PL194329B1 - Zastosowanie monoestru probukolu kwasu bursztynowego lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli dowytwarzania leku do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1 - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie skutecznej leczniczo ilosci monoestru probukolu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby mediowanej VCAM-1 wybranej z grupy obejmujacej dusznice bolesna i chorobe tetnic malego kalibru. 16. Zastosowanie skutecznej ilosci monoestru probukolu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby, mediowanej VCAM-1, bedacej choroba zapalna. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie monoestru probukolu kwasu bursztynowego lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby, której mediatorem jest VCAM-1, chorób układu krążenia i chorób zapalnych w tym miażdżycy przez podanie skutecznej ilości estru probukolu.

Choroby układu krążenia są obecnie najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. W około dziewięćdziesięciu przypadkach chorób układu krążenia stawia się obecnie rozpoznanie miażdżycy. Choroby układu krążenia łączono z kilkoma czynnikami przyczynowymi; należą do nich hipercholesterolemia, hiperlipidemia i ekspresja VCAM-1 w komórkach śródbłonka naczyń.

Hipercholesterolemia jest ważnym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia. Nośnikami lipidów w krążeniu są lipoproteiny surowicy. Lipoproteiny klasyfikuje się zależnie od gęstości: wyróżnia się chylomikrony, lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL), lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i lipoproteiny o dużej gęstości (HDL). Chylomikrony uczestniczą głównie w transporcie trójglicerydów pokarmowych i cholesterolu z jelita do tkanki tłuszczowej i wątroby. VLDL przenoszą wytwarzane endogennie trójglicerydy z wątroby do tkanki tłuszczowej i innych tkanek. LDL przenosi cholesterol do tkanek obwodowych i reguluje poziom cholesterolu endogennego w tych tkankach. HDL przenosi cholesterol z tkanek obwodowych do wątroby. Cholesterol ścian naczyniowych pochodzi niemal wyłącznie z LDL. Brown i Goldstein, Ann. Rev. Biochem. 52, 223 (1982); Miller, Ann. Rev. Med. 31, 97 (1980). U pacjentów z niskim poziomem LDL rzadko rozwija się miażdżyca.

W wielu stanach chorobowych dochodzi do podwyższenia się poziomu cholesterolu; należą do nich restenoza, dusznica bolesna, miażdżyca naczyń mózgowych i kępki żółte. Korzystne byłoby zapewnienie sposobu obniżania poziomu cholesterolu w osoczu u pacjentów, u których występują następujące choroby lub ryzyko powstania tych chorób: restenoza, dusznica bolesna, miażdżyca naczyń mózgowych, kępki żółte i inne choroby związane z podwyższeniem poziomu cholesterolu.

W przypadku stwierdzenia, że hipercholesterolemia spowodowana jest podwyższeniem poziomu LDL (hiperlipidemia), próbuje się osiągnąć obniżenie poziomu LDL poprzez stosowanie diety. Znanych jest ponadto kilka klas leków, powszechnie stosowanych do obniżania poziomu LDL, takich jak leki wiążące kwasy żółciowe, kwas nikotynowy (niacyna) i inhibitory reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMG CoA). Probukol i pochodne fibratów stosuje się niekiedy jako leczenie dodane, zwykle w połączeniu z innymi lekami. Inhibitory reduktazy HMG CoA zwane są statynami lub wastatynami. Statyny należą do najskuteczniejszych obecnie dostępnych na rynku leków do terapii hipercholesterolemii; należą do nich: prawastatyna (Pravchol, Bristol Myers Squibb), atrowastatyna (Warner Lambert/Pfizer), simwastatyna (Zocor, Merck), lowastatyna (Mevacor, Merck) i fluwastatyna (Lescol).

U wielu pacjentów wystarcza dieta plus jeden z leków hipolipemicznych. U pacjentów z wyjściowym poziomem frakcji LDL cholesterolu powyżej 200 mg/dl konieczne jest obniżenie poziomu LDL o 50% lub więcej. Pojedynczy lek może niekiedy zapewnić ten stopień obniżenia LDL, znacznie częściej jednak spadek LDL wynosi zaledwie 20-30%. Tak więc u pacjenta z heterozygotyczną hipercholesterolemią rodzinną z poziomem cholesterolu LDL 200-400 mg/dl konieczne jest połączenie dwóch, czasami trzech leków hipolipemicznych w celu osiągnięcia poziomu cholesterolu LDL poniżej 100 mg/dl. Połączenie żywicy wiążącej żółć i kwasu nikotynowego może obniżać poziom LDL o 45%-55%, żywicy ze statyną o około 50%-60%, kwasu nikotynowego ze statyną o około 50%, a zastosowanie trzech leków - żywicy wiążącej kwasy żółciowe, statyny i kwasu nikotynowego -o aż 70%.

Pewne dane wskazują, że za powodowanie miażdżycy przez lipoproteiny o małej gęstości (LDL) w części odpowiada modyfikacja oksydacyjna. Wykazano, że probukol wykazuje silne właściwości przeciwutleniające i blokuje modyfikację oksydacyjną LDL. Jak można było w związku z tym oczekiwać, probukol wykazuje właściwości spowalniania postępu miażdżycy u królików nie posiadających receptorów LDL, jak to omówili Carew i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7725-7729 (1987). Najbardziej prawdopodobne jest to, że skuteczność probukolu wynika stąd, że jest on wysoce rozpuszczalny w tłuszczach i transportowany przez lipoproteiny, zabezpieczając je przed uszkodzeniem oksydacyjnym.

Probukol jest chemicznie podobny do szeroko stosowanych środków dodatkowych do żywności -2-[3]-tert-butylo-4-hydroksyanizolu (BHA) i 2,6-di-tert-butylo-4-metylofenolu (BHT). Pełna chemiczna nazwa probukolu to 4,4'-(izopropylidenoditio)bis(2,6-di-tert-butylofenol).

PL 194 329 B1

Obecnie probukol stosuje się przede wszystkim do obniżania poziomu cholesterolu w surowicy u chorych z hipercholesterolemią. Probukol podaje się w tabletkach o nazwie handlowej Lorelco™. Niestety probukol jest niemal nierozpuszczalny w wodzie, zatem nie może być podawany dożylnie. Komórki trudno wchłaniają probukol in vitro ze względu na jego słabą zdolność mieszania się z buforami i pożywkami do hodowli komórkowej. Probukol w postaci stałej słabo wchłania się do krwi i jest wydalany w postaci niemal niezmienionej. Ponadto probukol w postaci tabletek wchłania się z istotnie różną prędkością i w różnej ilości u poszczególnych pacjentów. W jednym z badań (Heeg i wsp., Plasma Levels of Probucol in Man After Single and Repeated Oral Doses, La Nouvelle Presse Medicale, 9: 2990-2994 (1980) stwierdzono, że szczytowy poziom probukolu w surowicy różni się aż o czynnik 20 u poszczególnych pacjentów. W innym badaniu Kazuya i wsp., J. Lipid Res. 32; 197-204 (1991) obserwowali włączanie poniżej około 1mg probukolu/10⁶ komórek przy inkubacji komórek śródbłonka przez 24 godziny z 50 mM probukolu.

W patencie Stanów Zjednoczonych nr 5262439 wydanym na nazwisko Partasarathy opisano rozpuszczalne analogi probukolu, w których jedną lub obie reszty grup hydroksylowych zastąpiono grupami estrowymi, nadającymi związkowi rozpuszczalność w wodzie. W jednym z wykonań rozpuszczalną pochodną dobiera się z grupy, do której należą ester kwasu jedno- lub dwubursztynowego, ester kwasu glutarowego, ester kwasu adypinowego, ester kwasu suberynowego, ester kwasu sebacynowego, kwas azelainowy lub ester kwasu maleinowego probukolu. W innym wykonaniu pochodna probukolu stanowi monoester lub diester, w którym ester zawiera grupę alkilową lub alkenylową, zawierającą grupę funkcyjną dobraną z grupy, do której należy grupa kwasu karboksylowego, grupa aminowa, sól grupy aminowej, grupy amidowe i grupy aldehydowe.

W serii patentów francuskich opisano, że niektóre pochodne probukolu są środkami obniżającymi poziom cholesterolu i lipidów: Fr 2168137 (estry bis-4-hydroksyfenylotioalkanowe), Fr 2140771 (tetralinylofenoksyalkanoilowe estry probukolu), Fr 2140769 (pochodne kwasu benzofuryloksyalkanoilowego probukolu), Fr 2134810 (bis-(3-alkilo-5-t-alkilo-4-tiazolo-5-karboksy)fenylotio)alkany; Fr 2133024 (bis(4-nikoinoiloksyfenylotio)propany i Fr 2130975 (bis(4-(fenoksyalkanoiloksy)fenylotio)alkany).

W patencie Stanów Zjednoczonych nr 5155250 opisano, że 2,6-dialkilo-4-sililofenole są środkami przeciwmiażdżycowymi. Te same związki opisano jako środki obniżające poziom cholesterolu w surowicy w publikacji PCT nr WO 95/15760, opublikowanej 15 czerwca 1995. W patencie Stanów Zjednoczonych nr 5608095 opisano, że alkilowane 4-sililofenole hamują peroksydację LDL, obniżają poziom cholesterolu w osoczu i hamują ekspresję VCAM-1, są zatem korzystne w leczeniu miażdżycy.

Opis patentowy PL 184466 (odpowiadająca publikacja WO 9530415) opisuje stosowanie rozpuszczalnych w wodzie pewnych pochodnych probukolu w celu podwyższenia dostępności probukolu. Ten opis patentowy opisuje szeroki rodzaj molekuł z korzystnymi pochodnymi będącymi diestrami. Centralną sprawą wynalazku według publikacji WO 9530415 jest to, że pochodne probukolu przekształcają się do macierzystej molekuły. Zgłaszający niespodziewanie stwierdził, że monoestry probukolu nie przekształcają się do probukolu in vivo.

Opis zastosowania probukolu i jego estrów jedynie jako antyoksydantów w opisie patentowym według publikacji WO 9530415 nie motywuje nikogo do ich stosowania do leczenia chorób mediowanych przez VCAM-1. Zgłaszający niespodziewanie stwierdził, że monoestry probukolu, w przeciwieństwie do probukolu lub do jego diestrów, są zdolne do tłumienia VCAM- 1. Ta aktywność jest niezależna od aktywności antyoksydacyjnej probukolu. Choroby mediowane przez VCAM-1 nie są współmierne z chorobami, które są mediowane przez uszkodzenia wolnymi rodnikami jak opisano w tej publikacji WO 9530415.

Ekspresja VCAM-1

Adhezja leukocytów do śródbłonka jest podstawowym, wczesnym zjawiskiem w chorobach układu krążenia, jak również w wielu chorobach zapalnych, w tym w chorobach autoimmunologicznych oraz zakażeniach bakteryjnych i wirusowych. Napływ leukocytów do śródbłonka rozpoczyna się, gdy indukowalne receptory cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek śródbłonka wchodzą w interakcję z przeciwstawnymi receptorami na komórkach immunologicznych. Naczyniowe komórki śródbłonka określają, które typy leukocytów (monocyty, limfocyty czy neutrofile) napływają, poprzez wybiórczą ekspresję swoistych cząsteczek adhezyjnych, takich jak cząsteczka adhezji komórkowej naczyń-1 (VCAM-1), międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna-1 (ICAM-1) i E-selektyna (ELAM). W najwcześniejszym stadium zmiany miażdżycowej dochodzi do miejscowej śródbłonkowej ekspresji VCAM-1 i wybiórczego napływu leukocytów jednojądrzastych, wykazujących ekspresję przeciwstawnego receptora integrynowego VLA-4. Ze względu na swoistą ekspresję VLA-4 na monocytach i limfo4

PL 194 329 B1 cytach, lecz nie na neutrofilach, VCAM-1 odgrywa istotną rolę w mediacji wybiórczej adhezji leukocytów jednojądrzastych. VCAM-1 uczestniczy jako mediator w przewlekłych chorobach zapalnych, takich jak dychawica oskrzelowa, reumatoidalne zapalenie stawów i cukrzyca autoimmunologiczna. Wiadomona przykład, że u chorych z dychawicą oskrzelowa ekspresja VCAM-1 i ICAM-1 jest zwiększona. Pilewski JM i wsp., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 1-3 (1995); Ohkawara Y i wsp., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 4-12 (1995). Oprócz tego zablokowanie receptorów integrynowych dla VCAM-1 i ICAM-1 (odpowiednio, VLA-4 i LFA-1) powodowało zahamowanie reakcji zarówno fazy wczesnej, jak i późnej, w uczulonym albuminą jaja kurzego modelu szczurzym reakcji uczuleniowych ze strony dróg oddechowych. Rabb, 11 A i wsp., Am. J. Respir. Care Med. 149, 1186-1191 (1994). Dochodzi również do zwiększenia ekspresji śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych, w tym VCAM-1, w mikrokrążeniu błony maziowej w zapaleniu stawów. Koch AE i wsp., Lab. Invest. 64, 313-322 (1991); Morales-Ducret J i wsp., Immunol. 149, 1421-1431 (1992). Zobojętnienie przeciwciał skierowanych przeciwko VCAM-1 lub receptorze do niego przeciwstawnym - VLA-4 - może opóźnić wystąpienie cukrzycy w modelu mysim (myszy NOD), w którym dochodzi do samoistnego powstania choroby. Yang XD i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10494-10498 (1993); Burkly LC i wsp., Diabetes 43, 523-534 (1994); Baron JL i wsp., J. Clin. Invest. 93, 1700-1708 (1994). Również przeciwciała monoklonalne przeciwko VCAM-1 mogą wywierać korzystne działanie w zwierzęcym modelu odrzucania przeszczepów allogenicznych, co sugeruje, że inhibitory ekspresji VCAM-1 mogą znaleźć zastosowanie w zapobieganiu odrzucaniu przeszczepów. Oroez CG i wsp., Immunol. Lett. 32, 7-12 (1992).

VCAM-1 ulega ekspresji przez komórki zarówno w postaci związanej z błoną, jak i w postaci rozpuszczalnej. Wykazano, że rozpuszczalna postać VCAM-1 pobudza chemotaksję komórek śródbłonka naczyniowego in vitro i pobudza reakcję tworzenia naczyń w rogówce szczura. Koch AF i wsp., Nature 376, 517-519 (1995). Inhibitory ekspresji rozpuszczalnego VCAM-1 mają potencjalną wartość terapeutyczną w leczeniu chorób z wyraźną komponentą tworzenia naczyń, czyli komponentą angiogenną, w tym wzrostu nowotworów i tworzenia się przerzutów. Folkman J i Shing Y, Biol. Chem. 10931-10934 (1992).

VCAM-1 ulega ekspresji w hodowli ludzkich komórek śródbłonka po pobudzeniu lipopolisacharydem (LPS) i cytokinami, takimi jak interleukina-1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworu (TNF-a). Czynniki te nie są wybiórcze w odniesieniu do pobudzania ekspresji cząsteczki adhezji komórkowej.

Następujące później przekształcenie leukocytów do piankowatych makrofagów powoduje wytwarzanie wielu cytokin zapalnych, czynników wzrostu i czynników chemotaktycznych, które ułatwiają szerzenie się napływu leukocytów i płytek krwi, proliferację komórek mięśni gładkich, pobudzenie komórek śródbłonka i charakterystykę wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowej dojrzewającej blaszki miażdżycowej.

Analiza cząsteczkowa elementów regulacyjnych ludzkiego genu VCAM-1, kontrolującego jego ekspresję, wskazuje na ważną rolę czynnika jądrowego-kB (NF-kB) - transkrypcyjnego czynnika regulacyjnego -lub podobnego do NF-kB białka wiążącego, we wrażliwej na utlenianie i redukcję ekspresji genu VCAM-1. Czynniki transkrypcyjne są białkami pobudzającymi (lub hamującymi) ekspresję genu w obrębie jądra komórkowego poprzez wiązanie ze swoistymi sekwencjami DNA, zwanymi elementami wzmacniającymi, znajdującymi się zwykle w pobliżu regionu genu zwanego promotorem, od którego rozpoczyna się synteza RNA. Dokonano sklonowania i uzyskano charakterystykę promotorów zarówno VCAM-1, jak i ICAM-1. Na przykład oba promotory zawierają wiele elementów sekwencji DNA wiążących czynnik transkrypcyjny - NF-kB. Iademarco MF i wsp., J. Biol. Chem. 267, 16323-16329 (1992).

Czynnik jądrowy-kB jest ulegającym ekspresji we wszystkich komórkach wielopodjednostkowym czynnikiem transkrypcyjnym, pobudzanym w kilku typach komórek przez dużą i zróżnicowaną grupę czynników zapalnych, takich jak TNFa, IL-1B, endotoksyny bakteryjne i wirusy RNA. Odgrywa on kluczową rolę w mediacji sygnałów zapalnych i innych sygnałów stresowych dla aparatu regulacyjnego jądra. Mimo że nie są znane dokładnie sygnały biochemiczne pobudzające NF-kB, ten czynnik transkrypcyjny może włączać do wspólnego szlaku cząsteczkowego wiele czynników ryzyka i przyczynowych sygnałów miażdżycy, takich jak hiperlipidemia, palenie tytoniu, nadciśnienie tętnicze i cukrzyca.

Pobudzenie NF-kB w komórkach śródbłonka naczyń rozmaitymi sygnałami można swoiście hamować przeciwutleniaczami, takimi jak N-acetylocysteina i ditiokarbaminian pirolidynowy. Spowodowało to powstanie hipotezy, że rodniki tlenowe odgrywają istotną rolę w pobudzaniu NF-kB poprzez nieokreślony mechanizm utlenienia i redukcji. Jako że NF-kB-podobny element wzmacniający reguluje transkrypcję promotora VCAM-1 również w sposób wrażliwy na utlenienie i redukcję, sugerowano

PL 194 329 B1 możliwy udział stresu oksydacyjnego w zmianach miażdżycowych w regulowaniu ekspresji genu VCAM-1 poprzez to wrażliwe na utlenienie i redukcję transkrypcyjne białko regulacyjne. W patencie Stanów Zjednoczonych 5380747 (PCT/US93/10496) po raz pierwszy opisano, że można hamować ekspresję VCAM-1 w komórkach śródbłonka naczyń poprzez podawanie klasy ditiokarbaminianów, do której należy dikarbaminian pirolidynowy. Dikarbaminiany te są zatem korzystne w leczeniu chorób układu krążenia, i obecnie wykazano, że istotnie zmniejszają one obecność zmian miażdżycowych u królików z hipercholesterolemią.

Sugerowano, że głównym zjawiskiem zapoczątkowującym i rozprzestrzeniającym miażdżycę jest modyfikacja lipoprotein o małej gęstości (LDL) do oksydacyjnie zmodyfikowanych LDL (oks-LDL) przez reaktywny tlen. Steinberg i wsp., N. Engl. J. Med. 1989/320:915-924. Utleniona LDL jest złożoną strukturą, utworzoną z co najmniej kilku chemicznie odrębnych substancji utlenionych, z których każda, sama lub w połączeniu, może modulować aktywowaną przez cytokiny ekspresję genu cząsteczki adhezyjnej. Lipooksygenazy wytwarzają z wolnych kwasów tłuszczowych wodorotlenki kwasów tłuszczowych, na przykład wodorotlenek linoleilowy (13-HPODE), które są ważnym składnikiem utlenionych LDL.

Uważa się, że wskutek działania układu lipoksygenaz komórkowych tworzy się grupa utlenionych lipidów, które następnie są przenoszone do LDL, po czym następuje reakcja szerzenia się w obrębie LDL w środowisku katalizowanym przez metale przejściowe i/lub związki sulfhydrylowe. Uprzednie badania dowiodły, że modyfikacja hodowli komórek śródbłonka kwasem tłuszczowym może zmieniać ich podatność na uszkodzenie oksydacyjne. W publikacji PCT/US95/05880, stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich wodorotlenki pobudzają ekspresję VCAM-1, Iecz nie ICAM-1 ani E-selektyny w komórkach aorty śródbłonka człowieka, w mechanizmie, którego mediatorem nie są ani cytokiny, ani inne sygnały niecytokinowe. Było to istotne odkrycie ważnego i uprzednio nieznanego szlaku biologicznego reakcji immunologicznych, których mediatorem jest VCAM-1. W PCT/US95/05880 donoszono, że pobudzenie VCAM-1 przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ich wodorotlenki ulega supresji przez ditiokarbaminiany, w tym ditiokarbaminian pirolidynowy.

Biorąc pod uwagę, że choroby układu krążenia są obecnie najważniejszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych, istnieje potrzeba opracowania nowych sposobów ich leczenia. Celem jest zapewnienie nowych środków, jednocześnie leczących hipercholesterolemię i hiperlipidemię i zdolnych do hamowania ekspresji VCAM-1 w komórkach śródbłonka naczyniowego.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem opracowanie sposobu i preparatu do hamowania VCAM-1, a zwłaszcza sposobu leczenia chorób układu krążenia.

Celem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób i preparat do leczenia chorób układu krążenia, przy czym te sposoby i preparaty zapewniają jednoczesne zwalczanie hipercholesterolemii, hiperlipidemii i zdolne są do hamowania ekspresji VCAM-1 w komórkach śródbłonka naczyniowego.

Krótki opis wynalazku

Stwierdzono, że monoestry probukolu są skuteczne w jednoczesnym zmniejszaniu poziomu cholesterolu, obniżaniu poziomu LDL i hamowaniu ekspresji VCAM-1, tak więc związki te są korzystne jako leki o złożonym działaniu na układ krążenia. Ponieważ związek wykazuje jednocześnie trzy kierunki istotnego działania ochronnego na naczynia, chory może przyjmować jeden lek zamiast wielu leków i osiągać ten sam efekt. Powinno to zwiększyć efektywność leczenia i stosowanie się pacjenta do zaleceń lekarskich.

Stwierdzono, że monoester probukolu hamuje VCAM-1; było to nieoczekiwane, biorąc pod uwagę, że sam probukol, będąc silnym przeciwutleniaczem, nie wpływa istotnie na ekspresję VCAM-1. Również diestry probukolu ani statyny nie zmieniają istotnie ekspresji VCAM-1.

Stwierdzono także, że monoester kwasu bursztynowego jedynie w niewielkim stopniu obniża poziom HDL u królików, i nie zmienia poziomu HDL u myszy i małp. Probukol przeciwnie, powoduje jedynie w niewielkim stopniu spadek LDL i znaczny spadek HDL. Statyny obniżają LDL i mogą wpływać lub nie wpływać na HDL.

Stwierdzono również, że monoestry probukolu, a zwłaszcza monoester probukolu kwasu bursztynowego (zwany w niniejszym opisie MSE wybiórczo hamują wywoływaną przez TNF ekspresję genu VCAM-1 i MCP-1, lecz nie ICAM-1, w ludzkich komórkach śródbłonka aorty. MSE nie wpływa na pobudzenie NF-kB. MSE stosuje się w niniejszym opisie jako ilustrację monoestrów probukolu. Zastosowanie MSE jako ilustracji służy jedynie uproszczeniu omawiania, nie ograniczając w żaden sposób zakresu niniejszego wynalazku.

Biorąc pod uwagę stwierdzony fakt blokowania przez monoestry probukolu, a zwłaszcza ester kwasu jednobursztynowego probukolu, pobudzonej ekspresji cząsteczki adhezyjnej powierzchni ko6

PL 194 329 B1 mórek śródbłonka VCAM-1, związki te są korzystne w leczeniu wszelkich chorób, których mediatorem jest VCAM-1, w tym miażdżycy, restenozy po angioplastyce, chorób naczyń wieńcowych, dusznicy bolesnej i innych chorób układu krążenia, jak również innych chorób zapalnych, których mediatorem jest VCAM-1. Związki te można również stosować w leczeniu odrzucania przeszczepów serca.

Wynalazek obejmuje zastosowanie skutecznej leczniczo ilości monoestru probukolu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby mediowanej VCAM-1 wybranej z grupy obejmującej dusznicę bolesną i chorobę tętnic małego kalibru. Zastosowanie to zgodnie z jednym z wykonań obejmuje również podawanie monoestru probukolu w połączeniu z innym lekiem, stosowanym w leczeniu chorób układu krążenia, dobranym z grupy, do której należą leki obniżające poziom lipidów, inhibitory agregacji płytek krwi, leki przeciwkrzepliwe, blokery kanału wapniowego, inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), i b-blokery.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie skutecznej ilości monoestru brobukolu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby, mediowanej VCAM-1, będącej chorobą zapalną. Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem chorobę stanowi choroba wybrana z grupy obejmującej zaburzenie śródbłonkowe, dychawicę oskrzelową, łuszczycę, wypryskowe zapalenie skóry, mięsak Kaposi, stwardnienie rozsiane, proliferacyjne zaburzenie komórek mięśni gładkich.

Zgodnie z wynalazkiem w każdym z jego korzystnych wykonań zastosowany monoester probukolu wybiera się z grupy obejmującej monoester probukolu kwasu bursztynowego, monoester probukolu kwasu glutarowego, monoester probukolu kwasu adypinowego, monoester stanowi monoester probukolu kwasu suberynowego, monoester probukolu kwasu sebacynowego, monoester probukolu kwasu azelainowego, monoester probukolu kwasu maleinowego.

W korzystnym wykonaniu zastosowanie skutecznej ilości monoestru brobukolu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby, mediowanej VCAM-1, będącej chorobą zapalną obejmuje również podawanie monoestru probukolu w połączeniu z innym lekiem, stosowanym w leczeniu chorób układu krążenia, dobranym z grupy, do której należą leki obniżające poziom lipidów, inhibitory agregacji płytek krwi, leki przeciwkrzepliwe, blokery kanału wapniowego, inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), i b-blokery.

Lek jest korzystnie w odpowiedniej postaci do podawania doustnego, miejscowego, dożylnego, podskórnego, pozajelitowego, śródskórnego oraz korzystnie jest dla człowieka. Monoestry probukolu, a zwłaszcza monoester kwasu bursztynowego są korzystne zarówno w podstawowym, jaki dodanym leczeniu farmakologicznym chorób układu krążenia. Związki te stosuje się jako leki podstawowe w terapii na przykład chorób układu krążenia takich, jak miażdżyca, restenoza po angioplastyce, choroby naczyń wieńcowych i dusznica bolesna. Związki można podawać w leczeniu chorób małych naczyń, których nie można leczyć chirurgicznie ani angioplastycznie, lub chorób innych naczyń, w których leczenie chirurgiczne jest niewskazane. Związki można stosować również do stabilizacji stanu pacjenta przed leczeniem rewaskularyzacyjnym.

Niniejszy wynalazek, właściwie stosowany, zapewnia farmakologiczne wyleczenie miażdżycy poprzez zapobieganie tworzeniu się nowych zmian i powodowanie cofania się istniejących zmian.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku można stosować monoestry probukolu do leczenia przeciwzapalnych chorób, których mediatorem są leukocyty jednojądrzaste.

Krótki opis rysunków

Figura 1 stanowi wykres kolumnowy porównania działania monoestru probukolu kwasu bursztynowego z probukolem w stężeniu 2,5 mM, 5 mM, 10 mM i 100 mM na ekspresję VCAM-1 w komórkach HAEC.

Figura 2 stanowi wykres kolumnowy porównania działania monoestru probukolu kwasu bursztynowego z probukolem w stężeniu 2,5 mM, 5 mM, 10 mM i 100 mM na ekspresję ICAM-1 w komórkach HAEC.

Figura 3 stanowi wykres kolumnowy porównania działania 10 mM monoestru probukolu kwasu bursztynowego, 50 mM probukolu i TNF na ekspresję MCP-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty (HAEC).

Figura 4 ilustruje wpływ monoestru probukolu kwasu bursztynowego (10 i 25 mM) i probukolu (50 mM) na ekspresję genuw HAEC.

Figura 5 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego i probukolu na poziom cholesterolu w osoczu u królików żywionych lipidami.

Figura 6 stanowi wykres kolumnowy porównania stężenia monoestru probukolu kwasu bursztynowego i probukolu na poziom cholesterolu w osoczu u królików żywionych lipidami.

PL 194 329 B1

Figura 7 stanowi wykres wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom cholesterolu całkowitego w surowicy w modelu królików z hipercholesterolemią przez sześć tygodni.

Figura 8 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom cholesterolu całkowitego, LDLc, VLDLc, ILDLc, HDLc i TG u królików żywionych lipidami po sześciu tygodniach.

Figura 9 stanowi wykres odsetka pola powierzchni aorty, pokrytego zmianami, u królików żywionych lipidami, nieleczonych i leczonych monoestrem probukolu kwasu bursztynowego.

Figura 10 stanowi wykres poziomu w osoczu monoestru probukolu kwasu bursztynowego w mikromolach w zależności od liczby dni leczenia.

Fig. 11 stanowi wykres kolumnowy poziomu cholesterolu całkowitego, VLDL, IDL, LDL, HDL i trójglicerydów u myszy ApoE-KO po dwóch tygodniach po doustnym podaniu monoestru probukolu kwasu bursztynowego w porównaniu z kontrolą, w mg/ml.

Figura 12 stanowi wykres obniżenia poziomu LDL w surowicy u małp z hipercholesterolemią w poszczególnych dniach w czasie podawania i po podaniu monoestru probukolu kwasu bursztynowego.

Figura 13 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom LDL w surowicy u małp z hipercholesterolemią.

Figura 14 stanowi wykres kolumnowy wpływu na poziom białka całkowitego, wapnia, fosforanu, glukozy, BUN i cholesterolu (w jednostkach arbitralnych) doustnego podawania u szczurów przez dwa tygodnie monoestru probukolu kwasu bursztynowego w dawce 1000 mg/kg/d w porównaniu z kontrolą.

Figura 15 stanowi wykres kolumnowy wpływu, na poziom albuminy, kreatyniny, kwasu moczowego i bilirubiny całkowitej (w jednostkach arbitralnych) doustnego podawania u szczurów przez dwa tygodnie monoestru probukolu kwasu bursztynowego w dawce 1000 mg/kg/d w porównaniu z kontrolą.

Szczegółowy opis wynalazku

I. Definicje

Pojęcie monoester probukolu w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje (i) dowolny monoester probukolu, opisany w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5262439, na przykład estry kwasu karboksylowego i estry kwasu dikarboksylowego i ich sole; (ii) dowolny monoester probukolu o rozpuszczalności w wodzie większej od probukolu, obniżający poziom cholesterolu w osoczu, obniżający LDL i hamujący ekspresję VCAM-1, jak to szczegółowo opisano. W jednym z wykonań do monoestrów probukolu należą estry kwasu dikarboksylowego probukolu, w tym, jednak bez ograniczenia, estry kwasu bursztynowego, glutarowego, adypinowego, suberynowego, sebacynowego, azelainowego i maleinowego. W innym wykonaniu grupa estrowa obejmuje cząstkę czynnościową, zwiększającą rozpuszczalność związku w porównaniu z probukolem, włączając w to, jednak bez ograniczenia, nasycone i nienasycone kwasy dikarboksylowe i ich sole, kwasy aminokarboksylowe i ich sole, zawierające aldehyd kwasy karboksylowe i ich sole, grupę aminową, sól grupy aminowej, grupę amidową, grupy aldehydowe i ich sole. W jeszcze innym wykonaniu ester posiada cząstkę czynnościową dobraną z grupy, do której należą kwasy sulfonowe, estry kwasu sulfonowego, kwasy fosforowe, estry kwasu fosforowego, cykliczne fosforany, grupy polihydroksyalkilowe, grupa węglowodanowa, C(O)-grupa rozdzielająca-SO3H, przy czym grupę rozdzielającą stanowi (CH2)n-, -(CH2)n-CO-, -(CH2)n-N-, -(CH2)n-O-, -(CH2)n-S-, -(CH2O)-, -(OCH2)-, -(SCH2)-, -(CH2S)-, (arylo-O)-, -(O-arylowa), (alkilo-O)-, -(O-alkilowa)-; wartość n wynosi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10; C(O)-grupa rozdzielająca-SO3M, przy czym M stanowi metal stosowany do wytworzenia farmaceutycznie dopuszczalnej soli, na przykład sód lub potas, C(O)-grupa rozdzielająca-PO3H2, C(O)-grupa rozdzielająca-PO3M2, C(O)-grupa rozdzielająca-PO3HM, C(O)-grupa rozdzielająca-PO4H, C(O)-grupa rozdzielająca-PO4M, SO3M, -PO3H2, -PO3M2, -PO3HM, cykliczne fosforany, grupy polihydroksyalkilowe, węglowodanowe, grupa C(O)-grupa rozdzielająca-[O(C1-3alkilowa)p]n, w której n jest takie, jak to zdefiniowano powyżej, a wartość p wynosi 1, 2 lub 3, niższy alkil [O(C1-3alkilowy)p]nkarboksylowy, niższy alkil niższej grupy alkilokarbonylowej, niższy alkil N,N-dialkiloaminowy, niższy alkil pirydylowy, niższy alkil imidazolilowy, niższy alkil morfolinylowy, niższy alkil pirolidynylowy, niższy alkil tiazolinylowy, niższy alkil piperydynylowy, niższy hydroksyalkil morfolinylowy, grupa N-pirylowa, niższy alkil piperazynylowy, niższy alkil N-alkilopiperazynylowy, niższy alkil triazolilowy, niższy alkil tetrazolilowy, niższy alkil tetrazoliloaminowy lub niższy alkil tiazolilowy.

Pojęcie farmaceutycznie dopuszczalna pochodna oznacza pochodną związku czynnego, która po podaniu dawcy jest zdolna do dostarczenia, bezpośrednio lub pośrednio, związku macierzystego, lub sama wykazuje aktywność.

PL 194 329 B1

Pojęcie fizjologicznie rozszczepialna grupa opuszczająca oznacza cząstkę, którą można rozszczepić in vivo od cząsteczki, do której jest przyłączona; pojęcie to obejmuje, jednak bez ograniczenia, anion organiczny i nieorganiczny, farmaceutycznie dopuszczalny kation, grupę acylową (włączając w to, jednak bez ograniczenia, grupę (alkilo)C(O), w tym grupę acetylową, propionylową i butyrylową), alkilową, fosforan, siarczan i sulfonian.

W leczeniu miażdżycy i innych chorób układu krążenia i chorób zapalnych należy stosować te monoestry probukolu, które wykazują lipofilność odpowiednią do umiejscowienia się w miejscu zajętym procesem chorobowym. Związek nie powinien gromadzić się w miejscach o małym obrocie metabolicznym, takich jak na przykład tkanka tłuszczowa. W korzystnym wykonaniu w leczeniu chorób układu krążenia zastoinowa niewydolność serca ani niewydolność nerek nie powinny wpływać na farmakokinetykę związku.

Związek czynny lub mieszaninę związków podaje się w dowolny odpowiedni sposób, w tym, jednak bez ograniczenia, podaje się go ogólnie, w tym doustnie lub dożylnie, lub miejscowo, w tym przezskórnie. Dawki pozostają na ogół w zakresie od 0,1 do 500 mg/kg masy ciała, a częstość podawania zależy od podawania raz na dwa dni do dwóch lub kilku razy dziennie. Czas trwania leczenia wynosi od pojedynczej dawki podanej jednorazowo do dwóch dawek dziennie podawanych przez czas od dwóch do sześciu miesięcy. W leczeniu chorób układu krążenia związki można także podawać bezpośrednio do ściany naczyniowej, stosując perfuzyjne cewniki z balonikiem po angioplastyce naczyń wieńcowych lub innych tętnic lub zamiast takiej angioplastyki. Na przykład podaje się 2-5 ml fizjologicznie dopuszczalnego roztworu, zawierającego około 1-500 mM związku lub mieszaniny związków pod ciśnieniem 1-5 atmosfer. Przez następne sześć miesięcy, czyli w okresie największego zagrożenia restenozą, podaje się związki czynne innymi korzystnymi drogami według innych korzystnych schematów podawania.

Leczenie względnie krótkotrwałe związkami czynnymi stosuje sięw celu wywołania skurczenia się uszkodzeń miażdżycowych naczynia wieńcowego, których nie można leczyć angioplastycznie ani chirurgicznie. Nieograniczającym przykładem leczenia krótkotrwałego jest podawanie związku przez czas od dwóch do sześciu miesięcy w dawce od 0,5 do 500 mg/kg masy ciała z częstością od raz na dwa dni do trzy razy dziennie.

Można prowadzić leczenie bardziej długotrwałe w celu zapobiegania rozwojowi zaawansowanych zmian u pacjentów wysokiego ryzyka. Leczenie długoterminowe można prowadzić przez wiele lat, podając dawki 0,5-500 mg/kg masy ciała z częstością od raz na dwa dni do trzy razy dziennie.

Związek czynny można również podawać w okresie bezpośrednio przed i bezpośrednio po angioplastyce naczyń wieńcowych jako środek do zmniejszania lub eliminowania nieprawidłowej reakcji proliferacyjnej i zapalnej, która obecnie prowadzi do klinicznie istotnej restenozy.

Związek czynny można podawać w połączeniu z innymi lekami, stosowanymi w leczeniu chorób układu krążenia, takimi jak inhibitory agregacji płytek krwi, takie jak aspiryna; leki przeciwkrzepliwe, takie jak kumadyna; blokery kanału wapniowego, takie jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), takie jak kaptopril i enalapril, i b-blokery, takie jak propranolol, terbutalol i labetalol. Związki można podawać także w połączeniu z niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi, takimi jak ibuprofen, indometacyna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy i sulindak. Związek można podawać także w połączeniu z kortykosteroidami.

MSE podawane przez grudki wstrzyknięte podskórnie (grudki uwalniające 150 mg/kg/dziennie) blokują pobudzaną przez LPS ekspresję genu VCAM-1 i MCP-1 w płucach w modelu mysim. Doustne podawanie MSE (150 mg/kg/dziennie) przez sześć tygodni obniża poziom cholesterolu całkowitego w osoczu, poziom cholesterolu zawierającego ApO-B i cholesterolu HDL w modelu białych królików nowozelandzkich. Wpływowi na poziom cholesterolu w osoczu towarzyszy zaznaczone hamowanie tworzenia zmian miażdżycowych, gromadzenia się makrofagów i ekspresji VCAM-1.

Doustne podawanie MSE przez dwa tygodnie wybiórczo obniża poziom zawierających apoB lipoprotein w modelu myszy czarnych karmionych cholesterolem i myszy nie wykazujących ekspresji apoE, bez wpływu na HDL. Doustne podawanie MSE przez dwa tygodnie w modelu makaków z hipercholesterolemią obniża poziom cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL w osoczu, bez wpływu na HDL.

W bakteryjnym teście Amesa MSE nie jest mutagenem. Doustne podawanie MSE w dawce 1000 mg/kg/dziennie przez dwa tygodnie szczurom nie powoduje ich padania i nie wywiera wpływu na poziom elektrolitów w surowicy ani na wartości hematokrytu. Obserwowano podwyższenie poziomu

PL 194 329 B1

LDH w surowicy, fosfatazy alkalicznej, SGOT i SGPT, jednak nie było ono statystycznie różne od grupy nieleczonej i nie towarzyszyły mu zmiany w zakresie morfologii i histopatologii wątroby.

Do zastosowania miejscowego w leczeniu zapalnych chorób skórnych dobrany związek należy wytworzyć w takiej postaci, aby wchłaniał się przez skórę w ilości odpowiedniej do wywarcia działania terapeutycznego na miejsce objęte zmianami. Monoester probukolu musi być fizjologicznie dopuszczalny. Na ogół dopuszczalne są związki o wskaźniku terapeutycznym wynoszącym co najmniej 2, korzystnie, co najmniej 5 lub 10. Wskaźnik terapeutyczny definiuje się jako EC50/IC50, przy czym EC50 oznacza stężenie związku hamujące ekspresję VCAM-1 o 50%, a IC50 oznacza stężenie związku, które jest toksyczne dla 50% komórek docelowych. Toksyczne działanie na komórki można mierzyć poprzez bezpośrednie oznaczanie liczby komórek, wyłączanie błękitu trypanowego, lub rozmaite badania aktywności metabolicznej, takie jak włączanie 3H-tymidyny, znane specjalistom.

Wynalazek zilustrowano w poniższych przykładach, stosujących MSE jako związek modelowy. Służą one jedynie ilustracji, nie zaś ograniczeniu zakresu niniejszego wynalazku. Do leczenia chorób układu krążenia i chorób zapalnych w podobny sposób można stosować dowolny inny monoester probukolu według niniejszego wynalazku.

Przykład 1

Ekspresja VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty

Figura 1 stanowi wykres kolumnowy porównania działania monoestru probukolu kwasu bursztynowego z probukolem w stężeniu 2,5 mM, 5 mM, 10 mM i 100 mM na ekspresję VCAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty in vitro jako odsetek ekspresji VCAM-1 wywoływanej przez sam TNF. Komórki inkubowano przez szesnaście godzin w pożywce do hodowli komórkowej w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowej. Po szesnastu godzinach komórki przemyto i inkubowano z przeciwciałami skierowanymi przeciwko VCAM-1. Ilość przeciwciał wiążących się z komórkami oznaczano w kolorymetrycznym teście ELISA, stosując przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową, skierowane przeciwko przeciwciału VCAM-1. Jak to wskazano, MSE hamuje w tych warunkach ekspresję VCAM-1, natomiast probukol nie wykazuje zauważalnego działania na VCAM.

Przykład 2

Ekspresja ICAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty

Figura 2 stanowi wykres kolumnowy porównania działania monoestru probukolu kwasu bursztynowego z probukolem w stężeniu 2,5 mM, 5 mM, 10 mM i 100 mM na ekspresję ICAM-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty in vitro jako odsetek ekspresji ICAM-1 wywoływanej przez sam TNF. Komórki inkubowano przez szesnaście godzin w pożywce do hodowli komórkowej w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowej. Po szesnastu godzinach komórki przemyto i inkubowano z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ICAM-1. Ilość przeciwciał wiążących się z komórkami oznaczano w kolorymetrycznym teście ELISA, stosując przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową, skierowane przeciwko przeciwciału ICAM-1. Jak to wskazano, MSE wykazywało jedynie nieznaczny wpływ na ekspresję ICAM, który nie zależał w znacznym stopniu od stężenia, a probukol nie wykazywał wpływu na ekspresję ICAM.

Przykład 3

Ekspresja MCP-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty

Figura 3 stanowi wykres kolumnowy porównania działania 10 mM monoestru probukolu kwasu bursztynowego, 50 mM probukolu i TNF na ekspresję MCP-1 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty (HAEC). Komórki traktowano samym TNF lub TNF w połączeniu z 10 mikromolami monoestru probukolu kwasu bursztynowego przez cztery godziny. Zebrano pożywkę do hodowli komórkowej i zastosowano ją do ilościowego oznaczenia ilości MCP-1, stosując oparty na zabarwieniu test ELISA. Jak to ukazano, monoester probukolu hamował ekspresję MCP-1 w większym stopniu, niż sam probukol. MCP-1 jest białkiem chemotaktycznym, powodującym napływ monocytów do zmiany miażdżycowej.

Przykład 4

Wpływ monoestru probukolu kwasu bursztynowego na ekspresję genu in vitro w ludzkich komórkach śródbłonka aorty

Figura 4 stanowi analizę metodą Northern blot ekspresji genu VCAM-1 i MCP-1 z RNA izolowanego z płuc eksponowanych na LPS myszy nie wykazujących ekspresji apoE. Myszom podawano MSE, probukol i placebo podskórnie w postaci 400 mg grudki uwalniającej swą zawartość w czasie 90 dni. Po tygodniu myszom podano dootrzewnowo 1 mg/kg LPS. Po dwóch godzinach zwierzęta uśmiercano, a płuca zamrażano w celu izolowania RNA. Dokonywano frakcjonowania RNA ze względu na wielkość poprzez denaturację metodą elektroforezy na 1,0% żelu agarozowym, przenoszono na

PL 194 329 B1 błonę nylonową i hybrydyzowano z mysią sondą cDNA, JE-swoistą, wyznakowaną ³²P. Błonę pocięto następnie na paski i hybrydyzowano z mysim cDNA VCAM-1-swoistym w następnie z kurzą b-aktynowo-swoistą sondą cDNA.

Przykład 5

Wpływ monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom cholesterolu w osoczu u królików żywionych lipidami.

Figura 5 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego i probukolu na poziom cholesterolu całkowitego i poziom cholesterolu lipoprotein w osoczu u królików żywionych lipidami. Króliki żywiono karmą wysokotłuszczową (0,5% cholesterolu i 3% oleju kokosowego), zawierającą 0,5% wagowo MSE lub probukolu, przez trzy tygodnie. Zwierzęta kontrolne żywiono tą samą karmą bez dodatku leku. Z osocza pełnego izolowano frakcje lipoprotein chromatografią płynną fazy szybkiej i analizowano pod kątem zawartości cholesterolu. MSE spowodowało statystycznie znamienne zmniejszenie poziomu wszystkich frakcji lipoprotein, a probukol - jedynie cholesterolu HDL (p<0,05).

Przykład 6

Porównanie działania poziomu MSE i probukolu w osoczu u królików otrzymujących przez trzy tygodnie dietę wysokocholesterolową.

Królikom podawano w karmie wysokotłuszczowej (0,5% cholesterolu i 3% oleju kokosowego) MSE lub probukol w stężeniu 0,5% wagowo przez trzy tygodnie. Leki ekstrahowano z surowicy eterem i analizowano chromatografią cieczową wysokociśnieniową. Jak to ukazano, poziom probukol i MSE był podobny, mimo że, jak to pokazano w przykładach wyżej, związki wykazywały znamiennie różny wpływ na poziom cholesterolu i lipoprotein w osoczu.

Przykład 7

Wpływ MSE na pobudzenie NF-kB

Ludzkie komórki śródbłonka aorty traktowano samym TNF lub TNF w połączeniu z 25 mikromolami MSE lub PDTC przez czas jednej, dwóch lub czterech godzin. Komórki przemyto i przygotowano ekstrakty z jąder w celu przeprowadzenia żelowej analizy przemieszczeń, z zastosowaniem sondy promotorowej VCAM-1.

Stwierdzono, że MSE nie wpływa na pobudzenie NF-kB, natomiast PDTC hamuje pobudzenie NF-kB.

Przykład 8

Efekt sześciotygodniowego oddziaływania MSE na poziom cholesterolu u królików żywionych cholesterolem.

Białym królikom nowozelandzkim podawano dietę wysokotłuszczową i wysokocholesterolową (0,5%), samą lub w połączeniu z 0,5 wagowo (około 150 mg/kg/dzień) AGE-3 lub probukolu przez sześć tygodni.

Figura 8 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom cholesterolu całkowitego, LDLc, VLDLc, ILDLc, HDLc i trójglicerydów (TG) u królików żywionych lipidami po sześciu tygodniach. Po sześciu tygodniach z osocza pełnego wydzielono frakcje lipoprotein poprzez chromatografię cieczową fazy szybkiej i analizowano pod kątem zawartości cholesterolu i trójglicerydów. Jak to wskazano w przykładzie 8, poziom cholesterolu całkowitego, jak również cholesterolu w VLDL i IDL, uległy znaczniejszemu obniżeniu pod wpływem AGE-3, niż probukolu.

Przykład 9

Wpływ AGE-3 na postęp miażdżycy u zwierząt z hipercholesterolemią.

Króliki opisane w przykładzie 8 uśmiercono i pobrano ich aorty. Aorty barwiono sudanem 4 i analizowano natężenie zabarwienia.

Figura 9 stanowi wykres odsetka pola powierzchni aorty, pokrytego zmianami, u królików żywionych lipidami, leczonych MSE i nieleczonych. Aorty królików otrzymujących AGE-3 wykazywały znacznie słabsze zabarwienie, co wskazuje na mniejsze nasilenie miażdżycy u zwierząt leczonych monoestrem probukolu kwasu bursztynowego.

Przekroje aort barwiono immunologicznie dla uwidocznienia ekspresji VCAM-1 lub gromadzenia się makrofagów, stosując przeciwciała skierowane przeciwko VCAM-1 lub antygenowi Ram-11. Leczenie AGE-3 wyraźnie zmniejszało ekspresję VCAM-1 i gromadzenie się makrofagów (to znaczy o ponad 75%). W podobnym doświadczeniu probukol w tej samej dawce był znacznie mniej skuteczny (zmniejszenie ekspresji VCAM-1 i gromadzenia się makrofagów o mniej niż 25%).

PL 194 329 B1

P r zyk ł a d 10

AGE-3 w sposób odwracalny obniża poziom LDL u małp z hipercholesterolemią.

Przed podaniem AGE-3 u makaków wywołano hipercholesterolemię poprzez podawanie diety wysokotłuszczowej i wysokocholesterolowej. Małpom podawano następnie doustnie AGE-3 (100 mg/kg/dzień) przez dwa tygodnie. W tym czasie odsetek cholesterolu LDL w surowicy małp spadał o 4-60%. Zaprzestawano wówczas podawania leku, i sprawdzano poziom cholesterolu w dniu 29. Poziom cholesterolu powracał do wartości sprzed leczenia i pozostawał stały.

P r zyk ł a d 10

Figura 10 stanowi wykres poziomu w osoczu monoestru probukolu kwasu bursztynowego w mikromolach w zależności od liczby dni leczenia. Jak to wskazano, poziom MSE pozostawał dość stały.

P r zyk ł a d 11

Figura 11 stanowi wykres kolumnowy poziomu cholesterolu całkowitego, VLDL, IDL, LDL, HDL i trójglicerydów u myszy ApoE-KO po dwóch tygodniach po doustnym podaniu estru kwasu jednobursztynowego probukolu (150 mg/kg/dzień) w porównaniu z kontrolą, w mg/ml.

P r zyk ł a d 12

Figura 12 stanowi wykres odwracalnego obniżenia poziomu LDL u małp z hipercholesterolemią w poszczególnych dniach w czasie podawania i po podaniu monoestru probukolu kwasu bursztynowego.

P r z y k ł a d 13

Figura 13 stanowi wykres kolumnowy wpływu monoestru probukolu kwasu bursztynowego na poziom LDL w surowicy u małp z hipercholesterolemią.

P r zyk ł a d 14

Figura 14 stanowi wykres kolumnowy wpływu na poziom białka całkowitego, wapnia, fosforanu, glukozy, BUN i cholesterolu (w jednostkach arbitralnych) doustnego podawania u szczurów przez dwa tygodnie monoestru probukolu kwasu bursztynowego w dawce 1000 mg/kg/d w porównaniu z kontrolą.

P r zyk ł a d 15

Figura 15 stanowi wykres kolumnowy wpływu na poziom albuminy, kreatyniny, kwasu moczowego i bilirubiny całkowitej (w jednostkach arbitralnych) doustnego podawania u szczurów przez dwa tygodnie monoestru probukolu kwasu bursztynowego w dawce 1000 mg/kg/d w porównaniu z kontrolą.

Stwierdzono, że istnieje różnica w działaniu MSE i probukolu u myszy, u królików i u małp w zakresie działania na poziom cholesterolu całkowitego i LDL. MSE jest znamiennie bardziej skuteczne w obniżaniu zarówno cholesterolu, jak i LDL, u królików i małp w porównaniu z myszami. Wydaje się, że MSE ma to samo działanie u myszy, co probukol, to znaczy minimalny lub żaden wpływ na te dwa czynniki. MSE jednakże hamuje ekspresję VCAM-1 u wszystkich badanych gatunków.

III. Preparaty farmaceutyczne

Ludzi, konie, psy, bydło i inne zwierzęta, zwłaszcza ssaki, cierpiące na którąkolwiek z chorób wspomnianych w niniejszym opisie, w tym na choroby układu krążenia i choroby zapalne, których mediatorem jest VCAM-1, można leczyć poprzez podawanie im skutecznej ilości jednego lub kilku wyżej opisanych związków lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych lub soli w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozcieńczalniku. Substancję czynną można podawać dowolną odpowiednią drogą, na przykład doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie farmaceutycznie dopuszczalne sole lub kompleksy oznacza sole lub kompleksy, zachowujące biologiczną aktywność wyżej opisanych związków i wykazujące jak najmniej niepożądanych działań toksycznych. Nieograniczającymi przykładami takich soli są (a) kwasowe sole addycyjne utworzone z kwasami nieorganicznymi (na przykład kwasem solnym, bromowodorowym, siarkowym, fosforowym, azotowym i tym podobnymi) i sole utworzone z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, bursztynowy, jabłkowy, askorbinowy, benzoesowy, garbnikowy, 4,4'-metylenobis-3-hydroksynaftoesowy, alginowy, poliglutaminowy, naftalenosulfonowy, naftalenodisulfonowy i poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne utworzone z wielowartościowymi kationami metali, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas i tym podobne, lub z kationem organicznym, utworzonym z N,N-dibenzyloetylenodiaminy, D-glukozaminy, amonu, tetraetyloamonu lub etylenodiaminy lub (c) połączenia (a) i (b), na przykład sól garbnikowa cynku lub tym podobne.

Związek czynny obecny jest w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozcieńczalniku w ilości wystarczającej dla dostarczenia pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości leku bez powodowania

PL 194 329 B1 u leczonego pacjenta poważnych działań toksycznych. Korzystna dawka związku czynnego dla wszystkich wyżej opisanych warunków wynosi od około 0,1 do 500 mg/kg, korzystnie, 1-100 mg/kg dziennie. Skuteczny zakres dawek farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych można obliczyć w oparciu o masę podawanego związku macierzystego. Jeżeli pochodna sama wykazuje aktywność, skuteczne dawkowanie można oszacować w sposób wyżej opisany z zastosowaniem masy pochodnej lub innymi sposobami znanymi specjalistom.

Przy podawaniu ogólnym, związek korzystnie podaje się w dowolnej postaci dawek jednostkowych, w tym, jednak bez ograniczenia, w dawce zawierającej 1-3000 mg, korzystnie 5-500 mg składnika czynnego na postać dawek jednostkowych. Zwykle korzystna jest dawka doustna 25-250 mg. Składnik czynny należy podawać w taki sposób, aby uzyskiwać szczytowe stężenie w osoczu związku czynnego wynoszące około 0,1-100 mM, korzystnie około 1-10 mM. Można to osiągnąć na przykład poprzez dożylne wstrzyknięcie roztworu lub preparatu składnika czynnego, ewentualnie w soli fizjologicznej, lub w środowisku wodnym, lub podawać w postaci bolusu składnika czynnego.

Stężenie związku czynnego w preparacie leku będzie zależało od prędkości wchłaniania, dystrybucji, unieczynniania i wydalania leku, jak również od innych czynników znanych specjalistom. Należy zauważyć, że wartość dawek będzie również zależała od nasilenia leczonego schorzenia. Należy również rozumieć, że dla każdego pacjenta należy odpowiednio dostosować schemat dawkowania w czasie w zależności od indywidualnego zapotrzebowania i profesjonalnej oceny osoby podającej lek lub nadzorującej podawanie leku, i że podany powyżej zakres stężenia jest jedynie przykładowy i nie ma na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku. Składnik czynny można podawać w jednej dawce lub w kilku mniejszych dawkach w różnych odstępach czasu.

Preparaty doustne będą zwykle zawierać obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one być nałożone do kapsułek żelatynowych lub sprasowane w tabletki. W celu leczniczego podawania doustnego składnik czynny można łączyć z zaróbkami i podawać w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. Jako składnik preparatu można dodawać farmaceutycznie dopuszczalne środki wiążące i/lub substancje dodatkowe.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i tym podobne mogą zawierać dowolne z następujących składników lub związki o podobnym charakterze: środek wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, żywica tragakantowa lub żelatyna; zaróbkę, taką jak skrobia lub laktoza; środek rozsadzający, taki jak kwas alginowy; Primogel lub skrobia kukurydziana; środek zwilżający, taki jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, taki jak koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna; lub środek poprawiający smak, taki jak mięta, salicylan metylowy lub smak pomarańczowy. Gdy postać dawek jednostkowych stanowi kapsułka, może ona zawierać, oprócz substancji omówionego wyżej typu, nośnik płynny, taki jak olej. Ponadto postać dawek jednostkowych może zawierać rozmaite inne substancje, zmieniające postać fizyczną dawek jednostkowych, na przykład powłokę z cukru, szelaku lub innego środka powlekającego. Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub pochodną można podawać jako składnik eliksiru, zawiesiny, syropu, wafla, gumy do żucia lub tym podobnych. Syrop może zawierać, oprócz związków czynnych, sacharozę jako środek słodzący i pewne środki konserwujące, barwniki i środki poprawiające smak.

Związek czynny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub pochodną można również podawać wraz z innymi substancjami czynnymi, nie zaburzającymi jego korzystnego działania, lub z substancjami uzupełniającymi korzystne działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne lub przeciwwirusowe. Związki czynne można podawać ze środkami obniżającymi poziom lipidów, takimi jak probukol i kwas nikotynowy; inhibitorami agregacji płytek krwi, takimi jak aspiryna; lekami przeciwkrzepliwymi, takimi jak kumadyna; blokerami kanałów wapniowych, takimi jak werapamil, diltiazem i nifedypina; inhibitorami konwertazy angiotensyny (ACE), takimi jak kaptopril i enalapril, i b-blokerami, takimi jak: propanalol, terbutalol i labetalol. Związki można podawać także w połączeniu z niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi, takimi jak ibuprofen, indometacyna, aspiryna, fenoprofen, kwas mefenamowy, kwas flufenamowy i sulindak. Związek można podawać także w połączeniu z kortykosteroidami.

Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskórnego, podskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki: jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do wstrzyknięć; roztwór soli fizjologicznej, oleje zestalone, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub parabeny metylowe; przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub dwusiarczyn sodowy; środki chelatujące,

PL 194 329 B1 takie jak kwas etylenodiaminoczterooctowy; bufory, takie jak octany, cytryniany lub fosforany i środki do modyfikacji toniczności, takie jak chlorek sodu lub dekstroza.

Preparaty pozajelitowe można pakować w ampułki, strzykawki do jednorazowego użytku lub fiolki zawierające wiele dawek, szklane lub plastykowe.

Znane są korzystne zaróbki i nośniki do podawania miejscowego; do preparatów do podawania miejscowego należą płyny do zmywania, zawiesiny, maści, kremy, żele, nalewki, aerozole, proszki, pasty, plastry przezskórne o powolnym uwalnianiu, aerozole do stosowania w dychawicy oskrzelowej i czopki - doodbytnicze i dopochwowe oraz środki do stosowania na śluzówkę nosa i jamy ustnej.

Do wytwarzania preparatów do stosowania miejscowego można stosować środki zagęszczające, emulgujące i stabilizujące. Przykładami środków zagęszczających są wazelina żółta, wosk pszczeli, żywica ksantanowa i glikol polietylenowy; można stosować środki zwilżające, takie jak sorbit, emulgujące, takie jak olej mineralny, lanolina i jej pochodne, lub skwalen. Na rynku znajduje się kilka roztworów i maści.

Do preparatów do stosowania miejscowego, w celu wywołania miejscowego efektu, na powierzchnię śluzówek można dodawać naturalne lub sztuczne środki poprawiające smak i środki słodzące w celu wzmocnienia smaku preparatu. Można dodawać obojętne barwniki, zwłaszcza w przypadku preparatów do stosowania na śluzówkę jamy ustnej.

Związki czynne można wytwarzać w postaci preparatów z nośnikami zabezpieczającymi związek przed szybkim uwalnianiem, na przykład w postaci preparatów o kontrolowanym uwalnianiu, w tym wszczepów i mikrokapsułkowych systemów uwalniania. Można stosować ulegające rozpadowi biologicznemu i zgodne biologiczne polimery, takie jak octan etylenowinylowy, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele jest opatentowanych lub ogólnie znanych sposobów wytwarzania takich preparatów.

Przy podawaniu doustnym korzystne nośniki stanowią sól fizjologiczna lub sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS).

Związek czynny można również podawać w postaci plastra przezskórnego. Sposoby wytwarzania plastrów przezskórnych są znane specjalistom. Por. na przykład Brown, L. i Langer, R., Transdermal Delivery of Drugs, Annual Review of Medicine, 39: 221-229 (1988); publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.

W innym wykonaniu związek czynny wytwarza się z nośnikami zabezpieczającymi związek przed szybką eliminacją z ustroju, w postaci na przykład preparatów o kontrolowanym uwalnianiu, w tym wszczepów i mikrokapsułkowych systemów uwalniania. Można stosować ulegające rozpadowi biologicznemu i zgodne biologiczne polimery, takie jak octan etylenowinylowy, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich preparatów są oczywiste dla specjalisty. Materiały na ten temat można również nabyć w firmie Alza Corporation lub Nova Pharmaceuticals, Inc. Farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami mogą być również zawiesiny liposomowe. Można je wytwarzać sposobami znanymi specjalistom, jak to opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4522811 (który włącza się w całości do niniejszego opisu przez przywołanie). Preparaty liposomowe można na przykład wytwarzać poprzez rozpuszczenie odpowiedniego lipidu lub lipidów (takiego jak fosfatydyloetanoloamina stearylowa, fosfatydylocholina stearylowa, fosfatydylocholina arachidoilowa i cholesterol) w rozpuszczalniku nieorganicznym, który następnie odparowuje, pozostawiając cienką warstwę wysuszonego lipidu na powierzchni pojemnika. Następnie do pojemnika można wprowadzić wodny roztwór składnika czynnego lub jego pochodnej jednofosforanowej, dwufosforanowej i/lub trójfosforanowej. Pojemnik następnie ręcznie wprawia się w ruch wirowy dla uwolnienia substancji lipidowej z boków pojemnika i rozproszenia skupisk lipidów, wytwarzając w ten sposób zawiesinę liposomów.

Dla specjalisty po zapoznaniu się z powyższym opisem oczywiste będą modyfikacje i odmiany niniejszego wynalazku. Wszystkie takie wykonania objęte są zakresem niniejszego wynalazku.

Claims (35)

1. Zastosowanie skutecznej leczniczo ilości monoestru probukolu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby mediowanej VCAM-1 wybranej z grupy obejmującej dusznicę bolesną i chorobę tętnic małego kalibru.

2. Zastosowanie według zastrz. 1do wytwarzania leku do leczenia choroby tętnic małego kalibru.

PL 194 329 B1

3. Zastosowanie według zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia dusznicy bolesnej.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu bursztynowego.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu glutarowego.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu adypinowego.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu suberynowego.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu sebacynowego.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu azelainowego.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu maleinowy.

11. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienne tym, że obejmuje również podawanie monoestru probukolu w połączeniu z innym lekiem, stosowanym w leczeniu chorób układu krążenia, dobranym z grupy, do której należą leki obniżające poziom lipidów, inhibitory agregacji płytek krwi, leki przeciwkrzepliwe, blokery kanału wapniowego, inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), i b-blokery.

12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienne tym, że lek jest w odpowiedniej postaci do podawania doustnego, miejscowego, dożylnego, podskórnego, pozajelitowego, śródskórnego.

13. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienne tym, że lek jest dla człowieka.

14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest w odpowiedniej postaci do podawania doustnego, miejscowego, dożylnego, podskórnego, pozajelitowego, śródskórnego.

15. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, żelek jest dla człowieka.

16. Zastosowanie skutecznej ilości monoestru probukolu lub jego farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarzania leku do leczenia choroby, mediowanej VCAM-1, będącej chorobą zapalną.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi ludzkie zaburzenie śródbłonkowe.

18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi dychawica oskrzelowa.

19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi łuszczyca.

20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi wypryskowe zapalenie skóry.

21. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi mięsak Kaposiego.

22. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi stwardnienie rozsiane.

23. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobę stanowi proliferacyjne zaburzenie komórek mięśni gładkich.

24. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu bursztynowego.

25. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu glutarowego.

26. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu adypinowego.

27. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu suberynowego.

28. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu sebacynowego.

29. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu azelainowego.

30. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że monoester stanowi monoester probukolu kwasu maleinowego.

31. Zastosowanie według zastrz. 16 albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, znamienne tym, że obejmuje rówPL 194 329 B1 nież podawanie monoestru probukolu w połączeniu z innym lekiem, stosowanym w leczeniu chorób układu krążenia, dobranym z grupy, do której należą leki obniżające poziom lipidów, inhibitory agregacji płytek krwi, leki przeciwkrzepliwe, blokery kanału wapniowego, inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE), i b-blokery.

32. Zastosowanie według zastrz. 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, znamienne tym, że lek jest w odpowiedniej postaci do podawania doustnego, miejscowego, dożylnego, podskórnego, pozajelitowego, śródskórnego.

33. Zastosowanie według zastrz. 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, znamienne tym, że lek jest dla człowieka.

34. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że lek jest w odpowiedniej postaci do podawania doustnego, miejscowego, dożylnego, podskórnego, pozajelitowego, śródskórnego.

35. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że lek jest dla człowieka.