PL183228B1 - Sposób otrzymywania enzymatycznie aktywnej ssaczej trzustkowej karboksypeptydazy B - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania enzymatycznie aktywnej ssaczej trzustkowej karboksypepty- dazy B CPB, która posiada sekwencje aminokwasowai aktywnosc enzymatyczna naturalnie wystepujacej ssaczej trzustkowej CPB, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy: (a) traktowanie rekombinowanej komórki bakteryjnej zawierajacej DNA kodujace ProCPB prowadzace do ekspresji DNA dajacej ProCPB; (b) rozpuszczanie tak ekspresjonowanego ProCPB w pH 7-9,5; (c) inkubowanie rozpuszczonego ProCPB w pH okolo 9-9,5 pozwalajace na faldowa- nie ProCPB; (d) poddawanie sfaldowanego ProCPB trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania enzymatycznie aktywnego CPB; i (e) oczyszczanie enzymatycznie aktywnego CPB. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze etap rozpuszczania obejmuje: (a) rozbijanie sciany komórkowej komórki rekombinowanej w celu uzyskania lizatu; (b) izolowanie wewnatrzkomórkowego precypitatu z lizatu poprzez odwirowywanie, oraz (c) rozpuszczanie wewnatrzkomórkowego precypitatu w odpowiednim buforze. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania enzymatycznie aktywnej ssaczej trzustkowej CPB, która posiada sekwencję aminokwasową i aktywność enzymatyczną naturalnie występującej ssaczej trzustkowej CPB, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) traktowanie rekombinowanej komórki bakteryjnej zawierającej DNA kodujące ProCPB prowadzące do ekspresji DNA dającej ProCPB;

(b) rozpuszczanie tak ekspresjonowanego ProCPB w pH 7-9,5;

(c) inkubowanie rozpuszczonego ProCPB w pH około 9-9,5 pozwalające na fałdowanie ProCPB;

(d) poddawanie sfałdowanego ProCPB trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania enzymatycznie aktywnego CPB; i (e) oczyszczanie enzymatycznie aktywnego CPB.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że etap rozpuszczania obejmuje:

(a) rozbijanie ściany komórkowej komórki rekominowanej w celu uzyskania lizatu;

(b) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu z lizatu poprzez odwirowywanie, oraz

183 228 (c) rozpuszczanie wewnątrzkomórkowego precypitatu w odpowiednim buforze.

Równie korzystnie inkubowanie z etapu (c) jest prowadzone w temperaturze pokojowej przez okres około 20-24 godzin.

Równie korzystnie inkubowanie z etapu (c) jest prowadzone w temperaturze pokojowej przez okres około 20-24 godzin w obecności utlenionego ZnCl₂ glutationu i glutationu zredukowanego.

Równie korzystnie poddawanie z etapu (d) obejmuje:

(i) doprowadzanie pH do około 8,5; i (ii) trawienie ProCPB trypsyną w 37°C, przez około 60 minut.

Równie korzystnie oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną.

Równie korzystnie oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną i chromatografię hydrofobową.

Równie korzystnie oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną, chromatografię hydrofobową i diafiltrację.

Równie korzystnie ProCPB jest ekspresjonowany z plazmidu pAProCPB zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu 69673.

Mapy restrykcyjne plazmidów, przedstawione na fig. 2 i 3, nie ukazują wszystkich miejsc restrykcyjnych obecnych na plazmidach. Jednakże przedstawiono miejsca restrykcyjne niezbędne dla pełnego zrozumienia niniejszego wynalazku.

Figura 1 - aminokwas i odpowiadająca mu sekwencja nukleotydową cDNA szczurzej prokarboksypeptydazy B trzustkowej

Przedstawiono sekwencję nukleotydową cDNA i odpowiadaj ącą jej sekwencję aminokwasów szczurzej prokarboksypeptydazy B trzustkowej, zawierającej sekwencję nukleotydową dojrzałej karboksypeptydazy B i sekwencję nukleotydową peptydu aktywującego. Sekwencja DNA różni się od sekwencji DNA opublikowanej przez Clausera i wsp. (5) czterema nukleotydami, z których dwa są wynikiem zmiany aminokwasów: Lys¹⁴—Asn i Arg ^l42—>Asp.

Przedstawiono również (dużą czcionką) sekwencję nukleotydową DNA trzech primerów stosowanych w czasie klonowania (przykład 1): primer końca 5' prokarboksypeptydazy B primer końca 5' dojrzałej karboksypeptydazy B i primer końca 3' karboksypeptydazy B.

Numerację aminokwasów przeprowadzono zgodnie z homologią do karboskypeptydazy A, pochodzącej z trzustki bydlęcej (10,12) : pierwszy aminokwas (Ala) dojrzałej szczurzej karboksypeptydazy B oznaczono cyfrą „4”. Gwiazdka (*) wskazuje dodatkowy aminokwas (Leu), którym szczurza karboksypeptydaza B różni się od karboksypeptydazy A.

Figura 2 - wytwarzanie plazmidu pCPB i plazmidu pCPB-C

Plazmid pABN poddano traktowaniu BamHI i Ncol. Wyizolowano fragment o długości 2500 bp i poddano go ligacji z fragmentem cDNA BamHI-Ncol karboskypeptydazy B, o długości 940 bp (wytworzonym w sposób opisany w przykładzie 1). Nowo wytworzony plazmid oznaczono jako pCPB i wykorzystywano do transformacji E coli 4300.

Plazmid pCPB poddano trawieniu BamHI i Ndel w celu wyizolowania dużego fragmentu. Plazmid pCPB poddano również trawieniu Asel i Scal w celu wyizolowania dużego fragmentu.

Wytworzono heterodupleks poprzez zmieszanie tych dwóch dużych fragmentów z fosforylowanym oligonukleotydem 5'-końcowym, wytworzonym poprzez mutagenezę swoistą ze względu na miejsce (przykład 1) z zastosowaniem bufora polimeraza-ligaza (5x bufor:32,5 mM Tris-HCl o pH 7,5, 40 mM MgCl₂ 5 mM 2-merkaptoetanolu, 0,5 M NaCl) (9). Mieszaninę ogrzewano w celu denaturacji nici DNA, a następnie powoli schładzano w celu renaturacji DNA. Produkty reakcji zastosowano do transformacji E. coli 1645 poprzez elektroporację. Transformanty poddano przesiewowi poprzez prowadzenie wzrostu na pożywce agarowej LB, zawierającej ampicylinę, i poprzez hybrydyzację różnicową kolonii in situ z zastosowaniem fosforylowanego oligonukleotydu 5'-końcowego, wytworzonego do mutagenezy.

Z dodatnich kolonii ekstrahowano plazmid DNA i po analizie enzymem restrykcyjnym i sekwescjonowanlu nukleotydów DNA wybrano klon zawierający zmutowane miejsce Spel. Nowo wytworzony plazmid oznaczono jako pCPB-C; plazmid ten koduje karboksypeptydazę B

183 228 z mutacją na aminokwasie 290 (seryna zamiast cysteiny). Plazmid pCPB-C zastosowano do transformacji E coli 4300.

Figura 3 - wytwarzanie plazmidu pProCPB-C i plazmidu pAProCPB cDNA prokarboksypeptydazy B, wytworzone w sposób opisany w przykładzie 1, poddano odszczepieniu z zastosowaniem Ndel i Ciał w celu wyizolowania fragmentu o długości 470 bp, kodującego peptyd aktywujący i część karboksypeptydazy B.

Plazmid pCPB-C poddano odszczepieniu z zastosowaniem BamHI i Ciał w celu wyizolowania fragmentu o długości 760 bp, kodującego pozostałą część karboksypeptydazy B, w skład której wchodzi mutacja Cys²⁹⁰ -» Ser.

Plazmid pAB poddano odszczepieniu z zastosowaniem Ndel i BamHI w celu wyizolowania fragmentu o długości 2500 bp, kodującego wszystkie elementy niezbędne do ekspresji bakterii (por. przykład 1).

Powyższe trzy fragmenty poddano ligacji, a nowowytworzony plazmid oznaczono jako pProCPB-C.

Plazmidy pProCPB-C i pCPB poddano odszczepieniu z zastosowaniem Stul i Xhol. Z plazmidu pProCPB-C wyizolowano fragment o długości 3700 bp, kodujący wszystkie elementy niezbędne do ekspresji bakterii (por. przykład 1), całość peptydu aktywującego i część karboksypeptydazy B.

Z plazmidu pCPB wyizolowano fragment o długości 430 bp, kodujący pozostałą część karboksypeptydazy B.

Oba te fragmenty poddano ligacji i nowowytworzony plazmid oznaczono jako pXProCPB.

Figura 4 - porównanie aktywności rekombinacyjnej karboksypeptydazy B i karboksypeptydazy B występującej naturalnie

Aktywność dostępnej w handlu świńskiej karboksypeptydazy B (Sigma) i rekombinacyjnej karboksypeptydazy B, wytworzonej w sposób opisany w przykładzie 5, oznaczono sposobem Folka (11) z zastosowaniem Hippurylo-L-Arg. V0 reakcji katalitycznej mierzono z zastosowaniem stężenia substratów wynoszącego 0,025-1,0 mM.

Plazmid pAProCPB zdeponowano w E. coli, zgodnie z wymaganiami Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznaniu depozytu drobnoustrojów w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, dla celów procedury patentowej, pod numerem ATCC 69673, dnia 4 sierpnia 1994. W rozumieniu niniejszego opisu, „CPB” oznacza polipeptyd, wytworzony metodami rekombinacji DNA lub w inny sposób wykazujący taką samą lub w zasadzie taką samą sekwencję aminokwasów, jak dowolna z naturalnie występujących karboksypeptydaz B ssaków. Tak więc, termin „CPB” oznacza polipeptydy, różniące się jednym lub kilkoma aminokwasami, korzystnie, różniące się nie więcej niż dziesięcioma aminokwasami, od naturalnie występującej karboksypeptydazy B.

W rozumieniu niniejszego opisu, „ProCPB” oznacza polipeptyd, wytworzony metodami rekombinacji DNA lub w inny sposób, wykazujący taką samą lub w zasadzie taką sama sekwencję aminokwasów, jak dowolna z naturalnie występujących prokarboksypeptydaz B ssaków. Tak więc, termin „ProCPB” oznacza polipeptydy, różniące się jednym lub kilkoma aminokwasami, korzystnie, różniące się nie więcej niż dziesięcioma aminokwasami, od naturalnie występującej prokarboksypeptydazy B.

Specjaliści łatwo ocenią, które reszty aminokwasowe można dołączyć, poddać delecji lub podstawieniu (jak również to, jakich aminokwasów można używać w charakterze podstawników), stosując procedury znane ze stanu techniki, włączając w to np. konwencjonalne sposoby projektowania i wytwarzania sekwencji DNA kodujących ekspresje polipeptydów w bakteriach, modyfikację cDNA i sekwencji genomowych poprzez techniki mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, wytwarzanie białek rekombinacyjnych i wektorów ekspresyjnych, ekspresję polipeptydów w bakteriach i pomiar aktywności biochemicznej polipeptydów z zastosowaniem konwencjonalnych prób biochemicznych

183 228

W rozumieniu niniejszego opisu, CPB „enzymatycznie czynny” oznacza CPB wykazujący aktywność biologiczną naturalnie występującej karboksypeptydazy B ssaków. Dla celów tej definicji, aktywność biologiczna naturalnie występującej karboksypeptydazy B stanowi zdolność do swoistego usuwania z peptydu C-końcowej argininy, lizyny lub omityny.

„W zasadzie taka sama sekwencja aminokwasów”, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza sekwencję obejmującą podstawienia i/lub delecje i/lub addycje aminokwasów w sekwencji aminokwasowej, obejmuje do dziesięciu (10) reszt według grup homologicznych lub równoważnych, opisanych np. przez: Lehninger, Biochemistry, wydanie II, Worth Pub., N.Y. (1975), rozdział IV; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Pressat at Oxford University Press, Oxford, Anglia (1989); i Dayhoff, Atlas of Protein Seguence and Structure, tom V, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), rozdział IX. Podstawienia takie są znane specjalistom.

W korzystnym wykonaniu, DNA kodujące proCPB lub CPB może być pochodzenia ludzkiego, szczurzego, bydlęcego lub świńskiego. DNA można wytwarzać poprzez odwrotną transkrypcję, polimerazową reakcję łańcuchową (PCR), syntetycznie lub półsuntetycznie lub z zastosowaniem więcej niż jednego z tych sposobów, lub z zastosowaniem innych sposobów znanych ze stanu techniki.

DNA kodujące polipeptyd ProCPB lub CPB można poddawać mutacji sposobami znanymi specjalistom, jak to opisali np. Bauer i wsp. (1985), Gene 37:73-81. Zmutowaną sekwencję można umieszczać w odpowiednich wektorach ekspresyjnych, jak to opisano w niniejszym zgłoszeniu, które wprowadza się do komórek, poddawanych następnie obróbce, tak aby uzyskać ekspresję polipeptydu kierowaną przez zmutowany DNA.

Specjalistom wiadomo, że plazmid zdeponowany w związku z niniejszym zgłoszeniem można w łatwy sposób poddawać modyfikacjom, np. poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, lub insercję łączników (linkerów) w celu uzyskania ekspresji polipeptydu. Techniki takie opisali np. Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie II, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Przykładowe wektory, które można stosować do ekspresji kwasu nukleinowego kodującego CPB lub ProCPB, stanowią wirusy, takie jak wirusy bakteryjne, np. bakteriofagi (np, fag lambda), kosmidy, plazmidy i inne wektory. Dokonuje się insercji cDNA kodującego ProCPB lub CPB, do odpowiednich wektorów sposobami znanymi ze stanu techniki. Na przykład, z zastosowaniem konwencjonalnych miejsc restrykcyjnych enzymu endonukleazy, można dokonać odszczepienia zarówno insertu, jak i wektora DNA, w celu wytworzenia komplementarnych końców, których zasady tworzą wzajemne pary i poddaje się je następnie ligacji z ligaząDNA. Zamiast tego można dokonać ligacji DNA poddawanego insercji z syntetycznymi łącznikami, zawierającymi sekwencje zasad komplementarne do miejsca restrykcyjnego w wektorze DNA, po czym DNA, które poddano insercji, poddaje się traktowaniu enzymem restrykcyjnym, który dokonuje ciecia w tym miejscu. Dostępne są również inne sposoby.

Wektory zawierające sekwencje kodujące ProCPB lub CPB, można przystosować do ekspresji w różnych komórkach-gospodarzach, prokariotycznych i eukariotycznych, np. w bakteriach, drożdżach, grzybach, komórkach owadów lub komórkach ssaków, takich jak CHO, komórki zarodków kurzych, fibroblasty, komórki nerki lub inne znane linie komórkowe. Wektory te zawierają ponadto elementy regulacyjne niezbędne do ekspresji klonowanego genu w komórce-gospodarzu, umiejscowione względem kwasu nukleinowego kodującego ProCPB lub CPB w taki sposób, aby wywoływać jego ekspresję.

Do elementów regulacyjnych niezbędnych do ekspresji należą sekwencje promotora i operatora i miejsce wiązania w rybosomie. Na przykład, bakteryjny wektor ekspresyjny może zawierać sekwencję promotora/operatora, jak np. promotora AP_L0_L lub deo. Do zapoczątkowania translacji można stosować rybosomalne miejsca wiązania aC_It lub deo. Wektory te są dostępne w handlu; można je również wytworzyć z opisanych sekwencji sposobami znanymi ze stanu techniki, opisanymi np. w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4 831 120, wydanym

183 228 maja 1989, i w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5 143 836, wydanym 1 września 1992, w którym opisano sposoby z wykorzystaniem promotora ^XP_L i w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 303972, opublikowanym 22 lutego 1989, w którym opisano sposoby z wykorzystaniem promotora Deo. Mogą być również obecne dodatkowe odpowiednie elementy takie jak represory lub wzmacniacze. Specjalistom wiadomo, jak stosować te elementy regulujące w zależności od doboru systemu ekspresji.

Plazmidy ekspresyjne obejmują odpowiednie elementy regulacyjne, umieszczone w plazmidzie zawiązanym z DNA kodującym polipeptyd ProCPB lub CPB w taki sposób, aby wywołać ekspresje polipeptydu ProCPB lub CPB w odpowiedniej komórce-gospodarzu. Do takich elementów regulacyjnych należą promotory i operatory, np. deo PjP₂ i ^XP_L, i rybosomalne miejsca wiązania, np. deo i C_n, jak również te presory i wzmacniacze.

W korzystnym wykonaniu elementy regulacyjne umiejscowione są w pobliżu i w kierunku końca 5' DNa kodującego ProCPB lub CPB.

Plazmidy zawierają również kodon inicjujący ATG. DNA kodujące ProCPB lub CPB jest w fazie z kodonem inicjującym ATG.

Plazmidy zawierają również sekwencję DNA, zawierającą początek replikacji z plazmidu bakteryjnego zdolnego do automatycznej replikacji w komórce-gospodarzu. Odpowiednie początki replikacji są dostępne z licznych źródeł, np. stanowi je plazmid pBR322 (nr ATCC 37017).

Plazmidy zawierają, również sekwencję DNA, zawierającą gen związany z cechą fenotypową, według której plazmid można wyselekcjonować łub zidentyfikować, przy czym ta cecha fenotypowa manifestuje się wtedy, gdy plazmid znajduje się w komórce-gospodarzu; cechę taką stanowi np. gen oporności na lek, np. oporności na ampicylinę, chloramfenikol lub tetracyklinę.

Korzystne bakteryjne komórki-gospodarze stanowią komórki E. coli. Przykład odpowiadającej komórki E. coli stanowi szczep 4300, jednakże inne szczepy E coli i inne bakterie można również stosować jako gospodarzy dla plazmidów.

Bakterie stosowane jako gospodarze mogą stanowić bakterie dowolnego szczepu, włączając w to szczepy auksotroficzne (takie jak A1645), szczepy prototroficzne (takie jak A4255) i szczepy lityczne; szczepy F+ i F'; szczepy zawierające sekwencję represorową cl⁸⁵⁷ profaga λ (takie jak A1645 i A4255) i szczepy pozbawione represorów deo i/lub genu deo (por. europejskie zgłoszenie patentowe nr 0303972, opublikowane 22 lutego 1989). Szczep E coli 4300 zdeponowano pod nr ATCC 69363.

Wszystkie opisane powyżej szczepy gospodarzy E. coli można „pozbawić” plazmidów, które zawierają, sposobami znanymi ze stanu techniki, np. sposobem z zastosowaniem bromku etydyny, opisanym przez R.P. Novick w Bacteriol Review 33, 210 (1969). Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania enzymatycznie aktywnej CPB, polegający na poddaniu komórki rekombinacyjnej, zawierającej DNa kodujące ProCPB, takiej obróbce, aby DNA kierowało ekspresją ProCPB, zebraniu z komórki ProCPB, której ekspresję w ten sposób uzyskano, poddaniu wytworzonej ProCPB obróbce w warunkach umożliwiających zwinięcie się ProCPB, poddaniu zwiniętej ProCPB odszczepieniu enzymatycznemu dla wytworzenia enzymatycznie czynnej CPB i oczyszczeniu enzymatycznie czynnej CPB.

W korzystnym wykonaniu, zebranie ProCPB z komórki rekombinacyjnej polega na naruszeniu ściany komórkowej rekombinacyjnej lub jej fragmentów dla wytworzenia lizatu, izolowaniu z lizatu osadu poprzez odwirowanie i rozpuszczeniu osadu wewnątrzkomórkowego w odpowiednim buforze. W innym wykonaniu, obróbka zebranego ProCPB obejmuje inkubację ProCPB w temperaturze pokojowej przez około 20-24 godzin w pH wynoszącym około 9-9,5.

W jeszcze innym wykonaniu, obróbka zebranego ProCPB obejmuje inkubacje ProCPB w temperaturze pokojowej przez około 20-24 godzin w pH wynoszącym około 9-9,5, w obecności ZnCl₂, utlenionego glutationu (GSSG) i zredukowanego glutationu (GSH).

183 228

Zakłada się, ze poddanie zwiniętego ProCPB odszczepieniu enzymatycznemu obejmuje doprowadzenie pH do około 8,5 i rozszczepienie ProCPB z zastosowaniem trypsyny w temperaturze 37°C w ciągu około 60 minut.

Zakłada się następnie, że oczyszczanie enzymatycznie czynnej CPB obejmuje chromatografię jonowymienną. Spacjalista stwierdzi, że można stosować dowolną metodę chromatografii jonowymiennej. Korzystne są słabe kolumny anionowymienne, takie jak DEAE-Sepharose. Słabe kolumny anionowymienne zawierają zwykle jako grupę funkcyjną aminę trzeciorzędową (grupę dwuetyloaminoetylową), jednakże stosować można również czwartorzędową grupę aminoetylową lub czwartorzędową aminę.

Podłoże mogą stanowić związki nieorganiczne, żywice syntetyczne, polisacharydy lub polimery organiczne; dopuszczalne podłoża stanowią agaroza, celuloza, trójakryl, dekstran, perełki szklane, perełki z tlenku etylenu i akrylu, akrylamid, kopolimer agarozowo-poliakrylamidowy lub hydrofilowy polimer winylowy.

Zakłada się również, że oczyszczanie enzymatyczne czynnej CPB obejmuje chromatografię jonowymienną i chromatografię hydrofobową.

Specjalista stwierdzi, że można stosować dowolną kolumnę hydrofobową. Korzystna jest kolumna Phenyl-Sepharose. Gupę funkcyjną stanowić może grupa fenylowa, benzylowa, oktylowa lub butylowa. Podłoże stanowić może dowolne z podłóż omówionych powyżej.

W innym korzystnym wykonaniu, oczyszczanie enzymatycznie czynnej CPB obejmuje chromatografię jonowymienną, chromatografię hydrofobową, i diafiltrację. W szczególnie korzystnym wykonaniu, ekspresja ProCPB zachodzi w plazmidzie p^ProCPB, zdeponowanym pod nr ATCC 69673.

Wynalazek ujawnia ponadto enzymatycznie czynną CPB wolną od innych substancji pochodzących od ssaków.

Poniższe przykłady służą ułatwieniu zrozumienia wynalazku, nie ograniczają natomiast w żaden sposób jego zakresu. W przykładach nie zawarto dokładnego opisu konwencjonalnych metod stosowanych do wytwarzania wektorów i insercji genów kodujących polipeptydy do takich wektorów, oraz wprowadzania powstałych plazmidów do gospodarzy.

W przykładach nie zawarto również dokładnego opisu konwencjonalnych metod stosowanych do badania polipeptydów wytworzonych przez takie układy gospodarz-wektor. Sposoby te są dobrze znane specjalistom i opisane w licznych publikacjach, które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie; w tym np. następującą publikację: Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie II, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Przykład 1.

Klonowanie cDNA szczurzej karboskypeptydazy B poprzez PCR I. Amplifikacja DNA

Z trzustki szczurów szczepu Sprague-Dawley ekstrahowano całkowite DNA. Z całkowitego RNA wyizolowano 40 pg poli A+ mRNA (na kolumnie oligo dT-celulozowej). Próbkę (10 pg) tak wytworzonego poli A+ mRNA zastosowano jako matryce w reakcji odwrotnej transkrypcji w obecności primera 3'-końcowego syntetycznej karboksypeptydazy B (5) (fig. 1).

Po wytworzeniu jednoniciowego komplementarnego DNA (ss-cDNA) mRNA wytrącono etanolem. Próbkę ss-cDNA poddano następnie amplifikacji metodą PCR.

Do amplifikacji DNA kodującego CPB (940 bp) zastosowano syntetyczny primer odpowiadający końcowi 3' karboksypeptydazy B, i syntetyczny primer odpowiadający końcowi 5' dojrzałej karboksypeptydazy B (fig. 1).

Do amplifikacji DNA kodującego ProCPB (1230 bp) zastosowano syntetyczny primer odpowiadający końcowi 3' karboksypeptydazy B, i syntetyczny primer odpowiadający końcowi 5' prokarboksypeptydazy B (fig. 1).

Warunki amplifikacji PCR były następujące:

1. Primer 3'-końcowy 2 |μ

2. Primer 5'-końcowy 2 |_ąg

3. ss-cDNA 5 pl

183 228

4. Bufor:
dNTPs	0,2 oMi
Tris-HCl	eOmM
Kcl	20 mM
MgCl2	8i oM
5. Pklimerazα Taq I	2,5
Objętość całkowita:	100 μΐ

6. Olej mineralny (dla zapobiegania parowaniu) 50 μΐ

7. 1 cykl x [1' w temp. 92°C, 2' w temp. 40°C i 4' w temp. 72°C]

8. 35 cykli x [1' w temp. 92°C, 2' w temp. 53°C i 3' w temp. 72°C]

9. 1 cykl x [1' w temp. 92°C, 2' w temp. 53°C i 15' w temp. 72°C]

Produkty ymalifieacji PCR poddano anaiizie na 1% żelu ayajzznwym; (do analizy włączono również nńe poddnne ampiifikacii próbkś Κοιτ™^ i markery weelkości. Zaobserwowano dwa oddzielne prążki o długości około 940 bp i 1230 bp. Prążek 940 bp odpowiadał sekwencji nuklektydkwej CPB, a prążek 1230 bp odpowiadał sekwencji nueleotydkwbj ProCPB, w której zawarta jest sekwencja nukleotydową peptydu aktywującego. Po amalifikacji metodą PCR DNA wyizklkwαyo z mibszyyiyy reakcyjnej, stosując ekstrakcję chloroformem i fenolem i strącenie octanem amonowym i izkproaanklem.

II. Plazmid pCPB

Plazmid pCPB (fig. 2) wytworzono poprzez trawienie cDNA CPB BamHI i Ncol i, po oczyszczeniu na żelu, subklknkwanie fragmentu do fragmentu BrnHI i Ncol, i długości 2500 bp, plazmidu pABN, kodującego następujące elementy niezbędne dla ekspresji w bakteriach:

(i) promotor XP_L, umożliwiający ekspresję genu z komórek E. coli poprzez indukcję, tzn. poprzez podniesienie temperatury z 30°C do 42°C, co inyetewuje termowsażliwe reasetkr cI⁸⁵7;

(ii) ryaoskmalne miejsce wiązania deo (rbs);

(iii) terminator transesyacji trp (8);

(iv) gen kaorności na ampicylinę z plazmidu pBR322; i (v) początek replikacji pBR322.

III. Plazmid pCPB-C

Naturalnie występująca sekwencja amiykkwasowa eαraokseaeptydαze B zawiera siedem reszt cysteiny, z których sześć tworzy wiązania S-S, a jedna (Cys²⁹⁰) stanowi wolną resztę cysternową (1). Uważamy, że ta wolna reszta cysteinowa może tworzyć niepożądane między- lub wewnątrzkomórkowe wiązania S-S w czasie zwijania rekombiyacyjnego CPB. Cys290 nie znajduje się w miejscu katalitycznym ani w miejscu wiązania substratu karboksypeptydysy B i najprawdopodobniej nie jest niezbędna dla aktywności enzymatycznej enzymu (1.2). Zdecydowano zatem, żeby wytwarzać CPB, w którym tę resztę cysternową zastępuje się resztą serynową; taką CPB oznaczono jako CPB-C. Wytworzono fosfoIylowαyy oligonukleotyd 5-końcowy, zawierający dwa podstawienia nuelbotydów:

Thr Cys

.....ACC TGT.... oryginalna sekwencja w karaoksyabatedasie B

Thr Ser

5; ATC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3' SpeI sekwencja zmutowana

Ten ollgoyuklektyd z kolei zystosowyyo do podstawienia sekwencji yukleotedowej kodującej Cys290 sekwencja nuklektydową kodującą serynę w plazmidzie pCPB poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, jak to opisano na fig. 2 (9). Nowowetworzony plazmid oznaczono jako pCPB-C.

183 228 genezę ukierunkowaną. na miejsce, jak to opisano na fig. 2 (9). Nowowytworzony plazmid oznaczono jako pCPB-C.

IV. Plazmid pProCPB-C

Wytworzono (fig. 3) plazmid oznaczony jako pProCPB-C, zawierający sekwencję nukleotydową ProCPB-C (zawierającą mutację Cys²⁹0—>Ser) i zastosowano go do transformacji E coli 4300.

V. Plazmid pXProCPB

Wytworzono (fig. 3) plazmid oznaczony jako pAProCPB, zawierający sekwencję nukleotydową ProCPB i zastosowano go do transformacji E. coli 4300. Plazmid ten zdeponowano pod nr ATCC 69673 4 sierpnia 1994. Plazmid DNA wytworzono z plazmidów pCPB, pCPB-C, pkProCPB i pProCPB-C i poddano analizie enzymem restrykcyjnym sekwencjonowaniu nukleotydów dla weryfikacji obecności prawidłowych sekwencji.

Przykład 2

Fermentacja, warunki wzrostu i oczyszczenie ProCPB i CPB

I. Hodowle podstawowe

Hodowlę podstawową E. coli 4300, zawierającą plazmid pAProCPB, prowadzono na pożywce LB z dodatkiem ampicyliny (100 (g/ml).

II. Inokulum

Inokulum umieszczano w 100 ml pożywki LB z dodatkiem ampicyliny (100 pg/ml) w temperaturze 30°C aż do momentu, kiedy stężenie komórek osiągało O.D.₆₆₀ wynoszące 2,0. Dokonano posiewu na pożywkę produkcyjną (pożywka LB + ampicylina (100 pg/ml), hodowlę inkubowano w temperaturze 30°C, napowietrzano, mieszano i pH utrzymywano na poziomie 7,2, stosując NH₃. W czasie wzrostu do hodowli dodano 20 g glukozy. Kiedy stężenie komórek osiągnęło O.D.₆₆q wynoszące 12, temperaturę podniesiono do 42°C dla umożliwienia ekspresji ProCP.B. Po dwóch godzinach stężenie komórek osiągnęło O.D.660 wynoszące 22-29; dokonano zebrania bakterii.

III. Oczyszczenie

ProCPB, którego ekspresja dokonała się w plazmidzie pAProCPB, nagromadziła się w osadzie wewnątrzkomórkowym, który wyizolowano w następujący sposób: 40g (wilgotna masa) masy bakterii zawieszono w 450 ml bufora zawierającego 1 mM PMSF (Sigma), 50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA i traktowano lizozymem (Sigma) aż do uzyskania końcowego stężenia 50 pg/ml, w temperaturze 37°C przez 2 godziny.

Następnie dokonano sonikacji mieszaniny i dodano Triton Χ-100 (Merck) aż do uzyskania końcowego stężenia 2%, po czym mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nieoczyszczony osad wewnątrzkomórkowy granulowano poprzez odwirowanie (14000 obr./min., 30 minut, 4°C) i przepłukano wodą.

Osad wewnątrzkomórkowy, zawierający ProCPB, rozpuszczono w buforze B zawierającym 25 mM NaCl, 8 M mocznika, 10 mM DTT, 20 mM Bis-Tris, pH 7. Roztwór poddano chromatografii na kolumnie DEAE-Sepharose Fast Flow, zrównoważonej w buforze B, białko eluawano około 100 mM NaCl w buforze B i dokonano wytrącenia ProCPB, stosując (NH₄)2SO₄, przy saturacji 40% w temperaturze 0°C.

Jak później stwierdzono, enzymatycznie czynne CPB można wytwarzać jedynie poprzez wytwarzanie białka prekursorowego. Jednakże początkowo polipeptydy CPB i CPB-C wytwarzano w sposób podobny do wyżej opisanego sposobu wytwarzania Pro-CPB; ProCPB-C również wytwarzano podobnie. Stosowane plazmidy stanowiły, odpowiednio, pCPB, pCPB-C i pProCPB-C (jak to opisano w przykładzie 1). Warunki wzrostu E. coli, zawierających te plazmidy, i oczyszczenie polipeptydów, były zasadniczo takie, jak to opisano powyżej dla ProPCB, z tym wyjątkiem, że bufor stosowany do rozpuszczania osadu wewnątrzkomórkowego, zawierającego rekombinacyjną CPB lub CPB-C, zawierał 20 mM etanoloaminy, pH 9, 10 mM DTT i 8 M mocznika.

183 228

U

Należy zauważyć, że we wszystkich przypadkach polipeptydy wytworzone i oczyszczone według powyższego opisu nie wykazywały aktywności enzymatycznej. Zwijanie polipeptydów, w celu wytworzenia enzymatycznie czynnych białek, opisano w przykładzie 3.

Przykład 3

Zwijanie i aktywacja ProCPB-C

Wytworzono polipeptydy CPB i CPB-C w sposób opisany w przykładzie 2, jednakże stwierdzono, że nie wykazują one aktywności enzymatycznej. Zastosowano znane metody zwijania (jak to opisano powyżej), jednakże nie uzyskano enzymatycznie czynnego białka.

W celu rozwiązania problemu niemożności uzyskania enzymatycznie czynnego białka, rozwinięto alternatywny sposób wytwarzania, polegający na ekspresji i zwijaniu białka prekursorowego, a następnie obróbce dla usunięcia części odpowiadającej peptydowi aktywującemu, ze zwiniętego białka prekursorowego. W wyniku tego opracowano proces opisany poniżej.

ProCPB-C, wytworzony w sposób opisany w przykładzie 2, rozpuszczono, w stężeniu 10 mg/ml, w 8 M mocznika 5 mM HCl i rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml w 100 mM glicyny, 0,2 mM ZnCl₂ przy pH 9,10 i 11. Roztwory te stanowiły roztwory zwijające. Zwinięcie przeprowadzono poprzez inkubowanie powyższych roztworów zwijających przez 17 godzin w temperaturze pokojowej. Tak wytworzona ProCPB-C na tym etapie nie wykazywała aktywności enzymatycznej (por. tab. 1).

pH roztworu zawierającego zwiniętą ProCPB-C doprowadzono następnie do wartości około 8,5, stosując HCl, i traktowano trypsyną (1:200 wagowo) przez 30 minut w temperaturze 37°C w celu usunięcia peptydu aktywującego. Dla zakończenia reakcji dodano PMSF do końcowego stężenia 0,1 mM.

Zbadano aktywność enzymatyczną tak wytworzonego zwiniętego CPB-C (tabela 1) sposobem Folka (1970) (11). Jedną jednostkę aktywności (u) definiuje się jako ilość enzymu katalitycznego hydrolizę 1 (mola substratu Hippurylo-L-Arg na minutę w temperaturze 25°C, i powodującego w ten sposób zwiększenie absorbancji wynoszące 0,12 przy 254 nm i długości ścieżki 1 cm. Aktywność swoista dostępnej w handlu świńskiej karboksypeptydazy B (Sigma) wynosi 230 u/mg.

Tabela I

Aktywność swoista Pro-CPB-C (i pochodzącej z niej CPB-C) w różnych warunkach

Reakcja	Aktywność swoista (u/mg)
1. Tylko substrat	0,0
2. Zwijanie w pH 9, obróbka trypsyną, ProCPB-C nieobecna	0,0
3. Zwijanie w pH 9, obróbka trypsyną	4,3
4. Tylko zwijanie w pH 9	0,0
5. Zwijanie w pH 10, obróbka trypsyną	1,7
6. Zwijanie w pH 11, obróbka trypsyną	0,3
7. Dostępna w handlu świńska CPB	230

W tabeli I ukazano, że enzymatycznie czynną CPB-C uzyskano po zwinięciu ProCPB-C i obróbce trypsyną zwiniętej ProCPB-C, z zastosowaniem opisanych powyżej warunków wstępnych. W tabeli I ukazano ponadto, że aktywność swoista CPB-C jest wyższa, gdy pH mieszaniny zwijającej wynosi 9, niż wtedy, gdy pH mieszaniny zwijającej wynosi 10 lub 11.

Przykład 4

Ulepszone warunki zwijania

W celu ustalenia optymalnych warunków zwijania i aktywacji przeprowadzono następujące doświadczenia. Założyliśmy, że im wyższa jest aktywność swoista CPB-C wytworzonej poprzez odcięcie trypsyną części zwiniętej ProCPB-C, tym bardziej korzystne są warunki

183 228 zwijania ProCPB-C. Oprócz poniższego doświadczenia badano również próbki kontrolne: „tylko substrat” i „dostępna w handlu świńska karboksypeptydaza”. Początkowo, wyniki (jak to opisano w przykładzie 3) były lepsze, gdy zwijanie prowadzono stosując 0,05-0,1 mg/ml ProCPB-C przy pH 9,5.

I. Wpływ temperatury na zwijanie ProCPB-C

Zwijanie ProCPB-C prowadzono poprzez inkubowanie 0,05 mg/ml polipeptydu w 100 mM glicyny przy pH 9,5 przez 90 minut w temperaturze pomiędzy 10 a 37°C. Próbki zwiniętej ProCPB-C poddawano obróbce trypsyną (1:200 wagowo) i mierzono aktywność swoistą tak wytworzonej CPB-C sposobem opisanym w przykładzie 3. Najwyższą aktywność swoistą CPB-C uzyskiwano wtedy, gdy zwijanie ProCPB-C prowadzono w temperaturze pomiędzy 20-30°C

II. Wpływ utlenionego i zredukowanego glutationu na zwijanie ProCPB-C

Zwijanie ProCPB-C prowadzono poprzez inkubowanie 0,05 mg/ml polipeptydu w 100 mM bufora glicynowego o pH 9,5, 0,01 mM ZnCl₂ w temperaturze 25°C w obecności utlenionego i/lub zredukowanego glutationu (GSSG/GSH) lub kwasu askorbinowego (tabela II). Następnie inkubowane roztwory poddawano obróbce trypsyną (1:200 wagowo) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i mierzono aktywność swoistą tak wytworzonej CPB-C (sposobem opisanym w przykładzie 3) po 18 i 45 godzinach.

Tabela II

Aktywność swoista CPB-C jako funkcja obecności utleniacza/reduktora w roztworze zwijającym

Utleniacz/reduktor dodany do roztworu zwijającego	Aktywność swoista (u/mg)
18 godzin	45 godzin
0,1 mM GSSG	2,18	16,39
0,1 mM GSSG, 1 mM GSH	16,37	26,90
16,5 pM kwasu askorbinowego*	4,06	9,24
Kontrola (bez dodatku żadnej z powyższych substancji)	1,19	5,39

* Kwas askorbinowy dodany w stężeniu 2,5 mola na jeden mol grupy SH

Tabela II ukazuje, że dodanie jednocześnie GSSG i GSH powoduje wybitny wzrost aktywności swoistej CPB-C i, co za tym idzie, prawdopodobnie akuteczności zwijania ProCPB-C. Sam GSSG, jak również kwas askorbinowy, powodują również zwiększenie skuteczności zwijania ProCPB-C, aczkolwiek w mniejszym stopniu. W innej serii doświadczeń stwierdzono, że optymalne zwijanie ProCPB-C uzyskuje się poprzez dodanie do roztworu zwijającego 0,1 mM GSSG i 0,5 mM GSH.

III. Aktywacja zwiniętej ProCPB-C przez trypsynę

Stwierdzono, że najbardziej czynna CPB-C wytwarza się poprzez rozszczepienie ProCPB-C trypsyną dla usunięcia peptydu aktywującego, kiedy inkubowany roztwór zwijający poddaje się obróbce trypsyną w stosunku wagowym 1:50 przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

IV. Wpływ pH na zwijanie ProCPB-C

Wpływ pH na zwijanie ProCPB-C ustalono w serii reakcji prowadzonej w uprzednio wyznaczonych optymalnych warunkach. Zwijanie ProCPB-C prowadzono w stężeniu 0,1 mg/ml w 100 mM glicyny, 0,02 mM ZnCl₂, 0,5 mM zredukowanego glutationu (GSH), 0,1 mM utlenionego glutationu (GSSG) w temperaturze 25°C przez 24 godziny przy różnych wartościach pH (od 8,75 do 10,00). Próbki zwiniętej ProCPB-C poddawano obróbce trypsyną (w stosunku wagowym 1:50; rozpuszczone w 1 mM HCl, 10 mM CaCty), i mierzono aktywność swoistą

183 228 tak wytworzonej CPB-C sposobem opisanym w przykładzie 3. Najwyższą aktywność swoistą CPB-C osiągano przy zwijaniu ProCPB-C przy pH 9,25.

V. Wpływ ZnCl₂ na zwijanie ProCPB-C

Wpływ stężenia ZnCl₂ w roztworze zwijajcym na zwijanie ProCPB-C ustalono w serii reakcji prowadzonej w uprzednio wyznaczonych optymalnych warunkach. Najwyższą aktywność swoistą wytworzonego CPB-C osiągano przy stężeniu ZnCl₂ 2-20-krotnie przewyższającym szacunkowe stężenie CPB-C (mol/mol). Aktywność swoista CPB-C spadała do zera, kiedy zwijanie prowadzono bez dodatku ZnCR, dodając do mieszaniny zwijającej EDTA w celu chelatowania ewentualnie pozostałych w roztworze jonów dwuwartościowych.

VI. Wpływ stężenia białka na zwijanie ProCPB-C

Zwijanie ProCPB-C prowadzono przez 24 godziny w warunkach optymalnych (wyznaczonych powyżej) przy stężeniu białek ukazanym w tabeli III. Po trawieniu trypsyną dokonano pomiaru aktywności CPB-C według opisu z przykładu 3.

Tabela III

Aktywność swoista CPB-C jako funkcja stężenia białka w roztworze zwijającym

Stężenie białka (mg/ml)	Aktywność swoista (u/mg)
0,05	35,1
0,10	31,8
0,20	20,3

W tabeli III ukazano, że aktywność swoista wytwarzanego CPB-C była najwyższa przy stężeniu białka wynoszącym 0,05 mg/ml.

VII. Czas awijaniajako funkcńa aktywności swsistej CPB-C

W serii reakcji, przeprowadzonych w uprzednio wyznaczonych warunkach optymalnych, oznaczono optymalny czas zwijania ProCPB-C.

Zwijanie ProCPB-C przeprowadzono w stężeniu 0,1 mg/ml w 100 mM glicyny, pH

9.25, 0,1 mM GSSG, 0,5 mM GSH i 0,01 mM ZnC^. Próbki zwiniętej ProCPB-C potraktowoso trypsyną (w stosunku wagowym 1:50), i mierzono aktywność swoistą tak wytworzonego CPB-C, sposobem opisanym w przykładzie 3, w różnych punktach czasowych (między 0-40 godzin) od początku zwijania.

Najwyższą aktywność CPB-C uzyskano przy rozszczepianiu ProCPB-C trypsyną po 20 godzinach od początku zwijania. Prowadzenie zwijania przez ponad 20 godzin nie powodowało zwiększenia swoistej aktywności CPB-C.

Przykład 5

Zwijanie i aktywacja różnych białek CPB

Prowadzono zwijanie CPB, CPB-C, ProCPB i ProCPB-C, wytworzonych i oczyszczonych według opisu z przykładu 2, w stężeniu 0,1 mg/ml w 100 mM bufora glicynowego, pH

9.25, 0,01 mM ZnC^, 0,5 mM GSH, 0,1 mM GSSG w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, tzs. zastosowane warunki zwijania nie różniły się w zasadzie od warunków optymalnych wyznaczonych w przykładzie 4. pH każdego z roztworów zawierających zwinięte CPB, CPB-C, ProCPB i ProCPB-C doprowadzono do 8,5, stosując HC1, i roztwory zawierające ProaPC i ProCPB-C poddano obróbce trypsyną (w stosunku wagowym 1:50) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, w celu usunięcia peptydu aktywującego. Dla zakończenia reakcji dodano PMSF aż do uzyskania końcowego stężenia 0,1 M. Przeprowadzono pomiar swoistej aktywacji CPB, CPB-C, ProCPB i ProCPB-C według opisu z przykładu 3.

183 228

Tabela IV

Aktywność swoista CPB, CPB-C, ProCPB i ProCPB-C po zwijaniu i aktywacji w warunkach optymalnych

Zwijanie	Aktywność swoista (u/mg)
Kontrola1: - bez obróbki trypsyną	0,00
- bez białka	0,00
Zwijanie: - CPB	0,00
-CPB-C	0,08
- nroCPB	42,90
- nroCnB-C	20,90

Kontrolę „bez trypsyny” przeprowadzono wyłącznie dla ProCPB-C.

Tabela IV ukazuje, że enzymatycznie czynną. CPB można wytwarzać wyłącznie z komórek wykazujących ekspresję prekursora zawierającego peptyd aktywujący. Tak więc, peptyd aktywujący jest niezbędny do prawidłowego zwijania CPB.

Tabelka lV ukazuje również, że PCB o optymalnej aktywności swoistej wytwarza się poprzez zwijanie i aktywację ProCPB (której ekspresję wykazuje plazmid pAProCPB), zawierającej wolną resztę Cys²⁹⁰, nie zaś poprzez zwijanie i aktywację ProCPB-C, zawierającej mutację Cys²⁹⁰-»Ser. Tak więc, Cys29° wydaje się niezbędna dla optymalnego zwijania i/lub uzyskania najwyższej aktywności CPB.

Przykład 6

Ulepszone zwijanie ProCPB

I. Zwijanie ProCPB z nieoc^szczonegz osadu wewnątrwomórkowego. Stw.erdtwno. że optymalne warunki zwijania dla ProCPB są w zasadzie identyczne z optymalnymi warunkami zwijania dla nrzCPB-C wyznaczonymi w przykładzie 4.

Przeprowadzono zwijanie i aktywację Pro^B sposobem uproszczonym, stosując nieoczyszczony osad wewnątrzkomórkowy, omijając konieczność wstępnego oczyszczenia opisanego w części III przykładu 2.

Stwierdzono, że oieoczyszczzny osad wewnątrzkomórkowy, zawierający ProCPB (wytworzony sposobem opisanym w przykładzie 2, można rozpuścić, przy wysokim stężeniu białka (tabela V), w 100 mM glicyny, pH 9,5, i 8 M mocznika.

Zwijanie prowadzono, w optymalnych warunkach, przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. pH podniesiono do optymalnej, wyznaczonej uprzednio, wartości 9,5. Zwiniętą ProCPB rozszczepiono trypsyną (w stosunku wagowym 1:50) i dokonano pomiaru swoistej aktywności CPB według opisu z przykładu 3.

Tabela V

Aktywność swoista CPB jako funkcja stężenia białka w roztworze zwijającym zawierającym oieceyseceooy osad wewnątrzkomórkowy

Stężenie białka *mg/ml)	Aktywność swoista (u/mg)
0,1	10,5
0,2	10,9
0,5	11,9
1,0	12,1
2,0	11,4

183 228

Tabela V wykazuje, że enzymatycznie czynną CPB można wytworzyć poprzez zwijanie ProCPB pochodzącej z nieoczyszczonego osadu wewnątrzkomórkowego, i następnie trawienie trypsyną. Ponadto, poziom aktywności enzymatycznej takiej CPB jest podobny przy wszystkich wartościach stężenia białek, dla których przeprowadzono pomiar. Jest to wynik nieoczekiwany, ponieważ aktywność swoista CPB, oczyszczonej przed zwijaniem na DEAE-Sepharose (przykład 2), zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia białka w mieszaninie zwijającej. Osad wewnątrzkomórkowy, jak się wydaje, zawiera czynniki ułatwiające zwijanie się ProCPB.

II. Wytwarzanie ioczyszczynie CPB poPrzez zwijznie PaoC PB pochodzącej z nic oc szczonego osadu wzwoątrckzmórkowzgz (i) Wytwarzanie

CPB oczyszczono do niemal pełnej hetzrzgznnzści z 42 litrów E. coli 4300, zawierającej plazmid eλProCPB i wykazującej ekspresję ProOPh. Warunki fermentacji i wzrostu nie różniły się w zasadzie od opisanych w przykładzie 2. Nieoczyscccony osad wewnątrzkomórkowy przemyto wodą i rozpuszczono w stężeniu 20 mg/ml w 100 mM glicyny, pH 9,5, 8 M mocznika, po czym rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml, dodając 100 mM glicyny pH 9,5. Dodano 0,1 mM ZnCl₂, 0,5 mM GSH i 0,1 mM GSSG, i powstały roztwór zwijający inkubowano w temperaturze 25° prcec 24 godziny. pH doprowadzono następnie do wartości 8,5, dodając HCł, i zwiniętą ProCPB poddano trawieniu trypsyną (20 pg/ml) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Trypsynę uoizccyoniono 0,1 mM PMSF.

(II) Oczyszczenie

Enzymatycznie czynną CPB załadowano na kolumnę DEAE-Szpharzse Fast-Flow (Pharmacia), zrównoważoną 20 mM Tris-HCl, pH 8, przy zawartości żywicy wynoszącej 20 mg/ml. CPB eluoweoz 80 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8. Do zbiornika elucyjnzgz DEAE dodano siarczan amonowy (0,8 M), po czym kontynuowano chromatografię na kolumnie PCznyl-Szeharzsz Fast-Flow (Pharmacia), zrównoważonej 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0,8 M siarczanu amonowego. CPB zluowaoo 0,4 M siarczanu amonowego, zatężono, diafiltroweoo przeciwko 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8, i przechowywano w temperaturze -20°C.

W wyżej opisanym procesie oczyszczania obróbce poddano 42 litry E coli 4300, zawierającej plazmid p?ProCPB przy O.D.₆₆₀=36, uzyskując 1,25 grama enzymatycznie czynnej CPB o aktywności swoistej wynoszącej 637 u/mg. Całkowita wydajność procesu wynosiła około 60%

Aktywność swoista dostępnej w handlu świńskiej kerboksypeptydecy B, mierzona w takich samych warunkach doświadczalnych, wynosiła 298 u/mg.

Przykład 7

Charakterystyka enzymatycznie czynnej CPB

CPB, wytworzona według opisu z przykładów 5 i 6, wykazuje właściwości biochemiczne i enzymatyczne porównywalne ze świńską karboksyeeptydacą B.

Współczynnik ekstynkcji rekombinacyjnej CPB, obliczony na podstawie jej składu ami^kwasowego, wynosi s^lo/o280 = 19,7. Współczynnik ekstynkcji dostępnej w handlu świńskiej karbzksyeeetydacy B wynosi s^1%2₈0 = 21,4 (1).

Rzkombmacyjoa CPB wykazuje aktywność swoistą wynoszącą 637 u/mg (substrat Hipeurylz-L-Arg) i zawiera 1 mol Zn na mol enzymu, jak to oznaczono metodą absorpcji atomowej. Analiza N-końcowej sekwencji aminokwasowej wykazała Ala-Ser-Gly-His-Ser, tak jak tego oczekiwano, biorąc pod uwagę analizę sekwencji dojrzałej szczurzej karboksypeetydazy B (5).

Oznaczono pH optymalne dla aktywności rekzmbinacyjoej CPB, stosując 25 mM następujących buforów: NaOAc, pH 4-6; Bis-Tris, pH 6-7,5; Tris-HCl pH 7,5-9; i glicyna, pH 9-12. Pomiaru swoistej aktywności CPB dokonano w sposób opisany w przykładzie 3. Optymalną aktywność enzymatyczną CPB uzyskano w pH 8. Inkubacja CPB w temperaturze 55°C powodowała 50% spadek aktywności, a w temperaturze 65°C dochodziło do pełnego unieczynnienia.

183 228

Przeprowadzono analizę kinetyczną rekombinacyjnego CPB, stosując substrat Hippurylo-L-Arg (fig. 4). Stwierdzono hamowanie aktywności CPB przy stężeniu substratu powyżej 0,5 mM. Dodatkowe badania wykazały, że rekombinacyjna CPB ulegała hamowaniu przez produkt katalizy argininę, która stanowi kompetycyjny inhibitor karboksypeptydazy B. Odpowiednia krzywa Lineweayer-Burk wykazała wartość Km wynoszącą 0,38 mM. Rekombinacyjna CPB ulegała również hamowaniu przez 1,10-fen.antrolinę, silny chelator jonów dwuwartościowych, co dowodzi ważnej roli jonów Zn w enzymatycznej aktywności CPB. W obecności 1 mM 1,10-fenantroliny obserwowano 50% spadek aktywności 1 mg/ml rekombinacyjnej CPB.

Przykład 8

Konwersja proinsuliny do insuliny przez CPB

Możliwe jest dokonanie konwersji mini-proinsuliny, opisanej w EP 347781 B1, do insuliny, poprzez poddanie jej obróbce trypsyną i rekombinacyjną CPB, wytworzoną według opisu z przykładów 5 i 6.

Trypsyna powoduje swoiste odszczepienie reszty argininowej od łańcucha A. Następnie CPB powoduje swoistą hydrolizę reszty argininowej od C-końca łańcucha B.

Jako wzorzec stosować można dostępną w handlu (Boehringer-Mannheim) insulinę ludzką, jak również mini-proinsulinę rozszczepioną przez trypsynę i dostępną w handlu świńską karboksypeptydazę B, a także mini-proinsulinę rozszczepioną wyłącznie przez trypsynę.

Piśmiennictwo

1. Barrett i McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, t. 2 Academic Press, Orlando, Florida.

2. Coli i wsp., (1991), The Embo J. 10:1-9.

3. Burgos i wsp., (1991), Biochemistry 30: 4082-4089.

4. Titani i wsp., (1975), P.N.A.S. 72:1666-1670.

5. Cluuser i wsp., (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845.

6. Yamamoto i wsp., (1992), J. Biol. Chem. 267: 2575-2581.

7. Aviles i wsp., (1985), Biochem. and Bioph. Res. Comm. 130:97-103.

8. Yanofsky i wsp., (1981), Nucleic, Acid Res. 9:6647-6668.

9. Morinaga i wsp., (1984), Bio-Technology July: 636-639.

10. Bradshaw i wsp., (1969), P.N.A.S. 63: 1389-1394.

11. Folk (1970), Methods in Enzymology 19: 504-508.

12. Gardell i wsp., (1988), J. Biol. Chem. 263(33): 17828-17836.

183 228

OPIS SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Bio-Technology General Corp.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: WYTWARZANIE AKTYWNEJ

KARBOKSYPEPTYDAZY B (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Cooper & Dunham LLP (B) ULICA: 1185 Avenue of the Americas (C) MIASTO: Nowy Jork (D) STAN: Nowy Jork (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD POCZTOWY: 10036 (v) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) TYP MEDIUM: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.30 (vi) DANE NT NINIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: jak dotąd nieznany (B) DATA ZŁOŻENIA: 25 STYCZNIA 1996 (C) KLASYFIKACJA:

(vii : DANE NT RZECZNIKA PATENTOWEGO/AGENTA:

(A) NAZWISKO: White, John P.

(B) NUMER LICENCJI: 28678 (C) NUMER REFERENCYJNY: 0336/43847-A-PCT (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (212) 278-0040 (B) TELEFAKS: (212) 391-0525 (2) INFORMACJA O SEQ ID NR 1:

(i) CHARAKTERYSTYK SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI : cDNCA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE

ENZYMATYCZNIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE

183 228 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 1:

GCGCATATGC ATGCTTCCGA GGAGCACTTT GATGGC 36

2) INFORMACJA 0 SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA. SEIWENTCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 285 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..285 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

CAT

GCT

TCC

GAG

GAG

CAC

TTT

©AT

GGC

AAC

ccrs

GTG

TAC

CGT

GTC

AGT

48

His

Ala

Sei:

Glu

Glu

His

Phe

Asp

Gly

Asn

Arg

Val

Tyr

Arg

Val

Ser

1

5

10

15

GTA

CAT

GGT

©AA

GAT

CAC

GTC

AAC

TTA

ATT

CAG

©AG

CTA

GCC

AAC

ACC

96

Val

His

Gly

Glu

Asp

His

Val

Asn

Leu

Ile

Gln

Glu

Leu

Ala

Asn

Tłix

20

25

30

AAA

GAG

ATT

©AT

TTC

TGG

AAAA

CCA

GAT

TCT

GCT

ACCA

©AA

GTG

AAG

CCT

114

Lys

Glu

11(5

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

Ala

Thr

Gln

Val

Lys

Pro

35

40

45

CTC

ACT

ACA

GTT

GAC

ttt

CCAT

GTT

AAAA

GCA

GAA

GAT

GTT

GCT

GAT

GTG

110

Leu

Thr

Thr

Val

Asp

Phe

His

Val

Lys

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Asp

Val

50

55

60

GAG

AAC

TTT?

CTG

GAG

©AG

AAT

GAA

GTT

CAC

TAT

GAG

GTA

CTG

ATCA

AGC

240

Glu

Asn

Phe

Leu

Glu

Glu

Asn

Glu

Val

His

Tyr

Glu

Val

Leu

Ile

Ser

65

70

75

80

AAC

GTG

A©A

AAT

GCT

CTG

GAA

TCC

CAG

TTT

GAT

AGC

CAC

ACC

CGT

225

Asn

Val

Arg

Asn

Ala

Leu

Glu

Ser

Gln

Phe

Asp

Ser

His

Thr

Arg

85

90

95

(2) INFORMACJA O SEQ ID NO :3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 95 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:

His 1

Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn

Arg Val

Tyr Arg Val 11

Ser

5

10

Val

His

Gly Glu Asp

His

Val Asn

neu

Ile

dn

neu

Geu

A1l

Ae n

Ahr

20

25

30

183 228

Lys Glu	I1i Asp Phe erp Lys Pro Asp Ser 35 40	Ala	Thr	Gin 45	Val	Lys	Pro
Leu Thr 50	Thr Val Asp PPe His Val Lys Ala 55	Glu	Asp 60	Val	Ala	Asp	Val
Glu Asn 65	Phe Leu A1g Ulu Asn Glu Val His 70	Tyr 7)5	Glu	Val	Leu	Ile	Ser 80
Asn Val	Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe 85 90	Asp	Ser	His	Thr	Arg 95
(2) INFORMACJA 0 SEQ ID NO :4:
(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI: clDNA
(iii)	HrPOTETYCZPA: NIE
(iv)	/ANTYSENSOWNA: NIE
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:0:
GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAA					38
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO :5:
(i)	CHARAKTERYSTYK SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 927 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(iii)	HIPOTETYCZAA: NIE
(iv)	/ANTYSENSOWNA: NIE
(ix)	CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..927
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:
GCA AGT Ala Ser	GGA CAC AGC TAC ACC /AAG TAC AAC Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn 100 105	/AAC Asn	TGG Trp	GAA Glu	ACG Thr	ATT He	AGAG Glu 110
GCG TGG Ala Trp	ATT GAA CAA GTT (GCC ACT AGAT /AAT Ile Gin Gin Val Ala Thr Asp Asn 115 120	CCA Pro	GAC Asp	CTT Leu	GGC Val 125	ACT Thr	CAG Gin

183 228

AGC Ser

GTC ATT

GGA G ly

ACC AAA

TTT GAA PheGlu 130

GGA Gly

CGT TAC ATG TAT

GTC Val

CTC Leu

AAG Lys

144

Val

Ile 140

Thr

Thr

Arg Asn Met

Tyr 140

ATT

GGT

AAA

ACT

aga

CCG

AAT

AAG

CCT

GCC

ATC

TTC

ATC

CT

TGT

GGT

192

Ile

Gly

Lys

Thr

.TAg

Tro

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

Phe

Ile

Asp

Cys

Gly

140

150

155

TTC

CAT

GCA

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

TTC

TGT

CAG

TGG

TTT

GTG

240

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Tle

Ter

Pro

Ala

Phe

Cys

Gin

Τηο

Phe

Val

160

165

170

175

AGA

GAG

GCT

GTC

CGT

AAC

TAT

JUT

CA.

GAG

ATC

CAC

ATG

AAA

CAG

CTT

288

Arg

Glu

A^

Vvl

Arg

Thr

Tyr

Asn

Gin

Glu

Ile

His

Met

Lys

Gln

Leu

180

185

190

CTA

GAT

GAA

CTG

GAT

TTC

TAT

GTT

CTG

CCT

GTG

GTC

AAC

ATT

TAT

G<^<C

446

Leu

Asp

Glu

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

Val

Asn

Ile

Asp

Gly

190

200

22^50

TAT

GTC

TAC

AAC

TGG

AAT

AAG

GAC

AGA

ATG

TGG

AGA

TAAA

ACC

CGC

TCT

48 4

Tyr

Val

Tyr

TTge

Τη?

Tłu:

Lys

Asp

Arg

Met

Tig>

Acg

Lys

Thr

Arg

Ser

210

23L5

220

ACT

ATG

GCT

GGA

AGT

TCC

TGC

TTG

©GT

GTA

GAC

CCC

TAC

A©T

AAT

τττ

442

Thr

Met

Ala

Gly

Ser

Ser

Cys

Leu

Gly

Val

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

220

230

225

AAT

GCT

GGC

TGG

TGT

TAA

GTG

GGA

GCT

TCT

CGG

AGT

CCC

TGC

TCT

GHA

480

Asn

Ala

Gly

Τη?

Cys

Glu

Val

(Gly

Ala

Ser

Arg

Ser

Pro

Cys

Ser

Glu

240

245

220

255

ACT

TAC

TGT

TGA

TCA

GCC

TCA

GAG

TCT

Gid

TAA

TTAG

AC.

TUT

GCC

CTG

028

Thr

Tyr

Cys

Gly

PrO

Ala

Pxo

Glu

Ser

Glu

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

260

2 65

220

GCA

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAC

CTC

TCC

ACC

ATC

TAG

GCC

TAC

CTG

ACC

07 6

Ala

Asp

Phe

Tle

Arg

Asn

Asn

Leu

Ser

Tł^ar

Ile

Lys

Ala

TTr

Leu

Thr

270

280

228

ATC

CAC

TCA

TAC

TCA

(TWA

ATG

ATG

CTC

TAC

CCT

TAC

TTC

TTA

GAC

TAC

624

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Leu

Tys:

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Asp

Tyr

290

2 95

300

AAA

CTG

CCT

GAG

AAC

TTC

GAG

GGH

TTG

TUT

GCC

CCG

GTG

Tm

GGT

GCG

672

Lys

Leu

Pro

Glu

Asn

Tyr

Glu

Glu

Leu

Asn

Ala

Llu

Val

Lls

Gly

TALa

400

310

301

GCA

AAG

GAG

CTT

GCC

ACT

CTG

CCAT

©gc

ACC

TAG

TAC

AC

TTA

GGC

CCA

720

Ala

Lys

Glu

Leu

Ala

Thr

Leu

His

Gly

Thr

Lls

Tyr

TTe

Tts

Gly

Pro

320

325

340

344

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

©tt

TTGA

TT'

TAC

CC

TGTT

TCT

7 68

Gly

Ala

Thr

Tir:

Ile

Tya:

Pro

Ala

Ala

Gly

Gly

Ser

TAp

TAp

Tg??

Ser

340 344 350

GAG Tyr

GAT Asp

CAG Gin

GGA G ly 400

ATC ATU TATA TCC TTT ACC TGT GGA CCT TCT TGAł ACA. 816

Ile Lys

Tyr

Sejg

Phe 340

TTr: Phe

GGu Tlu

TAg 346

Asp

Tłu:

TTC

TTC

TTT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCT

GAA

TGC

GC^G

TCC

CCT

TCA

ACC

TGG

8 64

Gly

Phe

Phe

G ly

Phe

Leu

L eu

Pro

Glu

Ser

TTl

TIl

TAg

TTn

Thr

Ccs

470

347

340

183 228

GAG Glu

GAG ACC

ATG Met

CTT Leu

GCA GTC AAG

TAC ATT

GCC Ala

AAT1 Asn 395

TAT Tyr

GTC Val

CGA Arg

GAAA Glu

912

Glu 385

Thr

Ala Val 390

Lys

Tyr

He

CAT

CTA

TAT

TAG

TGA

927

His

Leu

Tyr

*

*

400 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO :0:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 309 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

(xi)

OPIS SEKWENCJI:

SEQ

ID NO:0

Ala 1

Ser

Gly

His

Sr a 5

TyA

hr>

yy a

yy>

sn a 10

sn a

rpA

llA

t:a

1S a 15

Hu

Ala

Trp

Ile

Gln> 20

Gln

Val

Ala

Thr

Asp 25

Asn

Pro

Asp

L eu

Val 30

Thr

Gln

Ser

Val

Ile 35

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu 40

Gly

Arg

Asn

Met

Tyr 40

Val

Leu

Lys

Ile

Gly 50

Lys

Thr

Arg

Pro

Asn 55

Lys

Pro

ALa

Ile

Phe 60

Ile

Asp

Cys

Gly

Phe 65

His

ALa

Arg

Glu

Τη? 77

Ile

Ser

Pro

Ala

Phe 70

Cys

Gln

Trp

Phe

Val 80

Arg

Glu

Ala

Val

Arg 85

Thr

Tyr

Assn

Gln

Glu 90

Ile

His

Met

Lys

Gln 95

Leu

Leu

Asp

Glu

Leu 100

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu 115

Pro

Val

Val

Asn

IIe 110

Asp

Gly

Tyr

Val

Tyr 115

Thr

Trp>

Thr

Lys

A3p 110

Arg

Met

Trp

Arg

Byt 112

Thr

Arg

Ser

Thr

Met 130

Ala

Gly

Ser

Ser

Cys H5

Leu

Gly

Val

Asp

Pro 110)

Asn

Arg

Asn

Phe

Asn 145

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu 110

Val

Gly

Ala

Ser

Arg 115

Ser

Pro

Cys

Ser

Glu 1^0

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro 165

Ala

Pro

Glu

Ser

Glu 110

Lyy

Glu

Thr

Lys

Ala 175

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile 180

Arg

Am

Asn

Leu

Ser 115

Thr

IlA

Lys

ALa

Tyr 110

Leu

Thr

Ile

His

Ser 195

Tyr

Ser

Gln

Met

Met 2C)0

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Sss 225

Tyr

Asp

Tyr

Lys

Leu 210

Pro

Glu

Asn

Tyr

Glu 221

Glu

Leu

Asn

Ala

Leu 2220

Val

Lys

Gly

Ala

Ala 225

Lys

Glu

Leu

Ala

Thr 230

Leu

His

Gly

Thr

Lys 235

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pyo 200

183 228

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile 245

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly 250

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp 255

Ser

Tyr

Asp

Gln

Gly 260

He

Lys

Tyr

Ser

Phe 265

Thr

Phe

Glu

Leu

Arg 270

Asp

Thr

Gly

Phe

Phe 275

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro 280

Glu

Ser

Gln

Ile

Arg 255

Gln

Thr

Cys

Glu

Glu 290

Thr

Met

Leu

Ala

Val 295

Lys

Tyr

He

Ala

Asn 300

Tyr

Val

Arg

Glu

His Leu Tyr * 305 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO :7:

(i) CIHMRAKTERYST-YKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOETTYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

CGCGGATCCT CACTA^TATA GATGTTCTCG GACATAATT (2) INFORMACJA O SEQ ID NO :8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDJGA (iii) HIPOTETYCZNA : NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG

Nde I

183 228

Primer końca 5 ProCPB

5'GCGCAIiKQIGCTKCGeG(SGQCKI(SIGS:3'

Peptyd aktywujący

Cf

Dojrzała CPB

Bxa

Ala

Ser

Clu

Clu

Bla

Zha

Aap

Cly

Aau

Ar?

7*1

Tyr

Ar?

7*1

Ser

CC

CCT

TCC

GAG

GAG

CAC

TTT

AT

GGC

AAC

CGG

CTG

TAC

CCT

rt—

ACT

ΑΛ

MO

7*1

Ala

Sly

Clu

Aap

Bla

7*1

Aan.

Lau

Xla

Glu

Lau

Ala

Aan

Thr

GTA

CAT

CGT

GAA

GAT

CAC

GTC

AAC

TTA

AST

CAG

GAG

CTA

GCC

AAC

ACC

Ly.

Clu

Ilo

Aap

Zha

Trp

Lye

Zro

Aap

Sar

Ala

Thr

Cla

v*i

Lye

Zro

AAA

GAG

ATT

GAT

TTC

TGC

AAA

CCA

GAS

TCT

CCT

ACA

CAA

CTC

AAG

CCT

xco

Leu

Thr

Thr

7*1

Aap

Zho

Bla

7*1

Lys

Ala

Cla

Aap

7*1

Al*

Aap

7*1

CTC

ACT

ACA

CTT

GAC

TTT

CAT

GTT

AAA

GCA

CAA

GAS

CTT

CCT

GAS

CTC

A79

Glu

Aaa

Zha

Lau

Glu

Clu

Aaa

Glu

7*1

Bla

Tyr

Gla

7*1

Lau

Xla

Ser

GAG

AAC

TTT

CTC

OLG

CAG

AAS

CU

CTT

OC

TAT

GAG

CTA

CTC

ATA

AGC

ABO

Aan

7*1

Ar?

Aaa

Ala

leu

Clu

Sur

Cla

Zha

Aap

Sar

Bla

Thr

Ar?

AAC

GTC

AGA

AAT

GCT

CTC

GAA

TGC

CAC

CAT

AGC

CAC

ACC

CCT

Primer

końca

5'ProCPB

I

A

10

30

Al* Sar

Sly

Ala

Sar

Tyr

Thr

Ły«

Tyr

Aau

Aau

ϊχρ

Clu

Thr

Ile

Glu

Al*

GCA AGT

GSA

CAC

AGC

TAC

ACC

AAG

AC

AAC

AAC

TGC

OkA

ACC

ACT

CAG

GCG

Trp

XI·

Gla

Gla

Vxl

Ala

Thr

Aap

Aaa

Zro

Aap

Lau

7*1

Thr

Cla

Sar

TCG

ATT

CAA

CAA

GTT

GCC

ACT

CAT

AAT

CCA

GAC

CTT

GCT

ACT

CAG

ACC

7*1

Χία

Sly

Thr

Thr

Zha

Clu

Sly

Ar?

Aaa

Mat

Ty*

7*1

leu

Ly»

Xla

CTC

ATT

CGk

ACC

ACA

TTT

OA

GCA

CGT

AAC

ATC

w

CCT

CCT

AAG

ACT

ŁLy

Lye

Thr

AX?

Sto

Aau

Ly»

Zro

Ala

XI·

Zha

Ilo

Aap

cy·

Cly

Zha

CGT

AAA

ACT

AGA

CCC

AAT

AAG

CCT

CCC

ACT

TTC

ASC

as

TCT

GCT

CTC

n

β

Bla

Ala

Ar?

Glu

Trp

XI·

Sar

Zro

Ala

Zha

cy«

Gla

Trp

Zha

7*1

Ar?

CAT

GCA

AGA

GAC

TGG

ATT

TCT

CCT

CCA

TTC

TCT

CAC

TGC

TCT

GTC

λα

M

100

Glu

Ala

Vxl

Ar?

Thr

Tyr

Aaa

Gla

Cla

Xla

Bla

Mar

Ly»

Gla

Lau

Lau

GAG

GCT

CTC

CCT

ACC

TAT

AAS

CAA

GAG

ACT

CAC

ASC

AAA

CAG

CCT

CTA

A»p

Clu

Leu

Aap

Zha

Tyr

7*1

Leu

Zro

7*1

7*1

Aaa

Xle

Aap

Cly

Tyr

GAT

aa

CTC

CAT

TTC

TAT

CTT

CTC

cct

CTC

CTC

AAC

ACT

as

GCC

TAS

7*1

Thr

139 Trp

Thr

Lya

Aap

Ar?

Mat

Trp

Ar?

Lye

Thr

130 Ar?

Ser

Thr

CTC

nc

ACC

TGC

ACT

AAG

OC

ACA

ASG

TCG

AGA

AAA

ACC

CSC

TCT

ACT

Mar

Ala

<Uy

Sar

Sar

cy«

Lau

eiy

7*1

Aap

Zro

Aon

Ar?

Asa

Zha

Aon

ATG

CCT

CGA

AGT

TCC

TGC

TTC

GGT

GTA

GAC

CCC

AAC

ACG

AAT

TCT

AAT

IM

1M

Ala

Cly

Trp

Cya

Glu

7*1

Sly

Ala

Sar

Ar?

Sar

Zro

Cya

Sar

Glu

Thr

CCT

GCC

TCC

TCT

OkA

GTG

OGA

GCT

TCT

CSC

AGT

CCC

TCC

TCT

GAA

ACT

170

IM

Tyr

er·

Cly

Zro

Ala

Zro

Cla

Sar

Glu

Lyu

Glu

Thr

Ly»

Al*

Lau

Ala

TAC

TCT

OSA

CCA

GCC

CCA

GAG

TCT

GAA

AAA

GAG

ACA

AAG

GCC

CTC

ca

A«p

Zha

ii·

Ar?

Aaa

Aaa

ter

Thr

Χία

1* ly·

Ala

Tyr

Lau

Thr

Xla

GAT

TTC

ATC

COC

AAC

AAC

CSC

TCC

ACC

ASC

AAG

OCC

TAC

CTG

ACC

ASC

SM

»9

Kle

Sar

Tyr

Sar

Cla

Ibt

Mar

Lau

*y*

Zro

Tyr

Sar

Tyr

Aap

Tyr

Ly»

ac

TCA

TAC

TCA

CAG

ATC

ASO

CSC

TAC

CCS

TAC

TCC

TAT

GAC

TAC

AAA

lun

ZXO

Glu

Aau

Tyr

Clu

eiw

Lau

Aaa

Ala

lau

7*1

Ly»

Cly

Ala

Ala

CTC

CCT

GAG

AAC

TAT

OC

GAA

TTC

AAS

GCC

CTC

GTG

AAA

CCT

GCS

ca

J-r«

βία

Uq

Ala

Thr

Lau

Bla

Oly

Thr

Lyu

TJT

Tir

MO Tyr

Sly

Zro

Cly

AAG

OC

CTT

CCC

ACT

CTC

AS

GGC

ACC

AAG

TAC

ACA

TAT

CSC

ca

ca

Ala

Thr

Thr

Χία

Tyr

Zro

Ala

Ala

Cly

Cly

Sar

Aap

Aap

Trp

Sar

Tyr

CC?

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCS

GCT

GCC

GCA

TCT

GAC

OC

TOG

CTT

TAS

IM

iro

Aap

Gin

ŁiT

Xla

ly.

Tyr

Sar

Zha

Thr

Zha

Cla

Lau

Ar?

Aap

Thr

Cly

CAT

CAC

ca

ATC

AAA

TAT

TCC

TTT

ACC

TTT

GAA

CTC

CGC

as

ATA

GCC

3M

2M

Zha

Rm

eiy

Zha

Lau

Lau

Zro

Glu

Sar

Cla

11*

Ar?

Gla

Thr

cy·

Glu

TTC

TTT

GCC

TTT

CTC

CTT

CCT

GAG

TCT

QG

ASC

CSC

OC

ACC

CTT

GAG

Glu

Thr

Mar

Lau

Ala

7*1

Lya

Tyr

Χία

Ala

Aa

Tyr

7*1

Ar?

Cla

Bił

GAG

ACA

ATG

CTT

GCA

CTC

AAG

TAC

ATT

GCC

AAS

TAT

CTC

ca

GAA

CAT

3' ra ifl OS G3 O! Gfl

L*a Tjr ·” ···

CBk nr BkC TOk

Oi ifl MC JC CCT 1SG

Bas 51

Primer końca 3

C37 5’ 'CPB

Fig. 1

183 228

ο =

Mutant

Pig. 2

183 228

ΧΙ...Ι •blllllll

Asel

ProCPB PCR cDNA 1230 oo

Mdcl

Ciał . ' . 3amKI Ndel

I Izolowany fragment ▼ 470bp

Ndel Ciał

Ndel-BamHI Izolowany fragment 2500bp	Ciał-BamHI Izolowany fragment 760bp
	Ligacja

Asel

CUi Asel

Stul-Xhol

X~

Stul-Xhol

Izolowany.? fragmentj _{Izolouany fra9ment}

Ligacja

440bp

Asel x-

N de/

Pig. 3

183 228 (jednostek/min)

Hippurylo-Arg(mM)

Pig. 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania enzymatycznie aktywnej ssaczej trzustkowej karboksypeptydazy B CPB, która posiada sekwencję aminokwasową i aktywność enzymatyczną naturalnie występującej ssaczej trzustkowej CPB, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

   (a) traktowanie rekombinowanej komórki bakteryjnej zawierajacej DNA kodujące ProCPB prowadzące do ekspresji DNA dającej ProCPB;

   (b) rozpuszczanie tak ekspresjonowanego ProCPB w pH 7-9,5;

   (c) inkubowanie rozpuszczonego ProCPB w pH około 9-9,5 pozwalające na fałdowanie ProCPB;

   (d) poddawanie sfałdowanego ProCPB trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania enzymatycznie aktywnego CPB; i (e) oczyszczanie enzymatycznie aktywnego CPB.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap rozpuszczania obejmuje:

   (a) rozbijanie ściany komórkowej komórki rekombinowanej w celu uzyskania lizatu;

   (b) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu z lizatu poprzez odwirowywanie, oraz (c) rozpuszczanie wewnątrzkomórkowego precypitatu w odpowiednim buforze.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubowanie z etapu (c) jest prowadzone w temperaturze pokojowej przez okres około 20-24 godzin.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubowanie z etapu (c) jest prowadzone w temperaturze pokojowej przez okres około 20-24 godzin w obecności utlenionego ZnCl₂ glutationu i glutationu zredukowanego.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poddawanie z etapu (d) obejmuje:

   (i) doprowadzanie pH do około 8,5; i (ii) trawienie ProCPB trypsynąw 37°C, przez około 60 minut.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną i chromatografię hydrofobową.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczanie z etapu (e) obejmuje chromatografię jonowymienną, chromatografię hydrofobową i diafiltrację.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ProCPB jest ekspresjonowany z plazmidu pAProCPB zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu 69673.

   W niniejszym zgłoszeniu cytowane publikacje oznaczane sa cyframi arabskimi, bez nawiasów. Wykaz piśmiennictwa znajduje się na końcu zgłoszenia. Publikacje te w całości włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie w celu pełniejszego opisu stanu techniki w zakresie dziedziny wynalazku.

   Naturalnie występująca karboksypeptydaza B [peptydylo-L-lizyno(-L-arginino)hydrolaza EC 3.4.17.2] jest zawierającą cynk egzopeptydazą trzustkową, swoiście usuwajacą C-końcowe Arg, Lys lub Orn z peptydów (1,2).

   Naturalnie występująca szczurza karboksypeptydaza B tworzy się z białka prekursorowego, preprokarboksypeptydazy B, zawierającej fragment N-końcowy o długości 108 amino183 228 kwasów, w którym znajduje się sekwencja sygnalna (13 aminokwasów) i peptyd aktywujący (95 aminokwasów). Preprokarboksypeptydaza B jest enzymatycznie nieczynna.

   W czasie transportu preprokarboksypeptydazy B do siateczki endoplazmatycznej peptyd sygnałowy ulega odszczepieniu; powstały w wyniku tego enzymatycznie nieczynny prekursor, prokarboksypeptydaza B, wydziela się z komórki. Następnie tworzy się enzymatycznie aktywna karboksypeptydaza B, poprzez odcięcie peptydu aktywującego przez trypsynę (7).

   Dojrzała szczurza karboksypeptydaza B zawiera 307 aminokwasów (5), i jak się wydaje, jej masa cząsteczkowa wynosi 35 kd. Zawiera ona siedem reszt cysteiny, z których sześć tworzy parami wiązania S-S.

   Karboksypeptydaza B jest szeroko stosowana w celach handlowych i naukowych, np. do wytwarzania insuliny i innych biologicznie czynnych polipeptydów, oraz do analizy sekwencji białek. Dostępna w handlu karboksypeptydaza B, izolowana z trzustek świńskich, nie bardzo droga i nie jest całkowicie wolna od innych proteaz.

   Opublikowano częściową sekwencję aminokwasową świńskiej prekursorawej prokarboksypeptydazy B, i pełną sekwencję aminokwasową bydlęcej karboksypeptydazy B (odpowiednio, 3,4). Ponadto opublikowano pełną sekwencję nukleotydową genu szczurzego i cDNA ludzkiego (odpowiednio, 5,6).

   Yamamoto i wsp.(6) opisali rekombinacyjną ekspresję enzymatycznie nieczynnej ludzkiej prokarboksypeptydazy B, pozbawionej początkowego peptydu aktywującego, utworzonego z 11 aminokwasów.

   Opisali oni również rekombinacyjną ekspresję enzymatycznie nieczynnej p-galktozydazoprokarboksypeptydazy B, białka powstałego w wyniku fuzji, w którym prokarboksypepdydaza pozbawiona jest początkowego peptydu aktywującego, utworzonego z 11 aminokwasów.

   W europejskiej publikacji nr nr 588118 A2 opisano związane z tkanką kostną karboksypepdydazopodobne białko, nazwane OSF-5. Uważa się, że OSF-5 działa być może jako cząsteczka adhezyjna lub jako czynnik wzrostu, i że można je wykorzystywać jako środek do leczenia chorób metabolicznych kości. Jednakże nie opisano rzeczywistego działania lub aktywności OSF-5, nie przedstawiono wytwarzania naturalnie występującego lub rekombinacyjnego biologicznie czynnego białka.

   Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wytwarzanie rekombinacyjnej, wysoko oczyszczonej, enzymatycznie aktywnej i niezbyt drogiej karboksypeptydazy B. Nie opisywano uprzednio wytwarzania enzymatycznie aktywnej karboksypeptydazy B, zatem niniejszy wynalazek jest nowy.

   Istota wynalazku