PL221689B1 - Sposób wytwarzania (R)-flawanonu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania (R)-flawanonu, o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie do otrzymywania środków farmaceutycznych oraz prekursorów wielu antyutleniaczy, mogących służyć jako konserwanty w przemyśle spożywczym.

Naturalne flawanony izolowane z roślin, takie jak: pinocembryna, pinostrobina, hesperetyna oraz naryngenina mają centrum chiralności o konfiguracji S [Simirgiotis M.J.; Adachi S.; To S.; Yang H.; Reynertson K.A.; Basile M.J.; Gil R.R.; Weinstein I.B.; Kennelly E.J., (2008) Cytotoxic chalcones and antioxidants from the fruits of Syzygium samarangense (Wax Jambu). Food Chemistry, 107, 2, 813-819; Gonzalez-Cortazar, M.; Maldonado-Abarca, A.M.; Jimenez-Ferrer, E.; Marquina, S.; Ventura-Zapata, E.; Zamilpa, A.; Tortoriello, J.; Herrera-Ruiz, M., (2013) lsosakuranetin-5-O-rutinoside: A New Flavanone with Antidepressant Activity Isolated from Salvia elegans Vahl.. Molecules, 18, 1326013270;

T. Morikawa, K. Funakoshi, K. Ninomiya, D. Yasuda, K. Miyagawa, H. Matsuda, M. Yoshikawa, (2008) Medicinal Foodstuffs. XXXIV. Structures of new prenylchalcones and prenylflavanones with TNF-a and aminopeptidase N inhibitory activities from Boesenbergia rotunda. Chem. Pharm. Bull. 56, (7) 956-962).

W badaniach aktywności biologicznych związków chiralnych ważna jest czystość enancjomerów, które poddaje się testom. Udowodniono, iż enancjomer (S)-naryngeniny inhibuje dwukrotnie silniej cytochrom P450 CYP19 i CYP2C19 w porównaniu z enancjomerem R, z kolei ten drugi enancjomer wykazuje dwukrotnie silniejszą inhibicję cytochromu P450 CYP3A oraz CYP2C9 (Lu W.J., Ferlito V., Xu C., Flockhart D.A., Caccamese V., (2011) Enantiomers of Naringenin as Pleiotropic, Stereoselective Inhibitors of Cytochrome P450 Isoforms, Chirality, 23, 891-896).

Związki flawonoidowe posiadają wysokie aktywności przeciwutleniające. Wykazują one zdolność do neutralizowania wolnych rodników oraz chelatowania jonów metali ciężkich (van Acker S.A.B.E., van Baien G.P., van den Berg D.J., Bast A., van der Vijgh W.J.F. 1998. Influence of iron chelation on the antioxidant activity of Flavonoids, Biochem. Pharmacol., 56, 935-943; Cao G., Sofic E., Prior R.l. 1997. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure - activity relationship, Free Radic. Biol. Med., 22, 5, 749-760).

Poza wymienionymi, flawonoidy wykazują znacznie szerszy wachlarz aktywności, typu: uszczelnianie i wzmacnianie ścian kapilarnych, działanie diuretyczne, spazmolityczne, przeciwzapalne, przeciwmiażdżycowe, antyagregacyjne, moczopędne, detoksykujące, przeciwnowotworowe oraz przeciwdrobnoustrojowe (Majewska M., Czeczot H. 2009. Flawonoidy w profilaktyce I terapii. Terapia i leki: 5, 369-375; Małolepsza U., Urbanek H. 2000. Flawonoidy roślinne jako związki biochemicznie czynne. Wiadomości Botaniczne: 44, 27-37. Martinez-Florez S., Gonzalez-Gallego J., Culebras J.M., Tunon M.J. 2002. Los Flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutricion Hospitalaria: 6, 271 -278. Yanez J.A., Andrews P.K., Davies N.M. 2007. Methods of analysis and separation of chiral flavonoids. Journal of Chromatography B: 848, 159-181).

Znany jest sposób otrzymywania (R)-flawanonu metodą chemicznego rozdziału (±)-flawanonu z użyciem (+)-butan-2,3-ditiolu poprzez syntezę diastereoizomerycznych tioketali, a następnie ich hydrolizę. Była to pierwsza metoda otrzymywania poszczególnych enancjomerów flawanonu opublikowana w 1962 roku (Corey E.J., Mitra R.B. 1962. L(+)-2,3-Butanedithiol: Synthesis and Application to the Resolution of Racemic Carbonyl Compounds. The Journal of American Chemical Society: 84, 2938-2941).

Kolejna chemiczna metoda otrzymywania enancjomerycznie wzbogaconych flawanonów z ich racematów opierała się na wieloetapowej syntezie. Powyższy rozdział osiągnięto poprzez otrzymanie cis-amin, a następnie ich deaminację do flawanoli, które na koniec zostały utlenione do odpowiednich enancjomerów flawanonu (Rakosi M., Tokes A.L., Bognar R. 1970. Synthesis of the enantiomers of flavan-4-ol and flavanone. Tetrahedron Letters: 11, 2305-2305).

Znany jest również sposób otrzymywania (R)-flawanonu na drodze enancjoselektywnej hydrolizy estrów oksymów (±)-flawanonu z zastosowaniem lipaz (Izumi, T. and Suenaga, K. (1997), Enzymatic resolution of flavanone oximes. J. Heterocyclic Chem., 34: 1535-1538) oraz w wyniku enancjoselektywnej redukcji (S)-flawanonu w mieszaninie (±)-flawanonu w kulturze drożdży piekarskich. W drugim przypadku możliwe jest uzyskanie (R)-flawanonu z wydajnością 51% i nadmiarem enancjomePL 221 689 B1 rycznym równym 20% (T. Izumi, T. Hino, A. Kasahara; Enzymatic kinetic resolution of flavanone and cis-4-acetoxyflavan. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1992, 1265-1267).

(P)-flawanon otrzymano również w wyniku utlenienia tlenkiem manganu(IV) (2P,4P)-cis-flawan-4-olu. Alkohol, będący substratem w powyższej reakcji, uzyskano natomiast zarówno w wyniku enzymatycznej estryfikacji odpowiednich alkoholi (T. Izumi, T. Hino, A. Kasahara, (1992) Enzymatic kinetic resolution of flavanone and cis-4-acetoxyflavan. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1265-1267), jak i enancjoselektywnej hydrolizy odpowiednich estrów (S. Ramadas and G.L.D. Krupadanam, (2004) Enantioselective acylation of (±)-cis-flavan-4-ols catalyzed by lipase from Candida cylindracea (CCL) and the synthesis of enantiopure flavan-4-ones. Tetrahedron: Asymmetry 15, 3381-3391).

Znany jest również sposób otrzymywania (P)-flawanonu z estru tert-butylowego kwasu 2-benzylo-3(-2-hydroksyfenylo)-3-keto-2-propenowego z użyciem tiomocznikowego katalizatora oraz kwasu p-toluenosulfonowego w temperaturze -25°C z 85% wydajnością oraz nadmiarem enanjomerycznym ee = 92% (zgodnie z analizą HPLC Chiracel OD-H) (M.M. Biddle, M. Lin, K.A. Scheidt, (2007), Catalytic Enantioselective Synthesis of Flavanones and Chromanones, JACS Communications, 129, 3830-3831).

Otrzymywanie (R)-flawanonu o wzorze 2 na drodze mikrobiologicznej, znane jest ze zgłoszenia wynalazku P. 407242. W opisanym sposobie (P)-flawanon otrzymano w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Yarrowia lipolytica KCh 71, na drodze enancjoselektywnego utlenienia jednego z enancjomerów (±)-trans-flavan-4-olu.

Istota wynalazku polega na tym, że do przygotowanej pożywki wprowadza się szczep Fusarium oxysporum AM 13 i w momencie osiągnięcia przez szczep końcowej fazy logarytmicznego wzrostu, dodaje się racemiczny (±)-flawanon, w ilości od 5 mg na 100 ml pożywki do 15 mg na 100 ml pożywki. Proces transformacji mikrobiologicznej prowadzi się wodną kulturą szczepu przy ciągłym wstrząsaniu, w wyniku czego, przy udziale systemu enzymatycznego szczepu, przekształceniu ulega (S)-enancjomer substratu. Uzyskany nieprzereagowany (P)-flawanon ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystne jest, gdy proces biotransformacji prowadzi się wodną kulturą mikroorganizmu, przy ciągłym mieszaniu reagentów, w temperaturze od 15 do 35°C.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie (+)-(P)-flawanonu z nadmiarem enancjomerycznym wynoszącym 96%, w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do 10 kolb Erlenmajera o pojemności 300 cm , w których znajduje się po 100 cm sterylnej pożywki zawierającej 1 g aminobaku i 3 g glukozy, wprowadza się szczep Fusarium oxysporum AM 13. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg racemicznego (±)-flawanonu, o wzorze 1, ₃ rozpuszczonego w 10 cm acetonu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez cztery dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu, po czym odparowuje się rozpuszczalnik. Otrz ymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksanu i acetonu w stosunku 15:1. Na tej drodze otrzymuje się 41 mg (+)-(P)-flawanonu (wydajność 41%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

(+)-(P)-flawanon (bezbarwne kryształy); [a]2° = +57.1° (c=0.5, etanol), 96% ee; (lit. [a] ²⁰ = + 55.6 (c=0.5, etanol), 94% ee; (K. Scheidt, M.M. Biddle, Catalytic enantioselective synthesis of flavanones and chromanones. Patent US 007851640B2, 2010).

¹H NMR (300 MHz) (CDCI₃) δ (ppm): 2,90 (dd, 1H, >16,9; 2,9 Hz, H-3e); 3,10 (dd, 1H, >16,9,

13,5 Hz, H-3a); 5,50 (dd, 1H, >13,5; 2,9 Hz, H-2a); 7,05-7,08 (m, 2H, H-6 and H-8), 7,38-7,53 (m, 6H, H-7, H-2' H-3', H-4', H-5'and H-6'), 7,94 (dd, 1H, >8,0; 1,8 Hz, H-5).

¹³C NMR (75,5 MHz, CDCI₃) δ = 44,7 (C-3), 79,6 (C-2), 118,1 (C-8), 120,9 (C-4a), 121,6 (C-6), 126,1 (C-2' and C-6'), 127,1 (C-5), 128,8 (C-4'), 128,9 (C-3' and C-5'), 136,2 (C-7), 138,7 (C-1'), 161,6 (C-8a), 192,0 (C-4).

Claims (3)

1. Sposób wytwarzania (P)-flawanonu, znamienny tym, że do przygotowanej pożywki wprowadza się szczep Fusarium oxysporum AM 13 i w momencie osiągnięcia przez szczep końcowej fazy logarytmicznego wzrostu, dodaje się racemiczny (±)-flawanon o wzorze 1, w ilości od 5 mg na 100 ml

PL 221 689 B1 pożywki do 15 mg na 100 ml pożywki, przy czym proces transformacji mikrobiologicznej prowadzi się wodną kulturą szczepu przy ciągłym wstrząsaniu, w wyniku czego, przy udziale systemu enzymatycznego szczepu, przekształceniu ulega (SJ-enancjomer substratu, po czym nieprzereagowany (RJ-flawanon ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 15-35°C.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem organicznym jest octan etylu.