PL192391B1

PL192391B1 - DNA kodujący aspartokinazę III, zrekombinowany DNA, mikroorganizm oraz sposób wytwarzania L-lizyny i L-treoniny poprzez fermentację

Info

Publication number: PL192391B1
Application number: PL322611A
Authority: PL
Inventors: Yoshimi Kikuchi; Kazuo Nakanishi; Hiroyuki Kojima
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2006-10-31
Also published as: CZ295853B6; RU2204604C2; ID18631A; HUP9701652A3; KR19980032831A; US5932453A; PL322611A1; BR9705038A; JP4088982B2; BR9705038B1; EP0837134A3; PE44399A1; AU4096597A; CA2214498C; EP0837134A2; CA2214498A1; ZA979229B; HUP9701652A2; HU9701652D0; CN1110560C

Abstract

1. DNA kodujacy aspartokinaze III z bakterii nalezacej do rodzaju Escherichia i posiadajacy w regionie kodujacym mu- tacje znoszaca hamowanie lizyna przez sprzezenie zwrotne uwalniania aspartokinazy III, znamienny tym, ze wymieniona mutacja jest mutacja, w wyniku której reszta metioninowa 318 aspartokinazy III zastapiona jest reszta izoleucynowa i reszta gli- cynowa 323 zastapiona jest reszta kwasu asparaginowego, mutacja, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastapiona jest reszta fenyloalaninowa i reszta walinowa 347 zasta- piona jest reszta metioninowa, mutacja, w wyniku której reszta glicynowa 323 zastapiona jest reszta kwasu asparaginowego i reszta walinowa 347 zastapiona jest reszta metioninowa, mutacja w wyniku której reszta leucynowa 325 zastapiona jest reszta fenyloalaninowa i reszta serynowa 345 zasta- piona jest reszta leucynowa, mutacja, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 jest zastapiona reszta lizynowa, mutacja, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 346 zastapiona jest reszta lizynowa i reszta leucynowa 374 zastapiona jest reszta fenyloalaninowa, mutacja, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 zastapiona jest reszta lizynowa i reszta treoninowa 364 zastapiona jest reszta metioninowa, mutacja, w wyniku której reszta kwasu asparaginowego 202 zastapiona jest reszta glicynowa i reszta serynowa 321 zastapiona jest reszta prolinowa, lub mutacja, w wyniku której reszta argininowa 283 zastapiona jest reszta serynowa, reszta alaninowa 333 zastapiona jest reszta treoninowa, reszta serynowa 338 zastapiona jest reszta treoninowa, reszta kwasu glutaminowego 346 zastapio- na jest reszta kwasu asparaginowego i reszta asparaginowa 414 zastapiona jest reszta serynowa, przy czym DNA wykazuje duza produktywnosc lizyny. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący aspartokinazę III, zrekombinowany DNA zawierający DNA kodujący aspartokinazę III, mikroorganizm zawierający zrekombinowany DNA oraz sposób wytwarzania L-lizyny i L-treoniny poprzez fermentację. Ogólnie wynalazek dotyczy dziedziny mikrobiologii przemysłowej.

Wiadomo, że gdy L-lizynę otrzymuje się metodą fermentacji, w celu polepszenia wydajności wykorzystuje się szczepy wyizolowane z naturalnego podłoża lub szczepy otrzymane sztucznie. Znanych jest wiele sztucznie otrzymanych mutantów syntezujących L-lizynę, a wiele z nich jest szczepami aminoetylocysteinoopornymi (AEC opornymi), należącymi do rodzaju Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus lub Escherichia. Ponadto stosuje się transformanty uzyskane z zastosowaniem techniki rekombinacji DNA (US Patent No 4,278,765). Opracowano więc wiele różnorodnych technik służących zwiększaniu wydajności otrzymywania aminokwasów.

Na przykład, dla rodzaju Escherichia opracowano sposób wytwarzania L-lizyny poprzez wzmaganie ekspresji syntetazy kwasu dihydropikolinowego (dalej: DDPS), przedstawiony w Japońskim opisie wyłożeniowym, Kokai No 18,596/1981 oraz w amerykańskim opisie patentowym Nr 4,346,170 i ogłoszony w Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982).

Syntetaza kwasu dihydropikolinowego (DDPS) jest enzymem katalizującym dehydrokondensację semialdehydu kwasu asparaginowego i kwasu pirogronowego do kwasu dihydropikolinowego. Reakcja ta stanowi etap wstępny biosyntezy L-lizyny, syntezowanej w szlaku syntezy aminokwasów typu kwasu asparaginowego. Wiadomo, iż enzym ten, wraz z aspartokinazą, stanowi ważny element regulacji procesu syntezy L-lizyny w komórkach bakterii rodzaju Escherichia.

DDPS kodowana jest przez gen dapA w Escherichia coli (E.coli). Gen dapA został niedawno sklonowany i określono jego sekwencję nukleotydową [Richaud, F iwsp. J.Bacteriol. 297 (1986)].

Aspartokinaza (AK) jest enzymem katalizującym reakcję przekształcenia kwasu asparaginowego do kwasu beta-fosfoasparaginowego i stanowi główny element regulacji systemu biosyntezy aminokwasów typu kwasu asparaginowego. AK z E.coli obejmuje trzy typy białek (AKI, AKII, AKIII); dwa znich są enzymami sprzężonymi z dehydrogenazą homoserynową (ED). Jeden z wymienionych skoniugowanych enzymów AKI-HDI kodowany jest przez gen thrA, drugi - AKII-HDII, kodowany jest przez gen metLM. AKI ulega supresji pod wpływem treoniny i izoleucyny oraz hamowaniu pod wpływem treoniny, natomiast AKII ulega supresji pod wpływem metioniny.

AKIII jest enzymem jednofunkcyjnym i jest kodowany przez gen lysC. Ulega supresji oraz inhibicji zwrotnej pod wpływem L-lizyny. Stosunek aktywności wymienionych enzymów w komórkach wynosi w przybliżeniu AKI:AKII:AKIII = 5:1:4.

Gen lysC z E.coli został niedawno sklonowany i określono jego sekwencję nukleotydową (Cassan M, Parsot C, Cohen GN, Patte JC J.Biol.Chem. 262, 1052, 1986).

Sposób wytwarzania L-lizyny z wykorzystaniem E.coli zawierającej gen dapA zmutowany tak, by znieść hamowanie zwrotne przez lizynę oraz zawierający lysC zmutowany tak, by znieść hamowanie zwrotne przez lizynę przedstawiono w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042.

W przypadku wytwarzania L-treoniny metodą fermentacji, jako mikroorganizmy wykorzystuje się szczepy wyizolowane ze środowiska naturalnego lub sztucznie otrzymane mutanty. Znanych jest wiele, sztucznych mutantów wytwarzających L-treoninę, wiele z nich jest opornych na kwas alfa-aminobeta-hydroksywalerianowy i należy do rodzaju Escherichia, Serratia, Brevibacterium lub Corynebacterium. Dla rodzaju Escherichia, sposób wytwarzania L-treoniny z wykorzystaniem szczepu stransformowanego zrekombinowanym plazmidem zawierającym operon treoninowy, przedstawiono w Japońskim opisie wyłożeniowym, Kakai No 131,397/1980, 31,691/1984 i 15,696/1981 i Japońskim opisie wyłożeniowym, Kokai No 501,682/1991.

Ponadto ujawniono sposób wytwarzania L-treoniny z wykorzystaniem szczepu E.coli zawierającego gen lysC, zmutowany tak, by znieść hamowanie zwrotne przez lizynę (opis wyłożeniowy publikacji międzynarodowej WO94/11517).

Celem obecnego wynalazku było uzyskanie AKIII z bakterii z rodzaju Escherichia, w których nie następuje hamowanie zwrotne przez L-lizynę oraz dostarczenie lepszego niż dotychczasowy sposobu wytwarzania L-aminokwasu metodą fermentacji.

Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący aspartokinazę III z bakterii należących do rodzaju Escherichia i posiadający w regionie kodującym mutację znoszącą hamowanie zwrotne uwalniania aspartokinazy III przez lizynę, charakteryzujący się tym, że wymieniona mutacja jest

PL 192 391 B1 mutacją, w wyniku której reszta metioninowa 318 aspartokinazy III zastąpiona jest resztą izoleucynową i reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego, mutacją, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją, w wyniku której reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta serynowa 345 zastąpiona jest resztą leucynową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 jest zastąpiona resztą lizynową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta leucynowa 374 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta treoninowa 364 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu asparaginowego 202 zastąpiona jest resztą glicynową i reszta serynowa 321 zastąpiona jest resztą prolinową, lub mutacją, w wyniku której reszta argininowa 283 zastąpiona jest resztą serynową, reszta alaninowa 333 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta serynowa 338 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta asparaginowa414 zastąpiona jest resztą serynową, przy czym DNA wykazuje dużą produktywność lizyny.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA, który otrzymany jest w wyniku zligowania DNA kodującego aspartokinazę III według wynalazku z DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii z rodzaju Escherichia. Wynalazek dotyczy również mikroorganizmów z rodzaju Escherichia posiadających DNA kodujące aspartokinazę III według wynalazku.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny charakteryzujący się tym, że prowadzi się inkubowanie w pożywce fermentacyjnej wymienionego mikroorganizmu mającego zdolność wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny, wytwarza się i gromadzi L-lizynę lub L-treoninę w hodowli, po czym zbiera się L-aminokwas z wymienionej hodowli.

Autorzy wynalazku prowadzili wytrwałe badania w celu rozwiązania problemów omówionych w stanie techniki i osiągali kolejne sukcesy w uzyskiwaniu DNA kodującego AKIII, pochodzącą z bakterii rodzaju Escherichia, w których zniesiono hamowanie zwrotne przez L-lizynę. DNA kodujący AKIII, pochodzący z bakterii rodzaju Escherichia, w których zniesiono hamowanie zwrotne przez L-lizynę nazwano w niniejszym opracowaniu mutantem genu lysC lub mutantem genu kodującego AKIII.

DNA kodujący DDPS pochodzący z E.coli, w których zniesiono hamowanie zwrotne przez L-lizynę nazwano w obecnym opracowaniu mutantem genu dapA lub mutantem genu DDPS.

Autorzy wynalazku wytworzyli bakterie rodzaju Escherichia zawierające mutację lysC w komórkach i wykazali, iż kultury takie mogą produkować i gromadzić w podłożu hodowlanym znaczące ilości L-lizyny lub L-treoniny.

W obecnym opracowaniu DNA kodujący DDPS lub AKIII lub DNA zawierający wymienione geny i promotor nazywany jest genem DDPS lub genem AKIII. Ponadto, zmutowany enzym ze zniesionym hamowaniem zwrotnym L-lizyną, określany jest mianem zmutowanego enzymu i DNA kodujący wymieniony enzym lub DNA kodujący wymieniony enzym przyłączony do promotora nazywany jest zmutowanym genem. Ponadto zniesienie hamowania zwrotnego przez L-lizynę oznacza, iż hamowanie jest zniesione w znacznej mierze i nie jest koniecznie zniesieniem całkowitym.

Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania jest pokazany na rysunku, na którym fig.1 przedstawia sposób przygotowania pMLYSC2, fig. 2 przedstawia sposób przygotowania plazmidów serii RFSD, a fig. 3 przedstawia sposób przygotowania pLLC*Y6.

Bardziej szczegółowo wynalazek opisany jest poniżej.

<1> DNA kodujący zmutowaną aspartokinazę (AKIII) według wynalazku.

DNA kodujący zmutowaną aspartokinazę (AKIII) według wynalazku jest DNA kodującym AKIII dzikiego typu z mutacją znoszącą hamowanie zwrotne syntezy AKIII przez L-lizynę. Jako AKIII, określa się AKIII pochodzący z bakterii z rodzaju Escherichia, szczególnie AKIII pochodzący z E.coli. Mutacja znosząca hamowanie zwrotne syntezy AKIII przez L-lizynę, obejmuje (w sekwencji aminokwasowej AKIII przedstawionej przez Sek. No 1w zestawieniu sekwencji, licząc od końca N AKIII),

a) mutację, w wyniku której reszta metioninowa 318 aspartokinazy III zastąpiona jest izoleucyną i reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego,

PL 192 391 B1

b) mutacją, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową,

c) mutacją, w wyniku której reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową,

d) mutacją, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta serynowa 345 zastąpiona jest resztą leucynową,

e) mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 zastąpiona jest resztą lizynową,

f) mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta leucynowa 374 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową,

g) mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta treoninowa 364 zastąpiona jest resztą metioninową,

h) mutacją, w wyniku której reszta kwasu asparaginowego 202 zastąpiona jest resztą glicynową i reszta serynowa 321 zastąpiona jest resztą prolinową,

i) mutacją, w wyniku której reszta argininowa 283 zastąpiona jest inną resztą serynową, reszta alaninowa 333 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta serynowa 338 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta asparaginowa zastąpiona jest resztą serynową.

DNA kodujący AKIII typu dzikiego nie jest w szczególny sposób ograniczony. DNA kodujący AKIII pochodzi z bakterii z rodzaju Escherichia, na przykład E.coli. W opisie wymieniane są szczególnie: DNA kodujący sekwencję aminokwasową przedstawioną przez Sek. No 1i sekwencje obejmujące zasady numer 584-1930 Sek No 1. AKIII z E. coli kodowany jest przez gen lysC.

Wymienione wyżej sekwencje zmutowane, w których zmiana zasad powoduje podstawienie aminokwasowe, są DNA kodującym zmutowaną AKIII według wynalazku. Rodzaj kodonu odpowiadający podstawionej reszcie aminokwasowej nie jest szczególnie ograniczony, jeśli tylko koduje właściwą resztę aminokwasową. Sekwencja aminokwasowa AKIII typu dzikiego może się nieco różnić w zależności od bakterii lub szczepu. Sekwencja posiadająca substytucję, delecję lub insercję reszty aminokwasowej w pozycji nie uczestniczącej w aktywności enzymatycznej również obejmuje zmutowany gen AKIII według wynalazku.

Na przykład sekwencja zasad (Sek No 1) genu lysC typu dzikiego uzyskana w przykładzie 1 różni się w 6 miejscach od opublikowanej sekwencji lysC E.coli K-12 szczepu JC411 (Cassan M i wsp (1986) J Biol Chem 261, 1052) . Sekwencja aminokwasowa różni się natomiast w 2 z wymienionych 6 miejsc (w genie lysC szczepu JC411 reszta glicynowa 58, licząc od końca N, podstawiona jest resztą cysteinową i reszta glicynowa 401 zastąpiona jest resztą alaninową w sekwencji aminokwasowej białka kodowanego przez gen lysC, przedstawioną przez Sek. No 1). Jeżeli dowolna z wymienionych wyżej mutacji, od a) do l), zostanie wprowadzona do LysC, mającego tę samą sekwencję co lysC E.coli K-12 szczepu JC411, oczekuje się, iż uzyska się mutację znoszącą hamowanie zwrotne L-lizyną.

DNA kodujący zmutowaną AKIII, w której zniesiona jest zdolność do hamowania zwrotnego przez L-lizynę, uzyskany został jak następuje. Po pierwsze DNA zawierający gen AKIII typu dzikiego lub gen AKIII niosący inną mutację został zmutowany in vitro, a zmutowany DNA został zligowany z DNA wektora odpowiedniego do rodzaju gospodarza, tworząc zrekombinowany DNA. Zrekombinowany DNA wprowadzony został do mikroorganizmu z wytworzeniem transformanta. Następnie wybrano transformanta eksprymującego i jednocześnie utrzymującego zmutowany gen AKIII. Ponadto DNA zawierający gen AKIII typu dzikiego lub gen AKIII niosący inną mutację przyłączono do DNA wektora właściwego dla rodzaju gospodarza, w celu uzyskania zrekombinowanego DNA. Zrekombinowany DNA został następnie zmutowany in vitro, a zmutowany DNA został wprowadzony do komórki bakteryjnego gospodarza, z wytworzeniem transformanta. Wybrano następnie transformanta eksprymującego i jednocześnie utrzymującego zmutowany gen AKIII. Możliwe jest również, iż mikroorganizm wytwarzający enzym typu dzikiego został zmutowany w celu otrzymania zmutowanego szczepu wytwarzającego zmutowany enzym, i że zmutowany gen został następnie otrzymany ze zmutowanego szczepu.

Czynnikiem służącym do bezpośredniej mutagenezy DNA może być hydroksylamina lub podobny związek chemiczny. Hydroksyloamina jest chemicznym mutagenem, powodującym mutację cytozyny do tyminy, poprzez zmianę cytozyny w N⁴-hydroksycytozynę. Ponadto, gdy mutagenizowany jest sam mikroorganizm, zastosować można naświetlenie ultrafioletem lub traktowanie czynnikiem mutagennym, zwykle stosowanym do sztucznej mutagenezy, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyną (NTG).

PL 192 391 B1

Donorem DNA zawierającego gen AKIII typu dzikiego lub genu AKIII posiadającego inną mutację, może być dowolny mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia. Przykładami są mikroorganizmy opisane w: Documents, F. C. Neidhardt i wsp, Escherichia coli i Salmonella typhimurium, American Soc. for Microbiol., Wash.DC, str. 1208, tabela 1). Przykładem wymienionych mikroorganizmów jest E.coli szczep JM109 i E.coli szczep MC1061.

1) Uzyskiwanie genu AKIII typu dzikiego

Poniżej przedstawiony jest przykład otrzymywania DNA zawierającego gen AKIII typu dzikiego. Po pierwsze, na przykład szczep dziki E.coli MC1061 posiadający gen lysC inkubowano w celu uzyskania hodowli komórek. Mikroorganizm ten można hodować na zwykłym podłożu stałym. Ze względu na wydajność hodowli, korzystnie jest stosować podłoże płynne. W tym przypadku, podłożem hodowlanym jest, na przykład podłoże powstałe z dodania jednej lub więcej soli nieorganicznych, wybranych z wodorofosforanu potasu, dwuwodorofosforanu potasu, siarczanu magnezu, chlorku sodu, chlorku magnezu, chlorku żelaza, siarczanu żelaza i siarczanu manganu, do jednego lub więcej źródła węgla wybranego z ekstraktu drożdżowego, peptonu, ekstraktu mięsnego, wyciągu z kukurydzy i soi lub wyciągu mięsnego, i dodaniu następnie w odpowiednich ilościach do materiału sacharydowego, witamin i tym podobnych niezbędnych substancji. Korzystne jest doprowadzenie początkowego pH pożywki hodowlanej do wartości pH 6-8. Hodowlę przeprowadza się w temperaturze od 30 do 42°C, korzystnie w 37°C przez okres od 4 do 24 godzin z wytrząsaniem, mieszaniem lub w hodowli stacjonarnej.

Otrzymana w ten sposób hodowla zostaje żwirowana np. przy 3000 rpm przez 5' w celu uzyskania komórek E.coli szczepu MC1061. DNA chromosomalny można uzyskać z komórek tego szczepu np. metodą Saito i Mitury (Biochem Bioph Acta 72, 619, 1963) lub metodą Kirby'ego (Biochem J 64, 405, 1956).

W celu wyizolowania genu AKIII z uzyskanego chromosomalnego DNA, przygotowuje się bibliotekę chromosomalnego DNA. Najpierw chromosomalny DNA zostaje częściowo strawiony odpowiednim enzymem restrykcyjnym, do otrzymania mieszaniny fragmentów o różnej długości. Jeżeli stopień strawienia jest kontrolowany, poprzez określanie czasu trawienia lub podobnego parametru reakcji, uzyskuje się duży zakres wielkości fragmentów DNA. Na przykład chromosomalny DNA poddawany jest działaniu enzymu Sau 3AI, przy stężeniu enzymu 1-10 U/ml przy temperaturze 30°C lub wyższej, korzystnie w 37°C przez okres od 1 minuty do 2 godzin.

Następnie fragmenty chromosomalnego DNA ligowane są do DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii rodzaju Escherichia, w celu otrzymania rekombinowanego DNA. Szczegółowo, DNA wektora poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego, który tworzy takie same zakończenia fragmentów restrykcyjnych jak endonukleaza Sau 3AI, na przykład enzymu BamHI, przy stężeniu enzymu od 1do 100 U/ml, w temperaturze 30°C lub wyższej, przez okres 1 godziny lub dłużej, bardziej korzystnie przez 1 do 3 godzin, do całkowitego strawienia. Następnie wspomniana mieszanina fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA mieszana jest ze strawionym DNA wektora. Mieszanina poddawana jest reakcji ligacji, korzystnie z ligazą faga T4 przy stężeniu enzymu od 1 do 1000 U/ml w temperaturze od 4 do 16°C przez okres 1 godziny lub dłużej, korzystnie przez okres od 6 do 24 godzin, w celu otrzymania zrekombinowanego DNA.

Mikroorganizm z rodzaju Escherichia, na przykład E.coli szczepu K-12, korzystnie szczep całkowicie pozbawiony AKI, AKII i AKIII, na przykład E.coli szczepu GT3 (który to mikroorganizm można otrzymać z E.coli Genetic Stock Center, Connecticut, USA) transformuje się w celu przygotowania biblioteki DNA. Transformację można przeprowadzić metodą Morrisona (Methods Enzymology 68, 326, 1979) lub metodą wapniową, zwiększającą przenikalność ściany komórkowej dla DNA poprzez traktowanie komórek bakteryjnego biorcy roztworem CaCl2 (Mandel M, HigaA JMol Biol 53, 159, 1970).

Szczep posiadający zrekombinowany DNA genu AKIII uzyskano ze szczepu posiadającego zwiększoną aktywność AKIII lub ze szczepu, w którym auksotrofia, wynikająca z delecji genu AKIII została przełamana przez wprowadzony chromosomalny DNA. Na przykład, gdy mutant wykazujący całkowity brak AK wykorzystywany jest jako komórka gospodarza, szczep zrekombinowany może wzrastać na podłożu pozbawionym L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny i kwasu diaminopimelinowego lub w hodowli wolnej od homoseryny i kwasu dipimelinowego, a zrekombinowany DNA można odzyskać ztego szczepu, co pozwala uzyskać fragment DNA zawierający gen AKIII. Z podejrzanego szczepu przygotowuje się ekstrakt komórkowy, a z niego otrzymuje się nieoczyszczony roztwór enzymu. Następnie można określić aktywność AKIII. Aktywność enzymatyczną AKIII można oznaczyć metodą opracowaną przez ER Stadtman'a i wsp (Stadtman J, Cohen G, LeBras GN, Robichon-Szulmajster H J Biol Chem 236, 2033, 1961).

PL 192 391 B1

Zrekombinowany DNA uzyskany poprzez wstawienie DNA zawierającego gen AKIII do DNA wektora można wyizolować np. metodą opisaną przez P.Guerry'ego i wsp. (J Bacteriol 116, 1064, 1973) lub metodą DB Clewella (J Bacteriol 110, 667, 1972).

Gen AKIII typu dzikiego otrzymuje się również przez przygotowanie chromosomalnego DNA ze szczepu posiadającego gen AKIII w chromosomalnym DNA metodą Saito i Mitury i amplifikowanie genu AKIII techniką PCR (PCR White Tj i wsp Trends Genet 5, 185, 1989). Starter DNA wykorzystywany do amplifikacji jest komplementarny do obu 3' końców dwuniciowego DNA zawierającego cały region genu AKIII lub jego część. Gdy amplifikowana jest jedynie część genu AKII, konieczne jest wyszukiwanie fragmentu DNA zawierającego cały region genu z biblioteki DNA chromosomalnego, z wykorzystaniem fragmentu DNA posiadającego część regionu genu AKIII jako starterem. Gdy powielany jest cały region genu AKIII, mieszanina reakcyjna PCR, zawierająca fragment DNA obejmujący zamplifikowany gen AKIII poddawana jest elektroforezie w żelu agarozowym, i pożądany fragment DNA ekstrahowany jest z żelu, tak że odzyskiwany jest fragment DNA zawierający gen AKIII.

Starter DNA można zaprojektować właściwie na podstawie, na przykład, znanej sekwencji DNA E.coli (Cassan M, Parsot C, Cohen GN, Patte JCJ Biol Chem 261, 1052 1986). Starter zdolny do amplifikacji regionu złożonego z 1347 zasad sekwencji kodującej genu lysC jest starterem użytecznym. Na przykład dwa typy starterów, których sekwencję obrazuje Sek No 2 i 3 są użyteczne. Starter DNA można zsyntezować metodami standardowymi, na przykład metodą fosfoamidynową (Tetrahedron Lett 22, 1859, 1981) z wykorzystaniem dostępnych handlowo syntetyzerów DNA (na przykład syntetyzer 380B firmy Applied Biosystems). Następnie reakcję PCR można prowadzić w sposób wskazany przez producenta termocyklera (DNA Thermal Cycler PJ 2000, Takara Shuzo Co, Ltd) 12i polimerazy Taq (Takara Shuzo Co, Ltd).

Gen AKIII zamplifikowany techniką PCR jest ligowany z DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należącej do rodzaju Escherichia i wprowadzony następnie do komórek bakterii z rodzaju Escherichia, gdzie można łatwo dokonać następnie wprowadzenia mutacji do genu AKIII. DNA wektora, sposób transformacji i wykrywania obecności genu AKIII są takie same, jak podano wyżej.

2) Wprowadzanie mutacji do genu AKIII

Wymieniony wyżej gen AKIII poddawany jest mutagenezie, wprowadzającej substytucje, insercje lub delecje reszt aminokwasowych techniką PCR (Higuchi R 61, w PCR Technology (Erlich HA wyd. Stockton Press 1989), techniką specyficznego względem miejsca wprowadzania mutacji (Kramer W, Frits HJ Methods Enzymol 154, 350, 1987); Kunkel TA i wsp Methods Enzymol 154, 367, 1987) lub podobną metodą. Metody te powodują wprowadzenie pożądanych mutacji w pożądane miejsce.

Określone mutacje lub mutacje przypadkowe można wprowadzić w pożądane miejsce metodą chemicznej syntezy pożądanego genu.

Ponadto istnieje sposób w którym gen AKIII w chromosomie lub w plazmidzie jest bezpośrednio traktowany hydroksylaminą (Hashimoto T, Seekiguchi M J Bacteriol 159, 1039 1984). Możliwy jest ponadto sposób w którym bakteria z rodzaju Escherichia zawierająca gen AKIII naświetlana jest światłem ultrafioletowym lub sposób z użyciem takiego czynnika chemicznego jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna lub kwas azotowy. Sposoby te wprowadzają mutację przypadkowe.

Sposób selekcjonowania zmutowanego genu AKIII przedstawiony jest poniżej. Najpierw zrekombinowany DNA zawierający zmutowany gen AKIII wprowadzany jest do całkowicie pozbawionego AK szczepu, np. E.coli GT3. Następnie transformant hodowany jest w podłożu minimalnym, na przykład M9, zawierającym znaczącą ilość L-lizyny. Ponieważ AK jest hamowany przez L-lizynę w szczepie posiadającym zrekombinowany DNA obejmujący gen AKIII typu dzikiego, L-treonina, L-izoleucyna, L-metionina i kwas diaminopimelinowy (DAP) nie mogą być syntetyzowane, co kontroluje wzrost hodowli. W międzyczasie, szczep posiadający zrekombinowany DNA obejmujący zmutowany gen AKIII, w którym hamowanie zwrotne przy użyciu L-lizyny zostało zniesione, może rosnąć na pożywce minimalnej zawierającej znaczące ilości L-lizyny. Wykorzystując to zjawisko można wyselekcjonować szczep odporny na L-lizynę lub S-2-aminoetylocysteinę (AEC), analog L-lizyny, a więc szczep posiadający zrekombinowany DNA obejmujący gen AKIII posiadający zniesioną cechę hamowania przez L-lizynę.

Tak otrzymany zrekombinowany gen w postaci zrekombinowanego DNA wprowadzonego do użytecznego mikroorganizmu (gospodarza) i ulegający ekspresji powoduje, że mikroorganizm zawierający wspomniany gen AKIII nie jest hamowany przez L-lizynę.

Ponadto, użyta być może substancja otrzymana przez wycięcie fragmentu zmutowanego genu AKIII ze zrekombinowanego DNA i wprowadzenie do tego samego lub innego wektora. Korzystnym

PL 192 391 B1 wektorem według wynalazku jest wektor plazmidowy. Przykłady takiego wektora obejmują pUC19, pUC18, pBR32, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW11, pMW118, pMW219 i pMW218. Można wykorzystać również DNA wektora fagowego lub wektor transpozonowy.

W celu wydajnej ekspresji zmutowanego genu AKIII, z regionem DNA powyżej zmutowanego genu AKIII zligować można promotor, aktywny w mikroorganizmach taki, jak: lac, trp i PL. Można również poddać amplifikacji promotor obecny w genie AKIII.

Jak wspomniano wyżej substancja otrzymana przez wstawienie genu do DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji może być wprowadzona do gospodarza i utrzymywana w nim jako pozachromosomalny DNA, na przykład plazmid. Alternatywnie, zmutowany gen może być wprowadzony do chromosomu gospodarza poprzez transdukcję, wraz z transpozonem (Berg DE, Berg CM Bio/Technology 1, 417 1983), wraz z fagiem Mu (Japoński opis wyłożeniowy, Kokai No 109,985/1990) lub poprzez komplementarną rekombinację (Experiments in Molecular Genetics, CSH 1972).

3) Wytwarzanie L-lizyny i L-treoniny według wynalazku

L-aminokwas można wytwarzać z dobrą wydajnością poprzez inkubowanie bakterii z rodzaju Escherichia, posiadającej wprowadzony zmutowany gen AKII, w odpowiedniej pożywce hodowlanej, w której wspomniana bakteria produkuje i gromadzi L-aminokwas w kulturze, z której aminokwas może być następnie zbierany.

Dostępna jest również bakteria z rodzaju Escherichia zawierająca AK, charakteryzujący się zniesieniem hamowania zwrotnego przez L-lizynę, obejmuje bakterię z rodzaju Escherichia stransformowaną DNA kodującym AKIII posiadającym mutację, znoszącą hamowanie zwrotne przez L-lizynę, który to DNA wprowadzony jest do chromosomalnego DNA, oraz bakteria z rodzaju Escherichia stransformowaną zrekombinowanym DNA, poprzez wprowadzenie do komórek zrekombinowanego DNA utworzonego poprzez ligację wspomnianego wyżej DNA z DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii z rodzaju Escherichia. Ponadto, zmutowana bakteria z rodzaju Escherichia, umożliwiająca produkcję zmutowanej AKIII, uzyskana poprzez mutagenezę komórek bakterii z rodzaju Escherichia.

W przypadku bakterii z rodzaju Escherichia, które są wykorzystane jako gospodarz do transformacji, dowolna bakteria może zostać wykorzystana jako gospodarz gdy promotor zmutowanego genu AKIII lub inny promotor służący do ekspresji tego genu jest aktywny w komórkach danej bakterii. Alternatywnie, jeżeli zmutowany gen AKIII wprowadzony jest w plazmidzie jako pozachromosomalny DNA, dowolna bakteria może zostać wykorzystana, jeżeli region początku replikacji (ori) wektorowego DNA wykorzystanego do wprowadzenia DNA genu do komórki, jest w niej aktywny i powoduje replikację wspomnianego plazmidu.

Podłoże hodowlane używane do hodowli mikroorganizmu posiadającego zmutowany gen według wynalazku jest powszechnie stosowanym podłożem zawierającym źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i inne substancje organiczne, w zależności od potrzeby.

Przykładami źródła węgla są sacharydy, takie jak glukoza, laktoza, galaktoza, fruktoza i hydrolizat skrobiowy; alkohole takie jak glicerol i sorbitol; i kwasy organiczne takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy i kwas bursztynowy.

Przykłady źródła węgla obejmują nieorganiczne sole amonowe, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu i fosforan amonu; hydrolizat sojowy; NH3 gazowy i rozpuszczony w wodzie.

Jako źródła organicznych substancji dodatkowych, korzystne jest dodanie użytecznych ilości substancji uzupełniających, takich jak witamina B1lub L-izoleucyna, lub ekstrakt drożdżowy. Ponadto: fosforan potasu, siarczan magnezu, jony żelaza i manganu dodawane są w niewielkich ilościach, w zależności od potrzeby.

Hodowla prowadzona jest z dostępem powietrza przez czas od 16 do 72 godzin. Temperatura inkubacji wynosi od 25 do 45°C. pH ustalone jest pomiędzy 5 i 8 w czasie hodowli. W celu ustalenia pH wykorzystać można substancje organiczne, kwasowe lub zasadowe, a ponadto gazowy amoniak.

L-aminokwas można zbierać z hodowli poprzez łączenie do żywicy jonowymiennej, poprzez precypitację lub dowolną znaną metodą.

Wynalazek zilustrowany jest następującymi przykładami.

Przykład 1

Przygotowanie zmutowanego genu AKIII (1) <1> Klonowanie genu AKIII typu dzikiego

Sekwencja zasad genu AKIII (lysC) z E.coli została opublikowana (Cassan M, Parsot C, Cohen GN, Patte JC J Biol Chem 261, 1052, 1986). Wiadomo, że otwarta ramka odczytu (ORF) składa się

PL 192 391 B1 z 1347 pz, kodujących białko składające się z 449 reszt aminokwasowych. Gen ten posiada operator, ijego ekspresja podlega hamowaniu przez L-lizynę. Tak więc, w celu usunięcia regionu operatorowego, zamplifikowano sekwencję SD wraz z regionem zawierającym ORF techniką PCR, i następnie sklonowano.

Całkowity, genomowy DNA E.coli szczep K-12 MC1061 przygotowano metodą Saito i Mitury (Biochem Bioph Acta 72, 619, 1963), i przygotowano dwa rodzaje starterów, o sekwencji podanej wSek No 2 i 3. PCR prowadzono metodą przedstawioną prze HA Erlicha i wsp (PCR Technology, Stockton Press 1989) z wykorzystaniem wspomnianych starterów służących do amplifikacji genu AKIII. Powstały DNA strawiono enzymami Bam HI i Ase I, odtrawiono lepkie końce i wklonowano do miejsca Sma I niskokopiowego wektora pMW119, tworząc konstrukt pMLYSC2. Miejsce Sma I położone jest w kierunku 3' od promotora lacZ, obecnego w DNA wektora. Gdy zrekombinowany DNA uzyskany poprzez wstawienie fragmentu DNA do miejsca Sma I pMW119 wprowadzony jest do komórki E.coli, wstawiony fragment DNA ulega transkrypcji z promotora lacZ (fig.1).

<2> Klonowanie zmutowanego genu AKIII

Plazmidy posiadające zmutowany gen AKIII (pLYSC1*80, pLYSC1*117 i pLYSC1*126, jak przedstawiono to w opisach wyłożeniowych publikacji międzynarodowych WO94/11517 i WO95/16042) strawiono enzymami Eco RI i Hind III, w celu wycięcia fragmentu DNA zawierającego zmutowany gen AKIII. Fragmenty te wstawiono w miejsce Eco RI -Hind III plazmidu pMW119, tworząc plazmidy oznaczone odpowiednio jako: pMLYSC2*20, pMLYSC2*117 i pMLYSC2*126.

Plazmid pLYSC*80 można otrzymać z plazmidu pLLC*8 według ujawnienia zamieszczonego w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO94/11517. Szczep uzyskany przez wprowadzenie pLLC*80 do E.coli szczepu HB101, oznaczono jako AJ12750. Został on zdeponowany w National Institute of Bioscience and Human Technology (Agency of Industrial Science and Technology, No 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod numerem referencyjnym FERM P-13136, 1 września 1992. Szczep ten przekazany został do międzynarodowego centrum depozytów biotechnologicznych, zgodnie z układem budapeszteńskim z 4 listopada 1993 i otrzymał numer referencyjny FERM BP-4462. Plazmidy pLYSC2*117 i pLYSC2*126 nie zostały dotychczas zdeponowane. Jednakże mutacje punktowe obecne w tych plazmidach zostały przedstawione w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO94/11517 i mogą one zostać w prosty sposób przygotowane z plazmidu pLYSC1*80.

<3> Badania nad warunkami selekcji nowego, zmutowanego genu AKIII

Transformant uzyskany przez wprowadzenie plazmidu pMLYSC1 do całkowicie pozbawionego AK szczepu E.coli GT3 (thrA1016b, metLM1005, lysC 1004) oznaczono jako GT3/pMLYSC2. Podobnie uzyskano GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 i GT3/pMLYSC2*126. Szczep GT3/pMLYSC2 zawierał plazmid obejmujący gen lysC typu dzikiego, i AKIII kodowana przez gen lysC z plazmidu był jedynym źródłem AK w komórce. Ponieważ AKIII typu dzikiego była jedyną AK, znaczące ilości L-lizyny w podłożu minimalnym hamowane były obecnością L-lizyny, L-treoniny, L-izoleucyny, L-metioniny i kwasu diaminopimelinowego (DAP), co hamowało wzrost hodowli. Zgodnie z oczekiwaniami, jedynie szczep zawierający plazmid ze zmutowanym genem lysC, który posiada zniesioną zdolność do hamowania zwrotnego za pomocą L-lizyny mógł wzrastać na pożywce minimalnej zawierającej znaczące ilości L-lizyny, w ten sposób wybrany został szczep posiadający oporność na L-lizynę, zawierający plazmid ze zmutowanym genem lysC. Szczep GT3/pMLYS2, szczep GT3/pMLYSC2*80, szczep GT3/pMLYSC2*117 i szczep GT3/pMLYSC2*126 hodowane były w minimalnym agarze stałym, zawierającym L-lizynę w różnych stężeniach dla zbadania stężenia L-lizyny hamującej wzrost i określenia warunków selekcji szczepów zawierających plazmid. Wzrost transformantów na płytkach z minimalnym agarem zawierających L-lizynę w różnych stężeniach przedstawiony został w tabeli 1. W tabeli 1 znak + wskazuje, że transformant wzrasta na agarze, znak +/- oznacza słaby wzrost, znak - wskazuje na brak wzrostu.

Tabel a 1

	0	0,2	0,4	0,6	0,8	(M)
GT#/pMLYSC2	+/-	-	-	-	-
GT3/pMLYSC2*80	+	+	+/-	-	-
GT3/pMLYSC2*117	+	+/-	-	-	-
GT3/pMLYSC2*126	+	+/-	-	-	-

PL 192 391 B1

Wzrost szczepu GT3/pMLYSC2 posiadającego gen lysC typu dzikiego był całkowicie zahamowany przy dodaniu 0.2 M lizyny do agaru. Ponadto wzrost szczepu GT3/pMLYSC2*80, szczepu GT3/pMLYSC2*117 i szczepu GT3/pMLYSC2*126 posiadających zmutowany gen lysC był również prawie całkowicie zahamowany pod wpływem 0.4 M L-lizyny w agarze. Tak więc, przyjęto że zmutowany gen lysC może być uzyskany poprzez selekcję w obecności 0.4 M L-lizyny. Wykazano, iż hamowanie wzrostu można wyeliminować poprzez jednoczesne dodane homoseryny i kwasu diaminopimelinowego.

W teście wprowadzania mutacji, używano minimalnego agaru M9 zawierającego 0.4 M L-lizynę, w celu wyselekcjonowania szczepu posiadającego zmutowany gen lysC. Podłoże to określono mianem podłoża selekcyjnego w przykładzie 1.

<4> Mutageneza genu AKIII i przygotowanie zmutowanego genu AKIII

Do wprowadzenia mutacji do plazmidu pMLYSC1 zastosowano dwie metody: mutagenezę in vitro w której plazmid jest bezpośrednio traktowany hydroksylaminą i metodę mutagenezy PCR do wprowadzenia różnych mutacji, innych niż mutacja cytozyny w tyminę z wykorzystaniem hydroksylaminy.

Dwa mikrogramy pMLYSC2 traktowano 0.4 M hydroksylaminą [roztwór zawierający 100 mikrolitrów mieszaniny 0.1 M KH2PO4 i 1 mM EDTA (pH 6.0) i mieszaninę 1 M hydroksylaminy i 1mM EDTA (pH 6.0) i 2 mikrogramy DNA doprowadzono do końcowej objętości 200 mikrolitrów przez dodanie wody] w temperaturze 75°C przez od 1do 4 godziny. Traktowany w ten sposób DNA oczyszczano na glass powder i następnie wprowadzano do komórek E.coli szczep GT3 całkowicie pozbawionych aktywności AK. Powstający transformant był rozprowadzany na podłożu kompletnym (zawierającym 1% pożywkę L, 0.5% ekstrakt drożdżowy, 0.5% NaCl, 50 mg/L ampicyliny i 1.5% agar) i hodowany aż do utworzenia kolonii. Kolonie przenoszono w formie replik na podłoże selekcyjne, i szczepy zdolne do wzrostu na podłożu selekcyjnym wybierano jako szczepy podejrzane.

Technikę przypadkowej mutagenezy poprzez PCR wykonywano sposobem C.Cadwella i wsp (PCR Methods Appl 2, 28, 1982). A więc, fragment genu lysC amplifikowano wspomnianą metodą z wykorzystaniem pMLYSC2 i uniwersalnego startera M13. Fragment trawiono Eco RI i Hind III a następnie wstawiano w miejsce Eco RI - Hind III plazmidu pMW119 i wprowadzano do całkowicie pozbawionego AK szczepu E.coli GT3. Powstający transformant był rozprowadzany na podłożu kompletnym (zawierającym 1% pożywkę L, 0.5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl, 50 mg/L ampicyliny i1.5% agar) i hodowany aż do utworzenia kolonii. Kolonie przenoszono w formie replik na podłoże selekcyjne, i szczepy zdolne do wzrostu na podłożu selekcyjnym wybierano jako szczepy podejrzane.

Plazmid odzyskiwano z całkowitej liczby 47 podejrzanych szczepów uzyskanych jak opisano wyżej, tzn. 44 szczepów uzyskanych metodą mutagenezy z użyciem hydroksylaminy i 3 szczepów otrzymanych techniką mutagenezy PCR. Oznaczano sekwencję zmutowanego genu lysC i identyfikowano mutacje punktowe. Określanie sekwencji zasad przeprowadzano metodą standardową, wykorzystując automatyczny sekwenator ABI 373A (dostarczony przez firmę ABI). W rezultacie oznaczenia uzyskano szczepy zmutowane AKIII posiadające 4 rodzaje (nr 1, 6, 14 i 21) mutacji punktowych, powstałych w wyniku mutagenezy hydroksylaminowej i mutanty genu AKIII posiadające 3 rodzaje (No 28, 29 i 30) mutacji punktowych uzyskanych przypadkową mutagenezę z użyciem techniki PCR (tabela 2).

Tabela 2

Mutant LysC	Technika mutagenezy	Mutacja punktowa (aminokwas)
1	2	3
Nr 1	hydroksylamina	ACG-->ATG (344Thr-->Met)
Nr 6	hydroksylamina	GAG-->AAG (250Glu-->Lys)
Nr 14	hydroksylamina	GAA-->AAA (346Glu-->Lys) CTT-->TTT (347Leu-->Phe)
Nr 21	hydroksylamina	GAG-->AAG (250Glu-->Lys) ACG-->ATG (346Thr-->Met)
Nr 28	PCR	GAT-->GGT (202Asp-->Gly) TCT-->CCT (321Ser-->Pro)

PL 192 391 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
Nr 29	PCR	CGC-->AGC (283Arg-->Ser) GCG-->ACG (333Ala-->Thr) TCG-->ACG (338Ser-->Thr) GAA-->GAT (346Glu-->Asp) AAC-->AGC (414Asn-->Ser)
Nr 30	PCR	ATG-->AAG (318Met-->Lys) TCT-->CCT (321Ser-->Pro) GTT-->TTT (328Val-->Phe) GTG-->GGG (349Val-->Gly) GAG-->GTG (405Glu-->Val)

Przedstawione siedem plazmidów (pMLYSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29 i pMLYSC2*Y30) wprowadzono do całkowicie pozbawionego AK szczepu GT3 i przygotowano z uzyskanych transformantów ekstrakt komórkowy. W ekstrakcie oznaczano aktywność AKIII. Otrzymywanie ekstraktu komórkowego i oznaczanie aktywności AKI prowadzono metodą podaną przez Stardtmana i wsp (Stardtman RE, Cohen GN, LeBras G i Robichon-Szulmajster H J Biol Chem 236, 2033, 1961). Następnie, podczas pomiaru aktywności enzymatycznej AKIII do mieszaniny reakcyjnej dodawano L-lizynę w różnych stężeniach, dla pomiaru stopnia hamowania zwrotnego. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. Stopień znoszenia hamowania zwrotnego opisuje stosunek aktywności resztkowej AK w obecności 0,4 M L-lizyny do aktywności AK w nieobecności L-lizyny.

Tabel a 3

Szczep	Stopień zniesienia hamowaniazwrotnego (%)
GT3/pMLYSC2*80	75
GT3/pMLYSC2*117	76
GT3/pMLYSC2*Y1	56
GT3/pMLYSC2*Y6	127
GT3/pMLYSC2*Y14	87
GT3/pMLYSC2*Y21	117
GT3/pMLYSC2*Y28	114
GT3/pMLYSC2*Y29	99
GT3/pMLYSC2*Y30	116

Jak wynika jasno z przedstawionych wyżej wyników, zmutowany AKIII, posiadający wyższy stopień zniesienia hamowania zwrotnego niż typowy mutant AKIII (mutant AKIII kodowany przez plazmid pMLYSC2*80 i pMLYSC2*117) może być łatwo wyselekcjonowany jedną z metod podanych wyżej. Na aktywność specyficzną całkowitego białka wpływają zwykle warunki wzrostu komórek lub sposób przygotowania próbki. Aktywność specyficzna jest więc równa aktywności enzymu typu dzikiego i enzymu zmutowanego konwencjonalnie i prawie nie ulega zmniejszeniu po wprowadzeniu mutacji obserwowanych. Zgodnie z tym oczekuje się że aktywność centrum aktywnego AKIII i miejsca kontrolnego dla L-lizyny są niezależne, jedna od drugiej.

P r zyk ł a d 2

Przygotowanie zmutowanego genu AKIII (2)

Gen lysC w którym Ser 358 została podstawiona Leu przygotowano poprzez wprowadzenie mutacji w pożądane miejsce techniką LA PCR (in vitro Mutagenesis Kit, firmy Takara Shuzo Co). Jednocześnie plazmid pLYSC1 ujawniony w opisach wyłożeniowych publikacji międzynarodowych WO94/11517 i WO95/16042 użyty został jako matryca, a jako starter wprowadzający mutację użyto fragmentu DNA opisanego w tabeli sekwencji pod numerem 4. Oba końce amplikonu strawiono enzymem Eco RI i Hind III i zligowano z fragmentem uzyskanym z przecięcia plazmidu pUC19 enzymaPL 192 391 B1 mi Eco Rl i Hind III, otrzymując tym samym plazmid pLYSC358L. Zmutowany gen AKIII w którym Ser 354 zmutowana została do Ile lub Val przygotowany został w analogiczny do podanego wyżej sposobu, z tym że jako startera użyto fragmentów DNA przedstawionych w tabeli sekwencji pod numerami 5 i 6. Gen został następnie zligowany z fragmentem uzyskanym z przecięcia plazmidu pUC19Enzymem Eco RI i Hind III. W ten sposób utworzono plazmidy pLYSC354I i pLYSC354V.

Fragmenty zawierające gen lysC uzyskano poprzez trawienie pLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*150 i pLYSC1*158 enzymami Eco RI i Hind III i wstawiono do miejsca Eco RI Hind III plazmidu pUC19, a powstające fragmenty oznaczono odpowiednio: pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2*126, pLYSC2*150 i pLYSC2*158. Struktura pLYSC1 oraz miejsca mutacji punktowych plazmidów pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2*126, pLYSC2*150 i pLYSC2*158 zostały przedstawione w opisach wyłożeniowych publikacji międzynarodowych WO94/11517 i WO95/16042. Plazmidy te można więc przygotować z plazmidu pLYSC1*80.

Następnie mutant genu lysC posiadający dwa typy mutacji przygotowany został z wykorzystaniem miejsca Ssp I, obecnego w pobliżu centrum mutacji punktowych tak uzyskanego punktowego mutanta lysC oraz miejsca Ssp I położonego w kierunku 3' od lysC wprowadzonego do pUC19. Tak więc plazmid pU2547M przygotowany został poprzez zligowanie fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC z plazmidu pLYSC2*48 z fragmentem Ssp I zawierającym fragment 3' genu lysC z plazmidu pLYSC2*158; pU234 przygotowano poprzez ligację fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*126 z fragmentem zawierającym region 3' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*158; pU254L przygotowano poprzez ligację fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*48 z fragmentem zawierającym region 3' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*117; pU2358L przygotowano poprzez ligację fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*126 z fragmentem zawierającym region 3' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC358L; pU2345V przygotowano poprzez ligację fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*126 z fragmentem zawierającym region 3' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC345V; i plazmid pU2345I przygotowano poprzez ligację fragmentu Ssp I zawierającego region 5' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC2*126 z fragmentem zawierającym region 3' genu lysC pochodzący z plazmidu pLYSC345I; Ponieważ mutacje punktowe pLYSC2*150 i pLYSC2*126 położone są bardziej w kierunku 5' niż miejsce cięcia enzymu Ssp I mutant podwójny lysC posiadający wymienione dwie mutacje punktowe przygotowany został jak następuje. Najpierw fragment DNA zawierający dwie mutacje został powielony z wykorzystaniem pLYSC2*126 jako matrycy i oligonukleotydu przedstawionego w tabeli sekwencji pod numerem 7 i wymienionego zestawu do mutagenezy in vitro. Następnie oba końce powstałego fragmentu DNA strawiono enzymami Eco RI i Hind III i zligowano z fragmentem powstałym w wyniku cięcia plazmidu pUC19 enzymami Eco RI i Hind III. Otrzymany produkt nazwano pU1823D.

Stopień zniesienia hamowania zwrotnego przez Lys tak otrzymanego enzymu AKIII z mutanta podwójnego genu lysC oznaczano tak, jak w przykładzie 1. Okazało się, że stopień znoszenia hamowania zwrotnego dowolnego mutanta podwójnego AKIII był wyższy niż pojedynczego mutanta AKIII (tabela 4). Mutant lysC w pLYSC582L, pLYSC345I i pLYSC345V jest nowym zmutowanym genem. W każdym z produktów genu hamowanie zwrotne przez lizynę jest zniesione i ligacja z innymi mutacjami zwiększa stopień zniesienia hamowania zwrotnego. Produkt jest również użyteczny jako produkt pośredni przy konstruowaniu podwójnego mutanta AKIII.

Tabel a 4

Szczep	Mutacja punktowa (aminokwas)	Stopień zniesienia hamowania zwrotnego (%)
1	2	3
GT3/pLYSC2*48	325Leu-->Ser	12
GT3/pLYSC2*117	345Ser-->Leu	75
GT3/pLYSC2*126	323Gly-->Asp	5
GT3/pLYSC2*150	318Met->Ile	8
GT3/pLYSC2*158	347Val-->Met	3

PL 192 391 B1 cd. tabeli 4

1	2	3
GT3/pU345I	345Ser-->Ile	108
GT3/pU345V	345Ser-->Val	98
GT3/pU358L	358Ser-->Leu	3
GT3/pU2547M	325Leu-->Phe, 347Val-->Met	90
GT3/pU2347M	323Gly-->Asp, 347Val-->Met	94
GT3/pU2545L	325Leu-->Phe, 345Ser-->Leu	172
GT3/pU2358L	323Gly-->Asp, 358Ser-->Leu	18
GT3/pU2345V	323Gly-->Asp, 345Ser-->Val	109
GT3/pU2345I	323Gly-->Asp, 345Ser-->Ile	152
GT3/pU1823D	318Met-->Ile, 323Gly-->Asp	91

P r zyk ł a d 3

Wytwarzanie L-lizyny metodą fermentacji z wykorzystaniem szczepu posiadającego zmutowany gen DDPS i zmutowany gen AKIII

Wpływ zmutowania genu DDPS i AKIII na produkcję L-lizyny przedstawiono w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042. W celu zwiększenia tego efektu spowodowano by zmutowany gen AKIII uzyskany, jak przedstawiono to w przykładzie 1, współwystępował ze zmutowanym genem DDPS.

Szczep uzyskany przez wprowadzenie plazmidu RSF24P, niosący zmutowany gen DDPS i przedstawiony w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042, obecny w szczepie E.coli JM109, oznaczono mianem AJ12395. Został on zdeponowany w National Institute of Bioscience and Human Technology (Agency of Industrial Science and Technology, No 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod numerem referencyjnym FERM P-13935, 28 października 1993. Szczep ten przekazany został do międzynarodowego centrum depozytów biotechnologicznych, zgodnie z układem budapeszteńskim z 4 listopada 1993 i otrzymał numer referencyjny FERM BP-4858.

Plazmidy RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD245M, RSFD237M, RSFD254L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I oraz RSFD1823D przygotowano tak, jak przedstawiono na figurze 2, z jednego rodzaju plazmidu, wybranego z plazmidów zawierających zmutowany gen AKIII, pMLYSC2*Y1, pLMYSC2*Y6, pLMYSC2*Y14, pLMYSC2*Y21, pLMYSC2*Y28, pLMYSC2*Y29, pLMYSC2*Y30, pU2547M, pU2347M, pU2545L, pU2358L, pU2545V, pU2345I oraz pU1823D.

Plazmid RSFD80 przedstawiony w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042 wykorzystano jako kontrolę. Szczep uzyskany z wprowadzenia plazmidu RSFD80 do E.coli szczep JM109 oznaczono jako AJ12396. Został on zdeponowany w National Institute of Bioscience and Human Technology (Agency of Industrial Science and Technology, No 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod numerem referencyjnym FERM P-13936, 1 listopada 1993. Szczep ten przekazany został do międzynarodowego centrum depozytów biotechnologicznych, zgodnie z układem budapeszteńskim z 1 listopada 1993 i otrzymał numer referencyjny FERM BP-4859.

Wymienione wyżej plazmidy RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD245M, RSFD237M, RSFD254L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I oraz RSFD1823D wprowadzono do szczepu B-399 w standardowy sposób, tworząc szczepy wytwarzające L-lizynę. Oceniano następnie wydajność produkcji L-lizyny przez wymienione wyżej szczepy. Wydajność produkcji L-lizyny oceniano również dla szczepu B-399/RSFD80, jako kontroli. Metoda uzyskiwania szczepu B-399 została przedstawiona w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042.

Hodowlę prowadzono w podłożu właściwym dla produkcji L-lizyny w temperaturze 37°C przez okres 48 godzin, z mieszaniem przy 114-116 rpm, zgodnie ze sposobem przedstawionym w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO95/16042. Rezultaty zebrano w tabeli 5.

PL 192 391 B1

T ab el a 5

Szczep	Ilość utworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/L)
B-399/RSFD80	9,2
B-399/RSFDY1	9,4
B-399/RSFDY6	9,6
B-399/RSFDY14	9,6
B-399/RSFDY21	9,5
B-399/RSFDY28	9,6
B-399/RSFDY29	9,5
B-399/RSFDY30	9,3
B-399/RSFD2547M	9,6
B-399/RSFD2347M	9,5
B-399/RSFD2545L	9,6
B-399/RSFD2358L	9,3
B-399/RSFD2345V	9,4
B-399/RSFD2345I	9,3
B-399/RSFD1823D	9,6

P r zyk ł a d 4

Wytwarzanie L-lizyny poprzez fermentację z wykorzystaniem szczepu posiadającego wprowadzony zmutowany gen DDPS i zmutowany gen AKIII (2)

Wykazano w przykładzie 3, że produktywność L-lizyny można zwiększyć poprzez wprowadzenie do bakterii rodzaju Escherichia zmutowanego genu DDPS i zmutowanego genu AKIII.

Przeprowadzono test wykazujący, czy efekt ten utrzyma się w przypadku zmiany gospodarza.

E.coli szczep W3110 (tyrA) wykorzystano jako gospodarza. Szczep W3110 (tyrA) przedstawiono szczegółowo w opisie wyłożeniowym Europejskiego zgłoszenia patentowego Nr 488,424/1992. Opis wyłożeniowy Europejskiego zgłoszenia patentowego Nr 488,424/1992 opisuje dużą liczbę szczepów uzyskanych poprzez wprowadzenie plazmidu do szczepu W3110 (tyrA). Na przykład szczep uzyskany poprzez wprowadzenie plazmidu pHATerm oznaczono jako szczep E.coli W3110' (tyrA)/pHATerm. Został on zdeponowany w National Institute of Bioscience and Human Technology (Agency of Industrial Science and Technology, No 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod numerem referencyjnym FERM BP-3653, 18 listopada 1991, zgodnie z układem budapeszteńskim. Szczep W3110 (tyrA) można również uzyskać poprzez wprowadzenie plazmidu pHNATerm z wymienionego szczepu E.coli W3110 (tyrA)/pHATerm. Wprowadzenie plazmidu dokonać można metodami standardowymi.

Plazmidy zawierające zmutowany gen DDPS i zmutowany gen AKIII uzyskane w przykładzie 3, to znaczy plazmidy RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD245M, RSFD237M, RSFD254L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I oraz RSFD1823D wprowadzono do wspomnianego szczepu W3110 (tyrA), i oceniano produktywność L-lizyny przez otrzymane szczepy tak, jak w przykładzie 3. Jako kontrolę stosowano szczep W3110 (tyrA)/RSFD80, powstały przez wprowadzenie plazmidu RSFD80 do szczepu W3110 (tyrA). Oceniano również produktywność L-lizyny dla szczepu kontrolnego. Rezultaty przedstawia tabela 6.

PL 192 391 B1

T ab el a 6

Szczep	Ilość utworzonego chlorowodorku L-lizyny (g/L)
W3110 (tyrA) /RSFD80	8,9
W3110 (tyrA) /RSFDY1	9,1
W3110 (tyrA) /RSFDY6	9,3
W3110 (tyrA) /RSFDY14	9,3
W3110 (tyrA) /RSFDY21	9,2
W3110 (tyrA) /RSFDY28	9,3
W3110 (tyrA) /RSFDY29	9,2
W3110 (tyrA) /RSFDY30	9,0
W3110 (tyrA) /RSFD2547M	9,3
W3110 (tyrA) /RSFD2347M	9,2
W3110 (tyrA) /RSFD2545L	9,3
W3110 (tyrA) /RSFD2358L	9,0
W3110 (tyrA) /RSFD2345V	9,1
W3110 (tyrA) /RSFD2345I	9,0
W3110 (tyrA) /RSFD1823D	9,3

Przykład 5

Wytwarzanie L-treoniny poprzez fermentację z wykorzystaniem szczepu z wprowadzonym zmutowanym genem AKIII

Jako szczep E.coli produkujący treoninę wybrano szczep B-3996, o najwyższej znanej produktywności. Tak więc, jako szczep gospodarza, w celu oceny zmutowanego genu AKIII, zastosowano szczep B-3996. Szczep ten opisano w US Patent 5,175,107 i zdeponowano w Research Institute for Genetics and Industrial Microorganisms Breeding pod numerem referencyjnym BKIIM B-3996. Jako zmutowany gen AKIII do testów wybrano trzy rodzaje mutantów genu AKIII (RSFDY6, RSFE254M i RSFD1823D, spośród zmutowanych genów o największej produktywności L-lizyny. Po pierwsze, wcelu zwiększenia ekspresji zmutowanego genu AKIII, gen AKIII obecny w plazmidzie pMLYSC2*Y6 zligowano z regionem 3' promotora lacZ z plazmidu pUC19 (Takara Shuzo Co). Tak utworzony nowy plazmid oznaczono jako pLLC*Y6 (figura 3). Zastosowano taką orientację, ponieważ w plazmidach pU2547M i pU1823D, zmutowany gen AKIII położony był pierwotnie w kierunku 3' od promotora lacZ z pUC19 (Takara Shuzo, Co).

Plazmidy te wprowadzono do szczepu B-3996 metodą standardową i przeprowadzono ocenę produktywności. Warunki inkubacji przedstawiono w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO94/11517.

pLLC*Y6, pU2547M i pU1823D wprowadzono do szczepu B-3996 i transformanty inkubowano w obecności lizyny o stężeniu 1 g/L. Szczep gospodarza B-3996 oraz B-3996/pLLC*80 przedstawione w opisie wyłożeniowym publikacji międzynarodowej WO94/11517 stosowano jako kontrole.

Wyniki zebrano w tabeli 7. Wrażliwość na lizynę w tabeli 7 oznacza stosunek ilości cukru zużywanego w obecności lizyny do ilości cukru zużywanego przy braku lizyny. W szczepie B-3996 spadek ilości cukru zużywanego podczas inkubacji w obecności lizyny w stosunku do ilości cukru zużywanego przy braku lizyny wynosił 0,74; ten sam stosunek dla szczepu B-3996/pLLC*80 wynosił w przybliżeniu 0,90. Nowo otrzymane zmutowane geny AKIII okazały się nieco lepsze w wydajności produkcji treoniny i wrażliwości na lizynę.

PL 192 391 B1

Tabela 7

Szczep	Ilość dodanej L-lizyny (g/L)	Ilość zużytego cukru (%)	Wrażliwość na lizynę
B-3996	0	30,7
	1	22,6	0,74
B-3996/pLLC*80	0	39,7
	1	35,6	0,90
B-3996/pLLC*Y6	0	40,5
	1	39,2	0,97
B-3996/pU2547M	0	40,7
	1	39,5	0,97
B-3996/pU1823D	0	41,4
	1	40,5	0,98

Wynalazek umożliwia produkcję zmutowanego genu AKIII pochodzącego z bakterii rodzaju Escherichia, dla którego skutecznie zniesiono hamowanie zwrotne przez L-lizynę. Szczep produkujący L-lizynę lub L-treoninę jest ulepszony, w porównaniu ze szczepami uzyskanymi poprzednio i powstał w wyniku wprowadzenia wspomnianego genu do bakterii z rodzaju Escherichia. Wynalazek dostarcza sposobu produkcji L-lizyny lub L-treoniny poprzez fermentację, korzystniejszego niż sposoby konwencjonalne z użyciem szczepu wydajnie wytwarzającego L-aminokwas.

PL 192 391 B1

Cecha: sekwencja -10 Pozycja: 265..273 Sposób oznaczenia: S Cecha: miejsce wiązania startera Pozycja: 536..555 Sposób określenia: E Cecha: miejsce wiązania startera Pozycja: 2128..2147 Sposób określenia: E Cecha: RBS Pozycja: 575..578 Sposób określenia: S Cecha: CDS Pozycja: 584..1933 Sposób określenia: S Cecha: kodony terminacyjne Pozycja: 1941..1968 Sposób określenia: S OPIS SEKWENCJI

TCGAAGTGTT	TCTGTAGTGC	CTGCCAGGCA	GCGGTCTGCG	TTGGATTGAT	GTTTTTCATT	60
AGCAATACTC	TTCTGATTTT	GAGAATTGTG	ACTTTGGAAG	ATTGTAGCGC	CAGTCACAGA	120
aaaatgtgat	GGTTTTAGTG	CCGTTAGCGT	AATGTTGAGT	GTAAACCCTT	AGCGCAGTGA	180
AGCATTTATT	AGCTGAACTA	CTGACCGCCA	GGAGTGGATG	AAAAATCCGC	ATGACCCCAT	240
CGTTGACAAC	CGCCCCGCTC	ACCCTTTATT	TATAAATGTA	CTACCTGCGC	TAGCGCAGGC	300
CAGAAGAGGC	GCGTTGCCCA	AGTAACGGTG	TTGGAGGAGC	CAGTCCTGTG	ATAACACCTG	360
AGGGGGTGCA	TCGCCGAGGT	GATTGAACGG	CTGGCCACGT	TCATCATCGG	CTAAGGGGGC	420
TGAATCCCCT	GGGTTGTCAC	CAGAAGCGTT	CGCAGTCGGG	CGTTTCGCAA	GTGGTGGAGC	480
ACTTCTGGGT	GAAAATAGTA	GCGAAGTATC	GCTCTGCGCC	CACCCGTCTT	CCGCTCTTCC	540

PL 192 391 B1

CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT

Met Ser Glu Ile

595

GTT

GTC

TCC

AAA

TTT

GGC

GGT

ACC

AGC

GTA

GCT

GAT

TTT

GAC

GCC

ATG

Val

Ser

Lys

Phe

Gly

Thr

Ser

Val

Ala

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

5

10

15

20

AAC

CGC

AGC

GCT

GAT

ATT

GTG

CTT

TCT

GAT

GCC

AAC

GTG

CGT

TTA

GTT

Asn

Arg

Ser

Ala

Asp

Ile

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Leu

Val

25

30

35

GTC

CTC

TCG

GCT

TCT

GCT

GGT

ATC

ACT

AAT

CTG

GTC

GCT

TTA

GCT

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

Ile

Thr

Asn

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

40

45

50

GAA

GGA

CTG

GAA

CCT

GGC

GAG

CGA

TTC

GAA

AAA

CTC

GAC

GCT

ATC

CGC

Glu

Gly

Leu

Glu

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Ile

Arg

55

60

65

AAC

ATC

CAG

TTT

GCC

ATT

CTG

GAA

CGT

CTG

CGT

TAC

CCG

AAC

GTT

ATC

Aśn

Ile

Gin

Phe

Ala

Ile

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

Pro

Asn

Val

Ile

70

75

80

CGT

GAA

GAG

ATT

GAA

CGT

CTG

GAG

AAC

ATT

ACT

GTT

CTG

GCA

GAA

Arg

Glu

Ile

Glu

Arg

Leu

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Leu

Ala

Glu

85

90

95

100

GCG

CTG

GCA

ACG

TCT

CCG

GCG

CTG

ACA

GAT

GAG

CTG

GTC

AGC

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

Thr

Asp

Glu

Leu

Val

Ser

105

110

115

643

691

739

787

835

883

931

PL 192 391 B1

CAC

GGC

GAG

CTG

ATG

TCG

ACC

CTG

TTT

GTT

GAG

ATC

CTG

CGC

GAA

979

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

Glu

120

125

130

CGC

GAT

GTT

CAG

GCA

CAG

TGG

TTT

GAT

GTA

CGT

AAA

GTG

ATG

CGT

ACC

1027

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

Val

Arg

Lys

Val

Met

Arg

Thr

135

140

-

145

AAC

GAC

CGA

TTT

GGT

CGT

GCA

GAG

CCA

GAT

ATA

GCC

GCG

CTG

GCG

GAA

1075

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Ala

Glu

Pro

Asp

Ile

Ala

Leu

Ala

Glu

150

155

160

CTG

GCC

GCG

CTG

CAG

CTG

CTC

CCA

CGT

CTC

AAT

GAA

GGC

TTA

GTG

ATC

1123

Leu

Ala

Leu

Gin

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

Gly

Leu

Val

Ile

165

170

175

180

ACC

CAG

GGA

TTT

ATC

GGT

AGC

GAA

AAT

AAA

GGT

CGT

ACA

ACG

CTT

1171

Thr

Gin

Gly

Phe

Ile

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

Thr

Leu

185

190

195

GGC

CGT

GGA

GGC

AGC

GAT

TAT

ACG

GCA

GCC

TTG

CTG

GCG

GAG

GCT

TTA

1219

Gly

Arg

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

200

205

210

CAC

GCA

TCT

CGT

GTT

GAT

ATC

TGG

ACC

GAC

GTC

CCG

GGC

ATC

TAC

ACC

1267

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ile

Trp

Thr

Asp

Val

Pro'

Gly

Ile

Tyr

Thr

215

220

225

ACC

GAT

CCA

CGC

GTA

GTT

TCC

GCA

AAA

CGC

ATT

GAT

GAA

ATC

GCG

1315

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

Ser

Ala

Lys

Arg

Ile

Asp

Glu

Ile

Ala

230 235 240

PL 192 391 B1

TTT

GCC

GAA

GCG

GCA

GAG

ATG

GCA

ACT

TTT

GGT

GCA

AAA

GTA

CTG

CAT

1363

Phe

Ala

Glu

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Gly

Ala

Lys

Val

Leu

His

245

250

255

260

CCG

GCA

ACG

TTG

CTA

CCC

GCA

GTA

CGC

AGC

GAT

ATC

CCG

GTC

TTT

GTC

1411

Pro

Ala

Thr

Leu

Pro

Ala

Val

Atg

Ser

Asp

Ile

Pro

Val

Phe

Val

2 65

270

275

GGC

TCC

AGC

AAA

GAC

CCA

CGC

GCA

GGT

ACG

CTG

GTG

TGC

AAT

AAA

1459

Gly

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Ala

Gly

Thr

Leu

Val

Cys

Asn

Lys

280

285

-

290

ACT

GAA

AAT

CCG

CTG

TTC

CGC

GCT

CTG

GCG

CTT

CGT

CGC

AAT

CAG

1507

Thr

Glu

Asn

Pro

Leu

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Leu

Arg

Asn

Gin

295

300

305

ACT

CTG

CTC

ACT

TTG

CAC

AGC

CTG

AAT

ATG

CTG

CAT

TCT

CGC

GGT

TTC

1555

Thr

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Met

Leu

His

Ser

Arg

Gly

Phe

310

315

320

CTC

GCG

GAA

GTT

TTC

GGC

ATC

CTC

GCG

CGG

CAT

AAT

ATT

TCG

GTA

GAC

1603

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Leu

Ala

Arg

His

Asn

Ile

Ser

Val

Asp

325

330

335

340

TTA

ATC

ACC

ACG

TCA

GAA

GTG

AGC

GTG

GCA

TTA

ACC

CTT

GAT

ACC

1651

Leu

Ile

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

Leu

Asp

Thr

345

350

355

GGT

TCA

ACC

TCC

ACT

GGC

GAT

ACG

TTG

CTG

ACG

CAA

TCT

CTG

ATG

1699

C-ly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Thr

Gin

Ser

Leu

Met

365 370

PL 192 391 B1

GAG	CTT	TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG	GTG GAA GAA GGT CTG GCG	CTG	1747
Glu	Leu	Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu	Val Glu Glu Gly Leu Ala	Leu
		375 380	385
GTC	GCG	TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA	AAA GCC TGC GGC GTT GGC	AAA	1795
Val	Ala	Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser	Lys Ala Cys Gly Val Gly	Lys
	390	395	400
GAG	GTA	TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC	AAC ATT CGC ATG ATT TGT	TAT	1843
Glu	Val	Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe	Asn Ile Arg Met Ile Cys	Tyr
405		410	415	420
GGC	GCA	TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC	CTG GTG CCC GGC GAA GAT	GCC	1891
Gly	Ala	Ser Ser His Asn Leu Cys Phe	Leu Val Pro Gly Glu Asp	Ala
		425	430 435
GAG	CAG	GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT	AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT	1940
Glu	Gin	Val Val Gin Lys Leu His Ser	Asn Leu Phe Glu
		440 445
ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA	2000
ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT	2060
ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA	2120
TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC			2147

PL 192 391 B1

SEK ID NO: 2

DŁUGOŚĆ SEEKWENCJI: 20

TYP SEKWENCJI: kwas nukleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowa

TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20

SEK ID NO: 3

DŁUGOŚĆ SEKWENCJI: 18

TYP SEKWENCJI: kwas nukleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy

TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

GAATTCCTTT GCGAGCAG 18

SEK ID NO: 4

DŁUGOŚĆ SEKWENCJI: 32

TYP SEKWENCJI: kwas nukleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy

TOPOLOGIA: liniowy

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

GAGGTCAGAC CGGTGGTATC AAGGGTTAAT GC 32

SEK ID NO: 5

DŁUGOŚĆ SEKWENCJI: 51

TYP SEKWENCJI: kwas nukleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: j ednoniciowy

TOPOLOGIA: liniowy

PL 192 391 B1

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC GATCGTGGTG ATTAAGTCTA C 51

SEK ID NO: 6

DŁUGOŚĆ SEKWENCJI: 51

TYP SEKWENCJI: kwas nukleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: j ednoniciowy

TOPOLOGIA: liniowy

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC AACCGTGGTG ATTAAGTCTA C 51

SEK ID NO: 7

DŁUGOŚĆ SEKWENCJI: 30

TYP SEKWENCJI; kwas nucleinowy

ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy

TOPOLOGIA: liniowy

TYP CZĄSTECZKI: inny DNA

OPIS SEKWENCJI:

TGCAGTATAT TCAGGCTGTG CAAAGTGAGC 30

Claims

1. DNA kodujący aspartokinazę III z bakterii należącej do rodzaju Escherichia i posiadający w regionie kodującym mutację znoszącą hamowanie lizyną przez sprzężenie zwrotne uwalniania aspartokinazy III, znamienny tym, że wymieniona mutacja jest mutacją, w wyniku której reszta metioninowa 318 aspartokinazy III zastąpiona jest resztą izoleucynową i reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego, mutacją, w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją, w wyniku której reszta glicynowa 323 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta walinowa 347 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją w wyniku której reszta leucynowa 325 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową i reszta serynowa 345 zastąpiona jest resztą leucynową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 jest zastąpiona resztą lizynową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta leucynowa 374 zastąpiona jest resztą fenyloalaninową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu glutaminowego 250 zastąpiona jest resztą lizynową i reszta treoninowa 364 zastąpiona jest resztą metioninową, mutacją, w wyniku której reszta kwasu asparaginowego 202 zastąpiona jest resztą glicynową i reszta serynowa 321 zastąpiona jest resztą prolinową, lub mutacją, w wyniku której reszta argininowa 283 zastąpiona jest resztą serynową, reszta alaninowa 333 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta serynowa 338 zastąpiona jest resztą treoninową, reszta kwasu glutaminowego 346 zastąpiona jest resztą kwasu asparaginowego i reszta asparaginowa 414 zastąpiona jest resztą serynową, przy czym DNA wykazuje dużą produktywność lizyny.

2. Zrekombinowany DNA otrzymany poprzez ligację DNA z zastrz. 1 z DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii z rodzaju Escherichia.

3. Mikroorganizm z rodzaju Escherichia niosący DNA z zastrz. 1.

4. Sposób wytwarzania L-lizyny lub L-treoniny, znamienny tym, że inkubuje się mikroorganizm z zastrz. 3, zdolny do wytwarzania odpowiednio L-lizyny lub L-treoniny w pożywce fermentacyjnej, wytwarza się i gromadzi L-lizynę lub L-treoninę w hodowli, po czym zbiera się L-lizynę lub L-treoninę z wymienionej hodowli.