NO854723L

NO854723L - Bionedbrytbar matriks og fremgangsmaate for fremstilling av denne.

Info

Publication number: NO854723L
Application number: NO854723A
Authority: NO
Inventors: Frederick H Silver; Richard A Berg; David E Birk; Kevin Weadock; Conrad Whyne
Original assignee: Univ New Jersey Med
Priority date: 1984-03-27
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1985-11-26
Also published as: US4703108A; IT8547869A1; EP0177573B1; US4970298A; DE3585069D1; DK547485D0; CA1295796C; ES8605988A1; AR240608A1; JPS61502129A; MX163953B; IT1182725B; BR8506206A; JPH0811121B2; FI854692A0; EP0177573A1; DK547485A; CN85101396A; ES541629A0; IT8547869A0

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår en bionedbrytbar matriks, og nærmere bestemt en multifunksjonell collagen-basert matriks og/eller bærersystem derav.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Utlevering av legemidler, vekstfaktorer, hormoner, peptider og glycopeptider til ytre sår har klassisk funnet sted ved direkte topisk administrering og påføring til indre sår ved injeksjon i blodet eller ved absorpsjon i blodet gjennom fordøyelsessystemet. Regulert frigivelse av disse midler er blitt oppnådd ved innkapsling enten i større om-fang eller til et mikroskopisk nivå under anvendelse av syntetiske polymerer slik som silikon, og naturlige polymerer slik som gelatin og cellulose. Frigivelseshastigheten kan reguleres i perioder opp til et år ved riktig valg av det polymere system som anvendes for å regulere diffusjons-hastigheten (Langer, R.S. og Peppas, N.A., Biomaterials 2, 201, 1981) . Naturlige polymerer slik som gelatin og cellulose, oppløses langsomt i løpet av minutter til timer, mens silikon forblir intakt i perioder på måneder til år. Bionedbrytbare polymerer medfører en fordel når det gjelder regulert frigivelse til indre sår da bare en enkel kirurgisk prosedyre er nødvendig.

Collagen er en bionedbrytbar polymer som finnes i dyr og mennesker. Det har vært anvendt som et plasmafordrøy-ningsmiddel, bærer for legemiddelutlevering, glasslegeme-erstatning, hemostatisk middel, sømmateriale, hornhinne-erstatning, hemodialysemembran, sårforbindingsmateriale og kunstig hud, brokklapp, karprotese, vaginal-antikonsepsjons-middel og injiserbart middel for vevforøkelse (Chvapil et al., Int. Review of Connective Tissue Research 6, 1, 1973;

Chvapil, in Biology of Collagen, redigert av A. Viidik og

J. Vuust, Academic Press, kapittel 22, 1980). I de fleste

av disse anvendelsesområder rekonstitueres collagen og tverrbindes i en uløselig form.

Yannas et al. beskriver i US patentskrift 4 060 081 anvendelse av collagen og mucopolysaccharider som syntetisk hud. Et slikt materiale tverrbindes under anvendelse av glutaraldehyd, et bifunskjonelt tverrbindingsmiddel, som reagerer med frie aminer. En hovedulempe med anvendelse av tverrbundet collagen har vært den uheldige biologiske effekt av fritt glutaraldehyd, et vanlig middel som anvendes for å tverrbinde og uløseliggjøre collagen i mange anvendelsesområder. Utlutning av glutaraldehyd fra tverrbundet collagen har vist seg å være cytotoksisk overfor celler, spesielt fibroblaster (Speer et al., J. Biomedical Materials Research 14, 753, 1980; Cooke et al., British J. Exp. Path. 64, 172, 1983). Nylige undersøkelser antyder at glutaraldehydpoly-merer og ikke monomert glutaraldehyd danner tverrbindinger mellom collagenmolekylene, og disse tverrbindinger kan deretter omordnes for å frigi fritt glutaraldehyd og glutar-aldehydpolymerer (Cheung, D.T. og Nimni, M.C., Connective Tissue Research 10, 187-217, 1982).

Mål med oppfinnelsen

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar matriks.

Et annet mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en

ny collagen-basert matriks.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny collagen-basert matriks i svamp- eller arkform.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar matriks impregnert med en bærerforbindelse.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med en bærerforbindelse.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med en bærerforbindelse i svamp- eller arkform.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med en bærerforbindelse og som er ikke-toksisk og i stand til å aktivere cellevekst.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med

en bærerforbindelse for regulert frigivelse av legemidler.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med en bærerforbindelse for topisk administrering til ytre sår.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny bionedbrytbar collagen-basert matriks impregnert med en bærerforbindelse for administrering til indre sår.

Sammendrag av oppfinnelsen

Disse og andre mål med oppfinnelsen oppnås ved en ut-førelsesform ved dannelse av en svamp eller et ark av et collagen-basert materiale innbefattende et collagen valgt fra gruppen bestående av type I, II og III collagener, hvilken svamp eller ark bringes i kontakt med et tverrbindingsmiddel valgt fra gruppen bestående av et carbodiimid eller en succinimidyl-aktiv ester under dannelse av en collagen-basert mellomproduktmatriks som deretter underkastes betingelser med streng dehydratisering under dannelse av en collagen-basert matriks i svamp- eller arkform. I en annen utførelsesform underkastes først svampen eller arket av det collagen-baserte materiale betingelser med streng dehydratisering, hvoretter den således dannede collagen-baserte mellomproduktmatriks bringes i kontakt med en carbodiimid-tverrbindende forbindelse under dannelse av den collagen-baserte matriks i svamp- eller arkform. I en ytterligere . utførelsesform av oppfinnelsen blandes tverrbindingsmidlet med det coliagen-baserte materiale før dannelse av den collagen-baserte intermediære svamp eller ark, etterfulgt av bearbeidelsestrinnene med streng dehydratisering. I en særlig foretrukket form av oppfinnelsen inkorporeres en bærerforbindelse.under bearbeidelsen under dannelse av en collagen-basert matriks i svamp- eller arkform, impregnert med en bærerforbindelse, hvori bærerforbindelsen er valgt fra gruppen bestående av collagen av type IV og V, fibronectin, laminin, hyaluronat, proteoglycan, epidermisk vekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, angiogenesefaktor, antibiotika, antifungale midler, spermicidale midler, enzymer og enzyminhibitorer.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

De collagen-baserte bærersystemer ifølge oppfinnelsen

er basert på anvendelse som utgangsmateriale av et løselig eller uløselig collagen valgt fra gruppen bestående av collagener av type I, Il og III og blandinger derav.

Løselige collagener av type I, II og III fremstilles

ved begrenset enzymatisk oppslutning av vev anriket i slike collagentyper og omdannes til en collagen-basert løsning (dvs. et løselig collagen oppløst i et egnet løsningsmiddel slik som fortynnet saltsyre, fortynnet eddiksyre eller lignende) .

Uløselige collagener er avledet fra følgende typiske kilder: type I collagen; kveg, kylling og fiskeskinn, kveg og kyllingsener og kveg og kyllingben innbefattende foster-vev; type II collagen: kvegleddbrusk, neseskillevegg, ribbensbrusk; og type III collagen: kveg- og human-aorta og hud.

I en utførelsesform av oppfinnelsen underkastes en collagen-basert løsning eller et uløselig collagen dispergert og svellet i et egnet væskemedium (f.eks. fortynnet saltsyre, fortynnet eddiksyre eller lignende) en temperatur på mellom 0 og -100°C for derved å bringe det collagen-baserte materiale i fast form. Etter at det collagen-

baserte materiale er bragt i fast form, underkastes det et vakuum på mindre enn 50 millitorr ved en temperatur på fra 22 til -100°C under dannelse av en collagen-basert svamp som skal bli bearbeidet ytterligere som beskrevet nærmere i det etterfølgende. Generelt anvendes et vektforhold mellom løselig eller uløselig collagen og løsningsmiddel eller dis-persjonsmiddel på fra 1 til 10.000 eller fra 1 til 15 for å danne den collagen-baserte løsning eller dispersjon.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen tørkes en slik collagen-basert løsning eller collagen-basert dispersjon i arkform før ytterligere bearbeidelse som beskrevet i det etterfølgende. Tørkingen utføres ved temperaturer på fra 4 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 48 timer.

For å danne en collagen-basert matrise ved en utfør-elsesform av oppfinnelsen bringes først en collagen-basert svamp eller ark i kontakt med et tverrbindingsmiddel valgt fra gruppen bestående av et carbodiimid eller N-hydroxysuccinimid-avledede estere (succinimidyl-aktive estere) etterfulgt av streng dehydratisering under dannelse av den collagen-baserte matriks. Eksempler på carbodiimidene innbefatter cyanamid og l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid. Eksempler på bifunksjonelle aktive succinimidylestere innbefatter bifunksjonelt N-hydroxysuccinimid, 3,3^-dithio-(sulfosuccinimidyl)-propionat og bis-(sulfosuccinimidyl)-suberat. Ved anvendelse av et carbodimid-tverrbindingsmiddel nedsenkes den collagen-baserte svamp eller ark i en carbodiimidløsning i en konsentrasjon på fra 0,1 til 10% (w/v) opprettholdt ved en temperatur på fra 2 til 40°C, og ved en pH på mellom 2 og 11 i et tidsrom på fra 2 til 9 6 timer. Ved anvendelse av et aktivt succinimidylester-tverrbindingsmiddel nedsenkes den collagen-baserte svamp eller ark i en løsning derav i en konsentrasjon på fra 0,1 til 15,0% (w/v) opprettholdt ved en temperatur på fra 2 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 9 6 timer. Den collagen-baserte svamp eller ark anbringes i en løsning inneholdende 0,1 til 15% (w/v) N-hydroxysuccinimid og carbodiimid ved en pH mellom 2 og 11 i et tidsrom på fra 2 til 96 timer ved en temperatur på fra 2 til 40°C. Den således behandlede, intermediære collagen-baserte matriks vaskes grundig for å fjerne overskudd av tverrbindingsmiddel.

Streng hydratisering av det collagen-baserte mellom-produkt innbefatter temperaturbetingelser på fra 50 til 200°C ved et vakuum på 50 millitorr eller mindre i et tidsrom på fra 2 til 9 6 timer under dannelse av den collagen-baserte matriks. Før streng dehydratisering bringes den collagen-baserte mellomproduktmatriks i svampform fortrinnsvis i fast form ved en temperatur på mellom 0 og -100°C, og underkastes deretter et vakuum på minst 50 millitorr ved en temperatur på mellom 22 og -100°C.

For å danne den collagen-baserte matriks under anvendelse av et carbodiimld-tverrbindingsmiddel kan i en annen

I

utførelsesform av oppfinnelsen den strenge dehydratisering utføres under dannelse av en collagen-basert mellomproduktmatriks før en slik collagen-basert mellomproduktmatriks

bringes i kontakt med et slikt tverrbindingsmiddel.

For å danne den collagen-baserte matriks ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen forblandes tverrbindingsmidlet med det collagen-baserte matriale før tørking eller starten av frysetørkings-bearbeidelsestrinnene.

Den collagen-baserte matriks fremstilt i henhold til oppfinnelsen, kan beskrives som en "korall-lignende" eller "stillaslignende" struktur med mellomrom med en porestørrelse på > fra 3 til 100 , um, og med en molekylvekt på fra 10 x 10<6>

/ g til mere enn 50 x 10 og med en molekylvekt mellom tverr-bindingene på fra 1.000 til 100.000 via dannelsen av covalente bindinger.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er innarbeidelse av en bærerforbindelse i den collagen-baserte matriks.

En slik bærerforbindelse er valgt fra gruppen bestående av collagen type IV og V, fibronectin, laminin, hyaluronat, proteoglycaner, epidermisk vekstfaktor, blodplate-avledet vekstfaktor, angiogenesefaktor, antibiotikum, antifungalt middel, spermacidalt middel, hormon, enzym og enzyminhibitor.

Generelt kan bærerforbindelsen innføres på et hvilket

som helst tidspunkt under bearbeidelsen av det collagen-baserte materiale til den collagen-baserte matriks i svamp-eller arkform. Fortrinnsvis innarbeides bærerforbindelsen før det løselige eller uløselige collagen bringes i fast form ved dannelse av den collagen-baserte mellomproduktmatriks, eller før den collagen-baserte mellomproduktmatriks bringes i fast form før den strenge dehydratisering. Bærer-materialene tilsettes i en mengde på fra 1 til 30 (w/w) basert på vekten av løselig eller uløselig collagen. Generelt innarbeides bindevevfaktorer slik som fibronectin, collagen

av type IV og V; laminin, glycosaminoglycaner og hyaluronat under de første bearbeidelsestrinn ved dannelse av den collagen-baserte svamp, eller etter tverrbindihg av den collagen-baserte mellomproduktmatriks. Det er fordelaktig å

innarbeide fibronectin og hyaluronat under dannelse av den

collagen-baserte mellomproduktmatriks.

Det er mange kilder for forskjellige bærerforbindelser for innarbeidelse i den collagen-baserte matriks som utgjør en utførelsesform av oppfinnelsen. Collagener av type IV og V finnes assosiert med basalmembraner og glattmuskelceller i vev. Typiske kilder for type IV innbefatter EHS muse-sarcomatumor, kveg og human placenta, linsekapsel og nyre; kilder for type V collagen innbefatter placentamembraner, okularvev og fosterhud (se f.eks. Trelstad, In Immuno-chemistry of the Extracellular Matrix, vol. 1, redigert av H. Furthmayr, CRC Press, kapittel 2, 1982) .

Typiske kilder for proteoglycaner innbefatter kveg- og human brusk og synovialvæske, neseskillevegg og ribbensbrusk, og hud. Typiske kilder for glycoproteiner innbefatter EHS tumor, kveg- og humane nyrer, brusk, ben og placenta såvel som blod fra kveg og mennesker. Typiske kilder for hyaluronat innbefatter haneskjell og glasslegeme fra kveg.

Foretrukne bærerforbindelser for den collagen-baserte matriks innbefatter fibronectin, laminin, type IV collagen og komplekser av hyaluronat og proteoglycaner. En verdi for svellingsforholdet på mellom 2,5 til 5 er nødvendig for en collagen-basert matriks som kommer i kontakt med åpne sår, mens et svellingsforhold på mellom 2,5 til 10 er anvendbart for en collagen-basert matriks innbefattende bærerforbindelser for subkutan implantasjon. Svellingsforholdet defineres som volumet av absorbert vann pr. volumenhet av collagen-basert matriks.

Når det gjelder innvendige sår og korttidsfrigivelse

av legemiddel, anbringes den collagen-baserte matriks innbefattende en bærerforbindelse i form av et ark eller en slange i direkte kontakt med vev.

Bionedbrytningshastigheten og frigivelseshastigheten kan reguleres ved variasjon av tverrbindingsdensiteten. For anvendelsesområder hvori langvarig frigivelse ønskes, påføres et ikke-porøst diffusjonslag av en bionedbrytbar polymer

slik som poly-3-(hydroxybutyrat) på hver side av den collagen-baserte matriks. For materialer som skal anvendes på kjøtt-sår, anbringes et diffusjonskontrollag slik som beskrevet i

det tidligere angitte US patent tilhørende Yannas, for å forhindre diffusjon av vann eller andre små flyktige molekyler fra den collagen-baserte matriks, idet diffusjonskontrollaget må adhere tett til det collagen-baserte matrikslag. Kombinasjonen av collagen-basert matrikslag og diffusjonskontrollag må være sterk nok til å kunne syes og må ha en strekkstyrke på minst 7 kg/cm og må være i stand til å deformeres til minst 10% før sammenbrudd. Syntetiske ikke-bionedbrytbare polymerer slik som silikonpolymerer (Silastic Medical Grade Adhesive) eller bionedbrytbare polymerer slik som poly-melkesyre, polyglycolsyre, poly-3-(hydroxybutyrat)

og copolymerer av disse materialer, kan anvendes som diffusjonskontrollaget.

Silikonpolymerer er foretrukne materialer for å kon-trollere diffusjonsgraden av små molekyler. Herding av klebemidlet i diffusjonskontrollaget kan finne sted uten fukting av bærerforbindelsen i den collagen-baserte matriks ved tørking ved romtemperatur. En film med tykkelse på 0,5 til 1,5 mm påføres matrikslaget og tillates å herde ved romtemperatur i minst 2 timer under anvendelse av et vakuum på 35,5 cm Hg.

Tykkelsen av den collagen-baserte matriks kan varieres fra 1 til flere hundre mm. For kjøttsår er en tykkelse på 2 til 3 mm ønskelig og muliggjør nær kontakt mellom bærerforbindelsen i den collagen-baserte matriks og sårskiktet.

Når den implanteres subkutant eller direkte på dermale kjøttsår, vil en hvilken som helst collagen-basert matriks

ifølge oppfinnelsen ikke stimulere den inflammatoriske prosess. I tillegg vil kronisk implantasjon resultere i fibroblast- og endothelial-cellemigrering inn i den collagen-baserte matriks. Nedbrytnings- og resorpsjonsgraden av

collagen-baserte matriser er som bestemt in vitro ved bestemm-else av den tid som 1 mg av materialet motstår oppløselig-gjøring av 100 enheter av bakteriell collagenase. En enhet av collagenase frigir aminosyrer i collagen ekvivalent med 1,0 mikromol L-leucin i løpet av 5 timer ved 37°C. En kom-binasjon av dannelse av succinimidyl-aktiv ester og streng dehydratisering eller carbodiimidbehandling og streng

dehydratisering øker collagenase-resistenstiden signifikant i forhold til den som observeres ved en hvilken som helst av de tidligere anvendte prosedyrer. Disse studier indikerer at tvérrbindingsmetodene ifølge oppfinnelsen resulterer i resistens overfor collagenasenedbrytning og viser ingen stimulering av inflammasjon.

Eksempler på oppfinnelsen

De etterfølgende eksempler illustrerer betingelser for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og det skal forstås at oppfinnelsens ramme ikke derved begrenses.

Eksempel 1

Fremstilling av løselige og uløselige collagener

Det anvendte collagen ble fremstilt fra kalvehud etter at narvelaget var fraskilt fra lærhuden eller dermis. Lærhuden ble kuttet i biter, vasket, svellet, frysetørket og lagret ved -20°C. Løselig collagen ble erholdt ved å an-bringe 250 g av det frysetørkede, uløselige collagen i 1,5 1 HCl ved en pH på 2,5 inneholdende 1,5 g krystallinsk pepsin (Sigma Chemical Company). Blandingen ble omrørt over natten ved 4°C og ble deretter filtrert gjennom et osteklede, Whatman filterpapir nr. 4 etterfulgt av Whatman filterpapir nr. 42, Gelman 5 ,um filter og l,2^um filter og til slutt gjennom Millipore® 0,65^um og0,45^um filtere. Den løselige fraksjon erholdt etter sekvensfiltrering, inneholdt collagener av type I, III og V. Den løselige collagenfraksjon ble dialysert mot en 1,0 M NaCl-løsning inneholdende 50 mM tris justert til pH 7,5, og nok fast NaCl ble tilsatt for å heve molariteten på løsningen til 1,7. Bunnfallet ved 1,7 M NaCl er collagen av type III, og dette ble oppsamlet ved sentrlfugering ved 10.000 x g i 60 minutter og ble deretter dialysert mot 0,005 M eddiksyre, frysetørket og lagret ved

-20°C. Til supernatanten ble det tilsatt tilstrekkelig NaCl for å heve molariteten til 2,5 M, og bunnfallet (collagen av type I) ble pelletisert ved sentrifugering, dialysert mot 0,005 M eddiksyre, frysetørket og lagret ved -20°C. Den

gjenværende supernatant inneholdt collagen av type V og ble dialysert mot 0,005 M eddiksyre, ble frysetørket og lagret ved -20°C.

Uløselige collagenløsninger ble erholdt ved disperger-ing av oppmalt, frysetørket lærhud under anvendelse av en Wiley-mølle i HC1 ved pH 2,5. Det svellede collagen ble deretter dialysert mot 0,005 M eddiksyre og ble frysetørket.

Hvis hud fra voksent kveg er kilden for lærhuden, er det frem-stilte, uløselige collagen typisk type I.

Løselig collagen av type IV ekstraheres fra EHS muse-sarcomatumor etter vasking av tumoren i kaldt, destillert vann 3 ganger ved sentrifugeringsfiltrering ved 10.000 x g i 30 minutter. Pelletten (0,500 g) ble homogenisert i 0,5 1 0,5 M eddiksyre justert til pH 2,5 med HC1, og 0,5 g pepsin ble tilsatt. Homogenatet fikk blandes ved 4°C i 24 til 48 timer, ble filtrert gjennom et osteklede, sentrifugert ved 10.000 x g i 30 minutter. Pelletten ble resuspendert i

0,5 M NaCl inneholdende 50 mM tris, NaCl ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 4,5 M ble erholdt, hvorpå blandingen ble sentrifugert ved 10.000 x g i 30 minutter, hvoretter

pelletten ble dialysert mot 0,1 N eddiksyre 3 ganger og ble frysetørket.

Eksempel 2 Fremstilling av kvegserum- fibronectin

80 ml friskt uttrukket kvegblod ble oppsamlet i et polypropylenrør inneholdende 20 ml 5% trinatriumcitrat og

0,1 mM fenylmethylsulfonylfluorid. Blodet ble sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter, og plasmaet ble deretter separert

fra cellelaget og ble ytterligere sentrifugert ved 30.000 x g ved en temperatur på 15°C i 30 minutter. Til plasmaet ble deretter tilsatt ytterligere 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid og ble deretter helt gjennom en gelatin-sefarosekolonne. Kolonnen ble vasket med en fosfatbufferløsning (0,182 M fosfat og 0,145 M NaCl), 2 kolonnevolumer 1 M NaCl i en fosfatbuffer, 2 kolonnevolumer fosfatbufferløsning, 2 kolonnevolumer 4 M urea i en fosfatbuffer. Den optiske densitet av kolonnefraksjonene ble overvåket ved en bølgelengde på

280 nm hvor hovedmengden av fibronectinet normalt er til stede i fraksjoner inneholdende 4 M urea. Fibronectinholdige fraksjoner med optiske densiteter større enn 0,1 ble dialysert mot 0,180 M fosfatbuffer inneholdende 0,145 M NaCl (pH 7,2). Prøven ble deretter dialysert mot 0,05 M tris-HCl inneholdende 4,5 M urea (pH 7,2) og ble anbragt på en DEAE (diethyl-aminoethylcellulose) ionebytterkolonne ved romtemperatur. Kolonnen ble eluert med en 0 til 0,3 M lineær NaCl-gradient

i en 0,05 M tris-HCl bufferløsning (pH 7,2) inneholdende 4,5 M urea. Det eluerte fibronectin ble dialysert mot 0,180 M fosfat inneholdende 0,145 M NaCl og 1,0 M urea og ble fryst ved -20°C.

Eksempel 3

Fremstilling av laminin

Laminin ble fremstilt fra lathrytisk EHS-tumorer dyrket i C57/6J mus. Tumorene ble dissekert og homogenisert i 3,4 M NaCl inneholdende 50 mM tris-HCl justert til pH 7,4 og proteaseinhibitorer.Homogenatet ble sentrifugert ved 16.000 x g i 60 minutter, og pelletten ble oppsamlet og resuspendert i 3,4 M NaCl. Etter sentrifugering ved 16.000 x g i 60 minutter en ytterligere gang ble homogenatet resuspendert i 0,5 M NaCl inneholdende 50 mM tris-HCl, pH 7,4, og proteaseinhibitorer, og ble omrørt i 18-24 timer ved 4°C, etterfulgt av sentrifugering ved 16.000 x g i 60 minutter. Supernatanten ble bragt til 3,5 M ved tilsetning av fast NaCl, ble omrørt over natten ved 4°C, hvorpå bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering. Laminin ble ytterligere renset ved reoppløsning i 0,5 M NaCl inneholdende 50 mM tris-HCl, pH 7,4, etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 x g i

60 minutter, hvorpå supernatanten ble dialysert mot 2 M urea inneholdende 2,5 NaCl og 50 mM tris-HCl, pH 8,6, og ble kromatografert over en 2,5 x 2,5 cm kolonne inneholdende DEAE cellulose ekvilibrert med samme buffer ved 4°C. Den ubundne fraksjon ble dialysert mot 2 M urea inneholdende 50 mM tris-HCl, pH 8,6, og ble rekromatografert på DEAE-kolonnen ekvilibert med samme buffer. Den ubundne fraksjon ble konsentrert ved vakuumdialyse og ble kromatografert på

(r)

SephacrylV C-300 ekvilibrert med 1,0 M CaCl2, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, ved 22°C, og hulvolumet ble oppsamlet og dialysert mot 0,4 M NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,4, og ble lagret ved 4°C. Laminin ble oppløst på nytt i 0,1 M ammoniumhydroxyd, pH 11,0, hvorpå pH ble justert til 7,2.

Eksempel 4

Fremstilling av collagen- baserte svamper og ark

1,2 g løselig eller uløselig collagen ble tilsatt til 120 ml av en fortynnet HCl-løsning med pH 3,0, og blandingen ble malt i en Waring blander ved lav hastighet i 1 minutt og deretter ved høy hastighet i 1 minutt. Løsningen eller dispersjonen ble deretter helt over i en vakuumkolbe og ble avluftet ved et vakuum på 100 millitoll i 10 minutter. Collagendispersjonen eller løsningen som skal omdannes til svamper, ble avkjølt til 0°C og fryst ved -100°C før fryse-tørking ved -65°C under et vakuum på mindre enn 10 millitorr. Collagendispersjonen eller løsningen som skulle bearbeides

til ark, ble anbragt i et sterilt avtrekksskap og fikk luft-tørke i 24 til 48 timer ved 22°C.

Eksempel 5 Fremstilling av succinylert, succinimidylester-tverrbundet, intermediær collagen- basert matriks

9 g ravsyreanhydrid ble oppløst i 80 ml destillert

vann og ble blandet i 30 minutter ved 37°C. Etter at ravsyreanhydrid forelå i løsning, ble pH justert til 7,2, og volumet ble bragt til 100 ml. Denne løsning ble anbragt i en Waring blander, og 1,0 g collagen ble tilsatt, blandingen ble malt

i 2 minutter og fikk stå ved 22°C i 1 time og ble deretter

anbragt på et Whatman filterpapir nr. 4 for å fjerne uomsatt ravsyreanhydrid, og ble deretter vasket med 100 ml destillert vann.

Residuet ble anbragt i en løsning av 20 ml fosfatbuffer (0,182 M fosfat og 0,145 M NaCl), og 2 g N-hydroxysuccinimid og 2 g cyanamid ble tilsatt. pH på løsningen ble

deretter justert til 7,2. Residuet fikk reagere i 3 timer

ved romtemperatur og ble deretter vasket med destillert vann i en Buchner-trakt under et vakuum på 35,5 cm kvikksølv.

Ark og svamper av de succinylerte, succinimidylester-tverr-bundne, intermediære collagen-baserte matriser ble fremstilt 1 henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 6

Fremstilling av collagen-basert matriks inneholdende fibronectin

Til 1,2 g løselig eller uløselig collagen i 120 ml HCl, pH 3,0, ble tilsatt 0,12 g fibronectin (2,5 mg fibronectin/ml) i 0,1 M urea inneholdende 0,182 M fosfat og 0,145 M NaCl, og blandingen ble dispergert i en Waring blander i 2 minutter. Ark og svamper ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 7

Svamper og ark dannet med belegg av collagen type I med laminin, fibronectin og collagen av type IV

Collagenark og svamper dannet i henhold til eksempel 4 og 6, ble svellet i 0,1 ammoniumacetat, pH 7,2, inneholdende 1 til 5% laminin, fibronectin eller collagen av type IV.

Den svellede svamp eller ark ble deretter fryst og fryse-tørket ved -6 5°C i et vakuum på mindre enn 50 millitorr.

Eksempel 8

Fremstilling av collagen-basert matriks inneholdende hyaluronat og proteogycan

Til 1,2 g løselig og uløselig collagen i HCl, pH 3,0, ble tilsatt 0,12 g av et kompleks av hyaluronat og proteoglycan (Sigma Chemical Company Grade III-P) i HCl, pH 2,0, til et sluttvolum på 120 ml.Blandingen ble dispergert i en Waring blander og ble enten frysetørket eller lufttørket

i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 9

Fremstilling av collagen-basert matriks inneholdende collagen av type IV

Til 1,2 g løselig eller uløselig collagen av type I iHCl, pH 2,0, ble tilsatt 0,012 g collagen av type IV i 0,1 M ammoniumacetat, pH 7,2, til et sluttvolum på 120 ml. Blandingen ble dispergert i en Waring blander i 2 minutter og ble formet til ark eller svamper i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 10 Cyanamid- tverrbinding av collagen- basert matriks

Produktet ifølge eksempel 4 og 6 til 9 ble tverrbundet ved nedsenkning i en vandig løsning inneholdende 1 vekt% cyanamid ved pH 5,5 i 24 timer ved 22°C. Etter fjerning fra badet ble svampene og arkene grundig vasket i flere por-sjoner vann i løpet av 24 timer, ble fyst og frysetørket ved -65°C i et vakuum på mindre enn 50 millitorr.

Eksempel 11 Tverrbinding av collagen-basert matriks ved streng dehydratisering

Produktene ifølge eksempel 4 og 6 til 10 ble anbragt 1 en vakuumovn ved romtemperatur og utsatt for et vakuum på

mindre enn 50 millitorr. Etter 1 time ble prøvene oppvarmet til 110°C og holdt ved denne temperatur i 7 2 timer på hvilket tidspunkt temperaturen ble nedsatt til 40°C. Prøvene ble

deretter fjernet fra vakuumovnen og lagret ved -20°C.

Eksempel 12 Tverrbinding av collagen-basert matriks under anvendelse av succinlmidyl- aktiv ester

2 g collagen tverrbundet med succinimidyl-aktiv ester fremstilt i henhold til eksempel 5, ble anbragt i en Waring

blander inneholdende 400 ml HCl, pH 2,0, og dispergert i 2 minutter. Denne blanding ble avluftet ved at den ble anbragt i et vakuum på 300 millitorr og deretter anbragt ved

romtemperatur i et miljø med 100% relativ fuktighet i 24 timer. Materialet ble deretter avkjølt til 0°C, fryst og frysetørket ved -6 5°C under anvendelse av et vakuum på mindre enn 50 millitorr, eller ble lufttørket for dannelse av hhv. svamper eller ark.

Eksempel 13

Fremstilling av collagen-basert matriks inneholdende proteaseinhibitorer

Svamper og ark fremstilt i henhold til eksempel 4 til 9, ble anbragt i 20 ml HCl ved pH 2,0, inneholdende 25% cystein eller 0,1% (w/v) a-2-macroglobulin. Blandingen ble fryst og frysetørket ved -65°C ved et vakuum på mindre enn 50 millitorr, eller ble lufttørket ved romtemperatur.

Eksempel 14

Enzymatisk nedbrytning in vitro

1 cm 2 av hvert av produktene i de foregående eksempler ble anbragt i 2,0 ml 10 mM tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 25 mM calciumklorid og 100 enheter av collagenase av type IV fra Clostridium histolyticum (Sigma Chemical Co.) ble tilsatt pr. mg prøve. Prøvene ble anbragt i omgivelser ved 37°C, og intaktheten av hver prøve ble kontrollert visuelt hvert 10. minutt. Tiden ble nedtegnet når hver prøve var visuelt blitt nedbrutt til biter som var mindre enn 0,5^,um. Resultatene er oppført i tabell I.

Eksempel 15 In vitrobestemmelse av svelleforhold

Svelleforholdet av denaturert collagen er omvendt

beslektet med tverrbindingsgraden. Produktene ifølge de ovenfor angitte eksempler ble kokt i 2 minutter i destillert vann og ble anbragt mellom to servietter. En vekt på 1 kg ble anbragt på toppen av serviettene inneholdende materi-alene i 20 sekunder. Våtprøvevekten ble nedtegnet, og prøven ble deretter tørket ved 110°C i 3 timer. Etter tørking ble vekten igjen nedtegnet, og svelleforholdet (r) ble beregnet fra følgende ligning:

I

DW og WW er tørr- og våt-vektene, P_ og<p>H2<q>er material- og vanndensiteter. Resultatene er angitt i den ovenfor angitte

tabell I.

Eksempel 16 Mekaniske egenskaper av collagen- baserte matriser

Svamper og ark fremstilt i henhold til de ovenfor angitte eksempler, ble kuttet i rektangulære (4,0 cm x 1,0 cm) remser og nedsenket i fosfatbufferløsning ved pH 7,5 i 20 minutter før mekanisk testing. Remsene ble testet i uni-aksialt strekk ved 22°C i en belastningsgrad på 10%/minutt under anvendelse av en Instron® testanordning modell 1122. Endene av remsene ble anbragt i pneumatiske gripeanordninger som ble lukket under et trykk på 2,8 kg/cm 2 med en målelengde på 20 mm. Spenning-belastningskurver ble erholdt, fra hvilke Youngs modul ved høye (HSM) og lave belastninger ble beregnet. Belastningen ved hvilken området med lav modul sluttet, ble angitt som eT, og belastningen ved svikt ble angitt som e_. Belastningsresultåtene er angitt i tabell I.

Eksempel 17

Subkutan bioforenelighet av collagen- basert matriks

Svamper og ark fremstilt i henhold til de ovenfor angitte eksempler, ble testet med hensyn til subkutan bioforenelighet etter sterilisering ved eksponering av 2,5 M rad gammabestråling. Implantering ble foretatt under sterile betingelser under anvendelse av 3 50 g hvite hunnmarsvin som testdyr.

Et 1 cm kutansnitt ble foretatt på en side av ryggen, og huden ble skilt fra muskelhinnelaget, og en 1 cm x 1 cm bit av implantat ble anbragt i dette rom. Kantene av huden ble festet sammen over implantatet under anvendelse av sår-klips.

Dyrene ble avlivet på den 6., 9. og 12. dag etter implantering, og vevet inneholdende bæreren, ble anbragt i Carsons fiksativ og bearbeidet for histologiske studier. Resultatene er angitt i etterfølgende tabell II.

Eksempel 18

Fremstilling av diffusjonskontrollag på et matrikslag

Under anvendelse av svamper og ark fremstilt i henhold til eksempel 4 til 10, ble et 1 mm lag av Silasti<_®>Medical Grade klebemiddel påført på overflaten av matrikslaget under anvendelse av en spatel. Diffusjonskontrollaget ble herdet ved påføring av et vakuum på 100 millitorr i et tidsrom på 2 timer ved 22°C. Det resulterende kompleks av diffusjonskontroll- og matrikslag ble anbragt i kontakt med dermale kjøttsår.

Eksempel 19

Bioforenelighet av diffusjonskontroll- og matrikslag på dermale kjøttsår

Svamper og ark fremstilt i henhold til eksempel 18,

ble testet etter bestrålingssterilisering som forbindings-materialer på åpne dermale sår på hvite Hartley albino hunnmarsvin med en vekt på 350 g. Hvert dyr ble separat f6ret og veiet i 4 dager før testing. En dag før testing ble dyrene barbert under anvendelse av en elektrisk klipper etterfulgt av hårfjerningsbehandling med "Nair" og vasket. Dyret ble deretter bedøvet ved eksponering for ether, og ryggen ble vasket med povidon-jod og alkoholløsninger. En 2 cm x 2 cm bit av materiale sammensatt av matriks og diffusjonskontrollag oppbløtet i en fosfatbufferløsning (0,182 M fosfat og 0,154 M NaCl) ble anbragt på et dermalt kjøttsår med samme størrelse med matrikslaget mot panniculus carnosus. Matriks- og diffusjonskontrollagene ble sydd til sårskiktet ved kantene av forbindingen under anvendelse av kromgarvet tarmstreng. Dyret ble bandasjert ved at en steril bomulls-forbindingssvamp ble anbragt oversårforbindingen og deretter omviklet med en "Elasticon" elastisk tape (Johnson and Johnson Products, Inc.) festet rundt nakken. 3 dyr ble anbragt i et bur under forsøket.

Dyrene ble overvåket daglig, og deres bandasjer ble undersøkt med hensyn til flenger. Dyrene ble avlivet på den 6., 9. og 12. dag etter implantasjon, og implantatet og sårskiktene ble skåret ut, fiksert og bearbeidet for histo-logisk undersøkelse. Disse resultater er angitt i tabell III.

Utallige modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse er mulig i lys av den ovenfor angitte lære, og oppfinnelsen kan således utøves på andre måter enn hva som spesielt er beskrevet, men innen rammen for de etterfølgende krav.

Claims

I 1. Fremgangsmåte for fremstilling av en ny collagen-basert matriks, karakterisert ved at a) et collagen valgt fra gruppen bestående av collagen av type I, II og III, blandes med et væskeformig medium under dannelse av et collagen-basert substrat;

b) et tverrbindingsmiddel valgt fra gruppen bestående av et carbodiimid og en bifunksjonell succinimidyl-aktiv ester innføres i produktet fra trinn a); og

c) produktet fra trinn b) underkastes forhøyet temperatur under et vakuum, under dannelse av angitte collagen-baserte matriks.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

karakterisert ved at trinn c) utføres før trinn b).
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert , ved at angitte væskeformige medium er et løsningsmiddel for angitte collagen.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at angitte væskeformige medium er et dispergeringsmiddel for angitte collagen.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,

i karakterisert ved at tverrbindingsmidlet

er angitte carbodiimid og foreligger i løsning i en konsentrasjon på fra 0,1 til 10% (w/v).
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,

karakterisert ved at carbodiimidløsningen og det collagen-baserte substrat opprettholdes ved en temperatur på fra 2 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 96 timer før ytterligere bearbeidelse.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,

karakterisert ved at angitte carbodiimid-løsning foreligger ved en pH på fra 2 til 11.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,

karakterisert ved at angitte tverrbindingsmiddel er angitte bifunksjonelle succinimidyl-aktive ester og foreligger i løsning i en konsentrasjon på fra 0,1 til 15,0% (w/v).
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,

karakterisert ved at angitte bifunksjonelle succinimidyl-aktive esterløsning og angitte collagen-baserte substrat opprettholdes ved en temperatur på fra 2 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 96 timer før ytterligere bearbeidelse.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,

karakterisert ved at overskudd av tverrbindingsmiddel fjernes før trinn c).
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,

karakterisert ved at trinn c) utføres ved en temperatur på fra 50 til 200°C ved et vakuum på mindre enn 50 millitorr.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,

karakterisert ved at trinn c) utføres i et tidsrom på fra 2 til 9 6 timer.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,

karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat underkastes frysetørking før trinn b) ved angitte fremgangsmåte for dannelse av en collagen-basert matriks i svampform.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,

karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form før frysetørkingstrinnet.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at frysetørkingstrinnet utføres under et vakuum på mindre enn 50 millitorr og ved en temperatur på fra 22 til -100°C.
i 16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form ved en temperatur på fra 0 til -100°C.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at angitte intermediære collagen-baserte matriks underkastes frysetørking før trinn c) .
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at angitte intermediære collagen-baserte matriks bringes i fast form før frysetørking før trinn c).
19. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at frysetørkingstrinnet utføres under et vakuum på mindre enn 50 millitorr og ved en temperatur på fra 22 til -100°C.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form ved en temperatur på fra 0 til -100°C.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat tørkes før trinn b) ved angitte metode for dannelse av en collagen-basert matriks i arkform.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at tørkingen utføres ved en temperatur på fra 4 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 96 timer.
23. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at en bærerforbindelse innføres i angitte collagen-baserte matriks under dannelse av angitte collagen-baserte matriks, hvilken bærerforbindelse er valgt fra gruppen bestående av collagen av type IV,

type V, fibronectin, laminin, hyaluronat, proteoglycan, epidermisk vekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, angiogenesisfaktor, antibiotika, antifungale midler, spermacidale midler, enzymer og enzyminhibitorer.
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat underkastes frysetørking før trinn b) ved angitte metode for dannelse av en collagen-basert matriks i svampform.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form før frysetørkings-trinnet .
26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at frysetørkingstrinnet utføres under et vakuum på mindre enn 50 millitorr og ved en temperatur på fra 22 til -100°C.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form ved en temperatur på fra 0 til -100°C.
28. Fremgangsmåte ifølge krav 24 , karakterisert ved at angitte intermediære collagen-baserte matriks underkastes frysetørking før trinn c).
29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at angitte intermediære collagen-baserte matriks bringes i fast form før fryse-tørking før trinn c).
30. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at frysetørkingstrinnet utføres under et vakuum på mindre enn 50 millitorr og ved en temperatur på fra 22 til -100°C.
31. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat bringes i fast form ved en temperatur på fra j0 til -100 °C.
32. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at angitte collagen-baserte substrat tørkes før trinn b) ved angitte metode for dannelse av en collagen-basert matriks i arkform.
33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at tørkingen utføres ved en temperatur på fra 4 til 40°C i et tidsrom på fra 2 til 9 6 timer.
34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at den ytterligere innbefatter trinn for overlegging av angitte collagen-baserte matriks i arkform med et diffusjonslag.
35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at angitte diffusjonslag er ikke-porøst.
36. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at angitte ikke-porøse diffusjonslag er bionedbrytbart.
37. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at angitte diffusjonslag er formet av en ikke-bionedbrytbar polymer.
38. Collagen-basert matriks dannet av et collagen valgt fra gruppen bestående av collagen av type I, II og III med en molekylvekt på minst 1,0 x 10^.
39. Collagen-basert matriks ifølge krav 38, karakterisert ved at angitte molekylvekt er mer enn 50 x 10 .
40. Collagen-basert matriks ifølge krav 39, karakterisert ved at den har en molekylvekt mellom tverrbindinger på fra 1.000 til 100.000 via covalent binding.
41. Collagen-basert matriks ifølge krav 38, karakterisert ved at den har mellomrom med en porestørrelse på fra 3 til lOO^ um.
42. Collagen-basert matriks ifølge krav 38, karakterisert ved at den ytterligere innbefatter en bærerforbindelse valgt fra gruppen bestående av collagen av type IV, V, fibronectin, laminin, hyaluronat, proteoglycan, epidermisk vekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, angiogenesisfaktor, antibiotika, antifungale midler, spermacidale midler, enzymer og enzyminhibitorer.
43. Collagen-basert matriks ifølge krav 38 eller 42 i arkform .
44. Collagen-basert matriks ifølge krav 43 og ytterligere innbefattende et diffusjonslag.
45. Collagen-basert matriks ifølge krav 44 og ytterligere innbefattende et ikke-porøst diffusjonslag påført den ene eller andre side av angitte collagen-baserte matriks.
46. Collagen-basert matriks ifølge krav 45, karakterisert ved at angitte ikke-porøse diffusjonslag er bionedbrytbart.
47. Collagen-basert matriks ifølge krav 44, karakterisert ved at angitte diffusjonslag er festet tett til angitte collagen-baserte matriks.
48. Collagen-basert matriks ifølge krav 47, karakterisert ved at angitte collagen-baserte matriks og angitte diffusjonslag har en kombinert strekkstyrke på minst 7,03 kg/cm .
49. Collagen-basert matriks ifølge krav 47, karakterisert ved at angitte collagen-baserte matriks og angitte diffusjonslag har en deformasjon på minst 10%.
50. Collagen-basert matriks ifølge krav 43, karakterisert ved at den har et svelleforhold på minst 2,5.