PL219272B1 - Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4 - Google Patents
Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4Info
- Publication number
- PL219272B1 PL219272B1 PL400683A PL40068303A PL219272B1 PL 219272 B1 PL219272 B1 PL 219272B1 PL 400683 A PL400683 A PL 400683A PL 40068303 A PL40068303 A PL 40068303A PL 219272 B1 PL219272 B1 PL 219272B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- phi
- seq
- sequence
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 20
- 239000013574 grass pollen allergen Substances 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102220403082 c.1084C>G Human genes 0.000 claims description 4
- 102220358458 c.1090C>T Human genes 0.000 claims description 4
- 102220359549 c.185C>T Human genes 0.000 claims description 4
- 102220198636 rs1057520114 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220272383 rs1442003131 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220251169 rs368061837 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220119733 rs768434256 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220643912 39S ribosomal protein L9, mitochondrial_E100T_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220497132 5-hydroxytryptamine receptor 3B_S29T_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220618545 7-methylguanosine phosphate-specific 5'-nucleotidase_G76N_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220578977 ATPase MORC2_R351E_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220537656 NFAT activation molecule 1_H137Y_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220564036 Protein lifeguard 1_S107N_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 102220414015 c.1051A>G Human genes 0.000 claims description 2
- 102220367365 c.1073G>A Human genes 0.000 claims description 2
- 102220419759 c.1151G>C Human genes 0.000 claims description 2
- 102220362661 c.1152G>C Human genes 0.000 claims description 2
- 102220290132 c.1357T>A Human genes 0.000 claims description 2
- 102220347718 c.1414C>G Human genes 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 102220230729 rs1064795592 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200143404 rs12150889 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220285255 rs1302487476 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220121302 rs141987399 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220201848 rs142975776 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220278618 rs143865305 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220285944 rs1553125193 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220300234 rs1553365780 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220281029 rs1555281790 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220268839 rs1555365871 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220284994 rs1555439557 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220282784 rs1555605608 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220283451 rs1555740077 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220331113 rs185931852 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220080087 rs188147644 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200096955 rs199472892 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220005526 rs34410516 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200029883 rs35313315 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220005293 rs35960772 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220316556 rs368536824 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220038429 rs377164890 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220329681 rs543392107 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220058112 rs61747632 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220034732 rs62508688 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220057917 rs730881586 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220097312 rs748674194 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220062375 rs751352435 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220095014 rs752666485 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220200669 rs761037236 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220061222 rs786201058 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220158631 rs7914192 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200103633 rs80356471 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200037539 rs875989915 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220113148 rs891187 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200161719 rs756623659 Human genes 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 102200076572 rs121909718 Human genes 0.000 claims 1
- 102220057350 rs150269172 Human genes 0.000 claims 1
- 102220289232 rs1553936012 Human genes 0.000 claims 1
- 102220269077 rs1555383354 Human genes 0.000 claims 1
- 102220238575 rs1555514945 Human genes 0.000 claims 1
- 102220287859 rs1555739303 Human genes 0.000 claims 1
- 102220045788 rs373122667 Human genes 0.000 claims 1
- 102220230246 rs397516434 Human genes 0.000 claims 1
- 102220045267 rs41464156 Human genes 0.000 claims 1
- 102220047873 rs606231276 Human genes 0.000 claims 1
- 102220052622 rs727504548 Human genes 0.000 claims 1
- 102220250201 rs768588742 Human genes 0.000 claims 1
- 102220094122 rs876658353 Human genes 0.000 claims 1
- 102220122927 rs886043262 Human genes 0.000 claims 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 abstract description 57
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 abstract description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000746983 Phleum pratense Species 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 66
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 65
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 58
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 9
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 9
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 8
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 7
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 7
- 201000004338 pollen allergy Diseases 0.000 description 7
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 244000052363 Cynodon dactylon Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000001415 potassium malate Substances 0.000 description 3
- 102220045533 rs2070096 Human genes 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 240000004585 Dactylis glomerata Species 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 240000003857 Holcus lanatus Species 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical group O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 102200052301 rs2230243 Human genes 0.000 description 2
- 102200140028 rs79555199 Human genes 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220492454 2'-5'-oligoadenylate synthase 3_T35L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000000872 ATM Human genes 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000010267 Allergoid Substances 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000001358 L(+)-tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102100037106 Merlin Human genes 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102220642088 Prolactin-inducible protein_V26L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000013567 aeroallergen Substances 0.000 description 1
- 239000013572 airborne allergen Substances 0.000 description 1
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 102220346590 c.1335G>C Human genes 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 102200007665 rs121434310 Human genes 0.000 description 1
- 102220282905 rs1257200897 Human genes 0.000 description 1
- 102220224776 rs143947839 Human genes 0.000 description 1
- 102220320145 rs150188173 Human genes 0.000 description 1
- 102220274218 rs1555734898 Human genes 0.000 description 1
- 102220031432 rs2071313 Human genes 0.000 description 1
- 102220022585 rs386833699 Human genes 0.000 description 1
- 102220111286 rs61747067 Human genes 0.000 description 1
- 102220340951 rs62508595 Human genes 0.000 description 1
- 102220328471 rs771093792 Human genes 0.000 description 1
- 102220104277 rs879254200 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiot wynalazku
Wynalazek dotyczy dostarczenia sekwencji genetycznej głównego alergenu pyłku traw Phi p 4. Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym. Rekombinowane cząsteczki DNA i pochodzące od nich polipeptydy, fragmenty czy też nowe kombinacje i warianty sekwencji częściowych mogą zostać wykorzystywane w terapii chorób alergicznych wywoływanych przez pyłki. Białka wytworzone metodą rekombinacji mogą być zastosowane w diagnostyce in vitro i in vivo alergii na pyłki.
Stan techniki
Alergie typu I mają duże znaczenie światowe. Aż 20% populacji państw uprzemysłowionych cierpi na schorzenia o podłożu alergicznym takie jak zapalenie nosa, zapalenie spojówek, czy też dychawica oskrzelowa. Alergie te wywoływane są przez znajdujące się w powietrzu alergeny (aeroalergeny), które pochodzą z różnych źródeł takich jak pyłki roślin, kleszcze, koty lub psy. Z kolei aż u około 40% alergików należących do opisywanego typu I występuje specyficzna reaktywność IgE z alergenami pyłków traw (Freidhoff et al., J. Allergy Clin. Immunol. 78,1190-2001).
Do substancji wywołujących alergie I typu należą białka, glikoproteiny oraz polipeptydy. Po przeniknięciu błony śluzowej alergeny takie u osób uwrażliwionych reagują z cząsteczkami IgE znajdującymi się na powierzchni komórek tucznych. Jeśli dwie cząsteczki IgE łączą się ze sobą przez alergen, dochodzi do uwolnienia mediatorów (np. histamin i prostaglandyn) oraz cytokin przez komórkę efektorową, a tym samym do odpowiednich symptomów klinicznych.
W zależności od względnej częstotliwości reakcji poszczególnych cząsteczek alergenów z przeciwciałami IgE alergików, wyróżniamy alergeny główne i alergeny poboczne (drugorzędowe).
W przypadku tymotki łąkowej (Phieum pratense) jako alergeny główne zidentyfikowano dotychczas: Phi p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phi p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phi p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phi p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phi p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189198) oraz Phi p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Phi p 4 opisywana jest jako zasadowa glikoproteina o masie cząsteczkowej od 50 do 60 kDa (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). Cząsteczka Phi p 4 jest oporna na działanie trypsyny (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) i 70-88% alergików uczulonych na pyłki traw posiada przeciwciała IgE przeciwko niej skierowane (Valenta et al., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi et al., 2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33: 43-51). Opisano homologiczne cząsteczki ze spokrewnionych gatunków traw (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; 14-17); takie homologiczne cząsteczki traw (łac.: Poaceae) tworzą grupę alergenów 4, których molekuły wykazują wysoką immunologiczną reaktywność krzyżową między sobą jak również z monoklonalnymi przeciwciałami myszy oraz z ludzkimi przeciwciałami IgE (Fahlbusch et al., 1993 Clin. Exp. Allergy 23: 51-60; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 210; Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll et al. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote et al., 2002, Biol. Chem. 383: 1441-1445; Andersson und Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych alergenów głównych Phieum pratense (Phi p 1, Phi p 2/3, Phi 5a i 5b, Phi p 6 i Phi p 13), struktura pierwszorzędowa Phi p 4 nie jest jeszcze jasna. Pełna sekwencja cząsteczek grupy 4 z innych gatunków traw również jest jeszcze niedostępna.
Ustalenie N-terminalnej sekwencji aminokwasowej nie zakończyło się do tej pory sukcesem. Jednak przyczyny tego nie są znane. Fischer et al. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) wysuwają przypuszczenie o zablokowaniu N-końca, udało im się jednakże oczyścić peptyd wewnętrzny po rozcięciu endopeptydazą i ustalić jego sekwencję: IVALPXGMLK (SEQ ID NO 7). Peptyd ten wykazuje homologię z sekwencjami peptydowymi alergenów 3-krostawca-Amb a1 i -Amb a2, jak również podobieństwo do sekwencji białek kukurydzy (Zm 58.2), pomidora (lat 59, lat 56) i tytoniu (G10) (FiPL 219 272 B1 scher et al., 1996; J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198). Dla fragmentów peptydowych zasadowych alergenów grupy 4 w przypadku życicy trwałej (Lolium perenne) ustalono następujące sekwencje:
FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 8) oraz
GLIEFPAGV (SEQ ID NO 9) (Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).
W wyniku enzymatycznego rozcięcia uzyskano peptydy alergenów grupy 4 z Dactylus glomerata i poddano je sekwencjonowaniu:
DIYNYMEPYVSK (P15, SEQ ID NO 10),
VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID NO 11),
ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID NO 12) oraz
GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEQ ID NO 13) (Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).
Poprzez proteolizę otrzymano także peptydy alergenów grupy 4 subtropikalnego gatunku psioząba palczastego (Cynodon dactylon) i poddano je sekwencjonowaniu:
KTVKPLYIITP (S, SEQ ID NO 14),
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEQ ID NO 15),
TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEQ ID NO 16),
LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEQ ID NO 17),
KWQTVAPALPDPNM (P2, SEQ ID NO 18),
VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEQ ID NO 19),
GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID NO 20),
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEQ ID NO 21),
YRDLDLGVNQVVG (P3, SEQ ID NO 22),
SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEQ ID NO 23) oraz
AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID NO 24) (Liaw et al., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280: 738743).
Jednakże, opisane powyżej sekwencje peptydowe Phi p 4 i alergenów grupy 4 nie wystarczają do odtworzenia pełnej struktury pierwszorzędowej alergenów grupy 4.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie pełnej sekwencji DNA Phi p 4 jak również odpowiadających mu rekombinantów DNA, na bazie których alergen Phi p 4, mógłby zostać wyrażony jako białko i znaleźć znaczące zastosowanie farmakologiczne, jako takie lub w formie zmodyfikowanej.
Wykaz figur rysunku
Figura 1: wewnętrzna sekwencja DNA (SEQ ID NO 25) genu Phi p 4. Amplimery otrzymane z genomowego DNA zostały sklonowane i zsekwencjonowane z wykorzystaniem zdegenerowanych starterów nr 30 (sensowny) i nr 37 (antysensowny) - oba zaznaczono kursywą. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 6 klonów. Specyficzny starter sensowny nr 82 zaprojektowany na podstawie tej sekwencji jest podkreślony.
Figura 2: koniec 3' sekwencji kwasu nukleinowego (SEQ ID NO 26) genu Phi p 4. W wyniku reakcji amplifikacji na matrycy cDNA Phieum pratense techniką 3'-RACE PCR odcinka flankowanego specyficznym starterem nr 82 (zaznaczony kursywą) i starterem zakotwiczającym otrzymano amplimery i zsekwencjonowano je. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 3 procedur sekwencjonowania i obejmuje koniec 3' genu Phi p 4 do kodonu stop (podwójnie podkreślone). Zakresy sekwencji wykorzystanych do konstrukcji startera antysensownego nr 85 i nr 86 są podkreślone.
Figura 3: lokalizacja peptydu Phi p 4 w przypuszczalnej sekwencji aminokwasów alergenu Phi p 4 (SEQ ID NO 2). Sekwencje aminokwasowe peptydów P1-P6 (SEQ ID NO 27-32) otrzymanych przy okazji procesu sekwencjonowania aminokwasów oczyszczonego i pofragmentowanego alergenu Phi p 4 można jednoznacznie przyporządkować odpowiadającym im sekwencjom nukleotydowym genu Phi p 4.
Figura 4: udowodnienie identyczności rekombinowanego Phi p 4 (rPhl p 4) techniką Western Blot z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych 5H1 (Blot A) i 3C4 (Blot B).
Ścieżka 1: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhi p 4.
Ścieżka 2: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhl p 4.
Ścieżka 3: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4.
Ścieżka 4: oczyszczony nPhi p 4 z Phieum pratense.
PL 219 272 B1 (^): rozerwane lub zdegradowane fragmenty C-terminalnego odcinka rPhi p 4, bądź całej cząsteczki rPhl p 4.
Figura 5: udowodnienie techniką Western Blot reaktywności rekombinowanego Phi p 4 (rPhi p 4) z IgE pochodzącymi z surowicy alergików uczulonych na pyłki traw. Ekstrakty stransformowanych komórek E. coli, w których ekspresyjny ulegał cały gen Phi p 4 gen lub tylko N-terminalny fragment 1-200, bądź C-terminalny fragment 185-500, zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE i przeniesione na błonę nitrocelulozową. Naniesione na błonę peptydy inkubowano z surowicą alergików uczulonych na pyłki traw typu A, B lub C, a następnie połączone IgE z właściwymi im alergenami reagowały ze stosowanymi w tej metodzie skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą przeciwciałami anti-human-lgE, co umożliwiło kolorymetryczną detekcję związanych IgE.
Ścieżka 1: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhl p 4.
Ścieżka 2: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhi p 4.
Ścieżka 3: ekstrakt wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhi p 4.
Ścieżka 4: oczyszczony nPhI p 4 z Phieum pratense.
Powyżej i poniżej stosowane określenia sekwencji nukleotydowych bądź aminokwasowych „SEQ ID NO” opierają się na nazewnictwie zawartym w dołączonym protokole sekwencji.
Istota wynalazku
Wynalazek po raz pierwszy ujawnia sekwencje genową głównego alergenu pyłku traw Phi p 4, o trzech odkrytych dominujących sekwencjach (SEQ ID NO 1, 3 i 5) wynikających z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphisms - SNPs).
Wynalazek dotyczy zatem cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowej wyselekcjonowanej z grupy zawierającej sekwencje SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 oraz SEQ ID NO 5, względnie cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowej genu kodującego alergen główny Phi p 4 z Phieum pratense.
W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej cechującej się względem sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 homologią sekwencji wynoszącą co najmniej 91,8%.
W szczególności, istotą wynalazku jest także cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO 1 z co najmniej jedną pojedynczą zmianą nukleotydową wybraną z grupy obejmującej: T85A,
C130A, G159A, A160C, G169A, C185T, C186A, G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C273T,
C285T, C286T, G298A, A299C, C303T, C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T,
C411T, T420C, A421C, A423C, G424A, T425C, C456G, C462A, G522C, C525G, G567A, C618T,
A655C, G657A, G662A, C680T, G684C, C690A, G691A, G693A, C703T, C703A, A710C, G711A,
C713T, G743A, G750A, C768T, A773C, G790A, G798C, G801A, C804G, C809A, G834C, C844A,
A859T, A865G, G879C, G895C, G900C, G900A, G918A, A961G, A962C, A964C, G987C, A994T,
G1020A, G1023C, G1036C, C1040T, G1041C, C1047A, A1051G, G1052A, G1052C, G1053A,
G1053C, G1053T, G1056C, T1069C, G1073A, C1084G, G1086C, C1090T, G1098C, G1151C,
G1152C, G1155C, G1161C, C1185G. G1229C, G1133C, A1239C, T1240C, G1242C, G1257C,
C1266T, C1269T, A1278C, A1278G, C1305G, C1308T, 01311A, G1335C, G1350C, T1357A,
A1359G, G1370C, Tl3770, T1378A, T1379A, G13830, C1398T, T14110, C1414G, C1425A, C1428T, G14430, 01449T, G1464A, G1485A i A14980.
Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym.
Wynalazek dotyczy zatem również odpowiednich sekwencji częściowych, kombinacji sekwencji częściowych, względnie mutantów powstałych na skutek eliminacji lub addycji, które kodują immunomodulacyjny fragment alergenu grupy 4 rodziny Poaceae odpowiedzialny za reakcję z limfocytami T.
Oprócz alergenów grupy 4 innych gatunków traw, wynalazek dotyczy także alergenów grupy 13, ponieważ charakteryzują się podobną masą cząsteczkową do alergenów grupy 4, co wykazano techniką SDS-PAGE oraz są trudne do rozdziałem technikami biochemicznymi (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Za pomocą białka i sekwencji DNA według wynalazku, którą ujawniono po raz pierwszy, można jednak jednoznacznie wykazać zasadnicze różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy grupami 4 i 13.
PL 219 272 B1
Dzięki znajomości sekwencji DNA naturalnie występujących alergenów jest obecnie możliwe wytworzenie tych alergenów w postaci rekombinowanych białek, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób alergicznych (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).
Klasycznym sposobem postępowania w efektywnym leczeniu alergii jest specyficzna immunoterapia lub obniżenie wrażliwości (hiposensybilizacja) (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562). Pacjentom podaje się wówczas podskórnie zastrzyki z naturalnych ekstraktów alergenów zwiększając dozowanie. Przy tej metodzie istnieje jednak niebezpieczeństwo wywołania reakcji alergicznych a nawet szoku anafilaktycznego. Celem zminimalizowania tego ryzyka stosuje się innowacyjne preparaty w postaci alergoidów. Są to chemicznie zmodyfikowane ekstrakty alergenów, które charakteryzują się znacznie zredukowaną reaktywnością z IgE, ale taką samą jak w naturalnych ekstraktach reaktywnością z komórkami T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
Jeszcze większą optymalizację terapii umożliwiłoby zastosowanie alergenów wyprodukowanych z wykorzystaniem procesu rekombinacji. Zdefiniowane, w danym wypadku dostosowane do indywidualnego stopnia uczulenia pacjenta koktajle wytworzonych na drodze rekombinacji alergenów o wysokiej czystości mogłyby zastąpić ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, gdyż w ekstraktach takich oprócz różnych alergenów znajduje się duża liczba nie oddziałujących alergennie, jednakże posiadających właściwości immunogenne białek towarzyszących.
Zastosowanie celowo zmutowanych rekombinowanych alergenów ze specyficzną delecją epitopów IgE nie wpływającą ujemnie na niezbędne w terapii epitopy rozpoznawane przez komórki T, otwiera realistyczne perspektywy bezpiecznej hiposensybilizacji produktami ekspresji. (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).
Inną możliwością terapeutycznego wpływania na zaburzoną równowagę komórek TH u alergików jest immunoterapeutyczne szczepienie DNA. Polega ono na zastosowaniu funkcjonalnego DNA kodującego odpowiednie alergeny. Pierwszych dowodów na specyficzny dla alergenu wpływ na odpowiedź immunologiczną dostarczyły badania przeprowadzone na gryzoniach polegające na iniekcji DNA kodującego alergeny (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
Odpowiednie białka wytworzone z wykorzystaniem technik rekombinacji mogą być zastosowane w terapii jak również w in vitro- i in vivo- diagnostyce alergii na pyłki.
W celu wytworzenia rekombinowanego alergenu klonowany odcinek kwasu nukleinowego jest wbudowywany w wektor ekspresyjny i konstrukcja ta ulega ekspresji w organizmie gospodarza. Rekombinowany alergen po biochemicznym oczyszczeniu można wykryć odpowiednią metodą z wykorzystaniem przeciwciał IgE.
Wynalazek dotyczy zatem także rekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego opisaną powyżej lub poniżej cząsteczkę DNA funkcjonalnie połączoną z ekspresyjną sekwencją kontrolną oraz organizm gospodarza stransformowany wymienioną cząsteczką DNA lub wymienionym wektorem ekspresyjnym.
W szczególności istotą wynalazku jest rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający cząsteczkę DNA według wynalazku, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.
Wynalazek dotyczy również zastosowania przynajmniej jednej dotychczas opisanej cząsteczki DNA lub przynajmniej jednego dotychczas opisanego wektora ekspresyjnego do produkcji środka leczniczego wykorzystywanego w immunoterapeutycznym szczepieniu DNA pacjentów cierpiących na alergie, które wywołane są alergenami grupy 4 Poaceae i/lub w zapobieganiu takim alergiom.
Jak już wspomniano, wynalazek może znaleźć zastosowanie w specyficznej immunoterapii jako główny składnik preparatu zawierającego rekombinowany alergen lub kwas nukleinowy. Pojawia się tu więcej możliwości. Z jednej strony składnikiem preparatu może być białko o niezmienionej strukturze pierwszorzędowej. Z drugiej strony dla uniknięcia niepożądanych skutków ubocznych w terapii może być według wynalazku wykorzystywana hipoalergiczna forma alergoidu powstałego z pełnej cząsteczki w wyniku specyficznej delecji epitopów IgE, bądź przez wytworzenie pojedynczych fragmentów kodujących epitopy rozpoznawane przez komórki T. W końcu preparatem leczniczym może być sam w sobie kwas nukleinowy, który jeżeli wklonowany w eukariotyczny wektor ekspresyjny, daje preparat, który przy podaniu bezpośrednim zmieniałby stan immunologiczny w sensie terapeutycznym.
Wynalazek dotyczy także rekombinowanej cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencjom SEQ ID NO 1, 3 lub 5, przy czym sekwencja nukleotydową w pozycji 1-69 pochodzi z sekwencji aminokwasowej N-końca Phi p 4. Zostały wykorzystane przy tym kodony często występujące u E. coli. Od pozy6
PL 219 272 B1 cji 70 sekwencja DNA odpowiada takim sekwencjom, które zostały zidentyfikowane w DNA genomowym i cDNA Phieum pratense.
Wynalazek dotyczy zatem także cząsteczki DNA obejmującej sekwencję nukleotydową zgodną z sekwencjami SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, względnie SEQ ID NO 5, rozpoczynającą się w pozycji
70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phi p 4 z Phieum pratense.
Ponadto, wynalazek dotyczy polipeptydów kodowanych przez jedną lub większą liczbę dotychczas opisanych cząsteczek DNA, a szczególnie pod kątem ich właściwości leczniczych.
Chodzi tu szczególnie o polipeptydy o sekwencji zgodnej z sekwencjami SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 lub SEQ ID NO 6, gdzie pozycję aminokwasów 1-33 ustalono przez N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów wyizolowanego naturalnego alergenu Phi p 4. Sekwencje w pozycji 24-500 wywodzą się z sekwencji DNA według SEQ ID NO 1, 3 oraz 5. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 ustalono na podstawie N-końcowego sekwencjonowania białek z różnych preparatów naturalnego Phi p 4 (tabela 1).
Istotą wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, która charakteryzuje się tym, że rzeczony polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej: - polipeptyd mający sekwencję SEQ ID NO; 2 z jedną lub większą liczbą zmian aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej: A6L, A7K,
K8N, E9D, S29T, I54L, V57I, A62V, G76T, G76N, G76S, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, V142T, T189K, K219Q, R221K, P227L, V231I, P235T, P235S, K237T, A238V, R248K, D258A, V264I, T270K, Q282K, M287L, S289G, A299P, N321A, I322L, T332S, E346Q, P347L, R351E, R351T, F357L, S358N, L362V, P364S, W384S, G410A, E419D, F456Y, S457A, S457N, L460K, K468M, Q472E i K498Q.
Odpowiednio do powyższego, istotą wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu kodowanego sekwencją DNA zdefiniowaną według wynalazku poprzez hodowanie organizmu żywiciela transformowanego cząsteczką DNA zdefiniowaną według wynalazku lub wektorem ekspresyjnym według wynalazku i izolowanie odpowiedniego polipeptydu z kultury hodowlanej.
Wynalazku dotyczy również zastosowanie co najmniej jednego z dotychczas opisanych polipeptydów do produkcji preparatów leczniczych do diagnozy i/lub terapii alergii, które wywoływane są przez grupę 4 alergenów Poaceae jak również w zapobieganiu takim alergiom.
Polipeptydy takie lub białka zgodne z wynalazkiem, które mają oddziaływanie alergenne na organizm ludzki zawarte są w ziarnkach pyłku Phieum pratense. Ziarnka pyłku innych gatunków należących do rodziny Poaceae jak np. między innymi Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus zawierają homologiczne cząsteczki alergenów (alergeny grupy 4). Homologią tych cząsteczek została udowodniona przez ich krzyżową reaktywność immunologiczną zarówno z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi jak i ludzkimi przeciwciałami IgE.
Z tego względu, wynalazek dotyczy również sekwencji homologicznych do sekwencji DNA Phi p 4, bądź odpowiadającej jej cząsteczki DNA alergenów grupy 4 z innych gatunków Poaceae, jak na przykład Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum oraz Hordeum vulgare, które przez istniejącą homologię sekwencji, hybrydyzują z DNA Phi p 4 w ściśle określonych warunkach bądź wykazują krzyżową reaktywność immunologiczną względem Phi p 4.
W procesie wykrywania sekwencji DNA i sekwencji białek Phi p 4 postępowano następująco.
Naturalny alergen Phi p 4 oczyszczano i izolowano według opisanych sposobów (Fahlbusch et al. 1998, Glin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al. 2000, Clin. Exp. Allergy 30; 1395-1402). W celu dokładnego oczyszczenia i pozbycia się śladów alergenów grupy 13 postępowano zgodnie ze sposobem opisanym przez Suck et al. (2000, Glin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Analizę reszty N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyizolowanego z Phieum pratense Phi p 4 ustalono sposobem Edmana. Zamieszczone w tabeli 1 sekwencje N-terminalne (P1a-f) zostały ustalone na podstawie różnych wsadów Phi p 4. Jako sekwencję zgodną dla pierwszych 15 pozycji ustalono następującą sekwencję: YFPP'P'AAKEDFLGXL (SEQ ID NO 33). Nie udało się ustalić pozycji 14, prawdopodobnie jest ona podstawiona przez cysteinę. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 o różnych wsadach świadczą o występowaniu izoform. Pozycje 4 i 5 są podstawione hydroksyproliną (P'), co ustalono jednoznacznie na podstawie specyficznej analizy preparatów p1-a i -b.
Przez poddanie zdenaturowanych SDS Phi p 4 działaniu endopeptydazy Glu-G (Promega, Heidelberg, Niemcy) otrzymano różne peptydy. Ustalono sekwencję aminokwasową dwóch peptydów (P2 i P3) przedstawionych w tabeli 1. Po rozszczepieniu endopeptydazą Lys-C (Roche, Mannheim,
PL 219 272 B1
Niemcy) dwa peptydy (P4 i P5) zostały oczyszczone i zsekwencjonowane (tabela 1). Z zastosowaniem rozszczepienia CNBr wyizolowano i ustalono sekwencję kolejnego peptydu (P6) (tabela 1).
Podstawą konstrukcji zdegenerowanych starterów była N-terminalna sekwencja aminokwasowa oraz sekwencje wewnętrznych peptydów 2 i 6. Amplimery z genomowego DNA Phieum pratense otrzymano z wykorzystaniem startera sensownego nr 30 i startera antysensownego nr 37 (tabela 2). Klony uzyskane z tych amplimerów poddano sekwencjonowaniu (figura 1) i wykorzystano do konstrukcji specyficznych starterów sensownych nr 82 (tabela 2). Za pomocą cDNA otrzymanego z reprezentatywnej populacji mRNA z pyłku Phieum pratense oraz z wykorzystaniem specyficznego startera sensownego nr 82 według wynalazku oraz startera zakotwiczającego AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Niemcy), przeprowadzono reakcję PCR (ang. polymerase chain reaction - łańcuchowa reakcja polimerazy) w ściśle określonych warunkach. Otrzymany amplimer wielkości ok. 450 kb został zsekwencjonowany i zidentyfikowano dzięki temu brakującą sekwencję genu Phi p 4 przy końcu 3' (fig. 2). W oparciu o tą C-terminalną sekwencję Phi p 4 określoną według wynalazku skonstruowano specyficzne startery antysensowne nr 85 i nr 86 (tabela 2). W oparciu o N-terminalną sekwencję aminokwasową peptydu P1-a Phi p 4 (tabela 1) skonstruowano zdegenerowany starter sensowny nr 29 pochodzący z DNA kodującego pozycję aminokwasów 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID NO 34)).
Z użyciem starterów nr 29 i nr 86 przeprowadzono reakcję PCR na matrycy genomowego DNA Phieum pratense. Otrzymany produkt PCR posłużył jako matryca kolejnej reakcji PCR (zagnieżdżonej [ang. nested] PCR) z użyciem starterów nr 29 i nr 85. Amplimery te poddano insercji do wektora pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Niemcy), sklonowane i zsekwencjonowane. Sekwencja ta ma swój początek w pozycji 24 licząc od N-końca, względnie w pozycji 70 sekwencji DNA zgodnej z sekwencjami SEQ ID NO 1, 3 lub 5 i sięga w kierunku startera nr 85 (pozycja 1402 w SEQ ID NO 1, 3 lub 5), który zlokalizowany jest w już określonym C-terminalnym odcinku genu Phi p 4. Na podstawie otrzymanych danych z sekwencjonowania aminokwasów pierwszych 33 pozycji i z ustalonej, na podstawie zamplifikowanych klonów z użyciem starterów nr 29/nr 85 oraz nr 82/starter zakotwiczający przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej 477 pozycji, może zostać skonstruowana pełna sekwencja cząsteczki Phi p 4. Oba klony zachodzą na siebie w 197 pozycjach ich sekwencji nukleotydowych. Peptyd kodowany przez klon nr 29/nr 85 zachodzi na 10 pozycji aminokwasowych ustalonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie aminokwasów sekwencji N- terminalnej (pozycje 1-33) Phi p 4, przy czym obie zastosowane metody wskazują na obecność tych samych aminokwasów.
Sekwencja aminokwasowa Phi p 4 bazująca na bezpośrednio ustalonych aminokwasach N-terminalnych i przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej odpowiada sekwencjom przedstawionym w protokole sekwencji pod symbolami SEQ ID NO 2, 4 oraz 6.
Produkty reakcji PCR przygotowano ze specyficznego startera sensownego nr 88 (tabela 2) oraz specyficznego startera antysensownego nr 86, z wykorzystaniem zarówno genomowego, jak i cDNA Phieum pratense i poddano sekwencjonowaniu. Umożliwia to wykluczenie błędów reakcji PCR oraz odkrycie genetycznych zmienności (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu).
Wykryte polimorfizmy pojedynczego nukleotydu dla sekwencji DNA o symbolu SEQ ID NO 1 przedstawiono w tabeli 3. Niektóre z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu powodują zamianę aminokwasów. Są one przedstawione w tabeli 4. Zsekwencjonowano następnie klony DNA, których występowanie warunkowało obecność odmiennych aminokwasów w stosunku do dominujących sekwencji o symbolach SEQ ID NO 2, 4 i 6 (tabela 5).
Ta zmienność aminokwasów warunkuje występowanie izoform cząsteczki Phi p 4. Istnienie takich izoform zaobserwowano na podstawie heterogennego izoelektrycznego zachowania naturalnego Phi p 4. Wśród wszystkich dotąd poznanych alergenów pyłku można wyróżnić omawiane izoformy. Fakt, że odcinek DNA flankowany starterami nr 29 i nr 86 faktycznie koduje białko identyczne z naturalnym alergenem Phi p 4, może być udowodniony między innymi tym, że w zgodnej z wynalazkiem wydedukowanej sekwencji aminokwasów rekombinowanej cząsteczki Phi p 4 znaleziono (fig. 3) homologiczne sekwencje peptydowe do zidentyfikowanych wewnętrznych peptydów P3, P4 i P5 (tabela 1) naturalnego Phi p 4. Z opisanej sekwencji aminokwasowej Phi p 4 wynika, że jest on zasadową cząsteczką zbudowaną z 500 aminokwasów o punkcie izoelektrycznym wynoszącym 8,99 (SEQ ID NO 2), 8,80 (SEQ ID NO 4) lub 9,17 (SEQ ID NO 6). Ilościowe zestawienie aminokwasów przedstawiono w tabeli 6. Obliczona masa cząsteczkowa rekombinowanego Phi p 4 wynosi 55,762 (SEQ ID NO 2), 55,734 (SEQ ID NO 4), bądź 55,624 (SEQ ID NO 6) Daltonów. Ta wyliczona masa cząsteczkowa zgadza się bardzo dobrze z masą cząsteczkową naturalnego Phi p 4 wynoszącą 55kDA, ustaloną
PL 219 272 B1 metodą SDS-PAGE (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 i Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Także dla alergenów grupy 4 spokrewnionych gatunków traw opublikowano masy cząsteczkowe wynoszące pomiędzy 50 a 60 kDa (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; LeducBrodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14-17).
Celem wyprodukowania rekombinowanego białka Phi p 4, sekwencja kodująca Phi p 4 zgodna z sekwencjami SEQ ID NO 1, 3 i/lub 5 została wklonowana w wektor ekspresyjny (np. pProEx, pACro, pSE 380). Dla poznanych w wyniku sekwencjonowania białek aminokwasów N-terminalnych zastosowano zoptymalizowane kodony E. coli.
Rekombinowany Phi p 4 poddano transformacji w bakteriach szczepu E. coli, ekspresji i oczyszczaniu przy zastosowaniu różnych technik rozdzielania, a otrzymane białko zostało poddane procesowi wtórnego składania.
Z tak uzyskanego białka rPhi p 4 otrzymuje się pojedyncze pasmo w elektroforezie SDS-PAGE, które wędruje w takim samym zakresie wartości mas cząsteczkowych jak naturalny Phi p 4. Reaktywność immunologiczna rPhi p 4 mogła zostać udowodniona poprzez reakcję z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi 5H1 i 3C4, które zostały wyindukowane w wyniku oddziaływania naturalnego Phi p 4 i reagują krzyżowo z homologicznymi białkami (grupa 4) Poaceae (fig. 4) (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6); 361-367). rPhi p 4 wchodzi w reakcję z przeciwciałami IgE alergików, które charakteryzują się udowodnioną reaktywnością IgE z naturalnym Phi p 4. Ta reaktywność wobec IgE, a poprzez to oddziaływanie jako alergen mogło zostać udowodnione zarówno w teście-Dot, metodą Western-Blot i techniką adsorpcji alergenów na polistyrenowych mikropłytkach.
Detekcję metodą Western-Blot przedstawiono na rysunku fig. 5. W wyniku reakcji rPh1 p 4 z leukocytami zasadochłonnymi alergików uczulonych na alergeny grupy 4 pyłku traw, leukocyty zasadochłonne pobudzane są do zwiększonej ekspresji markera aktywującego CD 203c. Taka aktywacja leukocytów zasadochłonnych przez rPhi p 4 świadczy wyraźnie o funkcjonalnej czynności tego białka jako alergenu. Taki alergen rPhi p 4 może zatem zostać wykorzystywany do wysoko specyficznej diagnostyki alergików uczulonych na pyłki traw. Diagnostyka ta może przebiegać w warunkach in vitro poprzez detekcję specyficznych przeciwciał (IgE, lgG1-4, IgA) i reakcje z komórkami efektorowymi (np. leukocytami zasadochłonnymi z krwi) upakowanymi IgE lub w warunkach in vivo poprzez test reakcji skórnej i narażenie na organ reakcji.
Reakcja rPhi p 4 z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw może być dowiedziona przez specyficzną co do alergenu stymulację limfocytów T do proliferacji i syntezy cytokin dotyczącą komórek T ze świeżo spreparowanych limfocytów krwi, jak również założonych linii komórkowych limfocytów T i klonów nPhi p 4-reaktywnych.
Bazując na przedstawionej sekwencji DNA rPhi p 4 sekwencje częściowe kodujące peptydy posiadające od 50 do 350 aminokwasów zostały wklonowane w wektory ekspresyjne. Sekwencje częściowe pokrywają kolejno pełną sekwencję rPhi p 4, przy czym mamy do czynienia z zachodzeniem na siebie co najmniej 12 aminokwasów. Funkcjonalne peptydy odpowiadają fragmentom Phi p 4. Fragmenty te - pojedyncze lub połączone w różnych kombinacjach - nie reagują z przeciwciałami IgE alergików lub reakcja zachodzi na niskim poziomie, co pozwala zaklasyfikować je jako hipoalergiczne. W przeciwieństwie do tego mieszanina tych fragmentów jest zdolna w takim samym stopniu jak cała cząsteczka rekombinowanego lub naturalnego Phi p 4 do stymulacji limfocytów T alergików uczulonych na pyłki traw Phi p 4.
Na rysunku fig. 4 przedstawiono jako przykład charakterystykę dwóch takich fragmentów Phi p 4, odpowiadających aminokwasom 1-200 i 185-500, poprzez ich wiązanie z Phi p 4-specyficznymi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi. Fragment C-końcowy 185-500 reaguje tylko z przeciwciałem monoklonalnym 5H1, podczas gdy fragment N-terminalny 1-200 reaguje wyraźnie tylko z przeciwciałem monoklonalnym 3C4. Z rysunku fig. 5 jasno wynika, iż fragment 185-500 reaguje słabiej z IgE pochodzącymi z surowicy alergików B i C, jest zatem mniej alergenny niż fragment 1-200, który wykazuje zredukowaną IgE-reaktywność (właściwości hipoalergiczne) względem surowicy pacjenta C.
Zatem, wynalazek dotyczy również opisanej powyżej i poniżej cząsteczki DNA kodującej fragment 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4, jak również cząsteczki DNA kodującej fragment 285-500 z aminokwasami 285-500 Phi p 4.
PL 219 272 B1
W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA według wynalazku kodująca immunomodulatorowy fragment Phi p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:
- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4 oraz
- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phi p 4.
Triplety kodujące cysteinę zostały w wyniku mutagenezy ukierunkowanej tak zmienione, że kodują inne aminokwasy, a korzystnie serynę. Zostały wyprodukowane zarówno warianty, w których zamianie uległy pojedyncze reszty cystein, jak również takie, w których zamienione zostały różne kombinacje dwóch reszt cysteinowych względnie wszystkich pięciu cystein. Funkcjonalne białka tych mutantów punktowych pod względem cysteiny wykazują silnie zredukowaną względnie brak reaktywności z przeciwciałami IgE alergików, są jednakże zdolne do reakcji z limfocytami T tych pacjentów. Zatem, wynalazek dotyczy także opisanej powyżej i poniżej cząsteczka DNA, w której wskutek ukierunkowanej mutagenezy jeden, kilka lub wszystkie rodniki cysteinowe odpowiedniego polipeptydu uległy zamianie na inny aminokwas.
W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej według wynalazku, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, która charakteryzuje się tym, że rzeczona mutacja obejmuje zastąpienie co najmniej jednej cysteiny odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
Immunomodulatorowa aktywność fragmentów hipoalergicznych, odpowiadających polipeptydom posiadającym epitopy limfocytów T, jak również hipoalergicznych mutantów punktowych (np. polimorfizmów cysteiny) jest potwierdzona ich reakcją z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw.
Takie hipoalergiczne fragmenty, bądź mutanty punktowe cysteiny mogą znaleźć zastosowanie w produkcji preparatów do obniżania wrażliwości (hiposensybilizacji) alergików, ponieważ reagują one z taką samą reaktywnością z limfocytami T, jednakże w związku z ich zmniejszoną lub brakiem reaktywności względem IgE, wywołują minimalne skutki uboczne spowodowane przez oddziaływanie z IgE.
W przypadku wklonowania odcinków kwasów nukleinowych kodujących hipoalergiczne warianty Phi p 4 lub kodujących niezmienione DNA Phi p 4 w ludzkie wektory ekspresyjne, konstrukcje takie mogą znaleźć zastosowanie w immunoterapii (szczepienie DNA).
W końcu wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających co najmniej jedną z dotychczas opisanych cząsteczek DNA lub co najmniej jeden z dotychczas opisanych wektorów ekspresyjnych i opcjonalnie składniki aktywne i/lub pomocnicze do immunoterapeutycznego szczepi enia DNA pacjentów cierpiących na alergie wywołane alergenami grupy 4 Poaceae i/lub do zapobiegania takim alergiom.
Inna grupa kompozycji farmaceutycznych według wynalazku zawiera, zamiast DNA, co najmniej jeden z dotychczas opisanych polipeptydów nadających się do diagnozy i/lub terapii rzeczonych alergii.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jako aktywne składniki polipeptyd według wynalazku lub wektor ekspresyjny i/lub lub ich odpowiednią farmaceutycznie użyteczną pochodną, w tym ich mieszaniny w dowolnym stosunku.
Składniki aktywne według wynalazku mogą być dostarczane do właściwej postaci dozowania razem z nośnikiem lub substancją pomocniczą o konsystencji stałej, płynnej i/lub półpłynnej i opcjonalnie w połączeniu z jednym lub kilkoma środkami czynnymi.
Jako substancje pomocnicze szczególnie nadają się do użycia immunostymulujące odcinki DNA lub oligonukleotydy bogate w motywy CpG. Kompozycje te mogą znaleźć zastosowanie jako terapeutyki i preparaty diagnostyczne w medycynie i weterynarii. Rolę nośników mogą spełniać organiczne lub nieorganiczne substancje, które nadają się do stosowania pozajelitowego i które nie wpływają negatywnie na działanie składników aktywnych będących przedmiotem wynalazku. Do podawania pozajelitowego szczególnie właściwe są roztwory, najbardziej korzystne są roztwory oleiste lub wodne, korzystne są także zawiesiny, emulsje i implantaty.
Składnik aktywny według wynalazku może także być liofilizowany, a otrzymany liofilizat wykorzystany np. do produkcji preparatów do iniekcji. Wymieniona kompozycja może być sterylizowana i/lub zawierać substancje pomocnicze takie jak substancje poślizgowe, konserwujące, stabilizujące i/lub substancje zwilżające, emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe i/lub wiele innych składników aktywnych. Ponadto, poprzez odpowiednią formulację składników aktywnych według wynalazku można otrzymać preparaty o powolnym uwalnianiu.
Wynalazek służy zatem także polepszeniu diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji składnikowo-specyficznego spektrum wrażliwości na składniki wywołujące alergie.
PL 219 272 B1
Wynalazek służy również do otrzymywania znacząco ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii wywołanych przez pyłki traw.
T a b e l a 1
Sekwencja aminokwasów peptydów Phi p 4
| Preparat | Seria peptydu | SEQ ID NO | Aminokwasy | ||||||
| 1 | 6 | 11 | 16 | 21 | 26 | 31 | |||
| Cały Phi p 4 | P1-a | 35 | YFPP'P' | AAKED | FLGXL | VKEIP | PRLLY | AKSSP | AYP |
| P1-b | 36 | YFPP'P' | AAKED | FLGXL | VKE-P | PRLLY | AKSSP | ||
| P1-C | 37 | YFPXX | AAKED | FLGXL | |||||
| P1-d | 38 | YFPXX | AKKED | FLGXL | |||||
| P1-e | 39 | YFPXX | AAKDD | FLGXL | |||||
| P1-f | 40 | YFPXX | LANED | F | |||||
| Fragment Glu-C | P2 | 41 | SATPF | XHRKG | VLFNI | QYV | |||
| P3 | 42 | GLXYR | XLXPE | ||||||
| Fragment Lys-C | P4 | 43 | KXMGD | DHFXA | VR | ||||
| P5 | 44 | APEGA | VDI I | ||||||
| Fragment CNBr | P6 | 45 | MEPYV | SINPV | QAYAN | Y |
T a b e l a 2
Zdegenerowane oraz specyficzne sensowne (forward) i antysensowne (reverse) startery skonstruowane na bazie sekwencji peptydowych i sekwencji DNA Phi p 4
| Starter nr | Peptyd/DNA | Sensowny/An- tysensowny | SEQ ID NO | Sekwencja nukleotydowa |
| 29 | Phi p 4-P1 | S | 46 | YTN TAY GCN AAR WSN WSN CCN GCN TAY CC |
| 30 | Phi p 4-P2 | S | 47 | CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C |
| 37 | Phi p 4-P6 | As | 48 | TAR TTN OCR TAN GCY TGN ACN GGR TT |
| 82 | Phi p 4-DNANYW | S | 49 | ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG CC |
| 85 | Phi p 4-DNAGLV | As | 50 | TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CCA AAC C |
| 86 | Phi p 4-DNAQRL | As | 51 | CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTC TGG |
| 88 | Phi p 4-DNAPSV | S | 52 | CTC AGT CCT GGG GCA GAC CAT CC |
Sekwencje nukleotydów starterów 82, 85, 86 oraz 88 przedstawiono zwyczajowym kodem 4-literowym. W przypadku starterów 29, 30 oraz 37 zastosowano kod DNA lUPAC-IUB; w tym przypadku litera „N” oznacza inozynę.
PL 219 272 B1
T a b e l a 3
Wykryte polimorfizmy pojedynczych nukleotydów
| Pozycja w sekwencji | Nukleotyd według SEC ID NO 1 | Wykryte SNP |
| 1 | 2 | 3 |
| 85 | T | A |
| 130 | C | A |
| 159 | G | A |
| 160 | A | C |
| 169 | G | A |
| 185 | C | T |
| 186 | C | A |
| 222 | G | C |
| 226 | G | A |
| 227 | G | C |
| 228 | T | C |
| 237 | C | T |
| 273 | C | T |
| 285 | C | T |
| 286 | C | T |
| 298 | G | A |
| 299 | A | C |
| 303 | C | T |
| 309 | C | G |
| 318 | T | C |
| 320 | G | A |
| 333 | C | G |
| 348 | G | C |
| 369 | C | G |
| 409 | C | T |
| 411 | C | T |
| 420 | T | C |
| 421 | A | C |
| 423 | A | C |
| 424 | G | A |
| 425 | T | C |
| 456 | C | G |
| 462 | C | A |
| 522 | G | C |
| 525 | C | G |
| 567 | G | A |
PL 219 272 B1 cd. tabeli 3
| 1 | 2 | 3 |
| 618 | C | T |
| 655 | A | C |
| 657 | G | A |
| 662 | G | A |
| 680 | C | T |
| 684 | G | C |
| 690 | C | A |
| 691 | G | A |
| 693 | G | A |
| 703 | C | T, A |
| 710 | A | C |
| 711 | G | A |
| 713 | C | T |
| 743 | G | A |
| 750 | G | A |
| 768 | C | T |
| 773 | A | C |
| 790 | G | A |
| 798 | G | C |
| 801 | G | A |
| 804 | C | G |
| 809 | C | A |
| 834 | G | C |
| 844 | C | A |
| 859 | A | T |
| 865 | A | G |
| 879 | G | C |
| 895 | G | C |
| 900 | G | C, A |
| 918 | G | A |
| 961 | A | G |
| 962 | A | C |
| 964 | A | C |
| 987 | G | C |
| 994 | A | T |
| 1020 | G | A |
| 1023 | G | C |
PL 219 272 B1 cd. tabeli 3
| 1 | 2 | 3 |
| 1036 | G | C |
| 1040 | C | T |
| 1041 | G | C |
| 1047 | C | A |
| 1051 | A | G |
| 1052 | G | A, C |
| 1053 | G | A, C, T |
| 1056 | G | C |
| 1073 | G | A |
| 1084 | C | G |
| 1086 | G | C |
| 1090 | C | T |
| 1098 | G | C |
| 1151 | G | C |
| 1152 | G | C |
| 1155 | G | C |
| 1161 | G | C |
| 1185 | C | G |
| 1229 | G | C |
| 1233 | G | C |
| 1239 | A | C |
| 1240 | T | C |
| 1242 | G | C |
| 1257 | G | C |
| 1266 | C | T |
| 1269 | C | T |
| 1278 | A | C, G |
| 1305 | C | G |
| 1308 | C | T |
| 1311 | C | A |
| 1335 | G | C |
| 1350 | G | C |
| 1357 | T | A |
| 1359 | A | G |
| 1370 | G | C |
| 1377 | T | C |
| 1378 | T | A |
| 1379 | T | A |
PL 219 272 B1 cd. tabeli 3
| 1 | 2 | 3 |
| 1383 | G | C |
| 1398 | C | T |
| 1411 | T | C |
| 1414 | C | G |
| 1425 | C | A |
| 1428 | C | T |
| 1443 | G | C |
| 1449 | C | T |
| 1464 | G | A |
| 1485 | G | A |
| 1498 | A | C |
T a b e l a 4
Zamiany aminokwasów w konsekwencji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów
| Pozycja w sekwencji | Aminokwasy według SEQ ID NO 2 | Wykryte zamiany |
| 1 | 2 | 3 |
| 6 | A | L |
| 7 | A | K |
| 8 | K | N |
| 9 | E | D |
| 29 | S | T |
| 54 | I | L |
| 57 | V | I |
| 62 | A | V |
| 76 | G | T, N, S |
| 100 | E | T |
| 107 | S | N |
| 137 | H | Y |
| 141 | T | P |
| 142 | V | A, T |
| 189 | T | K |
| 219 | K | Q |
| 221 | R | K |
| 227 | P | L |
| 231 | V | I |
| 235 | P | T, S |
| 237 | K | T |
| 238 | A | V |
| 248 | R | K |
PL 219 272 B1 cd. tabeli 4
| 1 | 2 | 3 |
| 258 | D | A |
| 264 | V | I |
| 270 | T | K |
| 282 | Q | K |
| 287 | M | L |
| 289 | S | G |
| 299 | A | P |
| 321 | N | A |
| 322 | I | L |
| 332 | T | S |
| 346 | E | Q |
| 347 | P | L |
| 351 | R | E, T |
| 357 | F | L |
| 358 | S | N |
| 362 | L | V |
| 364 | P | S |
| 384 | W | S |
| 410 | G | A |
| 419 | E | D |
| 456 | F | Y |
| 457 | S | A, N |
| 460 | L | K |
| 468 | K | M |
| 472 | Q | E |
| 498 | K | Q |
T a b e l a 5
Pozycje aminokwasów różniących się w poszczególnych klonach Phi p 4 w porównaniu z sekwencją SEQ ID NO 2
| Przykład | Pozycje różniące się* |
| 1 | 2 |
| Klon 1 | L54, 157, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, 0219, K221, L227, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
| Klon 2 | L54, 157, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, 0219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, 0346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
| Klon 3 | P141, K282, L287, P299, L347, E351 |
| Klon 4 | G289, A410, D419, Y456, A 457, K460, E472 |
| Klon 5 | L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
PL 219 272 B1 cd. tabeli 5
| 1 | 2 |
| Klon 6 | N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460 |
| Klon 7 | K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384 |
| Klon 8 | Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, E351 |
| Klon 9 | M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334 |
| Klon 10 | Q219, K221, 1231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472 |
| Klon 11 | Wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408 |
* [Aminokwas według SEQ ID NO 2/pozycje w sekwencji/różniący się aminokwas]
T a b e l a 6
Skład aminokwasowy Phi p 4
| Aminokwasy | Liczba | % masowy |
| Z ładunkiem | 138/138/138 | 33,89/33,86/33,93 |
| Kwasowe | 45/46/43 | 9,82/10,05/9,38 |
| Zasadowe | 54/53/55 | 13,67/13,39/13,78 |
| Polarne | 120/119/124 | 24,88/24,71/25,89 |
| Hydrofobowe | 180/180/180 | 35,64/35,66/35,43 |
| A Ala | 40/40/41 | 5,10/5,10/5,24 |
| C Cys | 5/5/5 | 0,92/0,93/0,93 |
| D Asp | 24/24/24 | 4,95/4,96/4,97 |
| EGIu | 21/22/19 | 4,86/5,10/4,41 |
| F Phe | 24/24/22 | 6,33/6,34/5,82 |
| GGIy | 42/42/40 | 4,30/4,30/4,10 |
| H His | 10/10/9 | 2,46/2,46/2,22 |
| I Ile | 29/29/30 | 5,88/5,89/6,10 |
| K Lys | 29/29/33 | 6,67/6,67/7,60 |
| L Leu | 33/33/35 | 6,70/6,70/7,12 |
| M Met | 11/11/10 | 2,59/2,59/2,36 |
| N Asn | 22/22/23 | 4,50/4,50/4,72 |
| P Pro* | 38/39/39 | 6,62/6,80/6,81 |
| Q GIn | 15/15/15 | 3,45/3,45/3,46 |
| R Arg | 25/24/22 | 7,00/6,73/6,18 |
| S Ser | 32/32/33 | 5,00/5,00/5,17 |
| T Thr | 22/21/22 | 3,99/3,81/4,00 |
| V Wal | 41/41/40 | 7,29/7,29/7,13 |
| W Trp | 13/13/12 | 4,34/4,34/4,02 |
| Y Tyr | 24/24/26 | 7,02/7,03/7,63 |
* w tym hydroksyprolina
PL 219 272 B1
Wartości zostały podane dla trzech dominujących sekwencji w kolejności SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4/SEQ ID NO 6.
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej cechującej się względem sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 homologią sekwencji wynoszącą co najmniej 91,8%.
- 2. Cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 z co najmniej jedną pojedynczą zmianą nukleotydową wybraną z grupy obejmującej: T85A, C130A, G159A, A160C, G169A, C185T, C186A, G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C273T, C285T, C286T, G298A, A299C, C303T,C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T, C411T, T420C, A421C, A423C, G424A,T425C, C456G, C462A, G522C, C525G, G567A, C618T, A655C, G657A, G662A, C680T, G684C,C690A, G691A, G693A, C703T, C703A, A710C, G711A, C713T, G743A, G750A, C768T, A773C,G790A, G798C, G801A, C804G, C809A, G834C, C844A, A859T, A865G, G879C, G895C, G900C,G900A, G918A, A961G, A962C, A964C, G987C, A994T, G1020A, G1023C, G1036C, C1040T, G1041C, C1047A, A1051G, G1052A, G1052C, G1053A, G1053C, G1053T, G1056C, T1069C,G1073A, C1084G, G1086C, C1090T, G1098C, G1151C, G1152C, G1155C. G1161C, C1185G,G1229C, G1133C, A1239C, T1240C, G1242C, G1257C, C1266T, C1269T, A1278C, A1278G,C1305G, C1308T, C1311 A, G1335C, G1350C, T1357A, A1359G, G1370C, T1377C, T1378A,T1379A, G1383C, C1398T, T1411C, C1414G, C1425A, C1428T, G1443C, C1449T, G1464A, G1485A i A1498C.
- 3. Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, znamienna tym, że rzeczony polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej:- polipeptyd mający sekwencję SEQ ID NO: 2 z jedną lub większą liczbą zmian aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej: A6L, A7K, K8N, E9D, S29T, I54L, V57I, A62V, G76T, G76N, G76S, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, V142T, T189K, K219Q, R221K, P227L, V231I, P235T, ME262A P235S, K237T, A238V, R248K, D258A, V264I, T270K, Q282K, M287L, S289G, A299P, N321A, I322L, T332S, E346Q, P347L, R351E, R351T, F357L, S358N, L362V, P364S, W384S, G410A, E419D, F456Y, S457A, S457N, L460K, K468M, Q472E i K498Q.
- 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, kodująca immunomodulatorowy fragment Phi p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4 oraz- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phi p 4.
- 5. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej w zastrz. od 1 do 3, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, znamienna tym, że rzeczona mutacja obejmuje zastąpienie co najmniej jednej cysteiny odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
- 6. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.
- 7. Sposób otrzymywania polipeptydu kodowanego sekwencją DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4 poprzez hodowanie organizmu żywiciela transformowanego cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4 lub wektorem ekspresyjnym zdefiniowanym w zastrz. 6 i izolowanie polipeptydu z kultury hodowlanej.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02013953 | 2002-06-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL400683A1 PL400683A1 (pl) | 2013-02-04 |
| PL219272B1 true PL219272B1 (pl) | 2015-04-30 |
Family
ID=29797135
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL372423A PL215097B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense |
| PL400683A PL219272B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL372423A PL215097B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8128935B2 (pl) |
| EP (2) | EP1515988B1 (pl) |
| JP (1) | JP2006510346A (pl) |
| CN (1) | CN100391970C (pl) |
| AT (1) | ATE550349T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003279352B2 (pl) |
| BR (1) | BR0312068A (pl) |
| CA (1) | CA2491038C (pl) |
| ES (2) | ES2384045T3 (pl) |
| PL (2) | PL215097B1 (pl) |
| PT (2) | PT2392591T (pl) |
| RU (1) | RU2327739C2 (pl) |
| WO (1) | WO2004000881A1 (pl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10359351A1 (de) | 2003-12-16 | 2005-07-21 | Merck Patent Gmbh | DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung von Gruppe-4 Majorallergenen aus Getreiden |
| AU2011202726B2 (en) * | 2003-12-16 | 2012-04-26 | Merck Patent Gmbh | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |
| DE10359352A1 (de) | 2003-12-16 | 2005-07-21 | Merck Patent Gmbh | DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung des Graspollen-Allergens Lol p 4 |
| AU2013204574B2 (en) * | 2003-12-16 | 2015-02-26 | Merck Patent Gmbh | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |
| RU2607373C2 (ru) * | 2010-01-14 | 2017-01-10 | Мерк Патент Гмбх | Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков |
| IN2014MN01513A (pl) * | 2012-02-07 | 2015-09-11 | Jolla Inst Allergy Immunolog |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030135888A1 (en) * | 2001-09-26 | 2003-07-17 | Tong Zhu | Genes that are modulated by posttranscriptional gene silencing |
-
2003
- 2003-06-11 PT PT110056207T patent/PT2392591T/pt unknown
- 2003-06-11 EP EP03740216A patent/EP1515988B1/de not_active Revoked
- 2003-06-11 EP EP11005620.7A patent/EP2392591B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 JP JP2004514687A patent/JP2006510346A/ja active Pending
- 2003-06-11 WO PCT/EP2003/006092 patent/WO2004000881A1/de not_active Ceased
- 2003-06-11 CA CA2491038A patent/CA2491038C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 AT AT03740216T patent/ATE550349T1/de active
- 2003-06-11 ES ES03740216T patent/ES2384045T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 US US10/518,927 patent/US8128935B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 ES ES11005620.7T patent/ES2670573T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 PL PL372423A patent/PL215097B1/pl unknown
- 2003-06-11 RU RU2005101744/13A patent/RU2327739C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 PL PL400683A patent/PL219272B1/pl unknown
- 2003-06-11 CN CNB038151782A patent/CN100391970C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 BR BR0312068-6A patent/BR0312068A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-06-11 AU AU2003279352A patent/AU2003279352B2/en not_active Ceased
- 2003-06-11 PT PT03740216T patent/PT1515988E/pt unknown
-
2011
- 2011-02-24 US US13/034,210 patent/US9120866B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-11-21 US US14/550,370 patent/US9556241B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2384045T3 (es) | 2012-06-28 |
| WO2004000881A1 (de) | 2003-12-31 |
| PL215097B1 (pl) | 2013-10-31 |
| ATE550349T1 (de) | 2012-04-15 |
| EP1515988B1 (de) | 2012-03-21 |
| ES2670573T3 (es) | 2018-05-31 |
| CN1665835A (zh) | 2005-09-07 |
| US9120866B2 (en) | 2015-09-01 |
| RU2327739C2 (ru) | 2008-06-27 |
| CA2491038A1 (en) | 2003-12-31 |
| RU2005101744A (ru) | 2005-06-27 |
| US20120288526A1 (en) | 2012-11-15 |
| AU2003279352B2 (en) | 2009-09-10 |
| AU2003279352A1 (en) | 2004-01-06 |
| PT2392591T (pt) | 2018-05-23 |
| PL372423A1 (pl) | 2005-07-25 |
| PL400683A1 (pl) | 2013-02-04 |
| US8128935B2 (en) | 2012-03-06 |
| EP1515988A1 (de) | 2005-03-23 |
| EP2392591A1 (de) | 2011-12-07 |
| BR0312068A (pt) | 2005-03-29 |
| US9556241B2 (en) | 2017-01-31 |
| EP2392591B1 (de) | 2018-02-21 |
| US20150079120A1 (en) | 2015-03-19 |
| CA2491038C (en) | 2017-04-25 |
| WO2004000881A9 (de) | 2004-02-26 |
| US20060177470A1 (en) | 2006-08-10 |
| JP2006510346A (ja) | 2006-03-30 |
| CN100391970C (zh) | 2008-06-04 |
| PT1515988E (pt) | 2012-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9789178B2 (en) | DNA sequence, and recombinant preparation of the grass pollen allergen Lol p 4 | |
| US9556241B2 (en) | DNA sequence and preparation of grass pollen allergen Phl p 4 by recombinant methods | |
| NZ263913A (en) | Lol pi protein allergen from ryegrass and related peptides coding sequences, vectors, protein production and use | |
| US20170246317A1 (en) | Dna sequence, and recombinant preparation of group 4 major allergens from cereals | |
| RU2368620C2 (ru) | ПРОИЗВОДНЫЕ PhI p 5а, ОБЛАДАЮЩИЕ СНИЖЕННОЙ АЛЛЕРГЕННОСТЬЮ И СОХРАНЕННОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ РЕАКТИВНОСТЬЮ | |
| AU2011202726B2 (en) | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals | |
| AU2013204574B2 (en) | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |