ES2694011T3 - Método para producir L-aminoácido - Google Patents

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ES2694011T3
ES2694011T3 ES14835548.0T ES14835548T ES2694011T3 ES 2694011 T3 ES2694011 T3 ES 2694011T3 ES 14835548 T ES14835548 T ES 14835548T ES 2694011 T3 ES2694011 T3 ES 2694011T3
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Keiko Noguchi
Mika Moriya
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Abstract

Método para producir un L-aminoácido que comprende: cultivar una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene una capacidad de producción de L-aminoácido en un medio para producir y acumular un L-aminoácido en el medio o células de la bacteria; y recoger el L-aminoácido del medio o las células, en el que la bacteria se ha modificado de modo que el operón acpP-fabF se atenúa en comparación con una cepa no modificada, en el que el operón acpP-fabF se atenúa atenuando la expresión de un gen del operón acpP-fabF, en el que la expresión del gen del operón acpP-fabF se atenúa modificando una secuencia de control de la expresión del gen.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para producir L-aminoacido Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para producir un L-aminoacido usando una bacteria. Los L- aminoacidos son utiles de manera industrial como aditivos para piensos, ingredientes de condimentos, alimentos y bebidas, infusiones de aminoacidos, y as^ sucesivamente.
Tecnica anterior
Los L-aminoacidos se producen industrialmente, por ejemplo, mediante fermentacion usando diversos microorganismos que tienen una capacidad de produccion de L-aminoacidos. Los ejemplos de metodos para producir un L-aminoacido mediante fermentacion incluyen, por ejemplo, metodos de uso de un microorganismo de tipo natural (cepa de tipo natural), metodos de uso de una cepa auxotrofica derivada de una cepa de tipo natural, metodos de uso de una cepa mutante de regulacion metabolica derivada como una cepa mutante resistente a cualquiera de los diversos farmacos de una cepa de tipo natural, y metodos de uso de una cepa que tiene caractensticas como una cepa auxotrofica y como cepa mutante de regulacion metabolica.
Ademas, en los ultimos anos, se usan microorganismos de los cuales se mejora una capacidad de produccion de L- aminoacidos mediante tecnicas de ADN recombinante para la produccion de L-aminoacidos. Los ejemplos de metodos para mejorar una capacidad de produccion de L-aminoacidos de un microorganismo incluyen, por ejemplo, potenciar la expresion de un gen que codifica una enzima biosintetica de L-aminoacido (documentos de patente 1 y 2), y potenciar la entrada de una fuente de carbono en un sistema de biosmtesis de L-aminoacido (documento de patente 3).
El documento US 2009/286290 describe la produccion de un L-aminoacido mediante un microorganismo que se ha modificado de modo que se disminuyen la actividad de succinato deshidrogenasa y la actividad de alfa-cetoglutarato deshidrogenasa.
El documento US 2010/209977 describe la produccion de un L-aminoacido mediante una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, que se ha modificado para tener una mutacion espedfica en el gen yeaS.
El documento WO 2012/002486 describe un metodo para producir un L-aminoacido a partir de etanol como material de partida usando una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae modificada de modo que se reduce la actividad de la protema Aldb, preferiblemente una bacteria modificada adicionalmente de modo que se potencia la actividad de la protema AdhE.
El documento WO 2009/031564 describe la produccion de un L-aminoacido mediante una bacteria que pertenece a la familia Enterobacter, que se ha modificado para suprimir la expresion de uno o mas genes seleccionados de entre ydcU, yfeK, smpA, htrG, adiC, htrA, ydhK, bacA, yaiW y yidQ.
El documento WO 2011/152565 describe un metodo para producir L-aminoacidos usando una bacteria de la familia Enterobacteriaceae, que se ha modificado para atenuar la expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en los genes pepA, pepB y pepD.
El gen acpP es un gen que codifica la protema portadora de acilo (ACP) (documento no de patente 1). ACP se traduce como apo-ACP inactiva, entonces se anade 4’-fosfopantetema como cofactor al residuo de serina de la posicion 36 (en el caso de Escherichia coli) de apo-ACP mediante ACP sintasa, y apo-ACP se convierte de ese modo en holo-ACP activa. ACP es una protema que desempena un papel importante en las biosmtesis de acidos grasos de bacterias, y asf sucesivamente. Espedficamente, en la biosmtesis de acidos grasos, ACP (holo-ACP) se une a una cadena de acido graso por medio del grupo 4’-fosfopantetema, para portar de ese modo la cadena de acido graso.
El gen fabF es un gen que codifica p-cetoacil-ACP sintasa II (documento no de patente 1). El p-cetoacil-ACP sintasa II es una de las enzimas de biosmtesis de acidos grasos, y participa en la extension de la cadena de acido graso. Espedficamente, la p-cetoacil-ACP sintasa II cataliza la reaccion que genera una 3-oxoacil-ACP (numero de carbono = n + 2) de una acil-ACP (numero de carbono = n) y malonil-ACP (EC 2.3.1.41).
En Escherichia coli, los genes que participan en la biosmtesis de acido graso, incluyendo el gen acpP y el gen fabF, existen como la agrupacion genica yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF. Los genes de esta agrupacion genica se transcriben conjuntamente como varios pares de genes (documento no de patente 1). Por ejemplo, el gen acpP y el gen fabF se transcriben conjuntamente como el operon acpP-fabF. Ademas, el gen fabF tambien se transcribe independientemente con su propio promotor. Ademas, el gen acpP tambien puede transcribirse conjuntamente a partir del gen fabD y el gen fabG en la agrupacion genica yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF.
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Sin embargo, no se ha conocido la relacion entre los genes acpP y fabF, y la produccion de L-aminoacido. Referencias de la tecnica anterior Documentos de patente
Documento de patente 1: patente estadounidense n.° 5.168.056 Documento de patente 2: patente estadounidense n.° 5.776.736 Documento de patente 3: patente estadounidense n.° 5.906.925 Documento no de patente
Documento no de patente 1: Zhang Y, Cronan JE Jr., J Bacteriol., junio de 1996; 178(12):3614-20 Sumario de la invencion
Objeto que va a lograrse mediante la invencion
Un objeto de la presente invencion es desarrollar una tecnica nueva para mejorar una capacidad de produccion de L-aminoacido de una bacteria, y proporcionar de ese modo un metodo para producir de manera eficaz un L- aminoacido.
Medios para lograr el objeto
El inventor de la presente invencion llevo a cabo diversas investigaciones con el fin de lograr el objeto mencionado anteriormente. Como resultado, el inventor encontro que una capacidad de produccion de L-aminoacido de una bacteria puede mejorarse modificando la bacteria de modo que se reduce la expresion de los genes acpP y fabF, y logro la presente invencion.
Es decir, la presente invencion puede realizarse, por ejemplo, tal como sigue.
[1] Un metodo para producir un L-aminoacido que comprende:
cultivar una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene una capacidad de produccion de L- aminoacido en un medio para producir y acumular un L-aminoacido en el medio o celulas de la bacteria; y
recoger el L-aminoacido del medio o las celulas,
en el que la bacteria se ha modificado de modo que el operon acpP-fabF se atenua en comparacion con una cepa no modificada,
en el que el operon acpP-fabF se atenua atenuando la expresion de un gen del operon acpP-fabF,
en el que la expresion del gen del operon acpP-fabF se atenua modificando una secuencia de control de la expresion del gen.
[2] El metodo segun [1], en el que el gen del operon acpP-fabF consiste en el gen acpP y/o el gen fabF.
[3] El metodo segun [2], en el que el gen del operon acpP-fabF consiste en el gen acpP y el gen fabF.
[4] El metodo segun uno cualquiera de [2] a [3], en el que la expresion del gen del operon acpP-fabF se atenua reemplazando la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por otra base,
en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7.
[5] El metodo segun [4], en el que la expresion del gen del operon acpP-fabF se atenua reemplazando la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por adenina.
[6] El metodo segun uno cualquiera de [1] a [5], en el que la bacteria es una bacteria que pertenece a los generos Escherichia, Pantoea o Enterobacter.
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[7] El metodo segun [6], en el que la bacteria es Escherichia coli.
[8] El metodo segun uno cualquiera de [1] a [7], en el que la cepa no modificada es la cepa Escherichia coli MG1655.
[9] El metodo segun uno cualquiera de [1] a [8], en el que la cepa no modificada tiene la secuencia de nucleotidos del operon acpP-fabF, que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo, mostrada como SEQ ID NO: 7.
[10] El metodo segun uno cualquiera de [1] a [9], en el que el L-aminoacido es L-lisina.
[11] El metodo segun uno cualquiera de [1] a [10], en el que la cantidad de expresion del gen acpP no se reduce hasta el 0 %.
[12] Un metodo para producir L-lisina que comprende:
cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y
recoger L-lisina del medio o las celulas,
en el que la expresion de un gen del operon acpP-fabF se ha atenuado en la Escherichia coli en comparacion con una cepa no modificada modificando una secuencia de control de la expresion del gen.
[13] El metodo segun [12], en el que la cepa no modificada es la cepa Escherichia coli MG1655.
[14] El metodo segun [12] o [13], en el que la cepa no modificada tiene la secuencia de nucleotidos del operon acpP- fabF, que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo, mostrada como SEQ ID NO: 7.
[15] El metodo segun uno cualquiera de [12] a [14], en el que la cantidad de expresion del gen acpP no se reduce hasta el 0 %.
[16] Un metodo para producir L-lisina que comprende:
cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y
recoger L-lisina del medio o las celulas,
en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por otra base en la Escherichia coli,
en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7.
[17] El metodo para producir L-lisina segun [16], en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por adenina en la Escherichia coli.
Modos para llevar a cabo la invencion
En adelante, la presente invencion se explicara en detalle.
El metodo de la presente invencion es un metodo para producir un L-aminoacido que comprende cultivar una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido en un medio para producir y acumular un L-aminoacido en el medio o celulas de la bacteria, y recoger el L-aminoacido del medio o las celulas, en el que la bacteria se ha modificado de modo que el operon acpP-fabF se atenua tal como se define en las reivindicaciones. La bacteria usada para este metodo se denomina tambien “la bacteria de la presente divulgacion”.
<1> Bacteria de la presente divulgacion
La bacteria de la presente divulgacion es una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido, que se ha modificado de modo que el operon acpP-fabF se atenua.
<1-1> Bacteria que tiene capacidad de produccion de L-aminoacido
En la presente invencion, una “bacteria que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido” se refiere a una bacteria que tiene una capacidad para producir y acumular un L-aminoacido objetivo en un medio o celulas de la
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bacteria en tal medida que el L-aminoacido puede recogerse, cuando la bacteria se cultiva en el medio. La bacteria que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido puede ser una bacteria que puede acumular un L- aminoacido objetivo en un medio en una cantidad mayor que la que puede obtenerse con una cepa no modificada. Los ejemplos de la cepa no modificada incluyen cepas de tipo natural y cepas progenitoras. La bacteria que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido puede ser una bacteria que puede acumular un L-aminoacido objetivo en un medio en una cantidad de preferiblemente 0,5 g/l o mas, mas preferiblemente 1,0 g/l o mas.
Los ejemplos del L-aminoacido incluyen aminoacidos basicos tales como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina y L-citrulina; aminoacidos alifaticos tales como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina y glicina; aminoacidos que son acidos hidroxi-monoaminocarboxflicos tales como L-treonina y L-serina; aminoacidos dclicos tales como L- prolina; aminoacidos aromaticos tales como L-fenilalanina, L-tirosina y L-triptofano; aminoacidos que contienen azufre tales como L-cistema, L-cistina y L-metionina; aminoacidos acidos tales como acido L-glutamico y acido L- aspartico; y aminoacidos que tienen un grupo amida en la cadena lateral tales como L-glutamina y L-asparagina. La bacteria de la presente divulgacion puede tener una capacidad para producir un solo tipo de L-aminoacido, o dos o mas tipos de L-aminoacidos.
En la presente invencion, el termino “aminoacido” puede referirse a un L-aminoacido a menos que se declare lo contrario. Ademas, el L-aminoacido que va a producirse puede ser un compuesto libre, una sal del mismo, o una mezcla de los mismos. Es decir, en la presente invencion, el termino “L-aminoacido” puede referirse a un L- aminoacido en una forma libre, una sal del mismo, o una mezcla de ellos a menos que se declare lo contrario. Los ejemplos de la sal se describiran a continuacion.
Los ejemplos de bacterias que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae incluyen bacterias que pertenecen a los generos Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Morganella, o similares. Espedficamente, pueden usarse las bacterias clasificadas en la familia Enterobacteriaceae segun la taxonoirna usada en la base de datos del NCBI (Centro Nacional para la Informacion Biotecnologica) (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347).
Las bacterias de Escherichia no estan particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen las clasificadas en el genero Escherichia segun la taxonoirna conocida por los expertos en el campo de la microbiologfa. Los ejemplos de las bacterias de Escherichia incluyen, por ejemplo, las descritas en el trabajo de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, pags. 24602488, tabla 1, en F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, segunda edicion, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Los ejemplos de la bacteria de Escherichia incluyen, por ejemplo, Escherichia coli. Los ejemplos espedficos de Escherichia coli incluyen, por ejemplo, Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) y Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) derivadas de la cepa prototipo de tipo natural, cepa K-12.
Las bacterias de Enterobacter no estan particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen las clasificadas en el genero Enterobacter segun una clasificacion conocida para un experto en la tecnica de la microbiologfa. Los ejemplos de las bacterias de Enterobacter incluyen, por ejemplo, Enterobacter agglomerans y Enterobacter aerogenes. Los ejemplos espedficos de Enterobacter agglomerans incluyen, por ejemplo, la cepa Enterobacter agglomerans ATCc 12287. Los ejemplos espedficos de Enterobacter aerogenes incluyen, por ejemplo, la cepa Enterobacter aerogenes ATCC 13048, cepa NBRC 12010 (Biotechnol Bioeng., 2007, Mar. 27; 98(2):340-348), y cepa AJ110637 (FERM ABP-10955). Los ejemplos de la bacteria de Enterobacter tambien incluyen, por ejemplo, las cepas descritas en la solicitud de patente europea abierta a consulta por el publico (EP-A) n.° 0952221. Ademas, Enterobacter agglomerans tambien incluye algunas cepas clasificadas como Pantoea agglomerans.
Las bacterias de Pantoea no estan particularmente limitadas, y los ejemplos de las mismas incluyen las clasificadas en el genero Pantoea segun una clasificacion conocida para un experto en la tecnica de la microbiologfa. Los ejemplos de las bacterias de Pantoea incluyen, por ejemplo, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans y Pantoea citrea. Los ejemplos espedficos de Pantoea ananatis incluyen, por ejemplo, la cepa Pantoea ananatis LMG20103, cepa AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207), cepa SC17 (FERM BP-11091), y cepa SC17(0) (VKPM B-9246). Algunas cepas de Enterobacter agglomerans se reclasificaron recientemente en Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea stewartii basandose en el analisis de la secuencia de nucleotidos de ARNr 16S etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). En la presente invencion, las bacterias de Pantoea incluyen las reclasificadas en el genero Pantoea tal como se describio anteriormente.
Los ejemplos de las bacterias de Erwinia incluyen Erwinia amylovora y Erwinia carotovora. Los ejemplos de las bacterias de Klebsiella incluyen Klebsiella planticola.
Estas cepas estan disponibles de, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (direccion: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, apartado de correos 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de America). Es decir, se dan numeros de registro a las cepas respectivas, y las cepas pueden ordenarse usando estos numeros de
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registro (remftase a
http://www.atcc.org/). Los numeros de registro de las cepas se enumeran en el catalogo de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo.
La bacteria de la presente divulgacion puede ser una bacteria que tiene inherentemente una capacidad de produccion de L-aminoacido, o puede ser una bacteria modificada de modo que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido. La bacteria que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido puede obtenerse impartiendo una capacidad de produccion de L-aminoacido a una bacteria de este tipo tal como se menciono anteriormente, o potenciando una capacidad de produccion de L-aminoacido de una bacteria de este tipo tal como se menciono anteriormente.
Para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-aminoacido, pueden usarse metodos empleados convencionalmente en la mejora genetica de cepas productoras de aminoacidos de bacterias corineformes, bacterias de Escherichia, y asf sucesivamente (vease “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1.a edicion, publicado el 30 de mayo de 1986, pags.77-100). Los ejemplos de tales metodos incluyen, por ejemplo, adquirir una cepa mutante auxotrofica, adquirir una cepa resistente a analogos de L-aminoacidos, adquirir una cepa mutante de regulacion metabolica, y construir una cepa recombinante en la que la actividad de una enzima biosintetica de L-aminoacido se potencia. En la mejora genetica de bacterias productoras de L-aminoacidos, una de las propiedades descritas anteriormente tales como auxotroffa, resistencia a analogos y mutacion de regulacion metabolica puede impartirse sola, o pueden impartirse dos o tres o mas de tales propiedades en combinacion. Ademas, en la mejora genetica de bacterias productoras de L-aminoacido, la actividad de una de las enzimas biosinteticas de L-aminoacido puede potenciarse sola, o las actividades de dos o tres o mas de tales enzimas pueden potenciarse en combinacion. Ademas, impartir propiedad(es) tal(es) como auxotroffa, resistencia a analogos y mutacion de regulacion metabolica puede combinarse con potenciar la(s) actividad(es) de la(s) enzima(s) biosintetica(s).
Puede obtenerse una cepa mutante auxotrofica, cepa resistente a analogos de L-aminoacido, o cepa mutante de regulacion metabolica que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido sometiendo una cepa progenitora o cepa de tipo natural a un tratamiento de mutagenesis habitual, y despues seleccionando una cepa que presenta autotroffa, resistencia a analogos, o una mutacion de regulacion metabolica, y que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido a partir de las cepas mutantes obtenidas. Los ejemplos del tratamiento de mutagenesis habitual incluyen irradiacion de rayos X o ultravioleta y un tratamiento con un agente de mutacion tal como N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo (MMS).
Tambien puede impartirse o potenciarse una capacidad de produccion de L-aminoacido potenciando la actividad de una enzima implicada en la biosmtesis de un L-aminoacido objetivo. Puede potenciarse una actividad enzimatica, por ejemplo, modificando una bacteria de modo que la expresion de un gen que codifica la enzima se potencia. Los metodos para potenciar la expresion genica se describen en los documentos WO00/18935, EP 1010755 A, y asf sucesivamente. Los procedimientos detallados para potenciar la actividad enzimatica se describiran a continuacion.
Ademas, tambien puede impartirse o potenciarse una capacidad de produccion de L-aminoacido reduciendo la actividad de una enzima que cataliza una reaccion que se ramifica de la ruta biosintetica de un L-aminoacido objetivo para generar un compuesto distinto del L-aminoacido objetivo. La “enzima que cataliza una reaccion que se ramifica de la ruta biosintetica de un L-aminoacido objetivo para generar un compuesto distinto del L-aminoacido objetivo” a la que se hace referencia en este documento incluye una enzima implicada en la descomposicion del aminoacido objetivo. El metodo para reducir una actividad enzimatica se describira a continuacion.
A continuacion, las bacterias productoras de L-aminoacidos y metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-aminoacidos se ejemplificaran espedficamente. Todas las propiedades de las bacterias productoras de L-aminoacidos y modificaciones para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-aminoacidos pueden usarse independientemente o en cualquier combinacion apropiada.
<Bacterias productoras de acido L-glutamico>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de acido L-glutamico incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de acido L-glutamico. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, glutamato deshidrogenasa (gdhA), glutamina sintetasa (glnA), glutamato sintetasa (gltBD), isocitrato deshidrogenasa (icdA), aconitato hidratasa (acnA, acnB), citrato sintasa (gltA), metilcitrato sintasa (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), piruvato carboxilasa (pyc), piruvato deshidrogenasa (aceEF, IpdA), piruvato cinasa (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintasa (ppsA), enolasa (eno), fosfogliceromutasa (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinasa (pgk), gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (gapA), triosa fosfato isomerasa (tpiA), fructosa bisfosfato aldolasa (fbp), fosfofructocinasa (pfkA, pfkB), glucosa fosfato isomerasa (pgi), 6-fosfogluconato deshidratasa (edd), 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa (eda) y transhidrogenasa. Mostrados en los parentesis tras los nombres de las enzimas estan los nombres de los genes que codifican las enzimas (lo mismo se aplicara a los mismos casos a continuacion). Es preferible potenciar la actividad o actividades de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de, por ejemplo, glutamato
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deshidrogenasa, citrato sintasa, fosfoenol piruvato carboxilasa y metilcitrato sintasa, entre estas enzimas.
Los ejemplos de cepas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y modificadas de modo que se aumenta la expresion del gen de citrato sintasa, gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa y/o gen de glutamato deshidrogenasa incluyen las divulgadas en los documentos EP 1078989 A, EP 955368 A y EP 952221 A. Ademas, los ejemplos de cepas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y modificadas de modo que se aumenta la expresion de un gen de la ruta de Entner-Doudoroff (edd, eda) incluyen los divulgados en el documento EP 1352966 B.
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de acido L-glutamico tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades reducidas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta de biosmtesis de L-glutamina para generar un compuesto distinto de acido L-glutamico. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, isocitrato liasa (aceA), a-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA), fosfotransacetilasa (pta), acetato cinasa (ack), acido acetohidroxi sintasa (ilvG), acetolactato sintasa (ilvI), formiato acetiltransferasa (pfl), lactato deshidrogenasa (Idh), alcohol deshidrogenasa (adh), glutamato descarboxilasa (gadAB), succinato deshidrogenasa (sdhABCD) y 1-pirolina-5-carboxilato deshidrogenasa (putA). Es preferible reducir o eliminar, por ejemplo, la actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa, entre estas enzimas.
Se describen bacterias de Escherichia que tienen una actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa reducida o deficiente en la actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa, y metodos para obtenerlas en las patentes estadounidenses n.os 5.378.616 y 5.573.945. Ademas, se divulgan metodos para reducir o eliminar la actividad de a- cetoglutarato deshidrogenasa de bacterias de Enterobacteriaceae tales como bacterias de Pantoea, bacterias de Enterobacter, bacterias de Klebsiella y bacterias de Erwinia en las patentes estadounidenses n.os 6.197.559, 6.682.912, 6.331.419, 8.129.151 y el documento WO2008/075483. Los ejemplos espedficos de bacterias de Escherichia que tienen una actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa reducida o deficientes en la actividad de a- cetoglutarato deshidrogenasa incluyen las siguientes cepas.
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::Kmr es una cepa obtenida alterando el gen sucA que codifica a-cetoglutarato deshidrogenasa de E. coli W3110. Esta cepa es completamente deficiente en la actividad a-cetoglutarato deshidrogenasa.
Los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen bacterias de Pantoea, tales como la cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), cepa Pantoea ananatis SC17 (FERM BP-11091) y cepa Pantoea ananatis SC17(0) (VKPM B-9246). La cepa AJ13355 es una cepa aislada de tierra en Iwatashi, Shizuoka-ken, Japon como una cepa que puede proliferar en un medio de pH bajo que contiene acido L-glutamico y una fuente de carbono. La cepa SC17 es una cepa seleccionada como una cepa mutante poco productora de flema de la cepa AJ13355 (patente estadounidense n.° 6.596.517). Se deposito la cepa SC17 ante la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada, Depositario del Organismo Internacional de Patentes (actualmente agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 4 de febrero de 2009, y se le asigno el numero de registro de FERM BP-11091. Se deposito la cepa AJ13355 ante el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnologfa Humana, Agencia de Ciencia y Tecnologfa Industrial (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 19 de febrero de 1998 y se le asigno el numero de registro de FERM P-16644. Entonces, se convirtio el deposito en un deposito internacional con arreglo a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 11 de enero de 1999, y se le asigno el numero de registro de FERM BP-6614.
Ademas, los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen bacterias de Pantoea que tienen una actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa reducida o deficiente en la actividad a-cetoglutarato deshidrogenasa. Los ejemplos de tales cepas incluyen la cepa AJ13356 (patente estadounidense n.° 6.331.419), que es una cepa deficiente en el gen de la subunidad E1 de a-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA) de la AJ13355, y la cepa SC17sucA (patente estadounidense n.° 6.596.517), que es una cepa deficiente en el gen sucA de la cepa SC17. Se deposito la cepa AJ13356 ante el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnologfa Humana, Agencia de Ciencia y Tecnologfa Industrial (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 19 de febrero de 1998, y se le asigno el numero de registro de FERM P-16645. Entonces, se convirtio el deposito en un deposito internacional con arreglo a
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lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 11 de enero de 1999, y se le asigno el numero de registro de FERM BP- 6616. A la cepa SC17sucA se le asigno un numero privado de AJ417, y se deposito ante la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada, Depositario del Organismo Internacional de Patentes (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 26 de febrero de 2004, con el numero de registro de FERM BP-8646.
Se identifico la cepa AJ13355 como Enterobacter agglomerans cuando se aislo, pero se reclasifico recientemente como Pantoea ananatis basandose en la secuenciacion de nucleotidos de ARNr 16S y as^ sucesivamente. Por tanto, aunque las cepas AJ13355 y AJ13356 se depositan ante el depositario mencionado anteriormente como Enterobacter agglomerans, se denominan Pantoea ananatis en esta memoria descriptiva.
Ademas, los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen bacterias de Pantoea tales como la cepa Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, cepa Pantoea ananatis AJ13601, cepa Pantoea ananatis NP106 y cepa Pantoea ananatis NA1. Se obtuvo la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB introduciendo el plasmido RSFCPG que contiene el gen de citrato sintasa (gltA), gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) y gen de glutamato deshidrogenasa (gdhA) derivado de Escherichia coli, y el plasmido pSTVCB que contiene el gen de citrato sintasa (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum, en la cepa SC17sucA. La cepa AJ13601 es una cepa seleccionada de la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como una cepa resistente a una alta concentracion de acido L-glutamico a un pH bajo. Se obtuvo la cepa NP106 de la cepa AJ13601 curando los plasmidos RSFCPG y pSTVCB. Se deposito la cepa AJ13601 ante el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnologfa Humana, Agencia de Ciencia y Tecnologfa Industrial (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 18 de agosto de 1999, y se le asigno el numero de registro FERM P-17516. Entonces, se convirtio el deposito en un deposito internacional con arreglo a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 6 de julio de 2000, y se le asigno el numero de registro FERM BP-7207.
Los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas en las que tanto la actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA) como la actividad de succinato deshidrogenasa (sdh) se reducen o eliminan (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2010041920). Los ejemplos espedficos de tales cepas incluyen, por ejemplo, la cepa doble deficiente sucAsdhA de la cepa Pantoea ananatis NA1 (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2010-041920).
Los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas mutantes auxotroficas. Los ejemplos espedficos de cepas mutantes auxotroficas incluyen, por ejemplo, E. coli VL334thrC+ (VKPM B-8961, EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) es una cepa auxotrofica de L-isoleucina y L-treonina que tiene mutaciones en los genes thrC e ilvA (patente estadounidense n.° 4.278.765). E. coli VL334thrC+ es una bacteria productora de acido L-glutamico auxotrofica de L-isoleucina obtenida introduciendo un alelo de tipo natural del gen thrC en la cepa VL334. El alelo de tipo natural del gen thrC se introdujo mediante el metodo de transduccion general usando un bacteriofago P1 hecho crecer sobre las celulas de la cepa E. coli K-12 de tipo natural (VKPM B-7).
Los ejemplos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas que tienen resistencia a un analogo de acido aspartico. Tales cepas tambien pueden ser deficientes en la actividad a-cetoglutarato deshidrogenasa. Los ejemplos espedficos de cepas que tienen resistencia a un analogo de acido aspartico y deficientes en la actividad de a-cetoglutarato deshidrogenasa incluyen, por ejemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807, patente estadounidense n.° 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que adicionalmente tiene una capacidad de descomposicion de acido L-glutamico reducida (patente estadounidense n.° 5.393.671) y E. coli AJ13138 (FERM BP-5565, patente estadounidense n.° 6.110.714).
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de acido L-glutamico tambien incluyen un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la actividad de D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y/o la actividad de fructosa-6-fosfato fosfocetolasa se potencia(n) (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kohyo) n.° 2008-509661). O bien una de la actividad de D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa o bien la actividad de fructosa-6-fosfato fosfocetolasa puede potenciarse, o ambas pueden potenciarse. En esta memoria descriptiva, D- xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa y fructosa-6-fosfato fosfocetolasa pueden denominarse conjuntamente fosfocetolasa.
La actividad de D-xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa significa una actividad para convertir xilulosa-5-fosfato en gliceraldehndo-3-fosfato y acetil fosfato con consumo de acido fosforico para liberar una molecula de H2O. Esta actividad puede medirse mediante el metodo descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) o el metodo descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).
La actividad de fructosa-6-fosfato fosfocetolasa significa una actividad para convertir fructosa-6-fosfato en eritrosa-4- fosfato y acetil fosfato con consumo de acido fosforico para liberar una molecula de H2O. Esta actividad puede medirse mediante el metodo descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280, 1962) o el metodo descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).
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Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-glutamina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de potenciacion de la expresion del gen yhfK (documento WO2005/085419) o el gen ybjL (documento WO2008/133161), que es un gen de secrecion de acido L-glutamico.
<Bacterias productoras de L-glutamina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-glutamina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-glutamina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, glutamato deshidrogenasa (gdhA) y glutamina sintetasa (glnA). La actividad glutamina sintetasa tambien puede potenciarse mediante alteracion del gen de glutamina adenililtransferasa (glnE) o alteracion del gen de la protema de control PII (glnB) (documento EP 1229121).
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-glutamina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades reducidas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta de biosmtesis de L-glutamina para generar un compuesto distinto de L-glutamina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, glutaminasa.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de acido L-glutamico y cepas progenitoras para derivarlas incluyen una cepa que pertenece al genero Escherichia y que tiene una glutamina sintetasa mutante en la que el residuo de tirosina de la posicion 397 se reemplaza por otro residuo de aminoacido (solicitud publicada de patente estadounidense n.° 2003/0148474).
<Bacterias productoras de L-prolina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-prolina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-prolina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen glutamato-5-cinasa (proB), y-glutamilfosfato reductasa, y pirolina-5-carboxilato reductasa (putA). Para potenciar la actividad de una enzima de este tipo, por ejemplo, puede usarse preferiblemente el gen proB que codifica una glutamato cinasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante L-prolina (patente alemana n.° 3127361).
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-glutamina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad reducida de una enzima implicada en la descomposicion de L-prolina. Los ejemplos de una enzima de este tipo incluyen prolina deshidrogenasa y ornitina aminotransferasa.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-prolina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli NRRL B-12403 y NRRL B-12404 (patente britanica n.° 2075056), E. coli VKPM B-8012 (solicitud de patente rusa n.° 2000124295), cepas mutantes de plasmido de E. coli descritas en la patente alemana n.° 3127361, cepas mutantes de plasmido de E. coli descritas por Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34), cepa E. coli 702 (VKPM B-8011), que es una cepa resistente a 3,4-deshidroxiprolina y azetidina-2-carboxilato, y cepa E. coli 702ilvA (VKPM B-8012), que es una cepa deficiente en el gen ilvA de la cepa 702 (documento EP 1172433).
<Bacterias productoras de L-treonina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-treonina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-treonina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, aspartocinasa III (lysC), aspartato semialdehndo deshidrogenasa (asd), aspartocinasa I (thrA), homoserina cinasa (thrB), treonina sintasa (thrC), y aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa) (aspC). Entre estas enzimas, es preferible potenciar la actividad o actividades de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de aspartocinasa III, aspartato semialdehndo deshidrogenasa, aspartocinasa I, homoserina cinasa, aspartato aminotransferasa, y treonina sintasa. Cualquiera de los genes que codifican las enzimas de biosmtesis de L-treonina puede introducirse en una bacteria que tiene una capacidad reducida para descomponer treonina. Los ejemplos de una cepa de este tipo en la que se suprime la descomposicion de treonina incluyen, por ejemplo, la cepa E. coli TDH6, que es deficiente en la actividad treonina deshidrogenasa (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2001-346578).
Las actividades de las enzimas de biosmtesis de L-treonina se inhiben mediante el producto final, L-treonina. Por tanto, para construir cepas productoras de L-treonina, se prefiere que los genes de las enzimas de biosmtesis de L-
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treonina se modifiquen de modo que las enzimas se desensibilizan a inhibicion de retroalimentacion mediante L- treonina. Los genes thrA, thrB y thrC mencionados anteriormente constituyen el operon de treonina, que forma una estructura de atenuador. La expresion del operon de treonina se inhibe mediante isoleucina y treonina en el medio de cultivo y tambien se suprime mediante atenuacion. Por tanto, la expresion del operon de treonina puede potenciarse retirando la secuencia lfder o el atenuador en la region de atenuacion (remftase a Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, y Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (l987); documentos WO02/26993; WO2005/049808; y WO2003/097839).
El promotor nativo del operon de treonina esta presente en direccion 5' del operon de treonina, y puede reemplazarse por un promotor no nativo (remftase al documento WO98/04715). Ademas, el operon de treonina puede construirse de modo que los genes de biosmtesis de treonina se expresan bajo el control del represor y promotor de fago X (patente europea n.° 0593792). Ademas, tambien puede obtenerse una bacteria modificada de modo que se desensibiliza a inhibicion de retroalimentacion mediante L-treonina seleccionando una cepa resistente a acido a-amino-p-hidroxiisovalerico (AHV), que es un analogo de L-treonina.
Se prefiere que la cantidad de expresion del operon de treonina que se modifica para desensibilizarse a inhibicion de retroalimentacion mediante L-treonina tal como se describio anteriormente se aumente en un huesped aumentando el numero de copias del mismo o ligandolo a un promotor potente. El numero de copias puede aumentarse introduciendo un plasmido que contiene el operon de treonina en un huesped. El numero de copias puede aumentarse tambien transfiriendo el operon de treonina al genoma de un huesped usando un transposon, fago Mu, o similar.
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion L-treonina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de impartir resistencia a L-treonina a un huesped, y un metodo de impartir resistencia a L- homoserina a un huesped. Tal resistencia puede impartirse, por ejemplo, potenciando la expresion de un gen que imparte resistencia a L-treonina o un gen que imparte resistencia a L-homoserina. Los ejemplos de los genes que imparten la resistencia mencionada anteriormente incluyen el gen rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), gen rhtB (patente europea abierta a consulta por el publico n.° 0994190), gen rhtC (patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1013765), gen yfiK y gen yeaS (patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1016710). Como para los metodos para impartir resistencia a L-treonina a un huesped, puede hacerse referencia a los descritos en la patente europea abierta a consulta por el publico n.° 0994190 y el documento WO90/04636.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-treonina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996, patentes estadounidenses n.os 5.175.107 y 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081, patente estadounidense n.° 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (patente estadounidense n.° 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (patente estadounidense n.° 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 y FERM BP- 3520 (patente estadounidense n.° 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (en ruso), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 y VL2055 (documento EP 1149911 A) y E. coli VKPM B-5318 (documento EP 0593792 B).
La cepa VKPM B-3996 es una cepa obtenida introduciendo el plasmido pVIC40 en la cepa TDH-6. La cepa TDH-6 tiene capacidad de asimilacion de sacarosa y es deficiente en el gen thrC, y el gen ilvA del mismo tiene una mutacion parcial. Esta cepa VKPM B-3996 tambien tiene una mutacion en el gen rhtA, que imparte resistencia a alta concentracion de treonina u homoserina. El plasmido pVIC40 es un plasmido obtenido insertando el operon thrA*BC que contiene un gen thrA mutante que codifica una aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibicion de retroalimentacion mediante treonina y los genes thrBC de tipo natural en un vector derivado de RSF1010 (patente estadounidense n.° 5.705.371). Este gen thrA mutante codifica una aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa I que se desensibiliza sustancialmente a inhibicion de retroalimentacion mediante treonina. La cepa B-3996 se deposito el 19 de noviembre de 1987 en el All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscu, Rusia) con el numero de registro RIA 1867. Esta cepa tambien se deposito ante la Coleccion Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscu 117545, Rusia) el 7 de abril de 1987 con el numero de registro VKPM B-3996.
La cepa VKPM B-5318 es prototrofica con respecto a isoleucina, y alberga el plasmido pPRT614, que se corresponde con el plasmido pVIC40 del cual la region reguladora del operon de treonina se reemplaza por el represor Cl de fago X sensible a la temperatura y promotor PR. La cepa VKPM B-5318 se deposito ante la Coleccion Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscu 117545, Rusia) el 3 de mayo de 1990 con el numero de registro de VKPM B-5318.
Se ha dilucidado el gen thrA que codifica aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa I de E. coli (numeros de nucleotidos 337 a 2799, registro de GenBank nC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrA se ubica entre los genes thrL y thrB en el cromosoma de E. coli K-12. Se ha dilucidado el gen thrB que codifica homoserina cinasa de Escherichia coli (numeros de nucleotidos 2801 a 3733, registro de GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen de thrB se ubica entre los genes thrA y thrC en el cromosoma de E. coli K-12. Se ha dilucidado el gen thrC que codifica treonina sintasa de E. coli (numeros de nucleotidos 3734 a 5020, registro de GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrC se ubica entre el gen thrB y el marco de lectura abierto yaaX en el cromosoma de E. coli K-12. El operon thrA*BC que contiene un gen thrA mutante que codifica una aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa I resistente
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a inhibicion de retroalimentacion mediante treonina y los genes thrBC de tipo natural pueden obtenerse a partir del plasmido pVIC40 bien conocido, que esta presente en la cepa productora de treonina E. coli VKPM B-3996 (patente estadounidense n.° 5.705.371).
El gen rhtA de E. coli se ubica en 18 min en el cromosoma de E. coli proximo al operon glnHPQ, que codifica componentes del sistema de transporte de glutamina. El gen rhtA es identico a ORF1 (gen ybiF, numeros de nucleotidos 764 a 1651, numero de registro de GenBank AAA218541, gi:440181) y se ubica entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una protema codificada por el ORF1 se ha denominado gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). Tambien se ha revelado que la mutacion rhtA23 que imparte resistencia a alta concentracion de treonina u homoserina es una sustitucion de A por G en la posicion -1 con respecto al codon de inicio ATG (ABSTRACTS del 17° Congreso Internacional de Bioqmmica y Biologfa Molecular junto con el Encuentro Anual de la Sociedad Americana para Bioqmmica y Biologfa Molecular, San Francisco, California, 24-29 de agosto, 1997, n.° de resumen 457; documento EP 1013765 A).
El gen asd de E. coli ya se ha dilucidado (numeros de nucleotidos 3572511 a 3571408, registro de GenBank NC_000913.1, gi:16131307), y puede obtenerse mediante PCR (remttase a White, T.J., et al., Trends Genet, 5:185189, 1989) usando cebadores preparados basandose en la secuencia de nucleotidos del gen. Los genes asd de otros microorganismos tambien pueden obtenerse de manera similar.
El gen aspC de E. coli ya se ha dilucidado tambien (numeros de nucleotidos 983742 a 984932, registro de GenBank NC_000913.1, gi:16128895), y puede obtenerse mediante PCR usando cebadores preparados basandose en la secuencia de nucleotidos del gen. Los genes aspC de otros microorganismos tambien pueden obtenerse de manera similar.
<Bacterias productoras de L-lisina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-lisina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-lisina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, dihidrodipicolinato sintasa (dapA), aspartocinasa III (lysC), dihidrodipicolinato reductasa (dapB), diaminopimelato descarboxilasa (lysA), diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (patente estadounidense n.° 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), aspartato semialdetudo deshidrogenasa (asd), aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa) (aspC), diaminopimelato epimerasa (dapF), tetrahidrodipicolinato succinilasa (dapD), succinilo diaminopimelato deacilasa (dapE) y aspartasa (aspA) (documento EP 1253195 A). Es preferible potenciar la actividad o actividades de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de, por ejemplo, dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato descarboxilasa, diaminopimelato deshidrogenasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, diaminopimelato epimerasa, aspartato semialdetudo deshidrogenasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa, y succinilo diaminopimelato deacilasa, entre estas enzimas. Ademas, bacterias productoras de L-lisina y cepas progenitoras para derivarlas pueden expresar un nivel aumentado del gen implicado en la eficiencia energetica (cyo) (documento EP 1170376 A), el gen que codifica nicotinamida nucleotido transhidrogenasa (pntAB) (patente estadounidense n.° 5.830.716), el gen ybjE (documento WO2005/073390), o combinaciones de estos. Puesto que la aspartocinasa III (lysC) se somete a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina, un gen lysC mutante que codifica una aspartocinasa III desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina (patente estadounidense n.° 5.932.453) puede usarse para potenciar la actividad de esta enzima. Ademas, puesto que la dihidrodipicolinato sintasa (dapA) se somete a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina, un gen dapA mutante que codifica una dihidrodipicolinato sintasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina puede usarse para potenciar la actividad de esta enzima.
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-lisina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades reducidas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta biosintetica de L-lisina para generar un compuesto distinto de L-lisina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, homoserina deshidrogenasa, lisina descarboxilasa (patente estadounidense n.° 5.827.698) y enzima malica (documento WO2005/010175).
Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas mutantes que tienen resistencia a un analogo de L-lisina. Los analogos de L-lisina inhiben el crecimiento de bacterias tales como bacterias de la familia Enterobacteriaceae y bacterias corineformes, pero esta inhibicion se libera completa o parcialmente cuando L-lisina esta presente en el medio. Los ejemplos de estos analogos de L- lisina incluyen, pero no se limitan particularmente a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cistema (AEC), y- metil-lisina y a-clorocaprolactama. Pueden obtenerse cepas mutantes que tienen resistencia a estos analogos de lisina sometiendo una bacteria a un tratamiento de mutagenesis artificial convencional.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-lisina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, vease la patente estadounidense n.° 4.346.170) y E. coli VL611. En
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estas cepas, la aspartocinasa se desensibiliza a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina. Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-lisina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). La cepa AJIK01 se designo E. coli AJ111046, y se deposito ante la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes (n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, chiba-ken, 292-0818, Japon) el 29 de enero de 2013. Entonces, se convirtio en un deposito internacional con arreglo a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 15 de mayo de 2014, y se le asigno el numero de registro de NITE BP-01520.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-lisina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen la cepa E. coli WC196. La cepa WC196 se mejoro geneticamente impartiendo resistencia a AEC a la cepa W3110, que se derivo de E. coli K-12 (patente estadounidense n.° 5.827.698). La cepa WC196 se designo E. coli AJ13069 y se deposito ante el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnologfa Humana, Agencia de Ciencia y Tecnologfa Industrial (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, chiba-ken, 2920818, Japon) el 6 de diciembre de 1994 y se le asigno el numero de registro de FERM P-14690. Entonces, se convirtio el deposito en un deposito internacional con arreglo a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y se le asigno el numero de registro de FERM BP-5252 (patente estadounidense n.° 5.827.698).
Los ejemplos preferidos de bacterias productoras de L-lisina incluyen E. coli WC196AcadAAldc y E. coli WC196AcadAAldc/pCABD2 (documento WO2006/078039). La E. coli WC196AcadAAldc es una cepa construida a partir de la cepa WC196 alterando los genes cadA y ldcC que codifican lisina descarboxilasa. La cepa WC196AcadAAldc/pCABD2 se construyo introduciendo el plasmido pCABD2 que contiene genes de enzimas de biosmtesis de lisina (patente estadounidense n.° 6.040.160) en la cepa WC196AcadAAldc. La cepa WC196AcadAAldc, denominada AJ110692, se deposito ante la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada, Depositario del Organismo Internacional de Patentes (actualmente, agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Tecnologfa y Evaluacion, Depositario del Organismo Internacional de Patentes, n.° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japon) el 7 de octubre de 2008 como deposito internacional, y se le asigno el numero de registro de FERM BP-11027. El plasmido pCABD2 contiene un gen dapA mutante derivado de Escherichia coli y que codifica una dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) que tienen una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina, un gen lysC mutante derivado de Escherichia coli y que codifica aspartocinasa III que tiene una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion mediante L-lisina, el gen dapB derivado de Escherichia coli y que codifica dihidrodipicolinato reductasa, y el gen ddh derivado de Brevibacteria lactofermentum y que codifica diaminopimelato deshidrogenasa.
<Bacterias productoras de L-arginina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-arginina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-arginina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, N-acetilglutamato sintasa (argA), N- acetilglutamilo fosfato reductasa (argC), ornitina acetilo transferasa (argJ), N-acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), acetilornitina desacetilasa (argE), ornitina carbamoilo transferasa (argF), argininosuccinato sintetasa (argG), argininosuccinato liasa (argH) y carbamoilo fosfato sintetasa (carAB). Como gen de N-acetilglutamato sintasa (argA), por ejemplo, puede usarse preferiblemente un gen que codifica una N- acetilglutamato sintasa mutante desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante L-arginina por sustitucion para los residuos de aminoacido correspondientes a las posiciones 15 a 19 de la enzima de tipo natural (patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1170361).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-arginina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, la cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (solicitud publicada de patente estadounidense n.° 2002/058315A1), cepas derivadas de las mismas introducidas con el gen argA que codifica una N-acetilo glutamato sintasa mutante (solicitud de patente rusa n.° 2001112869, documento EP 1170361 A1), cepa E. coli 382 derivada de la cepa 237 y que tiene una capacidad de asimilacion de acido acetico mejorada (VKPM B-7926, documento EP 1170358 A1), y cepa E. coli 382ilvA+, que es una cepa obtenida de la cepa 382 introduciendo el gen ilvA de tipo natural a partir de la cepa E. coli K-12 de la misma. La cepa E. coli 237 se deposito ante la Coleccion Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscu 117545, Rusia) el 10 de abril de 2000 con el numero de registro de VKPM B-7925, y se convirtio el deposito en un deposito internacional con arreglo a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001. La cepa E. coli 382 se deposito ante la Coleccion Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscu 117545, Rusia) el 10 de abril de 2000 con el numero de registro de VKPM B-7926.
Los ejemplos de bacterias productoras de L-arginina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas que tienen resistencia a analogos de aminoacidos, y asf sucesivamente. Los ejemplos de tales cepas incluyen cepas
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mutantes de Escherichia coli que tienen resistencia a a-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil)-cistema, a-metilserina, p-2-tienilalanina, o sulfaguanidina (remftase a la patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 56-106598).
<Bacterias productoras de L-citrulina y bacterias productoras de L-ornitina>
Las rutas biosinteticas de L-citrulina y L-ornitina son comunes a las de L-arginina. Por tanto, puede impartirse o potenciarse una capacidad para producir L-citrulina y/o L-ornitina aumentando la actividad o actividades de N- acetilglutamato sintasa (argA), N-acetilglutamilo fosfato reductasa (argC), ornitina acetiltransferasa (argJ), N- acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD) y/o acetilornitina desacetilasa (argE) (documento WO2006/35831).
<Bacterias productoras de L-histidina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-histidina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-histidina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, ATP fosforibosiltransferasa (hisG), fosforibosilo AMP ciclohidrolasa (hisI), fosforibosil-ATP pirofosfohidrolasa (hisI), fosforibosilformimino-5- aminoimidazol carboxamida ribotido isomerasa (hisA), amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa (hisC), histidinol fosfatasa (hisB) e histidinol deshidrogenasa (hisD).
Entre estas enzimas, se sabe que las enzimas de biosmtesis de L-histidina codificadas por hisG y hisBHAFI se inhiben mediante L-histidina. Por tanto, la capacidad para producir L-histidina puede impartirse o potenciarse, por ejemplo, introduciendo una mutacion para conferir resistencia a inhibicion de retroalimentacion en el gen que codifica ATP fosforibosiltransferasa (hisG) (patentes rusas n.os 2003677 y 2119536).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-histidina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, cepas que pertenecen al genero Escherichia, tal como la cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU 2003677), E. coli NRRL B-12116 a B-12121 (patente estadounidense n.° 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) y H-9343 (FERM BP-6676, patente estadounidense n.° 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674, documento EP 1085087), E. coli AI80/pFM201 (patente estadounidense n.° 6.258.554), E. coli fErM P-5038 y FERM P-5048, que se han introducido con un vector que porta un ADN que codifica una enzima de biosmtesis de L-histidina (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 56-005099), cepas E. coli introducidas con un gen para el transporte de aminoacido (documento EP 1016710 A), y cepa E. coli 80, a las que se les ha importado resistencia a sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, y estreptomicina (VKPM B-7270, patente rusa n.° 2119536).
<Bacterias productoras de L-cistema>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-cistema incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-cistema. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, serina acetiltransferasa (cysE) y 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (serA). La actividad de serina acetiltransferasa puede potenciarse, por ejemplo, introduciendo un gen cysE mutante que codifica una serina acetiltransferasa mutante resistente a inhibicion de retroalimentacion mediante cistema en una bacteria. Una serina acetiltransferasa mutante de este tipo se divulga en, por ejemplo, la patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 11-155571 y solicitud publicada de patente estadounidense n.° 20050112731. Ademas, la actividad de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa puede potenciarse, por ejemplo, introduciendo un gen serA mutante que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa mutante resistente a inhibicion de retroalimentacion mediante serina en una bacteria. Una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa mutante de este tipo se divulga en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.180.373.
Ademas, los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-cistema tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades reducidas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta de biosmtesis de L-cistema para generar un compuesto distinto de L-cistema. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, por ejemplo, enzimas implicadas en la descomposicion de L-cistema. Los ejemplos de las enzimas implicadas en la descomposicion de L-cistema incluyen, pero no se limitan particularmente a, cistationina-p- liasa (metC, patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 11-155571; Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069), triptofanasa (tnaA, patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2003169668; Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 1211-1218), O-acetilserina sulfhidrilasa B (cysM, patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2005-245311), el producto genico malY (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2005-245311), y el producto genico d0191 de Pantoea ananatis (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2009-232844).
Ademas, los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-cistema tambien
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incluyen, por ejemplo, un metodo de potenciar el sistema excretor de L-cistema, y un metodo de potenciar el sistema de transporte de sulfato/tiosulfato. Los ejemplos de protemas del sistema excretor de L-cistema incluyen la protema codificada por el gen ydeD (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2002-233384), la protema codificada por el gen yfiK (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2004-49237), las protemas codificadas por los genes emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr y cusA (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2005-287333), y la protema codificada por el gen yeaS (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2010-187552). Los ejemplos de las protemas del sistema de transporte de sulfato/tiosulfato incluyen las protemas codificadas por la agrupacion genica cysPTWAM.
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-cistema y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli JM15 transformada con diferentes alelos de cysE que codifican serina acetiltransferasas resistentes a retroalimentacion (patente estadounidense n.° 6.218.168, solicitud de patente rusa 2003121601), E. coli W3110 que tienen un gen sobreexpresado que codifica una protema adecuada para la secrecion de una sustancia citotoxica (patente estadounidense n.° 5.972.663), cepas de E. coli que tienen una actividad de cistema desulfohidrasa reducida (documento JP11155571A2), y E. coli W3110 que tiene una actividad aumentada de un regulador de la transcripcion positivo por regulon de cistema codificado por el gen cysB (documento WO0127307A1).
<Bacterias productoras de L-metionina>
Los ejemplos de bacterias productoras de L-metionina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen cepas auxotroficas de L-treonina y cepas mutantes resistentes a norleucina (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2000-139471). Los ejemplos de bacterias productoras de L-metionina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen una cepa que contiene una homoserina transsuccinilasa mutante resistente a inhibicion de retroalimentacion mediante L-metionina (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2000139471, solicitud publicada de patente estadounidense n.° 20090029424). Puesto que la L-metionina se biosintetiza por medio de L-cistema como producto intermedio, la capacidad de produccion de L-metionina tambien puede mejorarse mejorando la capacidad de produccion de L-cistema (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2000-139471, solicitud publicada de patente estadounidense n.° 20080311632).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-metionina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli AJ11539 (NRRL B-12399), E. coli AJ11540 (NRRL B-12400), E. coli AJ11541 (NRRL B-12401), E. coli AJ11542 (NRRL B-12402, patente britanica n.° 2075055), la cepa E. coli 218 (VKPM B-8125, patente rusa n.° 2209248) y la cepa 73 (VKPM B-8126, patente rusa n.° 2215782), que son resistentes a norleucina, que es un analogo de L-metionina, y E. coli AJ13425 (FERMP-16808, patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2000-139471). La cepa AJ13425 es una cepa auxotrofica de L-treonina derivada de la E. coli W3110, en la que el represor de metionina se elimina, la actividad de S-adenosilmetionina sintetasa intracelular se atenua, y la actividad de homoserina transsuccinilasa intracelular, actividad de cistationina y-sintasa, y actividad de aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa II se potencian.
<Bacterias productoras de L-leucina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-leucina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-leucina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, las enzimas codificadas por los genes del operon leuABCD. Ademas, para potenciar la actividad de una enzima de este tipo, por ejemplo, puede usarse preferiblemente el gen leuA mutante que codifica una isopropil maleato sintasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante L-leucina (patente estadounidense n.° 6.403.342).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-leucina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, cepas que pertenecen al genero Escherichia, tales como cepas de E. coli resistentes a leucina (por ejemplo, la cepa 57 (VKPM B-7386, patente estadounidense n.° 6.124.121)), cepas de E. coli resistentes a un analogo de leucina tal como p-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina y 5,5,5-trifluoroleucina (publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 62-34397 y patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 8-70879), cepas de E. coli obtenidas mediante una tecnica de modificacion por ingeniena genetica descrita en el documento WO96/06926, y E. coli H-9068 (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 8-70879).
<Bacterias productoras de L-isoleucina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-isoleucina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene actividad o actividades aumentadas de una o mas enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-isoleucina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, treonina desaminasa y acido acetohidroxi sintasa (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2-458, FR 0356739, patente estadounidense n.° 5.998.178).
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Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-isoleucina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, bacterias de Escherichia tales como cepas mutantes que tienen resistencia a 6-dimetilaminopurina (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 5-304969), cepas mutantes que tienen resistencia a un analogo de isoleucina tal como hidroxamato de isoleucina y tiaisoleucina, y cepas mutantes que tienen resistencia a un analogo de isoleucina de este tipo y que tienen ademas resistencia a DL-etionina y/o hidroxamato de arginina (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 5-130882).
<Bacterias productoras de L-valina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-valina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-valina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, las enzimas codificadas por los genes del operon ilvGMEDA y las enzimas codificadas por el operon ilvBNC. El gen ilvBN codifica acido acetohidroxi sintasa, y el gen ilvC codifica isomerorreductasa (documento WO00/50624). Las expresiones del operon ilvGMEDA y el operon ilvBNC se suprimen (atenuan) mediante L-valina, L-isoleucina y/o L-leucina. Por tanto, para potenciar la actividad de una enzima de este tipo, se prefiere que la supresion de expresion mediante la L-valina producida se libere eliminando o modificando una region requerida para la atenuacion. Ademas, la treonina desaminasa codificada por el gen ilvA es una enzima que cataliza la reaccion de desaminacion de L-treonina que da como resultado acido 2-cetobutmco, que es la etapa limitante de la velocidad del sistema de biosmtesis de L-isoleucina. Por tanto, para la produccion de L- valina, se prefiere que el gen ilvA, por ejemplo, se altere, y de ese modo se disminuye la actividad de treonina desaminasa.
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-valina tambien incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades reducidas de uno o mas tipos de enzimas seleccionadas de las enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta de biosmtesis de L-valina para generar un compuesto distinto de L-valina. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, pero no se limitan particularmente a, treonina deshidratasa implicada en la smtesis de L-leucina, y las enzimas implicadas en la smtesis de acido D-pantotenico (documento WO00/50624).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-valina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, cepas de E. coli modificadas para sobreexpresar el operon ilvGMEDA (patente estadounidense n.° 5.998.178).
Los ejemplos de bacterias productoras de L-valina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas mutantes que tienen una mutacion en aminoacil ARNt sintetasa (patente estadounidense n.° 5.658.766). Los ejemplos de tales cepas incluyen, por ejemplo, E. coli VL1970, que tiene una mutacion en el gen ileS que codifica isoleucina ARNt sintetasa. Se deposito E. coli VL1970 ante la Coleccion Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, 1 Dorozhny Proezd, 1 Moscu 117545, Rusia) el 24 de junio de 1988 con el numero de registro de VKPM B-4411. Los ejemplos de bacterias productoras de L-valina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen cepas mutantes que requieren acido lipoico para el crecimiento y/o que carecen de H+-ATPasa (documento WO96/06926).
<Bacterias productoras de L-triptofano, bacterias productoras de L-fenilalanina y bacterias productoras de L-tirosina>
Los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-triptofano, capacidad de produccion de L-fenilalanina y/o capacidad de produccion de L-tirosina incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de una o mas enzimas seleccionadas de las enzimas de biosmtesis de L-triptofano, L-fenilalanina y/o L-tirosina.
Los ejemplos de enzimas comunes a los sistemas de biosmtesis de estos aminoacidos aromaticos incluyen, pero no se limitan particularmente a, 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato sintasa (aroG), 3-deshidroquinato sintasa (aroB), shikimato deshidrogenasa (aroE), shikimato cinasa (aroL), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (aroA) y corismato sintasa (aroC) (patente europea n.° 763127). Las expresiones de los genes que codifican estas enzimas se controlan mediante el represor de tirosina (tyrR), y las actividades de estas enzimas pueden potenciarse delecionando el gen tyrR (patente europea n.° 763127).
Los ejemplos de las enzimas de biosmtesis de L-triptofano incluyen, pero no se limitan particularmente a, antranilato sintasa (trpE), triptofano sintasa (trpAB) y fosfoglicerato deshidrogenasa (serA). Por ejemplo, introduciendo un ADN que codifica el operon de triptofano, puede impartirse o potenciarse la capacidad de produccion de L-triptofano. Triptofano sintasa consiste en las subunidades a y p codificadas por los genes trpA y trpB, respectivamente. Puesto que la antranilato sintasa se somete a inhibicion de retroalimentacion mediante L-triptofano, puede usarse un gen que codifica esta enzima introducido con una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion para potenciar la actividad de esa enzima. Puesto que la fosfoglicerato deshidrogenasa se somete a inhibicion de retroalimentacion mediante L-serina, puede usarse un gen que codifica esta enzima introducida con una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion para potenciar la actividad de esa enzima. Ademas,
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aumentando la expresion del operon (operon ace) que consiste en el gen de maleato sintasa (aceB), gen de isocitrato liasa (aceA) y gen de isocitrato deshidrogenasa cinasa/fosfatasa (aceK), puede impartirse o potenciarse la capacidad de produccion de L-triptofano (documento WO2005/103275).
Los ejemplos de las enzimas de biosmtesis de L-fenilalanina incluyen, pero no se limitan particularmente a, corismato mutasa y prefenato deshidratasa. La corismato mutasa y prefenato deshidratasa se codifican mediante el gen pheA como enzima bifuncional. Puesto que la corismato mutasa y prefenato deshidratasa se someten a inhibicion de retroalimentacion mediante L-fenilalanina, los genes que codifican estas enzimas introducidos con una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion pueden usarse para potenciar las actividades de estas enzimas.
Los ejemplos de las enzimas de biosmtesis de L-tirosina incluyen, pero no se limitan particularmente a, corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa. La corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa se codifican mediante el gen tyrA como enzima bifuncional. Puesto que la corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa se someten a inhibicion de retroalimentacion mediante L-tirosina, pueden usarse genes que codifican estas enzimas introducidos con una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion para potenciar las actividades de estas enzimas.
Las bacterias productoras de L-triptofano, L-fenilalanina y/o L-tirosina pueden modificarse de modo que se reduce la biosmtesis de un aminoacido aromatico distinto del aminoacido aromatico objetivo. Ademas, las bacterias productoras de L-triptofano, L-fenilalanina y/o L-tirosina pueden modificarse de modo que se potencia un sistema de captacion de subproducto. Los ejemplos del subproducto incluyen aminoacidos aromaticos distintos del aminoacido aromatico objetivo. Los ejemplos del gen que codifica un sistema de captacion de subproducto de este tipo incluyen, por ejemplo, tnaB y mtr, que son genes que codifican el sistema de captacion de L-triptofano, pheP, que es un gen que codifica el sistema de captacion de L-fenilalanina, y tyrP, que es un gen que codifica el sistema de captacion de L-tirosina (documento EP 1484410).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-triptofano y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli Jp4735/pMU3028 (DSM10122) y JP6015/pMU91 (DSM10123), que tienen un gen trpS mutante que codifica una triptofanil-ARNt sintetasa parcialmente inactivada (patente estadounidense n.° 5.756.345), E. coli SV164, que tiene un alelo trpE que codifica una antranilato sintasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante triptofano, E. coli SV164 (pGH5), que tiene un alelo serA que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante serina y un alelo trpE que codifica una antranilato sintasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante triptofano (patente estadounidense n.° 6.180.373), una cepa introducida con un operon de triptofano que contiene un alelo trpE que codifica una antranilato sintasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion mediante triptofano (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.os 57-71397 y 62-244382, patente estadounidense n.° 4.371.614), E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) y AGx6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), que son deficientes en triptofanasa (patente estadounidense n.° 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, que tiene una capacidad de produccion de fosfoenolpiruvato aumentada (documento WO97/08333, patente estadounidense n.° 6.319.696), y cepas que pertenecen al genero Escherichia que tienen una actividad aumentada de la protema codificada por el gen yedA o yddG (solicitudes publicadas de patente estadounidense 2003/0148473 A1 y 2003/0157667 A1).
Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-fenilalanina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen, por ejemplo, E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), que es deficiente en la corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa y el represor de tirosina (documento WO03/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371), que contiene un gen pheA34 mutante que codifica una corismato mutasa-prefenato deshidratasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion (patente estadounidense n.° 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, nRrL B-12146 y NRRL B-12147 (patente estadounidense n.° 4.407.952). Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L-fenilalanina y cepas progenitoras para derivarlas tambien incluyen, por ejemplo, E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAB> (FERM BP-3566), E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAD> (FERM BP-12659), E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHATerm> (FERM BP-12662), y E. coli K-12 AJ12604 <W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB> (FERM BP-3579), que contiene un gen que codifica una corismato mutasa-prefenato deshidratasa desensibilizada a inhibicion de retroalimentacion (documento EP 488424 B1). Los ejemplos espedficos de bacterias productoras de L- fenilalanina y cepas progenitoras para derivarlas incluyen ademas, por ejemplo, cepas que pertenecen al genero Escherichia que tienen una actividad aumentada de la protema codificada por el gen yedA o el gen yddG (solicitudes publicadas de patente estadounidense n.os 2003/0148473 y 2003/0157667, documento WO03/044192).
Ademas, los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-aminoacido incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad aumentada para secretar un L-aminoacido de una celula bacteriana. Una actividad de este tipo para secretar un L-aminoacido puede aumentarse, por ejemplo, aumentando la expresion de un gen que codifica una protema responsable para la secrecion del L-aminoacido. Los ejemplos de genes que codifican las protemas responsables para la secrecion de diversos aminoacidos incluyen, por ejemplo, gen b2682 (ygaZ), gen b2683 (ygaH), gen b1242 (ychE) y gen b3434 (yhgN) (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2002-300874).
Ademas, los ejemplos de metodos para impartir o potenciar una capacidad de produccion de L-aminoacido tambien
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incluyen, por ejemplo, un metodo de modificacion de una bacteria de modo que la bacteria tiene una actividad o actividades aumentadas de una o mas protemas seleccionadas de protemas implicadas en el glicometabolismo y protemas implicadas en el metabolismo energetico.
Los ejemplos de las protemas implicadas en el glicometabolismo incluyen protemas implicadas en la captacion de sacaridos y las enzimas del sistema de glicolisis. Los ejemplos de genes que codifican una protema implicada en el glicometabolismo incluyen el gen de glucosa-6-fosfato isomerasa (pgi, documento WO01/02542), gen de fosfoenolpiruvato sintasa (pps, patente europea abierta a consulta por el publico n.° 877090), gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc, documento WO95/06114), gen de piruvato carboxilasa (pyc, documento WO99/18228, patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1092776), gen de fosfoglucomutasa (pgm, documento WO03/04598), gen de fructosa bisfosfato aldolasa (pfkB, fbp, documento WO03/04664), gen de piruvato cinasa (pykF, documento WO03/008609), gen de transaldolasa (talB, documento WO03/008611), gen de fumarasa (fum, documento WO01/02545), gen de captacion de sacarosa no PTS (csc, patente europea abierta a consulta por el publico n.° 149911), y gen de asimilacion de sacarosa (operon scrAB, documento WO90/04636).
Los ejemplos de genes que codifican las protemas implicadas en el metabolismo energetico incluyen el gen de transhidrogenasa (pntAB, patente estadounidense n.° 5.830.716) y gen de citocromo tipo bo oxidasa (cyoB, patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1070376).
Los genes usados para la mejora genetica de las bacterias productoras de L-aminoacidos mencionados anteriormente no se limitan a los genes ejemplificados anteriormente y genes que tienen una secuencia de nucleotidos conocida, y pueden ser una variante de los mismos, siempre que se mantenga su funcion original. Por ejemplo, los genes usados para la mejora genetica de las bacterias productoras de L-aminoacidos pueden ser un gen que codifica una protema que tiene una secuencia de aminoacidos de una protema conocida, pero que incluye sustitucion, delecion, insercion o adicion de uno o varios residuos de aminoacido en una o varias posiciones. Para las variantes de genes y protemas, pueden aplicarse las descripciones para variantes de los genes acpP y fabF, y las protemas codificadas de ese modo mencionadas a continuacion, mutatis mutandis.
<1-2> Atenuacion del operon acpP-fabF
La bacteria de la presente divulgacion se ha modificado de modo que el operon acpP-fabF se atenua. El operon acpP-fabF participa en la biosmtesis de acido graso (documento no de patente 1). Por tanto, se asume que cuando se realiza cultivo de produccion de L-aminoacido usando una bacteria en la que el operon acpP-fabF se ha atenuado, se disminuye la entrada de una fuente de carbono en la ruta de biosmtesis de acido graso, y como resultado, puede usarse fuente de carbono excedente y poder de reduccion excedente para la produccion de L- aminoacido para mejorar de ese modo la produccion de L-aminoacido, en comparacion con cuando se realiza cultivo de produccion de L-aminoacido usando una cepa no modificada. La bacteria de la presente divulgacion puede obtenerse modificando una bacteria que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido de modo que el operon acpP-fabF se atenua. Ademas, la bacteria de la presente divulgacion tambien puede obtenerse modificando una bacteria de modo que el operon acpP-fabF se atenua, y despues impartiendo una capacidad de produccion de L- aminoacido a la bacteria o potenciando una capacidad de produccion de L-aminoacido de la bacteria. La bacteria de la presente divulgacion tambien puede ser una bacteria que ha adquirido una capacidad de produccion de L- aminoacido modificandose de modo que el operon acpP-fabF se atenua. Las modificaciones para construir la bacteria de la presente divulgacion pueden realizarse en un orden arbitrario.
La expresion que “el operon acpP-fabF se atenua” significa que la actividad de una protema codificada por un gen del operon acpP-fabF se reduce, y/o que la expresion de un gen del operon acpP-fabF se reduce. La expresion que “la expresion de un gen se reduce” significa que la cantidad de transcripcion del gen (la cantidad de ARNm) se reduce, y/o que la cantidad de traduccion del gen (la cantidad de la protema) se reduce. El “gen del operon acpP- fabF’ significa el gen acpP y/o el gen fabF. Es decir, la “protema codificada por un gen del operon acpP-fabF’ se refiere a una protema codificada por el gen fabF y/o una protema codificada por el gen acpP, es decir, protema AcpP y/o protema FabF. La actividad de una protema puede reducirse, por ejemplo, atenuando la expresion de un gen que codifica la protema, o alterando un gen que codifica la protema, tal como se describe a continuacion. Es decir, la expresion que “el operon acpP-fabF se atenua” tambien puede significar que, por ejemplo, la expresion de un gen del operon acpP-fabF se atenua. En la presente invencion, por ejemplo, la expresion de o bien uno o bien ambos del gen acpP y el gen fabF puede atenuarse. Es decir, la expresion de todo el operon acpP-fabF puede atenuarse tambien.
El gen acpP es un gen que codifica la protema portadora de acilo (ACP). “ACP” es una protema que tiene una funcion de union con una cadena de acido graso por medio del grupo 4’-fosfopantetema, y que porta de ese modo la cadena de acido graso en el momento de biosmtesis de acido graso. Esta funcion tambien se denomina “actividad de ACP”. ACP se traduce como una apo-ACP inactiva, entonces se anade 4’-fosfopantetema como cofactor al residuo de serina de la posicion 36 (en el caso de Escherichia coli) de apo-ACP mediante la ACP sintasa, y apo-ACP se convierte de ese modo en holo-ACP activa.
El gen fabF es un gen que codifica p-cetoacil-ACP sintasa II. La “P-cetoacil-ACP sintasa II” se refiere a una enzima
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que cataliza la reaccion que genera una 3-oxoacil-ACP (numero de carbono = n + 2) a partir de una acil-ACP (numero de carbono = n) y malonil-ACP (EC 2.3.1.41). La actividad de catalizar esta reaccion tambien se denomina “actividad de p-cetoacil-ACP sintasa II”.
El gen acpP de la cepa Escherichia coli K-12 MG1655 se corresponde con la secuencia de las posiciones 1150838 a 1151074 en la secuencia genomica registrada en la base de datos de NCBI como registro de GenBank NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990). El gen acpP de la cepa MG1655 es sinonimo con ECK1080 y JW1080. Ademas, la protema AcpP de la cepa MG1655 se registra como registro de GenBank NP_415612 (version NP_415612.1 GI: 16129057, locus_tag”b1094”).
El gen fabF de la cepa de Escherichia coli K-12 MG1655 se corresponde con la secuencia de las posiciones 1151162 a 1152403 en la secuencia genomica registrada en la base de datos de NCBI como registro de GenBank NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990). El gen fabF de la cepa MG1655 es sinonimo con ECK1081 y JW1081. Ademas, la protema FabF de la cepa MG1655 se registra como registro de GenBank NP_415613 (version NP_415613.1 GI: 16129058, locus_tag”b1095”).
La secuencia de nucleotidos del operon acpP-fabF (que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo) de la cepa MG1655 se muestra como SEQ ID NO: 7. En SEQ ID NO: 7, la secuencia de nucleotidos del gen acpP se corresponde con las posiciones 211 a 447, y la secuencia de nucleotidos del gen fabF se corresponde con las posiciones 535 a 1776. Ademas, las secuencias de aminoacidos de la protema AcpP y protema FabF de la cepa MG1655 se muestran como SEQ ID NO: 8 y 9, respectivamente.
El gen acpP de la cepa Pantoea ananatis AJ13355 se corresponde con la secuencia de las posiciones 986154 a 986528 en la secuencia genomica registrada en la base de datos de NCBI como registro de GenBank NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI: 386014600). Ademas, la protema AcpP de la cepa AJ13355 se registra como registro de GenBank YP_005933706 (version YP_005933706.1 GI: 386015425).
El gen fabF de la cepa Pantoea ananatis AJ13355 se corresponde con la secuencia de las posiciones 986650 a 987855 en la secuencia genomica registrada en la base de datos de NCBI como registro de GenBank NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI: 386014600). Ademas, la protema FabF de la cepa AJ13355 se registra como registro de GenBank YP_005933707 (version YP_005933707.1 GI: 386015426).
La secuencia de nucleotidos del operon acpP-fabF (que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo) de la cepa AJ13355 se muestra como SEQ ID NO: 10. En SeQ ID NO: 10, la secuencia de nucleotidos del gen acpP se corresponde con las posiciones 211 a 585, y la secuencia de nucleotidos del gen fabF se corresponde con las posiciones 707 a 1912. Ademas, las secuencias de aminoacidos de la protema AcpP y la protema FabF de la cepa AJ13355 se muestran como SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente.
La protema AcpP o protema FabF puede ser una variante de la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente, siempre que se mantenga la funcion original de cada protema. De manera similar, el gen acpP o gen fabF puede ser una variante del gen acpP gene o gen fabF mencionados anteriormente, siempre que se mantenga la funcion original de cada gen. Una variante de este tipo de la cual la funcion original se mantiene tambien puede denominarse “variante conservadora”. El termino “protema AcpP” o “protema FabF” no se limita a la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente, sino que tambien incluye variantes conservadoras de las mismas. De manera similar, el termino “gen acpP’’ o “gen fabF' no se limita al gen acpP o gen fabF mencionado anteriormente, sino que tambien incluye variantes conservadoras de los mismos. Los ejemplos de una variante conservadora de este tipo incluyen, por ejemplo, variantes homologas y artificialmente modificadas de la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente, o del gen acpP o gen fabF mencionado anteriormente.
La expresion que “la funcion original de la protema se mantiene” significa que una variante de la protema o el gen tiene una funcion (es decir, actividad o propiedad) correspondiente a la funcion (es decir, actividad o propiedad) de la protema original o el gen original. Concretamente, por ejemplo, la expresion que “la funcion original de la protema se mantiene” usada para la protema AcpP significa que la protema tiene la actividad de ACP, y la expresion que “la funcion original de la protema se mantiene” usada para la protema FabF significa que la protema tiene la actividad de p-cetoacil-ACP sintasa II. Ademas, por ejemplo, la expresion que “la funcion original del gen se mantiene” usada para el gen acpP significa que el gen que codifica una protema que tiene la actividad de ACP, y la expresion que “la funcion original del gen se mantenga” usada para el gen fabF significa que el gen codifica una protema que tiene la actividad de p-cetoacil-ACP sintasa II.
Un gen que codifica un homologo de la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente se obtiene facilmente a partir de una base de datos publica mediante, por ejemplo, busqueda BLAST o busqueda FASTA usando cualquiera de las secuencias de nucleotidos mencionadas anteriormente del gen acpP o gen fabF como una secuencia de consulta. Ademas, un gen que codifica un homologo de la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente puede obtenerse mediante, por ejemplo, PCR usando el cromosoma de un organismo tal como una bacteria como molde, y oligonucleotidos preparados basandose en una secuencia genica conocida de los mismos como cebadores.
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El gen acpP o gen fabF puede ser un gen que codifica una variante conservadora de la protema AcpP o protema FabF mencionada anteriormente. Por ejemplo, el gen acpP o gen fabF puede ser, por ejemplo, un gen que codifica una protema que tiene cualquiera de las secuencias de aminoacidos mencionadas anteriormente (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8, 9, 11 o 12) que incluyen sustitucion, delecion, insercion o adicion de uno o varios residuos de aminoacido en una o varias posiciones, siempre que codifique para una protema que tiene la funcion original. En tal caso, puede mantenerse habitualmente el 70 % o mas, preferiblemente el 80 % o mas, mas preferiblemente el 90 % o mas, de la actividad correspondiente de la protema (es decir la actividad de ACP o la actividad de p-cetoacil-ACP sintasa II) con respecto a la protema que no incluye adicion, delecion, insercion o adicion de uno o varios residuos de aminoacido. Aunque el numero de “uno o varios” puede diferir segun las posiciones de residuos de aminoacido en la estructura tridimensional de la protema o tipos de residuos de aminoacido, espedficamente, es de 1 a 50, de 1 a 40, o de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 20, mas preferiblemente de 1 a 10, todavfa mas preferiblemente de 1 a 5, de manera particularmente preferible de 1 a 3.
La sustitucion, delecion, insercion o adicion mencionada anteriormente de uno o varios residuos de aminoacido es una mutacion conservadora que mantiene la funcion normal de la protema. Ejemplos tfpicos de la mutacion conservadora son sustituciones conservadoras. La sustitucion conservadora es una mutacion en la que tiene lugar una sustitucion mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitucion es un aminoacido aromatico; entre Leu, Ile y Val, si es un aminoacido hidrofobo; entre Gln y Asn, si es un aminoacido polar; entre Lys, Arg e His, si es un aminoacido basico; entre Asp y Glu, si es un aminoacido acido; y entre Ser y Thr, si es un aminoacido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos de sustituciones consideradas sustituciones conservadoras incluyen, espedficamente, sustitucion de Ser o Thr por Ala, sustitucion de Gln, His o Lys por Arg, sustitucion de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, sustitucion de Asn, Glu o Gln por Asp, sustitucion de Ser o Ala por Cys, sustitucion de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, sustitucion de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, sustitucion de Pro por Gly, sustitucion de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, sustitucion de Leu, Met, Val o Phe por Ile, sustitucion de Ile, Met, Val o Phe por Leu, sustitucion de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, sustitucion de Ile, Leu, Val o Phe por Met, sustitucion de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, sustitucion de Thr o Ala por Ser, sustitucion de Ser o Ala por Thr, sustitucion de Phe o Tyr por Trp, sustitucion de His, Phe o Trp por Tyr, y sustitucion de Met, Ile o Leu por Val. Ademas, tal sustitucion, delecion, insercion, adicion, inversion, o similar de residuos de aminoacido tal como se menciono anteriormente incluye una mutacion que se produce de manera natural debido a una diferencia individual, o una diferencia de especies del organismo a partir del cual se deriva el gen (mutante o variante).
Ademas, el gen que tiene una mutacion conservadora de este tipo tal como se menciono anteriormente puede ser un gen que codifica una protema que muestra una homologfa del 80 % o mas, preferiblemente del 90 % o mas, mas preferiblemente del 95 % o mas, todavfa mas preferiblemente del 97 % o mas, de manera particularmente preferible del 99 % o mas, con respecto a la secuencia de aminoacidos total de cualquiera de las secuencias de aminoacidos mencionadas anteriormente, y que tiene la funcion original. En esta memoria descriptiva, “homologfa” significa “identidad”.
Ademas, el gen acpP o gen fabF puede ser un ADN que es capaz de hibridarse con un sonda que puede prepararse a partir de una secuencia genica conocida, tal como una secuencia complementaria a la totalidad o una parte de cualquiera de las secuencias de nucleotidos mencionadas anteriormente (por ejemplo, secuencias de nucleotidos de las posiciones 211 a 447 de SEQ ID NO: 7, las posiciones 535 a 1776 de SeQ ID NO: 7, las posiciones 211 a 585 de SEQ ID NO: 10, o las posiciones 707 a 1912 de SEQ ID NO: 10), en condiciones rigurosas, y codifica una protema que tiene la funcion original. Ademas, el operon acpP-fabF puede ser un ADN que es capaz de hibridarse con un sonda que puede prepararse a partir de una secuencia genica conocida, tal como una secuencia complementaria a la totalidad o una parte de cualquiera de las secuencias de nucleotidos mencionadas anteriormente (por ejemplo, secuencia de nucleotidos total de SEQ ID NO: 7, secuencia de nucleotidos de las posiciones 211 a 1776 de SEQ ID NO: 7, secuencia de nucleotidos total de SEQ ID NO: 10, o secuencia de nucleotidos de las posiciones 211 a 1912 de SEQ ID NO: 10), en condiciones rigurosas, y codifica una protema que tiene la funcion original. Las “condiciones rigurosas” se refieren a condiciones en las que se forma un denominado Idbrido espedfico, y no se forma un Idbrido inespedfico. Los ejemplos de las condiciones rigurosas incluyen aquellas en las que ADN muy homologos se hibridan entre sf, por ejemplo, ADN de no menos del 80 % homologos, preferiblemente no menos del 90 % homologos, mas preferiblemente no menos del 95 % homologos, todavfa mas preferiblemente no menos del 97 % homologos, de manera particularmente preferible no menos del 99 % homologos, se hibridan entre sf, y ADN menos homologos que los anteriores no se hibridan entre sf, o condiciones de lavado de hibridacion de tipo Southern tfpica, es decir, condiciones de lavado una vez, preferiblemente 2 o 3 veces, a una concentracion de sal y temperatura correspondiente a 1 x SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C, preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C, mas preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % a 68 °C.
Tal como se describio anteriormente, la sonda usada para la hibridacion mencionada anteriormente puede ser parte de una secuencia que es complementaria al gen mencionado anteriormente. Puede prepararse una sonda de este tipo mediante PCR usando oligonucleotidos preparados basandose en una secuencia genica conocida como cebadores y un fragmento de ADN que contiene cualquiera de las secuencias de nucleotidos como molde. Como sonda, por ejemplo, puede usarse un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb. Cuando se usa un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb como sonda, las
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condiciones de lavado de la hibridacion pueden ser, por ejemplo, 50 °C, 2 x SSC y SDS al 0,1 %.
Ademas, en el gen acpP o gen fabF, puede reemplazarse un codon arbitrario por un codon equivalente, siempre que el gen codifique para una protema que tiene la funcion original. Por ejemplo, el gen acpP o gen fabF puede modificarse de modo que tiene codones optimos segun frecuencias de codones observadas en un huesped que va a usarse.
Las descripciones anteriores que se refieren a variantes de los genes y protemas tambien pueden aplicarse mutatis mutandis a unas protemas arbitrarias tales como enzimas de biosmtesis de L-aminoacidos y genes que codifican las mismas.
<1-3> Metodo para reducir la actividad de una protema
A continuacion, se explicaran metodos para reducir la actividad de una protema tal como la protema AcpP y la protema FabF.
La expresion “la actividad de una protema se reduce” significa que la actividad de la protema por celula se disminuye en comparacion con la de una cepa no modificada tal como una cepa de tipo natural o cepa progenitora, e incluye un estado en el que la actividad ha desaparecido completamente. Espedficamente, la expresion “la actividad de una protema se reduce” significa que el numero de moleculas de la protema por celula se reduce, y/o la funcion de cada molecula de la protema se reduce en comparacion con la de una cepa no modificada. Es decir, el termino “actividad” en la expresion “la actividad de una protema se reduce” no se limita a la actividad catalttica de la protema, sino que puede significar la cantidad de transcripcion de un gen (la cantidad de ARNm) que codifica la protema o la cantidad de traduccion de la protema (la cantidad de la protema). El estado que “el numero de moleculas de la protema por celula se reduce” incluye un estado en el que la protema no existe para nada. El estado que “la funcion de cada molecula de la protema se reduce” incluye un estado en el que la funcion de cada molecula de protema desaparece completamente. Aunque el grado de reduccion en la actividad de una protema no esta particularmente limitado siempre que la actividad se reduzca en comparacion con la de una cepa no modificada, puede reducirse hasta, por ejemplo, el 90 % o menos, el 80 % o menos, el 70 % o menos, el 60 % o menos, el 55 % o menos, el 50 % o menos, el 30 % o menos, el 20 % o menos, el 10 % o menos, el 5 % o menos, o el 0 % de la de una cepa no modificada.
La modificacion para reducir la actividad de una protema puede lograrse, por ejemplo, reduciendo la expresion de un gen que codifica la protema. El estado que “la expresion de un gen se reduce” incluye un estado en el que el gen no se expresa para nada. El estado que “la expresion de un gen se reduce” tambien se denomina “la expresion de un gen se atenua”. La expresion de un gen puede reducirse hasta el 90 % o menos, el 80 % o menos, el 70 % o menos, el 60 % o menos, el 55 % o menos, el 50 % o menos, el 30 % o menos, el 20 % o menos, el 10 % o menos, el 5 % o menos, o el 0 % de la de una cepa no modificada.
Ademas, se sabe que, por ejemplo, en E. coli, el gen acpP es indispensable (esencial). Por tanto, cuando la actividad de la protema AcpP se reduce, la actividad de la protema AcpP se hace permanecer hasta tal medida que, cuando la bacteria de la presente divulgacion se cultiva en un medio, la bacteria de la presente divulgacion puede proliferar, y se produzca un L-aminoacido objetivo. Es decir, la actividad de la protema AcpP no se reducira hasta el 0 % de la de una cepa no modificada. Por ejemplo, puede permanecer el 1 % o mas, el 5 % o mas, el 10 % o mas, el 15 % o mas, el 17 % o mas, el 20 % o mas, el 30 % o mas, o el 50 % o mas de la actividad de la protema AcpP en comparacion con la de una cepa no modificada. Espedficamente, la actividad de la protema AcpP tambien puede reducirse hasta, por ejemplo, del 1 % al 90 %, del 5 % al 80 %, del 10 % al 70 %, del 15 % al 60 %, o del 17 % al 55 % de la de una cepa no modificada. Ademas, la cantidad de expresion del gen acpP no se reducira hasta el 0 % de la de una cepa no modificada. Por ejemplo, puede permanecer el 1 % o mas, el 5 % o mas, el 10 % o mas, el 15 % o mas, el 17 % o mas, el 20 % o mas, el 30 % o mas, o el 50 % o mas de la cantidad de expresion del gen acpP en comparacion con la de una cepa no modificada. Espedficamente, la cantidad de expresion del gen acpP tambien puede reducirse hasta, por ejemplo, del 1 % al 90 %, del 5 % al 80 %, del 10 % al 70 %, del 15 % al 60 %, o del 17 % al 55 % de la de una cepa no modificada. Tales descripciones que se refieren al caso en el que la actividad de la protema AcpP se reduce tambien pueden aplicarse mutatis mutandis a un caso en el que la actividad de la protema FabF se reduce.
La reduccion en la expresion genica puede deberse a, por ejemplo, una reduccion en la eficacia de transcripcion, una reduccion en la eficacia de traduccion, o una combinacion de las mismas. La expresion de un gen puede reducirse modificando una secuencia de control de la expresion del gen tal como un promotor, secuencia Shine- Dalgarno (SD) (tambien denominado sitio de union a ribosomas (RBS)), y una region espaciadora entre RBS y el codon de inicio. Se sabe que la protema AcpP es una protema abundante en las celulas, y por tanto, se sugiere que promotor de tipo natural del gen acpP muestra una alta actividad (documento no de patente 1). Por tanto, la expresion del gen acpP puede reducirse, por ejemplo, reemplazando un promotor de tipo natural del gen acpP por un promotor que muestra una actividad mas debil. Los ejemplos del promotor que muestra una actividad mas debil que la del promotor de tipo natural del gen acpP incluyen, por ejemplo, el promotor lac y promotor Ptac84 divulgados en la solicitud de patente rusa publicada n.° 2006/134574. Cuando se modifica una secuencia de control de la expresion, preferiblemente uno o mas nucleotidos, mas preferiblemente dos o mas nucleotidos, de manera
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particularmente preferible tres o mas nucleotidos, de la secuencia de control de la expresion se modifican. Ademas, puede delecionarse una parte o la totalidad de una secuencia de control de la expresion. La expresion de un gen tambien puede reducirse, por ejemplo, manipulando un factor responsable del control de la expresion. Los ejemplos del factor responsable del control de expresion incluyen moleculas pequenas responsables del control de la transcripcion o la traduccion (inductores, inhibidores, etc.), protemas responsables del control de la transcripcion o la traduccion (factores de transcripcion etc.), acidos nucleicos responsables del control de la transcripcion o la traduccion (ARNip etc.), y asf sucesivamente. Ademas, la expresion de un gen tambien puede reducirse, por ejemplo, introduciendo una mutacion que reduce la expresion del gen en la region codificante del gen. Por ejemplo, la expresion de un gen puede reducirse reemplazando un codon en la region codificante del gen por un codon sinonimo usado con menor frecuencia en un huesped. Ademas, por ejemplo, la expresion genica en sf puede reducirse mediante alteracion de un gen tal como se describe a continuacion.
El gen acpP y el gen fabF se transcriben conjuntamente como el operon acpP-fabF. El gen fabF tambien se transcribe independientemente con su propio promotor. Ademas, el gen acpP tambien puede transcribirse conjuntamente a partir del gen fabD y el gen fabG en la agrupacion genica yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF. Por tanto, por ejemplo, modificando el promotor que controla la cotranscripcion del operon acpP-fabF, puede reducirse la expresion total del gen acpP y gen fabF. Alternativamente, por ejemplo, modificando el propio promotor del gen fabF, la expresion del gen fabF puede reducirse independientemente. Ademas, por ejemplo, modificando el promotor del gen fabD y/o el fabG, la expresion del gen acpP puede reducirse junto con la expresion del gen fabD y/o el gen fabG. Ademas, por ejemplo, introduciendo una mutacion que reduce la expresion de un gen en la region codificante del gen acpP y/o el gen fabF, la expresion del gen acpP y/o el gen fabF puede reducirse.
Ademas, los ejemplos espedficos de la mutacion que reduce la expresion el gen acpP y/o el gen fabF incluyen, por ejemplo, una mutacion tal que la citosina (C) en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se reemplaza por otra base. La otra base es preferiblemente adenina (A).
La “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’’ a la que se hace referencia anteriormente significa la posicion 34.a en el lado en direccion 5' contada desde A del codon de inicio (ATG) del gen acpP en la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7. La posicion de A del codon de inicio (ATG) se corresponde con la posicion +1, y la posicion al lado de esa posicion en el lado en direccion 5' es la posicion -1. Es decir, la “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’ significa una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ iD NO: 7 (concretamente, la posicion 1150804 de la secuencia genomica de la cepa Escherichia coli K-12 MG1655 registrada como registro de GenBank NC_000913). La “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’ representa una posicion relativa basandose en la secuencia de SEQ ID NO: 7, y la posicion absoluta puede desplazarse hacia delante o hacia atras debido a delecion, insercion, adicion, o similar de uno o mas nucleotidos. Es decir, cuando un nucleotido se deleciona en la secuencia de SEQ ID NO: 7 entre el nucleotido de la posicion 177 y A del codon de inicio, la “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’ significa la posicion 33.a en el lado en direccion 5' contada desde A del codon de inicio del gen acpP. Cuando se inserta un nucleotido en la secuencia de SEQ ID NO: 7 entre el nucleotido de la posicion 177 y A del codon de inicio, la “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’ significa la posicion 35.a en el lado en direccion 5' contada desde A del codon de inicio del gen acpP.
Que nucleotido se corresponde con el nucleotido de la “posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP’ puede determinarse en el operon acpP-fabF de una bacteria arbitraria, por ejemplo, alineando la secuencia en direccion 5' del gen acpP de la bacteria y la secuencia en direccion 5' del gen acpP mostrada como SEQ ID NO: 7. Tal alineacion puede realizarse, por ejemplo, usando software de analisis genico conocido. Los ejemplos espedficos de tal software incluyen DNASIS producido por Hitachi Solutions, GENETYX producido por Genetyx, y asf sucesivamente (Elizabet C. Tiler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).
La modificacion para reducir la actividad de una protema tambien puede lograrse, por ejemplo, alterando un gen que codifica la protema. La alteracion de un gen puede lograrse, por ejemplo, delecionando una parte o la totalidad de la region codificante del gen en un cromosoma. Ademas, puede delecionarse la totalidad de un gen que incluye secuencias en direccion 5' y en direccion 3' del gen en un cromosoma. La region que va a delecionarse puede ser cualquier region tal como una region de extremo N-terminal, una region interna, o una region de extremo C-terminal, siempre que la actividad de la protema pueda reducirse. La delecion de una region mas larga puede, habitualmente, inactivar mas ciertamente el gen. Ademas, se prefiere que los marcos de lectura de las secuencias en direccion 5' y aguas debajo de la region que va a delecionarse no sean iguales.
La alteracion de un gen tambien puede lograrse, por ejemplo, introduciendo una mutacion para una sustitucion de aminoacidos (mutacion de sentido alterado), un codon de terminacion (mutacion sin sentido), una mutacion de desplazamiento de marco que anade o deleciona uno o dos residuos de nucleotido, o similar en la region codificante del gen en un cromosoma (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).
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La alteracion de un gen tambien puede lograrse, por ejemplo, insertando otra secuencia en una region codificante del gen en un cromosoma. El sitio de la insercion puede estar en cualquier region del gen, y la insercion de una region mas larga puede, habitualmente, inactivar mas ciertamente el gen. Se prefiere que los marcos de lectura de las secuencias en direccion 5' y en direccion 3' del sitio de insercion no sean iguales. La otra secuencia no esta particularmente limitada siempre que se elija un secuencia que reduce o elimina la actividad de la protema codificada, y los ejemplos de la misma incluyen, por ejemplo, un gen marcador tal como genes de resistencia a antibioticos, y un gen util para la produccion de la sustancia objetivo.
Tal modificacion de un gen en un cromosoma tal como se describio anteriormente puede lograrse, por ejemplo, preparando un gen de tipo deficiente en el que una secuencia parcial del gen se elimina de modo que no puede producir una protema que funciona normalmente, y transformando un huesped con un ADN recombinante que contiene el gen de tipo deficiente para provocar la recombinacion de homologos entre el gen de tipo deficiente y el gen de tipo natural en un cromosoma y sustituir de ese modo el gen de tipo deficiente por el gen de tipo natural en el cromosoma. En este procedimiento, si esta contenido un gen marcador seleccionado segun las caractensticas del huesped tal como auxotroffa en el ADN recombinante, la operacion se vuelve sencilla. La protema codificada por el gen de tipo deficiente tiene una conformacion diferente de la de la protema de tipo natural, incluso si se produce, y por tanto la funcion del mismo se reduce o se elimina. Tal alteracion genica basada en la sustitucion de genes usando recombinacion de homologos ya se ha establecido, y existen metodos de uso de un ADN lineal tal como un metodo denominado “integracion impulsada por Red (Red driven integration)’’ (Datsenko, K.A, y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), y un metodo que usa la integracion impulsada por Red en combinacion con un sistema de escision derivado de fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (remftase al documento WO2005/010175), un metodo de uso de un plasmido que tiene un origen de replicacion sensible a la temperatura, un metodo de uso de un plasmido capaz de transferencia conjugativa, un metodo de uso de un vector suicida que no tiene un origen de replicacion que funciona en un huesped (patente estadounidense n.° 6.303.383, patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 05-007491), y asf sucesivamente.
La modificacion para reducir la actividad de una protema tambien puede lograrse, por ejemplo, mediante un tratamiento de mutagenesis. Los ejemplos del tratamiento de mutagenesis incluyen irradiacion de rayos X, irradiacion ultravioleta, y un tratamiento con un agente de mutacion tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo (MMS).
Cuando una protema funciona como un complejo que consiste en una pluralidad de subunidades, puede modificarse una parte o la totalidad de la pluralidad de subunidades, siempre que la actividad de la protema se reduzca eventualmente. Es decir, por ejemplo, puede alterarse una parte o la totalidad de una pluralidad de genes que codifican las subunidades respectivas o similar. Ademas, cuando hay una pluralidad de isozimas de una protema, puede reducirse una parte o la totalidad de las actividades de la pluralidad de isozimas, siempre que la actividad de la protema se reduzca eventualmente. Es decir, por ejemplo, puede alterarse una parte o la totalidad de una pluralidad de genes que codifican las isozimas respectivas o similar.
Puede confirmarse una reduccion en la actividad de una protema midiendo la actividad de la protema.
Tambien puede confirmarse una reduccion en la actividad de una protema confirmando una reduccion en la expresion de un gen que codifica la protema. Puede confirmarse una reduccion en la expresion de un gen confirmando una reduccion en la cantidad de transcripcion del gen o una reduccion en la cantidad de la protema expresada del gen.
Puede confirmarse una reduccion en la cantidad de transcripcion de un gen comparando la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la observada en una cepa no modificada. Los ejemplos del metodo para evaluar la cantidad de ARNm incluyen hibridacion de tipo Northern, RT-PCR, y asf sucesivamente (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE. UU.), 2001). La cantidad de ARNm puede disminuirse hasta, por ejemplo, el 90 % o menos, el 80 % o menos, el 70 % o menos, el 60 % o menos, el 55 % o menos, el 50 % o menos, el 30 % o menos, el 20 % o menos, el 10 % o menos, el 5 % o menos, o el 0 %, de la observada en una cepa no modificada. Sin embargo, la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen acpP no se reducira hasta el 0 % de la de una cepa no modificada. Por ejemplo, cuando la expresion del gen acpP se reduce, el 1 % o mas, el 5 % o mas, el 10 % o mas, el 15 % o mas, el 17 % o mas, el 20 % o mas, el 30 % o mas, o el 50 % o mas de la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen tambien puede permanecer en comparacion con la observada en una cepa no modificada. Espedficamente, cuando la expresion del gen acpP se reduce, la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen acpP puede reducirse hasta, por ejemplo, del 1 % al 90 %, del 5 % al 80 %, del 10 % al 70 %, del 15 % al 60 %, o del 17 % al 55 % de la de una cepa no modificada.
Puede confirmarse una reduccion en la cantidad de una protema mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE. UU.) 2001). La cantidad de la protema puede disminuirse hasta, por ejemplo, el 90 % o menos, el 80 % o menos, el 70 % o menos, el 60 % o menos, el 55 % o menos, el 50 % o menos, el 30 % o menos, el 20 % o menos, el 10 % o menos, el 5 % o menos, o el 0 %, de la observada en una cepa no modificada. Sin embargo, la cantidad de la protema AcpP
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no se reducira hasta el 0 % de la de una cepa no modificada. Por ejemplo, cuando la expresion del gen acpP se reduce, el 1 % o mas, el 5 % o mas, el 10 % o mas, el 15 % o mas, el 17 % o mas, el 20 % o mas, el 30 % o mas, o el 50 % o mas de la cantidad de la protema AcpP tambien puede permanecer en comparacion con la observada en una cepa no modificada. Espedficamente, cuando la expresion del gen acpP se reduce, la cantidad de la protema AcpP puede reducirse hasta, por ejemplo, del 1 % al 90 %, del 5 % al 80 %, del 10 % al 70 %, del 15 % al 60 %, o del 17 % al 55 % de la de una cepa no modificada.
La alteracion de un gen puede confirmarse determinando la secuencia de nucleotidos de una parte o la totalidad del gen, mapa enzimatico de restriccion, longitud completa, o similar del gen segun los medios usados para la alteracion.
Los metodos mencionados anteriormente para reducir la actividad de una protema pueden aplicarse a, ademas de la atenuacion del operon acpP-fabF, reduccion en la actividad de una protema arbitraria tal como enzimas que catalizan una reaccion que se ramifica de la ruta biosintetica de un L-aminoacido objetivo para generar un compuesto distinto del L-aminoacido objetivo, y reduccion en la expresion de un gen arbitrario tal como genes que codifican esas protemas arbitrarias.
<1-4> Metodos para aumentar la actividad de una protema
A continuacion, se explicaran metodos para aumentar la actividad de una protema.
La expresion “la actividad de una protema se aumenta” significa que la actividad de la protema por celula se aumenta en comparacion con la de una cepa no modificada tal como una cepa de tipo natural y cepa progenitora. El estado que “la actividad de una protema se aumenta” tambien se expresa como “la actividad de una protema se potencia”. Espedficamente, la expresion “la actividad de una protema se aumenta” significa que el numero de moleculas de la protema por celula se aumenta, y/o la funcion de cada molecula de la protema se aumenta en comparacion con las de una cepa no modificada. Es decir, el termino “actividad” en la expresion “la actividad de una protema se aumenta” no se limita a la actividad catalttica de la protema, sino que puede significar la cantidad de transcripcion de un gen (la cantidad de ARNm) que codifica la protema, o la cantidad de traduccion del gen (la cantidad de la protema). Ademas, el estado que “la actividad de una protema se aumenta” incluye no o un estado en el que la actividad de una protema objetivo se aumenta en una cepa que tiene de manera inherente la actividad de la protema objetivo, sino tambien un estado en el que la actividad de una protema objetivo se imparte a una cepa que no tiene de manera inherente la actividad de la protema objetivo. Ademas, siempre que la actividad de la protema se aumente eventualmente, la actividad de la protema objetivo contenida de manera inherente en un huesped puede reducirse o eliminarse, y entonces puede impartirse un tipo apropiado de la protema a la misma.
Aunque el grado del aumento en la actividad de una protema no esta particularmente limitado siempre que la actividad de la protema se aumente en comparacion con una cepa no modificada, la actividad de la protema puede aumentarse, por ejemplo, 1,5 veces o mas, 2 veces o mas, o 3 veces o mas, en comparacion con la de una cepa no modificada. Ademas, cuando la cepa no modificada no tiene la actividad de la protema objetivo, es suficiente que la protema se produzca introduciendo el gen que codifica la protema, y por ejemplo, la protema puede producirse hasta tal grado que actividad enzimatica puede medirse.
La modificacion que aumenta la actividad de una protema se logra, por ejemplo, aumentando la expresion de un gen que codifica la protema. El estado que “la expresion de un gen se aumenta” tambien se denomina “la expresion de un gen se potencia”. La expresion de un gen puede aumentarse 1,5 veces o mas, 2 veces o mas, o 3 veces o mas, en comparacion con la observada en una cepa no modificada. Ademas, el estado que “la expresion de un gen se aumenta” incluye no o un estado en el que la cantidad de expresion de un gen diana se aumenta en una cepa que expresa de manera inherente el gen diana, sino tambien un estado en el que el gen se introduce en una cepa que no expresa de manera inherente el gen diana, y se expresa en la misma. Es decir, la frase “la expresion de un gen se aumenta” tambien significa, por ejemplo, que el gen diana se introduce en una cepa que no tiene el gen, y se expresa en la misma.
La expresion de un gen puede aumentarse, por ejemplo, aumentando el numero de copias del gen.
El numero de copias de un gen puede aumentarse introduciendo el gen en el cromosoma de un huesped. Un gen puede introducirse en un cromosoma, por ejemplo, usando recombinacion de homologos (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Puede introducirse o una copia, o dos o mas copias de un gen. Por ejemplo, realizando recombinacion de homologos usando una secuencia que esta presente en multiples copias en un cromosoma como diana, pueden introducirse multiples copias de un gen en el cromosoma. Los ejemplos de una secuencia de este tipo que esta presente en multiples copias en un cromosoma incluyen ADN repetitivos, y repeticiones invertidas ubicadas en ambos extremos de un transposon. Alternativamente, puede realizarse recombinacion de homologos usando una secuencia apropiada en un cromosoma tal como un gen innecesario para la produccion de la sustancia objetivo como diana. Puede realizarse recombinacion de homologos mediante, por ejemplo, un metodo de uso de un ADN lineal tal como integracion impulsada por Red (Datsenko, K.A., y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), un metodo de uso de un plasmido que tiene un
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origen de replicacion sensible a la temperatura, un metodo de uso de un plasmido capaz de transferencia conjugativa, un metodo de uso de un vector suicida que no tiene un origen de replicacion que funciona en un huesped, o un metodo de transduccion usando un fago. Ademas, tambien puede introducirse aleatoriamente un gen en un cromosoma usando un transposon o Mini-Mu (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2109985, patente estadounidense n.° 5.882.888, documento EP 805867 B1).
La introduccion de un gen diana en un cromosoma puede confirmarse mediante hibridacion de tipo Southern usando un sonda que tiene una secuencia complementaria a todo el gen o una parte del mismo, PCR usando cebadores preparados basandose en la secuencia del gen, o similar.
Ademas, el numero de copias de un gen tambien puede aumentarse introduciendo un vector que contiene el gen en un huesped. Por ejemplo, el numero de copias de un gen diana puede aumentarse ligando un fragmento de ADN que contiene el gen diana con un vector que funciona en un huesped para construir un vector de expresion del gen, y transformando el huesped con el vector de expresion. El fragmento de ADN que incluye el gen diana puede obtenerse mediante, por ejemplo, PCR usando el ADN genomico de un microorganismo que tiene el gen diana como molde. Como vector, puede usarse un vector replicable de manera autonoma en la celula del huesped. El vector es preferiblemente un vector multicopia. Ademas, el vector tiene preferiblemente un marcador tal como un gen de resistencia a antibioticos para la seleccion de un transformante. Ademas, el vector puede tener un promotor y/o terminador para expresar el gen introducido. El vector puede ser, por ejemplo, un vector derivado de un plasmido bacteriano, un vector derivado de un plasmido de levadura, un vector derivado de un bacteriofago, cosmido, fagomido, o similar. Los ejemplos espedficos de vector replicable de manera autonoma en bacterias que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae tales como Escherichia coli incluyen, por ejemplo, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (todos estos estan disponibles de Takara Bio), pACYC184, pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), vectores de la serie pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), vectores de la serie pET (Novagen), vectores de la serie pQE (QIAGEN), y vector de amplia variedad de huespedes RSF1010.
Cuando se introduce un gen, es suficiente que el gen este expresamente albergado por la bacteria de la presente divulgacion. Espedficamente, es suficiente que el gen se introduzca de modo que se expresa bajo el control mediante una secuencia de promotor que funciona en la bacteria de la presente divulgacion. El promotor puede ser un promotor derivado del huesped, o un promotor heterogeneo. El promotor puede ser el promotor nativo del gen que va a introducirse, o un promotor de otro gen. Como promotor, por ejemplo, tambien puede usarse un promotor mas fuerte de este tipo tal como se menciona a continuacion. Ademas, por ejemplo, puede ubicarse un terminador para la terminacion de la transcripcion genica en direccion 3' del gen. El terminador no esta particularmente limitado siempre que funcione en la bacteria de la presente divulgacion. El terminador puede ser un terminador derivado del huesped, o un terminado heterogeneo. El terminador puede ser el terminador nativo del gen que va a introducirse, o un terminador de otro gen. Los ejemplos espedficos de terminador incluyen, por ejemplo, terminador T7, terminador T4, terminador de fago fd, terminador tet y terminador trpA. Se divulgan en detalle vectores, promotores y terminadores disponibles en diversos microorganismos en “Fundamental Microbiology vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987”, y pueden usarse.
Ademas, cuando se introducen dos o mas de genes, es suficiente que los genes esten expresamente albergados cada uno por la bacteria de la presente divulgacion. Por ejemplo, todos los genes pueden llevarse por un unico vector de expresion o cromosoma. Ademas, los genes pueden llevarse por separado por dos o mas vectores de expresion, o llevarse por separado por un unico o dos o mas vectores de expresion y un cromosoma. Tambien puede usarse un operon constituido por dos o mas genes.
El gen que va a introducirse no esta particularmente limitado siempre que codifique para una protema que funciona en el huesped. El gen que va a introducirse puede ser un gen derivado del huesped, o puede ser un gen heterogeneo. El gen que va a introducirse puede obtenerse mediante, por ejemplo, PCR usando cebadores disenados basandose en la secuencia de nucleotidos del gen y el ADN genomico de un organismo que tiene el gen o un plasmido que porta el gen como molde. El gen que va a introducirse tambien puede sintetizarse totalmente, por ejemplo, basandose en la secuencia de nucleotidos del gen (Gene, 60(1), 115-127 (1987)).
Ademas, cuando una protema funciona como un complejo que consiste en una pluralidad de subunidades, puede modificarse una parte o la totalidad de la pluralidad de subunidades, siempre que la actividad de la protema se aumente eventualmente. Es decir, por ejemplo, cuando la actividad de una protema se aumenta aumentando la expresion de un gen, la expresion de una parte o la totalidad de la pluralidad de genes que codifican las subunidades puede potenciarse. Es habitualmente preferible potenciar la expresion de toda la pluralidad de genes que codifican las subunidades. Ademas, las subunidades que constituyen el complejo pueden derivarse de un unico tipo de organismo o dos o mas tipos de organismos, siempre que el complejo tenga una funcion de la protema objetivo. Es decir, por ejemplo, pueden introducirse genes del mismo organismo que codifica una pluralidad de subunidades en un huesped, o pueden introducirse genes de organismos diferentes que codifican una pluralidad de subunidades en un huesped.
Ademas, la expresion de un gen puede aumentarse mejorando la eficacia de transcripcion del gen. La eficacia de transcripcion de un gen puede mejorarse, por ejemplo, reemplazando el promotor del gen en un cromosoma por un
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promotor mas fuerte. El “promotor mas fuerte” significa un promotor que proporciona una transcripcion mejorada de un gen en comparacion con un promotor de tipo natural que existe de manera inherente del gen. Los ejemplos de promotores mas fuertes incluyen, por ejemplo, los promotores de alta expresion conocidos tales como promotor T7, promotor trp, promotor lac, promotor tac, promotor thr, promotor trc, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor PR y promotor PL. Ademas, como promotor mas fuerte, tambien puede obtenerse un tipo muy activo de un promotor existente usando diversos genes indicadores. Por ejemplo, haciendo que las regiones -35 y -10 en una region de promotor esten mas proximas a la secuencia de consenso, la actividad del promotor puede potenciarse (documento WO00/18935). Los ejemplos de promotor de tipo muy activo incluyen diversos promotores similares a tac (Katashkina JI et al., solicitud de patente de la Federacion Rusa n.° 2006134574) y promotor pnlp8 (documento WO2010/027045). Se describen metodos para evaluar la fuerza de promotores y ejemplos de promotores fuertes en el artmulo de Goldstein et al. (Prokaryotic Promotors in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), y asf sucesivamente.
Ademas, la expresion de un gen tambien puede aumentarse mejorando la eficacia de traduccion del gen. La eficacia de traduccion de un gen puede mejorarse, por ejemplo, reemplazando la secuencia Shine-Dalgarno (SD) (tambien denominada sitio de union a ribosomas (RBS)) por el gen en un cromosoma con una secuencia SD mas fuerte. La “secuencia SD mas fuerte” significa una secuencia SD que proporciona una traduccion mejorada de ARNm en comparacion con la secuencia SD de tipo natural que existe de manera inherente del gen. Los ejemplos de secuencia SD mas fuertes incluyen, por ejemplo, RBS del gen 10 derivado de fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Ademas, se sabe que la sustitucion, insercion, o delecion de varios nucleotidos en una region espaciadora entre RBS y el codon de inicio, especialmente en una secuencia inmediatamente en direccion 5' del codon de inicio (5'-UTR), afecta significativamente a la estabilidad y eficacia de traduccion de ARNm, y por tanto, la eficacia de traduccion de un gen tambien puede mejorase modificandolas.
En la presente invencion, sitios que afectan a la expresion genica, tales como un promotor, secuencia SD y region espaciadora entre RBS y el codon de inicio, tambien se denominan conjuntamente “region de control de la expresion”. Una region de control de la expresion puede identificarse usando un software de busqueda de vector de promotor o analisis genico tal como GENETYX. Una region de control de la expresion de este tipo puede modificarse mediante, por ejemplo, un metodo de uso de un vector sensible a la temperatura o el metodo de integracion impulsada por Red (documento WO2005/010175).
La eficacia de traduccion de un gen tambien puede mejorarse, por ejemplo, modificando codones. En Escherichia coli etc., existe un sesgo de codon claro entre los 61 codones de aminoacidos encontrados dentro de la poblacion de moleculas de ARNm, y el nivel de ARNt relacionado aparece directamente proporcional a la frecuencia de uso de codon (Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6 (5), 494-500 (1995)). Es decir, si hay una gran cantidad de ARNm que contiene una cantidad en exceso de codones raros, puede surgir un problema de traduccion. Segun las ultimas investigaciones, se sugiere que agrupaciones de codones AGG/AGA, CUA, AUA, CGA o CCC puedan reducir especialmente tanto la cantidad como la calidad de una protema sintetizada. Se produce un problema de este tipo especialmente en el momento de expresion de un gen heterologo. Por tanto, en el caso de expresion heterogenea de un gen o similar, la eficacia de traduccion del gen puede mejorarse reemplazando un codon raro presente en el gen con un codon sinonimo usado con mayor frecuencia. Los codones pueden reemplazarse por, por ejemplo, el metodo de mutacion espedfica del sitio para introducir una mutacion objetivo en un sitio objetivo de ADN. Los ejemplos del metodo de mutacion espedfica del sitio incluyen el metodo que usa PCR (Higuchi, R., 61, en PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Met. in Enzymol., 154, 382 (1987)), y el metodo que usa fago (Kramer, W. y Frits, H.J., Met. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Met. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternativamente, puede sintetizarse totalmente un fragmento genico en el que codones objetivos se reemplazan. Se divulgan las frecuencias de codones en diversos organismos en la “base de datos de uso de codones” (
http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
Ademas, la expresion de un gen tambien puede aumentarse amplificando un regulador que aumenta la expresion del gen, o delecionando o atenuando un regulador que reduce la expresion del gen.
Tales metodos para aumentar la expresion genica tal como se menciono anteriormente pueden usarse independientemente o en una combinacion arbitraria.
Ademas, la modificacion que aumenta la actividad de una protema tambien puede lograrse, por ejemplo, potenciando la actividad espedfica de la enzima. La potenciacion de la actividad espedfica tambien incluye reduccion o eliminacion de inhibicion de retroalimentacion. Puede obtenerse una protema que muestra una actividad espedfica potenciada, por ejemplo, buscando diversos organismos. Ademas, un tipo muy activo de una protema existente tambien puede obtenerse introduciendo una mutacion en la protema existente. La mutacion que va a introducirse puede ser, por ejemplo, sustitucion, delecion, insercion o adicion de uno o varios residuos de aminoacido en una o varias posiciones de la protema. La mutacion puede introducirse mediante, por ejemplo, un metodo de mutacion espedfica del sitio de este tipo tal como se menciono anteriormente. La mutacion tambien puede introducirse mediante, por ejemplo, un tratamiento de mutagenesis. Los ejemplos del tratamiento de mutagenesis incluyen irradiacion de rayos X, irradiacion de ultravioleta, y un tratamiento con un agente de mutacion tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS) y metanosulfonato de metilo
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(MMS). Ademas, puede inducirse una mutacion aleatoria tratando directamente ADN in vitro con hidroxilamina. La potenciacion de la actividad espedfica puede usarse independientemente, o puede usarse en una combinacion arbitraria con tales metodos para potenciar la expresion genica tal como se menciono anteriormente.
El metodo para la transformacion no esta particularmente limitado, y pueden usarse metodos convencionalmente conocidos. Puede usarse, por ejemplo, un metodo de tratamiento de celulas receptoras con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad de las mismas para ADN, que se ha notificado para la cepa Escherichia coli K-12 (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162), y un metodo de preparacion de celulas competentes a partir de celulas que estan en la fase de crecimiento, seguido por transformacion con ADN, que se ha notificado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1977, 1:153-167). Alternativamente, tambien puede usarse un metodo de elaborar celulas receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos, que puede tomar facilmente ADN recombinante, seguido por introducir un ADN recombinante en las celulas receptoras de ADN, que se sabe que es aplicable a Bacillus subtilis, actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933). Ademas, tambien puede usarse el metodo de pulso electrico notificado para bacterias corineformes (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2207791).
Un aumento en la actividad de una protema puede confirmarse midiendo la actividad de la protema.
Un aumento en la actividad de una protema tambien puede confirmarse confirmando un aumento en la expresion de un gen que codifica la protema. Un aumento en la expresion de un gen puede confirmarse confirmando un aumento en la cantidad de transcripcion del gen, o confirmando un aumento en la cantidad de una protema expresada del gen.
Un aumento de la cantidad de transcripcion de un gen puede confirmarse comparando la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la observada en una cepa no modificada tal como una cepa de tipo natural o cepa progenitora. Los ejemplos del metodo para evaluar la cantidad de ARNm incluyen hibridacion de tipo Northern, RT- PCR, y asf sucesivamente (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/tercera edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE. UU.), 2001). La cantidad de ARNm puede aumentar, por ejemplo, 1,5 veces o mas, 2 veces o mas, o 3 veces o mas, en comparacion con la de una cepa no modificada.
Un aumento en la cantidad de una protema puede confirmarse mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE. UU.), 2001). La cantidad de la protema puede aumentar, por ejemplo, 1,5 veces o mas, 2 veces o mas, o 3 veces o mas, en comparacion con la de una cepa no modificada.
Los metodos mencionados anteriormente para aumentar la actividad de una protema pueden aplicarse a la potenciacion de la actividad de una protema arbitraria tal como enzimas de biosmtesis de L-aminoacido, y potenciacion de la expresion de un gen arbitrario tal como genes que codifican las protemas arbitrarias.
<2> Metodo para producir L-aminoacido de la presente invencion
El metodo de la presente invencion es un metodo para producir un L-aminoacido que comprende cultivar la bacteria de la presente divulgacion en un medio para producir y acumular el L-aminoacido en el medio o celulas de la bacteria, y recoger el L-aminoacido del medio o las celulas tal como se especifica mediante las reivindicaciones. En la presente invencion, puede producirse un unico tipo de L-aminoacido, o pueden producirse dos o mas tipos de L- aminoacidos.
El medio que va a usarse no esta particularmente limitado, siempre que la bacteria de la presente divulgacion pueda proliferar en el, y puede producirse un L-aminoacido objetivo. Como medio, por ejemplo, puede usarse un medio habitual usado para cultivo de microorganismos tales como bacterias. El medio puede contener una fuente de carbono, fuente de nitrogeno, fuente de fosforo y fuente de azufre, asf como componentes seleccionados de otros diversos componentes organicos y componentes inorganicos, segun se requiera. Los tipos y concentraciones de los componentes del medio pueden establecerse adecuadamente segun diversas condiciones tales como el tipo de la bacteria que va a usarse, y el tipo del L-aminoacido que va a producirse.
La fuente de carbono no esta particularmente limitada, siempre que la bacteria de la presente divulgacion pueda utilizar la fuente de carbono elegida y producir un L-aminoacido. Los ejemplos espedficos de la fuente de carbono incluyen, por ejemplo, sacaridos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, galactosa, xilosa, arabinosa, melaza negra, hidrolisados de almidon e hidrolisados de biomasa, acidos organicos tales como acido acetico, acido fumarico, acido dtrico, acido succmico y acido malico, alcoholes tales como glicerol, glicerol en bruto y etanol, y acidos grasos. Como fuente de carbono, puede usarse un unico tipo de fuente de carbono, o pueden usarse dos o mas tipos de fuentes de carbono en combinacion.
La concentracion de la fuente de carbono en el medio no esta particularmente limitada, siempre que la bacteria de la
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presente divulgacion pueda proliferar, y se produzca un L-aminoacido. Es preferible hacer la concentracion de la fuente de carbono en el medio lo mas alta posible en tal intervalo que la produccion de L-aminoacido no se inhiba. La concentracion inicial de la fuente de carbono en el medio puede estar habitualmente en el intervalo del 5 al 30 % (p/v), preferiblemente del 10 al 20 % (p/v). Ademas, segun el consumo de la fuente de carbono que acompana el avance de la fermentacion, la fuente de carbono puede anadirse de manera complementaria.
Los ejemplos espedficos de la fuente de nitrogeno incluyen, por ejemplo, sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio y fosfato de amonio, fuentes de nitrogeno organico tales como peptona, extracto de levaduras, extracto de carne y productos de descomposicion de protema de soja, amoniaco y urea. Tambien pueden usarse gas amoniaco o amoniaco acuoso usados para el ajuste del pH como fuente de nitrogeno. Como fuente de nitrogeno, puede usarse un unico tipo de fuente de nitrogeno, o pueden usarse dos o mas tipos de fuentes de nitrogeno en combinacion.
Los ejemplos espedficos de la fuente de fosfato incluyen, por ejemplo, sales de acido fosforico tales como dihidrogenofosfato de potasio e hidrogenofosfato de dipotasio y polfmeros de acido fosforico tales como acido pirofosforico. Como fuente de fosfato, puede usarse un unico tipo de fuente de fosfato, o pueden usarse dos o mas tipos de fuentes de fosfato en combinacion.
Los ejemplos espedficos de la fuente de azufre incluyen, por ejemplo, compuestos de azufre inorganicos tales como sulfatos, tiosulfatos y sulfitos, y aminoacidos que contienen azufre tales como cistema, cistina y glutation. Como fuente de azufre, puede usarse un unico tipo de fuente de azufre, o pueden usarse dos o mas tipos de fuentes de azufre en combinacion.
Los ejemplos espedficos de otros diversos componentes organicos y componentes inorganicos incluyen, por ejemplo, sales inorganicas tales como cloruro de sodio y cloruro de potasio; metales traza tales como hierro, manganeso, magnesio y calcio; vitaminas tales como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, acido nicotmico, nicotinamida y vitamina Bl2; aminoacidos; acidos nucleicos; y componentes organicos que contienen aquellos tales como peptona, casaminoacido, extracto de levadura, y producto de descomposicion de protema de soja. Como otros diversos componentes organicos y componentes inorganicos, puede usarse un unico tipo de componente, o pueden usarse dos o mas tipos de componentes en combinacion.
Ademas, cuando se usa un mutante auxotrofico que requiere un aminoacido o similar para el crecimiento del mismo, es preferible complementar un nutriente requerido al medio. Por ejemplo, en muchas de las bacterias productoras de L-lisina, la ruta biosintetica de L-lisina se potencia y la capacidad de degradacion de L-lisina se atenua. Por tanto, cuando se cultiva una bacteria productora de L-lisina de este tipo, por ejemplo, uno o mas tipos de aminoacidos seleccionados de L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina y L-metionina se anaden preferiblemente al medio.
Ademas, es preferible tambien anadir una cantidad apropiada de un antiespumante comercialmente disponible al medio, con el fin de suprimir la formacion de espuma durante el cultivo.
Las condiciones de cultivo no estan particularmente limitadas siempre que la bacteria de la presente divulgacion puede proliferar, y se produzca un L-aminoacido. El cultivo puede realizarse, por ejemplo, en condiciones habituales usadas para cultivar microorganismos tales como bacterias. Las condiciones de cultivo pueden establecerse apropiadamente segun diversas condiciones tales como el tipo de bacteria que va a usarse, y el tipo de L- aminoacido que va a producirse.
El cultivo puede realizarse usando un medio lfquido. Para el cultivo, la bacteria de la presente divulgacion cultivada sobre un medio solido tal como medio de agar puede inocularse directamente en un medio lfquido, o la bacteria de la presente divulgacion cultivada en un medio lfquido como cultivo de siembra puede inocularse en un medio lfquido para el cultivo principal. Es decir, el cultivo puede realizarse como cultivo de siembra diferenciado y cultivo principal. La cantidad de la bacteria de la presente divulgacion contenida en el medio en el momento del inicio del cultivo no esta particularmente limitada. Por ejemplo, puede anadirse cultivo de siembra que muestra una DO600 de 4 a 8 al medio para el cultivo principal en una cantidad del 0,1 al 30 % en masa, preferiblemente del 1 al 10 % en masa, en el momento del inicio del cultivo.
El cultivo puede realizarse como cultivo discontinuo, cultivo semicontinuo, cultivo continuo, o una combinacion de estos. Ademas, cuando el cultivo se realiza como cultivo de siembra diferenciado y cultivo principal, las condiciones de cultivo del cultivo de siembra y el cultivo principal pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, tanto el cultivo de siembra como el cultivo principal pueden realizarse como cultivo discontinuo. Alternativamente, por ejemplo, el cultivo de siembra puede realizarse como cultivo discontinuo, y el cultivo principal puede realizarse como cultivo semicontinuo o cultivo continuo.
El cultivo puede, por ejemplo, realizarse de manera aerobia. Por ejemplo, el cultivo puede realizarse como cultivo de aireacion o cultivo de agitacion. La concentracion de oxfgeno puede controlarse para que sea, por ejemplo, del 5 al 50 %, preferiblemente de manera aproximada del 10 %, de la concentracion saturada de oxfgeno. El pH del medio puede ser, por ejemplo, de 3 a 10, preferiblemente de 4,0 a 9,5. El pH del medio puede ajustarse segun se requiera
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durante el cultivo. El pH del medio puede ajustarse usando diversas sustancias alcalinas y acidas tales como gas amoniaco, amoniaco acuoso, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, carbonato de magnesio, hidroxido de sodio, hidroxido de calcio e hidroxido de magnesio. La temperatura del cultivo puede ser, por ejemplo, de 20 °C a 45 °C, preferiblemente de 25 °C a 37 °C. El tiempo de cultivo puede ser, por ejemplo, de 1 hora o mas, 4 horas o mas, 10 horas o mas, o 15 horas o mas, y puede ser de 168 horas o menos, 120 horas o menos, 90 horas o menos, o 72 horas o menos. Espedficamente, el periodo de cultivo puede ser, por ejemplo, de 10 a 120 horas. El cultivo puede continuarse, por ejemplo, hasta que la fuente de carbono contenida en el medio se consuma, o hasta que la actividad de la bacteria de la presente divulgacion se pierda. Cultivando la bacteria de la presente divulgacion en tales condiciones, un L-aminoacido se acumula en las celulas y/o el medio.
Ademas, cuando se produce acido L-glutamico, el cultivo puede realizarse mientras se precipita acido L-glutamico en el medio usando un medio lfquido ajustado para satisfacer una condicion en la que precipita acido L-glutamico. Los ejemplos de la condicion en la que precipita acido L-glutamico incluyen, por ejemplo, pH de 5,0 a 3,0, preferiblemente pH de 4,9 a 3,5, mas preferiblemente pH de 4,9 a 4,0, de manera particularmente preferible aproximadamente pH 4,7 (patente europea abierta a consulta por el publico n.° 1078989). El periodo total o periodo parcial del cultivo puede realizarse al pH mencionado anteriormente. El “periodo parcial” puede ser, por ejemplo, del 50 % o mas, del 70 % o mas, del 80 % o mas, del 90 % o mas, del 95 % o mas, o del 99 % o mas, del periodo total del cultivo.
Cuando se produce un aminoacido basico tal como L-lisina, puede emplearse un metodo en el que el aminoacido basico se produce mediante fermentacion usando iones bicarbonato y/o iones carbonato como contraiones principales para el aminoacido basico (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2002-65287, solicitud publicada de patente estadounidense n.° 20020025564, documento EP 1813677 A). Mediante un metodo de este tipo, puede producirse un aminoacido basico mientras se reduce(n) la(s) cantidad(es) de iones sulfato y/o iones cloruro que van a usarse, que se han usado convencionalmente como contraiones para un aminoacido basico.
La produccion del L-aminoacido puede confirmarse mediante metodos conocidos usados para la deteccion o identificacion de compuestos. Los ejemplos de tales metodos incluyen, por ejemplo, HPLC, CL/EM, CG/EM y RMN. Estos metodos pueden usarse en una combinacion apropiada.
El L-aminoacido producido puede recogerse mediante metodos conocidos usados para la separacion y purificacion de compuestos. Los ejemplos de tales metodos incluyen, por ejemplo, metodo de resina de intercambio ionico, metodo de tratamiento de membrana, metodo de precipitacion y metodo de cristalizacion. Estos metodos pueden usarse en una combinacion apropiada. Cuando el L-aminoacido se acumula en celulas, las celulas pueden alterarse con, por ejemplo, ondas ultrasonicas o similares, y entonces el L-aminoacido puede recogerse mediante el metodo de resina de intercambio ionico o similar a partir del sobrenadante obtenido retirando las celulas de la suspension de celulas alterada mediante centrifugacion. El L-aminoacido que va a recogerse puede ser un compuesto libre, una sal del mismo, o una mezcla del mismo. Los ejemplos de la sal incluyen, por ejemplo, sulfato, clorhidrato, carbonato, sal de amonio, sal de sodio y sal de potasio. L-lisina puede ser, por ejemplo, L-lisina en una forma libre, la sal de clorhidrato de L-lisina, la sal de carbonato de L-lisina, o una mezcla de los mismos. Ademas, el acido L-glutamico puede ser, por ejemplo, acido L-glutamico en una forma libre, L-glutamato de monosodio (MSG), L-glutamato de monoamonio, o una mezcla de los mismos.
Ademas, cuando el L-aminoacido precipita en el medio, puede recogerse mediante centrifugacion, filtracion o similar. El L-aminoacido precipitado en el medio y el L-aminoacido disuelto en el medio pueden aislarse juntos despues de que el L-aminoacido disuelto en el medio se cristalice.
El L-aminoacido recogido puede contener, por ejemplo, celulas bacterianas, componentes del medio, humedad y metabolitos subproducto de la bacteria, ademas del L-aminoacido. La pureza del L-aminoacido recogido puede ser, por ejemplo, del 30 % (p/p) o mas, el 50 % (p/p) o mas, el 70 % (p/p) o mas, el 80 % (p/p) o mas, el 90 % (p/p) o mas, o el 95% (p/p) o mas (documentos JP1214636B, USP5.431.933, USP4.956.471, USP4.777.051, USP4.946.654, USP5.840.358, USP6.238.714, US2005/0025878).
Una realizacion del metodo de la presente invencion puede ser un metodo para producir L-lisina que comprende: cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y recoger L-lisina del medio o las celulas, en el que la expresion de un gen del operon acpP-fabF se ha atenuado en comparacion con una cepa no modificada en la Escherichia coli modificando una secuencia de control de la expresion del gen. Una realizacion del metodo de la presente invencion puede ser tambien un metodo para producir L-lisina que comprende: cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y recoger L-lisina del medio o las celulas, en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por otra base en la Escherichia coli, en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7. Una realizacion del metodo de la presente invencion puede ser tambien un metodo para producir L-lisina que comprende: cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y
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recoger L-lisina del medio o las celulas, en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por adenina en la Escherichia coli, en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7. Las descripciones mencionadas anteriormente que se refieren a la bacteria de la presente divulgacion y el metodo de la presente invencion pueden aplicarse mutatis mutandis a estas realizaciones.
Ejemplos
A continuacion, la presente invencion se explicara mas espedficamente con referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1: Construccion de bacteria productora de L-lisina que muestra expresion reducida de genes acpP y fabF (1)
Como bacteria productora de L-lisina, se uso la cepa E. coli WC196AcadAAldc (FERM BP-11027, documento WO2010/061890, en adelante denominada cepa WC196LC). Se introdujo una mutacion puntual en direccion 5' del operon acpP-fabF que consiste en los genes acpP y fabF de la cepa usando el metodo denominado “integracion impulsada por Red”, que se desarrollo por primera vez por Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 12, pags. 6640-6645). Segun este metodo, puede construirse una cepa a la que se le ha introducido mutacion en una etapa usando un producto de PCR obtenido usando oligonucleotidos sinteticos en los que una secuencia correspondiente a un gen diana se disena en el lado de extremo 5', y una secuencia correspondiente a un gen de resistencia a antibioticos se disena en el lado de extremo 3'. El procedimiento se muestra a continuacion.
Se realizo PCR usando el ADN cromosomico de la cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) como molde, y los oligonucleotidos sinteticos mostrados como SEQ ID NO: 1 y 2 como cebadores. El cebador de SEQ ID NO: 1 tiene una secuencia correspondiente a la secuencia alrededor del sitio BglII del plasmido pMW118 (XattL-Kmr-XattR) (documento WO2006/093322) en el extremo 5' del cebador, y una secuencia correspondiente a una parte de secuencia en direccion 5' del gen acpP en el extremo 3' del cebador. El cebador de SEQ ID NO: 2 tiene una secuencia correspondiente a la secuencia alrededor del sitio BglII del plasmido pMW118 (XattL-Kmr-XattR) (documento WO2006/093322) en el extremo 5' del cebador, y una secuencia correspondiente a una parte de secuencia en direccion 3' del gen fabF en el extremo 3' del cebador. Se ligo el fragmento de ADN obtenido con el vector pMW118 (XattL-Kmr-XattR) tratado con la enzima de restriccion BglII usando el kit de clonacion In-Fusion HD (TAKARA BIO). Se transformo la cepa E. coli JM109 usando la mezcla de reaccion In-Fusion. Se selecciono un transformante sobre un medio de L-agar que contema 50 mg/l de kanamicina. Se extrajo un plasmido del transformante, y se confirmo insercion del fragmento diana. Este plasmido se designo pMW118 (XattL-Km'-XattR)- acpP-fabF.
Usando pMW118 (XattL-Kmr-XattR)-acpP-fabFcomo molde, los oligonucleotidos sinteticos mostrados como SEQ ID NO: 3 y 4 como cebadores, y kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent Technologies), se construyo un plasmido introducido con una mutacion puntual. Esta mutacion reemplaza la citosina ubicada 34 bases en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por adenina. Este plasmido se designo pMW118 (XattL-Km'-XattR)- acpP*-fabF.
Se realizo PCR usando pMW118 (XattL-Kmr-XattR)-acpP*-fabF como molde, y los oligonucleotidos sinteticos mostrados como SEQ ID NO: 5 y 6 como cebadores. Se construyo la cepa WC196LCacpP* a partir de la cepa E. coli WC196LC usando el fragmento de ADN obtenido segun el metodo X-Red descrito en la solicitud publicada de patente estadounidense n.° 2006/0160191 y el documento WO2005/010175. En la cepa WC196LCacpP*, la citosina ubicada 34 bases en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se reemplaza por adenina. En el metodo X-red, se obtuvo un recombinante resistente a kanamicina realizando cultivo en placa sobre un medio de L- agar que contema 50 mg/l de kanamicina a 37 °C, y seleccionando un recombinante resistente a kanamicina.
Se transformo la cepa WC196LCacpP* con el plasmido pCABD2 (patente estadounidense n.° 6.040.160), y se selecciono un transformante sobre el medio de L-agar que contema 20 mg/l de estreptomicina, para obtener la cepa WC196LCacpP*/pCABD2. El plasmido pCABD2 contiene un gen dapA mutante derivado de Escherichia coli y que codifica una dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) que tiene una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion por L-lisina, un gen lysC mutante derivado de Escherichia coli y que codifica una aspartocinasa III que tiene una mutacion para desensibilizacion a inhibicion de retroalimentacion por L-lisina, el gen dapB derivado de Escherichia coli y que codifica dihidrodipicolinato reductasa, y el gen ddh derivado de Brevibacteria lactofermentum y que codifica diaminopimelato deshidrogenasa.
Ejemplo 2: Cultivo de produccion de L-Lisina (1)
Se realizo cultivo de produccion de L-Lisina usando la cepa WC196LCacpP*/pCABD2 preparada. Se cultivo la cepa sobre el medio L que contema 20 mg/l de estreptomicina a 37 °C hasta que la DO600 se volvio de aproximadamente 0,6, y se anadio una disolucion de glicerol al 40 % en un volumen igual al volumen del medio de cultivo, y se agito la
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mezcla. Entonces, se dividio la mezcla en volumenes apropiados, y se almaceno a -80 °C como reserva de glicerol.
Se aplico uniformemente la reserva de glicerol de la cepa WC196LCacpP*/pCABD2 al medio de L-agar que contema 20 mg/l de estreptomicina, y se cultivo a 37 °C durante 24 horas. La cepa WC196LC/pCABD2, que es una cepa de control obtenida introduciendo pCABD2 en la cepa WC196LC, se cultivo de manera similar sobre el medio de L-agar que contema 20 mg/l de estreptomicina. Se suspendieron las celulas hechas crecer en 3,0 ml del medio de produccion de L-lisina (medio MS-Glc) mostrado en la tabla 1, y se diluyo la suspension obtenida con el mismo medio de modo que la DO600 de la suspension se volvio 15. Se inoculo la suspension diluida obtenida en un volumen de 1,0 ml en 19 ml del medio de produccion de L-lisina que contiene 20 mg/l de estreptomicina y se contuvo en un matraz Sakaguchi de 500 ml de volumen, y se realizo el cultivo a 37 °C usando un aparato de cultivo de agitacion redproco. Cuarenta y ocho horas despues del inicio del cultivo, se cuantificaron las cantidades de glucosa residual y L-lisina producida.
[Tabla 1]
Tabla 1: medio de produccion de L-lisina (medio MS-Glc)
Glucosa
40,0 g/l
(NH4)2SO4
24 g/l
KH2PO4
1,0 g/l
MgSO4-7H2O
1,0 g/l
FeSO4-7H2O
0,01 g/l
MnSO4-7H2O
0,008 g/l
Extracto de levadura
2,0 g/l
CaCO3 (farmacopea iaponesa)
30 g/l
Se ajusto el medio a pH 7,0 con KOH, y se sometio a autoclave a 115 °C durante 10 minutos, siempre que la glucosa y MgSO4-7H2O se sometieron a autoclave por separado de los demas componentes. Se anadio CaCO3 despues de esterilizacion por aire caliente.
Las concentraciones de glucosa residual y concentraciones de acumulacion de L-lisina obtenidas tras 48 horas de cultivo se muestran en la tabla 2. En comparacion con la cepa de control WC196LC/pCABD2, el rendimiento de L- lisina se mejoro enormemente con la cepa WC196LCacpP*/pCABD2 en la que se redujo la expresion de los genes acpP y fabF.
[Tabla 2]
Tabla 2: Concentracion de glucosa residual y concentracion de acumulacion de L-lisina obtenidas tras 48 horas de cultivo
Acumulacion de L-Lys (g/l) Glucosa residual (g/l)
WC196LC/pCABD2
15,0 0
WC196LCacpP*/pCABD2
20,9 0
Ejemplo 3: Verificacion de la cantidad de expresion de gen acpP mediante RT-PCR (1)
La cepa WC196LCacpP*/pCABD2 y la cepa WC196LC/pCABD2 se cultivaron cada una en la misma condicion tal como se describio en el ejemplo 2, y se muestreo el caldo de cultivo despues de 17 horas del cultivo. Se extrajo ARN del caldo de cultivo usando el reactivo RNAprotect Bacteria (Qiagen) y el mini kit RNeasy (Qiagen). Se realizo PCR de transcripcion inversa usando el ARN obtenido como molde, y usando el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara Bio). Se realizo PCR cuantitativa usando el ADNc como molde, y los oligonucleotidos sinteticos mostrados como SEQ ID NO: 13 y 14 y los oligonucleotidos sinteticos mostrados como SEQ ID NO: 15 y 16 como cebadores, y usando la mezcla Power SYBR Green PCR Master (Applied Biosystems). Los oligonucleotidos mostrados como SEQ ID NO: 13 y 14 se corresponden cada uno con la secuencia de nucleotidos del gen acpP. Los oligonucleotidos mostrados como SEQ ID NO: 15 y 16 se corresponden cada uno con la secuencia interna de ORF de rrsA (ARNr 16s). La cantidad de ARNm del gen acpP se calculo usando rrsA (ARNr 16s) como patron estandar.
Las cantidades de ARNm del gen acpP obtenidas despues de 17 horas de cultivo se mostraron en la tabla 3. Los datos se mostraron como el valor relativo a la cantidad de ARNm del gen acpP observada en la cepa WC196LC/pCABD2 establecido como 1. En comparacion con la cepa de control WC196LC/pCABD2, la cantidad de ARNm de gen acpP se disminuyo enormemente en la cepa WC196LCacpP*/pCABD2.
[Tabla 3]
Tabla 3: Cantidad de ARNm de gen acpP obtenida despues de 17 horas de cultivo
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15
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WC196LC/pCABD2 1
WC196LCacpP*/pCABD2__________________________0,52_____________________
Ejemplo 4: Construccion de bacteria productora de L-lisina que muestra expresion reducida de los genes acpP y fabF (2)
Como bacteria productora de L-lisina, se usa la cepa WC196LC. La region en direccion 5' del operon acpP-fabF que consiste en los genes acpP y fabF de la cepa se reemplaza por el promotor Ptac84 (solicitud publicada de patente rusa n.° 2006/134574) o promotor lac usando el metodo de “integracion impulsada por Red”. La region que va a reemplazarse puede ser una parte o la totalidad de la region de -200 a -1 en direccion 5' del inicio de la transcripcion del operon acpP-fabF. Por ejemplo, puede reemplazarse la region de -100 a -1, de - 50 a -1, de -30 a -1, o de -30 a - 10 en direccion 5' desde el inicio de la transcripcion del operon acpP-fabF.
A continuacion, una cepa obtenida a partir de la cepa WC196LC reemplazando la region en direccion 5' del operon acpP-fabF con el promotor Ptac84 se designa cepa WC196LC Ptac84acpP, y una cepa obtenida a partir de la cepa WC196LC reemplazando la region en direccion 5' del operon acpP-fabF con promotor lac se designa cepa WC196LC Plac acpP.
La cepa WC196LC Ptac84acpP y la cepa WC196LC Plac acpP se transforman con el plasmido pCABD2, y se seleccionan transformantes sobre el medio de L-agar que contiene 20 mg/l de estreptomicina, para obtener la cepa WC196LC Ptac84acpP/pCABD2 y la cepa WC196LC Plac acpP/pCABD2.
Ejemplo 5: Cultivo de produccion de L-lisina (2)
Se realiza cultivo de produccion de L-lisina segun el metodo descrito en el ejemplo 2 usando la cepa WC196LC Ptac84acpP/pCABD2 y la cepa WC196LC Plac acpP/pCABD2, que se obtienen en el ejemplo 4, y la cepa WC196LC/pCABD2 como cepa de control.
Ejemplo 6: Verificacion de la cantidad de expresion de gen acpP mediante RT-PCR (2)
La cepa WC196LC Ptac84acpP/pCABD2 y la cepa WC196LC Plac acpP/pCABD2, que se obtienen en el ejemplo 4, y la cepa WC196LC/pCABD2 se cultivan cada una en la condicion descrita en el ejemplo 2, y la cantidad de ARNm de gen acpP se calcula usando el metodo descrito en el ejemplo 3.
Ejemplo 7: Construccion de bacteria productora de L-treonina que muestra expresion reducida de genes acpP y fabF
Como bacteria productora de L-treonina, se usa la cepa E. coli TDH-6 (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2001-346578). La cepa TDH-6 puede obtenerse a partir de la cepa E. coli TDH-6/pVIC40 (VkPM B-3996) curando el plasmido pVIC40 (patente japonesa abierta a consulta por el publico (Kokai) n.° 2001-346578). La citosina ubicada 34 bases en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP de la cepa TDH-6 se reemplaza por adenina usando el metodo descrito en el ejemplo 1. Alternativamente, la region en direccion 5' del operon acpP-fabF de la cepa TDH-6 se reemplaza por el promotor Ptac84 o promotor lac usando el metodo descrito en el ejemplo 4. La region que va a reemplazarse puede ser una parte o la totalidad de la region de -200 a -1 en direccion 5' del sitio de inicio de la transcripcion del operon acpP-fabF. Por ejemplo, puede reemplazarse la region de -100 a -1, de -50 a -1, de -30 a -1, o de -30 a -10 en direccion 5' del sitio de inicio de la transcripcion del operon acpP-fabF.
A continuacion, una cepa obtenida a partir de la cepa TDH-6 reemplazando la citosina ubicada 34 bases en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por adenina se designa TDH-6acpP*, una cepa obtenida a partir de la cepa TDH-6 reemplazando la region en direccion 5' del operon acpP-fabF por promotor Ptac84 se designa cepa TDH-6 Ptac84acpP, y una cepa obtenida a partir de la cepa TDH-6 reemplazando la region en direccion 5' del operon acpP-fabF con promotor lac se designa cepa TDH-6 Plac acpP.
La cepa TDH-6acpP*, la cepa TDH-6 Ptac84acpP y la cepa TDH-6 Plac acpP se transforman con el plasmido pVIC40 (patente estadounidense n.° 5.705.371), para obtener la cepa TDH-6acpP*/pVIC40, cepa TDH-6 Ptac84acpP/pVIC40 y cepa TDH-6 Plac acpP/pVIC40, respectivamente.
Ejemplo 8: Cultivo de produccion de L-treonina
Se realiza cultivo de produccion de L-treonina segun el metodo descrito en la patente estadounidense n.° 7.915.018 usando la cepa TDH-6acpP*/pVIC40, la cepa TDH-6 Ptac84acpP/pVIC40 y la cepa TDH-6 Plac acpP/pVIC40, que se obtienen en el ejemplo 7, y la cepa TDH-6/pVIC40 como cepa de control.
Ejemplo 9: Verificacion de la cantidad de expresion del gen acpP mediante RT-PCR (3)
Se realiza cultivo de produccion de L-treonina segun el metodo descrito en la patente estadounidense n.° 7.915.018

Claims (14)

1.
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15
2.
20
3.
25 4.
30
5.
35
6.
7. 40
8.
9.
45
10.
50 11.
12.
55
60
13.
65 14.
REIVINDICACIONES
Metodo para producir un L-aminoacido que comprende:
cultivar una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene una capacidad de produccion de L-aminoacido en un medio para producir y acumular un L-aminoacido en el medio o celulas de la bacteria; y
recoger el L-aminoacido del medio o las celulas,
en el que la bacteria se ha modificado de modo que el operon acpP-fabF se atenua en comparacion con una cepa no modificada,
en el que el operon acpP-fabF se atenua atenuando la expresion de un gen del operon acpP-fabF,
en el que la expresion del gen del operon acpP-fabF se atenua modificando una secuencia de control de la expresion del gen.
Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el gen del operon acpP-fabF consiste en el gen acpP y/o el gen fabF.
Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el gen del operon acpP-fabF consiste en el gen acpP y el gen fabF.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que la expresion del gen del operon acpP- fabF se atenua reemplazando la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por otra base,
en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7.
Metodo segun la reivindicacion 4, en el que la expresion del gen del operon acpP-fabF se atenua reemplazando la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP por adenina.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la bacteria es una bacteria que pertenece a los generos Escherichia, Pantoea o Enterobacter.
Metodo segun la reivindicacion 6, en el que la bacteria es Escherichia coli.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cepa no modificada es la cepa Escherichia coli MG1655.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cepa no modificada tiene la secuencia de nucleotidos del operon acpP-fabF, que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo, mostrada como SEQ ID NO: 7.
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1
Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones acpP no se reduce hasta el 0 %.
Metodo para producir L-lisina que comprende:
cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y
recoger L-lisina del medio o las celulas,
en el que la expresion de un gen del operon acpP-fabF se ha atenuado en la Escherichia coli en comparacion con una cepa no modificada modificando una secuencia de control de la expresion del gen.
Metodo segun la reivindicacion 12, en el que la cepa no modificada es la cepa Escherichia coli MG1655.
Metodo segun la reivindicacion 12 o 13, en el que la cepa no modificada tiene la secuencia de nucleotidos del operon acpP-fabF, que incluye en direccion 5' 210 pb del mismo, mostrada como SEQ ID NO: 7.
a 9, en el que el L-aminoacido es L-lisina.
1 a 10, en el que la cantidad de expresion del gen
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10
15
15. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la cantidad de expresion del gen acpP no se reduce hasta el 0 %.
16. Metodo para producir L-lisina que comprende:
cultivar Escherichia coli que tiene capacidad de produccion de L-lisina en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o celulas de la Escherichia coli; y
recoger L-lisina del medio o las celulas,
en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por otra base en la Escherichia coli,
en el que la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP es una posicion correspondiente a la posicion 177 de la secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 7.
17. Metodo para producir L-lisina segun la reivindicacion 16, en el que la citosina en la posicion -34 en direccion 5' del sitio de inicio de la traduccion del gen acpP se ha reemplazado por adenina en la Escherichia coli.
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