PT658626E

PT658626E - Metodos para produzir a proteina c

Info

Publication number: PT658626E
Application number: PT94309314T
Authority: PT
Inventors: Brian William Grinnell
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1993-12-15
Filing date: 1994-12-14
Publication date: 2001-01-31
Also published as: AU8045294A; US5618714A; SI0658626T1; JPH07222589A; CA2138101A1; ES2149244T3; HUT69979A; KR950018454A; ATE196165T1; GR3034909T3; IL111983A0; RU94043769A; CZ315794A3; HU9403600D0; FI945877L; JP3662614B2; NO944846L; DE69425809T2; YU73494A; RU2110574C1

Description

u*, ^ ι^Ί

DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA PRODUZIR A PROTEÍNA C"

Essta invenção refere-se a biologia molecular, particularmente a métodos para a produção de elevados níveis da proteína funcional recombinante C em linhas celulares de mamíferos.

Muitas proteínas sofrem extensas modificações pós-translacionais durante a maturação. A proteína C humana (HPC) é gama-carboxilada, beta-hidroxilada e glicosilada quer durante quer pouco depois da tradução da transcrição do RNA primário. Muitas linhas celulares, como a linha celular AVI2 do hamster sírio, são incapazes de processar com eficiência estas modificações pós-translacionais. Portanto, as moléculas da proteína C nestas linhas celulares não são completamente funcionais. Outras linhas celulares, como a linha celular 293 do rim humano, produzem moléculas de proteína C completamente funcionais mas os níveis de expressão das moléculas de proteína C nestas linhas celulares são relativamente baixos. A presente invenção refere-se a métodos para aumentar o nível de produção de proteína C completamente funcional nas linhas celulares que habitualmente não produzem moléculas completamente funcionais. A invenção também se refere a métodos para aumentar o nível de produção total de moléculas de proteína C nas linhas celulares que habitualmente produzem moléculas completamente funcionais. Os métodos da presente invenção dizem respeito à cultura de linhas celulares produzindo proteína C a temperaturas superiores às da temperatura de incubação comum de 37°C. -2-

Para efeitos da presente invenção, tal como é aqui revelada e reivindicada, os termos que se seguem são como a seguir se definem.

Linha celular transformada por adenovírus - uma linha celular que espressa o produto do gene EI A de um adenovírus.

Proteína C humana - o zimógeno da proteína C humana e a proteína C humana activada.

Proteína nascente - o polipéptido produzido pela tradução de uma transcrição de mRNA antes de quaisquer modificações pós-tradução. Contudo, as modificações pós-tradução como a gama-carboxilação dos resíduos de ácido glutâmico e a hidroxilação dos resíduos de ácido aspártico podem começar a ocorrer antes de uma proteína estar completamente traduzida a partir de uma transcrição de mRNA.

Actividade da proteína C - qualquer propriedade da proteína C humana, responsável pelas actividades proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas e biológicas (anticoagulantes ou profibrinolíticas). Os métodos para testar a actividade anticoagulante da proteína são bem conhecidos na técnica, isto é, ver Grinnell et. al., 1987, Bio/Tecnology 5: 1189-1192.

Zimógeno - um precursor enzimaticamente inactivo de uma enzima proteolítica. O zimógeno da proteína C, tal como é aqui usado, refere-se a formas segregadas, inactivas, quer de uma quer de duas cadeias de proteína C.

Todas as abreviaturas de aminoácidos usadas nesta apresentação são as que se encontram aceites pelo Instituto de Patentes e Marcas dos Estados Unidos tal como determinado em 37 C.F.R. §1.822 (b) (2) (1990). -3 -

Uuj A presente invenção refere-se a um método para aumentar a produção de proteína C numa célula hospedeira recombinante de mamífero, transformada por adenovírus. O método compreende a cultura de células hospedeiras recombinantes de mamífero, transformadas por adenovírus a uma temperatura entre 38° C e 39° C. A invenção também se refere a um método de aumentar a produção da proteína funcional C numa célula hospedeira recombinante de mamífero, transformada por adenovírus, compreendendo a cultura da célula hospedeira a uma temperatura entre 38° C e 39° C.

Muitas linhas celulares foram usadas para produzir a proteína C recombinante humana. Contudo, porque a molécula da proteína C humana passa por extensas modificações pós-tradução, a maioria das linhas celulares, comuns ou não, pròduzem uma proteína C completamente funcional ou, se for produzida uma proteína C completamente funcional numa linha celular, os níveis de expressão ou de secreção mantêm-se relativamente baixos. Por exemplo, a linha celular AVI2 do "hamster" sírio não produz, em geral, moléculas de proteína C que contenham todos os nove resíduos de ácido gama-carboxiglutâmico que são necessários para uma actividade completa. Por outro lado, as moléculas da proteína C produzidas nas células 293 do rim embriónico humano são, em geral, completamente gama-carboxiladas e beta-carboxiladas mas, no entanto, os níveis de produção da proteína C humana a partir destas linhas celulares é relativamente baixo.

Normalmente, as culturas de células de mamíferos são incubadas a 37°C. Quando a linha celular AVI2-664 do "hamster sírio" (ATCC CRL 9595), incluindo um plasmídeo contendo a codificação do gene da proteína C humana, foi incubada a 37°C, a linha celular produziu proteína C que apenas estava -4- (Μη ^ completamente carboxilada a 40% até 50%, resultando numa baixa funcionalidade da proteína C no meio de cultura em bruto. Quando esta mesma linha celular foi incubada a 38,5°C até 39°C, a actividade funcional anti-coagulante da proteína C, segregada no meio de cultura condicionado, aumentou. A velocidade de secreção da proteína C a partir desta linha celular incubada a temperatura elevada foi de cerca de 20% a 30% inferior à velocidade de secreção a 37°C, embora esta diminuição da velocidade de secreção fosse compensada pelo aumento em funcionalidade da proteína C segregada .

As células 293 do rim humano (ATCC CRL 1573) são células embrionárias primárias do rim humano, transformadas, que contêm e espressam o gene transformado de adenovírus 5. Estas células têm sido usadas para expressar vários produtos de genes importantes e têm sido usadas por um número de diferentes laboratórios em termos tanto académicos como industriais. Por exemplo, Yan, Patente U.S. No. 4.981.952 e Bang et. al, Patente U.S. No. 4.992.373, revelam, ambos, o uso da linha celular 293 para produzir a proteína C humna. A linha celular 293 do rim embriónico humano segrega a proteína C humana completamente gama-carboxilada quando abriga um plasmídeo de expressão contendo a codificação do gene da proteína C humana. Quando cultivada a 37°C, esta linha celular 293 segregou a proteína C recombinante humana cóm uma actividade específica de aproximadamente 350 U/mg. O aumento da temperatura de crescimento destas células recombinantes 293 não resultou num aumento da funcionalidade da proteína C segregada (porque a proteína C desta linha celular já está completamente gama-carboxilada). Contudo, as células recombinantes 293 desenvolvidas a 38°C a 39°C demonstraram um aumento na velocidade de secreção da proteína C em comparação com as mesmas células desenvolvidas a 37°C. Para efeitos da -5- Ι/Λη. presente revelação, um aumento na produção de proteína C pode significar quer um aumento na secreção de proteína C a partir da linha celular quer um aumento na funcionalidade da proteína C segregada. O técnico especializado compreenderá que a presente invenção não se limita ao uso da linha celular do rim embriónico humano transformada por adenovírus ou da linha celular Av12-664 do "hamster" sírio transformada por adenovírus. Existem várias linhas celulares de mamíferos à disposição para a produção da proteína C humana. Por exemplo, a linha celular HepG2 é uma linha celular do fígado humano que tem sido usada para produzir a proteína C humana. A linha celular BHK ("Baby Hamster Kidney", Rim do "Hamster" Bébé), a linha celular SA7, a linha celular SV20, a linha celular FAZA e a linha celular MK2, foram também todas usadas para produzir a proteína C humana. Embora nem todas as linhas celulares enunciadas na sentença anterior sejam linhas celulares transformadas por adenovírus, o técnico especializado compreende que muitas linhas celulares de mamíferos podem ser transformadas com o adenovírus para criar uma linha celular específica transformada por adenovírus a qual pode então ser usada no método da presente invenção.

As temperaturas preferidas do método da presente invenção situam-se na gamà dos 38°C a 39°C, enquanto o modelo de realização mais preferido da presente invenção é encontrado quando a temperatura de incubação da linha celular transformada por adenovírus é de 39°C. O técnico especializado reconhecerá também que o método da presente invenção permitirá seleccionar com maior rapidez os clones que espressam elevados níveis de proteína C. Por exemplo, como o nível de proteína C segregado a partir da linha celular é aumentado, é mais fácil fazer o ensaio da molécula no meio em bruto sendo, portanto, mais fácil seleccionar o clone que

-6- [/U espressa o nível mais elevado do produto desejado. 0 aumento médio nos níveis de expressão de clones isolados a 39°C situava-se na gama dos cerca de 69% a 93% em comparação com clones isolados a 37°C.

Os exemplos que se seguem são fornecidos como um meio de ilustrar a presente invenção e não devem ser considerados como uma limitação aos mesmos.

Exemplo 1

Produção da Proteína C humana em células 293 A proteína recombinante C humana (rHPC) foi produzida nas células 293 do rim humano por técnicas bem conhecidas do técnico especializado como as que estão indicadas por Yan na Patente U.S. No. 4.981.952, cujos ensinamentos estão aqui todos incorporados como referência. O gene contendo a codificação da proteína C humana está revelado e reivindicado por Bang et al., patente U.S. No. 4.775.624, cujos ensinamentos estão aqui todos incorporados como referência. O plasmídeo usado para expressar a proteína C humana em células 293 foi o plasmídeo pLPC que é revelado em Bang et al., patente U.S. No. 4.992.373, cujos ensinamentos estão aqui todos incorporados como referência. A construção do plasmídeo pLPC também está descrita na publicação da patente europeia No. 0 445 939, e em Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192, cujos ensinamentos estão também aqui incorporados como referência. Resumindo, o plasmídeo pLPC foi transfectado para dentro de células 293 e foram então identificados transformadores estáveis e subcultivados. Os clones que demonstraram o mais elevado nível de expressão receberam várias designações (por exemplo, CC35 e CC31-1) e desenvolveram-se sob condições -7- Ιμ, ^ normalizadas de cultura de células. Altemativamente, o plasmídeo pGTC foi usado para criar a linha celular GT-21 estavelmente transformada. A construção de plasmídeo pGTC foi revelada na publicação da patente europeia No. 0 445 939. Após o desenvolvimento a 37°C, a proteína C humana pode ser separada do fluido de cultura pelas técnicas de Yan, patente U.S. No. 4.981.952. A proteína C humana assim produzida pode ser usada na forma de zimógeno não activado ou pode ser activada por processos bem conhecidos do técnico especializado na técnica. Os mesmos clones também foram desenvolvidos sob as mesmas condições a 39°C. Os resultados estão indicados no Quadro I.

Quadro I

Efeito da temperatura de crescimento sobre a quantidade de proteína C segregada a partir de células 293

Clone nff/106/dia(â).37°C n2/106/dia(a).39oC Aumento percentual CC35 395 663 68 CC35 425 664 56 GT-21 237 747 215 CC31-1 1164 2361 103 CC35 824 1227 49 CC35 . 2100 3906 86

Mesmo quando as células foram desenvolvidas a várias densidades de células, produzindo assim dferentes níveis de expressão por célula (por exemplo, CC35), o aumento de percentagem na secreção a 39°C foi consistentemente observado. -8-

Exemplo 2

Produção de proteína C humana em células AVI2-664 A proteína C humana foi produzida usando plasmídeo pLPC substancialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 1 com a diferença de que se usaram células AVI2-664 do hamster sírio em vez das células 293 do rim embriónico humano. A actividade funcional anticoagulante foi medida pelas técnicas dé Grinnell et al, 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Os resultados estão indicados no Quadro II.

Quadro II

Efeito da temperatura de desenvolvimento sobre a actividade funcional anti-çoagulante da proteína C humana produzida em células AVI2

Temperatura Unidades/mili grama 37°C 216 + 62 39°C 460 + 19

Lisboa, 2 de Novembro de 2000

LUIS SILVA CARVALHO Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VtCTOR CORDON, 14 1200 USBÒA

Claims

- 1 -

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para aumentar a produção de proteína C numa célula hospedeira recombinante, de mamífero, transformada por adenovírus, compreendendo o referido método a cultura da referida célula hospedeira recombinante, de mamífero, transformada por adenovírus a uma temperatura entre 38°C e 39°C.
2. O método de reivindicação 1, onde a célula hospedeira recombinante de mamífero é uma célula 293.
3. O método de reivindicação 1, onde a temperatura de incubação é de 38°C.
4. O método de reivindicação 1, onde a temperatura de incubação é de 39°C.
5. O método de reivindicação 2, onde a temperatura de incubação é de 38°C.
6. O método de reivindicação 2, onde a temperatura de incubação é de 38,5°C.
7. O método de reivindicação 2, onde a temperatura de incubação é de 39°C.
8. O método de aumentar o nível de gama-carboxilação de uma molécula de proteína C produzida recombinantemente, compreendendo o referido -2- método a cultura da referida molécula de proteína C produzida recombinan-tementé numa célula hospedeira recombinante AVI2 a uma temperatura entre 38°C e 39°C.
9. O método de reivindicação 8, onde a cultura da célula hospedeira recombinante AVI2 é efectuada a 38°C.
10. O método de reivindicação 8, onde a cultura da célula hospedeira recombinante AV12 é efectuada a 39°C. Lisboa, 2 de Novembro de 2000 LUIS silva carvalho Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA