PL152568B1 - Protein extraction and purification method - Google Patents

Protein extraction and purification method

Info

Publication number
PL152568B1
PL152568B1 PL1986258745A PL25874586A PL152568B1 PL 152568 B1 PL152568 B1 PL 152568B1 PL 1986258745 A PL1986258745 A PL 1986258745A PL 25874586 A PL25874586 A PL 25874586A PL 152568 B1 PL152568 B1 PL 152568B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
supernatant
protein
subjected
ultrafiltration
hbsag
Prior art date
Application number
PL1986258745A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of PL152568B1 publication Critical patent/PL152568B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/303—Extraction; Separation; Purification by precipitation by salting out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA OPIS PATENTOWY 152568 Int.-Cl.5 A61K 39/29 C12N 15/00
Patent dodatkowy do patentu nr--- Zgłoszono: 56 04 03 /P. 258745/
Pierwszeństwo:85 04 03 Stany Zjednoczone Ameryki tnuuu
URZĄD PATENTOWY Zgłoszenie ogłoszono: 87 02 09 jULIiLI
RP Opis patentowy opublikowano: 1991 06 28
Twórca wynalazku:
Uprawniony z patentu: Smithkline Biologicals a.a., Rixensart /Belgia/
SPOSÓB EKSTRAKCJI I OCZYSZCZANIA BIAŁEK
Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji i oczyszczania białek w hodowli, w której są produkowane, a dokładniej sposób ekstrakcji i oczyszczania powierzchniowego antygenu wirusa hepatitis B i alfa-1-antytiypsyny, wytwarzanych za pomocą techniki rekombirnaji DNA w hodowlach komórek uzyskanych metodami inżynierii genetycznej, a dokładniej w hodowlach szczepów drożdży otrzymanych ratodami inżynierii genetycznej.
Mogą być stosowane różne drobnoustroje, a wśród nich bakterie i drożdże, jako organizmy gospodarcze dla różnych plazmidów zawierających cząsteczkę DNA posiadającą sekwencję nukleotydową kodującą specyficzne białko. Z tych drobnoustrojów korzystne są drożdże i są one ostatnio do tych celów stosowane. Np., w opublikująnym europejskim zgłoszeniu pateno^ym nr 0 106 82Θ ujawniono zastosowanie szczepów Saccharomyces cerevisiae dla wytwarzania powierzchniowego antygenu wirusa hepaaitis B /HBsAg/, a w opubliklwanym europejskim zgłoszeniu patentwwym nr O 103 409 opisano wytwarzanie alfa-1antytrypsyny z plazmid ów drożdży.
Wytwwazanie białka przez szczepy drożdży ma istotną przewagę nad wytwarzaniem przez szczepy bakteryjne. Ta przewaga wynika z łatwego wzrostu drożdży w dużych fermentoraoh i z faktu, iż w odróżnieniu od bakterii drożdże są zbliżone do komórek ssaków pod względem zdolności wprowadzania grup węglowodanowych do nowo syntetyowwanych białek.
Mimo wszystko, ekstrakcja i oczyszczanie białka z hodowli drożdży stwarza problemy techniczne ze względu na złożony skład chemiczny komórek drożdży, a w szczególności ze względu na wysoki poziom lipidów przy zwiększaniu wzrostu drożdży w celu poprawienia wydaaności polipeptydów.
Przyjmuje się np·, że ściana komórkowa Saccharomrces składa się z trzech warstw:
/a/ wewwętrznej warstwy nierozpuszczalnego w zasadaoh /3-glukanu, /b/ środkowej warstwy rozpuszczałnego w zasadach β -glukanu, oraz /c/ zewnętrznej warstwy glikoproteinowej, w której węglowodanem jest foaforyowwany mnnitan. Pod ścianą komórkową znajduje się błona cytoplazmiczna będąca bardzo skomplikowaną mieszaniną obojętnych lipddów /mono-,
152 568
152 568 dwu- i trójgliee rydów/, wolnych i zestiyfk kowanych steroli, kompleksowyoh sfing o lipidów, glicerofosfatydów oraz obojętnych i kwaśnych glikolppidow. Jądro zawiera DNA, różne gatunki RNA oraz polifosforan. Wooiiizki mogą zawierać wiele różnych składników zarówno o wysokim jak i. niskim ciężarze cząstecikowym i służą one jako pęcherzyki do przechowywania wielu enzymów hydrolitycznych. Mitochondria są bogate w składniki lipidowe, fosfolppddwe i ergosterolowe systemu błon, a cytoplazma zawiera między innymi duże ilości rybosomów, polifosforanów, glikogenu i wiele enzymów glikolitycznych. Większość komórek drożdży /takich jak Saccharomyyes/ zawiera także pewne ilości lipidów w postaci kuleczek, których ilość wzrasta w intensywnych hodowlach.
Opisano szereg wieloetapowych procesów ekstrakcji i oczyszczania białek pochodzących z różnych źródeł. Przykłady dotyczące białek wytwarzanych przez drobnoustroje uzyskane metodami inżynierii genetycznej opisano w pracy Th. Staehelina i wsp., w J. BLol. Chem., 256, 9750-9754 /1981,/, pracy K. Murraya i wsp·, w The Embo J·, 3, 645-650 /198-4,/, oraz w pracy R. A. Hit znana i wsp·, w Nuci* Ac. Res., 11, 2745-2763 /1983/·
Gdy wytwarzane białko znajduje się w komórce, wóweras powyższe różne procesy można podzielić na trzy serie etapów.
W pierwszej serii etapów pożądane białko usuwa się z wnętrza komórki. W tym celu komórki poddaje się albo lizie /np. za pomocą enzymu/ albo rozrywa się je /np. za pomocą sił mełhnicznych, takich jak siły tnące, stosując np. prasę Σ lub prasę francuską/, albo wytrząsa się je kulkami szklanymi, ewentualnie przy dodatku detergenta /patrz np. K. Muray i wsp., cytowana praca i R. A. Hitzman i wsp., cytowana praca/.
W drugiej serii etapów medium jest wzbogacane w pożądane białko, np. za pomocą frakcjonowanego wytrącania dodatkiem siarczanu amonu i/lub glikolu polietyennowego.
W trzeciej wreszcie serii operacji eliminuje się praktycznie wszystkie zanieczyszczenia, stosując np. jedną lub kilka operacji, takich jak ultrafiltracja, chromatografia jonowymmenna, filtracja na żelu i wirowanie w gradiencie izeRyk^.
Jest oczywiste, że obecne w tych procesach zanieczyszczenia, takie jak towarzyszące białka /opisane przez R. A. Hitzmana i wsp. w cytowanej pracy/, kwasy nukleinowe i lipidy, a zwłaszoza wysokie poziomy lipddów, wyynerają niekorzystny wpływ na co najmniej jeden z etapów trzeciej serii, np. na ultrafiltrację i chromaogrrfię kolumnową. Ponadto, enzymy proteolityczne muszą być szybko usuwane ze środowiska. Należy także zwróoić uwagę na fakt, że wytrącanie siarczą nem amonowym jest niemożliwe bez wstępnego zgrubnego usunięcia lipddów, gdyż przeszkadzają one wytrącaniu.
Dlatego też podstawowe znaczenie ma znalezienie ratody pozwaaającej na usuwanie większości zanieczyszczeń, przed rozpoczęciem trzeciej serii operacji.
W niektórych ze znanych sposobów opisano zastosowanie glikolu polietyCifowegf jako sele^wnego środka wytrącającego dla białek oraz przedstawiono także mtodę strącania lipoprotein z osocza z wykorzystaniem reakcji lipoprotein z polianfinθi i mtalem.
Metoda frakcjonowego wytrącania białek za pomocą niejonowych rozpuszczalnych w wodzie poimerów, w szczególności glikolu poliθtyeifowegf /PEG/, została wprowadzona przez PoJsona i wsp. w Biochem. Biophys. Acta, 82, 463-475 /1974/ i dyskutowana przez różnych autorów. Jedni z nich, W. Honig i wsp., wspominają w Annayt. Biochem·, 72, 502-512 /1976/, że specyficzność wytrącania, to znaczy stosunek pożądanego białka do całkowitej ilości białek, może ulec poprawie przez zastosowanie frakcji PEG o niższym średnim ciężarze cząs^-eezkow^^ niż ogólnie stosowany PEG 6000. Aczkolwiek przez dobór wartości pH można otrzymywać koncentraty poszczególnych białek osocza, to jak dodają autorzy jednak oczyszczanie bardziej złożonych mieszanin białek, takich jak supernatant homogenizatu komórek, jest znaoznie gorsze.
P. R. Foster i wsp. opisali w Biochem. Biophys., Acta, 317, 505-516 /1973/ młodę wytrącania enzymów z ekstrakt ów komórek Saccharom/ces cerevisiae za pomocą PEG. Metody zatężenia i oczyszczania wirusów i bakteriofagów ca pomocą PEG opisał B. P. Yajda w
152 568
Folia Micro biol., 23 , 88-96 /1978/ oraz G. J. Lanca w Arch. Yirusf orsch., 42, 303-306 /1973/· W dziedzinie izolowania antygenu zapalenia wątroby, oczyszczanie powierzchniowego antygenu wirusa hepptitis B /HBsAg/ zostało opisane przez Ph. Adamooicza i wsp. w Inserm Symposium No. 18, str. 37-49, Hepa^a B Vaccine, ^dawca Elsevier, Amsterdam, Holandia, 1981. Wykorzystano tu metodę polegającą na dwukrotnym trafcoowaniu PEG 6000.
W tej mtodzie oczyszczania HBsAg z osocza, w pierwszym etapie są wytrącane z osocza jsmunokoIsaθkty i większość lipo protein za pomocą dodawwnia PEG 6000 do stężenia . 5,5%, a następnie w drugim etapie wytrąca się - HBsAg z oddzielonego- sup^łmatantu dodatkiem PGE do końcowego stężenia 10%.
W opisie pateno owym Stanów Zjedn. Aimryici nr 3 790 552 przedstawiono sposób usuwania antygenu związanego z zapaleniem wątroby z frakcji białka, polegający na zastosowaniu PEG o ciężarze cząsteczkowym 200-6000 w ilości 12-^0% /waga na objętość/ do ^trącania po^ższego antygenu.
W opisie patenOiwym Stanów Zjedn. Ameyki nr 3 951 937 przedstawiono sposób oczyszczania antygenu hepeł^s B /HBsAg/ polegający na dwukrotnym wytrącaniu HBsAg za pomocą PEG o ciężarze cząsteczkowym co najmniej 600, stosowanym w stężeniu wynoszącym 4,0-4,5% Wag^owcin.
W opisie paten^w^ Sta!<w Zjedn. Aimeyki nr 3 994 870 ujawniono sposób oczyszczania antygenu hopp^^s B /HBAg/, w którym HBAg jest wytrącany za pomocą dodatku 4,0-4j5% wagowych PEG i następnie poddawany chruratoorafii z powinowactwem, z wykorzystaniem
A jako adSorbnta chΓlmtol2,&ficznrgo·
W opublikowanym europejskim zgłoszeniu paienOiWjm nr 0 112 506 ujawniono sposób wytwarzania szczepionki zapobbega j ącej zapaleniu wątroby /^ρβΙϊΛ^ B/, polega jący na strącaniu z osocza siarczanem amonu i następnie αdsolpaji na koloidalnym krzemianie oraz dwóch kolejnych wytrąceniach za pomocą PEG o ciężarze czątteczOiwys 2000-10 000 w stężeniu 3-7% /waga na objętość/ w celu wytrącenia wirusa hepaaitis B i immunokomplek· sów, a następnie w stężeniu 15-^22C^% /waga na- objętość/ w ηροτ^ί^^ dla wytrącenia HBaAg.
W zakresie izolacji tlga-1-antytrypsyny japońskie zgłoszenie patentowe 9128-355 /Deϊielt 84-217127/ ujawnia wytrącanie alfa-1tanjyryapθynn z frakcji osocza za pomocą dodawania PEG do stężenia 15-20% /waga na objętość/.
Jak uprzednio podano, młoda wytrącania lipoprotein, w której wykorzystuje się reakcję lip^ntein z polianoonem 1 mtalem, została także opisana np. przez M. Bursteina i wsp. w Adv. Lip. Res·, 11, 67-108 /1973/ i przez A. Van Dałem i wsp. w Bioohem. et Biophys. Acta, 147, 421-427 /1967/. Metoda ta jest oparta na reakcji pomiędzy lipoproteirnmi, dwuwirtośc0cwym katoonem mealu i kwasowym wielocukrem. W tych warunka^ ilość wytrąconego osadu jest funkcją stężenia dwuwartościowego kationu mealu.
Wyjściowym maariałem w sposobie według wym lazku /okreśaanym także jako surowy eks^iralk/ jest supernata! z otrzymanych metodą inżynierii genetycznej komórek drożdży wytwarzających wbudowane w komórkę białko, które to komóóki są rozi^am dobrze znanym sposobem w obecności nie omowego detergenta.
Zgodnie ze sposobem według wynnlazku, stosuje się kombbnację frakcllOiwanrgo wytrącania za pomocą PEG /pierwszy etapy/ 1 następnie albo frakcjonowane wtrącanie za pomocą wielowartośc0iwrgo kationu mealu /w szczególności dwuwittościowrgl kationu mealu, takiego jak wapń i mngan/ albo wytrącanie siarcaanem amonu, przy czym wytrącanie to jest eienluallie poprzedzone ultrafiltracją supernatu^ z pierwszego etapu.
Otecnie stwierdzono, że gdy stosuje się stały PEG /np. PEG 6000/ w stężeniu 6-12% /waga na objętość/ do ekstrakcji HBsAg z - produkowanych mtodami inżynneeii genetycznej komórek drożdży rozrywanych w nie oonowego detergenta, wówczas HBs-Ag nie wytrąca się· Ponadto, po następnym dodaniu siarcząnu amonu tworzy się układ dwufazowy charakteryzujący się tym, że HBsAg jest obecny w fazie PBG, natomiast większość zanieczyszczeń pozostaje w fazie woome. Jest to zaskakujący wynik, gdyż zgodnie z dotych4
152 568 czasową wiedzą dotyczącą innyoh surowych produktów, takie warunki pracy powinny powodować wytrącanie aię HBsAg. Stąd, celem wynalazku jest zastosowanie PBG jako rozpuszczalnika dla pożądanego białka produkowanego w hodowli komórkowej drożdży, przy czym większość zanieczyszczeń jest^ elhnnnowana za pomocą wtrącania ze środowiska.
PEG występuje w postaci stałej lub ciekłej w zależności od ciężaru cząsteczkowego. Granica między tymi postaciami przebiega około ciężaru cząsteczkowego 1500.
W pierwszym etapie sposobu według wynalazku /który może. być uważany za etap klarowania/ mogą być oczywiście stosowane glikole polietylenowe o różnych ciężarach cząstaczkowych i odpowiednie stężenie zależne od ciężaru cząsteczkowego.
Np., stężenie stałego PBG /np. PBG 6000/ wynosi korzystnie 6-12# /waga na objętość/, a stężenie ciekłego PBG /np. PBG 300 lub 400/ wynosi 10-35%, korzystnie 20-30# /objętość na objętość/. Korzystne jest jednak stosowanie ciekłego PBG ze względów technicznych, np. ze względu na łatwość późniejszej ultrafiltracji.
Przedmiotem wynalazku jest więc sposób ekstrakcji i oczyszczania białek, a dokładniej HBsAg lub alfa-1-anbytrypsyny z supernatantu komórek drożdży rozbitych w obeoności niejonowego detergenta, korzystnie detergenta polisorbiannowego. Supernatant ten określa się jako surowy ekstrakt. Sposób według wym lazku polega na tym, że w pierwszym etapie doda je się do surowego ekstraktu przy wartości pH 6,0+0,1 albo 6-12# /waga na objętość/ stałego PBG albo, korzystnie, 10-25# /objętość na objętość/ ciekłego PBG. Powyższe granice stężeń PBG są głównie ustalane na podstawie określenia punktu klarowności, gdyż dalsze dodawanie PBG mi jedynie ujemny efekt, to znaczy zwiększa lepkość roztworu i ryzyko niepożądanego współstrąoenia HBsAg lub alfa-1-antyt:ypsyny.
W sposobie według wyralazku PBG jest polmurycznym rozpuszczalnikom organicznym faworyzującym między innymi wytrącanie /lipo/ protein, których punkt izoelektryczny jest bliski wartości pH 6,0 oraz rozpuszczanie innych /lipo/protein, to znaczy takich, która mają znacznie różny punkt izmlektiyrczny i są bardzo hydrofobowe.
Stwierdzono, że w tym etapie klarowania za pomocą PBG wytrąca się około 75# zanieczyszczających białek, 90# wielocukrów, 94# kwasów nukleinowych i 45# lipidów, natomiast praktycznie cełość HBsAg lub alfa-1-antytrypsyny odzyskuje się w supernatanoie.
Jak podano powyżej, sposób według wynalazku jest połączeniem etapów, z których pierwszy stanowi etap klarowania prowadzący do otrzymywania częśoiowo oczyszczonego i ewentualnie nie opalizującego roztworu pożądanego białka.
W drugim etapie sposobu według wynalazku, otrzymany częściowo oczyszczony roztwór jest albo traktowany wielowartoscoowym, a zwłaszcza dwuwaatościowym, kationem mtalu, takm jak wodny roztwór chlorku wapcda lub ranganu, do stężenia końcowego wynoszącego 30 mM, albo traktowany siarczanem amonu. Siarczan amonu dodaje się albo po ultrafiltraoji opalizującego roztworu w postaci stałej do nasycenia 40-50#, zgodnie z klasyczną metodą wysalania pożądanego białka prowadzoną w buforze fosno-noowym, albo siarczan amonu dodaje się do nasycenia 40-50# do zawierającego PGB supernatantu, w wyniku czego tworzy się dwufazowy system z pożądanym białkeem w fazie PBG.
Każdy z tych wariant-cw drugiego etapu daje klarowny roztwór pożądanego białka, znacznie oczyszczony pod względem zawsa,tości wielocukrów, kwasów nukleinowych, lipddów i zanieczyszczających białek.
Tak ntriymany roztwór może być dalej przerabiany w omówwonej uprzednio trzeciej grupie klasycznych sposobów, takich np. jak ultrafiltracja, filtracja na żelu i chromtografia kolumnowe. W korzystnym wykonmiu sposobu na trzecią serię operacji składają się kolejno ultraf4 iltrac ja, pierwsza filtracja na żelu, chromaaografia kolumnowa na słabo alkalionym wymieniaczu jonowym zawierającym grupy dwueeylnaminoθtylowe /DBAB/ i druga fitrracja na żelu lub wirowanie w gradiencie stężenia chlorku ceznwθgn. Otrzymuje się wysoko oczyszczony roztwór HBsAg lub alfa-1—antyt:ypsyny, ndpowOθdni do zastosowania mdyczrago.
152 568
Oznaczenia za pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym /z dodecylosiarczanem sodowym/ produktu odzyskanego po drugiej filtraoji na żelu wykaoały, że jego czystość wynosi powyżej 98% w o^r^n^i^j.eniu do pasma 23 K, charakterystycznego dla HBsAg pochodzącego z drożdży·
Podstawową zaletą sposobu według wynalazku jest więc molliwlść usuwania praktycznie wszystkich wielocukrów, kwasów nukleinowych, lipddów i mitiiołu białkowego, zaś inną zaletą molliwlść wyddzelania pożądanego białka ze stosunkowo wysoką wyddinością·
Gdy sposób według'wynalazku stosuje się do surowego ekstraktu HBsAg z uzyskanych metodom. inżynierii geratycznej komórek drożdży, wówczas otrzymany HBsAg jest związany z ^μοι^ detergentem, tworząc kompleksowe micele o średnicy około 17-20 nm. Stwierdzono, że stosunek ilości niejonowego detergenta do ilości białek, całkowitej ilości lipddów i polisorbitanu w komplekso^j mice li polislΓbiianowej wynosi 1-35% /waga na objętość·/, zgodnie z klłlrymetϊyrcznym oznaczeniem białek /LuTr^/, całkowitej ilości lipidów /Zollner/ i niaoonowego detergenta /Huddleston i Allred/.
Kumliksowe micele otrzymywane sposobem według wyralazku przy zastosowaniu polisorbitanowego nillonowego detergenta są nowym związkami i wchodzą także w zakres wynalazku· Mają one właściwości Ιπ^ο^θηIczne i można z nich sporządzać szczepionkę podobną do klasycznej szczepionki HBsAg, sporządzanej sposobem dobrze znanym w dziedzinie ^^1^wo · rzanio szczepionek z wirusa hepaittis B.
Wy Miazek jest poniższymi, nie ograniczającymi jego zakresu, przykładami
Pr zykład I. W 7,12 litrach roztworu Na2HP0^ /7,098 g/1 itr/ zawieszano 3850 g pastylek komórek drożdży wytwarzającego HBsAg, hodowanego do uzyskania 30 g suchychkomórek w litrze
Do powyższej zawiesiny dodano 142,5 ml 4% /waga na objętość/ roztworu BDTA, 38,5 ml polisorbitanu 20 i 3θ5 ml iz^r^ono^ zawierającego 2,7 g fluorku flnylomeyloθulfliylu /PMSF/. Wartość pH doprowadzono do 8,1+0,1 za pomocą 10# roztworu NaOH w wodie. Zawiesinę ochłodzono w łaźni lodowej i kumplci rozrywano przepuszczając dwukrotnie przei chłodzony z kulkami szklanymi. Hlmolθnizat /surowy ekstrakt/ wirowano w ciągu 30 minut przy 13 000 g.
Do utrzymywanego w temperaturze poniżej 15°C surowego ekstraktu /7,7 litrów/ dodano powili 2,5 li^w PBG 400, po czym pH doprowadzono do 6+0,1 za pomocą 5 mlarnego kwasu octowego. Całość przet^y mywano w ciągu jednej godziny w tempera turze 4°C, a następnie wirowano w ciągu 45 m.nut przy 7 400-11 000 g.
Wartość pH supernatαitu doprowadzono do 7,0+0,05 za pomocą 1 n roztworu NaOH, a następnie dodano 300 m. 1 molornego roztworu CaC^, to znaczy 30 ml na jeden litr supernatontu· Wartość pH doprowadzono do 7+0,05 1 n roztworu NaOH i pozostawiono w ciągu nocy w temperaturze 4°C. Zawwesinę wirowano w ciągu 45 minut przy 3600 g, po czym supernatont poddano ultrafiltracji no operacie Amicon DC /sprzedawany przez firmę Amicon Corp., Danvers, MA, USA/ - wyp^oż^iym we wkład odcinający frakcję o 100 000 daltonów i zatężano w ten sposób do 1/4 pierwotnej objętości /1500 ml/. Roztwór prze^to w sposób ciągły 12,5 1 10 nM trometamolu, którego pH doprowadzono do 8+0,1 dodatkiem 1 n kwasu solnego /bufor ten określony jest w niniej sż^ opisie jako itkmeiamol pH 8/, o następnie dodano P^F, izoproponol i EDTA do klńolwyih stężeń odpowwednio 1 mi, 2,5% /objętość na objętość/ 1 2 mi. Re tent ont zai^żlil dalej do 350 ml·
Zatężony roztwór naniesiono na kolumnę o wymiarach 10 x 100 cm zawierającą 7 lirów żelu Froctogel^ TSK H^66/^y/ /ptosz^w^ żel hydrolowych. poMmerów zawierający liczne grupy hydroksylowe no powierzchii mOrycy, wielkość cząstek 32-63 nm, wytwarzony i sprzedawany przez fimię B. torck, RFN/,- zrównoważonego w 10 ϋ buforze tramtomolAwas solny o pH 7+0,01 zawierającym dodatek 5% /objętość no objętość/ glikolu etylenowego·
Frakcję zowwerojącą antygen HBsAg naniesiono no kolumnę o wymaroch 5 x 30 om zawierają^ 300 ml żelu FrootogelR TSK DBAB 650 A/ /słabo zosedowy wyymieniocz aiioilwy,
152 568 w którym grupy dwuetyloaminoetylowe są związane z grupami hydroksylowymi matrycy żelu Frsctogel TSK HW-65 wiązaniem eterowym, produkowany i sprzedawany przez firmę E. Merck, Darmstadt, RFN/, zrównoważonego w trometamolu pH 8 w temperaturze 4°C. Kolumnę przemyto trometamolem pH 8 zawierającym 0,05 mola NaCl i HBsAg eluowano 0,15 molarnym roztworem NaCl w trometamolu pH 8.
o
Eluat naniesiono na kolumnę zawierającą żel Frsctogel TSK HW 65 /F/ zrównoważony 10 milimolarnym roztworem buforu Na2HP04/NaH2P04 o pH 6,8 zawierającym 150 mM NaCl· Otrzymano roztwór kompleksowych mice li HBsAg/polisorbitan.
Uzyskany w każdym etapie stopień oczyszczania podano w tablicy 1.
Tablica 1 <
Frakcja 'Objętość /1/ Całkowita ilość HBsAg* /mg/ Całkowita ilość białek /g/ 'Całkowita ilość wielocukrów /g/ Całkowita ilość kwasów nukleinowych /mg/ Całkowita ilość lipidów
Surowy ekstrakt 7,7 1232 259 114 32500 104
Supernatant PEG 8,02 1100 64 9,5 641 53,7
Supernatant CaCl2 8 1190 37 3,8 512 27,2
Re te na nt 0,350 1320 26,7 0,744 37,6 3r596
Frakcja HBsAg z TSK 1,06 736 0,935 0,014 16 0,352
Eluat z TSK-DEAE 0,15 722 0,428 0,0084 2,6 0,275
Frakcja HBsAg z TSK -l 0,45 1117 0,244 0,094 2 0,179
x Oznaczana metodą radioinmunologiczną·
W tablicy 2 przedstawiono skład kompleksowych miceli trzech różnych próbek szczepionek otrzymanych w powyższym procesie z polisorbitanem 20.
Tablica 2
Próbka Białka Zug/ml/ /A/ Całkowite lipidy Zug/ml/ /B/ Polisorbitan 20 Zug/ml/ ^/C/ Stosunek C A/B/C
I 20 20 8,5 18
II 20 16 8,4 19
III 20 14,5 15,6 31
Przykład II· Do 2,650 ‘litrów surowego ekstraktu otrzymanego jak w przykładzie I dodano powoli 882 ml PEG 400 i wartość pH doprowadzono do 6+0,1· Całość pozostawiono w ciągu jednej godziny w temperaturze 4°C, a następnie wirowano przy 7400 g. Supernatant zatężono do 1000 ml stosując filtr Amicon DC zaopatrzony we wkładkę odcinającą przy 100 000 daltonow i następnie przemyto trzema objętośoiami 20 mM trometamolu pH 8. Następnie dodano powoli do retantatu podczas mieszania w temperaturze 4°C 277 g sproszkowanego siarczanu amonu. Całość pozostawiono w ciągu jednej godziny w temperaturze 4°C, po czym osad odwirowywano w ciągu 15 minut przy 1000 g. Supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w 400 ml 20 mM trometamolu pH 8 zawierającego 1 mM PMSF.
152 568
Roztwór poddano ultrafiltracji stosując filtr Amicon DC wyposażony we wkładkę odcinającą przy 10 daltonów. Retentat /500 m/ przemyto dwoma objętościami trometamolu pH 8 i naniesiono na kolumnę zawierającą 300 ml żelu TSK-DEAE 650 M zrównoważonego trometamolem pH 8. Po zakończeniu przechodzenia próbki kolumnę przemyto 0,05 mo lar nym roztworem NaCl w trometamolu pH 8 i następnie roztworem NaCl w liDówy^m.gradiencie stężenia od 0,05 do 0,5 mola. Frakcję al^u^^waną 0,15 molarnym roztworem NaCl . zawwer-ającą HBsAg zatężano do objętości 50 m za pomocą filtra Amicon 'DC zawieraj ącym wkładkę odcinającą przy 10 000 daltonów .i następnie naniesiono na kolumnę o wymiarach 50 x 100 cm wyne!nioną żelem agarozowym Sepfarose 4B-C1 /produkowany . i sprzedawany przez firmę Pharmacia Fine Cłteimcals, Uppsala, Sziweja/ zrównoważonym 20 mM trometamolem pH 8 zawieraj ącym 5% glikolu etyliiowego. Otrzymano roztwór kompleksowych miccei HBsSg/poliiaibbtan.
Stopieńoczyszczenia uzyskany w każdym etapie podano w tablicy 3·
Tablica 3
Frakcja Objętość /m/ . Całkowita ilość_ HBsAg* /^/ Całkowita ±lość białek /«/ Całkowita ilość wielocukrów /g/ Całkowita ilość kwasów nukleinowych /m&/
Surowy ekstrakt 2650 188 114,721 36,9 9250
Supprnatant PEG 2530 16O 22,755 3,321 536
Re te nant W5 1000 150 7,468 0-,181 175
Passylki AMS 400 80,8 1,248 0,0243 160
Retenant W5 1000 72,4 0,529 0,029 88
Eluat z TSK-DEAE 560 44 0,157 0,073 3 '
Frakcja HBsAg z żelu Seph^tiAe 4B-C1 200 23 0,030 0,0003 0,05
x Oznaczana mtodą radioinmunologiczną.
Przykład 111· Dwa litry surowego ekstraktu HBsAg skłaniano za pomocą PEG 400 w sposób opisany w przykładzie. I· Następnie dodano podczas mieszania 450 g sproszkowanego siarczanu amonowego /AMS/ do nasycenia 45%· Po rozpuszczenia AMS roztwór pr^trzmywano w ciągu 3 godzin w temperaturze 4°C. Pod koniec tego okresu uzyskano dwie wyraźne fazy, które rozdzielono w rozdzielaczu i otrzymano klarowną żółtą fazę górną /faza PEG 400/ oraz klarowną dolną fazę /i^s^za wońlna/, obie reprezentujące po około + 50% pierwotnej objętości. Fazę wodną odrzucono, a górną poddano ultrafiltracji na fj.ltze ArtLcon DC, tak jak opisano dla suparnatantu CaCl2 w przykładzie I· Oczyszczanie prowadzono dalej jak w przykładzie I i otrzmano roztwór kompleks owych mice li KBsAg/pooisorbitan.
Stopień oczyszczenia uzyskany w każdym etapie podano w tablicy 4.
Tablica 4
Frakcja O^bętość /m/ Całkowita ilość HBsAg*
Surowy ekstrakt 2000 99
Supprnatant PEG 2000 92
Faza PBG 1000 98
Retenant 50 98
Frakcja HBsAg z TSK 123 52
Eluat z TSK-DEAE 25 54
Frakcja HBsAg z TSK 60 35
Całkowita ilość białek /g/ Całkowita ilość wielocukrów /8/ Całkowita ilość kwasów nukleinowych
55 22 5588
13,2 5,68 243
2,8 1,536 98
1,5 0,14 6,66
0,288 0,0077 2,84
0,0377 0,0011 0,44
0,0207 0,00154 0,39
Oznaczana mtodą radi o iimuno logiczną
152 568
Przykład IV. Dwa litry surowego ekstraktu HBsAg sklarowano za pomocą PEG 400 w sposób opisany w przykładzie I· Następnie dodano podczas mieszania 450 g sproszkowarego siarczanu amonowego /AMS/ do nasycenia 45%. Po rozpuszczeniu AMS roztwór przetrzmywano w ciągu 3 godzin w temperaturze 4°C. Pod koniec tego okresu uzyskano dwie wyraźne fazy, które rozdzielono w rozdzielaczu ‘i otrzymano klarowną żółtą fazę górną /faza PEG 400/ oraz klarowną fazę dolną /faza wodnn/, obie reprezentujące po około + 50# pierwotnej objętości. Fazę wodną odrzucono, a porcję 1 litr fazy PBG . /górna faza/ rozcieńczono dwukrotnie 10 mM«tromatamolem pH 8 'i naniesiono na kolumnę zawierająoą 300 mL żelu Fraotogel TSK-DEAE 650 /M/ zrównoważonego trometamolem pH 8 z szybkością przepływu 100 ml/godzinę. Żel przebyto trometamolem pH 8 zawieraj ącym 0,05 mola NaCl i eluowano HBsAg w gradiencie stężenia NaCl od 0,05 do 0,5 mola w trometamolu pH 8. Frakcję HBsAg eluowano 0,15 molarnym NaCl i po zatężeniu za pomocą filtra Amicon DC wyposażonego we wkładkę odcinającą przy 10 000 daltonów retenant naniesiono na kolumnę o wymiarach 5 x 100 cm zawierającą żel Sepharose 4B-C1 zrównoważony trometamolem pH 8 zawierającym 5% /objętość na objętość/ glikolu etylenowego. Otrzymano frakcję zawierające komleksowe micele HsAg/polisorbitan.
Stopień oczyszczenia uzyskany w każdym etapie podano w tablicy 5·
Tablica 5
Frakcja Objętość /mi/ Całkowita ilość HBsAg* /^/ Całkowita ilość białek /8/ Całkowita ilość wielocukrćw /g/ Całkowita ilość kwasów nukleinowych /mg/
Surowy ekstrakt 2100 200 60,600 19,000 4860
Faza PEG 1200 210 3,100 1,436 80
Bluat z TSK-DEAE 460 134 0,750 0,0048 0,5
Frakcja HBsAg z Sepharose 4B-C1 150 110 0,120 0,0014 0,3
* Oznaczana mtodą radioimmunooogiczną.
Przykład V· 500 ml surowego ekstraktu HBsAg sklarowano dodając powoli podczas me sza nia w temperaturze 4°C roztwór 50 g PEG 6000 w 160 ml wody. Wartość pH doprowadzono do 6,1 dodatkiem 5 motornego kwasu octowego i pozostawiono w ciągu jednej godziny w temperaturze 4°C. Ekstrakt następnie wirowano w ciągu 15 minut przy 7000 g.
Do supernat^^ dodano podczas mieszania 157 g sproszkowanego siarcranu amonowego do nasycenia 50%. Po rozpuszczeniu roztwór pozostawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 4°C i uzyskano dwie wyraźne fazy, które rozdzielono w rozdzielaczu. Górną fazę PBG zawierającą HBsAg rozciańczono dwukrotnie trometamolem pH 8 i naniesiono na kolumnę zawierającą 300 ml żelu TSK-DEAE 650 /M/ zrównoważonego trometamolem pH 8 przy szybkości przepisu 100 ml/godzinę. Żel przemyto trometamolem pH 8 zawierającym 0,05 mola NaCl. Eluat zatężono za pomocą filtra Amicon DC wyposażonego we wkładkę odcinającą przy 10 000. Retentat naniesiono na kolumnę o w^nlarach 5 x 100 cm. zawierającą 2 litry żelu Fraotogel TSK-HW65 /F/ zrównoważonego trometamolem pH 8 zawierającym 10% /objętość na objętość/ glikolu etylenowego. Otrzymano roztwór kompOekslwych roBAg/pplisorbitan.
Stopień oczyszczenia w każdym etapie podano w tablicy 6.
152 568
Tablioa 6
Frakcja Objętość /ml/ Całkowita ilosć_ HBsAg* /mg/ Całkowita ilość białek /6/ Całkowita ilość wieloi oukrów /6/ Całkowita ilość kwasów nukleinowych /mg/
Surowy ekstrakt 500 . .123 22,600 6,400 1200
Supernatant PEG 490 100 4,153 0,509 24
Faza PEG' 270 110 1,820 0,2096 5,3
Eluat z TSK-DEAE 150 66 0,258 0,028 0,4
Frakcje HBsAg z TSK 60 4— — 68 0,065 0,00048 0,084
x Oznaczana metodą radioimnunologiczną.
Przykła d VI. Do 120 ml surowego ekstraktu alfa-1-antytrypsyny z hodowli otrzymanych mstodam inżynierii genetycznej drożdży dodano powooi 13 m PEG 400 i wartość pH doprowadzono do 6,1 za pomocą 5 molarnego kwasu octowego. Całość pozostawiono w ciągu jednej godziny w temperaturze 4°C, a następnie wirowano w ciągu 15 minut przy 5000 g i dodano powoi:! 1 molarny roztwór CaC^ do końcowego stężenia 40 mM. Wartość pH doprowadzono do 7 za pomocą 1 molarnego roztworu NaOH, pozostawiono w ciągu nocy w temperaturze 4°C i wirowano w cigu 15 minut przy 7000 g. Supernatant rozcieńczono dwukrotnie 50 mM trometamolem o pH doprowadzonym do 8,7 za pomocą 0,1 n kwasu solnego i następnie naniesiono na kolumnę zawierającą 20 ml żelu Fractogel TSK-DEAE 650 zrównoważonego trometamolem o pH 8,7, przy^g^ot^^i^r^im jak powyżej ale z dodatkiem 5 mM merkaptootanolu. Kolumnę przemyto trometamolem pK 8,7 zawierającym dodatek 10 mM NaCl, po czym stosowano gradient stężenia NaCl od 10 do 250 mM. Alfa-1-antytpypsynę eluowano przy stężeniu 80 mM NaCC. Frakcję zawierającą alfa-1-antytrypsynę zatężono w filtrze Amicon DC wyposażonym we wkładkę odcinającą przy 10 000 i naniesiono na kolumnę z żelem Sephader 150 zrównoważonym 50 mM trometamolem pH 8,7, przygotowanym jak to opisano uprzednio. Otrzymano roztwór oczyszczonej alfa-1-a ntytiyrpsyny.
Stopień oczyszczenia uzyskany w każdym etapie podano w tablicy 7.
Tablica 7 _
Frakcja Objętość /ml/ . Całkowita ilość alfa-1-antytrypsyny wg Eliaa /^/ Całkowita ilość białek /g/ Całkowita ilość wielocukrów /g/
Surowy ekstrakt 120 180 4,018 0,538
Supernatant PEG 100 212 1,300 0,290
Supernatant CaCl2 100 194 0,660 0,110
Eluat z TSK-DEAE -1 - 520 180 0,210 0,0052
Przykład VII. Stosowano postępowanie opisane w przykładzie I, zastępując jednak 300 ml 1 molarnego roztworu CaCl2 300 ml 1 mlarnego roztworu MnCl2· Charakterystyka końcowego produktu była podobna do charakterystyki produktu otrzymanego według przykładu I· ·
Przykła d VIII. Stosowano postępowanie opisane w przykładzie I, zastępując jednak 38,5 ml polisorbitanu 20, 20 ml Tritonu Χ-100 /produkt wytwarzany przez firmę Rohm and Danmsadt, RFN/. Uzyskano produkt o charakterystyce podobnej do charakterystyki produktu z przykładu I.
152 568
Przykład IX· Powtórzono postępowanie opisane w przykładzie I, ale zamiast
38,5 ml polisornitanu 20 etosowano 38,5 ml polisorbitanu 80. Uzyskano produkt o charakterystyce podobnej do charakterystyki produktu z przykładu I.
P r zy k ł a d X· Roztwór kompleksowej liceli KBsAg otrzymany według przykładu I rozcieńczono do zawartości białka 10 yig/ml, dodając chlorek sodowy do końcowego stężenia 0,9% /waga na objętość/, bufor fosforanowy /Na2^^^^,/NaH2P0^^/ do stężenia końcowego 20 nM i . AlhydrogelR /żel wodorotlen^ glnnowego /Al/OH^’/ produkowany i sprzedawany przez firmę Superphos Export Co·, Kopmhaga, Dania/ do stężenia końcowego 0,15% /waga na objętość/· Końcowa wartość pH wynosiła 6,9· Preparat wyjałowiono i rozlano do szklanych fiolek o pojemności 2 ml· Każda fiolka zawierała 1 ll szczepionki·
Przykłs d XI· Dawki jednostkowe szczepionki z przykładu X podawano domięśniowo dwói grupom surowiczo-nem nnych pacjentów, stosując dwie kolejne iniekcje w odstępie jednego miesiąca· Chociaż te iniekcje powinny być traktowane jako wstępne i powinny być uzupełniane dawką podtrzymującą, np· po upływie dwóch miesięcy od pierwszego podania, to jednak obserwowano powstawanie przeciwciał po upływie jednego i dwóch miesięcy po pierwszym podaniu·
W pierwszej grupie /32 surowiczo-ujmych pacjentów,/, po upływie jednego miesiąca od pierwszego podania zHana poziomu przeciwciał wynooiła 20/32, to jest 62,5%, a średnie georatryczne miano /GMT 9,95 MIU /milijednostek międzynarodowych/, a po upływie miesiąca od drugiego podania zmiana poziomu przeciwciał wyπosiła 31/32, to znaczy 96,9%, a GMT 36 MIU·
W drugiej grupie /46 pacjentów surowiczo-ujemnych/, po upływie jednego miesiąca od pierwszego podania zmiana poziomu przeciwciał wynosiła 31/46, to znaczy 67,4%, a GMT 13/6 MIU·
Zapisy objawów klinicznych nie wykazywały wzrostu temperatury i zauważalnych reakcji miejscowych po podaniu szczepionek·

Claims (15)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1· Sposób ekstrakcji i oczyszczania białek związanych w komórkach z supernatantu otrzymywanych metodami inżynierii genetycznej komórek drożdży wytwarzających te białka i rozrywanych w obecności niejonowego detergenta, znamienny tym, że wartość pH superratantu doprowadza się do 6+0,1, dodaje ciekły lub stały glikol polietylenowy dla sklarowania powyższego supernatantu i traktuje sklrtyrftSowany supernatant dwuwartoścoowym kationem mtalu albo po ewentualnej ultrafiltracji siarcaanem amonu z wydzielę neem powyższego białka·
  2. 2· Sposób według zastrz· 1, znamienny tym, że dodaje się ciekły glikol lolietyeθsooy do końcowego stężenia 10-35% /objętość na objętość/·
  3. 3· Sposób według zastrz· 1, znamienny tym, że dodaje się stały glikol lslietyjeoowy do końcowego stężenia 6-1% /waga na objętość/·
  4. 4· Sposób według zastrz· 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że białkeem jest antygen powierzchniowy zapalenia wątroby /hepatitis B/·
  5. 5· Sposób według zastrz· 1 albo 2 ąlbo 3, znamienny tym, że białkeem jest alfa-1-antytrypsyna·
  6. 6· Sposób według zastrz· 1,* znamienny t y m, że sklarowany supernatant traktuje się douwortoścSowym kationem raei^l.u·
  7. 7· Sposób według zastrz· 6, znamienny t y m, że jako dwuwortościsoy kation mtalu stosuje się kation wapniowy lub
  8. 8· Sposób według zastrz· 6 albo 7, z n a m i, e η n y tym, ' że izoluje się wytrącony osad, roztwór poddaje ultrafiltracji, retentat poddaje aię filtracji na żelu, frakoję zawierającą białko poddaje się chΓoIlrtsgtrii jsnowymlennθj, oraz ewentualnie stosuje się powtórną filtrację na żelu lub wirowanie w gradiencie stężenia chlorku cezu·
    152 568 że fazę· glikolu polietyfiltracji na żelu i chroże fazę glikolu polietychrom aoggnaii jonowy
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny t y m, że sklarowany supernatant traktuje się eiarczanem amonowym do 40-50% nasycenia i iaoluje się ocayszczone białko w fazie glikolu polietylenowego.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, lenowego poddaje się ewentualnie ultrafiltracji, a następnie maaoogrfii jonnwymiennnj.
  11. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, lenowego poddaje się ewentualnie ultrafiltracji, a następnie miennej· i f iltrac ji na żelu.
  12. 12. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że klarowny supernatant poddaje się ultrafiltracji i retentat traktuje się siarczanem amonowym do 40-50% nasycenia w celu wytracenia osadu, który rozpuszcza się w odpowiednim buforze.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, filtrację, filtrację na żelu i chromaao^raai.ę jonowymienna.
  14. 14· Sposób ν/edług zastrz. 1, znamienny tym, powierzchniowy czynny stosuje się polisorbitan.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, stosuje się polisorbitan 20.
    że stosuje się ultraże jako nie jonowy środek że jako polisorbitan
PL1986258745A 1985-04-03 1986-04-03 Protein extraction and purification method PL152568B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/719,601 US4683294A (en) 1985-04-03 1985-04-03 Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL152568B1 true PL152568B1 (en) 1991-01-31

Family

ID=24890650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1986258745A PL152568B1 (en) 1985-04-03 1986-04-03 Protein extraction and purification method

Country Status (29)

Country Link
US (2) US4683294A (pl)
EP (1) EP0199698B1 (pl)
JP (1) JP2512430B2 (pl)
KR (1) KR940010283B1 (pl)
CN (1) CN86101798A (pl)
AR (1) AR241596A1 (pl)
AT (1) ATE66694T1 (pl)
AU (1) AU580494B2 (pl)
CA (1) CA1272457A (pl)
CS (1) CS259537B2 (pl)
DE (1) DE3681058D1 (pl)
DK (1) DK152286A (pl)
EG (1) EG17972A (pl)
ES (1) ES8706166A1 (pl)
FI (1) FI85027C (pl)
GR (1) GR860874B (pl)
HU (1) HU206125B (pl)
IE (1) IE58854B1 (pl)
IL (1) IL78824A (pl)
MY (1) MY102936A (pl)
NO (1) NO170421C (pl)
NZ (1) NZ215618A (pl)
PH (1) PH22110A (pl)
PL (1) PL152568B1 (pl)
PT (1) PT82219B (pl)
RO (1) RO95349B (pl)
SU (1) SU1604144A3 (pl)
YU (1) YU46304B (pl)
ZA (1) ZA862374B (pl)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1268437A (en) * 1984-12-21 1990-05-01 Haruo Fujita Method for purification of hbc antigen and method for measurement of hbc antibody by using said purified hbc antigen
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
US5124256A (en) * 1985-11-13 1992-06-23 Labofina, S.A. Process for recovering polypeptides localized in the periplasmic space of yeast without breaking the cell wall by using an non-ionic detergent and a neutral salt
US4742158A (en) * 1986-04-25 1988-05-03 Merck & Co., Inc. Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding
FR2608052B1 (fr) * 1986-12-10 1990-04-13 Pasteur Vaccins Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu
AP56A (en) * 1987-01-30 1989-09-26 Smithkline Biologicals S A Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
US5026828A (en) * 1987-02-27 1991-06-25 Merck & Co., Inc. Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast
NZ225583A (en) * 1987-08-06 1991-07-26 Merck & Co Inc Process for purifying hepatitis a virions (hav)
US4883865A (en) * 1987-09-30 1989-11-28 Merck & Co. Inc. Recovery of pres2+s antigen
US5011915A (en) * 1987-10-26 1991-04-30 Merck & Co., Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
US5043287A (en) * 1989-05-16 1991-08-27 The Standard Oil Company Recovery of water soluble biopolymers from an aqueous solution by employing a polyoxide
US5151358A (en) * 1989-06-13 1992-09-29 Genencor International, Inc. Processes for the recovery of naturally produced chymosin
US5139943A (en) * 1989-06-13 1992-08-18 Genencor International, Inc. Processes for the recovery of microbially produced chymosin
DE4021979A1 (de) * 1989-07-15 1991-01-31 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur reinigung von annexinen
US4988798A (en) * 1990-01-22 1991-01-29 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
US5109121A (en) * 1990-01-22 1992-04-28 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
US5177194A (en) * 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
CA2093422C (en) * 1990-10-05 2001-04-03 Genencor International, Inc. DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5328841A (en) * 1990-10-05 1994-07-12 Genencor International, Inc. Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol
US5102989A (en) * 1991-03-15 1992-04-07 Merck & Co., Inc. Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
US6362003B1 (en) 1992-02-24 2002-03-26 Coulter Corporation Hematological reference control composition containing leukocyte analogs, methods of making, and uses thereof
US6509192B1 (en) * 1992-02-24 2003-01-21 Coulter International Corp. Quality control method
HRP950097A2 (en) 1994-03-08 1997-06-30 Merck & Co Inc Hepatitis a virus culture process
KR100254828B1 (ko) * 1994-12-24 2000-05-01 성재갑 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법
US5869604A (en) * 1995-11-09 1999-02-09 Georgia Institute Of Technology Crystallization and purification of polypeptides
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
AU2003270380B2 (en) * 2002-09-06 2010-07-01 Genentech, Inc. Process for protein extraction
US7777006B2 (en) 2002-12-31 2010-08-17 Csl Behring L.L.C. Method for purification of alpha-1-antitrypsin
US8323949B2 (en) * 2003-03-11 2012-12-04 Advanced Biocatalytics Corporation Altering metabolism in biological processes
US7476529B2 (en) * 2003-03-11 2009-01-13 Advanced Biocatalytics Corporation Altering metabolism in biological processes
PT1664123E (pt) * 2003-09-22 2008-07-16 Kamada Ltd Preparação em larga escala de um inibidor da alfa-1 proteinase e sua utilização
US8956812B2 (en) * 2003-12-30 2015-02-17 Bharat Biotech International Limited Process for the preparation and purification of recombinant proteins
SE0400886D0 (sv) * 2004-04-02 2004-04-02 Amersham Biosciences Ab Process of purification
CN1314447C (zh) * 2004-04-12 2007-05-09 爱华生物科技(香港)有限公司 一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法
CA2605179A1 (en) 2005-04-18 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
DK1909830T3 (da) * 2005-08-02 2011-12-19 Novartis Vaccines & Diagnostic Formindskelse af interferens mellem olieholdige adjuvanser og antigener indeholdende overfladeaktivt middel
JP5732196B2 (ja) * 2006-11-01 2015-06-10 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． 低ｐＨおよび二価カチオンを用いる生物高分子を単離する方法
US11051532B2 (en) 2017-09-22 2021-07-06 Impossible Foods Inc. Methods for purifying protein
EP3670646A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-24 Ohly GmbH Functional yeast protein concentrate
US12011016B2 (en) 2020-09-14 2024-06-18 Impossible Foods Inc. Protein methods and compositions

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3636191A (en) * 1969-10-08 1972-01-18 Cancer Res Inst Vaccine against viral hepatitis and process
US3790552A (en) * 1972-03-16 1974-02-05 Us Health Method of removing hepatitis-associated antigen from a protein fraction using polyethylene glycol
US3994879A (en) * 1972-12-18 1976-11-30 Hoechst Aktiengesellschaft Process for the preparation of benzofuran compounds
US3951937A (en) * 1973-12-20 1976-04-20 The Community Blood Council Of Greater New York, Inc. Large scale purification of hepatitis type B antigen using polyethylene glycol
US3994870A (en) * 1974-01-31 1976-11-30 The Community Blood Council Of Greater New York, Inc. Purification of hepatitis B surface antigen
SE437329B (sv) * 1975-03-14 1985-02-25 Community Blood Council Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit
NZ180199A (en) * 1976-03-04 1978-11-13 New Zealand Dev Finance Method of testing for the presence of elevated plasma liprotein concentration
US4113712A (en) * 1976-03-08 1978-09-12 The Green Cross Corporation HBsAG Particle composed of single polypeptide subunits and the preparation procedure
GB1589581A (en) * 1976-04-14 1981-05-13 Biotechnolog Forschung Gmbh Process for the separation of enzymes
US4102996A (en) * 1977-04-20 1978-07-25 Merck & Co., Inc. Method of preparing hepatitis B core antigen
DE2750045A1 (de) * 1977-11-09 1979-05-10 Behringwerke Ag Verfahren zur entfernung von detergentien aus virusantigensuspensionen
FR2470795A1 (fr) * 1979-12-07 1981-06-12 Pasteur Institut Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus
US4349539A (en) * 1980-08-15 1982-09-14 Merck & Co., Inc. Separation of hepatitis B surface antigen
US4314997A (en) * 1980-10-06 1982-02-09 Edward Shanbrom Purification of plasma protein products
JPH0625069B2 (ja) * 1981-01-29 1994-04-06 ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド Ｂ型肝炎ワクチン製造方法
US4542016A (en) * 1981-03-27 1985-09-17 Institut Merieux Non-a non-b hepatitis surface antigen useful for the preparation of vaccines and methods of use
US4329471A (en) * 1981-05-04 1982-05-11 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. 4-(4-Phenyl-1-piperidinyl)methyl-5-acyl-1,3-dihydro-2H-imidazol-2-ones
PL133476B1 (en) * 1981-06-10 1985-06-29 Akad Medyczna Method of obtaining pure antigen hba from human serum
US4379087A (en) * 1982-06-17 1983-04-05 Cutter Laboratories, Inc. Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
IL69202A (en) * 1982-09-08 1991-08-16 Smith Kline Rit Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof
SE8205892D0 (sv) * 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
JPS59101426A (ja) * 1982-11-29 1984-06-12 Green Cross Corp:The Ｂ型肝炎感染予防用ワクチンの製造方法
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate

Also Published As

Publication number Publication date
JP2512430B2 (ja) 1996-07-03
DE3681058D1 (de) 1991-10-02
EP0199698B1 (fr) 1991-08-28
ZA862374B (en) 1987-06-24
NO170421B (no) 1992-07-06
HU206125B (en) 1992-08-28
NZ215618A (en) 1988-08-30
RO95349A (ro) 1988-09-15
IL78824A (en) 1991-04-15
NO861234L (no) 1986-10-06
IE860826L (en) 1986-10-03
FI861251A0 (fi) 1986-03-24
YU46386A (en) 1988-02-29
PH22110A (en) 1988-06-01
DK152286A (da) 1986-10-04
ATE66694T1 (de) 1991-09-15
SU1604144A3 (ru) 1990-10-30
EP0199698A2 (fr) 1986-10-29
MY102936A (en) 1993-03-31
HUT40810A (en) 1987-02-27
ES8706166A1 (es) 1987-06-01
DK152286D0 (da) 1986-04-03
PT82219A (en) 1986-04-01
EP0199698A3 (en) 1989-05-24
JPS61249398A (ja) 1986-11-06
EG17972A (en) 1991-06-30
RO95349B (ro) 1988-09-16
FI85027C (fi) 1992-02-25
KR860008276A (ko) 1986-11-14
ES553633A0 (es) 1987-06-01
GR860874B (en) 1986-07-30
IE58854B1 (en) 1993-11-17
CN86101798A (zh) 1986-10-15
IL78824A0 (en) 1986-09-30
FI85027B (fi) 1991-11-15
AU5378686A (en) 1986-10-09
FI861251L (fi) 1986-10-04
US4683294A (en) 1987-07-28
AR241596A1 (es) 1992-09-30
CS223386A2 (en) 1988-02-15
CA1272457A (en) 1990-08-07
PT82219B (pt) 1988-02-17
US4857317A (en) 1989-08-15
NO170421C (no) 1992-10-14
KR940010283B1 (ko) 1994-10-22
AU580494B2 (en) 1989-01-12
YU46304B (sh) 1993-05-28
CS259537B2 (en) 1988-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL152568B1 (en) Protein extraction and purification method
EP0037078B1 (en) Process for heat treatment of aqueous solution containing human blood coagulation factor xiii
US4649192A (en) Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
HU202554B (en) Process for lipophyl protheines
JP3771935B2 (ja) 水溶性血漿タンパク質の純化方法
JPH0449999B2 (pl)
EP0468181A2 (en) Process for the purification of factor VIII and factor VIII obtained by said process
EP1041998A1 (en) Composition and method for dermal and transdermal administration of a cytokine
JP2534587B2 (ja) 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法
JPS6078999A (ja) ＨＢｓ抗原の精製方法
JP2003528803A (ja) 静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法
CN102994514A (zh) 一种从水稻种子生产和分离纯化重组人抗胰蛋白酶（OsrAAT)的方法
FI97058C (fi) Menetelmä soluissa tuotettavan HIV:n glykoproteiinin GP 160 eristämiseksi ja puhdistamiseksi
Myerowitz et al. [58] Studies of lysosomal enzyme biosynthesis in cultured cells
US5284937A (en) Process for the extraction and purification of human recombinant gamma interferon
SU1495377A1 (ru) Способ получени рибонуклеазы Н из ЕSснеRIснIасоLI
HK183395A (en) Method for production and purification of hepatitis b vaccine
WO1984004108A1 (fr) Nouvel adn de codage de l&#39;immunoglobuline
JPS619298A (ja) α‐インターフエロンの単離および精製のための方法
JPH0244320B2 (pl)
JPWO1999022753A1 (ja) ヘパリンコファクターｉｉ製剤及びその製造方法
JPS60246323A (ja) 免疫グロブリンから発熱性物質の除去方法