-conjugat (clona ATC35; BD Biosciences), şi 1:10 anticorp anti-CD127 uman de şoarece, diluat, PE-CyTM7-conjugat (eBiosciences). Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 7 (n = 1 de la fiecare donator), Teff umane şi Treg umane, purificate din sângele periferic, non-stimulate/aflate în repaus (ziua 0), nu au exprimat nici un CD134, cu toate acestea, Teff umane şi Treg umane, stimulate de particulele sferice CD3/CD28, au exprimat CD134 de suprafaţă. Expresia CD134 pe Teff umane şi Treg umane activate a atins apogeul după 2 zile de cultivare, şi a fost atenuată peste 5 şi 8 zile de cultivare.

Exemplul 3 Caracterizarea biologică a clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece

(a) Proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate, după tratamentul cu clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 0 şi 10 µg/ml timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi suspendate în cantitate de 2x106 celule/ml în mediul de cultură RPMI (Gibco), conţinând 10% ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml gentamicină (Gibco). Celulele au fost însămânţate cu 0,1x106 celule/100 µl/godeu (adică, 1x106 celule/ml) în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat (Corning), şi au fost expuse la 0; 0,025; 0,25; 2,5 sau 25,0 µg/ml clonă 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece, sau/şi în combinaţie cu 0; 0,01; 0,1 sau 1,0 µg/ml OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa raportului molar de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems) la 37°C/5% CO2, timp de 6 zile. Peste 6 zile, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind Proliferarea colorimetrică (incorporarea BrdU) a Celulelor ELISATM (Roche) şi un cititor ELISA (BioRad) la A450 nm.

După cum este arătat în figura 8 (media ± DS, n = 4, folosind un singur donator), clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece au indus dozo-dependent proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. În plus, OX40L uman, de asemenea, a indus dozo-dependent proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. OX40L uman a indus proliferarea la 0,1 şi 1,0 µg/ml. Limfocitele T umane CD134negative, aflate în repaus (fara stimulare cu PHA), nu au arătat nici un răspuns proliferativ după tratamentul cu clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece sau OX40L uman (datele nu sunt prezentate).

După cum este arătat în figura 9 (media ± DS, n = 2, folosind un singur donator), clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece (la 2,5 şi 25 µg/ml), şi OX40L uman (la 1,0 µg/ml) au indus proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Lipsa tratamentului (doar mediul) sau tratamentul cu izotipul de control IgG1κ de şoarece (la 2,5 şi 25 µg/mL; BD Biosciences) nu au demonstrat nici un efect asupra proliferării limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Combinaţiile dintre clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece la 2,5 şi 25 µg/mL (sau la concentraţii mai scăzute; datele nu sunt prezentate) şi OX40L uman la 1,0 µg/ml (sau la concentraţii mai scăzute; datele nu sunt prezentate) nu au demonstrat nici un efect reciproc (adică, sinergic sau aditiv, sau chiar inhibitor) asupra proliferării limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

(b) Proliferarea limfocitelor T efectoare şi T reglatoare, ce exprimă CD134 uman, stimulate de particulele sferice anti-CD3/anti-CD28 uman, după tratamentul cu clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece.

Limfocitele T CD4 umane au fost purificate din PBMC prin selecţie negativă, utilizând un amestec din anticorpi de şoarece (BD BioSciences), direcţionat împotriva CD8 uman (clona RPA-T8), CD14 (clona M5E2), CD16 (clona 3G8), CD19 (clona 4G7), CD33 (clona P67.6), CD56 (clona B159), şi CD235a (HIR2). După incubarea cu IgG anti-şoarece de berbec, conjugate cu Dynabeads® (Invitrogen), limfocitele T CD4 nelegate au fost colectate din Concentratorul de Particule Magnetice Dynal, MPC™-6 (Invitrogen). Dintre aceste limfocite T CD4 stimulate, Treg CD25înalt şi Teff CD25negative au fost separate prin sortarea MACS, folosind 10 µl anticorpi anti-CD25 uman de şoarece, conjugaţi cu microparticule sferice (Miltenyi Biotec)/107 celule şi coloane MiniMACSTM Magnet/MS (coloane Miltenyi Biotec VarioMACSTM Magnet/LS (Miltenyi Biotec)). Aceasta a avut ca rezultat creşteri de > 90% Teff şi de > 90% Treg. Teff şi Treg au fost introduse în cantitate de 0,25x106 celule/ml în mediul de cultură RPMI-1640/glutamax (Gibco), suplimentat cu 0,02 mM piruvat (Gibco), 100 U/ml penicilină (Gibco), 100 µg/ml streptomicină (Gibco), şi 10% HPSi. Ulterior, Teff şi Treg au fost însămânţate în cantitate de 2,5x104 celule/200 µl/godeu (adică, 0,125x106 celule/ml) în plăci cu 96 de godeuri cu fund rotund (Greiner), şi au fost stimulate cu particule sferice CD3/CD28 (Invitrogen) în cantitate de 1 particulă sferică/5 celule cu sau fără 5,0 µg/ml clonă 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece, 1,0 µg/ml OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa proporţiei molare de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems) sau o combinaţie dintre 5,0 µg/ml clonă 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece şi 1,0 µg/ml OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa proporţiei molare de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece), la 37°C/5% CO2, timp de 4 sau 5 zile. Peste 4 sau 5 zile, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind incorporarea a 0,5 µCi timidină tritiată (Perkin & Elmer) şi un calculator β (Canberra-Packard).

După cum este arătat în figura 10 (media ± DS) clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece nu a indus proliferarea suplimentară a Teff ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28.

După cum este prezentat în figura 11 (media ± SEM de la 5 donatori) clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece nu au indus deloc sau au indus proliferarea scăzută a Treg ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28, în timp ce OX40L uman a indus o proliferare foarte puternică a Treg ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28.

După cum este arătat în figura 12A (media ± DS) clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece în combinaţie cu OX40L uman nu a demonstrat nici un efect reciproc (adică, inhibitor, sinergic sau aditiv) asupra Teff ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28 (datele nu sunt prezentate).

După cum este arătat în figura 12B (media ± DS), în contrast cu acel (lipsa oricărui) efect observat la răspunsurile proliferative, mediate de OX40L uman, asupra Teff ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28, comparativ anticorpul monoclonal anti-CD134 uman de şoarece a suprimat puternic răspunsurile proliferative, mediate de OX40L uman, asupra Treg ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28.

(c) Funcţia supresoare a limfocitelor T reglatoare, ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice anti-CD3/anti-CD28 uman după tratamentul cu clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece.

Limfocitele T CD4 umane au fost purificate din PBMC, iar Teff şi Treg au fost stimulate conform Exemplului 3(b), descris mai sus. Teff şi Treg au fost introduse în cantitate de 0,25x106 celule/ml în mediul de cultură RPMI-1640/glutamax (Gibco), suplimentat cu 0,02 mM piruvat (Gibco), 100 U/ml penicilină (Gibco), 100 µg/ml streptomicină (Gibco), şi 10% HPSi. Ulterior, Teff şi Treg au fost însămânţate în cantitate de 2,5x104 celule/200 µl/godeu (adică, 0,125x106 Teff/ml) şi co-cultivate cu 2,5 x104 Treg supresoare/200 µl/godeu (adică, 0,125x106 Treg/ml; raportul Teff:Treg = 1:1) în plăci cu 96 de godeuri cu fund rotund (Greiner). Aceste co-culturi Teff/Treg au fost stimulate cu particule sferice CD3/CD28 (Invitrogen) în cantitate de 1 particulă sferică/10 celule cu sau fără 5,0 µg/ml clonă 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece şi 1,0 µg/ml OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa proporţiei molare de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems), la 37°C/5% CO2, timp de 5 zile. Peste 5 zile, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind incorporarea a 0,5 µCi timidină tritiată (Perkin & Elmer) şi un calculator β (Canberra-Packard).

După cum este arătat în figura 13 (media ± DS), Treg umane au suprimat răspunsurile proliferative ale Teff umane, induse de particulele sferice CD3/CD28 (adică, media). Clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman nu a demonstrat nici un efect asupra funcţiei de supresie a Treg umane.

Exemplul 4 Caracterizarea moleculară genetică a clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece

(a) Izotiparea şi degradarea Edman.

Clasa imunoglobulinei de şoarece, izotipul şi tipul catenei uşoare în cazul clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece, purificaţi de Proteina G, s-au determinat, folosind Setul pentru Izotipul Anticorpului Monoclonal de Şoarece IsoStripTM (Roche), şi a fost arătat că ambele clone 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece erau lgG1 de şoarece cu lanţuri uşoare κ.

După electroforeza standard LDS-PAGE, folosind sistemul cu gel prefabricat NuPage® Novex® (Invitrogen) în condiţii reduse (DTT şi încălzire la temperatura de 70°C), clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece a fost supusă electro-blotting-ului pe o membrană de transfer din fluorură de poliviniliden (PDVF/Immobilon-P) (Millipore), şi colorată cu albastru briliant de Coomassie (BioRad). Ulterior, benzile catenelor grele şi uşoare (50 kDa şi 25 kDa, respectiv) au fost excizate din membrana PVDF, şi utilizate pentru analiza de degradare Edman (realizată de EuroSequence, Groningen, Olanda) pentru a determina secvenţele N-terminale de aminoacizi. Rezultatele sunt prezentate în SEQ ID NO 3 şi SEQ ID NO 61 pentru clona 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece. Au fost determinaţi 11 aminoacizi la capătul N-terminal al catenelor grele şi 11 aminoacizi la capătul N-terminal al lanţurilor uşoare.

(b) RT PCR.

Celulele hibridomului din clonele 20E5 au fost recoltate din cultura de celule. Celulele au fost spălate cu PBS, alicotate în flacoane conţinând câte 5 x 106 celule, şi păstrate în calitate de granule la -80°C. Granulele de celule au fost folosite pentru a izola ARN, folosind Mini Setul pentru Izolare RNeasy (QIAGEN). A fost determinată concentraţia de ARN (A260 nm) şi ARN a fost depozitat la -80°C. Producerea totală de ARN izolat: 27,3 µg şi 58,4 µg pentru clona 20E5 (raportul A260/A280 pentru ambele 1,9). Prin intermediul revers transcriptazei, a fost sintetizat ADNc din 1 µg de ARN, folosind setul RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas), acesta fiind depozitat la -20°C.

Pe baza izotipului (kappa/IgG1 de şoarece) şi analizei de degradare Edman a clonei 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece, următorii primeri au fost desemnaţi pentru amplificarea regiunilor V ale clonei 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece:

Primerul nr.* Secvenţa** SEQ ID NO Direcţia Gena 201 GACAGTTGGTGCAGCATCAG 39 antisens mkappa 266 CACTGGATGGTGGGAAGATG 40 antisens mkappa 203 GGCCAGTGGATAGACAGATG 41 antisens mIgG1 204 TGGACAGGGATCCAGAGTTC 42 antisens mIgG1 259 GCGAAGTACAAYTNCARCARWSNGG 43 sens 20E5HC 260 GCGTACAATTACARCARWSNGGNCC 44 sens 20E5HC 265 GCGATATACARATGACNCARAC 45 sens 20E5LC

* nr. în conformitate cu sistemul intern de codificare Bioceros;

** primerii degeneraţi: N = A, C, G, sau T, Y = C sau T, R = A sau G, W = A sau T, şi S = G sau C.

Primerii 201 şi 266 sunt proiectaţi antisens pentru a se alipi în regiunea constantă a genei kappa de şoarece în poziţiile 214…232 şi 236…255, respectiv (pe baza numărului de acces V00807 [versiunea V00807.1].

Primerii 203 şi 204 sunt proiectaţi antisens pentru a se alipi în regiunea constantă a IgG1 de şoarece în poziţiile 115…134 şi 221…240, respectiv (pe baza numărului de acces J00453 [versiunea J00453.1].

Primerii 259 şi 260 sunt primeri sens de degenerare (degenerare, respectiv, 512 şi 256), alipiţi la capătul N-terminal (aminoacizii 1…8 şi, respectiv, 2…9) al catenei grele din clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, pe baza degradării Edman.

Primerul 265 este un primer sens de degenerare (degenerare la 16), alipit la capătul N-terminal (aminoacizii 1…7) al catenei uşoare din clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, pe baza degradării Edman.

Primerii 201, 266, 203, 204, 259, 260 şi 265 au fost utilizaţi în diferite combinaţii pentru a amplifica regiunile variabile ale clonei 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece. Au fost efectuate diferite PCR, folosind ADNc generat ale ambelor clone în calitate de model.

ADN Polimeraza AccuprimeTM Pfx (Invitrogen) a fost utilizată pentru a amplifica regiunile variabile ale catenelor grele şi uşoare ale clonei 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece. Produsele PCR au fost analizate pe un gel de agaroză 1%. Produsele reacţiilor PCR au fost purificate pe gel şi clonate în vectorul pCR-Blunt II-TOPO® pentru analiza secvenţei. Din plasmidele care conţin o inserţie PCR, inserţiile clonate au fost analizate prin secvenţierea ADN (realizată de ServicXS BV, Leiden, Olanda sau Macrogen, Amsterdam, Olanda), folosind T7 pentru a obţine secvenţa consens pentru regiunile V ale clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece. Pentru clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 de şoarece au fost obţinute 11 reacţii informative ale secvenţelor catenei grele şi 3 reacţii informative ale secvenţelor catenei uşoare. Pe baza acestor informaţii, au fost determinate secvenţele consens din regiunile V ale ambilor anticorpi (a se vedea SEQ ID NO 4, 5).

Specificarea sau discutarea unui document aparent publicat anterior în această specificaţie nu ar trebui să fie în mod necesar luată ca o recunoaştere a faptului că documentul este parte a elaborărilor de ultimă oră sau a cunoştinţelor generale comune.

Exemplul 5 Generarea clonelor himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG4/kappa şi/sau IgG1/kappa (adică, schimbul domeniilor constante de şoarece cu domeniile constante IgG/kappa umane)

Pe baza regiunilor V murine determinate (a se vedea exemplul 4(b) de mai sus) ale clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 de şoarece, a fost realizat un design pentru a genera versiuni umane de anticorpi himerici. Cu acest scop, secvenţele ADNc optimizate ale celulelor CHO (a se vedea SEQ ID NO 20 (care codifică clona himerică 20E5 a catenei grele IgG4 uman), SEQ ID NO 21 (care codifică clona himerică 20E5 a catenei uşoare κ uman), SEQ ID NO 22 (care codifică clona himerică 20E5 a catenei grele IgG1 uman) au fost comandate la GENEART (Regensburg, Germania), fiind codificate pentru o peptidă murină de semnalizare, urmată fie de lanţul uşor variabil, legat la regiunea constantă kappa umană, fie urmată de lanţul greu variabil, legat la regiunea constantă IgG umană. Acest design a fost realizat pentru ambii anticorpi; pentru clona 20E5, lanţul greu variabil a fost legat la regiunea constantă IgG4 umană sau IgG1 umană. Folosind enzime de restricţie corespunzătoare, moleculele de ADNc generate au fost subclonate în plasmide de expresie pcADN3.1-derivate. Anticorpii himerici au fost exprimaţi cu ajutorul Sistemului de Expresie FreeStyle™ MAX CHO (celule CHO-S) (Invitrogen). Anticorpii exprimaţi au fost purificaţi, folosind coloane cromatografice de afinitate a proteinei A (GE Healthcare). Pentru secvenţele de aminoacizi himerici, a se vedea SEQ ID NO 25, 26, 27, 28 şi 29.

Exemplul 6 Caracterizarea legării clonei himerice umane 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4/kappa şi/sau IgG1/kappa

(a) Caracteristicile de legare ale clonei himerice umane 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ pe limfocitele T CD4 pozitive, ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3. Celulele au fost incubate cu 0; 0,007; 0,02; 0,07; 0,2; 0,6; 1,9; 5,6; 16,7; 50,0 µg/mL clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:50 anticorpi anti-IgG4 uman de şoarece, diluaţi şi FITC-conjugaţi (Sigma), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate cu 1:10 anticorpanti-CD4 uman de şoarece, diluat şi PE-conjugat (BD Biosciences), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

Clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ a saturat moleculele de suprafaţă CD134 umane pe limfocitele T CD4pozitive, PHA-stimulate la aproximativ 5,0…10,0 µg/ml (datele nu sunt prezentate). Legarea pe jumătate maximală a fost observată la ≈ 1,0 µg/ml pentru clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ (datele nu sunt prezentate).

(b) Legarea clonei himerice umane 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ pe limfocitele T CD4 pozitive şi CD8 pozitive, ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml, timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3. Celulele au fost incubate cu sau fără 20,0 µg/mL clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior, timp de 30 min la 4°C cu 1:200 anticorpi anti-IgG umană de capră (Fcγ specifici), diluaţi şi PE-conjugaţi (Jackson ImmunoResearch). După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate, timp de 30 min la 4°C cu 1:10 anticorp anti-CD4 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), sau cu 1:10 anticorp anti-CD8 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), pentru a detecta subpopulaţiile de limfocite T. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

Clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ a demonstrat o colorare pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T umane CD4pozitive, PHA-activate, şi o colorare slab pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T umane CD8pozitive, PHA-activate (datele nu sunt prezentate).

(c) Legarea clonei himerice umane 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ pe limfocitele T CD4 pozitive şi CD8 pozitive, ce exprimă CD134 uman, stimulate cu ajutorul particulelor sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman/anti-CD28 uman.

Celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC) de la donatori sănătoşi (consimţământ informat) au fost izolate prin centrifugare de densitate pe Lymphoprep (1,077 g/ml; Nycomed). Ulterior, 1x106 PBMC/ml în mediul de cultură RPMI-1640 (Gibco), conţinând 10% ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml gentamicină (Gibco) au fost stimulate cu particule sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman de şoarece/anti-CD28 uman de şoarece (particule sferice CD3/CD28; Invitrogen) în cantitate de 1 particulă sferică/4 celule în absenţa sau prezenţa a 25 U/ml de interleukină-2 recombinantă umană (PeproTech) la 37°C/5% CO2, timp de 1 zi. După cultivare, PBMC au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3. Celulele au fost incubate cu sau fără 20,0 µg/mL clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:200 anticorpi anti-IgG umană de capră (Fcγ specifici), diluaţi şi PE-conjugaţi (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate, timp de 30 min la 4°C cu 1:10 anticorp anti-CD4 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), sau cu 1:10 anticorp anti-CD8 uman de şoarece, diluat şi FITC-conjugat (BD Biosciences), pentru a detecta subpopulaţiile de limfocite T. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 14, clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ a demonstrat o colorare pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T umane CD4pozitive, activate de particulele sferice CD3/CD28, şi o colorare slab pozitivă pe subpopulaţia de limfocite T umane CD8pozitive, activate de particulele sferice CD3/CD28. Nu a fost observat nici un efect aparent la utilizarea de supliment de IL-2 recombinantă umană.

Exemplul 7 Caracterizarea biologică a clonei himerice umane 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4/kappa

(a) Proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate, după tratamentul cu clona himerică umană 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ,

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml, timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi suspendate în cantitate de 2x106 celule/ml în mediul de cultură RPMI (Gibco), conţinând 10% ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml gentamicină (Gibco). Celulele au fost însămânţate în cantitate de 0,1x106 celule/100 µl/godeu (adică, 1x106 celule/ml) în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat (Corning), şi au fost expuse la 25,0 µg/ml clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau la 25,0 µg/ml anticorp uman de control anti-CD40 uman IgG4κ (PG102; Pangenetics), sau la 1,0 µg/ml OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa raportului molar de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems) la 37°C/5% CO2, timp de 6 zile. Peste 6 zile, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind Proliferarea colorimetrică (incorporarea BrdU) a Celulelor ELISATM (Roche) şi un cititor ELISA (BioRad) la A450 nm.

După cum este arătat în figura 15 (media ± DS), clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ (hu20E5) şi OX40L uman au indus proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Lipsa tratamentului (doar mediul) sau tratamentul cu anticorpul uman de control anti-CD40 uman IgG1κ (huIgG4) nu au demonstrat nici un efect asupra proliferării limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

(b) Proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate, după tratamentul cu clona himerică umană 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ în combinaţie cu OX40L uman recombinant.

Au fost generate limfocite T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate (la 10 µg/ml, timp de 1 zi; a se vedea mai sus). Celulele au fost recoltate şi suspendate în cantitate de 2x106 celule/ml în mediul de cultură RPMI (Gibco), conţinând 10% ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml gentamicină (Gibco). Celulele au fost însămânţate în cantitate de 0,1x106 celule/100 µl/godeu (adică, 1x106 celule/ml) în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat (Corning), şi au fost expuse la 0; 0,025; 0,25; 2,5 sau 25,0 µg/ml clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau/şi în combinaţie cu 0; 0,01; 0,1 sau 1,0 µg/mL OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa raportului molar de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems) la 37°C/5% CO2, timp de 6 zile. Peste 6 zile, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind Proliferarea colorimetrică (incorporarea BrdU) a Celulelor ELISATM (Roche) şi un cititor ELISA (BioRad) la A450 nm.

După cum este arătat în figura 16 (media ± DS), clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ (hu20E5) şi OX40L uman au indus dozo-dependent proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ a indus donator-dependent proliferarea la fie 2,5 şi 25 µg/mL (donator 1), fie la 0,25; 2,5 şi 25 µg/mL (donator 2). În plus, OX40L uman a indus donator-dependent proliferarea la fie 0,1 şi 1,0 µg/ml (donator 1), fie la 0,01; 0,1 şi 1,0 µg/ml (donator 2).

După cum este arătat în figura 17 (media ± DS), combinaţia dintre clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ (hu20E5) la 2,5 şi 25 µg/ml (sau la concentraţii mai scăzute; datele nu sunt prezentate) şi OX40L uman la 0,1 şi 1,0 µg/ml (sau la concentraţii mai scăzute; datele nu sunt prezentate) nu a demonstrat nici un efect reciproc (adică, sinergic sau aditiv, sau chiar inhibitor) asupra proliferării limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate.

(c) Proliferarea limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particulele sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman/anti-CD28 uman, după tratamentul cu clona himerică umană 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ,

Celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC) de la donatori sănătoşi (consimţământ informat) au fost izolate prin centrifugare de densitate pe Lymphoprep (1,077 g/ml; Nycomed). Ulterior, PBMC au fost însămânţate în cantitate de 0,1x106 celule/100 µl/godeu (adică, 1x106 celule/ml) în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat (Corning) în mediul de cultură RPMI-1640 (Gibco), conţinând 10% ser fetal de viţel (Bodinco) şi 50 µg/ml gentamicină (Gibco), şi au fost stimulate cu particule sferice stimulatoare ale anticorpului anti-CD3 uman de şoarece/anti-CD28 uman de şoarece (particule sferice CD3/CD28; Invitrogen) în cantitate de 1 particulă sferică/2 celule în absenţa sau prezenţa a 25 U/ml de interleukină-2 recombinantă umană (PeproTech) la 37°C/5% CO2. Peste 1 sau 2 zile, aceste limfocite T ce exprimă CD134 uman, stimulate cu particule sferice CD3/CD28 (minus şi plus interleukina-2), au fost expuse la 25,0 µg/mL clonă himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau la 1,0 µg/mL OX40L uman recombinant, marcat cu polihistidină (în prezenţa raportului molar de 1:5 a anticorpului anti-polihistidină de şoarece; R&D Systems) la 37°C/5% CO2, timp de 6 zile sau timp de 5 zile, respectiv. Celulele care au fost iniţial stimulate cu combinaţia dintre particule sferice CD3/CD28 şi interleukină-2 recombinantă umană, au fost stimulate în mod repetat cu 1 zi înainte de măsurările proliferării celulelor cu 25 U/ml de interleukină-2 recombinantă umană. Peste 6 zile sau peste 5 zile de expunere la clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ sau la OX40L uman recombinant, proliferarea celulelor a fost măsurată, folosind Proliferarea colorimetrică (incorporarea BrdU) a Celulelor ELISATM (Roche) şi un cititor ELISA (BioRad) la A450 nm.

După cum este arătat în figura 18 (media ± DS, n=3, folosind un singur donator), deşi particulele sferice stimulatoare CD3/CD28 au indus singure o proliferare considerabilă a limfocitelor T ce exprimă CD134 uman (adică, mediul), clona himerică umană 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman IgG4κ (hu20E5) şi OX40L uman au indus o proliferare suplimentară a limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, stimulate cu ajutorul particulelor sferice CD3/CD28. Se pare că adăugarea interleukinei-2 doar a crescut proliferarea bazală (adică, mediul) în cazul limfocitelor T ce exprimă CD134 uman, stimulate cu ajutorul particulelor sferice CD3/CD28.

(d) Răspunsurile imunostimulatoare la maimuţele Macac Rhesus după tratamentul cu clonele umane (himerice) 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman

Primatele non-umane, maimuţele Macac Rhesus, pot fi imunizate cu proteina virusului de imunodeficienţă simiană, gp130 (Weinberg et al. J. Immunother, 2006, 29, p. 575-585).

Se aşteaptă ca ganglionii limfatici regionali de la maimuţele imunizate, tratate cu clonele umane (de exemplu, himerice sau imunizate, sau deimunizate; de exemplu, subclasele umane IgG1 sau IgG4) 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman, să fie măriţi, comparativ cu maimuţele imunizate de control. Se aşteaptă ca maimuţele tratate cu clonele umane (de exemplu, himerice sau imunizate, sau deimunizate) 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman să prezinte creşterea titrurilor de anticorpi gp130-specifici şi răspunsuri crescute de lungă durată ale celulelor T, în comparaţie cu loturile de control. Nu ar trebui să existe semne evidente de toxicitate la maimuţele tratate cu clonele umane (de exemplu, himerice sau imunizate, sau deimunizate) 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman.

Exemplul 8 Caracterizarea domeniilor şi epitopilor CD134 uman, recunoscuţi de clonele 20E5 ale anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece

(a) Legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece cu proteina redusă şi neredusă de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman (western blotting).

Au fost supuse electroforezei 1300 sau 650 ng/bandă (pentru colorarea cu albastru brilliant de Coomassie) sau 250 ng/bandă (pentru western blotting) de proteină de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman (IgG1) (R&D Systems), folosind geluri Tris-bis de 4…12% şi soluţie-tampon continuu MOPS (Invitrogen), într-o varietate de condiţii de non-reducere şi de reducere (a se vedea figura 19-A) în sistemul prefabricat LDS-PAGE de electroforeză de denaturare NuPage® Novex®. Ulterior, proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman a fost fie colorată cu albastru brilliant de Coomassie (BioRad), fie supusă electro-blotting-ului pe o membrană de transfer din fluorură de poliviniliden (PDVF) (Millipore). După blocarea cu fracţiunea V PBS/0,05% Tween 20/1% BSA (Roche), timp de 20 min la temperatura camerei, membranele PDVF au fost incubate cu 100 ng/ml clonă 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece timp de 1 oră la temperatura camerei. În paralel, în calitate de control negativ, au fost folosite 100 ng/ml de anticorp de control izotip IgG1κ de şoarece (BD Biosciences). După spălarea extensivă în PBS/0,05% Tween 20, legarea clonei 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman de şoarece a fost determinată cu 1:5000 anticorpi diluaţi de capră Fcγ-specifici anti-şoarece, conjugaţi cu peroxidază de hrean (Jackson ImmunoResearch), timp de 1 oră la temperatura camerei, urmată de o soluţie gata pentru utilizare a substratului TMB (Sigma) pentru detectarea colorimetrică.

După cum este arătat în figura 19-B, proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman în condiţii de non-reducere (şi denaturante LDS fără şi cu denaturare termică, condiţie a şi b, respectiv) a demonstrat o masă moleculară de ≈ 130…140 kDa. Non-reducerea, fără încălzire (condiţia a), a arătat două benzi din imediata apropiere, ceea ce a sugerat faptul că o fracţiune din proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman a fost incomplet denaturată/desfăşurată. Non-reducerea, cu încălzire (condiţia b), a arătat o bandă, ceea ce a sugerat faptul că proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman a fost complet denaturată/desfăşurată. Proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman în condiţii de reducere (şi denaturare LDS fără şi cu denaturare termică, condiţia c şi d, respectiv) a avut ca rezultat benzi de ≈ 110 kDa (condiţia c) şi de ≈ 60-65 kDa (condiţia d). Observaţiile anterioare au sugerat reducerea incompletă a proteinei de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman, iar observaţiile ulterioare au sugerat reducerea completă/ruperea punţilor disulfidice, care unesc două fragmente Fcγ umane lgG1- derivate în fiecare moleculă a proteinei de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman.

După cum este arătat în figura 19-C, clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece au recunoscut proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman în condiţii de non-reducere (şi denaturante LDS fără şi cu denaturare termică, condiţia a şi b, respectiv) la predominant ≈ 130 kDa. clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece a arătat o legare puternică cu proteina de fuziune a CD134 uman recombinant: Fcγ uman în condiţii de reducere (şi denaturare LDS fără şi cu denaturare termică, condiţia c şi d, respectiv).

Aceste rezultate atestă, că clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece au recunoscut în mod specific CD134 uman. Aceste rezultate au sugerat faptul că clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece a recunoscut un epitop pe CD134 uman, care nu este sensibil la denaturare (tratament termic şi cu LDS) şi nu este sensibil la reducere (adică, ruperea punţii (-ilor) disulfidice de către DTT - cel mai probabil, legate de CRD).

(b) Legarea clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece cu structura umană de CD134 cu lungime completă şi diferite structuri trunchiate ale CD134 uman, exprimate pe linia celulară 293-F (cartografierea domeniilor).

Pentru a analiza specificitatea fină a clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece, localizarea epitopului (-ilor) recunoscuţi de către clonele 12H3 şi 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece a fost determinată prin cartografierea domeniilor. Capacitatea clonelor 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman de şoarece de a se lega la structurile trunchiate de CD134 uman, exprimat pe suprafaţa celulelor 297-F (HEK-derivate), a fost determinată prin analiza FACS.

În baza datelor din literatura de specialitate (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683; Bodmer et al. Trends Biochem. Sci. 2002, 27, p. 19-26; Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330; US 2011/0028688 A1), au fost identificate domeniile bogate în cisteină (CRD) şi o structură balama în regiunea extracelulară a CD134 uman. CRD au fost codificate ca CRD1, CRD2, CRD3 (trunchiat), CRD4 (trunchiat) (a se vedea figura 20). CRD conţin tipuri de module distincte din punct de vedere topologic, numite un A-modul şi un B-modul (a se vedea, de asemenea, figura 20). A-modulele sunt structuri în formă de C, iar B-modulele sunt structuri în formă de S. Un domeniu CRD tipic este de obicei compus din A1-B2-module sau A2-B1-module (sau, mai puţin frecvent, o altă pereche de module, cum ar fi A1-B1) cu 6 resturi conservate de cisteină, în care numeralul reprezintă numărul de punţi disulfidice în fiecare modul (a se vedea, de asemenea, figura 20). După cum este arătat în figura 20, 5 diferite structuri ale CD134 uman au fost generate şi exprimate: (1) structura CD134 uman cu lungime completă, care începe cu CRD1 N-terminal (adică, modulul CRD1 A1-B2 acoperă aminoacizii 29…65), şi, prin urmare, notată ca "CRD1", şi cuprinde aminoacizii 1…277 (vezi SEQ ID NO 1), (2) structura "CRD2", care începe cu CRD2 N-terminal (adică, modulul CRD2 A1-B2 acoperă aminoacizii 66-107) şi cuprinde aminoacizii 66…277, legaţi de aminoacizii peptidei de semnalizare 1…28 (vezi SEQ ID NO 30), (3) structura "CRD3", care începe cu CRD3 N-terminal (adică, modulul CRD3 A1-B1 acoperă aminoacizii 108-146 (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330) sau modulul CRD3 A1 trunchiat acoperă aminoacizii 108…126 (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683), şi cuprinde aminoacizii 108…277, legaţi de aminoacizii peptidei de semnalizare 1…28 (a se vedea SEQ ID NO 31), (4) structura "CRD4", care constă din CRD4 N-terminal sau modul B1/modul CRD4 A1 trunchiat al subdomeniului CRD3 (adică, modulul CRD4 A1-B1 acoperă aminoacizii 127…167 (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683), sau o combinaţie (nu este prezentată în figura 20) dintre modulul B1 al subdomeniului CRD3 şi modulul CRD4 A1 trunchiat, ce acoperă aminoacizii 127…146 cu aminoacizii 147…167, respectiv (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330), şi cuprinde aminoacizii 127…277, legaţi de aminoacizii peptidei de semnalizare 1…28 (vezi SEQ ID NO 32), şi (5) structura “trunchiată (tc) a CRD4", care constă din CRD4 N-terminal trunchiat sau modul B1 al subdomeniului CRD4 (adică, modulul CRD4 A1 trunchiat cuprinde aminoacizii 147…167 (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330) sau modulul B1 al subdomeniului CRD4 (nu este prezentat în figura 20 (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683) conţine aminoacizii 147…167)), şi cuprinde aminoacizii 147…277, legaţi de aminoacizii peptidei de semnalizare 1…28 (a se vedea SEQ ID NO 33). Prin asamblarea PCR, folosind ADN Polimerază AccuprimeTM Pfx (Invitrogen), aceste 5 structuri CD134 umane au fost generate cu utilizarea primerilor prezentaţi în tabelul următor:

Primerul nr.* Secvenţa SEQ ID NO Direcţia Gena 362 CTCGGATCCGCCACCATGTGCGTG 51 sens leader CD134 363 AGAATTCTTATTAGATCTTGGCCA 55 antisens capăt CD134 364 ACTGTCACTGGACCCTGCGGTCCC 52 sens CRD2 365 GGGACCGCAGGGTCCAGTGACAGT 53 antisens CRD2 366 ACTGTCACTGGAAGGTGCAGGGCT 54 sens CRD3 367 AGCCCTGCACCTTCCAGTGACAGT 56 antisens CRD3 368 ACTGTCACTGGACCCTGCCCCCCT 57 sens CRD4 369 370 371 AGGGGGGCAGGGTCCAGTGACAGT ACTGTCACTGGATGCACCCTGGCT AGCCAGGGTGCATCCAGTGACAGT 58 59 60 antisens sens antisens CRD4 CRD4 trunchiat CRD4 trunchiat

* Nr. primerului în conformitate cu sistemul intern de codificare Bioceros

În sumar, ADNc care codifică aminoacizii 1-28 din peptida de semnalizare şi ADNc care codifică aminoacizii 66-277 din CD134 uman au fost amplificaţi, folosind perechea de primeri 362/365 şi, respectiv, 364/363 într-o reacţie PCR cu CD134 uman cu lungime completă ca model. Ulterior, structura "CRD2" a fost generată prin utilizarea acestor două produse de PCR într-o asamblare PCR, folosind perechea de primeri 362/363. ADNc care codifică structura "CRD2" a fost subclonat într-o plasmidă de expresie pcADN3.1-derivată, folosind situsuri de restricţie corespunzătoare. În mod similar, structura "CRD3" (aminoacizii 1…28 din peptida de semnalizare, legaţi la aminoacizii 108…277 din CD134 uman), structura "CRD4" (aminoacizii 1…28 din peptida de semnalizare, legaţi la aminoacizii 127…277), şi structura “trunchiată CRD4" (aminoacizii 1…28 din peptida de semnalizare, legaţi la aminoacizii 147…277) au fost generate şi subclonate în plasmide de expresie pcADN3.1-derivate, utilizând primerii corespunzători, prezentaţi în tabelul menţionat anterior. Mai mult decât atât, CD134 uman cu lungime completă (SEQ ID NO 1) a fost de asemenea clonat repetat într-o plasmidă de expresie pcADN3.1-derivată.

Utilizând Sistemul de Expresie FreeStyleTM 293 (Invitrogen), celulele FreeStyleTM 293-F (Invitrogen) au fost transfectate tranzitoriu cu 5 variante generate de CD134 uman. Peste 48-72 h, expresia CD134 uman de suprafaţă pe celulele transfectate a fost analizată prin analiza FACS. În acest scop, celulele transfectate au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1…2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3. Celulele au fost incubate cu 20,0 µg/mL de clone 20E5 ale anticorpilor monoclonali CD134 anti-uman de şoarece, timp de 30 min la 4°C. În paralel, în calitate de control negativ au fost utilizate 20,0 µg/ml de anticorp de control izotip IgG1κ de şoarece (BD Biosciences). După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:200 anticorpi de capră anti-IgG de şoarece (Fcγ specifici), diluaţi şi PE-conjugaţi (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este arătat în figura 21, clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece au recunoscut CD134 uman cu lungime completă (notat ca structura "CRD1”) pe celulele transfectate 293-F, în timp ce clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece nu au arătat nici o legare pe celulele fals-transfectate 293-F. Mai mult decât atât, clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece au recunoscut variantele trunchiate ale CD134 uman, care nu aveau CRD1 şi CRD1-CRD2 (notate ca structura "CRD2" şi structura "CRD3", respectiv) pe celulele transfectate 293-F. Clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece a arătat o legare puternică la varianta trunchiată a CD134 uman, care nu avea CRD3 A1-modul CRD1-CRD2-trunchiat (notată ca structura "CRD4") şi la varianta trunchiată de CD134 uman, care nu avea A1-modul cu subdomeniu CRD3 A1-modul-CRD4 CRD1-CRD2-trunchiat (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683), sau, în mod alternativ, CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-modul (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330), notată ca structura "tcCRD4").

Aceste rezultate au demonstrat faptul că clonele 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece au recunoscut în mod specific CD134 uman (compararea transfecţiei CD134 uman cu lungime completă vs. transfecţie falsă). Aceste rezultate au demonstrat faptul că clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece părea să recunoască un epitop liniar sau non-liniar/conformaţional în CRD4 A1-modulul trunchiat (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330), şi, posibil, în structura balama, cu secvenţa de aminoacizi 147…214 (SEQ ID NO 36) pe CD134 uman extracelular.

Folosind o cristalografie, Compaan et al. (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330) au descoperit recent implicarea critică a CRD1, CRD2 (în special a buclei A1 şi a resturilor imediat următoare), şi a CRD3 (în primul rând, a buclei A1) pe CD134 uman în timpul interacţiunii OX40Ligand (CD252)/CD134 (= OX40). Această descoperire vine în acord cu concluziile noastre, conform cărora (1, a se vedea mai sus), clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece nu părea să recunoască un epitop al CD134 uman în CRD1, CRD2 şi A1-modulul cu subdomeniu CRD3 A1-modul-CRD4 trunchiat (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683), sau, în mod alternativ, CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-modulul (Compaan et al. Structure. 2006, 14, p. 1321-1330) pe CD134 uman extracelular, şi (2, a se vedea mai sus) clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece s-a legat simultan cu OX40L uman pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate. Acest lucru a sugerat că clona 20E5 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece a recunoscut un epitop pe CD134 uman, care nu a avut o implicaţie critică în interacţiunea dintre CD134 uman şi OX40L uman. Mai mult decât atât, constatările noastre, conform cărora (1, a se vedea mai sus), clona 12H3 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece părea să recunoască un epitop liniar sau non-liniar/conformaţional în CRD3 A1-modulul trunchiat (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683) (adică, peptida 19-merică RCRAGTQPLDSYKPGVDCA, a se vedea SEQ ID NO 34) pe CD134 uman extracelular, sau secvenţa de aminoacizi 108…126 (adică, peptida 19-merică RCRAGTQPLDSYKPGVDCA, a se vedea SEQ ID NO 34) a avut un rol crucial pentru legarea la un epitop non-liniar/conformaţional în CRD3 A1-modulul/CRD4 A1-B1-modulul trunchiat (Latza et al. Eur. J. Immunol. 1994, 24, p. 677-683), şi, posibil, în structura balama, cu secvenţa de aminoacizi 108…214 (vezi SEQ ID NO 35) pe CD134 uman extracelular, şi (2, a se vedea mai sus) clona 12H3 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, legată simultan cu OX40L uman pe limfocitele T ce exprimă CD134 uman, PHA-stimulate, a fundamentat ideea că epitopul (aşa cum este descris mai sus) de pe CD134 uman, care a fost recunoscut de clona 12H3 a anticorpului anti-CD134 uman de şoarece, nu a avut o implicaţie critică în interacţiunea dintre CD134 uman şi OX40L uman.

Exemplul 9 Caracterizarea domeniilor şi epitopilor CD134 uman, recunoscuţi de către clonele himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG4/kappa şi/sau IgG1/kappa

(a) Legarea clonelor himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG4κ şi/sau IgG1κ cu structura CD134 uman cu lungime completă şi diferite structuri trunchiate ale CD134 uman, exprimate pe linia celulară 293-F (cartografierea domeniului).

Pentru a analiza specificitatea fină a clonelor himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG 4κ şi/sau IgG1κ, localizarea epitopului (-ilor), recunoscută de către clonele himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG4κ şi/sau IgG1κ, a fost determinată cu ajutorul cartografierii domeniului. Capacitatea clonei himerice umane 20E5 a anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG4κ şi/sau IgG1κ de a se lega la structurile trunchiate ale CD134 uman (a se vedea Exemplul 8(b) de mai sus), exprimate pe suprafaţa celulelor 297-F (HEK-derivate), a fost determinată prin analiza FACS.

Utilizând Sistemul de Expresie FreeStyleTM 293 (Invitrogen), celulele FreeStyleTM 293-F (Invitrogen) au fost transfectate tranzitoriu cu 5 variante generate de CD134 uman (a se vedea mai sus). Peste 48…72 ore, expresia CD134 uman de suprafaţă pe celulele transfectate a fost analizată prin analiza FACS. În acest scop, celulele transfectate au fost recoltate şi introduse în cantitate de 1-2x106 celule/ml în soluţie refrigerată PBS/BSA/NaN3. Celulele au fost incubate cu sau fără 20,0 µg/mL de clone himerice umane 20E5 ale anticorpilor monoclonali anti-CD134 uman IgG 4κ şi/sau IgG1κ, timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost incubate ulterior cu 1:200 anticorpi de capră anti-IgG de şoarece (Fcγ specifici), diluaţi şi PE-conjugaţi (Jackson ImmunoResearch), timp de 30 min la 4°C. După spălarea extensivă în PBS/BSA/NaN3, celulele au fost fixate în 2% formaldehidă în PBS/BSA/NaN3, timp de 30 de min la 4°C. Legarea anticorpilor a fost măsurată, folosind citometria în flux (FACSCalibur, BD Biosciences).

După cum este prezentat în figura 22, clona himerică umană 20E5 a anticorpului monoclonal anti-CD134 uman IgG4κ a demonstrat caracteristici de legare la diferite structuri trunchiate ale CD134 uman pe celulele transfectate, care au fost identice cu caracteristicile de legare ale omologilor lor parentali corespunzător clonelor 20E5 ale anticorpilor anti-CD134 uman de şoarece (a se vedea Exemplul 8(b) de mai sus; pentru comparaţie, a se vedea figura 22 vs. figura 21).

Enumerarea anexată a secvenţelor face parte din această specificare.

În SEQ ID NO 1, care este secvenţa de aminoacizi a CD134 uman (GenBank ref CAB96543.1; aa 1-277), o peptidă de semnalizare este în regiunea aminoacizilor (aa) 1…28, iar o regiune transmembranară - în regiunea aa 215…235.

SEQ ID NO 61, care formează cei 11 aminoacizi N-terminali ai SEQ ID NO 5, de asemenea, prezintă interes. Aceasta este catena uşoară 20E5, echivalentă cu SEQ ID NO 3, care formează cei 11 aminoacizi N-terminali ai catenei grele 20E5.

SEQ ID NO 37 (TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC), secvenţa de aminoacizi din peptida umană, derivată din fibronectină, corespunde secvenţei de aminoacizi a domeniului structural de tip suplimentar III (ED1; (Peters et. al. Am. Rev. Resp. Dis. 1988, 138, p. 167-71).

1. Sugamura et al. Nature Rev. Imm. No 4, 2004, p. 420-431

2. Al-Shamkhani et al. Eur. J. Chem. No 26, 1996, p. 1695-1699

3. Hirschhorn-Cymerman et al. J. Exp. Med. No 206, 2009, p. 1103-1116

4. Morris et al. Mol. Immunol. No 44, 2007, p. 3,112-3,121

Claims (29)

1. Anticorp, care se leagă la CD134 uman şi care nu împiedică legarea receptorului CD134 uman (OX40) la ligandul OX40 (OX40L), unde anticorpul cuprinde o regiune variabilă a catenei uşoare şi o regiune variabilă a catenei grele, unde regiunea variabilă a catenei grele cuprinde: (a) o regiune CDR1 a catenei grele, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:6 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi; (b) o regiune CDR2 a catenei grele, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:7 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi şi/sau (c) o regiune CDR3 a catenei grele, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:8 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi. şi unde regiunea variabilă a catenei uşoare cuprinde: (a) o regiune CDR1 a catenei uşoare, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:9 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi; (b) o regiune CDR2 a catenei uşoare, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:10 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi şi/sau (c) o regiune CDR3 a catenei uşoare, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:11 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi.

2. Anticorp, conform revendicării 1, care cuprinde: (a) o regiune variabilă a catenei grele, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:4 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi şi/sau (b) o regiune variabilă a catenei uşoare, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:5 sau o variantă a acestei secvenţe cu 1, 2 sau 3 substituţii de aminoacizi.

3. Anticorp, care se leagă specific la un epitop într-o secvenţă de aminoacizi din domeniul extracelular al CD134 uman, la care se leagă anticorpul, definit în oricare din revendicările 1-2.

4. Anticorp, conform revendicării 3, care se leagă la un epitop din domeniul extracelular al CD134 uman, care conţine secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 35 sau SEQ ID NO: 36.

5. Anticorp, conform revendicării 3 sau 4, care nu împiedică legarea receptorului CD134 uman la ligandul OX40 (OX40L) pe celulele imunocompetente umane, care exprimă CD134 uman, implicate în inhibarea creşterii celulelor tumorale umane.

6. Anticorp, conform revendicării 3 sau 4, care îmbunătăţeşte legarea şi/sau răspunsurile imunostimulatoare ale ligandului uman OX40 (OX40L) pe celulele imunocompetente umane, care exprimă CD134 uman, implicate în inhibarea creşterii celulelor tumorale umane.

7. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, care reprezintă un anticorp uman.

8. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, care reprezintă un anticorp himeric, umanizat sau DeImmunized™, sau un fragment de acesta.

9. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, care reprezintă un anticorp IgA, IgD, IgE, IgG sau IgM, cum ar fi un anticorp IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4.

10. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, în care anticorpul reprezintă un fragment de legare a antigenului al unui anticorp, de exemplu, selectat din grupa constituită din: fragmente Fv (de exemplu, Fv a unei singure catene şi Fv disulfidice legate) şi fragmente similare Fab (de exemplu, fragmente Fab, fragmente Fab' şi fragmente F(ab')2).

11. Anticorp, conform revendicării 10, în care fragmentul de legare a antigenului reprezintă scFv.

12. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, în care fragmentul de legare reprezintă un anticorp recombinant.

13. Anticorp, conform oricărei din revendicările precedente, în care fragmentul de legare reprezintă un anticorp monoclonal.

14. Moleculă de acid nucleic, care codifică un anticorp, conform oricărei din revendicările precedente.

15. Vector, care conţine cel puţin o moleculă de acid nucleic, conform revendicării 14.

16. Celulă gazdă, care conţine un vector, conform revendicării 15.

17. Celulă gazdă, conform revendicării 16, care derivă de la un mamifer sau de la o insectă.

18. Metodă de preparare a unui anticorp, conform oricărei din revendicările 1-13, care include etapa (i) de preparare a anticorpilor-CD134 şi etapa (ii) de sortare a anticorpilor menţionaţi pentru a identifica şi obţine anticorpii, care nu împiedică legarea OX40L la CD134.

19. Metodă, conform revendicării 18, în care etapa prevede identificarea anticorpilor care leagă CD134 după expunerea CD134 la o concentraţie de saturaţie de OX40L.

20. Metodă, conform revendicării 18 sau 19, în care anticorpul reprezintă un anticorp monoclonal şi prevede imunizarea unui animal cu CD134 uman, prepararea hibridoamelor care secretă anticorpi anti-CD134 şi sortarea hibridoamelor care produc anticorpi anti-CD134.

21. Anticorp, conform oricărei din revendicările 1-13, sau produsă conform oricărei din revendicările 18-20, pentru utilizare în prevenirea sau în tratarea cancerului la un subiect care necesită aceasta.

22. Anticorp pentru utilizare, conform revendicării 21, în care cancerul este selectat din grupa constituită din: cancer pulmonar, cancer de prostată, cancer mamar, cancer al capului şi gâtului, cancer esofagian, cancer gastric, cancer de colon, cancer colorectal, cancer de vezică urinară, cancer cervical, cancer uterin, cancer ovarian, cancer hepatic, cancer hematologic sau oricare altă boală sau tulburare caracterizată prin creşterea necontrolată a celulelor.

23. Metodă de îmbunătăţire a răspunsului imun la un subiect uman, care prevede administrarea la un subiect uman a unei cantităţi terapeutic eficiente de anticorpi, conform oricărei din revendicările 1-13, sau produsă conform oricărei din revendicările 18-20, şi, opţional, a unui purtător farmaceutic acceptabil.

24. Metodă, conform revendicării 23, în care îmbunătăţirea răspunsului imun prevede o creştere a funcţiei imunostimulatoare/efectoare a celulelor T efectoare, opţional ca rezultat al proliferării acestor celule, şi/sau ca rezultat al fenomenului de reglare prin reducere a funcţiei imunosupresoare a celulelor T reglatoare, opţional fără creşterea numărului de aceste celule.

25. Metodă de tratament a cancerului la un subiect uman, care necesită aceasta, care prevede administrarea la un subiect uman a unei cantităţi terapeutic eficiente de anticorpi, conform oricărei din revendicările 1-13, sau produsă conform oricărei din revendicările 18-20.

26. Metodă, conform revendicării 25, în care cancerul este selectat din grupa constituită din: cancer pulmonar, cancer de prostată, cancer mamar, cancer al capului şi gâtului, cancer esofagian, cancer gastric, cancer de colon, cancer colorectal, cancer de vezică urinară, cancer cervical, cancer uterin, cancer ovarian, cancer hepatic, cancer hematologic sau oricare altă boală, sau tulburare caracterizată prin creşterea necontrolată a celulelor.

27. Metodă de reducere a dimensiunii unei tumori sau de inhibare a creşterii celulelor canceroase la un subiect, sau reducerea, sau suprimarea dezvoltării cancerului metastatic la un subiect care suferă de cancer, care prevede administrarea la un subiect uman a unui anticorp, conform oricărei din revendicările 1-13, sau produse conform oricărei din revendicările 18-20.

28. Compoziţie farmaceutică, care conţine un component de legare, conform oricărei din revendicările 1-13, sau produs, conform oricărei din revendicările 18-20, în asociere cu unul sau mai mulţi diluanţi sau excipienţi farmaceutic acceptabili.

29. Compoziţie, conform revendicării 28, potrivită pentru administrare parenterală unui organism uman, de exemplu, prin administrare intravenoasă, intramusculară, intradermală, intraperitoneală, intratumorală, intravezicală, intraarterială, intratecală, intracapsulară, intraorbitală, intracardiacă, transtraheală, intraarticulară, subcapsulară, subarahnoidală, intraspinală, epidurală, intrasternală sau subcutanată.