PT77392B

PT77392B - Dna sequences recombinant dna molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides

Info

Publication number: PT77392B
Application number: PT77392A
Authority: PT
Inventors: Nageswararao Movva; Marie-Francoise Schulz
Original assignee: Biogen Nv
Priority date: 1982-09-27
Filing date: 1983-09-26
Publication date: 1986-08-22
Also published as: JP2620479B2; EP0488479A1; EP0104920B1; ZA837034B; DK440083A; IE832259L; ATE77103T1; CA1341012C; IE64441B1; JP2533470B2; DE3382575T2; MX164375B; DK440083D0; NO833464L; DE3382575D1; ES525948A0; AU575784B2; ES8504937A1; EP0104920A1; JPH0656894A

Description

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção resolve os problemas referidos isolando as sequências de ADN que codificam para SGH ou rolipeptidos semelhantes a SGH e expressando aquelas sequências em hosnedeiros apropriados para produzir polipentidos que apresentam a actividade biológica reforçadora do crescimento de SGH.

Em virtude da nresente invenção, ó pela primeira vez possivel obter nolinentidos aue apresentam a actividade de SGH, em quantidades comerciais para utilização em diversas aplicações com o fim

-5de aumentar a velocidade do crescimento dos suinos e a produção de

carne nos mesmos.

Como se noder? arreciar nela memória descritiva a seguir, as sequências de ATO’ e as moléculas de ADR recombinante de acordo com a presente invenção sao capazes de orientar a produção, em um hospedeiro anrorriado, de hormona do crescimento de suinos ou de

X Z

polipeptidos semelhantes a hormona do crescimento de suinos, isto e polipeptidos que apresentam a actividade biologica reforcadora do crescimento da SGH. Os rolirertido? de acordo corn a presente invenção podem ser utilizados, ou como cao produzidos no hospedeiro ou apos derivação ou modificarão, em comnosiçoes e métodos destinados a melhorarem as velocidades de crescimento e a produção de

z

carne em suinos.

Devera, por conseguinto, entender-se, a partir da. descrição anterior, que um aspecto básico da. presente invenção e a prepa~ Zk A

racao dc uma seauencia de ADR que e caracterizada nor codificar nara um nolipertido oue apresenta, a actividade biologica reforçadora do crescimento da SGH. Essas sequências de AON compreendem

Λ, Z Λ*

inserções escolhidas no gruro constituídos por inserções de ADN de pBPôl? (Bst)/SGH-GD, pSGE-Z\7, pSC-Π-(ffet-Phe), sequências de ADR que hibridam nara ar inserções anteriores e que codificam nara poli péptidos semelhantes a SGH, e sequências de ADN que, por expressão, codificam nara um polineutido também codificado, por exnresss.o, ror qualquer das sequências de ADN ou inserções anteriores.

BREVE DESCRIÇÃO DGS DESENHOS

A figura 1 e uma renresentacao psquematlca de um modo de realízaçao de um nrocesso, de acordo com a presente invenção, para a rrenareoao de uma mistura de moléculas de ADR recombinante, alguma? da? quais sao caracterizadas por sequências de ADR inseridas que codificam nara. os polipeptidos de acordo com a presente invenção.

-6A figura 2 e uma representação esquemática de dois modos de realização de processos de selecção de clonio para escolher as sequências de ADH da presente invenção. Ho nrimeiro, escolhe-se uma sequência de cADN relacionada com SGH mediante hibridação para uma sonda a partir da hormona do crescimento bovino. Ho segundo, utiliza-se uma sonda construida mediante digestão da cADH relacionada com SGH.

A figura 3 e uma representação esquemática da estratégia de sequenciação utilizada para determinar a sequência de nucleotidos da sequência de ADH de SGH-9D da presente invenção.

As figuras 4e 5 representam a sequência de nucleotidos e a sequência

de aminoácidos de de sequência de ADH de SGH-9D da presente invenção.

A figura. 6 e uma list·' parcial de sitios de restrição determinados mediante análise no computador da sequência de nucleotidos apresentada nas figuras 4 e 5.

A figura 7 e uma representação esquemática de um modo de realização da construção da molécula de ADH recombinente pSGH- A7 de acordo com a presente invenção.

A figura 8 representa as sequências de nucleotidos e de aminoácidos correspondentes de pBGH-Z\9 (Ser), pSGH~9D e pSGH-Δ7.

As figuras 9 e 10 são uma. representação esquemática de um modo de realização da construção da molécula de ADH recombinante de pSGK-(Ket-Phe) de acordo com a presente invenção.

KKLHOR FODO DE EFECTUAR A IHVEHCSO

Rara que se compreenda melhor a invenção aqui descrita, apresenta-se a seguinte descrição pormenorizada.

Ha descrição, utiliza-se os seguintes termos:

Hucleotido - uma unidade monomerica de ADH ou de ARH constituída por uma porção de açúcar (pentose), um fosfato e uma base heterociclica azotada. A base esta ligada a porção do eoucar atra~Ί~

ves do carbono glucosidico (atomo de carbono 1' da pentose). Esta associação do uma base com um acuca.r e denominada nucleosido. Oada nucleotido e caracterizado nela sua base. As quatro bases de ADN são: adenina. ("A"), guanina ("G"), citosina ("C") e timina ("T").

As quatro bases de ARN são'· A, G, C _e uracilo (”U").

Sequencia de ΑΏΕ - uma fila linear de nucleotidos ligados

49 4 4

uns aos outros nor lipaooes fosfodiester entre os átomos de carbono 3 ’ e 5' de pentoses adjacentes.

Codão - uma sequência de ADN com três nucleotidos (um tri. 4 4

pleto.) que codifica, através de mAPR, para um aminoácido, um sinal

Ζ Λ 49 4.

de inicio de transferencia ou um sinal de terminacao de transferencia. Por exemplo, os triuletos nucleotidicos TTA, TTG, CTT, CTC, CTA e CTC- codificam o aminoácido leucina ("Leu”), TAG, TAA e TGA

99 49 4. 4 4

sao sinais de int°rrupeao de transferencia e ATG e um sinal de iniA

cio de transferencia.

4 49

Quadro de leitura - o agrupamento de codaos durante a transferência de mARN em sequências de aminoácidos. Durante a transferência. deverá manter-se o quadro de leitura apropriado. Por exemplo, a sequência GCTGGTTGTAAG pode ser transferida, em tres quadros

A

de leitura ou fases, cada um dos quais fornece uma sequencia de

4

aminoácidos diferente:

GCT GGT TGT AAG — Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG — Leu-Vai-Vai GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP)

4

Polinentido - uma fila linear de aminoácidos ligados uns

49 4

aos outros nor ligações pentiâicas entre os grupos C^-amino e carboxilo de aminoácidos adjacentes.

C-enoma - o ADN completo de uma célula ou de um virus. Inclui, entre outros, oo geneo que codificam os polipeptidos da substancia, assim como o operador, o promotor e as sequências de ligaçao e interacçao do ribosoma, como as sequências de Shine-Dalgarno.

-8Gene - uma sequencia de ADN que codifica, através do seu templato ou ARN mensageiro ("mARN”), uma sequência de aminoácidos caracteristica de um polipentido esnecifico.

Transcrição - o processo de produção de mARN a partir de

um gene.

Transferência - o processo de produção de um polipentido a partir de mARN.

Expressão - o processo a que e submetida uma sequência de ADN ou gene para produzir um polipeptido. E uma associaçao da transcrição e da transferência.

Plasmídeo - uma sequência de ADN de cadeia dunla, não cromosomica, que contém um "renlicao" intacto tal que o plasmídeo e replicado em uma célula hospedeira.Quando o plasmídeo é colocado dentro de um organismo unicelular, as caracteristicas desse organismo podem ser modificadas ou transformadas como resultado do ADN do plasmídeo-.

Por exemnlo, um nlasmideo que comnorta, o gene da resistência, a te/ T? \ * * ^K

traciclina (Tet ) transforma uma célula previamente sensível a tetraciclina em uma célula que e resistente à mesma. Uma célula transformada por um nlasmideo e denominada um "transformante".

z

Pago ou Bacteriofago - virus bacterianos muitos dos quais são constituídos por sequências de ADN encapsuladas em um envélucro ou revestimento proteico ("cápsula").

Veiculo de clonagem - um nlasmideo, ADN de fago ou outra sequencia de ADN que e canas de renlicar-se em uma. célula hospedeira, o qual e caracterizado por um sitio de reconhecimento de endonuclease ou nor um pequeno numero desses sitios em que essas sequências de ADN nodem ser cortadas de uma determinada maneira sem perda simultânea, de uma função biologica essencial do ADN, nor exemplo replicação, produção de proteínas de revestimento ou nerda de promotor ou de sitios de ligação, e que contem um marcador apropriado para utilização na identificação de células transformadas,

Λ * _Λ S

nor exemplo resistência a tetraciclina ou resistência, a ampicilina.

-qX X

Um veiculo de clonarem e muitas vezes denominado urn vector.

Clenorem - o processo de obtenção de uma nopulaçao de organismos ou de sequências de ADN derivados de um desses organismos ou dessa sequência mediante reprodução assexuada.

Kolecula de AON recombinante ou ADN hibrido - uma. molécula constituída por segmentos de ADN de genomas diferentes que foram ligados pelas extremidades fora de células vivas e têm a. capacidade de infectar algumas células hospedeiras ede ser mantidos dentro delas.

Sequência de controlo de expressão - uma sequência de nucleotidos que controla e regula a expressão de sequências de ADN ou de genes quando ligada operacíonalnentc a essas seauencias. Compreende o sistema lac. o sistema trp, regiões principais do operador e do promotor do fago X , a região de controlo da proteína de revestimento fd e outras sequências que se sabe controlarem a exXX '

pressão dc genes de células nrocarioticas ou eucarioticas e dos seus virus ou associações dos mesmos.

SGH - hormona do crescimento de suínos.

Polipeptido semelhante a SGH - um polipeptido que apresenta a actividade biologica reforçadora do crescimento da SGH.

Pazeizâo agora referencia ? figura 1, nela mostra-se uma representação esquemática de um modo de realização de um processo de preparação de um? mistura de moléculas de ADH recombinante, algumas das quais são caracterizadas por sequências de ADN inseridas que codificam paro a SGH ou nolipentidos semelhantes a SGH.

PREPARAÇAO DE mARN DE HORHONA DO CRESCIMENTO DE SUÍNOS CONTENDO · POLI A⁺ ARN (SGII-mARN)

Adicionou-se 4 a 6 g de glandulas pituitárias anteriores (Pelfreese, Arkansas), congeladas em neve carbónica, a uma solução de 5 M de tioçlanato de guanidio, 50 mH de citrato de sódio, 0,5%

-1(4

de sal de sódio de lauril-sarcosilo e 0,1 M de p>-mercapto-etanol

(10 ml/g de glândula) £ J. M. Chirgwin e colab., "Biochemistry", 18,

pág. 5294 -5299 (1979)J· Deixou-se descongelar as glândulas ate

4°C naquela solução e homogeneizou-se (Polytron) a mistura com seis

f aa

explosoes de 20 segundos, Apos centrifugação do homogeneizado (Sorvai, 6000 rpm, 5 min., temperatura ambiente), põs-se em camada 7,0 ml do liquido sobrenadante contendo acido nucleico sobre 2,5 ml de cloreto de cósio (5,7 M em 0,1 Ií de ácido etilenodiaminotetraacótico) e cobriu-se com parafina, liquida. Centrifugou-se depois o tubo'(SW 41, 30.000 rpm, 18 horas, 20°0) para formar uma pastilha da fracça.o que contem ARN.

Removeu-se o líquido sobrenadante e suspendeu-se novamente, em água, a nastilha que contóm o ARN total; extraiu-se a solução aauosa, duas vezes com volumes iguais de fenol/cloroformio a 1:1 e duas vezes com volumes iguais de eter. Precipitou-se depois o ARN · a partir da fase aquosa com 3 volumes de etanol e separou-se o precipitado resultante mediante centrifugação. Rendimento de ARN to/

tal: 8 mg.

Suspendeu-se novamente 4 mg do ARN total obtido antes em 1 ml de Tris-IICl (10 mM, pH 7,5)-EDTA (l mM) ("tampão TE") e aqueceu-se a solução a 65°C durante 10 minutos. Apos adição de 2 M de cloreto de potássio ató uma concentração final de 0,5 M, aplicou-se a mistura a uma coluna de oligo-dt-celulose e lavou-se a coluna com 0,5 M de cloreto de potássio para eliminar todos os ARN ribosomicos.

Z “}· s

Por ultimo,eluiu~se o poli A ARN que ficou ligado a coluna com 10 mM de Tris-IICl (pH 7,5) a temperatura ambiente e reuniu-se as fracções que contêm Poli id ARN. Isolou-se o ARN a partir destas fracções reunidas, como se indicou antes, mediante precipitação com etanol e sais, centrifugação e re-suspensao em agua. Rendimento de poli A⁺ ARN: 200ytg.

Para verificar a actividade do poli A ARN isolado, trans4.

feriu-se 2 Λ-g deste poli A ARN "in vitro", utilizando um sistema

1155

isento de células de lisado de reticulocito de coelho ⁷S-metionina (NE!?) £ U.R.B. Telham e R.J. Jackson, "Eur. J. Biochem.”, 67, pag. 247 e seg. (lⁿ76) J7 e ensaiou-se o produto sohre um pel de SDS/poliacrilamida mediante auto-radiografia. Este ensaio demonstrou que o poli A⁺ ARN isolado foi transferido para produzir um polipetido com um Γ.Μ. que correspondia ao tamanho esperado para a pre-hormona do crescimento de suinos (cerca de 24.000).

z 4*

Devera, evidentemente, considerar-se que este poli A ARN e uma mistura de um grande numero de ARNs diferentes (Pigura. l).

Com excençao do mARN especifico da SGH ou dos polipentidos semelhantes a SGH, estes ARNs sao contaminantes indesejáveis (Pigura l). Infelizmente, estes ARNs contaminantes comnortam-se analogamente a SGN-mARN através do restante processo de clonagem. Por isso, a sua

f- z z z

presença neste poli A ARN resultara num grande numero de clonios

z Z 99

inúteis e constituirá um problema de seleccao complexo a escolha deZ Z 99

um clonio correcto, isto e, ume codificação para. SGH, a partir de

z

um grande numero de contaminantes.

SÍNTESE DE UMA MISTURA DE .cADN CONTENDO SGH-cADN

Para, preparar complementos de ADN de cadeia simples para os

+ 4- 9

poli A ARNs isolados antes, misturou-se 2 0yizl de poli A ARN (10 yug em agua) e 2 yul de CK^Hg 0,15 M e deixou-se ficar a solução resultante a temperatura amhiente durante 15 minutos. Adicionou-se depois, a. solução, 10 yul de oligo dt (l ^icg/ml), 100 ^/ol de dNTPs (°,5 mM, isto e, para uma concentracao final de 0,5mM), 20 jjJl de Oí - P-dATP (10 mCi/ml) 50 ytl de transcriptase inversa, (lfi unidades/yUl, lifc Sciences) e um volume igual de uma. solução-tampao ZÍOOmM de Tris-HCL.(pH 8,5), 20 mM de MgC^ ,140mM deKCl, 50mM de DTT em águaj. 0 volume total da solução foi de 404,4Apos incubação da solução durante 90 minutos a. 4'^?°C, aqueceu-se esta a 100°C durante alguns minutos e centrifugou-se derois (10000 G, 5 minutos). 0 liqui-12do sobrenadante continha as cADNs âe cadeia simples complementares do poli A ARN anteriormente isolado. Rendimento de cAND: 1,4-^8 2Γ mediante precipitação de uma pequena porção aliauota. com TCA (tirocalcitonina)J.

Deverá, novamente, compreender-se que a cADN de cadeia simf

pies agora obtida e, na verdade uma mistura complexa de um grande número de cADNs diferentes transcritos a partir dos mARNs correspon•J*

dentes presentes na misture de poli A ARN anteriormente isolada (Pigura l). Também um outro factor actua pera complicar a mistura de cADN. Cada especie de mARN do poli A ARN pode nao ser transcrita comuletamente. Dm vez disso, pode ser produzida uma prende variedade de cADNs a partir de cada especie de mARN (não indicado na figura l). Como cada uma destas cADNs incompletas se comporta de maneira analoga à da cADN desejada durante a parte restante do processo, a sua presença na mistura de cADN apenas serve para complicar mais o processo final de selecçao de clónios.

PREPARAÇÃO DE cADN DE CADEIA DUPDA

Para converter a cADN preparada antes em cADN de cadeia dupla, adicionou-se, a metade da cADN obtida (0,7 /*Cg), 50 ytl de Klenow (0,7 unidades//ól), 1,5 yU>g de MgCl_?(l lí) e um volume igual de solução-tampão de polimerase de ADN £400 ml-r de Tris-HCl (pH 6,9), 150 mM de ECl, 1 mM de dNTPs, 20 mM de ^3 -mercaptoetanol J e incubou-se a mistura durante 17 horas a 16°C e depois durante mais 30 minutos a 37°θ. Em seguida, preciritou-se o ADN adicionando l/8 de volume de acetato de sodio 2 M (pH 5,5) e 2,5 volumes de etanol e arrefecendo a -70°C durante 15 minutos. Após separação do precipitado mediante centrifugação (10.000 g, 10 minutos), a pastilha do fundo do tubo foi lavada com etanol, suspensa novamente em agua e aplicada a uma coluna de Sephadex G-75. Elui-se 0 ADN com 10 mM

-13de Tris-HCl-0,1 mH de EDTA e reuniu-se ?s fraeções aue continham

ADN. Volume total dae fraeções aue continham ADN: 377 ^/tl.

Adicionou-se denois l⁹ jl de um? soluce? 7 21' de NaCl,

500 mH de acetato de sodio (uH 4,5), 10 mM de sulfato de zinco e

8 Jl de SI (1000 uri d? des/,/(.1, Boehrinrpr-Mannhelm) J às fraeções

contendo ADN reunidas e deixou-s? ficar a solução a 30°C durante

30 minutoo. Extraiu-s^p denois a mistura, tres vezes, com volumes

iguais de fenol e denois de eter, aulicou-se a fase aquosa resultamTli

te a. uma coluna, de Sephadex G-75 e elui-se o ADN com 5 ml·' de KOI.

As fraeções que continham ADN foram reunidas e Precipitadas com etanol como se referiu antes.

CDONAGEI’· DE ADN DE CADEIA DUPLA

Pode utilizar-se um? rrande variedade de associações de hospcdeiro/veiculo de clonagem na ciona,rem e expressão de cADN de

r /

cadeia dunla. Alem disso, dentro de cada veiculo de clonagem espeZ Ζ Z

cifico, rodem ser escolhidos vários sitios papa inserção da cADN de cadeia dupla. A escolha particular par? clonagem p expressão pode

Ζ Λ

ser feita. u?r um entendido na materi a sen aue se afaste do âmbito

da nresente invenção.

Para efectuar a clonarem inicial, escolhe-se neste caso o nlasridio bacteriano pBB327 £ B. Bolivar e colab., "Constmction And Chapactc^i zation Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Pumose Cloninr System”, Gene. nu. °5-ll3 (1^77) > 1· G. Su+cliffe, ⁿ-pBR3?e Restrictinn Man Derived Nrom The DNA Spquorce Accurate DNA Síf.p Mprkers Nu Το Λ~61 Hucleotido Pa i rs Dong", Nnolaio Aeiiia Research,

5, pn. 2721-28 (1978¹) J, the Bst I site therein £ D. Villa-Komaroff et al., ”A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Hatl. Acad. Sei, DSA. 75, nu. 3727-31 (1078)7 and E, coli Kl2 KC1061 £ M. Capedaban and 8. Γ. Cnppn, J. Mod . Bi ol., 138, pp. 179-207 (1980) 71. Preparação de pBR322 cindido em Pst-I e com cauda. dG

-14Purificou-se o plasmídeo pBR322 sobre dois gradientes de OsCl consecutivos e digeriu-se 25 fig deste plasmídeo puro com endonuclease de Pst I utilizando condições-padrão (Eigura l). Adicionou-se depois, ao plasmídeo cindido em Pst-I. 50 fil de H^O,

3 fil de DTT (10 mM), 1,5 ytl de GTP (lO mM), 10 fil de gelatina (l mg/ml), 10 fil de tampão Pe transferase terminal L 10 mM de Οοθΐρ, 1,4 M de cacodilato de potássio e 0,3 M de Tris-HCl (pH 7,6)£ e 0,9 fil de deoxinucleotidil-transfera.se terminal (160 unidades/ml, Ratcliff Biochemicals). Apos incubacao da solução a 10°C durante 13 minutos, adicionou-se 5 fil de EDTA (250 mK) e extraiu-se a mistura resultante, duas vezes, com volumes iguais de fenol/clorofórmio a 1:1 e três vezes com volumes iguais de eter. Reservou-se a. fase aquosa para associação subsequente com cADN de cadeia dupla e com cauda dC.

9. PREPARAÇAO DE cADN COM CATIDA dC

Adicionou-se caudas dC a cADN de cadeia dupla, obtida anteriorm.ente mediante re-suspensão de cerca, de 1/5 da. cADN preparada antes (lOO ng) em ?5fil de agua, adicionando 50 yz.1 de agua, 3 fil de DTT (10 mM), 1,5 fil de dCTP (10 mM), 10 fil de gelatina (l mg/ /ml), 10 fil de tampao de transferase terminal J£10 mM de GoCl^,

1,4 M de cacodilato de potássio, 0,3 M de Tris-HCl (pH 7,6)£ e 0,9 fil de deoxinucleotidil-transferase terminal (160 unidades/ml, Ratcliff Biochemicals) (Figura l). Anos incubação da mistura durante 13 minu+os a 1O°C, adicionou-se-lhe 5 fi£l de EDTA (25O mM) θ «traiu-se a mistura, resultante duas vezes com volumes iguais de fenol/cloroformio a 1 :i e tres vezes com volumes iguais de etpr. Not· vamente se reservou a fase aquosa parã associação com 0 pBR322 cindido em Pst e com cauda dG.

3. RECOZIMENTO DE pBR322 COM CAUDA dG E DE cADN COM CAUDA dC

Reuniu-se 1 yf.1 de pBR322 cindido em Pst I e com cauda dG /

(50 ng) e 2,5 β de cADN com cauda dC (1 ng) em 5 β de tampão de recozimento [1 M de NaCl, 200 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM de EDTA] e água até um volume final de 50β\.. Apos aquecimento da mistura a 80°C durante 3 minutos e a 45°C durante mais 2 horas, deixou-se descer a temperatura da solução até 4°C e ficar em repouso durante a noite.

Mais uma vez se deverá entender que apenas muito poucas das moléculas de ADN recombinante produzidas por esse recozimento contêm uma inserção de cADN que esta relacionada com SGH (Figura 1).

4. TRANSFORMAÇÃO DE "E. coli" K12 MC1061 COM HÍBRIDOS

Dialisou-se o pBR322 com cauda dG e o ADN com cauda dC recozidos, anteriormente descritos, em sacos de colódio (UH 100-25) contra 1/10 de tampão de recozimento (supra) durante 2 horas a 4°C para excluir qualquer espécie de P.M. baixo. Aplicou-se depois a mistura a 200 de ""E. coli" K12 MC1061, anteriormente tornado

competente substancialmente como foi descrito por G.N. Buell e colab. em "J. Biol. Chem.", 254 , pág. 9279-83 (1979).

Como o plasmídeo pBR322 inclui o gene que codifica para a resistência â tetraciclina e o gene que codifica para a resistência â ampicilina (Figura 1), e como este ultimo gene e inactivado se fôr inserido cADN no sítio Pst I, as colónias que tiverem sido transformadas com moléculas de ADN recombinante tendo inserções de ADN no sítio Pst I podem ser escolhidas a partir de colonias que não tenham sido transformadas (Figura 1). A partir de 1 ng da cADN obtida anteriormente foram isoladas cerca de 10.000 colonias

transformadas.

Estas colónias contêm uma grande variedade de moléculas de ADN recombinante que representam cópias completas ou parciais da mistura de ARNs no poli A⁺ ARN preparado antes (figura 1). A maior

Ζ Ζ /V

parte destas moléculas nao contem uma inserção de ADN relacionada

com SGH.

-16ESCOLHA DE HM CLONIO CONTENDO SGH-cADN

Μ

Existem diversos vias para seleccionar uma colecção de clonios com o fim de se obter um clonio contendo uma determinado, moleZ «w

cuia de ADN recombinante, isto e contendo uma inserção de ADN relacionada com SGH. Tara efectuar a seleccão inicial de clónios, a nresente requerente decidiu utilizar um fragmento de 400 pares de ba ses de Dst I de cADN codificando para a hormona do crescimento bovino £ por ex. Miller e colab., ”J. Biol. Chem.’¹, 255, pág. 7521-7524 (l98O)_7 (Figura 2). Esta, sequencia pode também ser obtida nor restrição de Dst I de nBGH-(Met-Ala), depositada na "Americam Tyne Culture Collection" em 16 de Agosto de 1982, sob o número de entrada ATCC 39173.

Utilizou-se esta, sonda nara selecção de hihridacão sobre uma colecção de clón.ios, preparada nor uma maneira, analoga a descrita antes (Figura. 2). Harcou-se nrimeiro a sonda substancialmente como descrevem M. Grunstein e D. D. Hogness, "Colony Hybridization:

A Method For The Isols.tion Of Cloned DNA’s That Contain A Specific Gene", "Proc. Natl. Acad. Sei. USA", 72, pa'g. 3961-39.65 (1975), que foi depois utiliza.da para escolher a colecção de clonios nriva.tiva da requerente substancialmente como se descreve infra utilizando a sonda de fragmento de SGH-Msp.

A partir de um dos clónios positivos de hihridação, isolouz

-se uma. molécula de ADN recombinante que tinha um fragmento de cADN inserido, que se tinha determinado, mediante sequenciacão nucleotidica, codificar para uma porção da sequência de aminoácidos de SGH ΖΓ por comnaraoao com a, sequencia de aminoácidos parcial referida (surra)£ (Figura 2).

-17Prerarou-se derois uir fragmento de 200 pares de bases dessa cADIi rositiva (mediante digestão com Msp, ver Figura. 2) que foi marcado (Orunstoin o hogness, surra) rara utilizacao como sonda de hibridação na. colecçao urorria de 10.000 clonios (Figura 2). Para

rt» 9

hibridaçao, transferiu-se as 10.000 colonias colocando-as sobre filtros de nitrooelulose (Millirore), e incubou-se os filtros durante a noite a 37°C. Aros lise das colonias com 0,5 K de Ra OH durante 7 minutos, neutralisou-se os filtros cor 1 F de Tris-HCl (pH 7,5), 0,6 Ii do NaCl (duas vezes, 3 minutos cada) e embebeu-se os filtros em 2X SSC [ 0,13 F de NaCl - 0,015 F de citrato de sódio (pH 7)7· Aros secarem ao ar, os filtros sao anuecidos a PQ°C eu uma estufa com vazio, durante ⁹ horas, e embebidos derois duas vezes em 4X SSC (supra), solucao de 10X Denhardt e SDS a 0,1% durante 2 hora,s a 65°C. Adicionou-se derois 25,000 'P-conta.gens/filtro da sonda de 200 pares de bases descrita antes (fervida durante 2 minutos e arrefecida rapidamente) e 4X SSC, solucao de 10X de Denhardt e SDS a 0,1%, hibridou-se os filtros a 65°C durante 12-14 horas, lavou-se derois em 4X SSC, solucao de 10X de Denhardt e SDS a 0,1% a 65°C durante 2 horas, lnvou-rc com ⁹X SSC a 65°C durante 30 minutos e secou-se os filtros. Aros exrosipao sobre uma relicula de raios X durante 1 dia, identificou-se cerca de 100 colonias que continham inserções de ADN cue hibridaram rara a. sonda utilizada.

9 9

Escolheu-cc 40 destes clonios rositivos para analise de restrição e clasrificacao ror dimensões (Pvu l/Bgl I) (Pigura 3).

A parir r desta analise, determjnou-se que um destes clonios tinha uma inserção de ADN de cerce dc 750 pares de bases. Desimnou-se este clónio "E. coli” K12 F01C61 Γ pBR322 (Pst)/SGH-QD J, a sua molécula de ADN recombinante rBP.3?⁹ (Pst)/SGH-oD e a sue inserção

9

SGIi-oD. Esta nomenclatura indica que o clonio comrreende "E. coli" Kl? KC1061 transformado com uma molécula d.e ADH recombinante conλ. 9

tendo pBP.3?? e SC-E-oD, estando ? inserção SGH-oD localizada no sitio

-1ΡPst I em pBR322 (Figura 3).

DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE NUCDSOTIDOS DA INSERÇÃO SGH-QD

Como se previu que uma sequência de ADN codificando para SGH e a sua sequência de sinal putativo deveriam conter cerca de 648 nucleotidos, escolheu-se a inserção SGH-9D para analise mediante determinação do quadro de restrição e da sequência de nucleotidos .

Fazendo agora referência à Figura. 3, renresentou-se nela a estratégia utilizada para determinar a sequência- de nucleotidos de SGH-QD. Fara. determinação da sequência de ADN, utilizou-se um

Z X

método que e suhstancialmente o descrito por A. K. Kaxam e W. Gilbert, em "A New Method For Seouencing DNA", "Proc. Natl. Acad. Sei. USA", 74, pag. 560-564 (1977). A maior parte dos alongamentos da inserção SGH-9D foi posta em sequência a partir de ambas a.s cadeias e a maior parte dos sítios de restrição que serviram como terminais marcados (os ponteados negros na Figura 3) foi também posta, em sequência utilizando fragmentos que os abrangem. A sequência de nucleotidos assim obtida esta representada nas Figuras 4 e 5.

Com referência agora às Figuras 4 e 5, a inserção estã flanqueada por resíduos 11 G na extremidade 5' e nor resíduos 10A (reflectindo provavelmente o terminal poli A⁺ do mARN) seguido de resíduos 24C no terminal 3¹. Para referência, a inserção estã numerada a partir do primeiro nucleotido a seguir a cauda dG ate ao

χ x

ultimo nucleotido antes dos resíduos poli A.

Por comparação com a sequência de aminoácidos parcial refe rida para SGH, toma-se evidente que os nucleotidos 1 a 570 codifi cam SGH, sendo os nucleotidos 571 a 573 um eódão de termo. Por consequência conclui-se que SGH é uma proteína com 190 aminoácidos A partir da sequência, também se toma visivel que existe uma rre-1Q-horm.ons. do crescimento de suínos. Ho entanto, não se determinou ainda o comprimento real ou a comnosicao do sinal putativo ou da pre-sequêncis de SC-E visto SGF-9D carecer não incluir todas as

ra 9

extremidades 5' codificantes e nao-codificantes para a pre-hormona

9 Λ r

do creccirento de suinos. Lesifnou-rc os primeiros tres nminoacidos das eeciuências de sinal nutatívo como ácidos -1, -2 e -3 (Figuras 4 e 5)· SGH-9D parece nao incluir toda, a região nao codificante 3' devido a localização dos res^Jos poli A.

Z 9

Devera, evidentemente, entender-se que a escolha dos cioΛ ra ra

nios aue contem toda a região codificante e nao codificante 5 e a identificação da nre-sequencia comieta d.a pre-hormona do crescimen, 9

to de suinos nodem ser feitas pelos entendidos na. matéria sem que se afastem do âmbito da presente invenção. Dor exemnlo, os clónios positivos anteriormente identificados podem ser escolhidos substancia.lmen.te como se descreveu antes utilizando uma. sonda, retirada da . extremidade 5’ da .inserção SGE-9D. Por exemplo, essa sonda node ser nrenarada digerindo SGH-9D com Ife.r I e isolando o fragmento entre os nucleoti.dos -5 e -GO (Figura Ό, Este fragmento node ser marcado denois, como se descreveu antes, e utilizado nara escolher um clonio aue contenha uma porcao 5' mais conrleta de SGH. Este

9 aa 9

clon.io, so nao contiver tam¹ og ? extremidade 3 ' completa, de SGF-oo,

9

node denois ser associado a toda ou a p-rte de SGH-QD através de um

z

sitio de Ooetr^cao comr, nor ume maneira hem conhecida pera o efeito, p-ra produzir um" soouerci.o do ADE simples mie contem es regiões completas codific«ntes p nao-codificantes nara SGH.

E evidente aue a ρρ+ηι+υΓ? do polipeptido, reprepontado nas Figuras Λ e 5 para SGE-oDj nao toga pp consideranao oualsmier modificnco«F, para a Proteína, causadas "in vivo" pelas suas intera.Cooes on- enzimas "in vivo", por ex. glicosilaeao. For esse motivo

' ~ Λ ^S

devera compreender-se aue esta estrutura pode nao ser idêntica a.

9 9

SGH rroduz.ida em suin.es, mao tom «inda propriedades hinlo^ic«P de activaeao do crascimertc muito semelhantes se nao idênticas. A pp-20X rs.

trutura proteica representada nas Figuras 4 e 5 também nao exclui

Au z

a probabilidade de outras modificações, quer ao nivel do gene quer dos próprios s,minoacidos, como mutações, incluindo substituições de base simples ou múltiplas, supressões, inserções ou inversões, derivações químicas ou a selecção de fragmentos activos dapuelas estruturas, nao produzirem também compostos que apresentem a activi dade de SGH.

Analisou-se também a. sequencia de nucleotidos de SGH-QD no computador para determinar a identidade e a localização de alguns

Ζ Μ X

dos sitios de endonuclease de restrição. Os resultados dessa analise estão representados na Figura 6.

SINTESE DE UM POLIPEPTIDO SEMELHANTE A SGH

O nivel de produção de uma. proteína e determinado nor dois factores principais: o numero de copias dos seus genes dentro da célula e a eficiência com aue essas copias de genes sao transcritas e transferidas. A eficiência da. transcrição e da transferência (que em conjunto constituem a expressão) e, por sua vez, denendente das sequências de nucleotidos, normalmente situadas adiante da sequência de codificacão desejada. Estas sequências de nucleotidos

A PF

ou seouencias de controlo de expressão definem, entre outros, a localizaçao em que a polimerase de ARN actua pa.ra iniciar a transcrição (a sequência nromotora) e em que os ribosomes se ligam e actuam recinrocamente com o mARN (o nroduto da. transcrição) nara. iniciar a transferencia. Nem todas essas seauências de controlo de pxnresΛ ^Z

sao funcionam com igual eficiência. E nor isso vantajoso separar a.s sequências de codiflcacao esnecificas nara uma nroteina desejada das su»s sequeuc.iee d.e nucleotidos adjacentes e rni-las, em vez de a.s ligar a outras seauências de controle de expressão, de maneira, a favorecer níveis de exnressão mais elevados. Conseguido isto, rode

-21ζ ζ

inserir-se ο novo fragmento de ADR construído em um plasmídeo de

Z / z

copia, múltipla, ou em um derivado de bacteriofago com o fim de aumentar o numero de copias do gene dentro da célula e melhorar ainda, deste modo, o rendimento de proteína expressa.

Podo, por isso, utilizar-se uma grande variedade de associações de hospedeíro-vector da sequencia de controlo de expressão na produção de polipeptidos semelhantes a SGH de acordo cor’ os proAJ Z

cessos da presente invenção. Por exemplo, os vectores utilizáveis

z z* z

podem ser constituídos por segmentos de sequências de ADR cromosomico, não-cromosomico e sintético, como diversos plasmídeos bacterianoe conhecidos de "E. coli" incluindo col E 1, pCRl, pBR322 e seus derivados, plasmídeos de uma maior variedade de hospedeiros, por ex. RP4, ADR de fago, por ex. o grande numero de derivados de fago X e dc vectores derivados de associações dos anteriores, como os vectores que contêm uma porção de pBR322, uma porção de fago X

ZJ Z z

e uma porção sintética. Os hospedeiros utilizáveis podem ser hospedeiros ba.ctcríanos como estirpes de "E. coli", por ex. "E. coli"

K12 KC1O61,"E.coli" HB 101,"E.coli" X 1776,"E.coli" X 2282,"E.coli"

MRCI e estirpes de "Pseudomonas","Bacillus subtilis", "Bacilus Stearothermophilus" e outros bacilos, leveduras e outros fungos, hospedeiros animais ou vegetais como células animais (incluindo humanas) ou vegetais em cultura ou outros hospedeiros. As sequências de controlo de expressão utilizáveis podem incluir o operador, o promotor e sequências de ligação de ribosoma e de interaeção (incluindo sequências como as sequências de Shine-Dalgarno) do operão de lactose de "E. coli" ("o sistema lac"). as sequencías correspondentes do sistema de sintetase do triptofano de "E. coli" ("o sistema trp”), as regiões principais de operador e promotor de fago X (θρ/Χ ^e θΒ,^ϊΡ» ^{a re}Rião de controlo da nroteina de revestimento fd do fago, ou outras sequencías que controlam ou facilitem a expressão de gene? de células procarioticas ou eucarioticas e os seus

-22virus ou diversas associações dos mesmos._

É evidente que nem todas as associações de hospedeiro - sequência de controlo de expressão - vector podem ser igualmente eficientes com uma determinada sequencia de codificação de ADN. No entanto, como se descreve na presente invenção, e tendo em devida consideração a bio-segurança, os sítios disponíveis nas sequências de ADN que codificam para SGH da presente invenção para construções especificas, o tamanho dos polipeptidos semelhantes a SGH a serem expressos, a susceptibilidade daqueles polipeptidos a degradação proteolitica pelos enzimas da célula hospedeira, as possíveis contaminações daqueles polipeptidos com proteínas da ceÍLula hospedeira de difícil eliminação durante a purificação, as caracteristicas de expressão das sequências que codificam para SC-H e polipeptidos semelhantes a SGH, como a estrutura da sequência de ADN e a localizaçao dos codões de inicio e de interrupção em relação as sequências de controlo de expressão e outros factores reconhecidos pelos

4 4J

entendidos na matéria, pode escolher-se ums. associaçao apropriada.

Existem tambem diversos métodos je conhecidos para inserir , em um vector, uma sequência de ADN e uma sequência de controlo de expressão. Compreendem, por exemplo, ligação directa, ligantes

X 49

sintéticos, reacções de restauro ligadas por exonuclease e polimerase seguidas de ligação ou alongamento da. cadeia de ADN com polimerase de ADN e um temnlato de cadeia simples apropriado seguidas de ligação. Pode ser escolhido qualquer destes métodos pera realizar a sintese dos polipeptidos semelhantes a SGH de acorâo com a presente invenção.

Devera tambem entender-se que, da presente sequência de ADN expressa em uma associação de hospedeiro - sequência de controlo de expressão - vector,podem resultar produtos que são idênticos à SGH completa.Por exemplo,a sequência de ADN expressa poderia codificar para a SGH completa mais tuna metionina ou parte ou toda a sequência

23de sinal putativo de SGH ou outros aminoácidos nao relacionados com SGH. A sequencia de ADH expressa poderia, em alternativa, codificar para apenas uma. parte ou partes da SCI! sozinha ou juntamenf aa

te com metionina ou outros aminoácidos. Ambas as situações estão compreendidas na presente invenção. Por exemplo, um Hospedeiro transformado com uma. sequencia de nucleotidos que codifica para uma

z z

pre-hormona. de crescimento dc suinos ou f-met-SGH poderia produzir esse composto semelhante a SGH sozinho ou ligado a outros aminoacidos ou poderia segregar um produto de SGH completa. 0 que e necesz z a

cario e que o produto, ou apos isolamento a partir da cultura de fermentação ou apos um tratamento convencional como cisão, ligaçao sintética ou outros processos bem conhecidos, apresente uma activiz

dade biologic? reforçadora do crescimento de SGH .

Na presente sintese, escolhou-se a seguinte construção para expressar um polipeptido semelhante a hormona do crescimento de suinos: SGH- Δγ.

Prnpnrou-se esta molécula de ADH recombinante pela maneira, representada na Figura 7.

Isolou-se primeiro ρΒ0Η-Δ9 (Ser) ?. partir de "E. coli"

Kl 2 Λ ΓρΒ6Η-Δ9 (S er) J, uma. oferta, de Ga.ry Buell e uma cultura depositada na "American Type Culture Collection" em 16 de Agosto de 1982 sob o numero de entrada 39174, utilizando o método de isoJ(f Z Z

Devera também entender-se que a f-met ou outros aminoácidos

aa f /

na.o relacionados com SGII ou os proprios aminoácidos essenciais da SGH sem actividade podem ser eliminados química ou enzimaticamente antes da utilizaeao do produto. Podem também ser decompostos pela célula hospedeira durante a expressão.

24lamento âe plasmídeo, substancialmente como descrevem R. D. Klein e colab., "Blasmid”, 3, pág. 88-91 (1980). Oindiu-se depois este plasmídeo com endonucleases de restrição EcoRI e BamHI e isolou-se o fragmento EcoRI-BamHI (Fragmento A) (Figura 7). Também se cindiu o mesmo plasmídeo com EcoRI e HgjA^, isolando-se o fragmento EcoRI-HgiA^ com cerca de 88 pares de bases (Fragmento B) (Figura 7). Cindiu-se também o mesmo nlasmideo com Fvnll e BamHI e isolou-se o fragmento FvuII-BamHI com cerca de 103 pares de bases (Fragmento

C) (Figura 7).

Restringiu-se depois pSGH-gB, descrito antes, com HgjA^ θ FvuII utilizando substancialmente as mesmas condições e isolou-se a parte da sequência de codificacão para SGH que se desenvolve do sitio HgiA₁ (GTC-CT^C) ate ao sitio Èrnll (CAG^OTG) (Figuras 7 e 8). Bigou-se depois este fragmento aos três fragmentos (A, B _e C), previamente preparadas a partir de pBGH- δ₉ (Ser), utilizando condições normais e liase de ADNT4 a 16°C, durante a noite.

Devido ap semelhanças entre a seauencia que codifica nara

/

BGH de pBGH-Ag (S er) e pSGH-gD _e as degenerações do codigo genetico, a molécula de ADR recombinante, que resulta da ligaçao descrita antes, codifica para um polipeptido semelhante a SG-H a que, depois de um inicio de f-Met, faltem os seus 7 primeiros aminoácidos (Figuras 7 e 8).

A sequência codificadora para SGH que caracteriza esta molecula tem 3 nucleotídos que sao diferentes dos que codificam para SGH em pSGH-₉B (Figuras 4 e 5). Buas destas diferenças resultam das diferenças entre a sequência codificadora para BGH e a sequência codificadora para SGH (A e Ç, Figura 8). A terceira diferença provem da construção especifica Utilizada para produzir pBGH- δ₉(Ser) (^, Figu ro 8). Nenhuma destas diferenças nos nucleotidos altera a sequência dos aminoácidos do polipeptido semelhante a SGH co dificado pela sequência de AON inserida de pSGII- δ₇.

-25Transformou-se depois 200 yXl do "E. coli" K12-A; apropriado (uma oferta, de Yfelter Fiers) na presença de 10 ypl de MgClp 0,1 ϊ'ί,

z

arrefecendo as células com gelo durante 15 minutos, incubando-as a 42°C durante 2 minutos e, depois, à temperatura, ambiente durante 10 minutos. Apos adiçao de 2 ml de caldo-L, cultivou-se as células a 37°C durante 1 hora e colocou-se uma porção alíquota de 200 yzl sobre placas de Petri, contendo caldo-L suplementado com 50 ytl/inl de ampicilina.

Cultivou-se culturas de cada um destes clonios em 5 ml de caldo-L, suplementodo com 50ycg/ml de ampicilina, durante 12 horas, a 37 C, e purificou-se o plasmídeo de ALÍJ a partir de 1 ml do células de cada cultura pelo método de miniprep descrito por Klein e colab., supra. Classificou-se depois, por dimensões, as inserções de EcoPJ-Bamiíl nos 24 plasmídeos mediante restrição de EcoRI- Bamiíl e fraccionamento sobre gel de poliacrilamina. Seleccionou-se 9 fragmentos que tinham inserções com o tamanho apropriado. Transformou-se depois "E. coli” KOI061, substancialmente como descreveram G. K. Buell e colab., "J. Biol. Chem.", 254, pag. 9279-9⁹83 (1979), com um destes clonios, designado pSC-H- Δ 7. Transformou-se também as células com pcI857 (uma oferta de W. Fiers) . Escolheu-se células transformadas com pSGH- Δ 7 e pcI857 cultivanX O

do as colonias durante 16 horas, a 30 C, em Caldo-L, suplementado com ampicilina. (50 ^p/ml) e canamicina (40yz-g/ml).

X s *

Oolheu-se, ao acaso, colonias resistentes a ampicilina e a canamicina e cultivou-se estas, durante a noite, em 5 ml de Caldo-L

< X X

pd857 e um peaueno plasmídeo que comporta um reoressor P^ senX 5 _Λ x

sivel a temperatura e 0 gene que codifica para a. resistência a canamicina.

-26supleroentado, como se indicou antes, con ampicilina e canamicina, a 30°C. Diliu-se depois as culturas com 25 rol de Caldo-l a 42°C e deixou-se as células a cultivar a 42°C durante 2 horas (O.D.=l).

Para isolai? os polipeptidos semelhantes a SGH produzidos pelas células transformadas, recolheu-se 1 ml de células que foram submetidas a uma rotação de 8.000 rpm durante 4 minutos e adicionadas de 50 ytl de solução-tampão de laemmli (1% de SDS) £ laemmli, "Hature", 227, pág. 681 e seg. (1970) ferveu-se a mistura durante 15 minutos e centrifugou-se novamente as células (8.000 rpm, 4

. X

minutos) para eliminar os detritos celulares. Ensaiou-se o liquii '

do sobrenadante mediante ensaio radio-imunologico utilizando antisoros de coelho em relação ao BGH autentico. Rendimento: actividade de SGIí (mg/l) 32; moléculas semelhantes a SGH por célula:

1,6 χ 10⁶.

Por conseguinte, as sequências de ADH e as moléculas de ADH recombinante de acordo com a presente invenção permitem a produção, com um rendimento elevado, de polipeptidos semelhantes a SGH. Alem disso, as sequências, moléculas e processos de acordo com a presente invenção permitem a produção de novos polipeptidos semelhantes a SGH, que podem ser utilizados, s.pós purificação segundo métodos convencionais, como agentes anabolicos gerais em suínos, muito especialmente para a.umenta.r a velocidade de crescimento, o ganho de peso e a produção de carne naqueles animais.

Embora o modo de realização anteriormente descrito de um processo de preparação de um polipeptido semelhante a SGH de acordo com a, presente invenção forneça um polipeptido semelhante a SGH a que faltam os seus primeiros 7 aminoácidos e que inclui uma f-Ket, em comparaçao com SGH autêntica, os entendidos na matéria podem executar outras construções para produzir outros polipeptidos semelhantes a SGH sem que se afastem do âmbito da presente invenção.

-27Ror exemplo, pode efectuar-se uma. construção em que um codao de

fr f fr fr ' ff '

iniciaçao ATG, ou um codao de iniciaçao ATG e outros codaos, e ligado directamente ao codao TTC que codifica para o primeiro aminoacido da SGII autêntica. Essa construção devera permitir a produção de uma SGF completa ligada a uma f-Ket ou através de outros aminoacidos a uma f-Met*. No entanto, preferiu utilizar-se pSGH- δ₇ em "E. coli" HBlOl para produzir polipeptidos semelhantes a SGH de acordo com a presente invençao porque se obtem, deste modo, rendimentos muito mais elevados.

Está representado, nas Figuras 9 e 10, um método que pode ser utilizado para preparar uma construção que codifica para f-Met-SGH completa. Nesse modo de realizaçao restringiu-se pSGH-9D com

Z fr

ITaell. removeu-se os nucleotidos que ficavam em frente do codao TTC que codifica o aminoacido 1 da SGH completa e restringiu-se o fragmento remanescente com Aval pera isolar uma extremidade de codificaçao 5' de SGH comuleta que começa com TTC. Reuniu-se este fragmento com um fragmento Aval-BamHI de pSGII- Δ 7 que codifica para a extremidade codificadora 3' da SGH completa. Inseriu-se depois esse fragmento em um vector de clonagem derivado de pBGH- Δ 9 (Ser),

Z fr

descrito anteriormente, de modo que o codao TTC fique com a extremidade truncada em um codao ATG. Ror conseguinte, esta construção C pSGH-(í-et-Phe) _7 permite a produção de f-Fet-SGH completa em hospedeiros apropriados.

Devera entender-se que qualquer aminoacido que nao faça, parte da SCN completa os próprios aminoácidos essenciais não activos de SGH podem ser removidos, durante a expressão ou a seguir à mesma, antes de ce utilizar o polipeptido para, tratar animais.

-28Em alternativa, pode preparar-se outros polipeptidos semelhantes a SGH novos, que contem supressões, a partir da SGH autêntica ou modificações de aminoácidos a partir da SGH autêntica mediante construções apropriadas ao nível do ADN ou mediante reacção química ou enzimática apos produção do polipeptido. Por exemplo, preparou-se uma Δ 3-SGH utilizando técnicas como as descritas antes. Estas construções e estes polipeptidos constituem uma parte da presente invenção.

Deverá entender-se que nem todas essas construções podem ser igualmente eficazes na produção dos desejados polipeptidos semelhantes a SGH de acordo com a presente invenção. No entanto, qualquer entendido na matéria pode escolher facilmente uma construção e um polipeptido apropriados para um determinado sistema de expressão, um hospedeiro e aplicação, utilizando os processos e ensaios aqui descritos.

Os polipeptidos semelhantes a SGH anteriormente descritos, depois de purificados, podem ser utilizados para tratar suínos de acordo com métodos convencionalmente conhecidos para a administração de hormonas do crescimento a animais (por ex., E. J. Turman, supra), para acelerar a sua velocidade de crescimento e a produção de carne. Por exemplo, SGH- Δν , produzida como se descreveu antes, apresenta uma actividade reforçadora do aumento de peso análoga â da SGH natural em ensaios efectuados em ratos.

Os microorganismos e moléculas de ADN recombinante preparados pelos processos de acordo com a presente invenção são exemplificados por culturas depositadas na colecção de culturas da "American Type Culture Collection", em Rockville, Maryland, em 15 de Setembro de 1982, e identificadas como SGH-A e B.

A: "E. coli" K12 MC1061 (pSGH-9D)

Β: "E. coli" K12 (pSGH-Δ?)

-29X

Λ estas culturas, foram atribuídos, respectivamente, os numeros de entrado. 39191 e 39192.

X

Embora tenha sido apresentado anteriormente um grande nu~ Λ, X

mero de modos de realizaçao da presente invenção, e evidente que a construção basica aqui apresentada pode ser alterada para proporcionar outros modos de realizaçao que utilizam os processos e as

49 49 4

composiçoes de acordo com a presente inveçao. Por isso, devera considerar-se que o âmbito da presente invenção deve ser definido pelas reivindicações anexas de preferencia a se-lo pelos modos de

49 4 4

realizaçao específicos apresentados antes a titulo de exemplo.

Claims

Reivindicações

1. - Processo para a preparação de polipeptidos semelhantes ã hormona de crescimento de suínos, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado por uma molécula de ADN recombinante que contém uma sequência de ADN, escolhida no grupo constituído por inserções de pSGH-9D, pSGH-A7 e pSGH-(Met-Phe) , sequências de ADN que hibridam para qualquer das inserções de ADN anteriores e que, por expressão, codificam um polipeptido semelhan te a SGH e sequências de ADN que, por expressão, codificam um polipeptido codificado, por expressão, pelos cõdãos de qualquer das sequências de ADN ou inserções anteriores, estando a citada sequên cia eficazmente ligada a uma sequência de controlo de expressão na molécula.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o citado polipeptido semelhante ã hormona de crescimento dos suínos no grupo constituído por polipeptidos de formula: Met-AA^ a AA_igo de SGH, Met-AA_g a ΑΑ^θ de SGH, AA^ a AA^qq de SGH, AA_g a AA^_gg de SGH, polipeptidos semelhantes a SGH codificados por sequências de ADN caracterizadas por uma supressão terminal 5’ a partir da sequencia de ADN, que codifica a hormona de crescimento de suínos completa, e fragmentos semelhantes a SGH e derivados dos polipeptidos citados.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher a citada molécula de ADN recombinante no grupo constituído por pSGH-9D, pSGH-A7, pSGH-(Met-Phe) e moléculas de ADN recombinante caracterizadas por inserções de ADN tendo

uma supressão terminal 5' a partir das sequências de ADN que codificam a hormona de crescimento de suínos completa e que codificam, por expressão, um polipeptido semelhante a SGH.

4, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher a citada sequência de controlo de expressão no grupo constituído por sistema lac, sistema trp, regiões do operador e do promotor principais do fagoX , região de controlo da proteína de revestimento fd e outras sequências que controlam a expressão de genes de células procarioticas ou eucarioticas e seus vírus e associações destes.

5. - Processo para a preparação de um polipeptido recombinante semelhante a hormona de crescimento de suínos , caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado com uma sequência de ADN que codifica o polipeptido citado.

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