PL215097B1 - Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense - Google Patents

Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense

Info

Publication number
PL215097B1
PL215097B1 PL372423A PL37242303A PL215097B1 PL 215097 B1 PL215097 B1 PL 215097B1 PL 372423 A PL372423 A PL 372423A PL 37242303 A PL37242303 A PL 37242303A PL 215097 B1 PL215097 B1 PL 215097B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
phl
seq
gly
ala
dna
Prior art date
Application number
PL372423A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372423A1 (pl
Inventor
Helmut Fiebig
Andreas Nandy
Roland Suck
Oliver Cromwell
Arnd Petersen
Wolf-Meinhard Becker
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29797135&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL215097(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of PL372423A1 publication Critical patent/PL372423A1/pl
Publication of PL215097B1 publication Critical patent/PL215097B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A61K39/36—Allergens from pollen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy dostarczenia sekwencji genetycznej głównego alergenu pyłku traw Phl p 4. Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym. Rekombinowane cząsteczki DNA i pochodzące od nich polipeptydy, fragmenty czy też nowe kombinacje i warianty sekwencji częściowych mogą zostać wykorzystywane w terapii chorób alergicznych wywoływanych przez pyłki. Białka wytworzone metodą rekombinacji mogą być zastosowane w diagnostyce in vitro i in vivo alergii na pyłki.
STAN TECHNIKI
Alergie typu I mają duże znaczenie światowe. Aż 20% populacji państw uprzemysłowionych cierpi na schorzenia o podłożu alergicznym takie jak zapalenie nosa, zapalenie spojówek, czy też dychawica oskrzelowa. Alergie te wywoływane są przez znajdujące się w powietrzu alergeny (aeroalergeny), które pochodzą z różnych źródeł takich jak pyłki roślin, kleszcze, koty lub psy. Z kolei aż u około 40% alergików należących do opisywanego typu I występuje specyficzna reaktywność IgE z alergenami pyłków traw (Freidhoff et al., J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001).
Do substancji wywołujących alergie I typu należą białka, glikoproteiny oraz polipeptydy. Po przeniknięciu błony śluzowej alergeny takie u osób uwrażliwionych reagują z cząsteczkami IgE znajdującymi się na powierzchni komórek tucznych. Jeśli dwie cząsteczki IgE łączą się ze sobą przez alergen, dochodzi do uwolnienia mediatorów (np. histamin i prostaglandyn) oraz cytokin przez komórkę efektorową, a tym samym do odpowiednich symptomów klinicznych.
W zależności od względnej częstotliwości reakcji poszczególnych cząsteczek alergenów z przeciwciałami IgE alergików, wyróżniamy alergeny główne i alergeny poboczne (drugorzędowe).
W przypadku tymotki łąkowej (Phleum pratense) jako alergeny główne zidentyfikowano dotychczas: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy C (in. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) oraz Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Phl p 4 opisywana jest jako zasadowa glikoproteina o masie cząsteczkowej od 50 do 60 kDa (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). Cząsteczka Phl p 4 jest oporna na działanie trypsyny (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) i 70-88% alergików uczulonych na pyłki traw posiada przeciwciała IgE przeciwko niej skierowane (Valenta et al., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi et al., 2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33:43-51). Opisano homologiczne cząsteczki ze spokrewnionych gatunków traw (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; 14 -17); takie homologiczne cząsteczki traw (łac.: Poaceae) tworzą grupę alergenów 4, których molekuły wykazują wysoką immunologiczną reaktywność krzyżową między sobą jak również z monoklonalnymi przeciwciałami myszy oraz z ludzkimi przeciwciałami IgE (Fahlbusch et al., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; Su et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll et al. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote et al., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson und Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych alergenów głównych Phleum pratense (Phl p 1, Phl p 2/3, Phl 5a i 5b, Phl p 6 i Phl p 13), struktura pierwszorzędowa Phl p 4 nie jest jeszcze jasna. Pełna sekwencja cząsteczek grupy 4 z innych gatunków traw również jest jeszcze niedostępna.
Ustalenie N-terminalnej sekwencji aminokwasowej nie zakończyło się do tej pory sukcesem. Jednak przyczyny tego nie są znane. Fischer et al. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) wysuwają przypuszczenie o zablokowaniu N-końca, udało im się jednakże oczyścić peptyd wewnętrzny po rozcięciu endopeptydazą i ustalić jego sekwencję: IVALPXGMLK (SEQ ID Nr 7).
Peptyd ten wykazuje homologię z sekwencjami peptydowymi alergenów krostawca -Amb a1 i Amb a2 jak również podobieństwo do sekwencji białek kukurydzy (Zm58.2), pomidora (lat 59, lat 56)
PL 215 097 B1 i tytoniu (G10) (Fischer et al., 1996; J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198). Dla fragmentów peptydowych zasadowych alergenów grupy 4 w przypadku życicy trwałej (Lolium perenne) ustalono następujące sekwencje: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID Nr 8) oraz GLIEFPAGV (SEQ ID Nr 9) (Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).
W wyniku enzymatycznego rozcięcia uzyskano peptydy alergenów grupy 4 z Dactylus glomerata i poddano je sekwencjonowaniu:
DIYNYMEPYVSK (P15, SEQ ID Nr 10),
VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID Nr 11),
ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID Nr 12) oraz GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEQ ID Nr 13) (Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072).
Poprzez proteolizę otrzymano także peptydy alergenów grupy 4 subtropikalnego gatunku psiozęba palczastego (Cynodon dactylon) i poddano je sekwencjonowaniu:
KTVKPLYIITP (S, SEQ ID Nr 14),
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEQ ID Nr 15),
TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEQ ID Nr 16),
LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEQ ID Nr 17),
KWQTVAPALPDPNM (Ρ2, SEQ ID Nr 18),
VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEQ ID Nr 19),
GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID Nr 20),
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEQ ID Nr 21),
YRDLDLGVNQVVG (P3, SEQ ID Nr 22),
SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEQ ID Nr 23), oraz AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID Nr 24) (Liaw et al., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280:738-743).
Jednakże opisane powyżej sekwencje peptydowe Phl p 4 i alergenów grupy 4 nie wystarczają do odtworzenia pełnej struktury pierwszo rzędowej alergenów grupy 4.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie pełnej sekwencji DNA Phl p 4 jak również odpowiadających mu rekombinantów DNA, na bazie których alergen Phl p 4, mógłby zostać wyrażony jako białko i znaleźć znaczące zastosowanie farmakologiczne, jako takie lub w formie zmodyfikowanej.
WYKAZ FIGUR RYSUNKU fig. 1: Wewnętrzna sekwencja DNA (SEQ ID Nr 25) genu Phl p 4. Amplimery otrzymane z genomowego DNA zostały sklonowane i zsekwencjonowane z wykorzystaniem zdegenerowanych starterów nr 30 (sensowny) i nr 37 (antysensowny) - oba zaznaczono kursywą. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 6 klonów. Specyficzny starter sensowny nr 82 zaprojektowany na podstawie tej sekwencji jest podkreślony.
fig. 2: Koniec 3' sekwencji kwasu nukleinowego (SEQ ID Nr 26) genu Phl p 4. W wyniku reakcji amplifikacji na matrycy cDNA Phleum pratense techniką 3'-RACE PCR odcinka flankowanego specyficznym starterem nr 82 (zaznaczony kursywą) i starterem zakotwiczającym otrzymano amplimery i zsekwencjonowano je. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 3 procedur sekwencjonowania i obejmuje koniec 3' genu Phl p 4 do kodonu stop (podwójnie podkreślone). Zakresy sekwencji wykorzystanych do konstrukcji startera antysensownego nr 85 i nr 86 są podkreślone.
fig. 3: Lokalizacja peptydu Phl p 4 w przypuszczalnej sekwencji aminokwasów alergenu Phl p 4 (SEQ ID Nr 2).
Sekwencje aminokwasowe peptydów P1 - P6 (SEQ ID Nr 27-32) otrzymanych przy okazji procesu sekwencjonowania aminokwasów oczyszczonego i pofragmentowanego alergenu Phl p 4 można jednoznacznie przyporządkować odpowiadającym im sekwencjom nukleotydowym genu Phl p 4.
fig. 4: Określenie identyczności rekombinowanego Phl p 4 (rPhl p 4) techniką Western Blot z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych 5H1 (Biot A) i 3C4 (Blot B).
Ścieżka 1: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhl p 4.
Ścieżka 2: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhl p 4.
Ścieżka 3: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4
Ścieżka 4: oczyszczony nPhl p 4 z Phleum pratense.
PL 215 097 B1 (p: rozerwane lub zdegradowane fragmenty C-terminalnego odcinka rPhl p 4 bądź całej cząsteczki rPhl p 4.
fig. 5: Określenie techniką Western Blot reaktywności rekombinowanego Phl p 4 (rPhl p 4) z IgE pochodzącymi z surowicy alergików uczulonych na pyłki traw.
Ekstrakty stransformowanych komórek E. coli, w których ekspresji ulegał cały gen Phl p 4 lub tylko N-terminalny fragment 1-200 bądź C-terminalny fragment 185-500, zostały rozdzielone metodą
SDS-PAGE i przeniesione na błonę nitrocelulozową. Naniesione na błonę peptydy inkubowano z surowicą alergików uczulonych na pyłki traw typu A, B lub C, a następnie połączone IgE z właściwymi im alergenami reagowały ze stosowanymi w tej metodzie skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą przeciwciałami anty-ludzka-lgE, co umożliwiło kolorymetryczną detekcję związanych IgE.
Ścieżka 1: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment
1-200 rPhl p 4.
Ścieżka 2: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment
185-500 rPhl p 4.
Ścieżka 3: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4.
Ścieżka 4: oczyszczony nPhl p 4 z Phleum pratense.
Powyżej i poniżej stosowane określenia sekwencji nukleotydowych bądź aminokwasowych „SEQ ID Nr” opierają się na nazewnictwie zawartym w dołączonym protokole sekwencji.
ISTOTA WYNALAZKU
Wynalazek po raz pierwszy ujawnia sekwencję genu głównego alergenu pyłku traw Phl p 4, o trzech odkrytych dominujących sekwencjach (SEQ ID Nr 1, 3 i 5) wynikających z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphisms - SNPs).
Istotą wynalazku jest zatem cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej wyselekcjonowanej z grupy zawierającej sekwencje SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 oraz SEQ ID Nr 5; względnie cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej genu kodującego alergen główny Phl p 4 z Phleum pratense.
Wynalazek dotyczy rekombinowanej cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencjom SEQ ID Nr 1, 3 lub 5, przy czym sekwencja nukleotydowa w pozycji 1-69 pochodzi z sekwencji aminokwasowej N-końca Phl p 4. Zostały wykorzystane przy tym kodony często występujące u E.coli. Od pozycji 70 sekwencja DNA odpowiada takim sekwencjom, które zostały zidentyfikowane w DNA genomowym i cDNA Phleum pratense.
Zatem istotą wynalazku jest cząsteczka DNA zawierająca lub mająca sekwencję nukleotydową zgodną z sekwencjami SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 względnie SEQ ID Nr 5, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
Polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane do produkcji preparatów leczniczych do diagnozy i/lub terapii alergii, które wywoływane są przez grupę 4 alergenów Poaceae jak również w zapobieganiu takim alergiom.
Polipeptydy takie lub białka według wynalazku, które mają oddziaływanie alergenne na organizm ludzki zawarte są w ziarnkach pyłku Phleum pratense. Ziarnka pyłku innych gatunków należących do rodziny Poaceae jak np. między innymi Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus zawierają homologiczne cząsteczki alergenów (alergeny grupy 4). Homologia tych cząsteczek została udowodniona przez ich krzyżową reaktywność immunologiczną zarówno z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi jak i ludzkimi przeciwciałami IgE.
Z tego względu wynalazek dotyczy również sekwencji homologicznych do sekwencji DNA Phl p 4 bądź odpowiadającej jej cząsteczki DNA alergenów grupy 4 z innych gatunków Poaceae jak na przykład Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum oraz Hordeum vulgare, które przez istniejącą homologię sekwencji, hybrydyzują z DNA Phl p 4 w warunkach rygorystycznych, bądź wykazują krzyżową reaktywność immunologiczną względem Phl p 4.
Istotą wynalazku jest więc zatem cząsteczka DNA, która ulega hybrydyzacji z opisaną powyżej cząsteczką DNA według wynalazku w warunkach rygorystycznych i pochodzi z sekwencji DNA gatunków Poaceae.
Istotą wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, charakteryzująca się tym, że polipeptyd ten jest wybrany z grupy obejmującej:
- polipeptyd mający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 i SEQ ID Nr: 6,
PL 215 097 B1
- polipeptyd mający sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 ze zmianami aminokwasowymi określonymi przez następujące klony 1 do 11:
klon 1: L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287,
P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351, klon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258,
I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, klon 7: K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, klon 8: Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299,
E351, klon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334, klon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282,
L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472, klon 11: wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408.
Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym.
Istotą wynalazku jest zatem również cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji częściowej lub kombinacji sekwencji częściowych według wynalazku zdefiniowanych powyżej kodująca immunomodulacyjny fragment Phl p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:
- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, oraz
- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phl p 4.
Wynalazek dotyczy również alergenów grupy 13, które charakteryzują się podobną masą cząsteczkową do alergenów grupy 4, co wykazano techniką SDS-PAGE oraz są trudne do rozdziałem technikami biochemicznymi (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Za pomocą białka i sekwencji DNA według wynalazku, którą ujawniono po raz pierwszy, można jednak jednoznacznie wykazać zasadnicze różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy grupami 4 i 13.
Bazując na przedstawionej sekwencji DNA rPhl p 4 sekwencje częściowe kodujące peptydy posiadające od 50 do 350 aminokwasów zostały wklonowane w wektory ekspresyjne. Sekwencje częściowe pokrywają kolejno pełną sekwencję rPhl p 4, przy czym mamy do czynienia z zachodzeniem na siebie co najmniej 12 aminokwasów. Funkcjonalne peptydy odpowiadają fragmentom Phl p 4. Fragmenty te - pojedyncze lub połączone w różnych kombinacjach - nie reagują z przeciwciałami IgE alergików lub reakcja zachodzi na niskim poziomie, co pozwala zaklasyfikować je jako hipoalergiczne. W przeciwieństwie do tego mieszanina tych fragmentów jest zdolna w takim samym stopniu jak cała cząsteczka rekombinowanego lub naturalnego Phl p 4 do stymulacji limfocytów T alergików uczulonych na pyłki traw Phl p 4.
Na rysunku fig. 4 przedstawiono jako przykład charakterystykę dwóch takich fragmentów Phl p 4, odpowiadających aminokwasom 1-200 i 185-500, poprzez ich wiązanie z Phl p 4-specyficznymi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi. Fragment C-terminalny 185-500 reaguje tylko z przeciwciałem monoklonalnym 5H1, podczas gdy fragment N-terminalny 1-200 reaguje wyraźnie tylko z przeciwciałem monoklonalnym 3C4. Z rysunku fig. 5 jasno wynika, iż fragment 185-500 reaguje słabiej z IgE pochodzącymi z surowicy alergików B i C, jest zatem mniej alergenny niż fragment 1-200, który wykazuje zredukowaną IgE-reaktywność (właściwości hipoalergiczne) względem surowicy pacjenta C.
Zatem wynalazek dotyczy również opisanej powyżej i poniżej cząsteczki DNA kodującej fragment 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, jak również cząsteczki DNA kodującej fragment 285-500 z aminokwasami 285-500 Phl p 4.
PL 215 097 B1
Triplety kodujące cysteinę zostały w wyniku mutagenezy ukierunkowanej tak zmienione, że kodują inne aminokwasy, a korzystnie serynę. Zostały wyprodukowane zarówno warianty, w których zamianie uległy pojedyncze reszty cystein jak również takie, w których zamienione zostały różne kombinacje dwóch reszt cysteinowych względnie wszystkich pięciu cystein. Funkcjonalne białka tych mutantów punktowych pod względem cysteiny wykazują silnie zredukowaną, względnie brak reaktywności z przeciwciałami IgE alergików, są jednakże zdolne do reakcji z limfocytami T tych pacjentów.
Zatem istotą wynalazku jest także opisana powyżej i poniżej cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej według wynalazku, w której, w szczególności wskutek ukierunkowanej mutagenezy, rzeczona sekwencja nukleotydowa została specyficznie zmodyfikowana przez zastąpienie jednej, wielu lub wszystkich cystein odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
Dzięki znajomości sekwencji DNA naturalnie występujących alergenów jest obecnie możliwe wytworzenie tych alergenów w postaci rekombinowanych białek, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób alergicznych (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).
Klasycznym sposobem postępowania w efektywnym leczeniu alergii jest specyficzna immunoterapia lub obniżenie wrażliwości (hiposensybilizacja) (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Pacjentom podaje się wówczas podskórnie zastrzyki z naturalnych ekstraktów alergenów zwiększając dozowanie. Przy tej metodzie istnieje jednak niebezpieczeństwo wywołania reakcji alergicznych a nawet szoku anafilaktycznego. Celem zminimalizowania tego ryzyka stosuje się innowacyjne preparaty w postaci alergoidów. Są to chemicznie zmodyfikowane ekstrakty alergenów, które charakteryzują się znacznie zredukowaną reaktywnością z IgE, ale taką samą jak w naturalnych ekstraktach reaktywnością z komórkami T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
Jeszcze większą optymalizację terapii umożliwiłoby zastosowanie alergenów wyprodukowanych z wykorzystaniem procesu rekombinacji. Zdefiniowane, w danym wypadku dostosowane do indywidualnego stopnia uczulenia pacjenta koktajle wytworzonych na drodze rekombinacji alergenów o wysokiej czystości mogłyby zastąpić ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, gdyż w ekstraktach takich oprócz różnych alergenów znajduje się duża liczba nie oddziałujących alergennie, jednakże posiadających właściwości immunogenne białek towarzyszących.
Zastosowanie celowo zmutowanych rekombinowanych alergenów ze specyficzną delecją epitopów IgE nie wpływającą ujemnie na niezbędne w terapii epitopy rozpoznawane przez komórki T, otwiera realistyczne perspektywy bezpiecznej hiposensybilizacji produktami ekspresji. (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).
Inną możliwością terapeutycznego wpływania na zaburzoną równowagę komórek TH u alergików jest immunoterapeutyczne szczepienie DNA. Polega ono na zastosowaniu funkcjonalnego DNA kodującego odpowiednie alergeny. Pierwszych dowodów na specyficzny dla alergenu wpływ na odpowiedź immunologiczną dostarczyły badania przeprowadzone na gryzoniach polegające na iniekcji DNA kodującego alergeny (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
Cząsteczka DNA według wynalazku lub odpowiadający jej wektor ekspresyjny mogą stanowić środki lecznicze.
Odpowiednie białka wytworzone z wykorzystaniem technik rekombinacji mogą być zastosowane w terapii jak również w in vitro- i in vivo- diagnostyce alergii na pyłki.
W celu wytworzenia rekombinowanego alergenu klonowany odcinek kwasu nukleinowego jest wbudowywany w wektor ekspresyjny i konstrukcja ta ulega ekspresji w organizmie gospodarza. Rekombinowany alergen po biochemicznym oczyszczeniu można wykryć odpowiednią metodą z wykorzystaniem przeciwciał IgE.
Istotą wynalazku jest zatem także rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający opisaną powyżej lub poniżej cząsteczkę DNA według wynalazku funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną oraz organizm żywiciela transformowany wymienioną cząsteczką DNA lub wymienionym wektorem ekspresyjnym.
Cząsteczka DNA według wynalazku lub wektor ekspresyjny według wynalazku mogą być zastosowane do produkcji środka leczniczego wykorzystywanego w immunoterapeutycznym szczepieniu DNA pacjentów cierpiących na alergie, które wywołane są alergenami grupy 4 Poaceae i/lub w zapobieganiu takim alergiom.
Jak już wspomniano, wynalazek może znaleźć zastosowanie w specyficznej immunoterapii jako główny składnik preparatu zawierającego rekombinowany alergen lub kwas nukleinowy. Pojawia się tu więcej możliwości. Z jednej strony składnikiem preparatu może być białko o niezmienionej strukturze
PL 215 097 B1 pierwszorzędowej. Z drugiej strony dla uniknięcia niepożądanych skutków ubocznych w terapii może być według wynalazku wykorzystywana hipoalergiczna forma alergoidu powstałego z pełnej cząsteczki w wyniku specyficznej delecji epitopów IgE, bądź przez wytworzenie pojedynczych fragmentów kodujących epitopy rozpoznawane przez komórki T. W końcu preparatem leczniczym może być sam w sobie kwas nukleinowy, który jeżeli wklonowany w eukariotyczny wektor ekspresyjny, daje preparat, który przy podaniu bezpośrednim zmieniałby stan immunologiczny w sensie terapeutycznym.
Ponadto istotą wynalazku są polipeptydy otrzymane sposobami rekombinacyjnymi, które są kodowane przez jedną lub większą liczbę opisanych sekwencji DNA, a szczególnie pod kątem ich właściwości leczniczych.
Chodzi tu szczególnie o polipeptydy o sekwencji zgodnej z sekwencjami SEQ ID Nr 2, SEQ ID Nr 4 lub SEQ ID Nr 6, gdzie pozycję aminokwasów 1-33 ustalono przez N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów wyizolowanego naturalnego alergenu Phl p 4. Sekwencje w pozycji 24-500 wywodzą się z sekwencji DNA według SEQ ID Nr 1, 3 oraz 5. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 ustalono na podstawie N-końcowego sekwencjonowania białek z różnych preparatów naturalnego Phl p 4 (Tabela 1).
Polipeptydy tego typu mogą być otrzymywane z wykorzystaniem hodowli organizmu żywiciela zdefiniowanego w zastrz. 11 i izolowania odpowiedniego polipeptydu z hodowli.
W procesie wykrywania sekwencji DNA i sekwencji białek Phl p 4 postępowano następująco:
Naturalny alergen Phl p 4 oczyszczano i izolowano według opisanych sposobów (Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al. 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). W celu dokładnego oczyszczenia i pozbycia się śladów alergenów grupy 13 postępowano zgodnie ze sposobem opisanym przez Suck et al. (2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Analizę reszty N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyizolowanego z Phleum pratense Phl p 4 ustalono sposobem Edmana. Zamieszczone w Tabeli 1 sekwencje N-terminalne (P1a-f) zostały ustalone na podstawie różnych wsadów Phl p 4. Jako sekwencję zgodną dla pierwszych 15 pozycji ustalono następującą sekwencję: YFPP'P'AAKEDFLGXL (SEQ ID Nr 33). Nie udało się ustalić pozycji 14, prawdopodobnie jest ona podstawiona przez cysteinę. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 o różnych wsadach świadczą o występowaniu izoform. Pozycje 4 i 5 są podstawione hydroksyproliną (P'), co ustalono jednoznacznie na podstawie specyficznej analizy preparatów p1-a i -b.
Przez poddanie zdenaturowanych SDS Phl p 4 działaniu endopeptydazy Glu-C (Promega, Heidelberg, Niemcy) otrzymano różne peptydy. Ustalono sekwencję aminokwasową dwóch peptydów (P2 i P3) przedstawionych w Tabeli 1. Po rozszczepieniu endopeptydazą Lys-C (Roche, Mannheim, Niemcy) dwa peptydy (P4 i P5) zostały oczyszczone i zsekwencjonowane (Tabela 1). Z zastosowaniem rozszczepienia CNBr wyizolowano i ustalono sekwencję kolejnego peptydu (P6) (Tabela 1).
Podstawą konstrukcji zdegenerowanych starterów była N-terminalna sekwencja aminokwasowa oraz sekwencje wewnętrznych peptydów 2 i 6. Amplimery z genomowego DNA Phleum pratense otrzymano z wykorzystaniem startera sensownego nr 30 i startera antysensownego nr 37 (Tabela 2). Klony uzyskane z tych amplimerów poddano sekwencjonowaniu (Figura 1) i wykorzystano do konstrukcji specyficznych starterów sensownych nr 82 (Tabela 2). Za pomocą cDNA otrzymanego z reprezentatywnej populacji mRNA z pyłku Phleum pratense oraz z wykorzystaniem specyficznego startera sensownego nr 82 według wynalazku oraz startera zakotwiczającego AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Niemcy), przeprowadzono reakcję PCR (ang. polymerase chain reaction - łańcuchowa reakcja polimerazy) w warunkach rygorystycznych. Otrzymany amplimer wielkości ok. 450 kb został zsekwencjonowany i zidentyfikowano dzięki temu brakującą sekwencję genu Phl p 4 przy końcu 3' (fig. 2). W oparciu o tą C-terminalną sekwencję Phl p 4 określoną według wynalazku skonstruowano specyficzne startery antysensowne nr 85 i nr 86 (Tabela 2). W oparciu o N-terminalną sekwencję aminokwasową peptydu P1-a Phl p 4 (Tabela 1) skonstruowano zdegenerowany starter sensowny nr 29 pochodzący z DNA kodującego pozycję aminokwasów 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID Nr 34)).
Z użyciem starterów nr 29 i nr 86 przeprowadzono reakcję PCR na matrycy genomowego DNA Phleum pratense. Otrzymany produkt PCR posłużył jako matryca kolejnej reakcji PCR (zagnieżdżonej [ang. nested] PCR) z użyciem starterów nr 29 i nr 85. Amplimery te poddano insercji do wektora pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Niemcy), sklonowano i zsekwencjonowano. Sekwencja ta ma swój początek w pozycji 24 licząc od N-końca względnie w pozycji 70 sekwencji DNA zgodnej z sekwencjami SEQ ID Nr 1, 3 lub 5 i sięga w kierunku startera nr 85 (pozycja 1402 w SEQ ID Nr 1, 3 lub 5), który zlokalizowany jest w już określonym C-terminalnym odcinku genu Phl p 4. Na podstawie otrzymanych danych z sekwencjonowania aminokwasów pierwszych 33 pozycji i z ustalonej, na pod8
PL 215 097 B1 stawie zamplifikowanych klonów z użyciem starterów nr 29/nr 85 oraz nr 82/starter zakotwiczający przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej 477 pozycji, może zostać skonstruowana pełna sekwencja cząsteczki Phl p 4. Oba klony zachodzą na siebie w 197 pozycjach ich sekwencji nukleotydowych. Peptyd kodowany przez klon nr 29/nr 85 zachodzi na 10 pozycji aminokwasowych ustalonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie aminokwasów sekwencji N-terminalnej (pozycje 1-33) Phl p 4, przy czym obie zastosowane metody wskazują na obecność tych samych aminokwasów.
Sekwencja aminokwasowa Phl p 4 bazująca na bezpośrednio ustalonych aminokwasach N-terminalnych i przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej odpowiada sekwencjom przedstawionym w protokole sekwencji pod symbolami SEQ ID Nr 2, 4 oraz 6.
Produkty reakcji PCR przygotowano ze specyficznego startera sensownego nr 88 (Tabela 2) oraz specyficznego startera antysensownego nr 86, z wykorzystaniem zarówno genomowego jak i cDNA Phleum pratense i poddano sekwencjonowaniu.
Umożliwia to wykluczenie błędów reakcji PCR oraz odkrycie genetycznych zmienności (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu).
Wykryte polimorfizmy pojedynczego nukleotydu dla sekwencji DNA o symbolu SEQ ID Nr 1 przedstawiono w Tabeli 3. Niektóre z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu powodują zamianę aminokwasów. Są one przedstawione w tabeli 4. Zsekwencjonowano następnie klony DNA, których występowanie warunkowało obecność odmiennych aminokwasów w stosunku do dominujących sekwencji o symbolach SEQ ID Nr 2, 4 i 6 (Tabela 5).
Ta zmienność aminokwasów warunkuje występowanie izoform cząsteczki Phl p 4. Istnienie takich izoform zaobserwowano na podstawie heterogennego izoelektrycznego zachowania naturalnego Phl p 4. Wśród wszystkich dotąd poznanych alergenów pyłku można wyróżnić omawiane izoformy. Fakt, że odcinek DNA flankowany starterami nr 29 i nr 86 faktycznie koduje białko identyczne z naturalnym alergenem Phl p 4, może być udowodniony między innymi tym, że w zgodnej z wynalazkiem wydedukowanej sekwencji aminokwasów rekombinowanej cząsteczki Phl p 4 znaleziono (fig. 3) homologiczne sekwencje peptydowe do zidentyfikowanych wewnętrznych peptydów P3, P4 i P5 (Tabela 1) naturalnego Phl p 4. Z opisanej sekwencji aminokwasowej Phl p 4 wynika, że jest on zasadową cząsteczką zbudowaną z 500 aminokwasów o punkcie izoelektrycznym wynoszącym 8,99 (SEQ ID Nr 2), 8,80 (SEQ ID Nr 4) lub 9,17 (SEQ ID Nr 6). Ilościowe zestawienie aminokwasów przedstawiono w Tabeli 6. Obliczona masa cząsteczkowa rekombinowanego Phl p 4 wynosi 55.762 (SEQ ID Nr 2), 55.734 (SEQ ID Nr 4) bądź 55.624 (SEQ ID Nr 6) Daltonów. Ta wyliczona masa cząsteczkowa zgadza się bardzo dobrze z masą cząsteczkową naturalnego Phl p 4 wynoszącą 55 kDA, ustaloną metodą SDS-PAGE (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 i Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Także dla alergenów grupy 4 spokrewnionych gatunków traw opublikowano masy cząsteczkowe wynoszące pomiędzy 50 a 60 kDa (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; LeducBrodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14 - 17).
Celem wyprodukowania rekombinowanego białka Phl p 4, sekwencja kodująca Phl p 4 zgodna z sekwencjami SEQ ID Nr 1, 3 i/lub 5 została wklonowana w wektor ekspresyjny (np. pProEx, pLCro, pSE 380). Dla poznanych w wyniku sekwencjonowania białek aminokwasów N-terminalnych zastosowano zoptymalizowane kodony E.coli.
Rekombinowany Phl p 4 poddano transformacji w bakteriach szczepu E.coli, ekspresji i oczyszczaniu przy zastosowaniu różnych technik rozdzielania, a otrzymane białko zostało poddane procesowi wtórnego składania.
Z tak uzyskanego białka rPhl p 4 otrzymuje się pojedyncze pasmo w elektroforezie SDS-PAGE, które wędruje w takim samym zakresie wartości mas cząsteczkowych jak naturalny Phl p 4. Reaktywność immunologiczna rPhl p 4 mogła zostać udowodniona poprzez reakcję z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi 5H1 i 3C4, które zostały wyindukowane w wyniku oddziaływania naturalnego Phl p 4 i reagują krzyżowo z homologicznymi białkami (grupa 4) Poaceae (fig. 4) (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367). rPhl p 4 wchodzi w reakcję z przeciwciałami IgE alergików, które charakteryzują się udowodnioną reaktywnością IgE z naturalnym Phl p 4. Ta reaktywność wobec IgE, a poprzez to oddziaływanie jako alergen mogło zostać udowodnione zarówno w teście-Dot, metodą Western-Blot i techniką adsorpcji alergenów na polistyrenowych mikropłytkach. Detekcję metodą Western-Blot przedstawiono na rysunku fig. 5. W wyniku reakcji rPhl p 4 z leukocytami zasadochłonnymi alergików uczulonych na alergePL 215 097 B1 ny grupy 4 pyłku traw, leukocyty zasadochłonne pobudzane są do zwiększonej ekspresji markera aktywującego CD 203c. Taka aktywacja leukocytów zasadochłonnych przez rPhl p 4 świadczy wyraźnie o funkcjonalnej czynności tego białka jako alergenu. Taki alergen rPhl p 4 może zatem zostać wykorzystywany do wysoko specyficznej diagnostyki alergików uczulonych na pyłki traw. Diagnostyka ta może przebiegać w warunkach in vitro poprzez detekcję specyficznych przeciwciał (IgE, IgG1 - 4, IgA) i reakcje z komórkami efektorowymi (np. leukocytami zasadochłonnymi z krwi) upakowanymi IgE lub w warunkach in vivo poprzez test reakcji skórnej i narażenie na organ reakcji.
Reakcja rPhl p 4 z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw może być dowiedziona przez specyficzną co do alergenu stymulację limfocytów T do proliferacji i syntezy cytokin dotyczącą komórek T ze świeżo spreparowanych limfocytów krwi jak również założonych linii komórkowych limfocytów T i klonów nPhl p 4-reaktywnych.
Immunomodulatorowa aktywność fragmentów hipoalergicznych, odpowiadających polipeptydom posiadającym epitopy limfocytów T, jak również hipoalergicznych mutantów punktowych (np. polimorfizmów cysteiny) jest potwierdzona ich reakcją z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw.
Takie hipoalergiczne fragmenty bądź mutanty punktowe cysteiny mogą znaleźć zastosowanie w produkcji preparatów do obniżania wrażliwości (hiposensybilizacji) alergików, ponieważ reagują one z taką samą reaktywnością z limfocytami T, jednakże w związku z ich zmniejszoną lub brakiem reaktywności względem IgE, wywołują minimalne skutki uboczne spowodowane przez oddziaływanie z IgE.
W przypadku wklonowania odcinków kwasów nukleinowych kodujących hipoalergiczne warianty Phl p 4 lub kodujących niezmienione DNA Phl p 4 w ludzkie wektory ekspresyjne, konstrukcje takie mogą znaleźć zastosowanie w immunoterapii (szczepienie DNA).
Kompozycje farmaceutyczne zawierające co najmniej jedną cząsteczkę DNA według wynalazku lub co najmniej jeden z wektorów ekspresyjnych według wynalazku i opcjonalnie składniki aktywne i/lub pomocnicze mogą być zastosowane do immunoterapeutycznego szczepienia DNA pacjentów cierpiących na alergie wywołane alergenami grupy 4 Poaceae i/lub do zapobiegania takim alergiom.
Inna grupa tego rodzaju kompozycji farmaceutycznych może zawierać, zamiast DNA, co najmniej jeden z dotychczas opisanych polipeptydów nadających się do diagnozy i/lub terapii rzeczonych alergii.
Taka kompozycja farmaceutyczna zawiera jako aktywne składniki polipeptyd według wynalazku lub wektor ekspresyjny i/lub ich odpowiednią farmaceutycznie użyteczną pochodną, w tym ich mieszaniny w dowolnym stosunku. Składniki aktywne według wynalazku mogą być dostarczane do właściwej postaci dozowania razem z nośnikiem lub substancją pomocniczą o konsystencji stałej, płynnej i/lub półpłynnej i opcjonalnie w połączeniu z jednym lub kilkoma środkami czynnymi.
Jako substancje pomocnicze szczególnie nadają się do użycia immunostymulujące odcinki DNA lub oligonukleotydy bogate w motywy CpG.
Kompozycje te mogą znaleźć zastosowanie jako terapeutyki i preparaty diagnostyczne w medycynie i weterynarii. Rolę nośników mogą spełniać organiczne lub nieorganiczne substancje, które nadają się do stosowania pozajelitowego i które nie wpływają negatywnie na działanie składników aktywnych będących przedmiotem wynalazku. Do podawania pozajelitowego szczególnie właściwe są roztwory, najbardziej korzystne są roztwory oleiste lub wodne, korzystne są także zawiesiny, emulsje i implantaty. Składnik aktywny według wynalazku może także być liofilizowany, a otrzymany Iiofilizat wykorzystany np. do produkcji preparatów do iniekcji. Wymieniona kompozycja może być sterylizowana i/lub zawierać substancje pomocnicze takie jak substancje poślizgowe, konserwujące, stabilizujące i/lub substancje zwilżające, emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe i/lub wiele innych składników aktywnych.
Ponadto poprzez odpowiednią formulację składników aktywnych według wynalazku można otrzymać preparaty o powolnym uwalnianiu.
Wynalazek służy zatem także polepszeniu diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji składnikowo-specyficznego spektrum wrażliwości na składniki wywołujące alergie. Wynalazek służy również do otrzymywania znacząco ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii wywołanych przez pyłki traw.
PL 215 097 B1
T a b e l a 1. Sekwencja aminokwasów peptydów Phl p 4
Preparat Seria peptydu SEQ ID Nr Aminokwasy
1 6 11 16 21 26 31
Cały P1-a 35 YFPP'P' AAKED FLGXL VKEIP PRLLY AKSSP AYP
Phl p 4 P1-b 36 YFPP'P' AAKED FLGXL VKE-P PRLLY AKSSP
P1-c 37 YFPXX AAKED FLGXL
P1-d 38 YFPXX AKKED FLGXL
P1-e 39 YFPXX AAKDD FLGXL
P1-f 40 YFPXX LANED F
Fragment P2 41 SATPF XHRKG VLFNI QYV
Glu-C P3 42 GLXYR XLXPE
Fragment P4 43 KXMGD DHFXA VR
Lys-C P5 44 APEGA VDI I
Fragment P6 45 MEPYV SINPV QAYAN Y
CNBr
T a b e l a 2. Zdegenerowane oraz specyficzne sensowne (forward) i antysensowne (reverse) startery skonstruowane na bazie sekwencji peptydowych i sekwencji DNA Phl p 4
Starter Nr Peptyd/DNA Sensowny /Antysensowny SEQ ID Nr Sekwencja nukleotydowa
29 Phl p 4-P1 S 46 YTN TAY GCN AAR WSN WSN CCN GCN TAY CC
30 Phl p 4-P2 S 47 CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C
37 Phl p 4-P6 As 48 TAR TTN GCR TAN GCY TGN
ACN GGR TT
82 Phl p 4-DNA-NYW S 49 ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG CC
85 Phl p 4-DNA-GLV As 50 TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CCA AAC C
86 Phl p 4-DNA-QRL As 51 CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTC TGG
88 Phl p 4-DNA-PSV S 52 CTC AGT CCT GGG GCA GAC CAT CC
Sekwencje nukleotydów starterów 82, 85, 86 oraz 88 przedstawiono zwyczajowym kodem 4-literowym. W przypadku starterów 29, 30 oraz 37 zastosowano kod DNA IUPAC-IUB; w tym przypadku litera „N” oznacza inozynę.
PL 215 097 B1
T a b e l a 3. Wykryte polimorfizmy pojedynczych nukleotydów
Pozycja w sekwencji Nukleotyd według SEQ ID Nr 1 Wykryte SNP
1 2 3
85 T A
130 C A
159 G A
160 A C
169 G A
185 C T
186 C A
222 G C
226 G A
227 G C
228 T C
237 C T
273 C T
285 C T
286 C T
298 G A
299 A C
303 C T
309 C G
318 T C
320 G A
333 C G
348 G C
369 C G
409 C T
411 C T
420 T C
421 A C
423 A C
424 G A
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 2 3
425 T C
456 C G
462 C A
522 G C
525 C G
567 G A
618 C T
655 A C
657 G A
662 G A
680 C T
684 G C
690 C A
691 G A
693 G A
703 C T, A
710 A C
711 G A
713 C T
743 G A
750 G A
768 C T
773 A C
790 G A
798 G C
801 G A
804 C G
809 C A
834 G C
844 C A
859 A T
865 A G
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 2 3
879 G C
895 G C
900 G C, A
918 G A
961 A G
962 A C
964 A C
987 G C
994 A T
1020 G A
1023 G C
1036 G C
1040 C T
1041 G C
1047 C A
1051 A G
1052 G A, C
1053 G A, C, T
1056 G C
1069 T C
1073 G A
1084 C G
1086 G C
1090 C T
1098 G C
1151 G C
1152 G C
1155 G C
1161 G C
1185 C G
1229 G C
1233 G C
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 2 3
1239 A C
1240 T C
1242 G C
1257 G C
1266 C T
1269 C T
1278 A C, G
1305 C G
1308 C T
1311 C A
1335 G C
1350 G C
1357 T A
1359 A G
1370 G C
1377 T C
1378 T A
1379 T A
1383 G C
1398 C T
1411 T C
1414 C G
1425 C A
1428 C T
1443 G C
1449 C T
1464 G A
1485 G A
1498 A C
PL 215 097 B1
T a b e l a 4. Zamiany aminokwasów w konsekwencji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów
Pozycja w sekwencji Aminokwasy według SEQ ID Nr 2 Wykryte zamiany
1 2 3
6 A L
7 A K
8 K N
9 E D
29 S T
54 I L
57 V I
62 A V
76 G T, N, S
100 E T
107 S N
137 H Y
141 T P
142 V A, T
189 T K
219 K Q
221 R K
227 P L
231 V I
235 P T, S
237 K T
238 A V
248 R K
258 D A
264 V I
270 T K
282 Q K
287 M L
289 S G
299 A P
PL 215 097 B1 cd. tabeli 4
1 2 3
321 N A
322 I L
332 T S
346 E Q
347 P L
351 R E, T
357 F L
358 S N
362 L V
364 P S
384 W S
410 G A
419 E D
456 F Y
457 S A, N
460 L K
468 K M
472 Q E
498 K Q
T a b e l a 5. Pozycje aminokwasów różniących się w poszczególnych klonach Phl p 4 w porównaniu z sekwencją SEQ ID Nr 2
Przykład Pozycje różniące się*
1 2
Klon 1 L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472
Klon 2 L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472
Klon 3 P141, K282, L287, P299, L347, E351
Klon 4 G289, A410, D419, Y456, A 457, K460, E472
Klon 5 L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472
Klon 6 N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460
Klon 7 K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384
PL 215 097 B1 cd. tabeli 5
1 2
Klon 8 Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, E351
Klon 9 M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334
Klon 10 Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472
Klon 11 Wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408
*[Aminokwas według SEQ ID Nr 2 / pozycje w sekwencji / różniący się aminokwas]
T a b e l a 6. Skład aminokwasowy Phl p 4
Aminokwasy Liczba % masowy
Z ładunkiem 138/138/138 33.89/33.86/33.93
Kwasowe 45/46/43 9.82/10.05/9.38
Zasadowe 54/53/55 13.67/13.39/13.78
Polarne 120/119/124 24.88/24.71/25.89
Hydrofobowe 180/180/180 35.64/35.66/35.43
A AIa 40/40/41 5.10/5.10/5.24
C Cys 5/5/5 0.92/0.93/0.93
D Asp 24/24/24 4.95/4.96/4.97
E Glu 21/22/19 4.86/5.10/4.41
F Phe 24/24/22 6.33/6.34/5.82
G Gly 42/42/40 4.30/4.30/4.10
H His 10/10/9 2.46/2.46/2.22
I Ile 29/29/30 5.88/5.89/6.10
K Lys 29/29/33 6.67/6.67/7.60
L Leu 33/33/35 6.70/6.70/7.12
M Met 11/11/10 2.59/2.59/2.36
N Asn 22/22/23 4.50/4.50/4.72
P Pro* 38/39/39 6.62/6.80/6.81
Q Gln 15/15/15 3.45/3.45/3.46
R Arg 25/24/22 7.00/6.73/6.18
S Ser 32/32/33 5.00/5.00/5.17
T Thr 22/21/22 3.99/3.81/4.00
V VaI 41/41/40 7.29/7.29/7.13
W Trp 13/13/12 4.34/4.34/4.02
Y Tyr 24/24/26 7.02/7.03/7.63
* w tym hydroksyprolina
Wartości zostały podane dla trzech dominujących sekwencji w kolejności SEQ ID Nr 2/SEQ ID Nr 4/SEQ ID Nr 6.
PL 215 097 B1
Lista sekwencji <110> Merck Patent GmbH <120> Sekwencja DNA i otrzymywanie alergenu Phi p 4 pyłku traw metodami rekombinacji <130> P 02/101 <140> EP 02 013953.1 <141> 2002-06-25 <160> 52 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <2-13> Phleusi pratense <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> ¢1),.(69} <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220>
<221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503} <223>
PL 215 097 B1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1503)
<223>
<400> 1
tac ttc Tyr Phe 1 ccg ccg ccg Pro 5 gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt 48
Pro Pro Ala Ala Lys GTo Asp Phe 10 Leu Gly Cys Leu 15 Val
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa teg teg ccg gcg tat 96
Lys Glu Ile Pro Ero Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
ccc tea gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac teg cgg tgg teg teg ccg 144
Pro Ser Val Leu Gly Gin Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac 192
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
50 55 60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc 240
Ile Gin Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc teg tac cgg tcc ctg 288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg 336
Gin Pro Glu Glu Fhe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag 384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Giy Ala Gin
115 120 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt cca gtg ctg gcg 432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Val Leu Ala
130 135 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg 480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Giy Gly Asn Phe Ala
145 15'0 155 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag 528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac 576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
180 185 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg 624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
195 200 205
PL 215 097 B1
qqc aac age ttc ggc Gly atc gtg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ccg Pro S72
Gly Glu 210 Ser Phe Ile Val 215 Val Ala Trp Lys Val 220 Arg Leu Leu
gtg ccg CCC acg gtg acc gtg ttc *3 JS /T CLdy at c ccc aag aag gcg age gag 720
Val Ero Pro Thr Val Thr Val Ehe Lys I le Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225 230 235 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc 768
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gin Val Val Ala Pro Gin Leu
245 250 255
ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg 816
Ero Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr
260 265 270
ttc gag gcc atg tac ctg gg<= acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg 864
Ehe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gin Thr Leu Thr Pro Met Met
275 280 285
age age aag ttc ccc gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag 912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac 960
Met Ser Trp Ile Gin Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc 1008
Asn Ile Glu Asp Asp, Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
325 330 335
gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag gaa gtg 1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Glu Val
340 345 350
tgg gag cag atc ttc age acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc 1104
Trp Glu Gin Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc age gcc acc ccg gag tgg 1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
370 375 380
gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin Tyr
385 390 395 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg 1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
age aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg age aag aac ccc 1296
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn' Pro
420 425 430
agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag 1344
Arg Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc age age ggt ttg gtg tgg ggc cag 1392
PL 215 097 B1
Val Val Asn Asp Val Ser 450 Thr Phe 455 Ser Ser Gly Leu 460 Val Trp Gly Gin
aaa tac ttc aag ggc aat ttc cag agg ctc gcc atc acc aag ggc aag 1440
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gin Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465 470 475 480
gtg gat ccc ctCCT gac ttc agg aac gag cag age atc ccg ccg ctc 14 88
Yal Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gin Ser Ile Pro Pro Leu
485 490 495
atc aaa aag tac tga 1503
Ile Lys Lys Tyr
500
<210> 2
<2H> 500
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<4 00> 2
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val 15 10 15
Lys Glu Ile Pro 20 Pro Arg Leu Leu Tyr 25 Ala Lys Ser Ser Pro 30 Ala Tyr
Pro Ser Yal Leu Gly Gin Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
40 45
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His 50 55 60
Ile Gin Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Yal Arg Ile Arg 65 70 75 30
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu 85 90 95
Gin Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val 100 105 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin 115 120 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Yal Leu Ala 130 135 140 .
PL 215 097 B1
Phe 145 Pro Ala Gly Val Cys 150 Pro Thr Ile Gly Yal 155 Gly Gly Asn Phe Ala 150
Gly Gly Gly Phe Gly 155 Met Leu Leu Arg Lys 170 Tyr Gly Ile Ala Ala 175 Glu
Asn Val Ile Asp 180 Val Lys Leu Val Asp 165 Ala Asn Giy Thr Leu 190 His Asp
Lys Lys Ser 195 Met Gly Asp Asp His 200 Phe Trp Ala Val Arg 205 Gly Gly Gly
Gly Glu 210 Ser Phe Gly Ile Val 215 Val Ala Trp Lys Val 220 Arg Leu Leu Pro
Yal 225 Pro Pro Thr Val Thr 230 Val Phe Lys Ile Pro 235 Lys Lys Ala Ser Glu 240
Gly Ala Yal Asp Ile 245 Ile Asn Arg Trp Gin 250 Yal Yal Ala Pro Gin 255 Leu
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Yal Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr
260 265 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gin Thr Leu Thr Pro Met Met
275 280 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
Met Ser Trp Ile Gin Ser Ile Pro Phe Yal His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
325 330 335
Ala Glu Tyr Lys 340 Ser Asp Tyr Yal Tyr 345 Glu Pro Phe Pro Lys 350 Glu Yal
Trp Glu Gin Ile Phe Ser Thr Trp Leu. Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
370 375 380
PL 215 097 B1
Ala 305 Thr Pro Phe Pro His 330 Arg Lys Gly Val Leu 395 Phe Asn Ile Gin Tyr 400
Val Asn Tyr Trp Phe 405 Ala Pro Gly Ala· Gly 410 Ala Ala Pro Leu Ser 415 Trp
Ser Lys Glu Ile 420 Tyr Asn Tyr Met Glu 425 Pro Tyr Val Ser Lys 430 Asn Pro
Arg Gin Ala 435 Tyr Al 3 Asn Tyr Arg 440 Asp Ile Asp Leu dy 445 Arg Asn Glu
Val Val 450 Asn Asp Yal Ser Thr 455 Phe Ser Ser Gly Leu 460 Val Trp Gly Gin
Lys 465 Tyr Phe Lys Gly Asn 470 Phe Gin Arg Leu Ala 475 Ile Thr Lys Gly Lys 480
Val Asp Pro Thr Asp 485 Tyr Phe Arg Asn. Glu 490 Gin Ser Ile Pro Pro 495 Leu
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 3 <211> 1503 <212> DNA <213> Phleum pratense <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> (1).,(69) <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220 <221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503) <223>
PL 215 097 B1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1503
<223>
<400> 3
tac ttc ccg ccg ccg Pro Pro Pro 5 gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt Val 48
Tyr 1 Phe Ala Ala Lys Glu Asp 10 Phe Leu Gly Cys Leu 15
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg.ttg tac gcg aaa teg teg ccg gcg tat 96
Lys Glu Ile Pro Pro 20 Arg Leu Leu Tyr 25, Ala Lys Ser Ser Pro 30 Ala Tyr
ccc tea gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac teg cgg tgg teg teg ccg 144
Pro Ser Val Leu Gly 35 Gin Thr Ile 40 Arg Asn Ser Arg Trp 45 Ser Ser Pro
gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac 192
Asp Asn 50 Val Lys Pro Ile Tyr Ile 55 Val Thr Pro Thr 60 Asn Ala Ser His
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc 240
Ile 65 Gin Ser Ala Val Val 70 Cys Gly Arg Arg His 75 Gly Val Arg Ile Arg 80
gtg cgc age ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc teg tac cgg tcc ctg 288
Val Arg Ser Gly Gly 85 His Asp Tyr Glu Gly 90 Leu Ser Tyr Arg Ser 95 Leu
cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt age aag atg cgg gcc gtg 336
Gin Pro Glu Glu Phe 100 Ala Val Val Asp 105 Leu Ser Lys Met Arg 110 Ala Val
tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag 384
Trp Val Asp Gly Lys 115 Ala Arg Thr 120 Ala Trp Val Asp Ser 125 Gly Ala Gin
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt aca gtg ctg gcg 432
Lsu Gly 130 Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile 135 His Lys Ala Ser 14 0 Thr Val Leu Ala
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg 480
Phe 145 Pro Ala Gly Val Cys 150 Pro Thr Ile Gly Val 155 Gly Gly Asri Phe Ala 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag 528
Gly Gly Gly Phe Gly 165 Met Leu Leu Arg Lys 170 Tyr Giy Ile Ala Ala 175 Glu
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac 576
Asn Val Ile Asp Val 180 Lys Leu Val Asp 185 Ala Asn Gly Thr Leu 190 His Asp
tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc cpjc ggg 624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
195 200 205
PL 215 097 B1
ggc Gly gag age ttc ggc atc Ile gtg Val 215 gtc gcg tgg aag gtg agg ctc Leu ctg Leu ccg Pro 672
Glu 210 Ser Phe Gly Val Ala Trp Lys Val 220 Arg
gtg ccg ccc acg gtg acc ttc aag at c ccc £<3.CJ «33.CJ gcg age gag 720
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225 230 235 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc 768
Gly Ala Val Asp Ile Ile Tlsn Arg Trp Gin Val Val Al a Pro Gin Leu
245 250 255
ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg 816
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr
260 265 270
ttc gag gcc atg tac ctg ggc acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg 864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr cys Gin Thr Leu Thr Pro Met Met
275 290 285
age age aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag 912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac 960
Met Ser Trp Ile Gin Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc 1008
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
325 330 335
gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag agg gtg 1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val
340 345 350
tgg gag cag atc ttc age acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc 1104
Trp Glu Gin Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 350 365
atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc age gcc acc ccg gag tgg 1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
370 375 380
gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc 'aac atc cag tac 1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin Tyr
385 390 395 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg 1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
age aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg age aag aac ccc 1296
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420· 425 430
agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag 1344
Arg Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc age age ggt ttg gtg tgg ggc cag 1392
PL 215 097 B1
Val Yal Asn 450 Asp Vsl Ser Thr 455 Phe Ser
aaa tac ttc aag <JCJC aat ttc cag agg
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gin Arg
465 470
gtg gat ccc acc gac tac ttc agg aac
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn
485
atc aaa aag tac tga
Ile Lys Lys Tyr
500
Ser Gly Leu 460 Vał Trp Gly Gin
ctc gcc atc acc aag ggc aag 1440
Leu Ala 475 Ile Thr Lys Gly Lys 460
gag cag age atc ccg ccg ctc 1488
Glu 490 Gin Ser Ile Pro Pro 495 Leu
1503
<21Q> 4
<211> 500
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 4
Tyr 1 . Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Yal
5 10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 .30
Pro Ser Yal Leu Gly Gin Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
Asp Asn Yal Lys Pro Ile Tyr Ile Yal Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
50 55 60
Ile Gin Ser Ala Val Yal Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
Val Arg Ser Gly Gly Hi,s Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 SO 95
Gin Pro Glu Glu Phe Ala Yal Yal Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
Trp Yal Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin
115 120 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Thr Yal Leu Ala
130 135 140
PL 215 097 B1
Phe Pro Ala 145 Gly Vał Cys Pro 150 Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
155 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
180 185 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gły Gly
195 200 205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
210 215 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225 230 235 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gin Val Val Ala Pro Gin Leu
245 250 255
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr
260 265 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gin Thr Leu Thr Pro Met Met
275 280 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
Met Ser Trp Ile Gin Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
325 330 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val
340 345 350
Trp Glu Gin Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
370 375 380
PL 215 097 B1
Ala 385 Thr Pro Phe Pro His 390 Arg Lys Gly Yal Leu Phe Asn Ile Gin Tyr
395 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
Ser lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420 425 430
Arg Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Yal Trp Giy Gin
450 455 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gin Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465 470 475 480
Yal Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gin Ser Ile Pro Pro Leu
485 490 495
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 5 <211> 1503 <212> DNA <213> Phleum praten.se <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> (1)..(69) ' <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220>
<221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503) <223>
PL 215 097 B1
<220>
<221> CDS
<222> {1)..(1503)
<223>
<400> 5
tac ttc ccg ccg ccg Pro 5 gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt 48
Tyr 1 Phe Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe 10 Leu Gly Cys Leu 15 Val
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa teg teg ccg gcg tat 96
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
ccc tea gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac teg agg tgg teg teg ccg 144
Pro Ser Val Leu Gly Gin Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
gac aac gtg aag ccg ctc tac atc atc acc ccc acc aac gtc tcc cac 192
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His
50 55 60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgc cac agc gtc cgc atc cgc 240
Ile Gin Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc teg tac cgg tct ttg 288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
cag ccc gag acg ttc gcc gtc gtc gac ctc aac aag atg cgg gcg gtg 336
Gin Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
tgg gtg gac ggc aag gcc cgc acg gcg tgg gtg gac tcc ggc gcg cag 384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin
115 120 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc tat aag gcg agc ccc acg ctg gcg 432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala
130 135 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acg atc gga gtg ggc ggc aac ttc gcg 480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcc gcg gag 528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc aag ctg cac gac 576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
180 185 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg 624
Lys Lys Ser Met Giy Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Giy Gly Gly
195 200 205
PL 215 097 B1
ggc gag age ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg cag gtg aag ctc ctg Leu ccg Pro 672
Gly Glu Ser Phe 210 Gly Ile Val 215 Val Al ci Trp Gin Val 220 Lys Leu
gtg ccg ccc acc gtg aca ata ttc aag atc tcc aag aca gtg age gag 720
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac aag tgg caa gtg gtc gcg ccg cag ctt: 768
Gły Ala Val Asp Ile Ile Asn Lys Trp Gin Val Val Ala Pro Gin jtau
245 250 255
ccc gcc gac ctc atg atc cgc atc atc gcg cag ggg ccc aag gcc acg 816
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gin Gly Pro Lys Ala Thr
260 265 270
ttc gag gcc atg tac ctc ggc acc tgc aaa acc ctg acg ccg ttg atg 864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
275 280 285
age age aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac ccc tcc cac tgc aac gag 912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
atg tea tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac 960
Met Ser Trp Ile Giń Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
gcc ctc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac tcc ttc aag ccc ttc 1008
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
325 330 335
gcc gaa tac aag tcc gac tac gtc tac cag ccc ttc ccc aag acc gtc 1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gin Pro Phe Pro Lys Thr Val
340 345 350
tgg gag cag atc ctc aac acc tgg ctc gtc aag ccc ggc gcc ggg atc 1104
Trp Glu Gin Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc age gcc acc ccg gag tcc 1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
370 375 380
gcc acg ccc ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin Tyr
385 390 395 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc gcc gcc gcg ccc ctc teg tgg 1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp
405 410 415
age aag gac atc tac aac tac atg gag ccc tac gtg age aag aac CCC 1296
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
420 425 430
agg cag gcg tac gca aac tac agg gac atc gac ctc ggc agg aac gag 1344
Arg Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
435 440 445
gtg gtc aac gac gtc tcc acc tac gcc age ggc aag gtc tgg ggc. cag 1392
PL 215 097 B1
val val 450 Asn Asp Yal Ser Thr 455 Tyr Ala Ser Gly Lys 460 Yal Trp Gly Gin
aaa tac ttc aag ggc aac ttc gag agg ctc gcc att acc aag ggc aag 1440
Lys Tyr Phe Lys Giy Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
4S5 470 475 490
gtc gat cct acc gac tac ttc agg aac gag cag age atc ccg cca ctc 1488
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gin Ser Ile Ero Pro Leu
485 490 495
atc aaa aag tac tga 1503
Ile lys Lys Tyr
<210> 500 6
<211> 500
<212> PRT
<213> Phleum pratensc
<400> 6
Tyr Phe Pro 1 Pro Pro 5 Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Yal
10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
20 25 30
Pro Ser Val Leu Gly Gin Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
35 40 45
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Yal Ser His
50 55 60
Ile Gin Ser Ala Yal Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65 70 75 80
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
85 90 95
Gin Pro Glu Thr Phe Ala Yal Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
100 105 110
Trp Yal Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Yal Asp Ser Gly Ala Gin
115 120 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu
130 135 140
PL 215 097 B1
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
165 170 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
180 IBS 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gin Val Lys Leu Leu Pro
210 215 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
'Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Lys Trp Gin Val Val Ala Pro Gin Leu
245 250 255
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gin Gly Pro Lys Ala Thr
260 265 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
275 280 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
290 295 300
Met Ser Trp Ile Gin Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305 310 315 320
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn •Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
325 330 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gin Pro Phe Pro Lys Thr Val
340 345 350
Trp Glu Gin Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
355 360 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
370 375 380
PL 215 097 B1
Ala 385 Thr Pro Phe Pro His 390 Arg Lys Gly Yal Leu 395 Phe Asn Ile Gin Tyr 4 00
Yal Asn Tyr Trp Phe 405 Ala Pro Gly Ais Ala 410 Ala Ala Pro Leu Ser 415 Trp
Ser Lys Asp Ile 420 Tyr Asn Tyr Met Glu 425 Pro Tyr Val Ser Lys 430 Asn Pro
Arg Gin Ala 435 Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp 440 Ile Asp Leu Gly 445 Arg Asn Glu
Val Yal 450 Asn Asp Yal Ser Thr 455 Tyr Ala Ser Gly Lys 4S0 Yal Trp Gly Gin
Lys 4 65 Tyr Phe Lys Gly Asn 470 Phe Glu Arg Leu Ala 475 Ile Thr Lys Gly Lys 480
Yal Asp Pro Thr Asp 485 Tyr Phe Arg Asn Glu 490 Gin Ser Ile Pro Pro 495 Leu
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (6)..(6) <22 3> nieokreślony aminokwas <400>- 7
Ile Yal Ala Leu Pro Xaa Gly Met Leu Lys 15 10 <210> 8 <211> 14
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 8
Phe Leu Glu Pro Val Leu Gly Leu Ile Phe Pro Ala Gly Val 15 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 9
Gly Leu Ile Glu Phe Pro Ala Gly Val
5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Dactylus glomerata
<400> 10
Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys 15 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Dactylus glomerata
<400> 11
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Glu Gin 1 .5 10 <210> 12 .
PL 215 097 B1
<211> 17
<212> PRT
<213> Dactylus gloraerata
<400> 12
Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin Leu Gly Glu Leu Ser 15 10 15
Tyr <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Dactylus glomerata <400> 13
Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin Tyr Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 14
Lys Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro
1 5
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 15
PL 215 097 B1
Lys Gin Val Glu Arg Asp Phe Leu Thr Ser Leu Thr Lys Asp Ile Pro 15 10 15
Gin Leu Tyr Leu Lys Ser
20
<210 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400 16-
Thr Yal Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Ile Thr Ala Ala Met Ile
1 5
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<4 00> 17
Leu Arg Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Asn Yal Ile Asp Ala Lys Val 1 5 10 '15
Yal Asp Ala Gin Gly Arg Leu Leu
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400 18
Lys Trp Gin Thr Val Ala Pro Ala Leu Pro Asp Pro Asn Met 1 .5 10 <210 19
PL 215 097 B1 <211> 15 <212> PRT <213> Cynodon dactylon <4G0> 19
Yal Thr Trp Ile Glu Ser Yal Pro Tyr Ile Pro Met Gly Asp Lys
1 5 10 15
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<220>
<221> CECHA MIESZANA
<222> (Θ).. (6)
<22 3> nieokreślony aminokwas
<400> 20
Gly Thr Yal Arg Gin Leu Leu Xaa Arg Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe
1 5 10 15
Gly Lys Tyr
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400 21
Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Leu
1 5 10 15
Glu Pro ile Pro Lys Lys Ser 20
PL 215 097 B1
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 22
Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Val Asn Gin Val Val Gly
1 5
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 23
Ser Ala Thr Pro Pro Thr His Arg Ser Gly Val Leu Phe Asn Ile
1 5
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> Cynodon dactylon
<400> 24
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Gin Val Thr Arg Asp Ile Tyr Ala Phe 15 10 15
Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gin Ala Tyr Val Asn Tyr 20 25 30
Arg Asp Leu Asp 35 <210> 25 <211> 149
PL 215 097 B1
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> 25 60
caccggaagg gggtgctgtt caacatccag tacgtcaact actggttcgc cccgggagcc
ggcgcggcgc cattgtcgtg gagcaaggag atctacaact acatggagcc gtacgtgagc 120
aaggaccccg tccaggccta cgccaacta 149
<210> 26
<211> 299
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> 26 actactggtt cgccccggga gccggcgcgg cgccattgtc gtggagcaag gagatctaca actacatgga gccatacgtg agcaagaacc ccaggcaggc ctacgccaac tacagggaca tcgacctcgg gaggaacgag gtggtgaacg acgtctccac cttcagcagc ggtttggtgt ggggccagaa atacttcaag ggcaacttcc agaggctcgc catcaccaag ggcaaggtgg atcccaccga ctacttcagg aacgagcaga gcatcccgcc gctcatcaaa aagtactga
120
180
240
299 <210> 27 <211> 33 <212> PB.T <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> {14},.(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 27 ·
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa'Leu Val
10 15
PL 215 097 B1
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr 20 25 30
Pro <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<22ł> CECHA MIESZANA <222> {6),.(6) <223> nieokreślony aminokwas <400> 28
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin 15 10 15
Tyr Val <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (3)..(8) <223> nieokreślony aminokwas <400> 29
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
10
PL 215 097 B1
.<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<220>
<221> CECHA MIESZANA
<222> ¢2)..(9)
<223> nieokreślony aminokwas
<400> 30
Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Yal
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 31
Ala Pro Glu Gly Ala Yal Asp Ile Ile
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 32
Glu Pro Tyr Yal Ser Ile Asn Pro Yal Gin Ala Tyr Ala Asn
1 5 10 . 15
<210> 33
PL 215 097 B1 <211> 15 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> {14)..(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 33
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT .
<213> Phleum pratense
<400> 34
Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr Pro 15 10 <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (14)..(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 35
PL 215 097 B1
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val 1 5 10 ' 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr 20 25 30
Pro <210> 36 · <211> 29 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (14).,(14} <223> nieokreślony aminokwas <400> 36
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val 15 10 15
Lys Glu Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro 2C 25 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (4)..(14) <223> nieokreślony aminokwas
PL 215 097 B1 <40Q> 37
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT '
<213> Phleum pratense
<220>
<221> CECHA MIESZANA
<222> (4)..(14}
<223> nieokreślony aminokwas
<400> 38
Tyr Phe ! Pro Xaa Xaa Ala Lys Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<220>
<221> CECHA MIESZANA
<222> (4}.-(14)
<223> nieokreślony aminokwas
<400> 39
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Αερ Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 5 10 . 15
<210> 40 <211> 11
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (4),.(5) <223> nieokreślony aminokwas <400> 40
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Leu Ala Asn Glu Asp Phe
10 <2ł0> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Phleum pratense <22O>
<221> CECHA MIESZANA <222> (6)..(6) <223> nieokreślony aminokwas <400> 41
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin 15 10 15
Tyr Val
<210> 42 ·
<211> 10
<212> PRT
<213> Phleum pratense
PL 215 097 B1 <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (3).-(6)
<223> nieokreślony aminokwas
<400> 42
Gly Leu i Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<220>
<221> CECHA MIESZANA
<222> (2) .. (9).
<223> nieokreślony aminokwas
<400> 43
Lys Xas t Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Phleum pratense(
<400> 44
Ala Pro Glu Gly Ala Yal Asp Ile Ile
1 5 '
<210> 45
<211> 16
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Phleum pratense <400 45
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Yal Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr
10 15 <210 46 <211> 29 <212> DNA <213> Phleum pratense <220 <221> cecha mieszana <222> (1) ..(293 <223> n oznacza inozynę <400 46 ytntaygcna arwsnwsncc ngcntaycc 29 <210 47 <211> 28 <212> DNA <213> Phleum pratense <220>
<221> cecha mieszana <222> (1)..(28) <223> n oznacza inozynę <400> 47 caymgnaarg gngtnytntt yaayatmc 28 <210> 48
PL 215 097 B1
<211> 26
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<220>
<221> cecha mieszana
<222> (1) .. (26]
<223> B oznacza inozynę
<400> 48 tarttngcrt angcytgnac nggrtt 26
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> 49 actactggtt cgccccggga gcc 23
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> EC tgaagtattt ctggccccac accaaacc 2Θ
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> 51 cccttggtga tggcgagcct ctgg 24
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Phleum pratense
<400> 52 ctcagtcctg gggcagacca tcc 23

Claims (10)

1. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej wybranej spośród SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 oraz SEQ ID Nr 5.
2. Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
3. Cząsteczka DNA mająca sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
4. Cząsteczka DNA, która ulega hybrydyzacji z cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 1 albo 2 w warunkach rygorystycznych i pochodzi z sekwencji DNA gatunków Poaceae.
5. Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, znamienna tym, że polipeptyd ten jest wybrany z grupy obejmującej:
- polipeptyd mający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 i SEQ ID Nr: 6,
- polipeptyd mający sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 ze zmianami aminokwasowymi określonymi przez następujące klony 1 do 11:
klon 1: L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351, klon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, klon 7: K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, klon 8: Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, E351, klon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334, klon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472, klon 11: wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408.
6. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji częściowej lub kombinacji sekwencji częściowych zdefiniowanej(ych) w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 5, kodująca immunomodulatorowy fragment Phl p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:
- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, oraz
- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phl p 4.
7. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 6, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, znamienna tym, że rzeczona sekwencja nukleotydowa została specyficznie zmodyfikowana przez specyficzne zastąpienie jednej, wielu lub wszystkich cystein odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
8. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający cząsteczkę DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 7, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.
9. Organizm żywiciela transformowany cząsteczką DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 7 lub wektorem ekspresyjnym zdefiniowanym w zastrz. 8.
10. Polipeptyd otrzymany sposobami rekombinacyjnymi, który jest kodowany przez sekwencję
DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. 1, 3, 4, 5, 6 i 7.
PL372423A 2002-06-25 2003-06-11 Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense PL215097B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02013953 2002-06-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372423A1 PL372423A1 (pl) 2005-07-25
PL215097B1 true PL215097B1 (pl) 2013-10-31

Family

ID=29797135

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372423A PL215097B1 (pl) 2002-06-25 2003-06-11 Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense
PL400683A PL219272B1 (pl) 2002-06-25 2003-06-11 Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL400683A PL219272B1 (pl) 2002-06-25 2003-06-11 Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4

Country Status (13)

Country Link
US (3) US8128935B2 (pl)
EP (2) EP1515988B1 (pl)
JP (1) JP2006510346A (pl)
CN (1) CN100391970C (pl)
AT (1) ATE550349T1 (pl)
AU (1) AU2003279352B2 (pl)
BR (1) BR0312068A (pl)
CA (1) CA2491038C (pl)
ES (2) ES2384045T3 (pl)
PL (2) PL215097B1 (pl)
PT (2) PT2392591T (pl)
RU (1) RU2327739C2 (pl)
WO (1) WO2004000881A1 (pl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10359351A1 (de) 2003-12-16 2005-07-21 Merck Patent Gmbh DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung von Gruppe-4 Majorallergenen aus Getreiden
AU2011202726B2 (en) * 2003-12-16 2012-04-26 Merck Patent Gmbh DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals
DE10359352A1 (de) 2003-12-16 2005-07-21 Merck Patent Gmbh DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung des Graspollen-Allergens Lol p 4
AU2013204574B2 (en) * 2003-12-16 2015-02-26 Merck Patent Gmbh DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals
RU2607373C2 (ru) * 2010-01-14 2017-01-10 Мерк Патент Гмбх Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков
IN2014MN01513A (pl) * 2012-02-07 2015-09-11 Jolla Inst Allergy Immunolog

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030135888A1 (en) * 2001-09-26 2003-07-17 Tong Zhu Genes that are modulated by posttranscriptional gene silencing

Also Published As

Publication number Publication date
ES2384045T3 (es) 2012-06-28
WO2004000881A1 (de) 2003-12-31
ATE550349T1 (de) 2012-04-15
EP1515988B1 (de) 2012-03-21
ES2670573T3 (es) 2018-05-31
CN1665835A (zh) 2005-09-07
US9120866B2 (en) 2015-09-01
RU2327739C2 (ru) 2008-06-27
CA2491038A1 (en) 2003-12-31
RU2005101744A (ru) 2005-06-27
US20120288526A1 (en) 2012-11-15
AU2003279352B2 (en) 2009-09-10
AU2003279352A1 (en) 2004-01-06
PT2392591T (pt) 2018-05-23
PL219272B1 (pl) 2015-04-30
PL372423A1 (pl) 2005-07-25
PL400683A1 (pl) 2013-02-04
US8128935B2 (en) 2012-03-06
EP1515988A1 (de) 2005-03-23
EP2392591A1 (de) 2011-12-07
BR0312068A (pt) 2005-03-29
US9556241B2 (en) 2017-01-31
EP2392591B1 (de) 2018-02-21
US20150079120A1 (en) 2015-03-19
CA2491038C (en) 2017-04-25
WO2004000881A9 (de) 2004-02-26
US20060177470A1 (en) 2006-08-10
JP2006510346A (ja) 2006-03-30
CN100391970C (zh) 2008-06-04
PT1515988E (pt) 2012-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9789178B2 (en) DNA sequence, and recombinant preparation of the grass pollen allergen Lol p 4
US9556241B2 (en) DNA sequence and preparation of grass pollen allergen Phl p 4 by recombinant methods
NZ263913A (en) Lol pi protein allergen from ryegrass and related peptides coding sequences, vectors, protein production and use
US20170246317A1 (en) Dna sequence, and recombinant preparation of group 4 major allergens from cereals
CA2574449C (en) Variants of group 1 allergens from poaceae having reduced allergenicity and maintained t-cell reactivity
AU2013204574B2 (en) DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals
AU2011202726B2 (en) DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals