NO861548L - Rekombinant dna-molekyl. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåte ved deres fremstilling. Mere spesielt vedrører oppfinnelsen rekombinante DNA molekyler uttrykt i passende verts-organismer. De aktuelle rekombinante DNA molekyler er særpreget ved DNA som koder for polypeptider som er spesifikke som hepa-

titt B viralantigener. Det vil forstås fra det etterfølgende at rekombinante DNA-molekyler kan anvendes ved påvisning av hepatitt B virus hos mennesker og for stimulering av dannelse av antilegemer i mennesker mot denne virus.

Virusen som forårsaker hepatitt B eller serum hepatitt synes

kun å infisere mennesker. Hepatitt B virus ("HBV") infeksjon hos mennesker har bred utbredelse. I England, USA og Vest-

Europa er ca. 0,1 % av alle blodgivere kroniske bærere av HBV.

Selv om dødsraten som følge av viral hepatitt ikke er høy (i

1975 var det i England 3 pr. million) er det visse indikasjoner på at så mange som 5 % av befolkningen i England er infisert og 15 % av befolkningen i USA er infisert. I mange afrikanske og asiatiske land er opp til 20 % av befolkningen kroniske bærere av HBV og over 50 % av alle voksne i disse land har vært eller er infisert med HBV.

Hepatitt infeksjonen overføres ved tre generelle mekanismer:

(1) ved parenteral inokulasjon av infisert blod eller kropps-væsker, enten i store mengder som ved blodoverføringer eller i meget små mengder via en tilfeldig hudavskrapning; (2) ved nær familie eller seksual kontakt; og (3) av visse mødre som ved infeksjon under svangerskapet overfører virusen til det nyfødte barn. Under naturlige betingelser er HBV ikke særlig smittsomt. Overføring ved inhalasjon skjer sjeldent, hvis overhodet.

Viktig informasjon

Av arkivmessige grunner har Patentstyret for denne allment tilgjengelige patentsøknad kun tilgjengelig dokumenter som inneholder håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, eller som kan være stemplet "Utgår" eller lignende. Vi har derfor måtte benytte disse dokumentene til skanning for å lage en elektronisk utgave.

Håndskrevne anmerkninger eller kommentarer har vært en del av saksbehandlingen, og skal ikke benyttes til å tolke innholdet i dokumentet.

Overstrykninger og stemplinger med "Utgår" e.l. indikerer at det under saksbehandlingen er kommet inn nyere dokumenter til erstatning for det tidligere dokumentet. Slik overstrykning eller stempling må ikke forstås slik at den aktuelle delen av dokumentet ikke gjelder.

Vennligst se bort fra håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, samt eventuelle stemplinger med "Utgår" e.l. som har samme betydning.

De fleste HBV infeksjoner er ikke hospitaliserende. Den kliniske sykdom varer vanligvis 3-6 uker og kan variere i alvorlighet fra mild til akutt utbrytende hepatitt etterfulgt av cirrhose eller død. Bedring fra hospitaliserende og ikke hospitaliserende HBV infeksjoner er vanligvis fullstendig. Imidlertid kan lang-tids effekter oppstå i visse tilfeller:

(1) ca. 5 % av de akutte infeksjoner fører til kronisk bæring

av hepatitt B virusantigen.og derav følgende bestående poten-sial for infisering av andre og vedvarende leverødeleggelse og (2) det er trolig at en tidligere infeksjon med HBV kan helt eller delvis være skyld i initiering av en signifikant andel av HBV-seronegative tilfeller av kronisk aktiv hepatitt, cirrhose og primære levercacinoma.

Nylige fremskritt innen den molekylære biologi har gjort det mulig å innføre DNA-koding for spesifikke, ikke-bakterielle eukarytt proteiner til bakterieceller. Generelt for DNA, andre enn de som er fremstilt via kjemisk syntese,som omfatter kon-struksjonen av rekombinante DNA-molekyler,fremstilling av en en-båndet DNA-kopi (cDNA) av en renset bærer (messenger) (mRNA) for det ønskede protein, omdanne cDNA til dobbel-båndet DNA, forbinde DNA til et passende sted i en passende klonebærer og overføre en passende vert med det rekombinante DNA-molekyl. Denne transformasjon tillater at verten produserer det ønskede protein. I tillegg er det i det minste for tilfelle av egg-albumin DNA kjent at passende sammensmeltning av det spesielle DNA til en sterk bakteriell promoter eller uttrykkskontrollsekvens danner store mengder av det ønskede egg-albuminprotein, eksempelvis 0,5 - 1 % av den totale proteinmasse av en E.Coli-celle (0. Mercereau-Puijalon et al., "Synthesis Of An Ovalbumin-Like Protein By Escherichia coli K12 Harboring A Recombinant Plasmid", Nature, 275, s. 505-510 (1978) og T.H. Fraser og

B.J. Bruce, "Chicken Ovalbumin Is Synthesized And Secreted

By Escherichia coli", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, s. 5936 - 5940 (1978)).

Flere ikke-bakterielle proteiner og gener er syntisert under anvendelse av rekombinant DNA teknologi. Disse innbefatter et protein som utviser rotteproinsulin antigene determinanter

(L. Villa-Komaroff et al., "A Bacterial Clone Synthesizing Pro-insulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, s. 3727-3731 (1978)), rotteveksthormon (P.H. Seeburg et al., "Synthesis Of Growth Hormone By Bacteria", Nature, 276, s. 795-798 (1978)), mus dihydrofolate reduktase (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic Expression in E. coli Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, s. 617-624 (1978)), somatostatin (K. Itakura et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chmically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science, 198, 1056-1063 (1977), Britiske patentbeskrivelser 2,007,675A, 2,007,676A og 2,008,123A og kombinerte søknader i andre land), og A og B polypeptidkjedene av menne-skeinsulin (D.V. Goeddel et al., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin",

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, s. 106-110 (1979) , samt de ovenfor nevnte Engelske og avlede patentbeskrivelser).

Ingen av de ovenfor nevnte henvisninger vedrører foreliggende oppfinnelse som er rettet på rekombinant DNA-syntese av virale proteiner så som hepatitt B virusantigener.

Det er kjent at HBV-infeksjoner forårsaker utvikling av antilegemer til virusens antigener. Disse antilegemer er legemets forsvarsmekanisme mot HBV-infeksjon. Utvikling av slike antilegemer før smitte eller raskt i det tilfelle hvor potensiell smitte kan oppstå skulle vesentlig redusere og bekjempe virus-vekst og spredning i pasienten.

Imidlertid et problem ved kunstig stimulert dannelse av antilegemer til antigenene av hepatitt B virus er de begrensede vertsmuligheter for viruset. For eksempel selv om hepatitt B viruset er meget smittsom hos mennesker har smitte med hepatitt B virus kun vært oppnådd hos noen få primater. Heller ikke har viruset utviklet seg i vevkulturer. Dette begrensede vertsområdet og at det er mulig å infisere vevkulturceller har i vesentlig grad begrenset både karakterisering av viruset og infeksjonens patologi og utvikling av raske påvisningsmetoder og effektive midler for infeksjonskontroll og beskyttelse.

Selv om det har vært forsøkt å anvende autentiske HBV virale antigener, isolert fra ofre for HBV-infeksjon, for utvikling av antilegemer og påvisning av infeksjonen har disse behandlinger generelt ikke vært ålment tilgjengelig på grunn av den begrensede tilførsel av aktive typer. Ytterligere anvendelse av menneskekilder for disse antigener anses for ikke fordelaktige på grunn av de velkjente forurensningsproblemer ved anvendelse av menneskeisolater.

Foreliggende oppfinnelse løser de amtallé: problemer ved å tilveie-bringe, i henhold til oppfinnelsen, et rekombinant DNA-molekyl som er særpreget ved en strukturell genkodning for et polypeptid som utviser HBV antigenitet.

Som følge av oppfinnelsen er det mulig å oppnå HBV-antigener

og gener i betydelige og u^/forurensede mengder for fremstilling av vaksine og for anvendelse ved påvisning av viral infeksjon og bestemmelse av dets patalogi og molekylære biologi. Slike tilførseler har tidligere ikke vært tilgjengelige på grunn av de begrensede vertsmuligheter for viruset og at det ikke er mulig å dyrke denne i en vevkultur.

Som det vil fremgå av det etterfølgende er det rekombinante DNA-molekyl, fremstilt ifølge oppfinnelsen, i stand til å produsere, i en passende vert i det minste et viralt polypeptid som utviser HBV~antigenitet og strukturelle gener som kode for disse. Disse rekombinante DNA-molekyler og verter kan anvendes for fremstilling av polypeptider som utviser HBV-antigenitet og strukturelle genekoder for disse polypeptider. Disse produkter kan også identifiseres og karakteriseres og er nyttige enten som dannet i verten eller etter passende avledning eller modifikasjoner i blandinger og metoder for å forbedre fremstilling av disse : produktene i seg selv og for å påvise HBV-infeksjon, for å følge dets patologi og stimulere dannelse av HBV-antigener hos mennesker.

I henhold til oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant DNA-molekyl som er særpreget ved å forbinde en DNA rekkefølge fremstilt fra det endogene DNA av en "Dane"-partikkel til en annen DNA-sekvens fremstilt fra en kilde annen enn "Dane"-partikkelen.

Foreliggende fremgangsmåte adskiller seg fra de kjente ved at ingen av disse fremgangsmåter anvender et naturlig gen eller DNA for et spesielt protein for konstruksjon av det rekombinante DNA-molekyl og fremstilling av dette protein eller gen. I stedet anvender de enten syntetiske gener fremstilt ved kjemisk syntese eller kunstige gener fremstilt ved enzymatisk kopiering av mRNA isolert fra en donorcelle for å gi cDNA-sekvenser.

En grunn for at naturlig DNA ikke tidligere har vært anvendt direkte i rekombinant DNA-syntese av proteiner er at naturlige DNA'er fra de fleste høyere organismer og i det minste visse dyre-virus innholder "introns" eller ytterligere nukleotidsekvenser som en del av genet. Disse introner utgjør ikke en del av den endelige informasjon for genet. I stedet fjernes de in vivo i høyere organismer ved spesielt virkende enzymer som virker på

det primære transkripsjonsprodukt til å gi genets endelige informasjon eller bud (mRNA). Bakterier er antatt ikke å være i stand til å bearbeide slike introner slik at naturlig DNA vil ikke forventes å komme til uttrykk i bakterieverter og de ønskede proteiner ville således ikke kunne forventes dannet i slike verter.

I den vedlagte tegning 1 er vist et forenklet diagram som representerer strukturen av det endogene DNA av en "Dane"-partikkel. Den utviser to komplimentære DNA-bånd, nemlig bånd a og b, inn-sjæringen i bånd a og gapet i bånd b og lukking av dette bånd ved DNA-polymerasereaksjon.

Fig. 2 viser skjematisk den foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen: fragmenter av endogent DNA iso-lért fra "Dane"-partikkelen sammenføyes til E. coli penicillinase genet på plasmidet pBR322 ved Pst I voksested. Etter omdannelse til E. coli HB101 vil det rekombinante DNA-molekyl pBr322-Pst I dG: HBV-Kpnl dC styre syntesen av polypeptider som utviser

HBV antigenitet.

Figurene 3-9 viser nukleotidsekvensen bestemt for en del av hepatitt B virus genomet i henhold til oppfinnelsen. Sekvensen er vist med stopp "condons" i de tre leserammer angitt over den. Den er tilfeldig nummerert fra initieringskodonet for genkoden for HBcAg, bestemt i henhold til oppfinnelsen. Nukleotidene

-80 til -1 representerer ledersekvensen som kommer før dette gen. Nukleotidene 1 - 549 representerer nukleotidesekvensen for genkoden for hepatitt B viruskjerneantigen, aminosyresekvensen (leseramme 1) for dette antigen er vist over denne sekvens.Nukleotidene 1 437 - 2 114 representerer nueklotidesekvensen bestemt for genet av hepatitt B virusoverflateantigen, aminosyresekvensen (leseramme 3) for dette antigen er angitt over denne sekvens. Forskjellige begrensende endonukleasegjenkjennende steder i disse gener er også vist i figurene 3-9. Fig. 10 viser skjematisk en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hvori et rekombinant DNA-molekyl, som er i stand til å produsere et polypeptid som utviser hepatitt B viruskjerneantigen, fragmenteres og et fragment derav knyttes til en forbedret "expression" kontrollsekvens, nemlig lac-systemet. Fig. 11 viser skjematisk en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hvori et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen fragmenteres og forbindes'til et fragment av fag DNA for anvendelse ved lyso-genisering av vertsceller og derved forøke antall genkopier der i.

I fig. 12 er vist skjematisk en annen utførelsesform av foreliggende fremgangsmåte: et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, som ikke produserer et polypeptid som utviser hepatitt B virus kjerneantigen, fragmenteres for å fjerne strukturgenet for HBsAg og dette strukturelle gen anvendes for å fremstille et rekombinant DNA-molekyl som produserer HBsAg i en passende vert.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere i det etterfølgende og i denne beskrivelse anvendes de følgende betegnelser: Nukleotid, en monomerenhet av DNA eller RNA bestående av en suk-kerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig hetrosyklisk base. Basen er forbundet til sukkerresten via glykosidkarbonet (1' karbonet i pentosen) og kombinasjonen av basen og sukkeret er et nukleotid. Basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C"), og tymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA sekvens, en lineær serie av nukleotider forbundet til hver-andre via fosfodiesterbindinger mellom 3' og 5' karbonene i tilstøtende pentoser.

Condon, en DNA sekvens av tre nukleotider (en triplett) som koder via mRNA en aminosyre, et oversettelsesstartsignal eller et oversettelsesavslutningssignal. For eksempel, nukleotidtriplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG kode for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er oversettelsesstoppsignaler og ATG er et oversettelsesstarsignal.

Leseramme, grupperingen av kodoner under overføring av mRNA til aminosyresekvenser. Under overføring må den riktige leseramme bibeholdes. For eksempel kan sekvensen GCTGGTTGTAAG om-settes til tre leserammer eller faser, hver som gir en forskjellig aminosyresekvens:

Polypeptid, en lineær serie av aminosyrer forbundet med hver-andre ved peptidbindinger mellom a-amino og kraboksygruppene av tilstøtende aminosyrer.

Genom, alt DNA av en substans. Det innbefatter blant annet strukturelle gener som kode for polypeptidene av substansen, så vel som operatør, promoter og samspillsekvenser innbefattende sekvenser så som Shine-Dulgano sekvenser.

Strukturelt gen, en DNA^sekvens som koder via dets mal eller "budbringer" RNA ("mRNA"), sekvens av aminosyrer som er karak-teristiske for et spesifikt polypeptid.

Transkripsjon, prosessen for dannelse av mRNA fra et strukturelt gen. • Qve- rføgmg-, prosessen ved fremstilling av et polypeptid fra mRNA.

te

Exjpresjon, prosessen som et strukturelt gen undergår for å

danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og overføring.

Plasmid, en ikke-kromosoi-i dobbeltberrtre-t DNA-sekvens omfattende

en intakt "replicon" slik at plasmidet dupliseres i vertscellen. Når plasmidet plasseres inne i en encelleorganisme vil orga-nismens egenskaper forandres eller omdannes som følge av plas-midets DNA. For eksempel et plasmid som bærer et gen for tetrasyklinresistens (Tet ) omdanner en celle som tidligere var føl-som for tetrasyklin til en som er resistent mot tetrasyklin.

En celle omdannet av et plasmid kalles en "transformant".

Fag eller bakteriofag, bakteriell virus hvorav mange innbefatter DNA sekvenser innkapslet i en proteinomhylning eller et protein-belegg ("capsid"). I en encelleorganisme vil et fag dupliseres ved en prosess som kalles transveksjon.

Klonings^ æ^ r*, et plasmid, fag DNA eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å duplisere seg i en vertscelle og er særpreget ved et eller et lite antall endonukleasegjenkjennende posisjoner, i hvilke slike DNA-sekvenser kan trenge inn på en bestembar måte uten at det oppstår tap av DNA<1>s nødvendige biologiske funksjon, dvs. duplisering, produksjon av dekkende proteiner eller tap av promoter eller bindingsposisjoner, og som inneholder en markør som er egnet for anvendelse ved identifikasjon av omdannede celler, eksempelvis tetrasyklinresistens eller ampicillinresistens. En kloningsbærer kalles ofte en vektor. ;Kloning, aseksuell reproduksjonsprosess.;Rekombinant DNA- molekyl, en hybrid DNA sekvens omfattende minst to nukleotidsekvenser, hvorav den første sekvens normalt i naturen ;ikke finnes sammen med den andre.;E^ presjonskontrollsekvens, en DNA-sekvens av nukleotider som kontrollerer og regulerer expresjonen av strukturelle gener når den er operativt forbundet med disse gener. ;Under henvisning til fig. 1 hvori er vist et forenklet diagram av det endogene DNA av en "Dane"-partikkel. "Dane"-partikler er påvisbare i blodplasma hos visse pasienter med hepatitt B virus infeksjoner (D.S. Dane og C. H. Cameron, "Virus-Like Particles In Serum Of Patients With Australia-Antigen Associated Hepatitis", The Lancet, 1, s. 695-698 (1970)). Denne partikkel er antatt å være identisk med eller nær beslektet med det infiserende virion av hepatitt B. Selv om dets størrelse er kjent (42 nm i diameter) er dets struktur ikke fullt ut forstått. Generelt er "Dane"-partikkelen antatt å bestå av et ytre lag og en indre kjerne. Det ytre lag av partikkelen inneholder generelt et polypeptid kjent som hepatitt B overflateantigen ("HBsAg"). Den indre kjerne (diameter 27 nm) inneholder et andre polypeptid, nemlig hepatitt B kjerneantigen ("HBcAg"), så vel som et endogent dobbeltbindet, sirkulært DNA-molekyl av 2,1 x 10 dalton, som inneholder et enkeltbåndet gap av vari-erende lengde. Et tredje poypeptid, 'e' antigen ("HBeAg") kan også være assosiert med "Dane"-partiklene. I tillegg er "Dane"-partiklene antatt å innbefatte et endogent DNA-avhengig DNA-polymerase som er særlig nær det enkeltbåndede gan i det endogene DNA ved en polymerasereaksjon hvori anvendes DNA som en primer/mal. Strukturen og egenskapene for "Dane"-partikkelen og mere spesielt dets DNA har vært underkastet flere analyser, se eksempelvis W. S. Robinson, "The Genome of Hepatitis B Virus", Ann. Rev. Micro.biol., 31, s. 357-377 (1977). Imidlertid har ikke den aktuelle struktur av de forskjellige antigener eller deres gener fullt ut blitt bestemt. ;"Dane"-partikkelens endogene DNA har blitt isolert ved ekstraksjon fra "Dane"-partikkelen. Den består av et nukleotidbånd med en konstant lengde og med et lite innsnitt eller åpning i denne (Fig. 1, bånd a, >~^3 000 nukleotider) og et andre nuklotidbånd med en noe variabel lengde (Fig. 1, bånd b,~- 2 000 nukleotider). ;Det andre bånd er komplementært til det første og overlapper dets innsnitt og danner en fullstendig sirkulær struktur ved hydrogenbinding mellom komplementære baser på en standard Watson-Crick måte. Denne overlapping fremgår av fig. 1. DNA-polymerasen av "Dane"-partikkelen synes å utnytte det andre bånd av det endogene DNA som en primer og det første bånd som en mal for å fylle inn det variable gap med nukloetider som er komplementære til nukleotidene i det første bånd og tilveie-bringer et dobbeltbåndet DNA med ca. 3 000 nukleotidpar. ;Fremgangsmåte ved fremstilling av hepatitt B virus DNA ;Menneskeserum fra en enkelt HBsAg positiv, HBeAg positiv donor (serotype adj^gO bl>e fortynnet med en lik volummengde buffer (0,1 M tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,1 % (vekt/volum) som anvendt gjennom det hele av 2-merkaptoetanol, 0,1 % kvegserumalbumin, 0,001 M EDTA) ved pH 7,4. Dette ble sentrifugert ved 35 000 omdr./min. i 2 h ved 4°C. Således erholdte pellet ble gjen-suspendert i 200 ul av den samme buffer og suspensjonen ble anbrakt i toppen av et sentrifugerør innholdende 20 % sukrose. Suspensjonen ble sentrifugert ved 40 000 omdr./min. i 2 h ved 4°C. Den således erholdte pellet ble igjen resuspendert i 100 ul buffer (0>1 M tris-HCl, 0,1 M NaCl) ved pH 7,5. ;Den erholdte DNA~inneholdende pellet ble merket med en<3>H eller 3 2 ;med P slik som beskrevet av P. M. Kaplan et al., "DNA Polymerase Associated With Human Hepatitis B Antigen", J.Virol., 12, s. 995-1005 (1973) for å kunne følge de etterfølgende trinn i prosessen. Denne merking oppstår ved omsetning av de konsentrerte "Dane"-partikler og 3 H- eller 3 2P-merket de-oksynukleosid trifosfater (dNTP'er) i 4 h ved 37°C. Etter denne DNA-polymerasereaksjon, hvilken fører til en delvis lukking av det enkeltbandede gap i DNA (se fig. 1), ble det merkede DNA-materialet påført i toppen av et sentrifugerør inneholdende 3 0 % sukrose og sentrifugert ved 4 2 000 omdr./min. ;i 3,5 h ved 4°C.;DNA ble deretter ektrahert med fenol fra den erholdte pellet under anvendelse av fremgangsmåten ifølge L.I. Lutwich og ;W. S. Robinson, "DNA Synthesized In The Hepatitis B Dane Par-ticle DNA Polymerase Reaction", J. Virol., 21, s. 96-104 ;(1977). Det ekstraherte DNA ble dialysert mot en oppløsning ;av 0,01 M tris-HCl, 0,001 MEDTA (pH 8,0) for å eliminere fenoloppløsningsmiddelet. Det isolerte DNA var deretter klart for begrenset enzymoppløsning. Det utviste en spesifikk strål-ingsaktivitet på ~10 Qcpm/ug. Den ovenfor diskuterte prosess er skjematisk vist i fig. 2. ;Kloning av hepatitt B virus DNA;Et antall vertsklonebærerkombinasjoner kan med fordel anvendes ved kloning av det dobbeltbåndede DNA, isolert som ovenfor angitt. For eksempel kan kloningsbærere innbefatte kromosonbærende, ikke kromosonbærende og syntetiske DNA-sekvenser, ;så som forskjellige kjente bakterieplasmider så som pBR322, andre E. coli plasmider og deres derivater og ytterligere bre-dere vertsområdetplasmider så som RP4, fag DNA så som antallet derivater av fag A, eksempelvis NM899 og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA'er så som plasmider som er modifisert for å anvende fag DNA expresjonskontrollsekvenser. Nyttige verter kan innbefatte bakterieverter så som E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli HB101 og E, coli MRC1 og stammer av Pseudomonas, Bacillus subtilis og andre bakterier, gjær og andre fungi, dyre- eller planteverter, så som dyre- eller planteceller i kulturer og andre verter. Naturligvis vil ikke alle verter være like effektive. Det spesielle valg av vert-klonebærerkombinasjon kan gjøres av en fagmann etter vurdering av de ovenfor gitte prinsipper. ;Ytterligere innen hver spesifikk vektor kan forskjellig posisjoner velges for innføring av det isolerte dobbeltbåndede DNA. Disse posisjoner er vanligvis angitt av begrensningsenzymet eller endonuklease som kutter disse. For eksempel i pBR3 22 ;er Pst I posisjonen lokalisert i genet for penicillinase ;-mellom nukleotidtriplettene som kode for aminosyrene 181 og;18 2 av penicillinaseproteinet. Denne posisjon ble anvendt av Villa-Komaroff et al., som nevnt ovenfor, ved deres syntese ;av protein som utviser rotte proinsulinantigeniske determinanter. ;En Hind II endonukleasegjenkjennende posisjon mellom triplettene som koder for aminosyrene 101 og 102 og en Taq posisjon for tripletten som koder for aminosyren 45 av dette protein i pBR322. På samme måte er en Eco RI endonukleasegjenkjennende posisjon for dette plasmid lokalisert mellom genene som koder for resistens mot henholdsvis tetrasyklin og ampicillin. Denne posisjonen ble anvendt av Itakura et al. og Goeddel et al i deres arbeid med rekombinante DNA-synteseskjemaer, som ovenfor nevnt. Fig. 2 og 11 angir for illustrasjonsformål noen av de begrensende posisjoner i plasmid pBR322 og fag ANM989. ;Den spesielt valgte posisjon for innføring av det valgte DNA— fragment inn i kloningsbæreren for å danne et rekombinant DNA-molekyl bestemmes av et antall faktorer. Disse innbefatter størrelse og strukturen av polypeptidet som skal uttrykkes, tilbøyeligheten for det ønskede polypeptid for endoenzymatisk degrasjon av vertscellekomponentene og forurensning av deres proteiner, expresjonsegenskaper, så som lokalisering av start og stopp kodoner, samt andre faktorer som vil være velkjent av en fagmann. Da denne expresjonsprosess ikke er fullt ut forstått vil ingen av disse faktorer alene fullstendig kontrol-lere valget av innføringsposisjonen for et spesielt polypeptid. ;I stedet vil den valgte posisjon utgjøre en balanse mellom disse faktorer og ikke alle posisjoner ville være like effektive for et gitt protein. ;Selv om flere fremgangsmåter er kjent innen teknikkens stand;for innføring av fremmed DNA til en kloningsbærer for å gi et rekombinant DNA-molekyl, så er den foretrukne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen vist i fig. 2. Den er særpreget ved spaltning av "Dane"-partikkelen DNA med en begrensningsendonuklease, tilknytning av poly-deoksyC sekvenser til 3' avslutningen (benevnt i henhold til konvensjon fra deoksyribosekarbonét av DNA sukkerkjeden) av det spaltede DNA og bindingen til det for-lengede DNA til kloningsbæreren som er avkuttet ved en spesiell posisjon av en restriksjonsendonuklease og forlenget ved 3' terminalen av dette kutt med poly deoksyG sekvenser, som er komplementære til poly-dC sekvenser av det spaltede DNA. Den komplementære karakter av av 3' halen av DNA og kloningsbæreren ;tillater vedheftning ved disse terminaler.;For å være nyttig ved foreliggende fremgangsmåte bør det valgte begrensningsenzym for deling av HBV DNA innen en essensiell del av genet som koder for polypeptider som utviser HBV antigenitet, og mere fordelaktig bør det dele DNA i et antall begrensede posisjoner. Begrensningsenzymene som har blitt anvendt ifølge oppfinnelsen innbefatter Kpn I, Bgl II, Barn HI, Ava I ;og Eco RI. Andre restriksjonsendonukleaser kan på samme måte være nyttige i henhold til oppfinnelsen. Valg av disse kan foretas av en fagmann under hensyntagen til de ovenfor omtalte faktorer. Figurene 3-9 viser noen av restriksjonsendonukle-asegjenkjennende posisjoner i deler av HBV-genomet. ;Naturligvis kan andre kjente metoder for innføring av DNA-sekvensen til kloningsbæreren for å gi rekombinante DNA-molekyler være like nyttige ved utøvelse av oppfinnelsen. Dette innbefatter eksempelvis direkte ligation hvori anvendes det samme begrensende endonuklease som anvendes ved spaltning av HBV DNA og kloningsbæreren. Denne fremgangsmåte vil nødvendigvis til-veiebringe komplementære ender for kohesjon. ;Det bør naturligvis forstås at nukleotidesekvensen eller genfragmentet som innføres i den valgte restriksjonsposisjon av kloningsbæreren kan innbefatte nukleotider som ikke er en del av det aktuelle strukturelle gen for det ønskede protein eller kan innbefatte kun et fragment av det strukturelle gen. Det er kun krevet for produksjon av polypeptider at uansett hvilket DNA sekvens som innføres så vil den transformerte vert produsere et polypeptid som utviser HBV antigenitet. ;Det rekombinante DNA-molekyl som inneholder hybridgenet kan anvendes for å omdanne en vert slik at det tillates at denne vert (transformanten) å uttrykke det strukturelle gen eller fragment derav og for å produsere polypeptider eller deler derav, kodet av det hybride DNA. Det rekombinante DNA-molekyl kan også anvendes for å omdanne en vert slik at det muliggjøres at verten ved duplisering eller reproduksjon vil danne ytterligere rekombinante DNA-molekyler som en kilde for strukturelle gener og fragmenter derav. Valget av en passende vert for hver av disse anvendelser styres av et antall faktorer som er velkjente innen teknikkens stand. Disse innbefatter eksempelvis forenlighet med den valgte vektor, toksitet av biprodukter, gjenvinningsletthet av det ønskede polypeptid, expresjonsegenskaper, biosikkerhet og omkostninger. Igjen da mekanismen for expresjonen ikke er fullt ut forstått kan ikke noe absolutt valg av vert gjøres for et spesielt rekombinant DNA molekyl eller polypeptid fra hver enkelt av disse faktorer alene. I stedet må det finnes en balanse mellom disse faktorer ut fra den kjensgjerning at ikke alle verter er like effektive for expresjon av et spesielt rekombinant DNA-molekyl. ;I foreliggende syntese er den foretrukne kloningsbærer bakterielt plasmid pBR322 og den foretrukne restriksjonsendonukleaseposi-sjon deri er Pst I posisjonen (fig. 2). Dette plasmid er et lite (molekylvekt 2,5 megadalton) plasmid som bærer resistente gener mot de antibiotiske ampicillin (Amp) og tetrasyklin (Tet). Plasmidet er fullt utkarakterisert(F. Bolivar et al., "Con-struction and Characterization of New Cloning Vehicles II. ;A Multipurpose Cloning System", Gene, s^95-113 (1977)). Den foretrukne vert i henhold til oppfinnelsen er E. coli HB101. ;1. Fremstilling av dC- forlenget " Dane"- partikkel DNA;Ved aktuell utøvelse av den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen ble DNA isolert, som angitt ovenfor, fra DNA partikler behandlet (digested) med restriksjonsendonuklease Kpn I (ca. ;20 ng DNA i 10 pl 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 40 mM NaCl, 0,5 pl enzympreparat) ved 37°C ;i 90 min. hvoretter restriksjonsenzymet ble inaktivert ved opp-varming til 70°C i 5 min. Poly-deoksyC sekvenser (kun betegnet med CCC i fig. 2) ble knyttet til 3' terminalene av enzymbehand-lingsproduktene ved standardomsetning med polynukleotidterminal-transferase etter fjernelse av gjenværende protein ved ekstraksjon med fenol og klorofrom (20 ul hver). Fenol ble fjernet fra den vandige fase ved ekstraksjon med eter, og DNA ble presipitert ved tilsetning av 3 M natriumacetat, pH 6,5 (5 pl) og kold etanol 0,1 ml. Etter oppbevaring ved -7 0°C i 1 h ble det presi-piterte DNA gjenvunnet ved sentrifugering ved 10 000 omdr./min. ;i 20 min. og den erholdte pellet oppløst i 10 mM tris-HCl pH;7,5 (10 pl). Til oppløsningen ble tilsatt 3 ul 400 mM kalium kakodylat, pH 7,0, 4 mM koboltklorid, 4 mM deoksycytosin tri-fosfat (dCTP), 200 ug/ml kvegserumalbumin og blandingen ble inkubert ved 27°C i 10 min. med 0,5 pl polynukleotidterminal-transferase (6000 enheter/ml) og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 50 mM EDTA (1 pl). ;2. Fremstilling av Pst I spaltet, dG- forlenget pBR322;Plasmidet pBR322 ble behandlet med begrensningsendonuklease;Pst I (for hvilket plasmidet inneholder et mål) og produktene renset ved hjelp av fenolekstraksjon og etanolpresipitering, ;på samme måte som beskrevet ovenfor for HBV DNA. Poly-dG sekvenser (illustrert kun som GGG i fig. 2) ble addert til 3' endene (termi) av lineærePBR322 molekyler ved terminaltrans-ferase, slik som beskrevet for addering av poly-dC sekvenser til HBV, bortsett fra at reaksjonen ble utført ved 37°C. ;3. Kohesjon av G- forlengetPBR322 og C- forlenget HBV DNA ;Ekvimolære mengder av pBR322-poly-dG og HBV DNA-poly-dC ble blandet sammen og de kompiimentære sekvenser ble tillatt sammen-knyttet ved inkubasjon i 100 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA (TNE), (50 pl) ved 65°C i en time, deretter i en time ved 47 C, deretter i en time ved 37°C og ytterligere en time ved 20°C, hvoretter ble tilsatt et tilsvarende volum TNE og 20 ul 100 mM MgCl2, 100 mM CaCl2, 100 mM tris-HCl, pH 7,5. ;4. Tranformasjon av E. coli HB 101;Kulturer av E. coli HB 101 kompetent eller egnet for transformasjon ble fremstilt som beskrevet av E.M. Lederberg, og S.H. Cohen, "Transformation of Salmonelle typhimurium By Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., 119, s. 1072-1074 (1974). 0,1 ml porsjoner av cellene ble blandet med 25 pl av de "annealed" DNA-preparater og inkubert ved 0°C i 20 min. og deretter ved 20°C i 10 min. før påføring på L-agarplater inneholdende tetrasyklin (50 pg/ml) for inkubasjon over natten ved 37°C. Da plasmidet pBR322 innbefatter genet for tetrasyklin resistens vil E. coli-kolonier som er transformert med dette plasmid vokse i kulturer inneholdende det nevnte antibiotikum og utelukke de E. coli-kolonier som ikke er slik transformert. Derfor vil vekst i en tetrasyklininneholdende kultur tillate utvalg av riktige transformerte verter. ;5. Utskilling ( screening) av E. coli- kolonier ved hybridisering ;Bakteriekolonier dyrket på de inkuberte tetrasyklininneholdende L-agarplater ble undersøkt med hensyn til sensitivitet ovenfor ampicillin. Plasmidet pBR322 innbefatter genet for ampicillinresistens. Dette gen er den antatte posisjon (site) for hydbrid gen-inhføring. Derfor vil kolonier som er transformert med et plasmid med DNA innført i den valgte gjenkjenningsposisjon være følsom for ampicillin, men vil bibeholde deres resistens mot tetrasyklin. E. coli-kolonier som var følsomme for ampicillin men resistente til tetrasyklin ble overført til en plate av "Millipore" cellulosenitratfilter båret på L-agarplater inneholdende tetrasyklin. Etter vekst over natten ved 37°C ble "Millipore" filteret overført til ferske L-agarplater inneholdende tetrasyklin og klorampheriicol (150 pg/ml) og ytterligere inkubert i flere timer ved 37°C for ytterligere å forsterke antallet kopier av plasmid inne i cellene (fig.2). "Millipore" filterene ble deretter anvendt for kolonihybridisering, slik som beskrevet av M. Grunstein og D.S. Hogness, "Colony Hybri-dization: A Method For The Isolation Of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 72, s. 3961-3 2 ;3965 (1975) med P-merketHBV DNA tildligere fremstilt som prøve. Radioautorgrafi av filterene viste tilstedeværelse av kolonier ;som inneholdt DNA-sekvenser komplementære til autentiske HBV;DNA. ;6. Påvisning av kolonier som danner polypeptider med HBV antigenitet ;Kolonier som var resistente for tetrasylkin, følsomme for ampicillin og hybridisert med autentisk HBV DNA ble undersøkt med hensyn til deres evne til å produsere minst 1 polypeptid som utviser HBV-antigenspesifisitet eller antigenitet. Kolonier ble igjen overført til "Millipore" filtere båret på L-agarplater ;o ;inneholdende tetrasyklin og inkubert ved 37 C over natten. En annen plate av L-agar ble dekket med en kultur av E. coli C600 ;(0,1 ml i 2 ml bløt agar) infisert med en virulent stamme av bakteriofag X vir (infiseringsgrad på ca. 1) og ytterligere inkubert ved 37°C over natten ved hvilket tidspunkt bakterie-dekket var lysert til flytende tilsatnd (dvs. i det vesentlige alle vertscelleveggene var brutt opp) av bakteriofagen (A vir). "Millipore" filteret inneholdende cellene omdannet i henhold til oppfinnelsen ble løftet opp fra platen og plassert, med koloniene ned, i kontakt med overflaten av L-agarplaten av E. ;coli C600 som var lysert med A vir. Denne kontakt forløp i ca. 10 min. for å tillate infeksjon av cellene på "Millipore" filteret med A vir. "Millipore" filteret ble deretter over- ;ført til en fersk L-agarplate og inkubert ved 37°C i ytterligere 5 h. I mellomtiden ble polyvinylplater belagt med HBV antilegemer, slik som beskrevet av S.. Broome og W. Gilbert, "Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 75, s. 2746 - 2749 ;(1978). "Millipore" filteret på hvilke tranformerte bakteriekolonier nå åpenbart var lysert ble plassert med koloniene i kontakt med de belagte polyvinylskiver og holdt ved 4°C i 3 h. Denne kontakt resulterte i at eventuelle HBV-antigener lysert fra cellene på "Millipore" filteret binder seg til HBV antilegemene på skivene. De belagte skiver ble separert fra "Millipore" filteret og deretter vasket og inkubert med 12 5I-merket HBV antilegemer. Denne inkubasjon førte til radioaktiv merking av de posisjoner på skivene hvor HBV antigenene fra "Millipore" filteret tidligere var bundet til HBV antilegemene på skiven. Etter vasking og radioautografi, slik som beskrevet av Broom og Gilberts, som nevnt ovenfor, ble kolonier som hadde produsert polypeptider med HBV-antigenspesifisitet lokalisert under henvisning til den erholdte radioautografi. ;Anvendelse av polypeptider og gener dannet av rekombinante DNA-molekyler for påvisning av tilstedeværelse av HBV-antilegemer i mennensker ;Polypeptider som utviser HBV-antigenitet og de strukturelle gener og fragmenter med koder derfor kan anvendes ved fremgangsmåter og utstyr egnet for å påvise tilstedeværelse av HBV-antilegemer hos mennesker og derfor for påvisning av mennesker og blodprøver som har vært infisert av denne virus. ;For eksempel kan HBcAg fremstilt av verter transformert med rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen anvendes ved immunologiske diagnostiske prøver som for tiden er tilgjengelige for hepatitt B virus påvisning, dvs. radioimmunobestemmelse eller ELISA (enzymbundet immunoabsorpsjonsbestemmelser). I en type radioimmunobestemmelse blir antikjerne-antigenantilegemet dyrket i et laboratoriedyr, knyttet til en fast fase, eksempelvis på innersiden av et prøverør. HBcAg ble deretter satt til prøven for å forbinde seg med antilegemet. Til røret belagt med antigen-antilegemetkomplekset tilsettes en prøve av pasientens serum sammen med en kjent mengde HBV-antikjerneantilegeme merket med en radioaktiv isotop, så som radioaktiv jod. Eventuelle HBV-antilegemer i pasientens serum vil konkurrere med det merkede antilegemet for de frie bindingsposisjoner i antigen-antilegemekomplekset. Når serumet har fått lov til å reagere blir overskuddet av væske fjernet og røret vasket og mengden av radioaktivitet målt. Et positivt resultat, dvs. at pasientens serum inneholder HBV-antilegeme vil indikeres med en lav radio- aktivitetstelling. I en type ELISA-prøve belegges en mikroti-treplate med HBcAg og til denne plate tilsettes en prøve av pasientens serum. Etter en viss inkubasjonsperiode som tillater samvirkning av et eventuelt antilegeme med antigenet, vaskes platen og et preparat av antimenneske-antilegemet, dyrket i et laboratoriedyr, og som er forbundet med en enzymmerking tilsettes, inkubert for å tillate at reaksjonen finner sted, hvoretter platen på nytt vaskes. Deretter tilsettes enzymsubstratet til mikrotitreplaten og inkuberes i en viss tidsperiode for å tillate at enzymet virker på substratet og absorpsjonene av det ferdige preparat måles. En stor forandring i absorpsjonen indikerer et positivt resultat. ;In vivo aktivitet av polypeptid fremstilt fra rekombinante DNA-molekyler ;For å bestemme den biologiske aktivitet av antigenpolypeptider overført (translated) fra det rekombinante DNA-molekyl i E. coli ifølge oppfinnelsen ble sterile ekstrakter av bakterieceller som var påvist å uttrykke HBcAg injisert i kaniner etter blanding méd det tilsvarende volum av Freund's hjelpemiddel. To dyr ble gitt det rå bakterieekstrakt og to ble inngitt prøver av det samme ekstrakt etter fraksjonering på en "Sephadex 650" kolonne. Ytterligere injeksjoner av den samme prøve, som hadde vært frosset og lagret (under bibeholdelse av full antigen aktivitet) ble gitt to og fem uker etter den første injeksjon. Blodprøver ble tatt i intervaller flere uker etter den initiale injeksjon. ;Immunodiffusjonsforsøk under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av O. Ouchterlony, "Immunodiffusion and Immunoelectro-phoresis", i Handbook of Experimental Immuology (D.W. Weir ed.) ;(Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh)kapittel 19 (1967), ble utført for å sammenligne kaninsera (antilegemer) med menneskehepatitt B virus kjerneantilegeme ("HBcAb") under anvendelse av HBcAg avledet fra menneskelever (B. J. Cohen og Y.E. Cossart, "Application Of A Screening Test For Antibody To Hepatitis B Core Antigen", J. Clin. Path., 30, s. 709-713 (1977)). Alle fire kaninsera ga precipitinlinjer med HBcAg identiske til de dannet mellom HBcAg og HBcAb avledet fra menneskekilder. ;Derfor er kjerneantilegemet syntisert i E. coli med de rekombinante DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen, seriologisk aktivt in vivo. Denne aktivitet etablerer muligheten og velegnetheten av blandinger og fremgangsmåter hvori anvendes virale antigener syntisert i mikrobeceller for stimulering av antilegemedannelse hos mennekser. Slike blandinger og fremgangsmåter er særpreget ved polypeptider fremstilt i verter omdannet av rekombinante DNA-molekyler fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Disse polypeptider kan anvendes alene eller sammen med farmasøytisk aksep-table bærere så som saltoppløsninger eller andre midler som innen teknikkens stand anvendes i blandinger og fremgangsmåter for behandling og forhindring av virale infeksjoner hos mennesker. ;Som tidligere angitt kan andre begrensningsenzymer bortsett;fra Kpn I/Pst I kombinasjonen ovenfor beskrevet også med fordel anvendes ved fremstilling av rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Andre begrensningsposisjoner i plasmid pBR322 ;og en del av HBV-genomet er avbildet i henholdvis figurene 2 og 3. Som illustrasjon til disse alternativer, men mindre foretrukne utførelsesformer skal de følgende eksempler gis. ;Barn HI, Eco RI, Bgl II— Pst i kombinasjoner;HBV DNA fragmentene fremstilt ved anvendelse av Barn HI Eco RI og Bgl II, forskjellige fra de som fremstilles av Kpn I kunne ikke direkte forankres (tailed) for kohesjon som følge av tilstede-værelsen av korte 5' enstrengede utstikninger. De ble derfor behandlet med X eksonuklease for å fjerne disse utstikninger før adhesjon av poly-dC sekvenser ved 3' endene. Dette ble utført ved inkubasjon av det begrensede DNA (10 pl av en oppløsning som tidligere beskrevet) med 15 pl 100 mM natriumglycinat, pH 9,5, 10 mM MgCl2, 100 pg/ml kvegserumalbumin, 5 pl A eksonuklease ved 0°C i 1,5 h. Blandingen ble deretter ekstrahert med fenol og kloroform og behandlingen forsatt. I preparatet hvori Barn HI ble anvendt underbygget den etterfølgende radioimmunologbe-stemmelse dannelse av polypeptider med HBV antigen spesifisitet. ;Direkte " underbinding" ( ligation) : Eco RI— Eco RI og Bam HI— Bam HI;I stedet for tilpasning (tailing) av DNA-fragmentene for kohesjon, som ovenfor beskrevet kan en direkte underbinding av genfragmentene anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. For eksempel i to ytterligere fremstillinger ble HBV DNA (20 ng) begrenset med begrensende endonuklease Eco RI eller Bam HI i 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM NaCl (10 ul) ved 37°C i 1,5 h og blandet med et overskudd av pBR322 som tidligere var inkubert med de samme enzymer under identiske betingelser. En konsentrert bufferoppløsning (660 mM tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 100 mM 2-merkaptoetanol, 400 mM NaCl, 1 mM ATP) (2 ul) ble tilsatt og blandingen inkubert med T4 DNA ligase (0,5 pl) ved 10°C i 3 h etterfulgt av inkubering ved 0°C i minst 24 h. Oppløsningen ble fortynnet til 0,1 ml med 10 mM tris-HCl, pH 7,5 og anvendt for transformering av egnede eller kompetente kulturer av E. ;coli HB 101, som tidligere beskrevet. For tilfelle av Bam HI preparerte rekombinante DNA-molekyler ble koloniene undersøkt, ;før sikting og hybridisering, men hensyn til følsomhet overfor tetrasyklin i stedet for ampicillin, fordi målet for Bam Hl i pBR322 faller innen genkodingen for tetrasyklinresistens og en vellykket innføring i denne gjenkjenningsposisjon vil således føre til tap av denne motstandsevne i stedet for ampicillinresistens, slik som er tilfelle for innføring ved Pst I posisjonen. ;For tilfelle av rekombinante DNA-molekyler fremstilt via Eco RI posisjonen, ble koloniene undersøkt, før sikting for hybridisering, med hensyn til resistens for både ampicillin og tretrasyklin fordi målet for EcoRI i pBR322 ligger mellom genene som koder for tetrasyklin og ampicillinresistens slik at ingen inakti-vering av genene for ampicillin eller tetrasyklinresistens finner sted ved hybrid DNA innføring i denne posisjon. ;Mikroorganismer frestilt ved de heri beskrevne fremgangsmåter;er eksemplifisert med kulturer deponert i Culture Collection of the Microbiological Research Establishment i Porton Down 15. desember 1978 og er identifisert som pBR322-HBV, A til F. ;Spesielt er disse kulturer betegnet som følger:;A: E. coli HB101/pBR322-Pst I dG:HBV-Kpn I dC:;TetR AmpS HBV<+>VA<+>;B: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bam HI dC:;TetR AmpS HBV<+>VA<+>;E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Bgl II dC: / ;TetR AmpS HBV+ Tv;D: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG:HBV-Eco RI dC: j(;TetR AmpSHBV<+>I;E: E. coli HB 101/pBR322-Bam HI: HBV-Bam HI: I^A^/U/T ;Tet Amp HBV;F: E. Coli HB 101/pBR322-Eco RI:HBV-Eco RI:;TetR AmpR HBV<+>\;V ;Porsjoner av disse identiske kulturer er også deponert i;Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Skottland 19. desember 1979. ;Den ovenfor gitte nomenklatur for kulturene er en beskrivelse;av kulturene på følgende måte: Vert/kloningsbærer - begrensningsposisjon i kloningsbæreren med indikasjon av forlengende nukleotid (hvis noen): hepatitt B virus begrensningsposisjon i hepatitt B virus med indikasjon av forlengelse (hvis noen) : resistens (R) eller sensitivitet (S) ovenfor tetrasyklin (Tet) ;og ampicillin (Amp), positiv hybridisering til HBV DNA i koloni-hybridiseringsforsøk, som ovenfor angitt, (HBV<+>) og produksjon av polypeptid som utviser HBV antigenitet, se ovenfor, (VA+). ;Ved anvendelse av denne nomenklatur vil kulturen pBR3 22-HBV-A;angi en E. coli HB 101 kultur inneholdende som plasmid et rekombinant DNA-molekyl omfattende pBR322 spaltet ved Pst I og forlenget med en poly dG hale ved 3' avslutningen knyttet til HBV DNA spaltet med Kpn I og forlenget med en poly-dC hale ved ;3' enden, hvilken kultur utviser resistens overfor tetrasyklin, sensitivitet for ampicillin, en positiv HBV DNA hybridiserings-prøve og som produserer et polypeptid som utviser HBV antigeni- ;tet. ;Det må naturligvis forstås at hybridmikroorganismene, rekombi-;nante DNA-molekyler og polypeptidene samt fremgangsmåtene som er anvendbare på disse og ifølge oppfinnelsen ikke er begrenset til de beskrevet i den ovenfor beskrevne foretrukne utførelses-form. Istedenfor kan med fordel de hybride organismer, rekombinante DNA-molekyler og polypeptider modifiseres under frem-stillingen eller deretter ved hjelp av kjente metoder. For eksempel kan en mere effektiv uttrykkskontrollsekvens utnyttes for overføring til HBV-gener eller hybridgener, det kan inn-føres mutasjoner for å nedsette syntese av uønskede genpro-dukter, proteasenivået i vertscellene kan nedsettes, termoin-duserbare lysogener inneholdende HBV-genene kan innarbeides i vertskromosomet eller andre modifikasjoner og fremgangsmåter kan utføres for å forøke antall genkopier i cellen eller for å forøke cellens produktivitet med hensyn til fremstilling av de ønskede polypeptider. ;Bortsett fra deres anvendelse som fremstilling av polypeptider som utviser HBV-antigenitet kan hybridmikroorganismen ifølge oppfinnelsen også være nyttig ved fremstilling av store mengder DNA inneholdende alt eller deler av genomet for hepatitt B virus. For eksempel vil forsterkning, eksempelvis ved tilsetning av kloramphenicol til vekstmediet når celletettheten har nådd et egnet nivå, eller anvendelse av mutasjoner for å forhindre lyse i bakteriofage hybrider som inneholder HBV sekvenser tillate fremstilling av HBV DNA i mengder som tidligere ikke var tilgjengelige. ;HBV DNA fremstilt på denne måte kan anvendes for å bestemme nukleotid sekvensen av genomet og fra dette genet og aminose-kvensen for HBV antigener også strukturen for selv genene. Kjennskap til disse sekvenser vil hjelpe forståelsen av hepatitt B virusets biologi og tillate at de ovenfor beskrevne modifikasjoner kan utnyttes på beste måte. ;Kartlegging av DNA- fragmenter og nukleotidsekvensbestemmelse;1. Hepatitt B kjerneantigen;En serie rekombinante DNA-molekyler, fremstilt i henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, og som bibrakte deres verts celler evnen til å syntisereHBcAg, bestemt ved fastfasestråle-immunobestemmelse ble valgt for sekvensanalyse. Fragmentene ble fremstilt fra disse rekombinante DNA-molekyler ved behandling med passende restiksjonsenzymer og fragmentene merket ved deres 5' terminaler med [ o- ^P] ATP og T4 polynukleotid kinase. Nukleotidsekvensene av hvert fragment ble bestemt ved hjelp av velkjente kjemiske spaltningsmetoder (A. M. Maxam og W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, s. 560-564 (1977). Den erholdte nukleotidsekvens er avbildet i fig. 3-9. For henvisning er sekvensen nummerert fra A for ATG's oversettelsesinitierings kodon av kjernegenet. Nukleotidsekvensen forHBcAg genet og aminosyresekvensen for polypeptidet dedusert fra dette gen (leseramme 1) er vist i fig. 3-9 mellom nukleotidene 1 - 549. Størrelsen av polypeptidet kodet av dette gen er nær opp til 19 000 som ;er molekylvekten funnet for kjerneantigener fra "Dane"-partikler. Imidlertid vil den foreliggende strukturbestemmelse ikke eksklu-dere muligheten for at visse aminosyrer kan være delt av in vivo fra aminoendedelen av dette polypeptid under dannelse av det autentiske antigen. Strukturen tar heller ikke hensyn til andre eller ytterligere modifikasjoner av polypeptidet forårsaket av dets samspill med andre menneskeenzymer, eksempelvis de enzymer som glykosolerer proteiner. Den bestemte polypeptidstruktur behøver derfor ikke være identisk med den for HBcAg funnet in vivo, men den vil likevel frembringe en meget tilsvarende om ikke identisk, immunorespons. ;Alle de undersøkte rekombinante DNA-molekyler hadde HBV DNA inn-ført slik at kjerneantigenet ble bibeholdt i den samme oversettelsesfase som genet for penicillinresistens for pBR322. Ytterligere i de forskjellige rekombinanter begynnte HBV DNA-innskuddet innen en eller to nukleotider fra den samme posisjon i HBV-sekvensen. Fordi disse rekombinante DNA-molekyler opp-rinnelig skrev seg fra HBV DNA behandlet med forskjellige begrensningsenzymer, eksempelvis Bam HI og Kpn I, så er denne spesielle tilknytning overraskende og kan være resultat av et utilsiktet brudd eller polynukleotidvedheftning av HBV DNA ved innsnittet i det endogene DNA i "Dane"-partikkelen (fig. 1). Rekombinante DNA-molekyler med HBV DNA-innskuddet i en annen oversettelsesfase uttrykte ikkeHBcAg genet og det kunne heller ikke påvises noe polypeptid som utviste HBV antigenitet i verter omformet med slike rekombinante DNA-molekyler. Det vil naturligvis forstås at slike ikke-gen uttrykkende verter og rekombinante DNA-molekyler likevel er nyttige ved fremstilling av HBV DNA i henhold til foreliggende oppfinnelse. ;Selv om det var forventet at HBcAg eller fragmenter derav fremstilt ved uttrykning av HBV DNA-innskuddene ville være smeltet til produktet (3-laktamase) i genet for penicillinaseresistens via et lite antall glycinrester, så var dette ikke tilfelle. ;I stedet var 3-laktamase i hvert tilfelle smeltet via 5-8 glycinenheter til en identisk peptidsekvens, men denne sekvens sluttet etter 25 aminosyrer. I leserammen (ramme 1, fig. 3), er en stoppkodon (TAG) tre nukleotider senere etterfulgt av en initieringskodon fra hvilken oversettelsen fortsetter uhin-dret til å gi et polypeptid med en lengde på 183 aminosyrer (fig. 3-8). Derfor ligger kjerneantigenets aktivitet i et polypeptid med ca. 21 000 dalton oversatt de novo fra HBV sekvensen med mRNA overført fra det rekombinante DNA-molekyl. Dette polypeptid forblir i vertscellen fordi det ikke er knyttet til det utskilte penicillinasebærerprotein som følge av arrange-mentet med stopp- og start- kodoner i HBV DNA-innskuddet. ;2. Hepatitt B overflateantigen;Nukleotidsekvensen for genet for HBcAg og aminosyresekvensen for polypeptidet dedusert fra dette gen (leseramme 3) er også vist i fig. 6-8, mellom nukleotidene 1 437 - 2 114. Aminosyresekvensen for dette polypeptid begynner ved N terminalen med sekvensen met-glu-asn-ile-thr-ser. Denne initiale aminosyresekvens ble bestemt av D. L. Peterson et al., "Partial Amino Acid Sequence Of Two Major Component Polypeptides Of Hepatitis B Surface Antigen", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 74, s. 1530-1534 (1977) fra autentisk menneskeHBsAg. Aminosyresekvensen for dette protein fortsetter i fig. 6-8 til en stoppkodon 226 aminosyreenheter bortenfor. Denne 226 polypeptidsekvens tilsvarer et protein med 25 4 00 dalton. ;HBsAg aminosyresekvensen og lengden er uavhengig underbygget ved sekvensering av passende rekombinante DNA-molekyler av P. Valenzuela et al., "Nucleotide Sequence Of The Gene Coding For The Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen", Nature, 280, s. 815-819 (1979). ;Nukleotidsekvensen bestemt for rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen viser at ingen av de undersøkte som uttrykte genet for HBcAg kan ha genet for HBsAg i en stilling i hvilken den også kunne forventes å være uttrykt i en passende vertscelle. ;I virkeligheten kunne intet HBsAg påvises i ekstrakter fra celler transformert med de plasmider som ble funnet å uttrykke genet for HBcAg. Imidlertid som ovenfor bemerket vil kjennskap til nukleotidsekvensen for disse gener tillate modifikasjon av ut-trykningsprosessen for å forbedre utbyttet og effekten for å fremme uttrykning av genene og produksjon av polypeptider som tidligere ikke har vært uttrykt eller påvist. ;Fremstilling av forbedrede rekombinante DNA-molekyler for fremstilling av HBV- antigener ;Genet og aminosyresekvensen for disse antigener er nyttige for;å finne metoder for å forbedre produksjonsnivået av antigenet eller gen pr. bakteriecelle. ;Produksjonsnivået for et protein styres av to hovedfaktorer: antallet kopier av dets gen inne i cellen og effektiviteten med hvilken disse genkopier overføres og oversettes. Effektiviteten av overføring og oversettelse (som sammen utgjør uttrykk) er i sin tid avhengig av nukleotidsekvenser, som normalt er plassert foran den ønskede kodesekvens. Ved disse nukleotidsekvenser eller uttrykkskontrollsekvenser definerer blant annet lokaliseringen ved hvilken RNA-polymerase innvirker for å initiere transkripsjon (promotorsekvens) og ved hvilken ribo-somer bindes og reagerer med mRNA ( produktet av transkripsjon) for å initiere oversettelse. Ikke alle slike uttrykkskontrollsekvenser virker med lik effektivitet. Det er således fordelaktig å separere den spesifikke inkodningssekvens for det ønskede protein fra deres tilstøtende nukleotidsekvenser og i stedet smelte dem sammen til kjente uttrykkskontrollsekvenser for så ledes å fremme høye uttrykksnivåer. Når dette er oppnådd kan de nylig konstruerte DNA-fragmenter innføres i et multikopi-plasmid eller bakteriofagderivat for å forøke antall genkopier inne i cellen og derved ytterligere forbedre utbytte av uttrykt protein. ;For illustrasjon ble sekvensen bestemt for genet til HBcAg anvendt på denne måte for å forbedre produksjonen av HBcAg i E. ;coli. En slik fremgangsmåte er avbildet i fig. 10.;Innspeksjon av DNA-sekvensen for HBcAg i fig. 3 viser at forut;for dette gen ligger et mål for Alu I ved nukleotid-26 (AGCT);og inneholder mål for Eco RI<+>ved nukleotidene 22 og 1 590,, for Eco RII ved 209 (CCTGG), for Hae III ved 280 (GGCC) og for Ava ;II ved 246 og 461 (GGACC, GGTCC). Gitt denne kompleksitet er;det mere velegnet å overføre kjerneantigenkodesekvensen til en mere effektiv uttrykkskontrollsekvens i to trinn. For eksempel vil behandling av et rekombinant DNA-molekyl, fremstilt i henhold til oppfinnelsen, og som har et HBV DNA-innskudd med ca. ;2 350basepar (nukleotider), dvs. fra nukleotidene -80 til ca.;2 270 i fig. 3, med både Alu I og Eco RI<+>blant annet i fragmentet mellom nukleotidene -26 og 22 (Fragment A) mens behandling med Eco RI<+>alene gir fragmentet fra nukleotidene 23 til 1 58 9 (Fragment B) og lavere utbytter av et fragment fra nukleotidene 23 til 576 (FragmentB'). Disse fragmenter kan lett identifiseres ved henvisning til fig. 3 - 4 og er avbildet skjematisk i fig. 10. Fragmentene A og B ble fraksjonert ved gel elektroforese for rensing og forbundet via deres Eco RI<+>vedheftende ender til å gi et kombinert fragment (Fragment C). Fragment C er nå knyttet til en ny uttrykkskontrollsekvens som ;er passende via direkte underbinding for å bibeholde den korrekte oversettelsesfase via 3' endevedheftningsmetoden, som tidligere beskrevet, eller via syntetiske oligo-nukleotidtilknyttere. ;Denne tilknytning ikke bare gjør anvendelse av en bedre uttrykkskontrollsekvens for å forbedre proteinproduksjonen, men tillater også at genfragmentkoding forHBcAg ble knyttet nærmere til selve uttrykkskontrollsekvensen og således forsterker kontrollen av dette gens fragmentuttrykk. På lignende måte kan fragmentene A og B' forenes eller mange andre fragmenter fremstilles og det erholdte fragment anvendes som angitt ovenfor. Denne prosess viser at kun en del av den strukturelle genkoding for et spesielt polypeptid kun behøver å anvendes i et rekombinant DNA-molekyl (pH bV 114) ifølge foreliggende oppfinnelse. ;For ytterligere å avkorte avstanden mellom den spesielle uttrykkskontrollsekvens og den initierende kodon for det valgte genfragment kan fragmentet behandles forsiktig med en kombinasjon av nukleaser som virker spesifikt på eller nær dets ter-minal eller anvendes i eksonuklease og polymerase-forbundene sammenføyningsreaksjoner for å fjerne noe eller alt av de nukleotider av fragmentet som går forut for fragmentets startko-don. Alternativt kan et fragment, så som et Alu I fragment erholdt ved spaltning av nukleotidene -26 og 30 på samme måte forkortes ved eksonukleasebehandling eller polymerase-forbundene parvis gjenforeningsreaksjoner og deretter spaltet med Eco RI<+>for å gi et fragment fra området mellom nukleotidene -26 og 1 ;og nukleotid 22 for å tillate sammensmeltning av Fragment B;før tilknytning til uttrykkskontrollsekvensen. En ytterligere rute kan innbefatte hybidisering av Fragment B eller et ekvi-valent fragment til en passende enkeltbåndet mal fra det opp-rinnelige rekombinante DNA-molekyl for utvidelse i en serie reaksjoner med DNA polymerase og et begrenset antall nukleotid trifosfater slik at fragmentbåndet vil bli rekonstruert ved begynnelsen av kodningssekvensen. Malen eller sjablonbåndet vil da brytes ved posisjonen for dets tilknytning til det for-lengede fragmentbånd med endonuklease Sl og det således erholdte fragment knyttet til uttrykkskontrollsekvensen. ;Flere uttrykkskontrollsekvenser kan anvendes som ovenfor beskrevet. Disse innbefatter operatør, promotor og ribosombinding og samspillssekvenser (innbefattende sekvenser så som Shine-Dulango sekvenser) av laktoseoperonet av E. coli ("lac-systemet"), de tilsvarende sekvenser av tryptofansyntasesystemet av E. coli ("trp-systemet"), hovedoperatøren og promotorområdene av fag A (0LPLog Orpr) i°9kontrollområdet for fag fd belagt protein. DNA-fragmeter inneholdende disse sekvenser fjernes ved spalt- • ning med begrensningsenzymer fra DNA isolert fra transduserende fag som bærer lac eller trp operoner, eller fra DNA av fag A eller fd. Disse fragmenter blir deretter manipulert på samme måte som indikert for HBV-antigensekvensen for å oppnå en begrenset populasjon av molekyler slik at de vesentlig kontrol-lerende sekvenser kan forbindes meget nær til eller i samstil-ling med initieringskodonet av kodningssekvensen for det ønskede antigen slik som beskrevet ovenfor for Fragment C. ;Sammensmeltningsproduktet ble deretter innført som tidligere angitt i en kloningsbærer for transformasjon av passende verter og nivået for antigenproduksjonen måles ved radioimmunobestemmelse etter lyse av cellene. Cellene som gir det mest effektive uttrykk kan således utvelges. Alternativt kan anvendes kloningsbærere som bærer lac, trp eller A PT kontrollsystemet knyttet til et initieringskodon og smeltes til et fragment inneholdende en sekvenskodning for et polypeptid som utviser HBV-antigenitet slik at det strukturelle genfragment er korrekt oversatt fra initieringskodonet av kloningsbæreren. ;Selv om disse forsøk spesielt har vedrørt fremstilling av HBV-kjerneantigen så er de også anvendbare for forbedring av ut-trykkning av andre gener så som HBsAg og HBeAg gener og fragmenter derav. ;Ytterligere forøkelse av celleutbytte for disse spesielle antigener er avhengig av en forøkning i antall gener som kan utnyttes i cellen. Dette er oppnådd for illustrasjonsformål, ved innføring av rekombinante DNA-molekyler, "konstruert" på den tidligere beskrevne måte i.moderat bakteriofag A (NM989), ;ganske enkelt ved behandling av plasmidet med et begrensningsenzym, eksempelvis Eco RI eller Hind III til å gi et lineært molekyl som deretter ble blandet med en begrenset fag A kloningsbærer (eksempelvis av typen beskrevet av N.E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants", Molec. gen. Genet., 150, s. 53-61 (1977) og ;N.E. Murray et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, s. 493-505 (1979)) ;og danne det rekombinante DNA-molekyl ved inkubasjon med DNA— ligase. En slik fremgangsmåte er avbildet i fig. 11. Det ønskede rekombinante fag ble valgt ved radioimmunobestemmelse for ;det spesielle antigen eller ved hybridisering med radioaktive merkede HBV DNA-sekvenser og anvendt for lysogenering av en vertsstamme av E. coli. ;Spesielt nyttig A kloningsbærere inneholder en temperaturfølsom mutasjon iundertrykkelsesgenet cl og undertrykkbare mutasjoner i gen S, hvis produkt er nødvendig for lyse av vertscellen, samt gen E, hvilket produkt er det vesentlige nedbrytbare (capsid) protein i viruset. Med dette system dyrkes de lysogene celler ved 32°C og oppvarmes deretter til 45°C for å indusere avskjæring av profaget. Forlenget vekst ved 37°C fører til høye produk-sjonsnivåer av antigenet som bibeholdes inne i cellene, da disse ikke lyseres av faggenproduktene på den normale måte og fordi det innskutte faggen ikke blir nedbrutt (encapsidated) vil det forbli tilgjenglig for transkripsjon. Kunstig lyse av cellene vil deretter frigjøre antigenet med høyt utbytte (fig. 11). ;I tillegg til E. coli systemene som disse eksempler spesielt;har vedrørt kan de samme manipulasjonstyper også utføres for å forøke nivået av antigenproduksjonen i andre mikrobielle celler, så som B. subtilis, termofile bakterier eller gjær og sopp, eller i dyr- og planteceller i kultur. For tilfelle av B. subtilis danner et plasmid som bærer determinantene for penicillinase isolert fra B. licheniformis en nyttig uttrykkskontrollsekvens for disse formål. ;Fremstilling av forbedrede rekombinante DNA-molekyler for uttrykning av genkoding for HBsAg ;Gen og aminosyresekvenser bestemt for HBsAg er nyttige ved plan-legning av metoder som tillater uttrykning av genet for HBsAg ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte. Slikt uttrykk ble tidligere ikke observert'i verter transformert med rekombinante DNA-molekyler som produserte polypeptider som utviste HBV-antigenitet. ;Nukleotidsekvensen i fig. 6-8 utviser genkodingen for HBsAg mellom nukleotidene 1 437 og 2 114. Dette gen er i en forskjellig oversettelsesfase (avlesningsramme 3) enn genkodingen for HBcAg (avlesningsramme 1) i HBV-genomet i fig. 3-9. Derfor ble det valgt et rekombinant DNA-molekyl som ikke produserte HBcAg når det ble anvendt for transformasjon av en passende vert, men som inneholdt et HBV DNA-innskudd på ca. 2 350 nukleotider (tilsvarende ca. nukleotidene -80 til 2 270 i sekvensen i fig. 3-8) for anvendelse ved HBsAg fremstilling. ;Det valgte rekombinante DNA-molekyl inneholdt blant annet hele genkodingen for HBsAg. Undersøkelse av nukleotidsekvensen for HBV DNA-innskuddet for det rekombinante DNA-molekyl viste flere begrensningsendonukleasemål som tillot utskjæring av fragmenter inneholdende genkodingen for HBsAg. Eksempelvis nukleotid 1 409 (Xho), nukleotid 1 410 (Taq), nukleotid 1 409 (Ava I) og nukleotid 1 428 (Hha I) (fig. 6). Av disse er den siste (Hha I) særlig nyttig fordi avspaltning av HBV DNA-innskuddet finner sted mellom nukleotidene 1 430 og 1 431, dvs. en avskjæring kun seks nukleotider foran det overførende initieringskodon (ATG) for selve genet for HBsAg. I alle fire tilfeller vil det utskilte fragment utstrekke seg forbi det valgte HBV DNA-innskudd til et mål for den spesielle begrensningsendonuklease lokalisert inni i nukleotidsekvensen for pBR322 delen av det rekombinante DNA-molekyl. Derfor er anvendelse av disse begrensningsendonukleaser og andre tilsvarende nyttige, alene eller i kombinasjon, og tillater utskilling av genkoden for HBsAg nær, men foran dets initeringskodon og etter dets over-føringsterminerende kodon. Det må naturligvis forstås at som vist i tilfelle for genet for HBcAg er det kun nødvendig å anvende fragmenter av det hele gen i rekombinante DNA-molekyler for fremstilling av polypeptider som utviser HBsAg antigenitet i passende verter. ;Fragmenter av HBV DNA avledet fra slike oppslutninger har vært behandlet i en serie reaksjoner analoge til de som er beskrevet for gen og genfragmentkodningen for kjerneantigenet. For eksempel kan genfragmentet innføres i genkodningen for penicillin-resistensen for pBR322 (eksempelvis Pst I gjenkjenningsposisjonen, fig. 2) som fremstiller polypeptidet som utviser HBsAg antigenitet ved sammensmeltning ved 3-laktamase (produktet fra penicillinasegenet), eller fragmentet kan innføres mellom gen kodingen for penicillinresistens og tetrasyklinresistens i pBR322 (Eco RI eller Hind III gjenkjenningsposisjonene, fig. 2) og forenes der eller før innføring til lac systemuttrykkskon-trollsekvensen og derved danne polypeptidet som utviser HBsAg antigenitet sammensmeltet til B-galactosidaseproteinet i lac systemet, genfragmentet kan også innføres i en kloningsbærer så nær som mulig til selve den valgte uttrykkskontrollsekvens, slik som tidligere beskrevet for genkoding for HBcAg, eller genfragmentet kan på annen måte klones som beskrevet i henhold til foreliggende oppfinnelse. ;For illustrasjonsformål er et slikt system avbildet i fig. 12.;I henhold til dette ble det valgte rekombinante DNA-molekyl;med et HBV DNA innskudd som utstrakk seg mellom nukleotidene;-80 og 2 270 (fig. 3-8) fragmentert ved oppslutning med Hha I. Det erholdte fragment ble innført via 3' endevedheftningsmetoden, som tidligere beskrevet ved Pst I i pBR322. Verter transformert med dette rekombinante DNA-molekyl produserte polypeptider som utviste HBsAg antigenitet. ;Andre fragmenter (eksempelvis Ava I, Taq, Xho eller Pst I (delvis oppsluttet)) har også blitt innført ved Pst I gjenkjenningsposisjonen eller ved andre posisjoner ved pBR322 for å danne rekombinante DNA-molekyler som er nyttige ved fremstilling av polypeptider som utviser HBsAg antigenitet eller genfragmenter for koding av HBsAg. ;I tillegg har slike genfragmenter blitt innført i pBr322, som var spaltet av Pst I og det erholdte fragment for genkoding for penicillinase og deretter trinnvis avdelt fra kodonkodingen for aminosyre 182 for penicillinase eller 3-laktamase i et tilfelle til kodonkodingen for aminosyre 32 og i et annet tilfelle til kodonkodingen for aminosyre 13 av dette polypeptid. Disse avledede plasmider av pBR322-Pst I<1>har også blitt anvendt med HBsAg genfragmenter som utstrakte seg fra nukleotidene 1 447 til 1 796 (fig. 6-7) til å produsere polypeptider som utviser HBsAg antigenitet. ;Nukleotidsekvensen mellom nukleotidene 948 og 1 437, umiddelbart før den strukturelle genkoding for HBsAg kan også være inn-befattet i fragmentene som anvendes for fremstilling av nyttige rekombinante DNA-molekyler for fremstilling av polypeptider som utviser HBsAg antigenitet og av genfragmentene for det strukturelle gen for HBsAg. Denne nukleotidsekvens betegnes som forløpersekvensen for dette gen. Genfragmenter innbefattende både denne forløpersekvens og det strukturelle HBsAg kan av- ;deles med Alu I (nukleotid 939), Hha I (nukleotid 900) eller Hae II (nukleotid 899). For tilfelle av Alu I og Hha I er en delvis oppslutning og separasjon av de dannede fragmenter, eksempelvis ved gelelektroforese, nødvendig fordi gjenkjennel-sesposisjonene for disse enzymer også er til stede inne i for-løpersekvensen for nukleotid 1 091 og for Alu I og ved nukleotid 1 428 forHha II. ;Mikroorganismer fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er eksemplifisert ved hjelp av kulturer deponert i Culture Collection of the National Collection of Industrial Bacteria, ;Aberdeen, Skottland den 19. desember 1979 og er identifisert;som pBR3 2 2-HBV-G-L og erkarakterisertsom følger:;G: E. coli HB101/pBR322-Pst I dG: HBV-Kpn I dC;(i det etterfølgende "pHBVH4") :TetR Amp<S>HBV<+>;H: E. coli HBl01/pBR322-Pst I'dG:pHBV114-Pst "^b&P . ;I:Tet<R>Amp<S>HBV<+>VA<+>I: E. coli HB101/ (pBR322-Eco RI, Bam HI: ' ;lac promotor sekvens) -Hind III tilknyttere: HBV114-Hha \ tø£tøML>y ;I Bam HI: Tet<S>Amp<R>HBV<+>Va<+>J: E. coli HBl01/pUR2<*>Eco RI:HBV114-Hha I Eco RI

tilknyttere:Tet<S>Amp<R>HBV<+>VA<+>

K: E. coli HB101/pBR322-Pst I dG:pHBV114-Ava I dC

Tet<R>Amp<S>HBV+ VA+

L: E. coli HBl01/pBR322-Pst I dG:pHBV114-Taq dC

Tet<R>Amp<S>HBV+ Va+

Et derivat av pBR322 med en DNA-sekvens hvor kodingen for polypeptidet med tetrasyklinresistens er erstattet med en mindre DNA-sekvens innbefattende E. coli lac-systemet.

Claims (15)

1. Et rekombinant DNA-molekyl, karakterisert omfatter en jninst^ ett polypeptid som utviser HBV-antigeniitet, idet DNA-sekvensen velges fra gruppen omfattende DNA-sekvenser som koder for hepatitt B virus-overflat.eantigen eller fragmenter derav, DNA-sekvenser som koder for hepatiitt B virus-kjerneantigen _eller fragmenter derav og DNA-sekvenser inneholdende de nevnte DNA-sekvenser eller fragmeiter som en del derav, idet DNA-sekvensene operativt er knyttet til en ekspresjons-kontrollsekvens i det rekombinante DNA-molekyl.

2. Rekombinant DNA-molekyl ifølg<; krav 1, karakterisert ved en rekombinant kloningsvektor omfattende en første og andre rest :iksjonsendonukleasegjen-k jenningsposis jon , idet DNA-sekv snsen koder f or^rninsjt^_ett polypeptid som utviser HBV-antigsnitet og er inskutt mellom den første og andre restriksjons posisjon.

3. Rekombinant DNA-molekyl ifølg* krav 1 eller 2, karakterisert ved at dens strukturelle genkoding f or^^s^e^tt^olypept .d som utviser HBV-antigenitet er ATGGACATTGACCCTTaTAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAG TTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCrTCCGTACGAGATCTTCTAGATACCG CCGCAGCTCTGTATCGGGATGCCTTAGAGTCTqCTGAGCATTGTTCACCTCACCATAC TGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGAGACTTAATGACTCTAGCTACCTGGGTG "HB C ( fa GGTACTAATTTAGAAGATCCAGCATCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTA ATGTGGGCCTAAAGTTCAGACAATTATTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGG AAGAGAAACGGTTCTAGAGTATTTGGTGTCTTTTCGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCA GCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCA/jcGCTTCCGGAGACTACTGTTGTTA GACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCqpTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCA . ATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAA TCTCAATGTTAG en^er^frag-m^ivter^derav som koder for polypeptider som utviser stor HBV-antigenitet.;

4. Rekombinant DNA-molekyl ifølge irav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for minst ett polypeptid som utviser HBV-antigenitet er ATGGAGAACATCACATCA GGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATC CTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGA ACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTCACCAACC TCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAA GGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGCACGGGATCC TGCAGAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGAATCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGT ACAAAACCTTCGGATGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTC GGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTG CCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCATTGTTTGGCTTTCAGTTATATGG ATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTG TTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGCATACATTTAA eller fragmenter derav somkoder for polypeptider som utviser HBV-antigenitet.;

5. Rekombinant DNA-molekyl i henhold til kravene 2-4, karakterisert ved at uttrykkskontrollsekvensen er innskutt mellom ytterligere endonukleasegjen-kjenningsposisjoner i kloningsvektoren.;

6. Rekombinant DNA-molekyl ifølge kravene 1-5, karakterisert ved at uttrykkskontrollsekvensen omfatter et lac-system, et trp-system, hovedoperatør og pro-moterområder av fag A eller kontrollområdet av fag fd kapselprotein.;

7.R ekombinant DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved" at det består av pBR322-Pst I dG:HBV- Kpn I dC; pBR322-Pst I dG : HBV-B_am HI dC; pUR2-EcoRI : pHBV114-HhaI, EcoRI bindere; pBR322-PstI dG:pHBV114-AvaI dC; og pBR322-PstI dG:pHBV114-Taq dC.;

8. Rekombinant DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at det omfatter gruppen bestående av rekombinante DNA-molekyler som inneholdes i den transformerte E.coli HB 101 stamme deponert i Culture Collection of the Microbiological Research Establishment at Porton Down, identifisert som pBR322-HBV-A - F og deponert i National Collection of Industrial Bacteria, identifisert som pBR322-HBV-G - L.;

9. En en-cellet vert omfattende stammer avE .coli, Pseudo-monus, Bacillus subtilis eller andre bakterier, gjær eller dyre- og planteceller i kultur, karakterisert ved at de er transformert med minst ett rekombinant DNA-molekyl i henhold til hvilket som helst av de foregående krav.;

10. En-cellet vert ifølge krav 9, karakter i- ' III sert ved at den omfatter gruppen bestående av tC <l<*> u^ E. coli HB 101/pBR322 J<f , Pst I dG/HBV-Kpn I DC:TetR AmpSHBV+VA; E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG/HBV-Bam HI dC: TetRAmpSHBV+VA+; E . coli HB 101/pUR2- h i (\ 0Eco RI: pHBV114-Hha I, Eco RI bindere: TetSAmpRH BV+VA+; l - tøOLoC E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG: pHBV114-Ava I dC:Tet <R> Amp <S> HBV <+> VA <+> ; og E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG: pHBV114-Ta3 dC:Tet <R> Amp <S> HBV <+> Va <+> .

11. En-cellet vert ifølge krav 10, karakterisert ved at den omfatter transformerte E.coli HB 101 stammer deponert i Culture Collection of the Microbiological Research Establishment at Porton Down, identifisert som pBR322-HBV-A - F og i National Collection of Industrial Bacteria, identifisert som pBR322-HBV-G - L. x

12. Et polypeptid som utviser HBV-antigenitet, karakterisert ved at det er produsert av en en-cellet vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl i henhold til hvilket som helst av kravene 1-8.

13. Polypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved den følgende formel MetGluAsnlleThrSerGly PheLeuGlyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArglleLeu ThrlleProGlnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThr |(^>S ^ ThrValCysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProIleSerAsnHisSerProThrSer J CysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhellellePhe LeuPhelleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGly MetLeuProValCysProLeuIleProGlySerSerThrThrSerThrGlySerCys ArgThrCysThrThrProAlaGlnGlylleSerMetTyrProSerCysCysCysThr LysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSerSerTrpAlaPheGly LysPheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuValPro PheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProIleValTrpLeuSerVallleTrpMet MetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlleLeuSerProPheLeuProLeuLeu ProIlePhePheCysLeuTrpAlaTyrlle, eller med formelen Met AspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaThrValGluLeuLeuSerPheLeuPro SerAspPhePheProSerValArgAspLeuLeuAspThrAlaAlaAlaLeuTyrArg AspAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHi sHi sThrAlaLeuArgGlnAla IleLeuCysTrpGlyAspLeuMetThrLeuAlaThrTrpValGlyThrAsnLeuGlu AspProAlaSerArgAspLeuValValSerTyrValAsnThrAsnValGlyLeuLys PheArgGlnLeuLeuTrpPheHisIleSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrVal LeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrpIleArgThrProProAlaTyrArgPro ProAsnAlaProIleLeuSerThrLeuProGluThrThrValValArgArgArgGly ArgSerProArgArgArgThrProSerProArgArgArgArgSerGlnSerProArg ArgArgArgSerGlnSerArgGluSerGlnCys^ 3^5 -^5^2^f3 i££ 3^fZ<_> som utviser HBV-antigenitet.

14. DNA-sekvens som koder f or jnins^ ^e_tt^ _polypeptid som utviser HBV-antigenitet, karakterisert ved at det er fremstilt av en en-cellet vert transformert med et DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1-8.

15. Middel for påvisning av HBV-infeks joner i blodserum, karakterisert ved minst ett polypeptid som utviser HBV-antigenitet eller minst en DNA-sekvens som koder for HBV-antigenitet, fremstilt av en en-cellet vert transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 eller minst ett antilegeme til hvilket som helst av de nevnte polypeptider.