CS259537B2

CS259537B2 - Method of proteins extraction and cleaning from penetically changed yeast cells' cultivating medium where production of above-mentioned proteins occurred

Info

Publication number: CS259537B2
Application number: CS862233A
Authority: CS
Inventors: Wijnendaele Frans Van; Daniel Gilles; Guy Simonet
Original assignee: Smith Kline Rit
Priority date: 1985-04-03
Filing date: 1986-04-01
Publication date: 1988-10-14
Also published as: YU46304B; IL78824A0; EP0199698A2; IE860826L; JPS61249398A; NO170421B; KR860008276A; PL152568B1; ES553633A0; FI85027C; NO861234L; IE58854B1; CA1272457A; RO95349A; FI861251L; DK152286A; NZ215618A; US4857317A; ES8706166A1; MY102936A

Description

Vynález se týká způsobu extrakce a čištění bílkovin z živného^ prostředí, v němž došlo* к jejich produkci. Jde zvláště o extrakci a čištění bílkovin typu povrchového antigenu viry hepatitidy В a úr-l-antitrypsinu, tyto látky jsou produkovány při použití rekombinantní DNA v buněčných kulturách, zejména v pozměněných kmenech kvasinek.

Různé mikroorganismy, mimo jiné bakterie a kvasinky je možno užít jako hostitelské organismy pro různé plasmidy, které obsahují molekulu DNA se sledem nukleotidů, který je kódem pro specifickou bílkovinu. Z uvedených mikroorganismů jsou zvláště výhodné a běžně užívané kvasinky. Například v uveřejněné Evropské patentové přihlášce č. 106 828 se popisuje použití kmenů Saccharomyces cerevisiae к produkci povrchového antigenu viru hepatitidy 3 (HBsAg) a v Evropské zveřejněné patentové přihlášce č. 103 409 se popisuje produkce α-1-antitrypsinu z kvasinkových plasmi* dů.

Produkce bílkovin z kmene kvasinek představuje podstatnou výhodu ve srovnání s produkcí těchto látek při použití bakteriálních kmenů. Tato výhoda je způsobena tím, že kvasinky snadno rostou ve velkých fermentorech a mimo to na rozdíl od bakterií se kvasinky chovají podobně jako buňky savců v tom směru, že mají schopnost navazovat uhlohydrátové zbytky na molekuly nově syntetizovaných bílkovin.

Extrakce a čištění bílkovin z kultury kvasinek však představuje technické problémy vzhledem к poměrně složitému chemickému složení kvasinkové buňky a zejména vzhledem к přítomnosti vysokého procenta tukovitých látek v případě, že růst kvasinek trvá dlouho za účelem získání většího výtěžku polypeptidu.

Například buněčná stěna Saccharomyces se skládá ze tří vrstev:

a) z vnitřní vrstvy, tvořené β-glukanem, který je nerozpustný v zásadách,

b) ze středí vrstvy β-glukanu, který je v zásadách rozpustný a

c) ze zemní vrstvy glykoproteinu, v němž tvoří uhlohydrátovou složku fosforylovaný mannan.

Pod buněčňou stěnou je cytoplasmatická membrána, která sestává ze složité směsi neutrálních tukovitých látek (monoglyceridy, diqlyceridy a triglyceridy), z volných a esterifikovaných sterolů, komplexního sfingolipidu, glycerofosfatidů a neutrálních a kyselých glykolipidů. Jádro obsahuje DNA, různé druhy RNA a polyfosfáty, vakuoly mohou obsahovat velké množství složek s nízkou i vysokou molekulovou hmotností a slouží ke skladování celé řady hydrolytických enzymů, mitochondrie jsou bohaté na lipidové, fosfolipidové a ergosterolové složky a cytoplasma obsahuje mimo jiné velké množství ribosomů, polyfosfátů, dále gly kogen a celou řadu glykolytických enzymů. Většina kvasinkových buněk, mimo jiné také čeleď Saccharomyces také obsahuje určité množství tukovitých látek, které jsou obvykle přítomny ve formě globulí, jejichž množství se zvyšuje při pěstování kvasinkových kultur ve velkém měřítku.

Byla navržena celá řada vícestupňových postupů pro extrakci a čištění bílkovin z různých zdrojů. Příklady, týkající se bílkovin, produkovaných geneticky pozměněnými mikroorganismy jsou uvedeny například v publikacích STAEHELIN a další [J. Btol. Chem. 259, 9750—54, 1981), K. MURRAY a další, (The EMRO J. 3, str. 645—650, 1984) a R. A. HITZEMAN a další (Nucl. Ac. Res. 11, 2 745—2 763, 1983).

V případě, že produkovaná bílkovina je vázána na buňku, mají všechny různé postupy tři typické stupně.

V prvním stupni je nutno požadovanou bílkovinu oddělit od zbytku vnitřního obsahu buňky. Z tohoto důvodu se buňky rozruší například působením enzymu nebo také mechanicky, například lisováním nebo jiným typem homogenizace, například protřepáváním se skleněnými kuličkami za případného přidání smáčedla, jak je popsáno například ve svrchu uvedených publikacích (K. MURRAY a dal. a R. A. HITZEMAN a další).

Ve druhém stupni se prostředí obohatí o požadovanou bílkovinu, například frakčním srážením přidáním síranu amonného a/nebo polyethylenglykolu.

Ve třetím stupni se odstraňují téměř veškeré nečistoty, které byly přítomny v původním živném prostředí. Tento postup se provádí v jednom nebo několika stupních, a to pomocí ultrafiltrace, iontoměničových postupů, filtrace na gelu a odstředěním při použití isopyknického gradientu.

Při provádění těchto postupů je zřejmé, že některé z nečistot, například doprovodné bílkoviny (uváděné například ve svrchu uvedené publikaci R. A. HITZEMANA a dalších, nukleové kyseliny, lipidy a zejména vysoký obsah lipidů má nepříznivý vliv na alespoň jeden ze svrchu uvedených stupňů, které se к čištění užívají, například zejména na ultrafiltraci a na chromatografii na sloupci, mimo to je zapotřebí velmi rychle z prostředí odstranit proteolytické enzymy. Mimo to bylo také pozorováno, že není možno uskutečnit srážení síranem amonným bez předchozího alespoň částečného odstranění tukovitých látek, protože tyto látky srážení zamezují.

Z tohoto důvodu by bylo velmi nutné navrhnout způsob, který by zajišťoval odstranění převážné většiny znečištěnin před uskutečněním třetího stupně.

V některých ze svrchu uvedených způsobů se navrhuje použití polyethylenglykolu jako selektivního srážecího činidla pro bílkoviny a také se navrhuje způsob i^áže ní lipoproteinů z plasmy při použití interakcí mezi lipoproteinem, polyaniontem a kovem.

Způsob trakčního srážení bílkoviny při použití ve vodě rozpustných polymerů neiontového typu, zvláště polyethylenglykolu (PEG) byl poprvé navržen v publikaci POLSON a další, Biochem. Biophys. Acta 82, 463— 4'7J, 19G4 a byl diskutován růanými autory. Z nich uvádí W. HONIG a další, v Anályt, Biochem. 7'2, 502—512, 1976), že požadované bílkoviny к celkové bílkovině je možno oJepšit při použití frakcí PEG s nízkou shodní molekulovou hmotností, nižší než má obvykle užívaný PEG 6 00J ^:.

Avšak přesto, že autor uvádí, že ,,změnami koncentrace pH je možno získat jednotlivé bílkoviny plasmy“, uvádí také, že ,,horších výsledků se dosahuje v případě, že je zapotřebí, čistit složitější směsi bílkovin, například supernatant buněčného homogenotu .

V publikaci P. R. POSTER a další Biochem. Biophys, Acta 317, 505--516, 1973 se popisuje způsob srážení enzymu z buněčných extraktů Saccharomyces cerevisiae při použití polyethylenglykolu. Způsob koncentrace a čištění virů a bakteriofágů při použití polyethylenglykolu se uvádí v publikaci B. P. VAJDA Folia Microbiol. 23, 88—96, 1978 a G. J. LANCZ Arch. Virusfersch. 42, 303— —306, 1973. Pokud jde c izolaci antigenu viru hepatitidy, bylo čištění povrchového aatigenu viru hepatitidy В (HBsAg) popsáno jako způsob, zahrnující dvojí postupné působení polyethylenglykolem PEG 6 000, postup byl uveden v publikaci Ph. ADAMOWICZ a další str. 37—49 INSERM SYMPOSIUM č. 13, HEPATITIS В VACCINE, Publ. ELSEVIER, Amsterdam, Holandsko 1981.

Při provádění tohoto postupu čištění HBsAg z plasmy, se nejprve vysráží imunní komplexy a většina lipoproteinů v prvním stupni přidáním PEG 6 000 do koncentrace 5,5 % a pak. se ve druhém stupni HBsAg vysráží z izolavaného supernatantu přidáním polyethylenglykolu do konečné koncentrace 10 %.

Pokud jde o patentovou literaturu, — US patent č. 3 790 552 popisuje způsob izolace antigenu hepatitidy z bílkovinné frakce tak, že se užije polyethylenglykol s molekulovou hmotností 200—6 000 v množství 12 až 30 g/100 ml к vysrážení uvedeného antigenu.

— US patentový spis č. 3 951 937 popisuje způsob čištění antigenu hepatitidy В (HBAg), který spočívá ve dvojím vysrážení této látky polyethylenglykolem s molekulovou hmotností alespoň 600, který se přidává do konečného obsahu 4,0 až 4,5 % hmotnostních.

— US patent č. 3 994 870 popisuje způsob čištění antigenu hepatitidy· В (HBAg), při němž se tato látka vysráží přidáním polyethylenglykolu z koncentrace 4,0 až

4,5 % hmotnostních a pak se podrobí afinitní chromatografii při použití nerozpustného konkavalinu A jako chromatografického adsorpčního činidla.

— v Evropské zveřejněné patentové přihlášce č. 112 506 se popisuje způsob výroby vakcíny, která chrání proti infekci virem hepatitidy В z plasmy, postup spočívá ve srážení síranem amonným s následnou adsorpcí na koloidní silikát a s použitím dvou postupných srážecích stupňů při použití polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 2 000 až 10 000, polyethylenglykol se přidává do množství 3 až 7 g/100 ml к vysrážení viru hepatitidy В a imunního komplexu a do množství 15 až 20 g/100 ml к supernatantu к vysrážení HBsAg.

— V japonské patentové přihlášce č. 9 128—335 (Derwent 84—217127) se popisuje vysrážení ff-l-antitrypsinu z frakce plasmy přidáním polyethylenglykolu do množství 15 až 20 g/100 ml.

Jak bylo uvedeno svrchu, byl také popsán způsob srážení lipoproteinů při využití interakcí mezi lipoproteinem, polyaniontem a kovem, například v publikacích M. BURSTEIN a další, Adv. Lip. Res. 11, 67—108, 1973 a A. VAN DÁLEN a další. Biochem. et Biophys. Acta 147, 421—427, 1967. Tento způsob se uskutečňuje interakcí mezi lipoprotuir.om, dvojvazným kationtem kovu a kyselým polysacharidem, za těchto podmínek je množství sraženiny funkcí koncentrace dvojvazného kaitontu kovu v prostředí, v němž se reakce provádí.

Výchozím materiálem к provádění způsobu podle vynálezu je supernatant geneticky pozměněných kvasinkových buněk, které vyprodukovaly bílkovinu, vázanou na buňku a pak byly rozrušeny za přítomnosti smáčedla neiontového typu, jak je v oboru běžné. Takto' získaný materiál bude dále nazýván ,,surový extrakt“.

Při provádění způsobu podle vynálezu se užívá kombinace frakčního srážení polyethylenglykolem (první stupeň), s následným frakčním srážením působením vícevazného kationtu kovu, zvláště dvojvazného kovu, jako je vápník nebo mangan nebo působením síranu amonného, před nímž popřípadě předchází ultrafiltrace supernatantu z prvního stupně.

Způsob podle vynálezu spočívá na zjištění, že v případě, že se užije pevný polyethylenglykol, například PEG 6 000 v koncentraci 6 až 12 g/100 ml pro extrakci HBsAg z geneticky pozměněných buněk kvasinek, rozrušených za přítomnosti neiontového smáčedla, HBsAg se nevysráží. Mimo to při následném přidání síranu amonného* vzniká dvoufázový systém, který je charakterizován skutečností, že HBsAg se nachází v polyethylenglykolové fázi, kdežto většina znéčištěnin se nachází ve vodné fá zi. Tento výsledek je překvapující, protože z až dosud uváděných výsledků bylo nutnousuzovat, že za těchto podmínek dojde к vysrážení HBsAg. Prvním rozdílem způsobu podle vynálezu oproti známým způsobům je tedy použití polyethylenglykolu jako rozpouštědla pro požadovanou bílkovinu, produkovanou kulturou kvasinek, kdežto většina. znečištěnin je odstraněna vysrážením z prostředí.

Podle molekulové hmotnosti má polyethylenglykol pevnou nebo kapalnou formu, rozhraní mezi těmito formami je přibližně u molekulové hmotnosti 1 500.

Při prvním stupni způsobu podle vynálezu, kterým je v podstatě vyčeření prostředí je možno užít polyethylenglykol s různou molekulovou hmotností při příslušné úpravě jeho koncentrace s ohledem na odpovídající molekulovou hmotnost.

Koncentrace polyethylenglykolu je s výhodou 6 až 12 g/100 ml v případě, že se užije pevný polyethylenglykol, například PEG 6 000 a 10 až 35 % objemových, s výhodou 20 až 30 % objemových v případě, že se užije kapalný polyethylenglykol, například PEG 300 nebo 400. Z technických důvodů je výhodnější použití kapalného polyethylengíykolu, zejména vzhledem к usnadnění následující ultrafiltrace.

Předmětem vynálezu je způsob extrakce a čištění bílkovin z živného prostředí geneticky pozměněných kvasinkových buněk, v němž došlo к produkci těchto bílkovin, vázaných na. buňky po rozrušení buněk z přítomnosti neiontového smáčedla, vyznačující se tím, že se pH supernatantu upraví na hoduotu 6 + 0,1, přidá se do konečné koncentrace 10 až 35 % objemových kapalný nebo- do konečného obsahu 6 až 12 g/100 ml pevný polyethylenglykol s molekulovou hmotností 300 až 600 až do vyčeření supernatantu, na který se pak působí dvojvazným kationtem kovu, a to chloridem vápenatým nebo manganatým nebo· po případné ultrafiltraci síranem amonným к oddělení bílkoviny, načež se získaný supernatant popřípadě dále zpracovává dělením sraženiny, ultrafiltraci roztoku, gelovou filtrací retentátu, chromatografií na iontoměniči na získání frakce s obsahem bílkoviny a popřípadě druhou filtrací na gelu nebo odstředěním při použití gradientu chloridu česného.

Při provádění způsobu podle vynálezu je polyethylenglykol považován za polymerní organické rozpouštědlo, které mimo jiné u snadňuje vysrážení [lípo]proteinů, jejichž isoelektrický bod leží v blízkosti pH 6 při současné solubilizaci jiných (lípo)proteinů, tj. těch, jejichž isoelektrický bod je značně odlišný a také těch, které jsou vysoce hydrofobní.

Při tomto prvním stupni je možno vysrážet přibližně 75 % znečišťujících bílkovin, 90 °/o po-lysacharidů, 94 % nukleových kyselin a 45 % lipidů, přičemž v podstatě veš keré množství HBsAg nebo α-1-antitrypsinu přichází do supernatantu.

Jak již bylo svrchu uvedeno, spočívá způsob podle vynálezu v kombinaci několika stupňů, z nichž po prvním stupni se získá částečně čištěný, popřípadě poněkud cpaleskující roztok požadované bílkoviny.

Ve druhém stupni způsobu podle vynálezu se na částečně čištěný roztok působí vícevazným, s výhodou dvojvazným kationtem kovu, například vodným roztokem chloridu vápenatého nebo manganatého do konečné koncentrace 30 mM nebo síranem amonným, působení síranu amonného se s výhodou uskuteční po případné ultrafiltraci opaleskujícího roztoku, síran amonný so přidává v pevném stavu do 40—50 % nasycení, tak, jak se to provádí při klasickém vysolování. Dojde к vysrážení požadované bílkoviny, kterou je možno přenést do fosfátového pufru nebo je možno přidat síran amonný к polyethylenglykolu do nasycení na 40—50 %, čímž vznikne dvoufázový systém, v němž se požadovaná bílkovina nachází v polyethylenglykolové fázi.

Při každé z těchto variací druhého stupně se získá čirý roztok požadované bílkoviny, který je v podstatě prostý polysacharidů, nukleových kyselin, lipidů a znečišťujících bílkovin.

• Takto získaný roztok je pak možno dále zpracovávat v klasickém třetím stupni například ultrafiltraci, filtrací na gelu, chroínatografií na sloupci, ve výhodném provedení sestává třetí stupeň z postupného použílí ultrafiltrace, první filtrace na gelu, chroraatografie na sloupci slabě alkalického aniontoměniče s diethylaminoethylenovýnii skupinami (DEAE) a druhé filtrace na gelu nebo odstředěním při použití gradientu chloridu česného, čímž se získá vysoce čištěný roztok HBsAg nebo tt-l-antitrypsinu, vhodný pro lékařské použití.

Při zkouškách elektroforézou na polyakrylovém gelu (dodecylsíran sodný), byl produkt čistý více než z 98 % při sledování pásu 23 K, který je charakteristický pro antigen HBsAg kvasinkového původu.

Prvný výhodou způsobu podle vynálezu je tedy skutečnost, že jsou v podstatě odstraněny veškeré polysacharidy, nukleové kyseliny, lipidy a znečišťující bílkoviny, další výhoda spočívá v tom, že požadovanou bílkovinu je možno izolovat v poměrně vysokém výtěžku.

V případě, že se způsobem podle vynálezu čistí surový extrakt HBsAg z geneticky pozměněných kvasinkových buněk, je získaný HBsAg vázán na neiontové smáčedlo, s nímž vytváří složené micely o průměru 17 až 20 ňm, a bylo zjištěno, že poměr, vyjadřující množství neiontového smáčedla к množství bílkoviny, celkovým lipidům a polysorbitanu v polysorbitanových složených mycelách se pohybuje v rozmezí 15 až 35 g/100 ml v případě, že se zkoušky prová dějí kolorimetrickou metodou na bílkoviny (LOWRY), celkové lipidy [ZOLLNER] a neiontové smáčedlo (HUDDLESTON a ALLRED).

Sležené mlčely, které Je možno získat při provádění způsobu podle vynálezu při použití pclysorbitanu jako neiontového smáčedla jsou nové útvary, které jsou rovněž předmětem vynálezu.

Tyto útvary jsou imunogenní a je možno je zpracovávat na vakcínu stejným způsobem jebe klasický HBsAg, jak je v oboru běžné při. výrobě vakcíny proti viru hepatitidy B. '

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

P г í к 1 a d 1

850 g poletovaných kvasinkových buněk z geneticky pozměněného kmene kvasinek, u nichž dochází к expresi HBsAg a které byly pěstovány až do obsahu 30 g suchých buněk na 1 litr živného prostředí se uvede do suspenze v 7,12 litrů hydrogenřosforečrtanu sodného, koncentrace soli je 7,098 g/ /1. '

К této suspenzi se přidá 142,5 ml roztoku kyseliny ethylendiamintetraoctové o koncentraci 4 g/100 ml, 33,5 ml prostředku polysorbat 20 a 335 ml isopropanolu s obsahem 2,7 g fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF). Pak se pH upraví na hodnotu. 8,1 + 0,1 přidáním NaOH ve formě vodného roztoku o koncentraci 10 g/100 ml. Pak se suspenze zchladí na ledové lázni a buňky se rozruší dvojím průchodem homogenizátorem s obsahem skleněných kuliček. Iiomogenát (surový extrakt) se pak odstřeluje 30 minut při 13 000 g.

Pak se přidává к 7,7 1 surového extraktu pomalu za stálého míchání 2,5 litrů PEG 400, přičemž se extrakt udržuje na teplotě pod 15 ^CC. Pak se upraví pH na hodnotu 6 _:|- 0,1 přidáním kyseliny octové o koncentraci 5M a prostředí se h. dinu nechá stát při teplotě 4 ^CC a pak se odstředí 45 minut při 7 400--1J 000 g.

S úporná Laní se pak upraví na pH 7,0 + + 0,0 i hydroxidem sodným o koncentraci ΪΝ a pak se přidá 300 ml chloridu vápenatého o koncentraci 1M, tj. 30 ml/litr supernatantu. Pak se pH znovu upraví na 7 + + 0,05 hydroxidem sodným o koncentraci 1Ň a směs se nechá stát přes noc při teplotě 4 ^CC_? pak se suspenze odstředí při 3 600 gramech, 45 minut a supernatant se podrobí ultrafiltraci na prostředku AMICON DG (AMiCON CORP., DAN VERŠ, MA USA), zařízení odděluje frakce při 100 000 jednotkách, tímto způsobem dojde к zahuštění na l^z4 počátečního^ objemu, tj. 1 500 ml.

Pak se roztok postupně promývá. 12,5 1 trometamolu o koncentraci 10 mM o pH 8 + 0,1, úprava se provádí kyselinou chlorovodíkovou o koncentraci 1N (tento pufr bude dále nazýván trometamol pH 8), pak se přidá i mM PMSF, 2,5 objemových % isopropanolu a 2 mmoly kyseliny ethylendiamiiitetraoctové (EDTA, konečné koncentrace). Retentát se pak zahustí na objem 350 mililitrů.

Koncentrovaný roztok se nanese na vrchol sloupce o rozměrech 10 x 100 cm s obsahem 7 1 prostředku FRACTOGEL^r TSK HW65(F) (polotuhý gel, sestávající z hydrofilních vinyicvých polymerů s četnými hydroxylovými skupinami na povrchu matrice, rozměry částic 32 až 63 ^m, E. Merck, Darmstdt, NSR) v rovnovážném stavu v pufru trometamol/ /НС1 10 mM pH 7 + 0,01 doplněném pěti objemovými procenty ethylenglykolu.

Frakce s obsahem antigenu HBsAg se nanese na vrchol sloupce o rozměrech 5 x x 30 cm s obsahem 300 ml prostředku FRACJTOGEL* TSK DEAE 650 (M) (slabě zásaditý aniontoměnič, v němž jsou diethylamínoethylová skupiny vázány na hydroxylové skupiny matrice prostředku FRACTOGEL TSK HW—65 éterovými vazbami, E, Merck, Darmstadt, NSR v rovnovážném stavu v pufru trometamol pH 8 při teplotě 4 stupně Celsia. Sloupec se promyje pufrem trometamol pH 8 s obsahem 0,05M chloridu sodného a HBsAg se vymyje 0,15M chloridem sodným v pufru trometamol pH 8.

Takto získaný eluát se nanese na sloupec prostředku FRACTOGEL* TSK HW (65) F v rovnovážném stavu v pufru Na₂HPO₄/ /NaHoPO/, o koncentraci 10 mM a pH 6,8, pufr je doplněn chloridem sodným do koncentrace 150 mM. Tímto způsobem se získá roztok, který obsahuje složené micely IIBsAg/polysorbát.

V následující tabulce I je uvedeno, do jaké čistoty byly tímto způsobem vzorky zpracovány.

V následující' tabulce II je pak shrnuto složení složených micel ze tří různých vzorků vakčín, získaných svrchu uvedeným postupem, při použití polysorbátu 20.

¢2

T a b u 1 kaj;I_; · Frakce	? l· .n objem (il	HBsAg RIA (mg)	7Г; . ···.' '
bílkoviny (gj	, Obsah polysacharidy (g)	nukleové kyseliny (mg)	lipidy (g)
surový extrakt	7,7	1232	259	114	32 500	104
PEG supernatant	8,02	1100	64	9,5	641	53,7
CaCl₂ supernatant	8	1190	37	3,8	512	27,2
retentát	0,350	1320	26,7	0,744	37,6	3,596
TSK frakce HBsAg	1,06	730	0,935	0,014	16	0,352
eluát TSK-DEAE	0,15	722	0,428	0,0084	2,6	0,275
TSK frakce HBsAg	0,45	1117	0,244	0,0094	2	0,179

RIA: Radioimunologické sledování.

Tabulka II

Vzorek	Bílkoviny (/íg/ml) (A)	Celkové lipidy ((Ug/ml) (B)	polysorbát 20 (Mg/ml) (C)	poměr C A/B/C
I	20	20	8,5	18
II	20	16	8,4	19
III	20	14,5	15,6	31

Příklad 2

882 ml polyethylenglykolu PEG 400 se pomalu přidá 2,650 1 surového extraktu, připraveného stejným způsobem jako v příkladu 1 a pH se upraví na hodnotu 6 + 0,1. Pak se směs udržuje hodinu na teplotě 4 °C, načež se odstředí při 7 400 g. Supernatant se pak zahustí na 1 000 ml přístrojem AMICON DC, který oddělí frakce v rozmezí 100 000 jednotek, zahuštěný materiál se promyje 3 objemy pufru trometamol pil 8 o koncentraci 20 mM. Pak se к retentátu pomalu přidá 277 g práškovaného síranu amonného za stálého míchání při teplotě 4 °C. Po hodině míchání při této teplotě se sraženina odstředuje 15 minut při 1000 g. Supernatant se odloží a sraženina se rozpustí ve 400 ml 20 mM trometamolu pH 8, doplněného 1 mM PMSF. Roztok se podrobí ultrafiltraci při použití přístroje Amicon DS, oddělí se frakce od 10⁶ jednotek. 500 mililitrů retentátu se promyje dvěma objeTabulka III my trometamolu pH 8 a pak se nanese na vrch 1 sloupce s obsahem 300 ml prostředku TSK-DEAE 650 M, gel se nachází v rovnovážném stavu s trometamolem pH 8. Jakmile vzorek projde, sloupec se promyje 0,05 M chloridem sodným v trometamolu pH 8 a pak se množství chloridu sodného zvyšuje až na 0,5M. Frakce, která se vymývá při obsahu 0,15M chloridu sodného' obsahuje požadovaný HBsAg. Tato frakce se zahustí na objem 50 ml v zařízení Amicon DC, oddělujícím materiál od 10 000 jednotek a pak se nanese na sloupec o rozměrech 50 x 100 cm s obsahem prostředku Sepharose 4B—Cl, jde o agarosový gel (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko), který se nachází v rovnovážném stavu v 20 mmolech trimetamolu pH 8, doplněného 5 % ethylenglykolu, čímž se získá roztok složených micel HBsAg/polysorbitan.

Stupen vyčištění je uveden v následující tabulce III.

Frakce objem Celkový obsah

	(ml)	HBsAg RIA (mg).	bílkovin (g)	polysacharldů (g) i	nukleových kyselin (mg)
surový extrakt	2 650	188	114,721	36,9	9 250
supernatant PEG	2 530	160	22,755	3,321	536
retentát 10⁵	1000	150	7,468	0,181	175
AMS-pelety	400	80,8	1,248	0,0248	160
retentát 10⁶	1 000	72,4	0,529	0,029	88
eluát TSK-DEAE	560	44	0,157	0,073	3
frakce s obsahem
HBsAg (sepharosa
4B—Cl)	200	23	0,030	0,0003	0,05

RIA: radioimunologická zkoušky

Příklad 3 litry surového extraktu HBsAg se vyčeří působením polyethylenglykolu PEG 400 tak, jak bylo· popsáno v příkladu 1. Pak se přidá 4/í) g práškovaného síranu amonného (AMS) za stálého míchání do· konečné koncentrace 45 % nasycení síranem amonným. Po rozpuštění síranu amonného se roztek nečiní stát 4 hodiny při teplotě 4 ^CC, po této době se materiál rozdělí na dvě oddělené fáze, které se rozdělí v dělicí nálevce na horní čirou žlutavou fázi v PEG 400 a na čirou spodní fází ve vodě, každá z těchto fází představuje přibližně 50 % přívodního objemu. Vodná fáze se odloží a horní fáze se podrobí ultrafiltraci (Amicon DC) jak bylo popsáno pro supernatant po působení chloridu vápenatého z příkladu 1. Materiál se pak dále čistí způsobem podle příkladu 1. čímž se získá roztok složených mycel HBsAg/polysorbitanu.

Dosažená úroveň vyčištění je uvedena v následující tabulce IV.

Tabulka IV

Frakce objem Celkový obsah

	(ml)	HBsAg (mg)	bílkovin (g)	polysacharirů .(g)	nukleových kyselin (mg)
surový extrakt	2 000	99	55	22	5 588
PEG supernatant	2 000	92	13,2	5,68	243
PEG fáze	1000	98	2,8	1,536	98
retentát	50	98	1,5	0,14	6,66
frakce s obsahem HBsAg (TSK)	123	52	0,288	0,0077	2,84
eluát TSK-DEAE	25	54	0,0377	0,0011	0,44
frakce s obsahem HBsAg (TSK)	60	35	0,0207	0,00154	0,39

RIA: radioimunologická zkouška

Příklad 4 litry surového extraktu HBsAg se čistí polyethylenglykolem PEG 400 stejně jako v příkladu 1. Pak se přidá za stálého míchání 450 g práškovaného síranu amonného do výsledné koncentrace 45 % nasycení síranem amonným. Po rozpuštění síranu amonného se roztok nechá stát 3 hodiny při teplotě 4 °C, čímž dojde к jeho zřetelnému rozdělení na dvě fáze, které se od sebe oddělí v dělicí nálevce. Jde o čirou žlutavou horní fázi v polyethylenglykolu PEG 490 a čirou spodní fázi ve vodě, každá z těchto fází tvoří přibližně 50 % původního objemu. Vodná fáze se odloží a 1 litr horní polyethylenglykolcvé fáze se dvakrát zředí 10 mM trometamolu pH 8 a pak se nanese na sloupec s obsahem 300 ml prostředku FRAC

TOGEL TSK-DEAE 650 (M), gel je v rovnovážném stavu v trometamolu pH 8, rychlost průtoku je 100 ml/h. Gel se promyje trnmetamolem pH 8 s obsahem 0,05M chloridu sodného, pak se HBsAg vymývá přidáváním chloridu sodného až do koncentrace 0,5M v trometamolu pH 8. Frakce s obsahem HBsAg se vymývá při 0,15M chloridu sodného, po zahuštění (AMÍCON DC) při oddělení materiálu od 10 000 jednotek se retentát nanese na sloupec o rozměrech 5 x x 10 cm s obsahem prostředku Sepharose 4B —Cl v rovnovážném stavu trometamolu pH 8 s 5 objemovými % ethylenglykolu. Získá se frakce s obsahem složený micel HBsAg/polysorbitan.

Úroveň čištění v jednotlivých stupních tohoto postupu je uvedeno· v následující tabulce V.

Tabulka V

Frakce objem Celkový obsah

	(ml)	HBsAg (mg)	bílkovin (g)	polysacharidů ________(g)___	nukleových kyselin (mg)
surový extrakt	2 100	200	60,600	19,000	4 860
PEG fáze	1200	210	3,100	1,436	80
čistý eluát TSK-DEAE	460	134	0,750	0,0048	05
frakce s obsahem HBsAg
(Sepharose 4B—Cl)	150	110	0,120'	0,0014	0,3

RIA: radioimunologická zkouška

Příklad 5

500 ml surového extraktu s obsahem HBsAg se čistí pomalým přidáváním roztoku 50 g polyethylenglykolu PEG 6 000 ve 160 ml vody za stálého míchání při teplotě 4 °C. Pak se roztok upraví na pH 6,1 přidáním kyseliny octové o· koncentraci 8M. Roztok se nechá 1 hodinu stát při teplotě 4 °C, pak se exrakt 15 minut odstřeďuje při 7 000 g. К supernatantu se přidá za stálého míchání 157 g práškovaného síranu amonného, konečná koncentrace odpovídá 50°/o nasycení síranem amonným. Po rozpuštění veškerého síranu amonného se roztok nechá stát ještě 3 hodiny při teplotě 4 °C, v průběhu této doby se roztok zřetelně oddělí na dvě fáze, které se pak dělí v dělicí nálevce. Horní fáze (PEG fáze s obsahem HBsAg) se dvakrát zředí trometamolem pH a pak se nanese na sloupec s obsahem 300 ml gelu TSK-DEAE 650 (M), který je v rovnovážném stavu trimetamolu pH 8, rychlost průtoku je 100 ml/h. Gel se promyje trometamolem pH 8 s obsahem 0,05M chloridu sodného a požadovaný antigen se pak vymývá trometamolem pH 8 s obsahem 0,15M chloridu sodného, eluát se zahustí (AMICOM DC) s oddělením materiálu v rozmezí 10 000 jednotek, retentát se pak nanese na sloupec o rozměrech 5 x 100 cm s obsahem 2 litrů prostředku FRACTOGEL TSK—IIW65 (F), který je v rovnovážném stavu s trometamolem pH 8, doplněným 10 proč, objemovými ethylenglykolu. Tímto způsobem se získá roztok složených micel HBsAg/polysorbitanu.

Úroveň čištění v jednotlivých stupních tohoto postupu je uvedeno v následující tabulce VI.

Tabulka VI

Frakce objem Celkový obsah

	(ml)	HBsAg (mg)	bílkovin (g)	polysacharidů (g)	nukleových kyselin (mg)
Surový extrakt	500	123	22,600	6,400	1200
PEG supernatant	490	100	4,153	0,509	24
PEG fáze	270	110	1,820	0,2096	5,3
eluát TSK-DEAE	150	66	0,258	0,028	0,4
frakce s obsahem
HBsAg (TSK)	60	68	0,065	0,00048	0,084

RIA: radioimunologická zkouška

Příklad 6 ml polyethylenglykolu PEG 400 se pomalu přidá ke 120 ml surového extraktu α-1-antitrypsinu z kultury geneticky pozměněných kvasinek a pH se upraví na hodno tu 6,1 přidáním kyseliny octové o· koncentraci 5M. Směs se nechá hodinu stát při teplotě 4 °C, načež se odstředí 15 minut při 5 000 g a pomalu se přidává roztok 1M chloridu vápenatého do konečné koncentrace 40 mM.

Pak se pH upraví na 7 přidáním hydroxidu sodného o koncentraci 1M a směs se nechá stát přes noc při teplotě 40 °C a pak se 15 minut odstřeďuje při 7 000 g. Supernatant se zředí na dvojnásobný objem 50 mM trometamolu, upraveného na pH 8,7 přidáním 0,lN kyseliny chlorovodíkové a pak se nanese na sloupec s obsahem 20 ml prostředku FRACTOGEL TSK-DEAE 650 (M)- v rovnovážném stavu v 50 mM trometamolu pH 8,7, připraveném jako svrchu a doplněném 5 mM merkaptoethanolu. Sloupec se p^rík promývá prometamolem pH 8,7, doplněným 10 mM chloridu sodného, načež se obsah chloridu sodného postupně zvyšuje z 10 až na 250 mM, ^-1-antitrypsin se ze sloupce vymývá při koncentraci chloridu sodného 124 mM, frakce je odlišná od frakce s obsahem bílkoviny, která se vymývá při koncentraci 80 mM chloridu sodného. Fáze s obsahem ^-1-antitrypsinu se pak zahustí (AMICON DC), přičemž se oddělí materiál od molekulové hmotnosti 10 000 jednotek, pak se získaná frakce nanese na sloupec s obsahem prostředku Sephadex 150 v rovnovážném stavu v 50 mM trometamolu pH 8,7, připraveném svrchu uvedeným způsobem, čímž se získá respekt čištěného' a-1-antitrypsinu.

Stupeň čištění v jednotlivých fázích je uveden v tabulce VII.

Tabulka VII

Frakce objem (ml)

Celkový obsah

AAT bílkovin polysacharidů (ELISA) (g) (g) (mg)

surový extrakt	120
PEG supernatant	100
CaC12 supernatant	100
eluát TSK-DEAE	520

AAT: α-1-antitrypsin

180	4,018	0,538
212	1,300	0,290
194	0,660	0,110
180	0,210'	0,052

Příklad 7

Postupně se obdobným způsobem jako v příkladu 1, avšak místo 300 ml 1M chloridu vápenatého se v tomto případě užije 300 mililitrů 1M chloridu manganatého. Vlastnosti takto získaného výsledného produktu jsou srovnatelné s vlastnostmi výsledného produktu, získaného způsobem podle příkladu 1.

Příklad 8

Postupuje se obdobným způsobem jako v příkladu 1, avšak užije se 20 ml prostředku Triton X—100 (Rohm a Ilaas, Darmstadt, NSR), místo 38,5 ml prostředku polysorbate 20, užitého v příkladu 1. Vlastnosti takto získaného^ výsledného produktu jsou srovnatelné s vlastnostmi výsledného produktu, získaného způsobem podle příkladu 1.

Příklad 0

Postupuje se obdobným způsobem jako v příkladu 1, avšak užije se 38,5 ml prostředku Polysorbate 80 místo 38,5 ml prostředku Polysorbate 20, užitého v příkladu .1. Vlastnosti výsledného produktu, získaného tímto způsobem jsou srovnatelné s vlastnostmi výsledného produktu, který byl získán způsobem podle příkladu 1.

Příklad 10

Roztok složených micel s obsahem HBsAg, získaný jako výsledný produkt v příkladu 1 se upraví na obsah bílkovin 100 ^ug/ral přidáním chloridu sodného, fosforečnanového pufru s obsahem hydrogenfosforečnanu a dihydrogenfosforečnanu sodného a přidá ním prostředku ALHYDROGEI? (gel hydroxidu hlinitého, SUPERPHOS Export Co, Copenhagen, Dánsko) až do konečného obsahu 0,0 /100 ml a 20 mM hydroxidu hlinitého o obsahu 0,15 g/100 ml, pH na konci přidávání má mít hodnotu 6,9.

Takto získaný materiál se sterilizuje a pak se rozdělí do lékovek o objemu 2 ml, z nichž každá obsahuje 1 ml vakcíny..

Příklad 11

Vakcína, získaná způsobem podle příkladu 10, byla podávána nitrosvalově dvěma skupinám seronegativních osob ve dvou postupných podáních, interval mezi jednotlivými dávkami byl 1 měsíc. Přesto, že tyto injekce byly základním podáním, které by bylo mělo být doplněno dalším podáním například 2 měsíce po první injekci, bylo možno potvrdit tvorbu protilátek odpovědí osob na aplikovaný antigen již jeden a dva měsíce po prvním podání vakcíny, získané způsobem podle příkladu 10.

V první skupině by]o 32 seronegativních osob. Měsíc po prvním podání byl poměr 20/32, což znamená, že 62,5 % ser mělo průměrný titr (geometrický průměr — GMT) 9,95 mjednotek (mezinárodní jednotky — MIU) a měsíc po druhém podání byla tato hodnota 31/32, což znamená, že 96,9 % osob mělo GMT 36 MIU.

Ve druhé skupině osob bylo 46 seronegativních jednotlivců. Měsíc po prvním podání byl poměr 31/46, což znamená, že 67,4 proč, osob mělo GMT 13/6 MIU.

Trvalé sledování klinických příznaků a hodnot prokázalo, že při podávání vakcíny nedocházelo к vzestupu tělesné teploty ani к pozorovatelným místním reakcím v okolí vpichu.

Claims

1. Způsob extrakce a čištění bílkovin z živného prostředí geneticky pozměněných kvasinkových buněk, v němž došlo к produkci těchto bílkovin, vázaných na buňky po rozrušení buněk z přítomnosti neiontového smáčedla, vyznačující se tím, že se pH supernatantu upraví na hodnotu 6 + 0,1, přidá se dokonečné koncentrace 10 až 35 % objemových kapalný nebo do konečného obsahu 6 až 12 g/100 ml pevný polyethylenglykcl s molekulovou hmotností 300 až 600 až do vyčeření supernatantu, na který se pak působí dvojvazným kati-ontem kovu, a to chloridem vápenatým nebo manganatým nebo* popřípadě ultrafiltrací síranem amonným к oddělení bílkoviny, načež se získaný supernatant popřípadě dále zpracovává dělením sraženiny, ultrafiltrací roztoku, gelovou filtrací retentátu, chromatografií na iontoměniči na získání frakce s obsahem bílkoviny a popřípadě druhou filtrací na gelu nebo odstředěním při použití gradientu chloridu česného.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že bílkovinou je povrchový antigen hepatitidy B.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že čištěnou bílkovinou je ^-1-antitrypsin.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se vyčeřený supernatant zpraco vává působením chloridu vápenatého nebo manganatého.

5. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se na vyčeřený supernatant působí síranem amonným do nasycení na 40 až 50 % s následnou izolací čištěné bílkoviny v polyethylenglykolové fázi.

6. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím, že se polyethylenglykolová fáze popřípadě dále podrobí ultrafiltrací, popřípadě následované filtrací na gelu nebo chromatografií na iontoměniči.

7. Způsob podle bodu 6, vyznačující se tím, že se polyethylenglykolová fáze dále zpracovává případnou ultrafiltrací, popřípadě následovanou chromatografií na iontoměniči a filtrací na gelu.

8. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vyčeřený supernatant dále podrobí ultrafiltrací a takto získaný retentát se pak dále zpracovává síranem amonným do* výsledného nasycení na hodnotu 40 až 50 proč, síranu amonného, čímž se vysráží bílkovina, kterou je pak možno přenést do> vhodného pufru, například pufru s hydrogenfosfátem a dihydrogeníosfátem sodným o pH 6,8.

9. Způsob podle bodu 8, vyznačující se tím, že se užije ultrafiltrace, filtrace na gelu a chromatografie na iontoměniči.