PL166827B1 - Sposób wytwarzania wypelnionych powietrzem lub gazem mikrobalonówdo sporzadzania zawiesin w cieklych nosnikach do echografii ultrasonograficznej PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania wypelnionych powietrzem lub gazem mikrobalonów do spo rzadzania zawiesin w cieklych nosnikach do echografii ultrasonograficznej nadajacych sie do podawania doustnie, doodbytniczo i do przewodu moczowego lub do wstrzykniec zywym organizmom, znamienny tym, ze (1) emulguje sie hydrofobowa faze organiczna w wodzie otrzymujac w fazie wodnej kropelki fazy hydrofobowej jako emulsje typu olej w wodzie, (2) dodaje sie do tej emulsji roztwór co najmniej jednego polimeru w nierozpuszczalnym w fazie wodnej, lotnym rozpuszczalniku, przy czym wokól kropelek tworzy sie warstwa polimeru, (3) odparowuje sie lotny rozpuszczalnik, przy czym polimer ulega wytracaniu na granicy faz wokól kropelek, które nastepnie tworza perelki z rdzeniem z fazy hydrofobowej zamknietej membrana polimerowa, przy czym perelki te sa w zawiesinie w fazie wodnej, (4) poddaje sie zawiesine dzialaniu obnizonego cisnienie w takich warunkach, zeby zakapsulkowana faza hydrofobowa byla usuwana przez odparowanie, przy czym tak dobiera sie faze hydrofobowa, zeby odparowala ona praktycznie równoczesnie z faza wodna i zeby byla zastepowana przez powietrze lub gaz. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wypełnionych powietrzem lub gazem mikrobalonów do sporządzania zawiesin w ciekłych nośnikach do echografii ultrasonograficznej.

Mikrobalony z powłoką z polimeru organicznego wypełnione gazem lub powietrzem w postaci zdyspergowanej lub jako zawiesina w ośrodku wodnym podaje się doustnie, doodbytniczo lub wprowadza do moczowodu a także może je stosować w postaci zastrzyków do organizmów żywych dla celów, na przykład, ultrasonografii i innych zastosowań medycznych.

Sposób wytwarzania obejmuje również wytwarzanie mikrobalonów w postaci suchej, która po rozprowadzeniu w ośrodku wodnym daje natychmiast zawiesinę o polepszonych własnościach w stosunku do znanych produktów. Stąd też gotowe do podawania zawiesiny mikrobalonów stanowią również część wynalazku. Wiadomo, że mikrociała lub mikroglobulki powietrza lub gazu, na przykład, mikrokulki takie jak mikropęcherzyki lub mikrobalony zawie4

166 827 szone w cieczy są wyjątkowo skutecznymi reflektorami ultradźwięków dla celów echografii. W niniejszym opisie termin mikropęcherzyk odnosi się w szczególności do mikrokulek powietrza lub gazu zawieszonych w ciekłym nośniku, do którego wprowadza się oddzielnie gaz lub powietrze. Celem regulowania własności powierzchniowych i trwałości mikropęcherzy wprowadza się do cieczy korzystnie środki powierzchniowo czynne (surfaktanty) lub tenzydy. Powierzchnia międzyfazowa gaz-ciecz w mikroglobulkach zawiera w istocie luźno związane cząsteczki ciekłego nośnika. Określenie mikrokapsułka lub mikrobalon oznacza, korzystnie ośrodek gazowy lub powietrze łącznie z cząsteczkami stanowiącymi materiał powłoki o składzie różniącym się od składu chemicznego ciekłego nośnika, tzn. może to być membrana polimerowa stanowiąca ściankę mikrokapsułki. Zarówno mikropęcherzyki jak i mikrobalony są bardzo użyteczne jako czynniki kontrastujące w technice ultradźwiękowej. Na przykład wstrzyknięcie zawiesiny mikropęcherzyków gazu lub mikrobalonów (o średnicy w zakresie 0,5 do 10 gm/) w ciekłym nośniku do krwiobiegu żywych organizmów powoduje znaczne wzmocnienie obrazu ultrasonograficznego a tym samym pozwala na wizualizację organów wewnętrznych. Wizualizacja naczyń i organów wewnętrznych może w istotny sposób pomóc w diagnozie medycznej.

Tworzenie zawiesin mikropęcherzyków we wstrzykiwanym ciekłym nośniku, przydatnych w echografii, może odbywać się przez uwolnienie gazu rozpuszczonego pod ciśnieniem w tej cieczy lub na drodze reakcji chemicznej prowadzącej do powstawania produktów gazowych, lub też przez wprowadzenie do ciekłego nośnika rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych ciał stałych zawierających zaokludowany lub zaadsorbowny gaz lub powietrze.

Na przykład z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki 4 446 442 znanych jest szereg różnych technik wytwarzania zawiesin mikropęcherzyków gazu w jałowym, ciekłym nośniku nadających się do wstrzyknięć. Zawiesiny te sporządza się stosując (a) roztwór tenzydu (środek powierzchniowo czynny) w ciekłym nośniku (roztwór wodny) oraz (b) roztwór zwiększający lepkość i działający jako stabilizator. Sposób wytwarzania pęcherzyków podany w wspomnianym opisie polega na wymuszonym przepływie mieszaniny (a), (b) i powietrza z dużą prędkością przez otwór o małej średnicy lub też przed użyciem wstrzykuje się mieszaninę (a) do mieszaniny (b) łącznie z fizjologicznie akceptowalnym gazem. Według innego sposobu wprowadza się kwas do mieszaniny (a) i węglan do mieszaniny (b) po czym oba składniki miesza się przed użyciem, w wyniku czego kwas reaguje z węglanem, wytwarzając pęcherzyki CO2, lub też wprowadza się gaz pod ciśnieniem do przechowywanych mieszanin (a) i (b), który w momencie użycia mieszaniny do zastrzyku uwalnia się w postaci mikropęcherzyków.

Jednym z problemów związanych z mikropęcherzykami jest fakt, że mają one na ogół krótki czas życia nawet w obecności stabilizatorów.

Stąd też w opisie patentowym nr EP-A-131,540 podany jest sposób przygotowania zawiesiny mikropęcherzyków, według którego stabilizowany ciekły nośnik do wstrzyknięć, na przykład wodny roztwór soli fizjologicznej lub roztwór cukru, takiego jak maltoza, dekstroza, laktoza lub galaktoza, miesza się z stałymi mikrocząsteczkami (średnica w zakresie od 0,1 gm do 1 gm) tych samych cukrów zawierających zaokludowane powietrze. Celem wytworzenia zawiesiny mikropęcherzyków w ciekłym nośniku zarówno ciekłe jak i stałe składniki miesza się razem przez kilka sekund, zachowując sterylne warunki. Po wymieszaniu otrzymana zawiesina musi być natychmiast wykorzystywana, tj. w przypadku pomiarów echograficznych wstrzyknięcie powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut. Postępowanie takie jest konieczne z uwagi na zanikanie pęcherzyków w wyniku czego stężenie ich staje się zbyt niskie aby mogły mieć one znaczenie praktyczne po tym okresie.

Innym probleme związanym z mikropęcherzykami dla celów echografii jest ich rozmiar. Powszechnie przyjmuje się, że użyteczny rozmiar mikropęcherzyków który umożliwia ich łatwe przemieszczanie się przez wąskie naczynia krwionośne mieści się w zakresie od około 0,5 gm do 10 gm. W przypadku większych pęcherzyków istnieje ryzyko tworzenia się skrzepów w następstwie czego powstają zatory. Na przykład, zawiesina pęcherzyków opisana w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 446 442, przy wytwarzaniu której wodne roztwory surfaktantów, takich jak lecytyna, estry i etery kwasów i alkoholi tłuszczowych z polioksyetylenem i polialkoholami polioksyetylenowymi, takimi jak sorbitol, glikole i gliceryna, cholesterol lub polimery polioksyetyleno-polioksypropylenowo, miesza się energicznie z roztworami zwię166 827 ksząjącymi lepkość i związkami stabilizującymi, takimi jak mono i polisacharydy (glukoza, laktoza, cukroza, dekstran, sorbitol), polialkohole np. glicerol, poliglikole i polipeptydami, jak np. proteiny, żelatyna, polioksyżelatyna oraz proteina plazmy, jedynie 50% pęcherzyków posiada wtedy rozmiary poniżej 40-50 pm, co z kolei czyni taką zawiesinę nie przydatną do wielu zastosowań w echografii.

Próbą wyeliminowania niektórych wymienionych wyżej niedogodności było opracowanie sposobów wytwarzania mikrokapsułek i mikrobalonów. Jak wspomniano poprzednio, podczas gdy mikropęcherzyki posiadają jedynie niematerialną, czy też zanikającą powłokę, tzn. są one otoczone tylko przez ściankę cieczy, której napięcie powierzchniowe modyfikuje się przez wprowadzenie surfaktantów, to mikrobalony i mikrokapsułki posiadają namacalną powłokę wykonaną z materiału innego aniżeli materiał nośnika, np. może to być membrana polimerowa posiadająca określoną wytrzymałość mechaniczną. Innymi słowy stanowią one mikrokulki wykonane z litego materiału w których gaz lub powietrze jest mniej lub bardziej szczelnie zamknięte.

Na przykład opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 276 885 podaje zastosowanie mikrokapsułek o powłoce będącej membraną, wypełnionych gazem, wykorzystywanych do wzmacniania obrazów ultradźwiękowych. W skład wspomnianej membrany wchodzą cząsteczki organiczne nie wykazujące właściwości toksycznych i antygennych.

W opisie podano, że mikropęcherzyki te posiadają membranę żelatynową, nie wykazującą koalescencji, a ich rozmiary wynoszą 5-10 μ m. Uważa się, że wspomniane mikropęcherzyki są wystarczająco stabilne do przeprowadzania pomiarów echograficznych, jednakże wspomniano również, iż po pewnym czasie gaz zaokludowany w nich rozpuszcza się w krwiobiegu a pęcherzyki stopniowo zanikają. Efekt ten spowodowany jest powolnym rozpuszczaniem się żelatyny. Przed użyciem wspomniane mikrokapsułki przechowuje się w roztworze żelatyny, gdzie zachowują one stabilność, lecz żelatynę tę należy ogrzać i stopić aby otrzymać ciekłą zawiesinę potrzebną w momencie wykonywania zastrzyku.

Mikrokulki o zwiększonej trwałości podczas przechowywania, aczkolwiek nie zawierające żelatyny, opisano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 718 433. Mikrokulki te zostały wykonane metodą nadźwiękowienia (częstotliwość 5-10 KHz), lepkich roztworów protein, jak np. 5% albumina surowicy i miały średnicę w zakresie 2-20 Jim a głównie 2-4 μm. Po nadźwiękowieniu, mikrokulki poddaje się stabilizacji przez denaturację protein (białek) tworzących membranę. Proces denaturacji przeprowadza się przez ogrzewanie lub na drodze reakcji chemicznej, na przykład z formaldehydem lub aldehydem glutarowym. Uważa się, że stężenie trwałych mikrokulek otrzymanych tą metodą wynosi około 8x 10⁶ /ml dla średnic w zakresie 2-4 μm, około 10⁶ /ml w zakresie średnic 4-5 μ m i poniżej 5x10⁵ /ml w zakresie średnic 5-6 μm. Okres trwałości takich mikrokulek wynosi 48 godzin i więcej, przy czym po wykonaniu zastrzyku dożylnego pozwalają one na skuteczną wizualizację lewej komory serca. Na przykład po wstrzyknięciu do żyły zewnętrznej nadźwiękowione mikropęcherzyki albuminy mają zdolność przechodzenia przez tkanki płucne. Skutkiem tego jest utrata przezroczystości jamy lewej komory oraz tkanek mięśnia sercowego.

Ostatnie doniesienia mówią o dalszych usprawnieniach związanych z wytwarzaniem mikrobalonów do wstrzyknięć dla celów ultrasonografii. W opisie patentowym nr EP-A324,938, opisano wypełnione powietrzem mikrokapsułki o powłoce proteinowej, których stężenie przekracza 10⁸ i o średnicy 10 μm a ich czas życia jest rzędu kilku miesięcy i więcej. Zawiesiny wodne tych mikrobalonów wytwarza się metodą ultradźwiękowej kawitacji roztworów denaturowych protein, np. albuminy surowicy ludzkiej. W procesie tym zachodzi również częściowe spienienie protein tworzących membranę a w następstwie ich utwardzenie wskutek działania ciepła. Również inne proteiny, takie jak hemoglobina i kolagen uważa się za przydatne do tych zastosowań.

Ostatnio M.A.Wheatley i inni w czasopiśmie Biomaterials, 11, 1990, 713-717, opisali wytwarzanie mikrokulek pokrytych polimerem metodą jonotropowej żelatynizacji alginatu. Wspomniana publikacja wymienia szereg technik stosowanych do wytwarzania takich mikrokulek. Według jednej z nich roztwór alginianu przetłacza się przez iglicę dyszy powietrznej w wyniku czego powstaje mgiełka składająca się z wypełnionych powietrzem kapsułek, które

166 322 utwardzają się w kąpieli zawierającej 1,2% wodny roztwór CaCl2. Według drugiego sposobu obejmującego współwytłaczanie gazu i cieczy pęcherzyki gazu wprowadza się do tworzących się kapsułek za pomocą głowicy o potrójnej tulei. Odbywa się to w ten sposób, że powietrze wstrzykuje się do środkowej kapilary (tulei) podczas gdy roztwór alginianu przetłacza się przez drugą, większą kapilarę usytuowaną współśrodkowo w stosunku do pierwszej, wokół której przepływa jałowe powietrze wewnątrz płaszcza otaczającego drugą kapilarę. Również według trzeciego sposobu gaz jest chwytany w roztworze alginianu sodu przed wytłoczeniem i utworzeniem kapsułek (przez rozpylenie) i dalszą przeróbkę roztworu z użyciem homogenizatora tkankowego lub łaźni bądź sondy sonikacyjnej. Tak otrzymane mikrobalony miały średnicę w zakresie 30-100 gm, jednak były one zbyt duże, aby móc z łatwością przemieszczać się w kanalikach płucnych.

Duża trwałość w czasie przechowywania zawiesin mikrobaloników opisanych w opisie patentowym nr EP-A-324,922 pozwala na ich dystrybucję handlową w takiej właśnie postaci, tzn. łącznie z ciekłym nośnikiem. Fakt ten stanowi bardzo silną zaletę handlową, ponieważ nie zachodzi już konieczność sporządzania zawiesiny tuż przed jej użyciem. Jednakże materiał proteinowy opisany w tym opisie może wywoływać reakcje alergiczne u wrażliwych pacjentów a ponadto wyjątkową wytrzymałość i trwałość materiału membrany ma szereg wad. Na przykład, z uwagi na sztywność membrany nie wytrzymuje ona nagłych zmian ciśnienia, jakim mogą podlegać mikrokulki podczas przemieszczania się w krwioobiegu. Wspomniane zmiany ciśnienia wywołane są pulsowaniem serca. Tak więc w trakcie wykonywania praktycznych testów ultradźwiękowych pewna część mikrokulek ulega zniszczeniu, w wyniku czego zakłócona zostaje powtarzalność otrzymywanych obrazów. Również wspomniane mikrobaloniki nie są odpowiednie do podawania doustnego, ponieważ wykazują brak odporności na trawiące działanie enzymów obecnych w przewodzie jelitowo-żołądkowym. Ponadto wiadomo, że mikrokulki o elastycznych ściankach dają lepsze echo akustyczne aniżeli kulki, których ścianki są sztywne.

W przypadku zastrzyków, nadmierna trwałość ścianek materiału, z którego wykonana jest mikrokulka, powoduje że procesy biodegradacji ścianki zachodzące w badanym organizmie zostaną spowolnione, co z kolei może wywołać problemy związane z metabolizmem. Stąd też preferowane są rozwiązania zmierzające do opracowania mikrobalonów o ściankach miękkich i elastycznych, które pod wpływem chwilowych zmian ciśnienia mogą ulegać deformacjom lecz za to charakteryzują się zwiększoną zdolnością odbijania fal akustycznych. Ponadto mikrobaloniki o regulowanej zdolności do biodegradacji, wykonane na przykład z półprzepuszczalnych powłok polimerowych, ulegających biodegradacji i o regulowanej mikroporowatości pozwalają na powolną penetrację cieczy biologicznych co byłyby wysoce pożądane.

Wspomniane wyżej korzystne cechy uzyskano w przypadku mikrobalonów sporządzonych sposobem według wynalazku. Ponadto, chociaż mikrobalony te wykazują względnie krótki czas życia, tzn. są podatne na biodegradację, co pozwala uporać się z wspomnianymi problemami metabolizmu przez zastosowanie wybranych typów polimerów tym mniej jednak cecha ta (kontrolowana przez parametry technologiczne) nie stanowi wady w sensie handlowym. Mikrobalony można bowiem przechowywać i transportować w postaci suchej, bo w tych warunkach zachowują one stabilność przez czas nieokreślony, lub też można wykonać membranę całkowicie nieprzepuszczalną dla ciekłego nośnika i wówczas degradacja zaczyna postępować jedynie po wstrzyknięciu. W pierwszym przypadku mikrobalony w postaci suchego proszku w odpowiednio, w zależności od potrzeb, dobranej proporcji łączy się przed użyciem z fazą wodną nośnika. Należy zauważyć, że takie postępowanie stanowi dodatkową zaletę w stosunku do znanych w technice produktów, ponieważ stężenie zawiesiny można dobrać w sposób dowolny, a początkowe wartości stężeń (tj. po sporządzeniu zawiesiny) znacznie przekraczają wspomnianą wyżej wartość 10 2/ml i mieszczą się w łatwo osiągalnym zakresie stężeń od 10⁵ do 10 6. Warto zaznaczyć, że sposób według wynalazku pozwala regulować porowatość w szerokim zakresie. Stąd też mikrobaloniki o trwale nieprzepuszczalnej membranie mogą być w łatwy sposób wytwarzane, zachowując przy tym trwałość w postaci zawiesiny w ciekłym nośniku wodnym i w takiej postaci można je wprowadzać na rynek.

Mikrokulki o membranach z międzyfazowo osadzonego polimeru nepełnione cieczą są dobrze znane. Zwykle mogą one powstawać na drodze emulgowania kropelek (których wielkość

166 827 zależy od parametrów procesu emulgowania) pierwszej fazy wodnej w roztworze organicznym polimeru a następnie zdyspergowania otrzymanej emulsji w drugiej fazie wodnej i z kolei odparowania rozpuszczalnika organicznego. Podczas odparowywania lotnego rozpuszczalnika zachodzi międzyfazowe osadzanie się polimeru na granicy kropelek z utworzeniem się mikroporowatej membrany, która skutecznie odgranicza zamkniętą pierwszą fazę wodną od otaczającej ją drugiej fazy wodnej. Technika ta aczkolwiek możliwa do realizacji nie jest korzystna w sposobie według wynalazku.

Inaczej, emulsję można wytworzyć stosując hydrofobową fazę emulgatora w fazie wodnej (zwykle zawierającej środek zwiększający lepkość i działający jako stabilizator emulsji, otrzymując w ten sposób emulsję kropelek, fazy hydrofobowej typu olej w wodzie a następnie wprowadzając do niej polimer tworzący membranę rozpuszczony w lotnym, organicznym rozpuszczalniku, nie mieszającym się z fazą wodną.

Jeżeli polimer ten jest nierozpuszczalny w fazie hydrofobowej, wówczas będzie on osadzał się na granicy międzyfazowej pomiędzy kropelkami a wspomnianą fazą wodną. Poza tym odparowanie lotnego rozpuszczalnika powoduje tworzenie się międzyfazowo osadzonej membrany wokół kropelek zemulgowanej fazy hydro fobowej. Dalsze odparowanie zamkniętej, lotnej fazy hydrofobowej prowadzi do powstania wypełnionych wodą mikrokapsułek otoczonych membraną z międzyfazowo osadzonego polimeru. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana w sposobie według wynalazku a została opisana prze K.Uno i innych w J. Microencapsulation 1 (198), 3-8 oraz K.Makino i innych w Chem. Pharm. Buli. 33 (1984), 1195-1201. Jak wspomniano, wielkość kropelek można regulować przez zmianę parametrów wytwarzania emulsji, tzn. rodzaj stosowanego emulgatora (bardziej skuteczny surfaktant, tzn. im większy jest stosunek fazy hydrofilowej do fazy liofilowej, tym mniejsze powstają krople) oraz przez warunki mieszania (im szybsze i bardziej energiczne mieszanie, tym powstające krople są mniejsze).

Według innego wariantu polimer tworzący ściankę międzyfazową rozpuszcza się w wyjściowej fazie hydrofobowej, która emulguje się w postaci kropelek w fazie wodnej, a powstawanie membrany wokół wspomnianych kropelek następuje w wyniku odparowania zamkniętej fazy hydrofobowej. Jako przykład może służyć publikacja w Powder Technology 22 (1978) 11-16 J.R. Farnanda i innych. Autorzy ci emulgowali roztwór polimeru (np. polietylenu) w naftalenie, stosując wodę w temperaturze wrzenia, po czym po ochłodzeniu odzyskiwali naftalen w postaci zawiesiny perełek polimeru w zimniej wodzie i w końcu usuwali naftalen, poddając mikroperełki sublimacji, w wyniku czego powstawały mikrobaloniki o średnicy 25 gm. Są także inne przykłady, według których polimer rozpuszcza się w mieszanej fazie hydrofobowej zawierającej hydrofobowy, lotny rozpuszczalnik organiczny oraz rozpuszczalny w wodzie rozpuszczalnik organiczny. Tak otrzymany roztwór polimeru poddaje się emulgowaniu w fazie wodnej zawierającej emulgatory, w wyniku czego rozpuszczalny w wodzie rozpuszczalnik ulega dyspersji w fazie wodnej, ułatwiając w ten sposób powstawanie emulsji mikrokulek fazy hydrofobowej i powodując wytrącanie się polimeru na granicy faz. Sposób ten opisano w opisie patentowym nr EP-A-274,961.

Opisane wyżej techniki można zaadaptować do wytwarzania wypełnionych gazem lub powietrzem mikrobalonów przydatnych do ultradźwiękowej wizualizacji pod warunkiem, że opracuje się odpowiednie możliwości regulacji wielkości kulek w pożądanych zakresach, kontroli przepuszczalnej lub nieprzepuszczalności na granicy komórka-ścianka oraz zastąpi się zamkniętą fazę ciekłą powietrzem lub wybranym gazem. Możliwość kontroli całkowitych wymiarów kulki jest oczywiście istotna przy adaptacji mikrobalonów dla przyjętych zastosowań, tj. wstrzykiwania lub podawania doustnego. Wymagania odnośnie wielkości kulek przeznaczonych do wstrzyknięcia (około 0,5-10 gm średni rozmiar) zostały omówione poprzednio. W przypadku podawania doustnego wspomniany zakres może być szerszy jeżeli się uwzględni, że zdolność odbijania fal dźwiękowych zwiększa się ze wzrostem rozmiaru kulek. Stąd też można stosować mikrobalony o średnicach mieszczących się w różnych zakresach wielkości powiedzmy w zakresie pomiędzy 1 i 1000 gm w zależności od potrzeb i pod warunkiem, że membrana jest na tyle elastyczna, że nie ulegnie pęknięciu w trakcie przemieszczania się w żołądku i jelitach. Możliwość regulowania przenikalności ścianki jest istotna dla zapewnienia, że nie zachodzi naciekanie (nasączanie) wodnej fazy wtryskiwanego nośnika lub też, że jest ono wolne na tyle,

166 827 iż nie utrudnia pomiarów echograficznych lecz, w niektórych przypadkach zapewnienia że przenikanie zachodzi w takim stopniu, że zapewnia względnie szybką biodegradację po wykonaniu testu, to jest łatwą metabolizację zawiesiny przez organizm. Również mikroporowata struktura powłoki mikrobalonu (pory rzędu od kilku nm do kilkuset nm lub więcej w przypadku powłok mikrobalonów o grubościach mieszczących się w zakresie 50-500 nm) jest czynnikiem określającym zachowanie kształtu, tzn. mikrokulki mogą z łatwością reagować na zmiany ciśnienia bez spowodowania pęknięć. Preferowany zakres wielkości porów wynosi około 50 2000 nm (nanometrów).

Warunki pozwalające na osiągnięcie tych wyników są spełnione przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, który polega na tym, że (1) emulguje się hydrofobową fazę organiczną w wodzie otrzymując w fazie wodnej kropelki fazy hydrofobowej jako emulsję typu olej w wodzie, (2) dodaje się do tej emulsji roztwór co najmniej jednego polimeru w nierozpuszczalnym w fazie wodnej, lotnym rozpuszczalniku, przy czym wokół kropelek tworzy się warstwa polimeru, (3) odparowuje się lotny rozpuszczalnik, przy czym polimer ulega wytrącaniu na granicy faz wokół kropelek, które następnie tworzą perełki z rdzeniem z fazy hydrofobowej zamkniętej membraną polimerową, przy czym perełki te są w zawiesinie w fazie wodnej, (4) poddaje się zawiesinę działaniu obniżonego ciśnienia w takich warunkach, żeby zakapsułkowana faza hydrofobowa była usuwana przez odparowanie, przy czym tak dobiera się fazę hydrofobową, żeby odparowała ona praktycznie równocześnie z fazą wodną i żeby była zastępowana przez powietrze lub gaz.

Polimer rozpuszcza się korzystnie w fazie hydrofobowej i wtedy etapy (2) i (3) mogą być pominięte, a membranę polimerową tworzy się przez wytrącanie na granicy faz w etapie (4). Odparowanie fazy hydrofobowej w etapie (4) przeprowadza się korzystnie w temperaturze, przy której ciśnienie cząstkowe par fazy hydrofobowej jest tego samego rzędu co ciśnienie pary wodnej, zwłaszcza w warunkach odpowiadających suszeniu przez wymrażanie, np. w zakresie temperatur od -40°C do 0°C.

W sposobie według wynalazku stosuje się fazę hydrofobową wybraną spośród związków organicznych, o prężności pary około 0,98· 10⁴ Pa w temperaturze mieszczącej się w przedziale od około -40°C do 0°C i fazę wodną zawierającą rozpuszczone stabilizatory w ilościach od około 1 do 20% wagowych obejmujące związki hydrofilowe wybrane spośród cukrów, PVA, PVP, żelatyny, skrobi, polidekstrozy i albuminy. Dodatki regulujące stopień przepuszczalności membrany polimeru dodaje się do fazy hydrofobowej, a szybkość biodegradacji polimeru po wstrzyknięciu mikrobalonów do żywego organizmu jest funkcją stopnia przepuszczalności. Stosuje się dodatki obejmujące hydrofobowe tłuszcze, woski i węglowodory lub fosfolipidy o dużym ciężarze cząsteczkowym i węglowodory o niskim ciężarze cząsteczkowym. Jako plastyfikatory stosuje się mirystynian izopropylu, jednostearynian gliceryny, substancje amfipatyczne obejmujące surfaktanty i fosfolipidy, takie jak lecytyna i związki hydrofobowe obejmujące węglowodory o wysokim ciężarze cząsteczkowym, takie jak wosk parafinowy. Miękkość i sprężystość membrany polimerycznej reguluje się dodawaniem polimerów zawierających węglowodory o niskim ciężarze cząsteczkowym, przy czym ciężar cząsteczkowy polimerów zawiera się w zakresie 1000 do 15 000.

Ponadto stosuje się dodatki wybrane spośród polilaktydów, poliglikolidów, glikoli polialkilenowych, takich jak glikol polietylenowy i glikol polipropylenowy i polialkohole, jak poligliceryna.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się fazę hydrofobową poddawaną emulgowaniu w fazie wodnej zawierającą również rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie, który po rozcieńczeniu w fazie wodnej podczas emulgowania będzie zmniejszał wielkość kropli i wywoływał wytrącanie polimeru na granicy faz przed przeprowadzeniem etapu (4), przy czym wytwarza się membranę elastyczną o grubości 50 - 500 nm, która wytrzymuje zmiany ciśnienia towarzyszące uderzeniom serca w strumieniu krwi.

Wytworzona membrana polimeryczna ma grubość od kilku do kilku tysięcy nanometrów, korzystnie 50 - 2000 nm. Jako polimer tworzący membranę stosuje się polimer ulegający biodegradacji wybrany spośród polisacharydów, poliaminokwasów, polilaktydów i poliglikolidów i ich kopolimerów, kopolimerów laktydów i laktonów, polipeptydów, poli/orto/estrów,

166 827 polidioksanonu, poli-p-aminoketonów, polifosfazenów, polibezwodników i poli/alkilo-cyjanoakrylanów/, korzystnie jako polimer membrany stosuje się polimer wybrany spośród pochodnych kwasów poliglutaminowego i poliasparaginowego i ich kopolimerów z innymi aminokwasami.

Stosuje się również pochodne kwasów poliasparaginowego i poliglutaminowego wybrane spośród estrów i amidów łącznie z łańcuchami bocznymi zawierającymi grupy karboksylowe o wzorach -/CWnCOO-OHRCOOR lub -/CH2nCOQCR'R²-O-COR lub -/CH₂/„CO/NH-CHXCO/_mNHCH/COOH/-/CH2/pCOOH, w których to wzorach R oznacza metyl, etyl, propyl, izopropyl, izobutyl i benzyl, R¹ oznacza metylen lub podstawiony metylen a R² oznacza atom wodoru lub R i R¹ połączone są przez podstawiony lub niepodstawiony człon łączący tworząc 5- lub 6-członowy pierścień, n jest 1 lub 2, p jest 1 2 lub 3, m jest liczbą całkowitą od 1 do 5, a X oznacza łańcuch boczny reszty aminokwasu.

Zgodnie z wynalazkiem wytwarza się membranę polimerową nie ulegającą biodegradacji w przewodzie pokarmowym i nieprzepuszczalną dla cieczy biologicznych.

Korzystnie stosuje się polimer wybrany z poliolefin, poliakrylanów, poliakrylonitrylu, poliestrów nie ulegających hydrolizie, poliuretanów i polimoczników.

Korzystnie w przypadku wytwarzania zawiesin do wstrzykiwania użytecznych jako kontrastowe czynniki do echografii ultrasonograficznej, suche, sypkie i nadające się do łatwego dyspergowania, wypełnione powietrzem mikrobalony otrzymuje się w wodzie lub w buforowanym albo niebuforowanym roztworze solanki.

Jednym z czynników, który pozwala regulować przepuszczalność membrany mikrobalonu jest stopień odparowania fazy hydrofobowej względem stopnia odparowania fazy wodnej w etapie (4) sposobu według wynalazku na przykład w warunkach liofilizacji, co stanowi przypadek opisany w zastrzeżeniu 4. Na przykład, jeżeli odparowywanie przeprowadza się w zakresie temperatur -40° do 0°C, a heksan używany jest jako faza hydrofobowa, wówczas polistyren jest polimerem osadzającym się na granicy faz i w rezultacie otrzymuje się perełki o względnie dużych porach. Dzieje się tak, ponieważ prężność par węglowodoru w wybranym zakresie temperatur jest znacznie większa od prężności par wody, a to oznacza, że różnica ciśnień pomiędzy wnętrzem a zewnętrznym obszarem kulek będzie powodowała wzrost rozmiarów porów membrany, poprzez które będzie zachodziło odparowywanie materiału znajdującego się wewnątrz mikrokulki. Przeciwnie, stosując cyklooctan jako fazę hydrofobową (w temperaturze -17°C prężność par cyklooctanu równa jest prężności par wody) uzyskuje się perełki o niewielkich porach, ponieważ w tych warunkach różnica ciśnień pomiędzy wnętrzem a zewnętrzną powłoką kulek jest zminimalizowana.

W zależności od stopnia porowatości mikrobalonów otrzymanych sposobem według wynalazku mogą one być stabilne w ciekłym nośniku przez okres od kilku godzin do kilku miesięcy a przy tym otrzymuje się sygnały echograficzne przez długi okres czasu. Rzeczywiście, w zależności od wybranego polimeru można otrzymać membranę całkowicie nie przepuszczalną w kontakcie z ciekłym nośnikiem wykazującym odpowiednie właściwości osmotyczne, tzn. takim który zawiera odpowiednią ilość substancji nierozpuszczalnej. Należy zauważyć, że obecność mikroporów w powłoce mikrobalonów wydaje się być również związana z odbitym sygnałem echograficznym, tzn. zachowując wszystkie inne czynniki bez zmian, mikroporowate pęcherzyki zapewniają otrzymanie bardziej skutecznego sygnału echograficznego niż pęcherzyki nie porowate. Powód nie jest dokładnie znany, lecz można twierdzić, że kiedy gaz jest w rezonansie, znajdując się w zamkniętej strukturze, wówczas jej własności tłumiące mogą być różne w zależności od tego czy jest ona porowata czy nie.

Jako rozpuszczalniki hydrofobowe według wynalazku mogą być stosowane inne nie rozpuszczalne w wodzie rozpuszczalniki organiczne, których prężność par w zakresie temperatur -40°C do 0°C jest tego samego rzędu. Należą do nich takie węglowodory, jak na przykład n-oktan, cyklooktan, dwumetylocykloheksan, etylocykloheksan 2-, 3-, i 4-metyloheptan, 3-etyloheksan, toluen, ksylen, 2-metylo-2-heptan, 2,2,3,3-czterometylobutan i podobne. Estry, takiejak propylo i izopropylomaślan i izomaślan, mrówczan butylu i podobne są również odpowiednie. Inną zaletą liofilizacji (odparowanie ze stanu zamrożenia) jest to, że proces ten można prowadzić pod zmniejszonym ciśnieniem gazu zamiast powietrza, otrzymując w rezultacie mikrobalony wypeł10

166 827 nione gazem. Można stosować również fizjologicznie akceptowalne gazy, takie jak CO2, N2O, metan, freon, hel i inne rzadko spotykane gazy. Można również zastanowić się nad wykorzystaniem gazów zawierających wskaźniki promieniotwórcze.

Jako lotne rozpuszczalniki nie rozpuszczalne w wodzie stosowane do rozpuszczania polimeru, który ma osadzić się na granicy faz, można wymienić związki chlorowcowe, takie jak CClą, CHaBr, CH2Cl2, chloroform, nisko wrzące estry jak metylowy, etylowy i octan propylu a także niższe etery i ketony charakteryzujące się nieznaczną rozpuszczalnością w wodzie. W przypadku użycia rozpuszczalników, które nie całkowicie rozpuszczają się w wodzie, np. eter etylowy, korzystnie jest zastosować jako fazę wodną roztwór wodny nasycony wspomnianymi rozpuszczalnikami.

Faza wodna, w której emulguje się fazę hydrofobową, jako emulsję typu olej w wodzie, korzystnie zawiera 1 -20 % wagowych związków hydrofilowych rozpuszczalnych w wodzie, takich jak cukry i polimery, które działają jako stabilizatory, np. alkohol poliwinylowy (PVA), poliwinylopirolidon (PVP), glikol polietylenowy (PEG), żelatyna, kwas poliglutarninowy, albumina oraz polisacharydy, takie jak skrobia, dekstran, agar, ksantogenian i podobne. Jako ciekły nośnik, w którym sporządza się zawiesinę mikrobalonów przed ich użyciem, można stosować fazy wodne podobne do wymienionych.

Część rozpuszczalnego w wodzie polimeru może pozostać w powłoce mikrobalonów lub można go usunąć na drodze wymywania perełek przed poddaniem ich końcowemu odparowaniu zakapsułkowanej fazy hydrofobowej rdzenia.

Emulgatory, które można zastosować (0,1 - 5% wagowo) do wytwarzania emulsji fazy hydrofobowej w fazie wodnej typu olej w wodzie obejmują większość fizjologicznie akceptowalnych emulgatorów, na przykład lecytynę zawartą w jajku lub soi lub też syntetyczne lecytyny, takie jak nasycone lecytyny syntetyczne, na przykład dipalmitoil D-a-fosfatydylocholiny, dimirystoil DL-a-fosfatydylocholiny lub distearoil fosfatydylocholiny lub nienasycone lecytyny syntetyczne, takie jak dioleoil L-a-fosfatydylocholiny lub dilinoleoil, L-a-fosfatydylocholiny. Grupa emulgatorów obejmuje również surfaktanty, takie jak wolne kwasy tłuszczowe, estry kwasów tłuszczowych ze związkami polialkilowymi, takimi jak glikol polioksypropylenowy i glikol polioksyetylenowy, etery alkoholi tłuszczowych z glikolami polioksyalkilowymi, estry kwasów tłuszczowych z polioksyalkilowanymi sorbitolami, mydła, stearyniany, glicerylo-polialkilenowe, rycynooleiniany glicerylo-polioksyetylenowe, mono- i kopolimery glikoli polialkilenowych, polioksyetylenowane oleje sojowe i rycynowe, jak również uwodornione pochodne, etery i estry sacharozy lub węglowodanów z kwasami tłuszczowymi ewentualnie polioksyalkilowane, jedno-, dwu- i trój-glicerydy kwasów tłuszczowych nasyconych i nienasyconych, glicerydy oleju sojowego i sacharozy.

Polimer, który stanowi powłokę lub membranę mikrobalonów do wstrzyknięć można wybrać spośród większości polimerów o własnościach hydrofilowych, ulegających biodegradacji i kompatybilnych fizjologicznie. Spośród tego rodzaju polimerów można wymienić polisacharydy o nieznacznej rozpuszczalności w wodzie, polilaktydy i poliglikolidy oraz ich kopolimery, kopolimery laktydów i laktonów takich jak ε-kaprolakton, δ-walerolakton i polipeptydy.

Wielką zaletą wynalazku jest uniwersalność w wyborze polimeru, ponieważ, jak to ma miejsce w przypadku pacjentów wrażliwych na uczulenia, można uniknąć stosowania mikrobalonów wykonywanych z protein naturalnych (albumina, żelatyna) opisanych w opisach patentowych nr US-A-4,276,885 lub EP-A-324,938. Inne odpowiednie polimery, które można zastosować to poli-/orto/estry (patrz na przykład US-A-4,093,709; US-A-4 131,648; US-A4,138,344; US-A-4,180,646), kwasy polimlekowy i poliglikolowy oraz ich kopolimery na przykład DEXON (patrz J.Heller,Biomaterials 1 (1980), 51; poli/DL-laktyd^-kaprolakton/, kopolimer poli/DL-laktyd^walerolakton/,kopolimer poli/DL-laktyd-y-butyrolakton/, poliakrylocyjanoakiylay;, poliamidy, polihydroksymaślan, polidioksanon; poli-P-aminoketony /Polymer 23 - 1982/ 1693; polifosfazeny (Science 193 /1976/, 1214/; i polibezwodniki. Odnośniki literaturowe dotyczące polimerów ulegających biodegradacji można znaleźć w R.Langer i inni, Macromol, Chem. Phys. C23 (1983) 61-126. Można również stosować poliaminokwasy, takie jak kwasy poliglutaminowy i poliasparginowy oraz ich pochodne, czyli częściowo ze166 827 stryfikowane z niższymi alkoholami lub glikolami. Praktycznym przykładem tego rodzaju polimerów jest poli-/IIIrz. butyloglutamina/. Można również stosować kopolimery z innymi aminokwasami, takimi jak metionina, leucyna, walina, prolina, glicyna, alamina i podobne. Ostatnio opisano nowe pochodne kwasów poliasparginowego i poliglutaminowego o kontrolowanej zdolności do biodegradacji (patrz opisy patentowe nr nr W087/03891; US-4,888,398 i EP-130,935). Polimery te (oraz kopolimery z innymi aminokwasami) można zapisać wzorem: -/NH-CHA-CO/x/NH-CHX-CO/_y, w którym X oznacza łańcuch boczny reszty aminokwasu, natomiast A jest grupą o wzorze -/C^nnĆOOR^-OCOR, w którym R¹ oznacza metylen lub podstawiony metylen a R² oznacza atom wodoru, a R oznacza metyl, etyl, propyl, izopropyl, izobutyl IIIrz - butyl i benzyl lub R i R¹ połączone są przez podstawioną lub nie podstawioną grupę łączącą tworząc 5- lub 6-członowe pierścienie.

A może być również grupą o wzorze: -/CH^nCOO-CHR^OOR i o wzorze -/CH2/nCO/NH-CHX-CO/_mNH-CH/CÓOH/-/CH2/pCOOH lub grupą odpowiedniego do nich bezwodnika. We wszystkich tych wzorach n, m i p oznaczają niewielkie liczby całkowite (nie przekraczające 5), natomiast x i y również liczbami całkowitymi dobranymi tak, aby ciężar cząsteczkowy nie był niższy od 5000.

Wspomniane wyżej polimery są odpowiednie do wytwarzania mikrobalonów sposobem według wynalazku. W zależności od rodzajów stosowanych podstawników R, R¹, R2 oraz X można wpływać na takie własności membrany, jak wytrzymałość, elastyczność i jej zdolność do biodegradacji. Na przykład X może oznaczać metylo/alaninę, izopropylo/walinę, izobutylo/leucynę lub izoleucynę/, benzylo/fenyloalaninę/.

Celem modyfikacji własności fizycznych polimerowej ścianki mikrobalonu, takich jak zdolność do dyspergowania, elastyczność oraz rozpuszczalność w stosunku do wody, można wprowadzać różne substancje dodatkowe. Dla wprowadzenie tych substancji do polimeru można je rozpuścić w fazie rozpraszającej polimer. Naprzykładprzez zemulgowanie fazy hydrofobowej w fazie wodnej zachodzi współstrącanie się dodatków z polimerem w trakcie tworzenia się membrany na granicy międzyfazowej.

Spośród użytecznych dodatków można wymienić związki, które mają zdolność hydrofobizowania membrany mikrobalonów celem zmniejszenia jej zdolności do przepuszczania wody. Jako substancje dodatkowe można stosować takie związki, jak węglowodory o dużym ciężarze cząsteczkowym, tłuszcze i woski. Dodatki, które polepszają zdolność do zdyspergowania mikrobalonów w ciekłym nośniku należą do grupy związków amfipatycznych, takich jak fosfolipidy, ponadto zwiększają również przenikalność wody przez membranę oraz szybkość procesu biodegradacji.

Polimery nie ulegające biodegradacji stosowane do wytwarzania mikrobalonów wprowadzanych do przewodu pokarmowego można wybrać spośród większości nie rozpuszczalnych w wodzie, akceptowalnych fizjologicznie i odpornych biologicznie polimerów, takich jak poliolefiny (polistyren), żywice akrylowe (poliakrylany, poliakrylonitryle), poliestry (poliwęglany), poliuretany, polimocznik i ich kopolimery, ABS (akrylo-butadienio-styren) jest kopolimerem preferowanym.

Dodatkami, które zwi^^^^^ją elastyczność membrany są plastyfikatory, takie jak mirystynian izopropylu i podobne. Również bardzo użyteczne dodatki można znaleźć wśród polimerów pokrewnych, tym, z których wykonanajest sama membrana, lecz posiadających względnie niski ciężar cząsteczkowy. Na przykład, jeżeli membrana utworzona jest z kopolimeru typu polilaktyd/poliglikolid, wówczas własności membrany można modyfikować (zwiększona miękkość i zdolność do biodegradacji) przez wprowadzenie, jako dodatków, poliglikolidów lub polilaktydów o niskim ciężarze cząsteczkowym (1000 do 15 000). Dodatkiem o właściwościach zmiękczających membranę jest glikol polietylenowy o umiarkowanym do niskiego ciężarze cząsteczkowym M_w(np.PEG 2000).

W zależności od potrzeb ilość wprowadzonych dodatków do polimeru tworzącego membranę mikrobalonu, wytwarzanych sposobem według wynalazku może zmieniać się w bardzo szerokich granicach. W niektórych przypadkach nie wprowadza się żadnych dodatków, w innych zaś ilość ta może osiągnąć wartość około 20 % wagowych w stosunku do polimeru.

166 827

Celem konserwacji i zapobieżenia koalescencji mikrobalony do wstrzyknięć przechowuje się w stanie suchym z udziałem lub bez dodatków. Jako dodatki można stosować od 0,1 do 25% wagowych rozpuszczalnych w wodzie, fizjologicznie akceptowalnych związków, takich jak mannitol, galaktoza, laktoza lub sacharoza lub polimery hydrofilowe, jak dekstran, ksantan, agar, krochmal, PVP, kwas poliglutaminowy, alkohol poliwinylowy (PVA), albumina i żelatyna. Użyteczny czas życia mikrobalonów w ciekłym nośniku, tzn. okres czasu, w którym można uzyskać użyteczne sygnały echograficzne, można regulować w zakresie od kilku minut aż do kilku miesięcy, w zależności od potrzeb. Można to osiągnąć poprzez kontrolę stopnia porowatości membrany, poczynając od całkowitej nieprzepuszczałności w kierunku ciekłego nośnika, do porowatości gdzie wielkość porów wynosi od kilku do kilkuset nanometrów. Taki stopień porowatości można uzyskiwać w sposób kontrolowany poprzez oprócz możliwości wyboru rodzaju polimeru tworzącego membranę i dodatków polimerowych, takie poprzez dobór szybkości odparowania i temperatury w etapie (4) sposobu według wynalazku oraz właściwy dobór rodzaju związku (lub mieszaniny związków) wchodzących w skład fazy hydrofobowej, tzn. im większa jest różnica jej prężności par w stosunku do prężności par fazy wodnej, tym większe będą pory membrany mikrobalonu. Oczywiście, opisany sposób regulacji poprzez wybór fazy hydrofobowej można jeszcze udoskonalić przez wybór stabilizatorów oraz ich stężenia co pozwoli na kontrolę szybkości odparowania wody podczas formowania mikrobalonów. Wszystkie te zabiegi mogą być z łatw<^;ścią przeprowadzane przez kogoś obdarzonego zręcznością bez wykazywania inwencji twórczej.

Należy zaznaczyć, że chociaż mikrobalony według wynalazku mogą być wprowadzone na rynek w postaci suchej, to w szczególnych przypadkach, zwłaszcza kiedy ich czas życia po wstrzyknięciu jest krótki, może zachodzić konieczność sprzedawania ich w gotowej postaci tzn. zawiesin mikrobalonów w wodnym nośniku, przeznaczonych do wstrzyknięć lub podawania doustnego. W takich zastosowaniach wymaga się aby membrana mikrobalonu była całkowicie nie przepuszczalna (co najmniej przez okres kilku miesięcy lub więcej) dla ciekłego nośnika. W opisie wykazano, że tego rodzaju wymagania mogą być łatwo spełnione zgodnie z wynalazkiem przez właściwy wybór rodzaju polimeru oraz parametrów procesu osadzania polimeru na granicy faz. W rzeczywistości parametry takie zostały dobrane ( na przykład, stosując polimer poliglutaminowy/ w którym A oznacza grupę o wzorze -/CHt/hCOoRk-O-COR/, w którym R oznacza metyl, .propyl, izopropyl, izobutyl, IlIrz. butyl i benzyl, R¹ oznacza metylen lub podstawiony metylen, a r2 oznacza atom wodoru lub R i R1 połączone są przez podstawiony lub niepodstawiony człon łączący tworząc 5- lub 6-członowy pierścień, a n jest 1 lub 2, i cyklooktan jako faza hydrofobowa) tak, że porowatość membrany po odparowaniu fazy hydrofobowej jest tak nieznaczna, że mikrobalony są całkowicie ni^pr:zi^^i^‘^:^(^:zale dla fazy ciekłego nośnika, w którym są one zawieszone. Zalecany sposób przygotowania preparatu do podawania dla celów diagnostycznych obejmuje wykonanie zawiesiny w zbuforowanym lub nie zbuforowanym roztworze soli (0,9% wodny roztwór NaCl, bufor 10 nM HCl) zawierającej 108-10^ pęcherzyków/ml. Preparat taki można przygotować postępując zgodnie ze wskazówkami zawartymi w przykładach podanych niżej, a w szczególności zaleca się przykład III i IV ilustrując wykorzystanie polimerów typu poli-/DL-laktyd/ firmy Boehringer Company, Ingelheim, Niemcy . Paidttyczną ilustrację wynalazku podają następujące przykłady.

Przykład I. Jeden gram polistyrenu rozpuszcza się w 19 g ciekłego naftalenu w temperaturze 100°C. Otrzymany roztwór naftalenu emulguje się w temperaturze 90-95°C z 200 ml wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego (PVA) (4% wagowe) zawierającego 0,1% emulgatora Tween-40, czyli 0,1 % polioksyetylenosorbitanu-monopalmitynianu. Do emulgowania stosowano głowicę typu Polytron PT-3000 wykonującą około 10 000 obrotów na minutę. Następnie otrzymaną emulsję rozcieńcza się, ciągle mieszając, w 500 ml tej samej fazy wodnej w temperaturze 15°C w wyniku czego kropelki naftalenu zestalają się w postaci perełek o średnicy poniżej 50 μm o czym świadczy test przesiewania ich przez sito o boku oczka 50 μm. Otrzymaną zawiesinę odwirowuje się stosując przyspieszenie 1000 g a następnie przemywa się perełki wodą i ponownie odwirowuje. Procedurę tę powtarza się dwukrotnie.

666 227

Z otrzymanych perełek przygotowuje się ponownie zawiesinę w 100 ml wody zawierającej 0,8 g rozpuszczonej laktozy, a następnie zawiesinę zamraża się w formie bloku w temperaturze -30°C. Z kolei zamrożony blok odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, wynoszącym około 0,49-1,96-10⁴ Pa w zakresie temperatur od -20° do -10°C. W rezultacie otrzymuje się wypełnione powietrzem mikrobaloniki o wielkości około 5-10 gm i kontrolowanej porowatości, które po zdyspergowaniu w wodzie (dyspersja 3% wagowych) dawały sygnał echograficzny przy częstotliwości 2,25 i 7,5 MHz. Mikrobalony w postaci suchej zachowują trwałość przez nieokreślony okres czasu. Z chwilą przygotowania zawiesiny w ciekłym nośniku jej czas życia dla celów echografii wynosił około 30 minut lub więcej. Polistyren nie ulega biodegradacji i dlatego nie jest zalecany do wstrzyknięć echograficznych lecz jest przydatny w przypadku badań przewodu pokarmowego. Przykład ten udowadnia w sposób przejrzysty przydatność sposobu według wynalazku.

Przykład II. Kopolimer mieszany (0,3 g) typu 50:50 DL-laktydu i glikolu (Du Pont Medisorb) oraz 16 mg lecytyny jajka kurzego rozpuszcza się w 7,5 ml CHCh i otrzymuje się roztwór (1).

Roztwór (2) zawiera 20 mg wosku parafinowego (o temperaturze topnienia 54°-56°C) rozpuszczonego w 10 ml cyklooktanu (temperatura topnienia 10^O-13°C). T ak otrzymany roztwór emulguje się w 150 ml wodnego roztworu (0,13% wagowo) preparatu o nazwie handlowej Pluronic F-102 (kopolimer blokowy tlenku etylenu i tlenku propylenu) zawierającego również 1,2 g CHCl3. Emulgowanie przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 1 minutę stosując głowicę typu Polytron wykonującą 7000 obrotów na minutę (7000 rpm). Następnie, ciągle mieszając, dodaje się roztwór (1) i po około 30-60 sekundach, zastępuje się głowicę mieszadłem śrubowym (500 obrotów na minutę) i kontynuuje się mieszanie przez około 3 godziny w temperaturze pokojowej (22°C). Otrzymaną zawiesinę przepuszcza się przez sito o boku oczka 50 gm, po czym zamraża w postaci bloku, który z kolei odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w zakresie temperatur od -20°C do 0°C (wymrażarka -60° do -20°C). W rezultacie otrzymuje się 0,264 g (88%) trwałych wypełnionych powietrzem mikrobalonów w postaci suchej.

Zawiesiny wspomnianych mikrobalonów w wodzie (bez dodatku stabilizatorów) dawały silny sygnał echograficzny przez co najmniej 1 godzinę. Po wstrzyknięciu do organizmu ulegają one biodegradacji w ciągu kilku dni.

Przykład III. Przygotowuje się roztwór, który w 200 ml tetrahydrofuranu (THF) zawiera 0,2 g kopolimeru 50:50 DL-laktydu i glikolidu (Boehrunger AG), 20 mg lecytyny jajka kurzego, 64 mg wosku parafinowego oraz 4 ml oktanu. Otrzymany roztwór emulguje się wpowadzając go powoli i przy ciągłym mieszaniu mieszadłem śrubowym (500 obrotów na minutę) do 400 ml 0,1% roztworu wodnego preparatu Pluronic F-102. Po mieszaniu przez 15 minut otrzymaną mleczną dyspersję odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem 9,2 -11,76 - 10ra, w temperaturze 25°C w wyparce rotacyjnej, dopóki objętość nie zmniejszy się do około 400 ml. Otrzymaną dyspersję przepuszcza się przez sito o boku oczka 50 gm, po czym oziębia się do temperatury -40°C i suszy przez wymrożenie pod zmniejszonym ciśnieniem wynoszącym około 0,92.10⁴ Pa. Otrzymaną pozostałość w ilości 1,32 g suchego, bardzo drobnego proszku miesza się z 40 ml wody destylowanej w wyniku czego, po 3 minutach ręcznego mieszania, otrzymuje się bardzo jednorodną dyspersję mikrobaloników, których średnia wielkość, zmierzona za pomocą analizatora cząstek (Mastersizer firmy Malvern), wynosi 4,5 gm. Stężenie mikrobalonów (zmierzone za pomocą licznika Coulter) wynosiło około 2· 10⁹/ml. Otrzymana zawiesina dawała silny sygnał echograficzny, który trwał przez około 1 godzinę.

Jeżeli w tym przykładzie nie wprowadzi się dodatków wchodzących w skład membrany polimerowej, czyli użyje się tylko 200 mg kopolimeru laktyd/glikolid w roztworze THF/oktan, wówczas obserwuje się drastyczne zmniejszenie przenikalności ścianki, przy czym po trzech dniach nie obserwuje się istotnego poziomu tłumienia sygnału echograficznego pochodzącego od dyspersji w ciekłych nośniku.

Stosując pośrednie ilości wprowadzonych dodatków otrzymuje się regulowaną pośrednią porowatość i czas życia dyspersji.

166 827

Przykład IV. W przykładzie tym stosuje się polimer o wzorze określonym w zastrzeżeniu 8, w którym grupa boczna ma wzór -/CH2/_nCOOR^łR²-O-COR, w którym R¹ i R² oznaczają wodór a R oznacza trzeciorzędowy rodnik butylowy. Otrzymanie tego polimeru (określanego nazwą poly/POMEG) opisane jest w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4,888, 398.

Postępowanie jest podobne do podanego w przykładzie III z użyciem 0,1 g poly-POMEG, 70 ml THF, 1 ml cyklooktanu i 100 ml 0,1% wodnego roztworu preparatu o nazwie handlowej Pluronic F-108. Nie dodaje się lecytyny czy też węglowodorów o dużym ciężarze cząsteczkowym. Mleczną emulsję odparowuje się w temperaturze 27°C pod ciśnieniem 9,8 10⁴ Pa aż pozostanie około 100 ml roztworu, który następnie przepuszcza się przez sito o boku oczka 50 gm i zamraża. Odparowanie zamrożonego bloku przeprowadza się (0,49-1,96- 104 P_a) aż ^o wysuszenia. Z uwagi na obecność surfaktantów, uzyskana wydajność wynosi 0,18 g. Otrzymaną substancję zdyspergowano w 10 ml wody destylowanej, po czym oceniano rozkład wielkości cząstek stosując licznik Coultera. W wyniku pomiaru stwierdzono, że stężenie wynosi 1,43x10⁹ mikrokapsułek/ml, średnia wielkość zmierzona analizatorem cząstek (Mastersizer firmy Malvern) wynosi 5,21 gm. Dyspersję rozcieńczono 100 krotnie, aby uzyskać stężenie 1,5x10⁷ mikrokulek/ml i zmierzono zdolność odbijania fal dźwiękowych. Amplituda odbitego sygnału była 5 krotnie większa przy częstotliwości 7,5 MHz aniżeli przy 2,25 MHz. Sygnały te były powtarzalne przez długi okres czasu.

Pomiary echogenności przeprowadzono stosując układ impulsów echa składający się z pleksiglasowego uchwytu próbki (średnica 300 nm) zaopatrzonego w okno akustyczne wykonane z mylaru o grubości 29 gm, przetwornika zamocowanego w uchwycie i zanurzonego w kąpieli wodnej o stałej temperaturze, odbiornika impulsów Accutron M3010JS (wyposażonego w przedwzmacniacz o stałym wzmocnieniu 40 dB i wzmacniacz zewnętrzny z regulowanym wzmocnieniem od -40 do +40 dB oraz wymienne 13 mm niezogniskowane przetworniki. Aby poprawić stosunek sygnału do zakłócenia umieszczono w części odbiorczej układu wąsko pasmowy filtr 10 MHz. Płytka przetwornika analogowo-cyfrowego A/D w komputerze IBM PC była typu Sonotek STR 832. Pomiary przeprowadzono przy częstotliwościach 2,25,3,5 oraz 7,5 MHz.

Jeżeli polimer zastosowany w tym przykładzie zastąpi się kopolimerami typu laktyd-lakton, przy czym jednym z laktonów może być γ-butyrolakton, δ-walerolakton lub ε-kaprolakton (patrz Fukuzaki i inni, J.Biomedical Mater. Res. 25/1991/315-328), wówczas otrzymuje się podobne wyniki, Zadawalające wyniki, również w podobnym znaczeniu, uzyskano stosując polialkilocyjanoakrylany, a w szczególności kopolimer mieszany typu 90:10 poli/DL-laktyd glikolid/, jednakże zalecanym polimerem jest poli/DL-laktyd/ firmy The Company BoehringerIngelheim sprzedawany pod nazwą handlową Resomer R-206 lub Resomer R-207.

Przykład V. Po wstrzyknięciu do żyły obwodowej psa doświadczalnego 0,1-2 ml dyspersji przygotowanej według przykładu IV (1,43x10⁹/ml) przeprowadzono dwuwymiarową echoradiografię za pomocą aparatury Acuson-128. Po uzyskaniu spodziewanego, wzmocnionego kontrastu obrazu prawej komory serca można było zaobserwować intensywny i utrzymujący się, wzmocniony sygnał lewej komory serca z jasnym zarysem wsierdzia. Potwierdza to, że mikrobalony wykonane przy zastosowaniu poly-POMEG (lub co najmniej istotnej ich części) były w stanie przedostać się do płucnego krążenia włośniczkowego i pozostawać w krwioobiegu przez okres czasu wystarczający do przeprowadzenia skutecznej analizy echograficznej.

W innych seriach doświadczeń uzyskano nie zanikający, wzmocniony sygnał Dopplera pochodzący od tętnic ogólnoustrojowych i żyły wrotnej. Doświdczenia te przeprowadzono na króliku i szczurze, którym wstrzyknięto 0,5-2 ml preparatu zawierającego mikrobaloniki wytworzone według przykładu IV z tym, że jako fazę polimerową zastosowano poli,/kwas dLmlekowy. Kompozycja ta zawierała 1,'9x10⁸ pęcherzyków.

Przygotowano inną kompozycję, również według wskazówek podanych w przykładzie IV, stosując tym razem poli/glutaminian IIIrz. -butylu jako fazę polimerową. Kompozycję tę (0,5 ml) rozcieńczoną do stężenia 3,4x10⁸ mikrobaloników/ml wstrzyknięto do żyły wrotnej szczura co pozwoliło na uzyskanie trwałego wzmocnionego kontrastu miąższu wątroby.

166 827

Przykład VI. Przygotowano zawiesinę mikrobalonów (1,1x10⁹ pęcherzyków/ml) według wskazówek z przykładu I (żywica = polistyren). Jeden ml tej zawiesiny rozcieńczono 100 ml roztworu mannitolu o stężeniu 300 nM. Następnie 7 ml tego roztworu wprowadzono do żołądka szczura laboratoryjnego. Badanie zwierzęcia przeprowadzono stosując urządzenie Acuson-128 przeznaczone do otrzymywania dwuwymiarowych obrazów echograficznych przewodu pokarmowego. Zaobserwowano wyraźnie pojedyncze pętelki jelita cienkiego i okrężnicy.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (21)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania wypełnionych powietrzem lub gazem mikrobalonów do sporządzania zawiesin w ciekłych nośnikach do echografii, ultrasonograficznej,nadających się do podawania doustnie, doodbytniczo i do przewodu moczowego lub do wstrzyknięć żywym organizmom, znamienny tym, że (1) emulguje się hydrofobową fazę organiczną w wodzie otrzymując w fazie wodnej kropelki fazy hydrofobowej jako emulsję typu olej w wodzie, (2) dodaje się do tej emulsji roztwór co najmniej jednego polimeru w nierozpuszczalnym w fazie wodnej, lotnym rozpuszczalniku, przy czym wokół kropelek tworzy się warstwa polimeru, (3) odparowuje się lotny rozpuszczalnik, przy czym polimer ulega wytrącaniu na granicy faz wokół kropelek, które następnie tworzą perełki z rdzeniem z fazy hydrofobowej zamkniętej membraną polimerową, przy czym perełki te są w zawiesinie w fazie wodnej, (4) poddaje się zawiesinę działaniu obniżonego ciśnienie w takich warunkach, żeby zakapsułkowana faza hydrofobowa była usuwana przez odparowanie, przy czym tak dobiera się fazę hydrofobową, żeby odparowała ona praktycznie równocześnie z fazą wodną i żeby była zastępowana przez powietrze lub gaz.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer rozpuszcza się w fazie hydrofobowej i wtedy etapy (2) i (3) mogą być pominięte, a membranę polimerową tworzy się przez wytrącanie na granicy faz w etapie (4).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odparowanie fazy hydrofobowej w etapie (4) się w temperaturze, przy której ciśnienie cząstkowe par fazy hydrofobowej jest tego samego rzędu co ciśnienie pary wodnej.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odparowanie w etapie (4) przeprowadza się w warunkach odpowiadających suszeniu przez wymrażanie.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że odparowanie przeprowadza się w zakresie temperatur od -40°C do 0°C.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się fazę hydrofobową wybraną spośród związków organicznych, o prężności pary około 0,98· 10* Pa w temperaturze mieszającej się w przedziale od około -40°C do 0°C.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się fazę wodną zawierającą rozpuszczone stabilizatory w ilościach od około 1 do 20% wagowych obejmujące związki hydrofilowe wybrane spośród cukrów polialkoholu winylu (PVA),poliwinylopirolidonu (PVP) żelatyny, skrobi, polidekstrozy i albuminy.
8. 8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że dodatki regulujące stopień przepuszczalności membrany polimeru dodaje się do fazy hydrofobowej, a szybkość biodegradacji polimeru po wstrzyknięciu mikrobalonów do żywego organizmu jest funkcją stopnia przepuszczalności.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się dodatki obejmujące hydrofobowe tłuszcze, woski i węglowodory lub fosfolipidy o dużym ciężarze cząsteczkowym i węglowodory o niskim ciężarze cząsteczkowym.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako plastyfikatory stosuje się mirystynian izopropylu, jednostearynian gliceryny, substancje amfipatyczne obejmujące surfaktanty i fosfolipidy, takie jak lecytyna i związki hydrofobowe obejmujące węglowodory o wysokim ciężarze cząteczkowym, takie jak wosk parafinowy
11. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że miękkość i sprężystość membrany polimerycznej reguluje się dodawaniem polimerów zawierających węglowodory o niskim ciężarze cząsteczkowym, przy czym ciężar cząsteczkowy polimerów zawiera się w zakresie 1000 do 15000.

    166 827
12. 12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się dodatki wybrane spośród polilaktydów, poliglikolidów, glikoli polialkilenowych, takich jak glikol polietylenowy i glikol polipropylenowy i poliole, jak poligliceryna.
13. 13. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się fazę hydrofobową poddawaną emulgowaniu fazie wodnej zawierającą również rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie, który po rozcieńczeniu w fazie wodnej podczas emulgowania będzie zmniejszał wielkość kropli wywoływał wytrącanie polimeru na granicy faz przed przeprowadzeniem etapu (4).
14. 14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się membranę elastyczną o grubości 50 - 500 nm, która wytrzymuje zmiany ciśnienia towarzyszące uderzeniom serca w strumieniu krwi.
15. 15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się membranę polimeryczną o grubości od kilku do kilku tysięcy nanometrów, korzystnie 50 - 2000 nm.
16. 16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako polimer tworzący membranę stosuje się polimer ulegający biodegradacji wybrany spośród polisacharydów, poliaminokwasów, polilaktydów i poliglikolidów i ich kopolimerów, kopolimerów laktydów i laktonów, polipeptydów, poli/orto/estrów, polidioksanonu, poli-p-aminoketonów, polfosfazenów, polibezwodników i poli/alkilo-cyjanoakrylanów/.
17. 17. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako polimer membrany stosuje się polimer wybrany spośród pochodnych kwasów poliglutaminowego i poliasparaginowego i ich kopolimerów z innymi aminokwasami.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się pochodne kwasów poliasparginowego i poliglutaminowego wybrane spośród estrów i amidów z łańcuchami bocznymi zawierającymi grupy karboksylowe o wzorach -/CH2/nCOO-OHR^lCOOR lub -/CH^nCOOCR κ-O-COR lub -/CH2/nCO/NH-CHX-CO/_mNHCH/COOH/-/CH2/pCOOH, w których to wzorach R oznacza metyl, etyl,propyl, izopropyl, izobutyl, IIIn-butyl i benzyl, R¹ oznacza, r2 oznacza atom wodoru lub R i R¹ połączone są przez podstawiony lub niepodstawiony człon łączący tworząc 5- lub 6-członowy pierścień, n jest 1 lub 2, pjest 1,2 lub 3, mjest liczbą całkowitą od 1 do 5, a X oznacza łańcuch boczny reszty aminokwasu.
19. 19. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się membranę polimerową nie ulegającą biodegradacji w przewodzie pokarmowym metyl lub podstawiony metylen, a i nieprzepuszczalną dla cieczy biologicznych.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się polimer wybrany z poliolefin, poliakrylanów, poliakrylonitrylu, poliestrów nie ulegających hydrolizie, poliuretanów i polimoczników.
21. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania zawiesin do wstrzykiwania użytecznych jako kontrastowe czynniki do echografii ultrasonograficznej, suche, sypkie i nadające się do łatwego dyspergowania, wypełnione powietrzem mikrobalony otrzymuje się w wodzie lub w buforowanym albo niebuforowanym roztworze solanki.