PT1515988E - Sequência de adn e produção recombinante do alergénio do pólen das gramíneas phl p4 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIA DE ADN E PRODUÇÃO RECOMBINANTE DO ALERGÉNIO DO PÓLEN DAS GRAMÍNEAS PHL P4"

Antecedentes da invenção A presente invenção é relativa à preparação da sequência genética do alergénio principal do pólen das gramineas Phl p 4. A invenção também compreende fragmentos, novas combinações de sequências parciais e mutantes pontuais com atividade hipoalergénica. As moléculas de ADN recombinante e os polipéptidos, fragmentos, novas combinações de sequências parciais e variantes derivados podem ser utilizados na terapia de doenças alérgicas aos pólenes. É possível utilizar as proteínas produzidas de forma recombinante no diagnóstico in vitro e in vivo de alergias aos pólenes.

As alergias do tipo 1 são significativas a nível mundial. Até 20% da população nos países industrializados padecem de problemas como rinite alérgica, conjuntivite ou bronquite asmática. Estas alergias são provocadas pelos alergénios que se encontram no ar (aeroalergénios) , libertados por fontes de diferentes origens, tais como pólenes das plantas, ácaros, cães ou gatos. Até 40% destes indivíduos alérgicos do tipo 1 mostram em torno uma reatividade IgE específica aos alergénios dos pólenes das gramineas (Freidhoff et al. , 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001).

As substâncias que desencadeiam a alergia do tipo 1 são proteínas, glicoproteínas ou polipéptidos. Estes alergénios reagem, após absorção através das mucosas, com as moléculas de IgE ligadas à superfície dos mastócitos das pessoas 2 sensibilizadas. Se duas moléculas de IgE forem interligadas por um alergénio, isto levará à libertação de mediadores (por exemplo, histamina, prostaglandinas) e citocinas através das células efetoras e, com isso, aos respetivos sintomas clínicos.

Em função da frequência relativa com que as diferentes moléculas de alergénios reagem com os anticorpos IgE de indivíduos alérgicos, é feita a distinção entre alergénios principais e alergénios secundários.

No caso do rabo-de-gato (Phleum pratense), identificou-se até à data o Phl p 1 (Petersen et ai., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), o Phl p 5 (Matthiesen e Lõwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), o Phl p 6 (Petersen et ai., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), o Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), o Phl p 4 (Haavik et ai., 1985, Int Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) e o Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) como alergénios principais. O Phl p 4 está indicado como glicoproteína básica com uma massa molecular entre 50 e 60 kDa (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Alergy Appl. Immunol. 78: 260-268). A molécula do Phl p 4 é resistente à tripsina (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) e 70-88% dos indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas têm anticorpos IgE contra esta molécula (Valenta et al., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi et al., 3 2001, Allergy 56: 1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33:43-51). Foram descritas moléculas homólogas de espécies de gramineas aparentadas (Su et ai., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et ai., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14-17). Estas moléculas homólogas da Poaceae constituem o grupo de alergénios 4, cujas moléculas apresentam uma elevada reatividade cruzada imunológica entre elas, tanto com anticorpos murinos monoclonais como também com anticorpos IgE humanos (Fahlbusch et al., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; Su et al., 1996, J. Allergy Clin.

Immunol. 97:210; Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et ai., 2000, Invest.

Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll et al. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote et al., 2002, Biol.

Chem. 383; 1441-1445; Andersson und Lidholm, 2003, Int.

Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).

Ao contrário dos alergénios principais acima referidos do Phleum pratense (Phl p 1, Phl p 2/3, Phl 5a e 5b, Phl p 6 e Phl p 13) , a estrutura primária do Phl p 4 ainda não está esclarecida. Do mesmo modo, não existe uma sequência completa de moléculas do grupo 4 de outras espécies de gramineas. A determinação da sequência de aminoácidos N-terminal não teve êxito até à data. As causas disso não são porém conhecidas. Fischer et ai. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) presumem um bloqueio N-terminal, tendo conseguido contudo purificar um péptido interno após 4 decomposição com lisil endopeptidase, e determinar a respetiva sequência: IVALPXGMLK (SEQ ID NO 7) .

Este péptido apresenta niveis de homologia em relação às sequências peptidicas nos alergénios de ambrósia Amb al e Amb a2, bem como semelhanças com sequências em proteínas de milho (Zm58.2), tomate (lat 59, lat 56) e tabaco (G10) (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189- 198) . No caso do Lolium perenne, foram descritos, para o alergénio do grupo 4 básico, fragmentos peptídicos com a seguinte sequência: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 8) e GLIEFPAGV (SEQ ID NO 9) (Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).

Do alergénio do grupo 4 do Dactylus glomerata também se obteve péptidos através de decomposição enzimática e fez-se o seu sequenciamento: DIYNYMEPYVSK {P15, SEQ ID NO 10), VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID NO 11), ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID NO 12) e GVLFNIQYVNYWFAP (Ρ22, SEQ ÍD NO 13} (Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

Também do alergénio do grupo 4 da graminea Bermuda subtropical (Cynodon dactylon) se obteve péptidos através de proteólise e se fez o seu sequenciamento: 5 KTVKPLYUTF (Sr SEQID NO 14), KQVERD FLTSLTKDíPQLYLKS (V49L, SEQ ID NO 15), TVKPLYIÍTPITAAMI (T33$, SEQ ID NO 16), LRKYOTAADNVIDAKWDAQGRLL (T35L, SEQ ÍD NO 17), KWQTVAPALPDPNM (P2, SEQ ID NO 18), VTWIESVPYtPMGDSÍ (V26L, SEQ ID NO 19). GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID NO 20), TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS ÇT22L, SEQ ID NO 21). YRDLDLOVNQWO (P3, SEQ ID NO 22), SATPPTHRSGVLFN1 (V20L, SEO ID NO 23), e

AAMLPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID NO 24) (Liaw et al., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280: 738-743).

Estas sequências peptídicas descritas para o Phl p 4 e alergénios do grupo 4 não levaram contudo, até à data, a um esclarecimento da estrutura principal completa dos alergénios do grupos 4. O objetivo na base da presente invenção consistiu assim na preparação da sequência total do ADN do Phl p 4, bem como num respetivo ADN recombinante, sobre cuja base o alergénio Phl p 4 se expressasse como proteina e pudesse ser obtido como produto farmacológico importante, como tal ou numa forma modificada.

Lista das Figuras

Figura 1: Sequência de ADN interna (SEQ ID NO 25) do gene do Phl p 4. Com os primers N.° 30 (sense) e n.° 37 (anti- sense) degenerados, os dois representados em itálico, os amplificados obtidos com ADN genómico foram clonados e sequenciados. A sequência apresentada representa o consenso 6 de 6 clones. 0 primer n.° 82 sense específico criado a partir desta sequência está representado a sublinhado.

Figura 2: Extremidade 3' da sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO 26) do gene do Phl p 4

Numa 3'-RACE PCR com ADNc do Phleum pratense, obteve-se e sequenciou-se amplificados com o primer n.° 82 sense específico (representado em itálico), bem como com um primer âncora. A sequência apresentada representa o consenso de 3 sequenciamentos e abrange a extremidade 3' do gene do Phl p 4 até a um codão de finalização (duplo sublinhado). As áreas de sequência utilizadas na construção dos primers anti-sense n.° 85 e n.° 86 estão representadas a sublinhado.

Figura 3: Localização dos péptidos do Phl p 4 na sequência de aminoácidos deduzida do alergénio Phl p 4 (SEQ ID NO 2)

Os péptidos PI - P6 (SEQ ID NO 27-32), obtidos do sequenciamento de aminoácidos do alergénio Phl p 4 purificado e fragmentado, podem ser atribuídos de forma unívoca à sequência de aminoácidos derivada da sequência de ácidos nucleicos do gene Phl p 4.

Figura 4: Deteção da identidade do Phl p 4 recombinante (rPhl p 4) por meio de anticorpos monoclonais específicos do nPhl p 4 5H1 (Blot A) e 3C4 (Blot B) no Western Blot.

Banda 1: Extrato celular total de E. coli contendo o fragmento do rPhl p 4 1-200

Banda 2: Extrato celular total de E. coli contendo o fragmento do rPhl p 4 185-500 7

Banda 3: Extrato celular total de E. coli contendo o rPhl p 4

Banda 4: nPhl p 4 purificado do Phleum pratense ( ........y, fragmentos de terminação ou de degradação do fragmento do rPhl p 4 C-terminal ou da molécula total do rPhl p 4

Figura 5: Deteção da reatividade do Phl p 4 recombinante (rPhl p4) com IgE de soros de indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas no Western Blot. Extratos de células de E. coli transformadas, que exprimem o gene Phl p 4 completo ou o fragmento N-terminal 1-200 ou o fragmento C-terminal 185-500, foram separados em SDS-PAGE e foram transferidos para membrana de nitrocelulose. O Blot foi incubado com soros de dadores alérgicos aos pólenes das gramíneas A, B ou C e detetou-se em seguida, por colorimetria, IgE ligada através de um anticorpo IgE anti-humano, conjugado com fosfatase alcalina.

Banda 1: Extrato celular total de E. coli contendo fragmento do rPhl p 4 1-200 Banda 2 : extrato celular total de E. coli contendo fragmento do rPhl p 4 185-500

Banda 3: Extrato celular total de E. coli contendo o rPhl p 4

Banda 4: nPhl p 4 purificado do Phleum pratense

As denominações anterior e posteriormente utilizadas para sequências nucleotídicas ou de aminoácidos "SEQ ID NO" são relativas ao protocolo de sequências anexo à descrição.

Descrição da invenção

Com a presente invenção prepara-se a sequência genética do alergénio principal do pólen das gramineas Phl p 4, resultando, das substituições de nucleótidos individuais encontradas (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP), três sequências dominantes (SEQ ID NO 1, 3 e 5) . A presente invenção tem assim por objeto uma molécula de ADN correspondendo a uma sequência nucleotidica, selecionada de um grupo composto pelas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 5 ou uma molécula de ADN correspondendo a uma sequência nucleotidica que codifica o alergénio principal Phl p 4 do Phleum pratense.

Em ligação com a presente invenção, são de interesse, além dos alergénios do grupo 4 das outras espécies de gramineas, os alergénios do grupo 13, dado mostrarem um peso molecular muito semelhante aos alergénios do grupo 4 em SDS-PAGE e serem de dificil separação através de técnicas bioquímicas (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Com a sequência proteica e de ADN agora pela primeira vez existente de acordo com a invenção, é contudo possivel mostrar de forma univoca que os grupos 4 e 13 apresentam sequências de aminoácidos claramente diferentes.

Com o conhecimento da sequência de ADN dos alergénios de origem natural, é agora possivel produzir estes alergénios na forma de proteinas recombinantes, que podem ser utilizadas no diagnóstico e na terapia de doenças alérgicas (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

Uma preparação clássica para o tratamento terapêutico eficaz de alergias é representada pela hipossensibilização 9 ou pela imunoterapia específica (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Neste caso, injeta-se por via subcutânea no doente extratos de alergénios naturais em doses crescentes. Em todo o caso, existe neste método o risco de reações alérgicas ou até mesmo de choque anafilático. De modo a minimizar estes riscos, utiliza-se preparados inovadores na forma de alergóides. Trata-se neste caso de extratos de alergénios quimicamente modificados, que apresentam uma reatividade com as IgE claramente reduzida, mas contudo uma reatividade idêntica com as células T, em comparação com o extrato não manipulado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Outra grande otimização terapêutica seria possível com alergénios produzidos de forma recombinante. Determinados cocktails, eventualmente personalizados para corresponder ao modelo de sensibilização individual do doente, de alergénios altamente puros produzidos de forma recombinante poderiam libertar extratos de fontes naturais de alergénios, visto estes conterem, além dos diversos alergénios, um maior número de coproteínas imunogénicas mas não alergénicas.

Perspetivas realísticas de se conseguir uma hipossensibilização segura com produtos de expressão são possíveis com alergénios recombinantes que sofreram mutação de forma dirigida, nos quais são deletados de forma específica os epítopos de IgE, sem afetar os epítopos das células T essenciais à terapia (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).

Outra possibilidade de influenciar em termos terapêuticos o equilíbrio afetado das células auxiliares T nos indivíduos 10 alérgicos consiste na vacinação imunoterapêutica com ADN. Neste caso, trata-se do tratamento com ADN capaz de expressão, que codifique os alergénios relevantes. A primeira prova experimental da influência especifica de alergénios na resposta imunitária foi apresentada em roedores, através da injeção de ADN que codifica alergénios (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).

As proteinas produzidas de forma recombinante correspondentes podem ser utilizadas na terapia e no diagnóstico in vitro e in vivo de alergias aos pólenes.

Com vista à produção de um alergénio recombinante, liga-se o ácido nucleico clonado num vetor de expressão e este construto é expresso num organismo hospedeiro apropriado. Após purificação bioquímica, este alergénio recombinante fica à disposição para a deteção de anticorpos IgE em processos estabelecidos.

Por conseguinte, a presente invenção tem ainda por objeto um vetor de expressão recombinante, contendo uma molécula de ADN anterior e posteriormente descrita, ligada de forma funcional a uma sequência de controlo da expressão, e um organismo hospedeiro, transformado com a referida molécula de ADN ou com o referido vetor de expressão.

Como já apresentado, é possível aplicar a invenção como um componente essencial num preparado recombinante contendo alergénios ou ácidos nucleicos, com vista à imunoterapia específica. Neste caso, existem várias possibilidades. Por um lado, a proteína não modificada na estrutura primária pode ser um componente do preparado. Por outro lado, é possível através da deleção dirigida de epítopos de IgE de toda a molécula ou da produção de fragmentos individuais, que codificam epítopos das células T, utilizar de acordo 11 com a invenção uma forma hipoalergénica (alergóide) com vista à terapia, de modo a evitar efeitos secundários indesejados. Por fim, consegue-se com o ácido nucleico propriamente dito, quando ligado a um vetor de expressão eucariótico, um preparado que, ao ser diretamente aplicado, altera o estado imunitário alérgico no sentido terapêutico. A invenção consiste assim em moléculas de ADN recombinante correspondendo à SEQ ID NO 1, 3 ou 5, tendo a sequência nucleotidica das posições 1-69 sido derivada da sequência de aminoácidos N-terminal do Phl p 4. Neste caso, utilizou-se os codões que existem com frequência em E. coli. A partir da posição 70, a sequência de ADN corresponde à que foi identificada no ADN genómico e no ADNc do Phleum pratense. Por conseguinte, a presente invenção tem ainda por objeto uma molécula de ADN compreendendo uma sequência nucleotidica de acordo com a SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 5, com inicio na posição 70, que codifica um polipéptido com as propriedades do alergénio principal Phl p 4 do Phleum pratense.

Além disso, a presente invenção é relativa aos polipéptidos codificados por uma ou mais das moléculas de ADN acima descritas. Neste caso, trata-se em particular de polipéptidos de acordo com a SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 6, tendo as posições de aminoácidos 1-33 sido determinadas por sequenciamento de aminoácidos N-terminais do alergénio Phl p 4 natural isolado. As posições 24-500 foram derivadas da sequência de ADN de acordo com a SEQ ID NO 1, 3 ou 5. Os aminoácidos variáveis nas posições 6, 7, 8 e 9 têm origem no sequenciamento proteico N-terminal de diferentes preparações do Phl p 4 natural (Tab. 1).

Em conformidade com isso, a invenção é igualmente relativa a um processo para a produção desses polipéptidos através 12 da cultura de um organismo hospedeiro e da obtenção do respetivo polipéptido a partir da cultura.

Estes polipéptidos ou proteinas de acordo com a invenção, que atuam nos humanos como alergénios, estão contidos nos grãos de pólen do Phleum pratense. Os grãos de pólen de outras espécies da Poaceae, como, por exemplo, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus Lantus, entre outros, contêm moléculas de alergénios homólogas (alergénios do grupo 4). A homologia destas moléculas é comprovada pela sua reatividade cruzada imunológica, tanto com anticorpos monoclonais murinos como também com anticorpos IgE humanos.

Por consequência, a invenção é igualmente relativa a sequências homólogas da sequência de ADN do Phl p 4 ou às respetivas moléculas de ADN dos alergénios do grupo 4 de outras Poaceae, como, por exemplo, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum e Hordeum vulgare, que hibridam, devido à homologia existente de sequência, com o ADN do Phl p 4 sob condições estritas e que apresentam uma reatividade cruzada imunológica relativamente ao Phl p 4.

Na determinação da sequência proteica e de ADN do Phl p 4 procedeu-se da seguinte forma:

Realizou-se a purificação e o isolamento do alergénio natural Phl p 4 de acordo com métodos descritos (Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) . A purificação fina e a separação de vestígios do alergénio do grupo 13 foram realizadas de acordo com o método descrito por Suck et al. (2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). 13

Deste Phl p 4 isolado do Phleum pratense, determinou-se a sequência de aminoácidos N-terminal por meio da decomposição de Edman. Com diferentes cargas do Phl p 4, determinou-se as sequências N-terminais (Pla-f) mostradas na Tabela 1. Como sequência consensual para as primeiras 15 posições, é considerada a seguinte sequência: YFPP' P' AAKEDFLGXL (SEQ ID NO 33). Não foi possível determinar a posição 14, provavelmente a mesma está ocupada por uma cisterna. Os diferentes aminoácidos nas posições 6, 7, 8 e 9 no caso das diferentes cargas apontam para variações no sentido de isoformas. As posições 4 e 5 estão ocupadas por hidroxiprolina (P'), o que foi determinado de forma unívoca por uma análise específica nas análises dos preparados pl-a e pl-b.

Através do tratamento do Phl p 4 desnaturado com SDS com a endopeptidase Glu-C (Promega, Heidelberg, Alemanha), obteve-se diferentes péptidos. A partir de dois péptidos (P2 e P3) , determinou-se as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1. Através de separação com a endopeptidase Lys-C (Roche, Mannheim, Alemanha), purificou-se e sequenciou-se 2 péptidos (P4 e P5) (Tab. 1) . Por meio de clivagem com CNBr, isolou-se outro péptido (P6) e determinou-se a sequência de aminoácidos (Tab. 1).

As sequências de aminoácidos da sequência N-terminal e dos péptidos internos 2 e 6 foram utilizadas como base para a construção de primers degenerados. Com o primer sense N.° 30 e com o primer anti-sense N.° 37 (Tab. 2), produziu-se amplificados com o ADN genómico do Phleum pratense. Os clones obtidos destes amplificados foram sequenciados (Fig. 1) e utilizados na construção do primer sense específico n.° 82 (Tab. 2). Com um ADNc, produzido a partir da população de ARNm representativa de pólen do Phleum 14 pratense, e com o primer sense específico de acordo com a invenção n.° 82, bem como com o primer âncora AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Alemanha), realizou-se uma PCR sob condições rígidas. Este amplificado de cerca de 450 kb foi sequenciado e identificou-se assim a sequência em falta até à extremidade 3' do gene do Phl p 4 (Fig. 2) . Com base na sequência do Phl p 4 C-terminal determinada de acordo com a invenção, construiu-se os primers anti-sense específicos n.° 85 e n.° 86 (Tab. 2). Com base na sequência de aminoácidos N-terminal do péptido do Phl p 4 Pl-a (Tab. 1, construiu-se o primer sense degenerado n.° 29, derivado do ADN que codifica as posições de aminoácidos 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID NO 34)).

Com os primers n.° 29 e n.° 86, realizou-se uma PCR com ADN genómico do Phleum pratense. Este produto de PCR foi utilizado como base para uma segunda PCR (nested PCR) com os primers n.° 29 e n.° 85. Os amplificados foram inseridos no vetor pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Alemanha), clonados e sequenciados. Esta sequência tem início na posição 24 a contar da terminação N ou na posição 70 da sequência de ADN de acordo com a SEQ ID NO 1, 3 ou 5 e chega até ao primer n.° 85, (posição 1402 na SEQ ID NO 1, 3 ou 5), localizado na secção C-terminal já determinada do gene do Phl p 4. Com estes dados, é possível construir a sequência de aminoácidos completa da molécula do Phl p 4 a partir das primeiras 33 posições de aminoácidos determinadas por sequenciamento proteico e da sequência de aminoácidos deduzida (477 posições), que pode ser derivada dos clones produzidos com os primers n.° 29/n. ° 85 e n.° 82/primer âncora. Os dois clones sobrepõem-se em 197 posições da respetiva sequência nucleotídica. O péptido codificado pelo clone n.° 29/n.° 85 tem uma sobreposição de 10 posições de aminoácidos com a sequência N-terminal 15 (posições 1-33) do Phl p 4 determinada por sequenciamento direto de aminoácidos, sendo coincidentes os aminoácidos determinados com os dois métodos. A sequência de aminoácidos do Phl p 4, com base nos aminoácidos N-terminais determinados de forma direta e na sequência de aminoácidos deduzida, corresponde às sequências apresentadas nas SEQ ID NO 2, 4 ou 6 no protocolo de sequências.

Com o primer sense especifico n.° 88 (Tab. 2) e com o primer anti-sense especifico n.° 86, produziu-se produtos de PCR tanto com ADN genómico como com ADNc do Phleum pratense e fez-se o seu sequenciamento direto.

Deste modo, é possível excluir erros de PCR e despistar variações genéticas (single nucleotide polymorphisms) .

As substituições de nucleótidos individuais encontradas na sequência de ADN SEQ ID NO 1 encontram-se apresentadas na Tabela 3. Algumas destas substituições de nucleótidos individuais levam a aminoácidos alterados. Estes encontram-se representados na Tabela 4. Sequenciou-se ainda clones de ADN, que levam a aminoácidos desviantes relativamente às sequências dominantes SEQ ID NO 2, 4 e 6 (Tab. 5).

Estas variações de aminoácidos devem ser consideradas isoformas da molécula Phl p 4. A existência destas isoformas é espectável devido ao comportamento isoelétrico heterogéneo do Phl p 4 natural. Todos os alergénios dos pólenes conhecidos até à data apresentam estas isoformas. 0 facto de o fragmento de ADN, determinado com os primers N.° 29 e 86, codificar realmente uma proteína que é idêntica ao alergénio Phl p 4 natural também pode ser comprovado, entre 16 outros, por se encontrar, para os péptidos internos identificados P3, P4 e P5 (Tab. 1) do Phl p 4 natural, sequências peptídicas homólogas na sequência de aminoácidos deduzida da molécula Phl p 4 recombinante de acordo com a invenção (Fig. 3) . A sequência de aminoácidos descrita do Phl p 4 mostra que se trata de uma molécula básica com um ponto isoelétrico calculado de 8,99 (SEQ ID NO 2), 8,80 (SEQ ID NO 4) ou 9,17 (SEQ ID NO 6), composta por 500 aminoácidos. A composição de aminoácidos quantitativa encontra-se representada na Tabela 6. O peso molecular calculado do Phl p 4 recombinante é de 55.7 62 (SEQ ID NO 2), 55.734 (SEQ ID NO 4) ou 55.624 (SEQ ID NO 6) Dalton. Esta massa molecular calculada coincide muito bem com a massa molecular determinada por SDS-PAGE do Phl p 4 natural, para o qual se determinou 55 kDa (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799 - 807 e Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

Também para os alergénios do grupo 4 de espécies de gramineas aparentadas, foram descritas massas moleculares entre 50 e 60 kDa (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl.

Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et al., 1996, J.

Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14 - 17).

Na produção da proteina do Phl p 4 recombinante, inseriu-se a sequência de ADN que codifica o Phl p 4 de acordo com a SEQ ID NO 1, 3 e/ou 5 em vetores de expressão (por exemplo, pProEx, pÀCro, pSE 380). No caso dos aminoácidos N- terminais conhecidos do sequenciamento proteico, utilizou-se codões otimizados de E. coli. 17

Após a transformação em E. coli, a expressão e a purificação do Phl p 4 recombinante através de diversas técnicas de separação, a proteína obtida foi sujeita a um processo de refolding.

Esta proteína rPhl p 4 assim obtida dá origem a uma única banda em SDS-PAGE, que oscila na mesma área de peso molecular que o Phl p 4 natural. A reatividade imunológica do rPhl p 4 pôde ser detetada através da reação com os anticorpos monoclonais murinos 5H1 e 3C4, que tinham sido induzidos com o Phl p 4 natural e com as proteínas homólogas (grupo 4) da Poaceae (Fahlbusch et ai., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et ai., 2000, Invest. Alergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367) (Fig. 4) . O rPhl p 4 reage com os anticorpos IgE dos indivíduos alérgicos, que têm uma reatividade IgE comprovada com o Phl p 4 natural. Esta reatividade IgE e com isso a atividade do alergénio puderam ser detetadas tanto no teste Dot, em Western Blot e também por adsorção do alergénio em placas de microtitulo de poliestireno. A deteção em Western Blot é mostrada na Figura 5. Na reação do rPhl p 4 com basófilos dos indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas, reativos ao grupo de alergénios 4, estes são estimulados para a expressão reforçada do marcador de ativação CD 203c. Esta ativação dos basófilos através do Phl p 4 mostra claramente que esta molécula também atua de forma funcional como alergénio.

Deste modo, é possível utilizar este alergénio rPhl p 4 no diagnóstico altamente específico de indivíduos alérgicos ao pólen das gramíneas. Este diagnóstico pode ser realizado in vitro através da deteção de anticorpos específicos (IgE, IgGl - 4, IgA) e da reação com células efetoras carregadas de IgE (por exemplo, basófilos do sangue) ou in vivo 18 através de reações de teste na pele e de provocação no órgão de reação.

Foi possível detetar a reação do rPhl p 4 com linfócitos T de indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas através de estimulação específica de alergénio dos linfócitos T, para a proliferação e para a síntese de citocinas tanto com células T em linfócitos do sangue acabados de preparar como também em clones e linhas de células T reativos com o nPhl p 4 estabelecidos.

Com base na sequência de ADN representada do rPhl p 4, clonou-se sequências parciais que codificam péptidos de 50 a 350 aminoácidos em vetores de expressão. Estas sequências parciais cobrem sequencialmente a sequência total do rPhl p 4, existindo sobreposições de pelo menos 12 aminoácidos. Os péptidos expressos correspondem a fragmentos do Phl p 4. Estes fragmentos do Phl p 4 não reagem ou reagem apenas pouco, individualmente ou como mistura, com os anticorpos IgE de indivíduos alérgicos, podendo ser classificados como hipoalergénicos. Em contrapartida, a mistura destes fragmentos é capaz, tal e qual como o Phl p 4 total recombinante ou natural, de estimular os linfócitos T de indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas com reatividade ao Phl p 4. A Figura 4 mostra, como exemplo, a caracterização de dois destes fragmentos do Phl p 4, correspondendo aos aminoácidos 1-200 e 185-500, através da ligação a anticorpos murinos monoclonais específicos do Phl p 4. O fragmento C-terminal 185-500 reage apenas com o anticorpo monoclonal 5H1, enquanto o fragmento N-terminal 1-200 reage de forma unívoca com o anticorpo monoclonal 3C4. A partir da Figura 5 é visível que o fragmento 185-500 reage com menos força com a IgE de soros de indivíduos alérgicos B e 19 C, portanto é menos alergénico do que o fragmento 1-200, que apresenta uma diminuída reatividade IgE (hipoalergenicidade) pelo menos relativamente ao soro do doente C.

Por conseguinte, a presente invenção tem também por objeto uma molécula de ADN descrita anterior e posteriormente, que codifica um fragmento 1-200, com os aminoácidos 1-200 do Phl p 4, bem como uma molécula de ADN que codifica um fragmento 285-500, com os aminoácidos 285-500 do Phl p 4.

Através de mutagénese dirigida ao local, alterou-se os tripletos que codificam a cisteína de modo a que codifiquem outros aminoácidos, preferencialmente serina. Produziu-se tanto variantes em que se trocou cisteínas individuais, como aquelas em que se alterou diversas combinações de 2 radicais cisteína ou todas as 5 cisteínas. As proteínas expressas destes mutantes pontuais de cisteína apresentam uma reatividade fortemente reduzida ou em falta com anticorpos IgE de indivíduos alérgicos, mas reagem contudo com os linfócitos T destes doentes.

Por conseguinte, o objeto da presente invenção é ainda uma molécula de ADN anterior ou posteriormente descrita, na qual, através de mutagénese dirigida ao local, um, mais ou todos os radicais cisteína do respetivo polipéptido foram substituídos por outro aminoácido. A atividade imunomoduladora dos fragmentos hipoalergénicos, que correspondem a polipéptidos com epítopos de células T, bem como a dos mutantes pontuais hipoalergénicos (por exemplo, substituições de cisteína) é detetada pela sua reação com as células T de indivíduos alérgicos aos pólenes das gramíneas. 20

Estes fragmentos ou mutantes pontuais das cisternas hipoalergénicos podem ser utilizados como preparados na hipossensibilização de indivíduos alérgicos, visto reagirem com a mesma eficácia com as células T mas, devido a uma menor reatividade ou à ausência total de reatividade com as IgE, levarem a poucos efeitos secundários mediados por IgE.

Se os ácidos nucleicos que codificam as variantes do Phl p 4 hipoalergénicas ou se o ADN que codifica o Phl p 4 inalterado se liga a uma vetor de expressão humano, será também possível utilizar estes construtos como preparados numa imunoterapia (vacinação de ADN).

Tabela 1 Sequência de aminoácidos de péptidos do Phl p 4 |Preparado C^BXÇjcL !SEQ ft>ní n o-ácidos \ pépti- MD I dos mo 1 6 11 1« 21 26 31 H Cargas Tt-a [35 VFPP-P· AAKED FLGXL VKBP PRLLY ÃKSSP ΑΫΡ""" jphl p4 ! P1-b 36 YFPPP* AAKED FLGXL VKE-P PRLLY AKSSP P1-C 37 YFRXX AAKED FLGXL ! P1-d 36 YFPXX AKKED FLGXL P1hs 39 YFPXX AAKDD FLGXL L...... PM 40 YFPXX LANED F I Fragmers- P2 41 SATPF XHRKG VLFNI QYV I t os de j Glu-C P3 42. GLXYR XLXPE j Fragiaen- P4 43 KÀmD DHFXA VR tos da I Lys-C P5 44 APEGA VDI ! ; Fracjiaerafco P6 ps MEPYV SSNPV GAYAN Y |de CNBe i 21

Tabela 2 Primers degenerados e específicos sense e anti-sense, construídos sobre a base das sequências de ADN e sequências peptídicas do Phl p 4

PrímST | péptido/ ADN ..........i.................................................... Sense/ Antl· Sense SEG !D NO Sequência de micleótidos 29 | Phf p 4-F1 s 46 YTN TAY GCN AAR W$N WSN CCN GCN TAY CG 30 j Phf p 4-P2 s 47 OAY um AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C 3? J Phl p 4-P6 as s 48 Si TAR TTN GCR TAN GCY TGN ACN GGRTT ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG GC 82 | Pliíp 4-DNA'NYW 85 | Phl p 4-DMA-GLV | as 50 TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CGAAACC i 88 [Phl p 4-DMA-QRL Jâi I | 51 CCC TTG GTG ATG GCG ÀGC CTC j TGG | 52 __ CTC AGT CGT GGG OCA GAC CAT ! CC

As sequências nucleotídicas dos primers 82, 85, 86 e 88 encontram-se representadas com o código de 4 letras usual. No caso dos primers 29, 30 e 37, utiliza-se o código de ADN IUPAC-IUB: a letra "N" representa neste caso inosina. 22 Tabela 3 Substituições detetadas de nucleótidos individuais

23

24

25

Tabela 4 Substituições de aminoácidos, no seguimento de substituições de nucleótidos individuais

26

Tabela 5 Posições de aminoácidos desviantes no caso de clones individuais do Phl p 4 recombinantes em relação à SEQ ID NO 2

*[aminoácido de acordo com a SEQ ID NO 2 / posição em sequência / aminoácido desviante] 27

Tabela 6 Composição de aminoácidos do Phl p 4

Aminoácidos Com earga ~4~ Mumero 138/138/138 % em peso 3339/33^86/33,93 Ácidos r 45/46/43 Ί 9,82/10,05/9,38 Alcai inos 54/53/55 13,67/13,39/13,78 Polares 120/119/124 24,88/24,71/25,89 Hidrófobos 180/180/180 .....35,64/35,66/35,43............... A Aia 40/40/41 6,10/5,10/5,24 C Cys 5/5/5 0,92/0,93/0,93 D Asp 24/24/24 4,95/4,96/4,97 EGtu 21/22/19 4,86/5,10/4,41 FRhé 24/24/22 6,33/6,34/5,82 G Gly 42/42/40 4,30/4,30/4,10 H Hís 10/10/9 2,46/2,46/2,22 I lie 29/29/30 5,88/5,89/6,10 K Lys 29/29/33 6,67/6,67/7,60 L Leu 33/33/35 6,70/6,70/7,12 MMet ΐ ϊ/ΐ Ϊ/Ϊ G 2,59/2,59/2,36 H Asm 22/22/23 4,50/4,50/4,72 P Pro* 38/39/39 6,62/6,80/5,81 G Gin 15/15/15 3,45/3,45/3,46 RArg S Ser '"t— TThr VVaJ 2BJ24I22 32/32/33~ 22/21/22 41/41/40' 7,00/6,73/6,18 5,00/5 00/5,17 '3,99/3,81/4,00 7,29/7,29/7,13

13/13/12 24/24/26 *inclusive hidroxiprolina 4,34/4,34/4,02 7,02/7,03/7,63“

Os valores encontram-se indicados para as três sequências dominantes na ordem sequencial SEQ ID NO 2/ SEQ ID NO 4/ SEQ ID NO 6.

Protocolo de sequências

«HÔ» KfeKCk Jíâignt *M)H

Sequência de AD8 e produção recoÉbiaante de alergénio do pólen das grassineas FM p 4 <130> P 02/101

<140> £« 02 8!3fS3,I «I4l> 2002-03-35 <1603· S2 «110» £«fce»tl« vêrsioa 3>t <11 S> 1 <21X> 1503 <212> DNà <2I3> Ph-lffl» psateme <23δ> <221> Sequência ADB artificial <222> UJ«* <223> Sequência de &DM derivada da proteína sequenciada <22C>

Sequência ÀDS nat iva <m> <220> 29 <221> COS<m> m.. asos) <223> <40Q> 1 t«c ttc ccg ccg ccg gct gct asa Tyr X Ph« Pr o Pro Pro S Ala Ala Lys SJQsi gss ate ccg ccg cgfc cig fctg Lys Glu Ile Pro 2.0 Pro Arg Leu Leu ccc i: c.3 gtc cfcg 990 cag acç ate ί'ΐΟ Set Vai Leu Gly Gin. Thr Ile 35 40 gac gtg aag ccg ate tac ate A&p AStí Vai Lys Pr» Ile lyr Ile 50 55 ate eag fcCG gee gtg gtg tgc gge 11¾ Gin Ser Ala Val Vai Cys Gly 65 70 gtg egc age gge ggg cac gac Val Arg Ser Gly Gly 85 Jfis As? Tyr eag ccc gag gag ttc. gee gtc gtc Gin Pro Glu Glu Pha Ãia Vai Val 100 tgg etg gac ggg ««9 gee ege a cg Ίερ Vai ftsp Gly Lys Ala Arg Thr 115 120 ctc ggc gag ctc tac tac gee. ate Lqu Gly ísiu Leu Tyr Tyr Ala He 130 13S ttc ccg gee gge gtg tgc ccg ácc Fhe Fro Ala Gly Vai Cys pro Thr 14S ISO S9<5 gge 3fc ttc gge atg etg etg GÍ,y Gly Gly Phe Gly Leu Leu 165 aac gtc ate gac gtg aag etc gtc ftsn Vãl ϊΐβ Ãsp Vai Lys Leu Val ISO aag aag tcc atg gge gac gac eat Lys tys Ser Hat Gly Asp Asp Sis 195 200 gaa Glu gac A s p 10 ttc Phe ctg Lífí U ggt tgc Gly Cys etg Leu IS gtc Vai tac Tvr 25 geg Ala aaa Lys teg 5®r teg Sar ccg Pro .30 gcg Ala tat Tyr cgg Arg agç Asm teg Ser egg Arg Trp 4S teg Ser teg Ser ccg Pro gtc Val acc Thr eee Pro acc Thr 60 aae AS ti gee Ala teç Ser cac His ege Arg egg Arg esc Hls 75 ggt Gly gtc vai ege Arg ate lia ege Arg 80-‘ gag Glu gge Gly 90 ctc Leu teg Ser tae egg Tyr Arg êec Ser S5 etg Leu gac Asp 105 ctt L®tl age Ser aag Lys atg Met cgg Arg 110 gee Ais gtg Val gtg Ala tgg Trp gtc Val gac Asp tcc Ser" 125 gge Gly gcg Ala Cag GIti cac His aag Lys gtg Ala agt Sar 140 ara Thr gtg Val etg Lau gcg Ala ate Ile gge Gly gtg Val 155 gge Gly gge.aac Gly Asn ttc Phe gcg Ala 160 ege Arg aag Lys 170 tae Tyr gge Gly ate 11« gcg Ala gee Ala 175 gag Glu gac Asp 1S5 gee Ala aac Aso gge Gly «cg Thr cfcg Leu 190 CSC Sis gac Asp ttc Phe tgg Trp gee Ala gtc val agg Arg gge Gly gge Gly ggg Gly 205 48 36 14 4 240 28 S 336 384 432 430 528 $76 624 30 <3QC age ttc ggc Stí'* O Wv çtg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ceg S72 Gly 60 u 210 Sex Phe Gly 11« Vai 215 Val Ãla Trp Lys Vai 220 Arg Leu Leu Pro gtg ecg CCC acg gfcg SCO gtg ttc aag ate CCC ase eag gcg age gag 720 Val 22$ Pro Pro Thr Val Thr 230 Val Phe Lys Ile Pro 235 Lys Lys Ala Ser Glu 2401 ggc gee gtg gae ate ate aac agg tgg eag gtg gtc gcg ccg eag etc 7 68 Gly Àla Vai Asp I I e 245 Ile Asn Arg Trp Gin 230 Val Val Ãla Pro Gin 255 Leu CCC gae gac ctc atg afcc ege gtc ate gcg eag gee cec a cg gee a cg 816 Pro Asp Asp Lee 260 Ket Ile Arg Val Ile 265 Ale Gin GÍy Pro Thr 270 Ala Thr ttc- g&g gee stg tac ctg ggc sec tqç caa acç ctg a cg ecg atg atg 3 64 Phs Gin Ãla 275 SSfit Tyr Leu Gly Thr 280 Cys Gin Thr Leu Thr 285 Pro tíet frset age age ãâÇ ttc ecg gag ctc ggc atg ase gee teg CSC tgc aac gag 912 Ser Ssr 290 hy$ Phe Pro Glu Leu 295 Gly Ket Asn Ala Ser 300 Hls cys Asn Giu âfcg teg tgg ate eag tec ate cec ttc gtc esc ctc gge CSC agg gae 960 Met 305 Ssr Trp Ile Gin Ser 310 Ile Pro Phe Val Kis 315 Leu Gly His Arg Àsp 32C aac ate gag gae gae etc etc aac CCQ aae ase BCC ttc aãg cec ttc 1008 Asn 11 a Glu .Asp Asp 33 S Lèc Leu As π Arg Ase 330 Asê Thr Pha Lys Pro 335 Phe gsc gaa tac teg gac tac gtc tac gag ecg ttc cec aag agg gtg 1056 Ala Glu Tyr Lys 340 Ser ASp Tyx Val Tyr 345 Glu pro Phe Pro Lys 350 Arg Vai tgg gâg cag ate fetc age ace tgg ctc ctg aag CCC çsgc gcg ggg ate U04 Trp 61u 6.1» 3SS Ile Phc Ser Thr Trp 360 Leu Leu Lys Pro Gly 363 Ala Gly lie atg ate ttc gse CGC tac ggc gee ÃCC ate age gee aee ecg gag tgg U52 Mat lie 3?Q Fh® Asp Pro Tyr Gly Ala 375 Thr Ile Set Alâ 380 Thr Pro GlU Trp gcg aeg ecg ttc Cct cac ege aag ggc gtc ctc ttc ase ate eag tac 1200 Ala 385 Thr Pro Phe Pro His 39Q ftrg Lys Gly Val Leu 395 Fhe As a Ilé Gin Tyr 400 gtc aae tac tgg ttc gee ccg gga gee ggc gcg gcg cea ttg teg tgg 1248 Vai Asn Tyr Trp Phe 405 Ala Pro Gly Ala Gly 410 Ma Ala Pro Leu Ser 415 Trp age aag gag ate tac aac tac atg gag CCS tac gtg age aag âãC eee 1296 Ser Lys Gly ile 420 Tyr Aân Tyr Hefc Glu 425 Pro Tyr Val Ser Ly« 430 Asn Pro agg cag gee tac gee aac tac agg gae ate gae ctc 9W agg aac gaq 1344 Arg Gin Ala 43S Tyr Ala Asfs Tyr Arg 440 Asp Ile Asp Leu Gly 445 Arg As» Gl« gt:g gtg aac gae gtc tec »ec ttc age age ggt ttg gtg tgg ggc eag 1392 31

Vai Vai 4.50 Asn Asp vai Ser Thr 4 55 Ph® Ser Set Gly Leu 460 V a 1 Trp QX y Gin aaa Lys 4 63 fcac Tyr ttc aag Lys ggc Gly aat Aân 470 ttc Phe csg Gin a gg Arg ctc Leu gCc Ais 475 ate lie sec Thr aag Lys ggc Gly aag Lys 400 14 40 gtg Vai gat Asp ccc Pro âÇC Thr gec Asp 4 85 tiiÇ íy* ttc Phe agg Arg «ac Asn gag Gl-j 490 eag Gin age Ser at c 11 e eeg Pm ecg Pr o 4 55 -ctc Leu 2488 Ile Lys *«g Lys tae Tyr SOO tgã 1503 <22Q> 2

<21l> SOO <212> PRT <2l3> Phleura pratense <400> 2

Tyr Phe Pr o Prs Pro Ala Ala Lys Glti Asp Phe lisa Gly Cys Leu Vai X 5 10 15 Lys 61 u Ile Pró P ΓΟ Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Pro Ala Tyr 20 25 30 Pr o Ser Vai Leu Gly Gin. Thr Ile Arg Asn Ser Asg Trp Ser Ser Pro 35 4 0 4S Asp Asn so Vai Lys Pro 11® Tyr 55 11.® vai fhr Pro Thr 60 Asn Ala Sar His Ile Gin Ser Ala vai Vai Cys Gly Arg Arg Mis Gly Vai Arg lie Arg es 70 75 se Vai Arg Ses Gly Gly His Asp Tyr Slu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu as 90 95 6.1 rs Fr o Glu Glo Phe Ala Vai Vai Asp Leu Ser Lys Met Arg ÃI a vai. 100 105 110 Trp V®1 Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala. Trp Vai Asp Ser Gly Ala Grm 113 120 125

Lau Gly GI.u Leu Tyr Tyr Ala He Htis Lys Ma Ser Thr Vai Leu Ala 130 J.35 140 32

Phe Pr o Ma Gly Vai Cys Pro Thr 145 ISO

Xle Giy Vai Gly Giy Asm Phe Ala 1S5 ISO

Giy Gly Gly Fhe Gly Hat Leu Leu

ÍSS

Arg lys Tyr Gly lie Ala Ai a Glu 170 175

Asn Vai IIe A.sp Vai Lys Leu Vai ISO

Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp 185 190

Lys Lys Ser Mst Gly Asp Asp Hí s 13 5 1 ;>oo

Fhe Trp Alá Vai Arg Gly Gly Gly 205

Giy Glsj .Ser Gly Ile Vai Vai 210 215

Ala Trp Lys Vai Arg Leu Leu Pro 220

Vai Pro Pr o Thr Vai Thr Vai Phe 225 230

Lys 1.1 tí Pro Lys Lys Ala Ser Glu 235 240

Gly Ala. Vai, Asp He lie Asfi Ârg 245

Trp Gin Vai Vai Ala Pro Gin Leu 250 2S5

Pro Asp Asp Leu Met lia Arg Vai 260

Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr zm 270

Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr 275 288

Cys Gin Thr Leu Thr Pro Met Mat 285

Ser Ser Lys Phe Pr o Glu Lee Giy 290 295

Mefc Asn .Ala Ser His Cys Asn Gi« 300

Het Ser Trp lie Gin Ser He Oro 3D5 310

Phe Vai His Leu Gly His Arg Asp 315 ' 320

Asn lie Gin AaP to Leu Leu As π 325

Arg Asrs Asn Thr Phe Lys Pro Phe 330 335

Ai a Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Vai 340 ' -

Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Vai 345 350

Trp GI« Gin Oe Phe Ser Thr Trp 355 36Ò

Leu Leu Lys Pro Giy Ala Giy lis? 365

Met He Phe Asp pro Tyr Giy Ai a 370 315

Thr He Ser Ala Thr Pro Giu Trp 3S0 33

Ala 3BS Tlir Fm Píh^ Oro H i $ 4*0 Ar;;í Lys. ©Ay fe1 L-8 U 393 Phe Así? 11.© ©A» Ty < 4 bo- Vê .1 Tyf trp. Pihe Âla. Pr© 04 y 4 lh Ms Mâ Prcs Leu Ser 41S Trp Ser Lys ály 11¾ ty£ rm A&n Tyr &lu §25 |'! r o Tyr fel fer Ly s 4 30 As» Pr o Ar$ Sln Ma Tyr ala 1 '15 ffe «s lis Asp Sly 44§ &rçj AíSO! ©Ití fel Vai 4 5-0 As» Ãsp Vai Ser Th r 4SS Fh© Ser Ssr oiy L«U Í€S Vgl Trp ©ly Gin 41$ Tyr Fife l-ys ©Ay &S:SS 42Õ Fhe Sln Affg 1¾¾ Ala 4"1'S 11© Thr Ly» Õly Ly.§; fel Asp :p<0 Tbr Asp !fy< i?h© Ar© ãSR 21 y £>i n fer lie Fr© Fm LSsU $$$ lis Lys ty* Tyr

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Lisboa, 15 de Junho de 2012

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ADN de acordo com uma sequência nucleotídica, selecionada de um grupo composto pelas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 5.

2. Molécula de ADN, compreendendo uma sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1, com início na posição 70, que codifica um polipéptido com as propriedades do alergénio principal Phl p 4 do Phleum pratense.

3. Molécula de ADN com uma sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1, com início na posição 70, que codifica um polipéptido com as propriedades do alergénio principal Phl p 4 do Phleum pratense.

4. Molécula de ADN que hibridiza com uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sob condições estritas, e que deriva de sequências de ADN de espécies da Poaceae.

5. Molécula de ADN que codifica um polipéptido, caracterizada por o polipéptido ser selecionado do grupo composto por um polipéptido com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo composto pelas SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 6, um polipéptido com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 com os desvios de aminoácidos de acordo com os clones 1 a 11: - clone 1: L54, 157, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, Kl 8 9, Q219, K221, L227, 1231, S235, T237, 2 V2 3 8, K24 8, A2 5 8, 1264, K27 0, K282, L287, P299 A321, L322, S332, Q34 6, P347, T351, L357, N358 V3 62, S384, A410, D419, Y45 6, A457, K460, E472, clone 2: : L54, 157, V62, T76 , T100 , NI 0 7, Y137, PI 41 T142, Kl 8 9, Q219, K221, 1231, S235, T237, V2 3 8 K24 8, A258, 1264, K27 0, K282, L287, P299, A321 L322, S332, Q34 6, P347, T351, L357, N358, V362 S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, clone 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351, clone 4 : G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, clone 5 : L347 , E351, S384, A410, D419, Y456, A457 K4 60, E472, clone 6 : NI 0 7 , Y137, PI 41, T142, K189, Q219, K221 1231, S235, T237, V238, K24 8, A2 58, 1264, K2 7 0 K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q34 6, P347 T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456 A457, K460, clone 7 : K2 4 8 , A258, 1264, K27 0, K282, L287, P299 A321, L322, S332, Q34 6, P347, T351, L357, N358 V362, S384, clone 8 : Q219 , K221, 1231, S235, T237, V238, K2 4 8 A258, 1264, K270, K282, L2 87, P299, E351, clone 9 : M2 31 , T246, A251, C263, G289, L307, L309 E334, clone 10: Q219, K221 , 1231, S235, . T237, M238, V242 V24 6, K24 8, A2 5 8, 1264, K27 0, K282, L287, P299 A321, L322, S332, Q34 6, P347, T351, N358, V362 S384, inserção de GA entre as posições 407 e 408 N452, Y456, A457, K460, E472, clone 11 : inserção de GA entre as posições 407 e 408

6. Uma molécula de ADN, correspondendo a uma sequência parcial ou a uma combinação de sequências parciais de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, que codifica um fragmento reativo com as células T 3 imunomodulador do Phl p 4, selecionado do grupo composto por fragmento 1-200, com os aminoácidos 1-200 do Phl p 4 e fragmento 185-500, com os aminoácidos 185-500 do Phl p 4.

7. Uma molécula de ADN correspondendo a uma sequência nucleotídica de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, que codifica um fragmento reativo com as células T imunomodulador, caracterizada por a referida sequência nucleotidica ter sido modificada por substituição especifica de uma, de mais ou de todas as cisteinas do respetivo polipéptido por outro aminoácido.

8. Um vetor de expressão de ADN recombinante, contendo uma molécula de ADN de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7, ligada de forma funcional a uma sequência de controlo da expressão.

9. Um organismo hospedeiro, transformado com uma molécula de ADN de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7 ou com um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 8.

10. Um polipéptido produzido de forma recombinante, que é codificado por uma sequência de ADN de acordo com uma ou mais das reivindicações 1, 3, 4, 5, 6 e 7. Lisboa, 15 de Junho de 2012