CZ704783A3 - Process for preparing polypetides exhibiting activity of pig growth hormone - Google Patents

Description

',Ο

« ; Z'1 f Γ, í .··; ' í :~r>\ i O·; ÍX> · c.n

1

Sledy DNA, rekombinantní molekuly DNA a způsob výroby poly-peptidů s účinností růstového hormonu vepře

Oblast techniky

Vynález se týká sledů DNA, rekombinantních molekul DNA a způsobů výroby růstového hormonu vepře a polypeptidů s účinností růstového hormonu vepře. Vynález se především týká sledů DNA exprimovaných v příslušných hostitelích a produktů získaných touto expresí. Sledy DNA a rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu se vyznačují tím, že kódují polypeptidy s biologickou účinností růstového hormonu vepře. Jak bude zřejmé z následujícího popisu, sledy DNA, rekombinantní molekuly DNA a způsoby podle vynálezu je možno používat při výrobě polypeptidů užívaných jako obecná anabolika pro prasata, zejména k intenzifikaci růstu, zvyšování hmotnosti a produkce masa u těchto zvířat.

Dosavadní stav techniky Růstový hormon vepře (dále SGH) je hormon typu polypep-tidu, syntetizovaný a vylučovaný předním lalokem hypofysy. SGH je patrně syntetizován jako bílkovinný prekursor (pre-kursor růstového hormonu vepře) a pak v průběhu vylučování a uvolňování hormon "zraje" na růstový hormon vepře. Hotový hormon je pak uvolňován do krevního oběhu. Částečný sled aminokyselin v růstovém hormonu vepře je popsán v publikaci "Cya-nogen Bromide Cleavage And Partial Amino Acid Sequence Of Porcine Growth Hormone" |J.B. Mills a spol., J. Biol. Chem., 245, str. 3407-15 ( 1970) j a v publikaci "Studies On The Pri-mary Structure Of Porcine Growth Hormone" |A.E. Wilhelmi a J.B. Mills, ed. A. Pecile a E.E. Muller, Amsterdam, Excerpta Medica Foundation, 1972, str. 38-41, Intern. Congr. Ser.244|. Růstový hormon, tak jak je normálně produkován v průběhu životního cyklu, je zjevně vylučován ve větším množství v průběhu dospívání. Hormony tohoto typu podporují růst kostry, syntézu bílkovin a také ovlivňují metabolismus glukózy a lipidů. Růstové hormony jsou proto obvykle uznávány jako anabolika. 2

Vynález se týká způsobu výroby polypeptidů s účinností růstového hormonu vepře» Růstový hormon'vepře ("SGH") je hormon typu polypeptidů, synthetizovsný a vylučovaný předním lalokem nypořysy. SGH je patrně synthetizován jako bílkovinný prekursor ( prekursor růstového hormonu vepře) a pak v průběhu vylučování a uvolňování hormon "zraj eM na růstový hormon veftře. Hotový hormon je pak uvolňován do krevního obě nu. Sástečnj1 sled aminokyselin v růstovém hormonu vepře je popsán v publikaci J.B. Mills a další, Cysnogen Bromide Cleavage and Par— tial Amino Acid Sequence o.f Porcine Grov;th Hormone", J. Biol. Chern», 245, str. 34C7-15 (1570), a dále v publikaci Δ.Ε. Wilhelmi a J.B. Mills, " Stucies Cn The Primsry Strueture Cf Porcine Grcv;th Hormone", ed. A. Fecile and Ε.Ξ. Muller, Amsterdam, Excerpta Médi ca

Foundation, 1572 J str. 36-41, I ntern. r\ _ ^ ,.... o ^ P 0 d 4- 4 o Půst GV ý hormon, tak j c:i£ j r-, ^ -v-, -- r- 1 p X pl‘ Odu- kován v průběhu úí X volního cyklu je zj & vně v y1uČ ov a n ve větším množství v průběhu dospívání. Hormony tohoto typu podporují růst kostry, syntnézu bílkovin a také ovlivňují metabolismus glukózy a lipidů». Růstové hormony jsou proto obvykle uznávány jako anabolické látky. 3 Růstové hormony jsou částečně specifické, pokud jde cj^ivočišný druh» Růstový hormon jednoho druhu vsak může být biologicky účinný pro jiný živočišný druh, který se nachází níže ve vývojové řaděo Přestože mechanismus účinku růstových hormnů není dostatečně znám, bylo prokázáno, žejpo podání růstového hormonu dochází ke zvýšení rychlosti růstu, ke zvýšení hmotnostních přírůstků a ke zvýšení produkce masa u zvířat. Například při pokusu s průměrnými přírůstky u vepřů byl průměrný přírůstek při denním injekčním podávání čištěného růstového hormonu vepřů 1,08 kg denně ( ve srovnání s přírůstkem 1,05 kg u kontrolních zvířat). Důležitější byla skutečnost, že pokusná zvířata spotřebovala denně statisticky význame méně krmivá než zvířata kontrolní ( pokusná zvířata 5,3 kg a zvířata kontrolní 7}5 kg krmdýa denně). líimoto bylo možno pozorovat u pokusných zvířat zvýšenou, kvalitu karkasu, u pokusných zvířat šlo o délku karkasu 80 cm a tlouštku sádla *cA Kfbei& 3,7 cm, kdežto u pokusu kont polního šlo o délku karkasu 76 cm a 4,5 cm hřbetního

UU tuku. Chemické složení poživatelného masa bylo rovněž výhodnější u pokusných zvířat, a to 13,5¾ bílkoviny, 49,13% vody a 36,76% tuku, kdežto u zvířat kontrolních šlo o 10,8% bílkovin, 39,43% vody a 49,27% tuku, jak 4 bylo popsáno v publikaci E.J, l/3^rman, " Some Effects of Pituitary Anterior Growth Hormone On Swine", Thesis: Purdue University, Apríl 1953·

Naneštěstí není možno použít v širokém měřítku výsledky pokusů, které byly získány při použití růstového hormonu vepřů, protože není k disposici dostatečné množství tohoto hormonu. Za dnešního stavu je 3GH izolován z hypofys vepřů, což znamená, že tento zdroj nekryje ani zlomek požadavků pro účinné využití tohoto hormonu»

Foslední pokroky molřkul/šární biologie u-možnují užít LNA jako kódu pro specifické bílkoviny nebakteii álního původu při přenesení tohoto kódu do bakteriálních buněk. Obecně je možno uvést, že v případě, že neběží o LNA, získanou chemickým způsobem, konstrukce rekombinantních molekul LNA spočívá v tom, že se nejprve získá kopie LNA s jednotlivým řetězcem (cLNA) z templátu PNA (mPNA), který je kódem pro výslednou bílkovinu, pak se cLNA převede na LNA s dvojitým řetězcem, cLNA s dvojitým řetězcem se naváže na vhodné místo v příslušném prostředku pro klonování za vzniku rekombinantní molekuly LNA a pak se vhodný hostitel transformuje touto rekombinantní molekulou - 5 - dna. Při pěstování hostitele, transformovaného svrchu uvedeným způsobem je pak možno dosáhnout exprese uvedeného sledu DNA a tím i produkce požadovaného proteinu.

Produkce některých bílkovin ne-bakteriálního původu při popsání technologie s použitím rekcmbinantní DNA byla již popsána. Například v případě prekursoru růstového hormonu skotu jde o publi kaci W. L. Miller a další, Moleculsr Gloning of DNA Complementary to Bovine Growth Hormone mRNA, Journa Biological Chem., 255, str. 7521 - 24 (1SSO), evropský patentový spis č. 47600' a britský patentový spis č. 2 073 245A. V případě prekursoru lidského růstového hormonu jde o publikaci J. A. Martial a další, "Kuman Grcwtli Hormone: Complementary DNA Clcning and Expres-sion In Bacteria", Science 205, str. 602 - 06 (1979) a evropský patentový spis Č. 20 147* žádný ze svrchu uvedených postupů se netýkal způsobu výroby růstového hormonu vepře, ani polypeptidú, které jsou svým účinkem tomuto růstovému hormonu podobné, ani zvýšené produkce masa v případě, že by bylo možno získat uvedený růstový hormon nebo polypeptid s podobným účinkem ve větším množství, které by toyi mohlo být průmyslově-využitelné. c.

Podstata vynélezu 6 i

w— i ’ i

Vynález řeší problém, který byl svrchu vysvětlen tak, že se izolují sledy DNA, které jsou kódem pro SGH nebo pro polypeptidy, blízké svým účinkem SGH a pak se dosáhne exprese v příslušném hostiteli za produkce poly-peptidů, které mají účinek, podobný SGH, pokud jde o zvýšení růstu· Předmětem vynélezu je způsob výroby polypeptidu s biologickou účinností růstového hormonu vepře, vyznačující se tím, že se pěstuje hostitel, transformovaný rekombinantní molekulou DNA, charakterizovanou sledem DNA ze ] skupiny a) včleněných sledů pSGH-SD, pSHGH«A7 a pSGH-(Uet-Phe), b) včleněných sledů, v nichž je vypuštěna část sledu na 5'- i -terminólním zakončení sledu úplného růstového hormonu vepře a které jsou při expresi kódem pro polypeptid s biologickou účinností růstového hormonu vepře a c) sledu DNA, které gm degenerují v důsledku genetického kódu na některý ze svrchu uvedených řetězců DNA nebo včleněných sledů a které jsou při expresi kódem pro polypeptid s biologickou účinností růstového hormonu vepře, přičemž tento sled je operativně vázán na řídící sled exprese v rekombinantní molekule DNA a při jeho expresi dochází k produkci uvedeného polypeptidu v případě pěstování hostitele, transformovaného touto rekombinantní molekulovou DNA· - 6a ~

Peptid se s výhodou volí ze skupiny polypeptidů Met-AA^ až AA^q růstového hormonu vepře, AA1-AA^o0 růstového hormonu vepře, Met-AAg-AA^ růstového hormonu vepře, AAg-AA-^ růstového hormonu vepře a dalších polypeptidů s biologickou účinností růstového hormonu vepře, pro něž jsou kódem řetězce DNA s vypuštěnou čéstí sledu na 5'--terminálním zakončení sledu PNA, který je kódem pro úplný růstový hormon vepře·

Ve výhodném provedení se řídící sled pro expresi volí ze skupiny lac systému, tro systému, oblasti hlavního promotoru a operátoru fágu lamMa*' řídící oblasti obalové bílkoviny fd a jiných sledů, ktmré řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk a jejích virů a jejich kombinací, a transformovaný hostitel ze skupiny E· coli, Pseudomonas Bacillus subtilis,Bacillus stearothermophilus a dalších bacilů, kvasinek a jiných hub, nebo hostitelů živočišného nebo rostlinného původu·

Způsobem podle vynálezu je poprvé možné získat polypeptidy, které mají účinnost SGH, a to v množství, které je možno využít ke zvýšení růstu a produkce masa u vepřů v obchodním měřítku·

Jak bude zřejmé z následujícího popisu způsobu podle vynálezu, umožňují sledy DNA a rekom-bijiantní molekuly DNA podle vynálezu produkci růstového hormonu vepře m nebo produkci polypeptidů, ktmrfl mají — 6b "* biologickou účinnost růstového hormonu vepře v příslušných hostitelích* Polypeptidy, získané způsobem podle vynálezu je mošno ušít bučí jako takové po získéní z hostitele nebo po vytvoření derivátu nebo po přeměně na prostředky se ým svrchu uvedených účinkem ke zlepšeni růstu a zlepšení pro dukce masa u vepřů· 7 Z toho, co bylo svrchu, uvedeno je ”2rejme, že základním hlediskem způsobu podle vynálezu je výroba sledu LNA, který je kódem pro polypeptid, který má účinek SGH na zlepšení růstových vlastností. Tyto sledy LNA v sobe zahrnují včleněné sledy, volené z včleněných sledů LNA z pBR322(Pst)/3GK-9T), pSGH-^7, pSGH-(Net-Phe), sledů LNA, které hybridizují na u-vedených včleněných sledéeh a které jsou kódem pro polypeptidy, svým účinkem podobné SGH 2 sledy LNA, které po expresi jsou kódem pro polypeptid, pro nějž jsou kódem rovněž některé ze svrchu uvedených sledů LNA.

Popsi výkresů

Na obr. 1 je ^cematicky znázorněno jedno & provedení způsobu podle vynálezu pro výrobu směsi rekombinantních molekul LNA, z nichž některé jsou charakterizovány včleněnými sledy LNA, které jsou kóde: pro polypeptidy s účinkem blízkým účinku růstového hormonu vepře. jsou

Na obro 2. gg sí\ce maticky znázorněná dvě další provedení způsobu podle vynálezu, při nichž 8 dochází k selekci sledů LNA podle vynálezu. V prvním případě se sled 0 cLNA, příbuzný SGH podrobuje selekci hybridizací na vzorek z růstového hormonu skotu. Ve druhém případě se užívá vzorek, získaný * i štěpením cLNA, příbuzné SGH. í*Ta obr. 3 je schematicky znázorněn sizd způsob stanovení sledu nukleotidů v SGH-9D podle vynálezu. !

Na obr. 4 a 5 je znázorněn sled nukleotidů a sled aminokyselin v SGH-9D, který byl získán způsobem podle vynálezu.

Na obr. 6 je znázorněn Částečný seznam míst pro působení restrikcních enzymů po analýze | sledů nukleotidů, znázorněných na obr. 4 a 5 pomocí počiteCe.

Obr. 7 je schematickým znázorněním jedoho prcvsdení způsobu podle vj^nslezu pro konstrukci re- 1 kombmsntní molekuly LNA pSGH - Δ7 podle vynálezu.

Obr. 8 znázorňuje ^ββγιεζχρςβχεζεκχ sled nukleotidů a aminokyselin pBGH- 9(Ser), pSGH - 9D 3 pSGH - &7.

Obr. 9 až 10 schematicky znázorňují jedno z provedení konstrukce rekombinantní molekuly DNA pSGH-(Met-Phe) podle vynalezu.

Provedení způsobu podle vynálezu

Aby bylo možno plně porozumět následujícímu popisu způsobu podle vynálezu, je zapotřebí vysvětlit některé méně běžné termíny, které budou v průběhu popisu používány:

Nukleotid - monomerní jednotka DNA nebo ENA, která sestává z cukerné složky (pentózy), fosfátu a dusíkaté heterocyklické baze* Baze je vázána na cukernou složku přes uhlíkový atom glykosidu (uhlík l^pentózy).Tato kombinace zásady a cukru se nazývá nukleosid. Každý nukleosid je charak- y.t terizován svou baží. Čtyři baze, vyskytující se v nukleosidu jsou sdenin MAM, gusnin "G", cytosin

I ”C" a thymin "T" pro DNA. Baze, které se vyskytují v PNA jsou A, G, C a uráčil "o".

Sled DNA - lineární uspořádání nukleotidů, vzájemně spojených fosfodiesterovými vazbami mezi uhlíkovými atomy 3'a 5^sousedních pentóz. 10

Kodon - sled DNA, složený ze tří nukleotidů (triplet), který je kódem ( přes mKNA) pro aminokyselinu, ze signálu pro počátek translace nebe pro ukončení translace. Například nukleotidové triplety TTA, TTG, CTT, CTC, CTA a CTG jsou kódem pro a-minokyselinu leucin ("Leu"), triplety TAG-, TAA s TGA jsou signály pro ukončení translace a ATG je signál pro počátek translace.

Způsob odečítání- seskupení kodonů v průběhu translace mKNA d o s ledu a mino mys je edeč ít ání to lc to se Nepříkl ad sled r nmr GTT vat tře. mi rů zný mi z půsi X C ιΐ j C os vede V η V li. m.· X ská minokys el τ n · GCT GGT m O. GT AAG - - - G CTG G ΓΊΓΠ JL X GTA k r*. 'GT ““ - - <~i ms·* n míj G TAA G -

(j O ycn ia·

‘V dú a-

Ala-Gly - Cys - Lys

Leu - Val - Val

Trp - Leu - (Stop)

Polypeptid - Lineární řetězec aminokyselin, které jsou mezi sebou navzájem spojeny peptidovými vazbami 11 mezi α-sminoskupinou jedné aminokyseliny s ksr-boxylovců skupinou aminokyseliny sousední»

Genom - Cela DNA buňky nebo viru. Zahrnuje mimo jiné vény, které jsou kódem pro požadované polypeptid a současně operátor, promotor, ribosomovou vazbu s interakční sledy včetně sledů jako je Shine-Dalgarnův sled.

Gen - Sled DNA, který je přes svůj templát nebo přes mRNA kódem pro sled aminokyselin, který je chera teristický pro určitý pol3rpeptid«

Transkripce - Způsob produkce mRNA z genu.

Translace - Způsob produkce pclypeptidu z mHNA.

Exprese - Způsob produkce polypeptidu z genu nebo z příslušné DNA. Jde o kombinaci transkripce a translace.

Plasmid - Kechromosomální dvod jitý sled DNA, který obsahuje neporušený "replikon”, takže může dojít k replikaci plasmidu v buňce hostitele. 7 případe, že se plasmid uloží do buňky jednobuněčného hostitele, může dojít ke směnám vlastností tohoto organismu a k jeho transformaci v důslea ku přítomnosti DMA plasmidu» Například plasmid který nese gen pro odolnost proti tetracyklinu (Tetil) transformuje buňku, kt: říve byls stává proti

Citlivá f;S tc trseyiil inu ocelnou» ._ unkb, která by i.s ^ ΓϋΓ.ν r n a ol&snidem ee nazývá trznsíor;..&nt, boktenofág - bakteriální sestává z< V i LU VIJ u

Mtíca

G^O U. £ i i. c li j·’ C I tílkcvinnér •usdru nebo obolu ("kspsiá")* rjLOt Ι,ι’ΰ eoek t-ro klonování - Flsemid, iA\k fáru nebe

Eieí který je schopen replikace v buň- . oharek t e ri z ov án jedním nebo malým počtem míst pro působení enlcnukleázv, 1 - j -l v ~~ r c r o r, z. pn o u c 7.. L.'.-tx‘.y nic: oři ok v mcui • kj ·- L·1 -1 <* ' v .C-2-Γιζ sled unree . příklad replikace, produkce o ba levnou bílkovin nebo prohot&ru nebo vsánycn míst, přičemž sled opsánuje označení, které umožňuje jeho identifikaci v tr&nsformovnrrycU buňkách, nspříklsd resistenči proti ampicilinu nebo proti te trs-cyklinu. Prostředek pro klonování se často nazývá vektor. klonování - Způsob získání populace crpsnižmů nebo sledu Lká, odvozených od tohoto or-seniemu nebo sledu B 3 Θ a U c. 1. n i reprodukcí. ;j ΙΓ. Cl _ h :ií nolskurs j.-.á 1:3b 0 úpěli::: 1 l-.l -mol - c u i £ ; ·- ·'' “-V ...n s rliú v c h ponomu , m v eré 0 y,i 1 s oojenp? svými kouči V i c i: Jíví c buněk a p ~ “í *1 —< — c C ZO Γ - no 3 t i uf i kovat buňky host j_ u '3 16 ci 1T- no žie se v nic ii 0 pio ří zení exprese- sled i j n í‘í. 3- ο 0 0 1.C c -- 9 --u £ rl - íd í 8. 0 v lá- u c. exp zas i sledu. 111 nebo í’ θ n u v c r 1 p c 0 - ? ZQ J ^ Kj p! y u c st ruktury navázán. Ob £ Cííj. f i ” cr ct éu lac, sy st én t r c; his vn í oblasti operátoru a pro moto ru fugu 2c mbes 5 1' i- / 1» 1C1 ob last obalové b í 1 kov iny fd a rl p Isí sled .v» 0 n i 0 1 '{. S 2 nám o, že řídí expresi Sunu crok s r Cule icýc h ne c 0 6 u k s I etických buněk a je jich virů >3 :bo komb ins c í t t ch - to 0 T· v u u. uktur. — r C ový hormon vepře. -3 3·!; 1 r! -U « podobny sGH - pol y ps ot id , £*. υ Ο V *: fy, £2 h io lo gic - i-0 u Úč 4 ^ ... ~ *. c fiu disiiO b u i-<wiu # -*a car. i je zn B. Z.O -V Π 1 2Ί0 o: dn 0 pro v sesn 1 bu 00 či 1c vysílenu schémat ic kým spi so »_ w bem. Ξ01 í 0 ' · / 0 i'· 1 - s;:. 0 1 re komb inantn íc 1 mo lekal 11Λ 9 z nichž ni kt 3 1 é >lecy HA, které jsou kcdcm pro SGH ne bo obsahují v cis niné : O Li 0 O ΰ Γί Θ 0 O 1, ě 0 C 'ii i u ' Příprava mBivA růstového hormoi ru vepře (SGIí-miuíA ) s obsa- , -j- _ _ _ : hem oo Iv Ji 4 a Ž 6 g předního laloku hypofysy vspře (Pelfreeze, * A i hansa ε ), zmražených s^uchým ledem se přidá k rostoku ε obsahem 5 M gusnid. lni urát hio kyanátu, pO mlh citronsnu sodného, 0,5 % laurylssrkosylátu sodného a 0,1 K β-měrka o- nolu ( lo ml/ g s -1^ ic. LIJ ; · Po S t U publikace J . r. . Ch 1IX VJ lil 3 o 0 3. S C A. c n CL - ~r ^ <- ./ j (Ir7 > \ j · Jr' α ίΓ. 8 '3 zlá z ul'· aecss^i roZT-a.r pn teplota ^jf°C v uvedeném ro stoku s homogenitu:í se (Folytron) 6 r 20 sekund. ?c cd středl ní bomogenátu (Servali, 6000 oeecsc mmu tu, 5 mi. ; J U 0 j T· ΰ plota m í s tn 0 3 t i ) C P lw> .·> 7,0 utu s Ob s a h : a: nukleo v ých ky selin nfs nav: rství CsCl ( 5,7 m v 0,1 LI SLih) a vr ~ V 3 dííc kx ým ol *- “í c~ *” o m. Pa íZ se z ku mavks od stř e cí ( C;~ 41, áče k /li minut; u, 1S ho din, 2 d°c), ρ-'-r r ks c· frak ijq £ s obsahem alA získá ve formě pelet.

Po odložení supernatantu se peleta s obsahem celého mnořstv í BIU uvede znovu do ευ. s sen ze ve vodí a ved- C_j. ok se dva krát extrahuje k J o > xjným objem em smlsi chlore ior mu v pornoru 1 : 1 a dvakrát stejným t : IU . Pa k S 6 Li .Βλ V’sráží *7 í-i vodné feze třemi o <rt- hanolu a výsledná sraženina nsoben se sis ká celkem 8 mg 4 mg svrchu uve o osa nem ( 10 mm, 7,5) s 1 mil ^ teplotu rr0n do výsledné TA - npu.fr ΐ3η-elkem 10 minut, končentrace 0,5 1- a

a rozzcT za iiřívá

Uc pak nanese na. sloupec o ligo-cT-celulozy myje 0,5 m KC1 k odstraň oni všech typu r nakonec se po ly ι·Λ r7i ř. -14 5 která byla naváz M KOI ta ku o získaný materiál se sloupe c se pro - > pn rr-4 1 η {p h K’>JA . vymývá 10 mlče 3 obsahem

Tris-hCl o ρΗ 7,5 při teplotě místnosti, frak

DO IV ϋ cí se pa k stejně jsko a sole mi s nás1 e ánýni o v e vodě. Tímto r, DU30DS

1111 se spojí. v r> on ?-f r L·- S Z těchto spojených frak-SKA vypražením ethan o lem suspsnáo váním polv A ‘ EM v celkovém v v tě: ku 200 r'&· i by bylo no z no zkontrolovat učiň. nost ta kto izolované pely A‘ FňňA , byla provedena translace 2 / ug •i- -í + 0 c; o ! • r—í O Cl, Λτ RHA i.n vitro při použití lysá Itu králičích re tikulo c y >: u jsko ''"'S-methionin- bs abunocn ého systému (Tli; i podle publikace H.E.3 . Pe Ih 67, str. 247 a násle d na Spc/polyekry lemido / s o b ‘7 n. j s sen e.n o přena z . E.J. Jackson, _r. 7. z v 1 n / o) a o .i. o - n \ gelu a utorad iograf ic ky. Tímto z ža svrchu uvedeným znásoben izo mocném. , εledován lováná póly -An ř;3Á po translaci vyvolává produkci polypep-t idu s sole kulovou hmo trio stí,která odpovídá hmotnosti, os o o oo u i l d · pro pre uursor .rnstoveno mormonu vepře (pri- 4 COO). 'e. věau sscozreice, j s št ě směsí velkého množství rušných typů ruU , "ipo r7 0 u* w ^ přiloženého ob r. lo S výjimkouJ nřniCA^. spaci :0U tyto liché pro SGIi nebo pro polypept ió. typy lál nežádoucím;! ne eis to tas i, obr. 1. Je nepříjemné, průběhu vnez sra-jse z ay ici časti to ski íte no rot v póly ti ulonovacriio postupu podobna jako ^ “*ssiTin-x; # * 3 ί'Ο li i>_ U U i: ir G ť O S ij_ď Z G X130τΰ O G U O , 6 O JÍ Z !j O fi.XÍO S í/ oovhc·· ke vzniku velkého imsns kl o i o u nv. oře z v o

OiiU , X cí u uo *j lic-. V o 1 fi. 1 O j uii zen, nzerv je noeso pro £uň. ; i chrň

od sob vy roby nJíi—cmA i + oyio sosno orioravi iďinvs , komplementární ke svrchu získaným různým typům pely 1T I;ílA, smísí se 20 ^ul póly A~ KKA (10 <uy v IUO) 17 a v.vsieciny xozzoíz

10 /ul oligo dT ( 1 Eg/ml), ICO CO 0,5 Z& ilOIiCí nonc enrrace j , yUi se nechá stát 15 tonuto routo ;ou O-i i f j 3 5 li—i- , -^C-Q i ΦΡ t»v (10 niCi/nl), 50 ώ rsv na ^ul , Life T-l o o r. ilV J- 0 Oi- u , ^ Cel kov 4 cbje roztok i-UC :i. U U hi'S 3Ů na nik' 5 blinu t pí i „j^· i.i 4. - ti zces '*) C ~η Á -Γ — ·; -- , ( prs s srážen cICÍA j e koup k t e r.é v zn i k 1' Ilili-iZi , t .L. L*. 0 Ό .i s»> t i ch ΐ o Ί / J- - koupi i kují j nemusí dojít o 000 ISitO vv v v ní transkriotázy (16 jednotek stejná objem duíru ( 100 ml\· Tri 20 níí Cg019, 140 oill KOI, 50 mil uTr ve vodě). C. výsledného roztoku bv1 404,4 /Ul. Pak se /" n u υ

G \J * iiC< U-· z se za· no re: lotu 1C0°C ε pak komplementární ks iiikvotního rnožszv l e ooťc urno zcu íShilil 1' 5 v elká ho rno žstv f 7 vídajíc ze rouro ζι ε trans r* i r» i 3 v Iv oriror.nv v ooxv n ε i ť chto látsk v >c sr reci i svrchu získané 1,43: lnou TC.4 ). V o [i C r i. i z* , . p c n rp pu * , a oy la sme u u r * i. vzniu O . ni cunA de napříkle Q o to , ze i* ch ždého tvp u "láká Z 6 ho zí ooIv 4 -1- mr . r i m !ř z každého ;yPu , ;uvodne pří tomného v Doly 1 může vytvořit velká řada ruznvch typu cDl'A. 'Teto skutečnost v obr. 1 znázorněna není. Pro to ze ;nto neuoin.Ycn ovnn se caova v Drúb; zbývající části celého postupu početně jako žáč slouží i s 3 í z: í točno o t ve směsi cDllA pouze k. áa olikování izolace po sodo váného klonu. aná cDIíA, lsíi.u skois* : PUSOU V v 1*007 nocucnvm smísí r< η i c; > p -.-1 t/ řa s e PO ra ymc Π \ *’v ob c 1 5 ^ 5 — ε 3 1 '-Λ ^ / 1 .T: 1/ inkubuje 17 bylo možno svrchu získanou cDllA s je; převést na cDlTA s dvojitým řetězcem, získané cDHÁ (0,7 /Uc), 50 rul álsno· /' Ό lupl ta plotě ’C. r jug ř£Cl2 (li:) (40C mu,: ϊτ is-HCl -ne rka ptoe t hanolu) isý a d a k lak ss Dí.A v v sráží přidáním 1/c objemu 211 octanu sodného o pH 5,5 a 2,5 ob minut na u c o i o tu jemu etnanolu a směs se. zchladí n -7OpC. Vzniklá sraženina se isoluje odsti sosním 10 minut ri 10 000 g) , získaná pelet- es prociv jí e thar-clen a znovu 7UJ-· nechá st sranune u do suspenze ve vod l a nane so u sa na sloupec i 5 · OiO U \j G C 3S 03 rl v y i^ _ rf n XX. Cíle. ní LHA při po už is-HCl - C,i nul 3ΏΤΑ a I rcr o í-r •feeré obsahují D . Osikový objem írsk 0 1 5 kusrá ob £3 HU ~ 1 JJivA j 6 r‘8 n £6 p„'l^d 8. 42 / ul rozao ku 2 II chloridu a pOO rul octěnu socn £ no o pH 4·: . 10 mM síranu e ho a o gul ol {irv / 0 i 0 u čnoiei:// "iDDdDex, ) ke spoj sula frakcí r-η £ r\ ;g u Ιο ul jsA a roztok se át 30 minut oři tepl 0 u 6 °.n 'Do k ε8 směs ex- třikrát stejným objs není fenolu a X Ci i\ td u c i 6 č 3 vodná fáze se nsnes β n čí s 10 u o e c s obsahem Se III D-75 a ze sloupce & £ vymývá I li A při poulití ^razeni se 377 a i·: o svícnu. orovac. i e cnano.

Kloro vání LHA s ávožitým. řetězcem í a evořeši -eřsttr s dvojitém irokou skálu hostitelů a inoto oři do užití kasčeho ze kleno v ‘ 1' x i't e z c e a r e rso z no p o u. sir prostředků pro Honování. 20 ipscif ických pro rtrsc ld\ pro klonování ýs ncrno zvolit cvonívr.: rcrescrrn. různá místa pro včlenění cDKA Vyber pro klonování a eroresi rrůžs pihová st snadno každý oobo rník, aniž by se odchýlil od základn ích principů svlsobu oovle 7. nálezu. ua n- ti o počata čni mj. o no v ani dví c:sisi, "uonstruc- .Ir.íjplasnrid phR32£ (í- Eolivs :nd Chsrsctc r i zas ic-n of Ber Clorinc Yehicles li, 13, á i-Ui u i -ťur 00 se

Gene , str. (117? ) i <J .0. Sutcliííe , phB322 Βθstřict ion Ihsp I?rivsά

Iron: the DIVA Sscuerce A couráte DBA Sis 4361 iíuclectiče rai rs Leno" , Ivuc 2721-26 (1172), dále vubiirree , které se týhcpr rrírts pro puso bení restrikční anionukleásy Pst I, napi íklsd 1. V i1- Bacterial Cloně E. nthesising d C Í É U 'CjA 7 5' 5

Research, : C ÍC1G ; Ί ·η· _ Γρ. *r c v o. v n: ^ *j o { · vU - fc'w' — Vl — U- „u iu i · 3727-31, roinsurm , rroc. uí * -·» # OO -i it ai · \ -- · h-z O — ---— i,. V — Vl */· X · -l* Ou C W1 ·,· -1 C: . iic , u 1 . íi ^ a i 107 Bv- C ) .

'iíprcvB nul-i 00 stáčení Pst I

,5 vonce niv, :;G xx u ·. i i ;0 dobx i n w í .... .· .· .... r.., ri-^r to rs „Ovůjii*. \ x 1 Xo íí \jJ uLux d 00:rosen "Osoběni β Ώ C Ο .Π 21 , . I. 1 - ,' U L X U cl Δ ·

Z £ b X

HO Ο χ. 5 10 c ;XÍdU , lozit; poloniu cnz';?iam r DIT (ΙΟ πώΐ) , · 1,5 j - 1 Gl Lil), 1C jMl príru pro ΐ Γ' \ ΡΌ

J

V O 3 /

1--3Z :o

1 X

C 6 p r (ISO 1z íno z s ii/ ml, při tc plote io|~'C ρ - p ί Ό i r 1 m o x ;Ui .Id-b / 03- o 2 o oLilr 1 ti:- a ob, pro -1 /1 V. ’w/ o

orccním dC ripezcer •:gíló c_ ...1 vod;v, 3 3 ; ' 1p i i rr‘ i/zu, t:.

;Γ"ι,'νι ( Ί r\ r, 1 /Ία V -LU J -πιε/!:ι i), ίο JA. 5 C:G §,5 v· · Q xl. cl-. b 1 iži}l 1/3 l 100 pp) a v opit: v m i /u. * /; ? I / pudru pro 10 :2..), 1C ,ul yiu.j -..O « L' . ^ oír ls -H Cl 0 Ol- / « >yJ ε 0 >s / u. 2. o 4 r rv inální ά s sonvnukl eo tidpl- ϋ Ϊ ci Π 21 ’Ξ. IE op (160 ΠΟ 0 3 ii/ml, ,-, .μ - 2 no x 1 ioc he rr.ic o. lol - - 1-- ^ J J 0 u Li- U vi ^ V £ C; "J li 0 Π1·' CJ- η • -i · *—> i.. t O· 0· e i- 1 - X -a b U j O r· eďkem 13 minut při PO tc.lo l ta 1C n -w c. P - 2 0 Γ- -a / ul 0. JjOii / K h 3 0 Hilu) ε smis se p γ O 4 s c v" hrá t 2 20 t ~*4' “* O b 6 C oe ui r oi o 1 fenolu a chloxof Ol' C'· í T \7 --- V 4 pru 1 : 1 a t f i IrcH f. - ; *2 -- "t rC T. ^ O '"‘C^ *** 0 b ,r: r.- g η- Λ 4- O d ” ·** ^ w xu. V o ά u = r / I 3. Δ e z e ope U 2Λ. i. chov á pxo C eakci CJ p3B31C PO stepem P = B Ci po V 3 0 j w 0 —· :ms r ' /-1 Ό* · J, uyO Λ'οΙι se zssoncenxm au a c±jxa se zátoce- 1 / u ο o j. a .1 Z— X sř 4-Á p!B3ž6 pc- řtooení ťs G x £ ;0 ns v á sá n i Ξ 2. ho n - - r\ 01-1. 0 a í, 3 0 n η) ε 2 5 -· /Ul clil. (1 no) '0 navách no Z· a o o n i e n o c; C ec srn i s í v n 3 / / ul sn oufxu pro isku ts 6ni ní Z w u 0 I S --0 2 , i.· j. I if chl 0 2' 1 ^ : 1 Cr\ n '-· r\ w. e·: j. * w j. ^ vj 5 2 CO 1 Y ^ 7 _ - o i o cli ? , u. , — 0 ;;u.. HP J.ii , VO i n oo ýslzčrJ ho o b “ onu bC / Lil · Po 22 no 2 2 1 ? o.-·o i i 1 3 Ol ; J lo t u cc|(J,C no 0 0 Ij u X iiiOUt" £ no -f- ^ T ^ 4- u ·.. U. 0 u ... , -b„ --- Lv J, O 1 no do bu čel 0 íc h 2 hoč.in ε 6 1: ·., o 1 XO r..4_ o i n .3 c / 22 r:Q 'J; *J 20 3 ,fC 3 on k; so c* v*· ·"' λ· í i μ.· >-\ v· - u_. 1. s_; W L4w. es no c 23

Je op/éět nutno zdůraznit, že pouze nepatrné množství rekombinanntních molekul DNA, získaných tímto způsobem obsahuje včleněnou cDNA, která je kódem pro SGH, jak je zřejmé z obr. 1*

Transformace E. coli K12 MC1061 získanými hybridy

Svrchu uvedený plasmid pBR322 zs zakončením dG a DNA se zakončením dC se po spojení dialyzují v kolo-diových vacích (UH 100-25) proti 1/10 svrchu uvedeného pufru pro uskutečnění spojení mezi oběma složkami, a to po dobu 2 hodin při teplotě 4^^ vyloučení nízkomoleku-lárních látek. Pak se směs přidá k 200 ^ul E. coli K12 MC1061, mikroorganismus je předem zpracován způsobem podle publikace GoN. Buell a další, J. Biol. Chem. 254, str. 927^fe3 (1979).

Protože plasmid pBE322 obsahuje gen, který je kódem pro odolnost proti tetracyklinu a gen, který je kódem pro odolnost proti ampicillinu, jak je zřejmé z obr. 1 a protože druhý z uvedených genů je inaktivovén v případě, že dojde ke včlenění cDNA do místa pro působení enzymu Pst I, je možno oddělit kolonie, které byly transformovény rekombinantními molekulami DNA s včleněnou cDNA v místě působení enzymu Pstl od kolonií, které tímto způsobem transformovány nebyly (obr. 1). Z původního množství 1 ng cDNA bylo izolováno přibližně 10 000 transformovaných kolonií.

Tyto kolonie obsahovaly celou řadu rekombinant-ních molekul DNA, které byly úplnými nebo částečnými kopiemi směsi různých typů ENA v póly A+ RNA z obr.lo Většina těchto molekul však neobsahuje včleněnou DNA, příbuznou SGHo

Vyhledávání klonu, obsahujícího SGH-cDNA

Existuje několik způsobů, jak z velkého množství klonů vyhledat klon, který obsahuje určitou rekombinant-ní molekulu DNA, tj. takovou, která obsahuje včleněnou DNA, příbuznou SGH. Při počáteční selekci se užije 400 bp Pst I fragment z cDNA, která je kódem pro růstový hormon skotu, popsaný v publikaci Miller a další, J. Biolo 6hem., 255, str. 7521-24 (1980). obr.2. Tento sled je rovněž možno získat tak, že se enzymem Pst I rozštěpí pBGH-(met-Ala), který byl uložen v American Type Culture Col- 25 lection dne 16. srpna 1982 pod číslem ATCC 38173, pod nímž je možno jej získat.

Tento vzorek byl užit pro hybridizační selekci klonů, připravených obdobným způsobem (obr. 2)0 Vzorek byl 1/ nejprve označen v souladu s publikací M. Grun-stein a D.D. Hogness, "Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNA^s That Contain A Speci-fic Gene”, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 72, str. 3961-65 (1975) a pak byl použit ke zpracování svrchu uvedené skupiny kolonií klonů, tak jak je dále popsáno, při použití fragmentu SGH-Msp, Z jednoho z klonů s positivní hybridizací byla izolována rekombinahtní molekula DNA, která obsahovala fragment cDNA, který byl podle analýzy sledu identifikován jako část sledu aninokyselin SGH (srovnáním se známým sledem), jak je zřejmé z obr. 2.

Pak byl z této positivní cDNA připraven fragment o 200 párech bsízí ( na trávením rozšzěpením Msp, viz obr.2) a byl označen ( podle svrchu uvedené publikace Grunsteina a Hognesse) k použití jako hybridizační vzorek pro skupinu 10 000 svrchu získaných klonů (obr.2). Pro hybridizaci 26 bylo uvedených 10 000 kolonií přeneseno na nitrocelulo-£pvé filtry (Millipore) a byly inkubovány přes noc při teplotě 37j°C. Pak byly kolonie rozrušeny působením 0,5 M hydroxidu sodného na 7 minut a filtry byly neutralizovány 1M Tris-HCl o pH 7,5, pak byly propláchnuty 2x po 3 minutách vždy 0,6 M NaCl a pak byly zvlhčeny dvojnásobnou koncentrací pufru SSC ( 0,15M NaCl a 0,015 M citronanu sodného, pH 7)· Po usušení filtrů na vzduchu byly filtry zahřívány ve vakuu při teplotě 80]pC celkem 2 hodiny a pak byly zvlhčeny čtyřnásobnou koncentrací pufru SSC, uvedeného svrchu, lOx Denharatovým roztokem a 0,1% SDS na 2 hodiny při teplotě 65^00 Pak byl přidán ^2P o 25 0000 impulsech/filtr svrchu uvedeného vzorku o 200 pórech baží (dvouminutový var, rychlé zchlazení) a 4X SSC, 10X Denhardtův roztok a 0,1% SDS, filtry byly hybridizo-vény při 65[°C po dobu 12 až 14 hodin, promyty 4X SSC, 10X Denhardtovým roztokem a 0,1% SDS při 65j°C dvě hodiny, pak byly promyty 2X SSC při 65°C na 30 minut a usušenyo řtá Po vystavení E^sSSřXX na rtg. film na 1 den bylo možno identifikovat přibližně 100 kolonií, které obsahovaly včleněné DNA po hybridizaci s použitým vzorkem*» 27 40 těchto positivních klonů bylo vybráno pro restrikční analýzu a pro určení velikosti včleněného fragmentu. Z této analyzy bylo^ stanoveno, že jeden z těchto klonů obsahoval včleněnou DNA o 750 párech baží o Tento klon byl označen E. coli K12 MC1061(pBR322(Pst)/3GH -9D), jeho rekobinantní molekula DNA byla označena jako pBR322(Pst)/SGH-9D a jeho včleněná část jako SGH-9Do Tato nomeklaťurť^ označuje, že tento klon je E* coli K12 MC 1061, transformovaný rekombinantní molekulou DNA, která obsahuje pBR322 a SGH-9D, přičemž včleněný sled SGH-9D je uložen v místě působení Pstl v pBK322 (obr<>3)·

Stanovení sledu nukleotidů ve včleněné části SGH-9D

Protože bylo předpokládáno, že sled DNA, který je kódem pro SGH a jeho signální sled budou mít přibližně 648 nukleotidů, byl včleněný sled SGH-9D zvolen pro analýzu zjišťováním míst pro působení restrikčních enzymů a současně pro stanovení nukleotidového sledu<>

Na obr. 3 je schematicky znázorněn postup, které ho bylo užito ke stanovení nukleotidového sledu ve včleněné části SGH-9Do Ke stanovení sledu v DNA bylo užito 28 způsobu podle publikace A.M. Maxam a W. Gilbert, " A New Method For Sequencing DNA", Proč. Nati. Aead. Sci., USA, 74, str. 560 až 64 (1977)· Většina sledů včleněných SGH-9D byla sledována z obou stran a většina míst pro působení restrikčních endonukleáz, sloužící jako značky, byla stanovena jako fragmenty, které leží mezi těmito místy, jak je zřejmé, z obr.3° Takto stanovený nukleotidový sled je znázorněn na obr. 4 a 5«

Na obr. 4 a 5 je včleněný sled určen zbytky 11 G na zakončení 5'b 10A (pravděpodobně odrážející zakončení póly A+ z mRNA) a pak 24C na zakončení 3· Včleněný sled je číslován od prvního nukleotidu po za-končení dG k poslednímu nukleotidu před zbytky póly A. Při srovnání s částečným sledem aminokyselin, který se uvádí pro SGH je pravděpodobné, že nukleotidy 1 až 570 jsou kódem pro SGH, nukleotidy 571 až 573 jsou pravděpodobně kodonem pro ukončení translace. Z to-horo důvodu je SGH pravděpodobně bílkovinou, která obsahuje 190 aminokyselin. Z uvedeného sledu také vyplývá, že existuje prekursor růstového hormonu vepře0 Zatím však nebylo možno prokázat ani délku ani sfczení signálního sledu nebo předběžného sledu SGH, protože SGH-9D pravděpodobně neobsahuje celý kód pro zakončení 5*prekursoru růstového hormonu vepře. Bylo možno zjistit první tři 29 aminokyseliny signálního sledu jako aminokyseliny -1, -2 a -3, jak je zřejmé z obr. 4 a 5· SGH-9D obsahuje celou nekodovou 3-oblast vzhledem k umístění zbytků póly AÍ

Je zapotřebí se zmínit o tom, že každý odborník může provádět další selekci klonů, které obsahují celou 5-kodovou část a nekodovou část a může také identifikovat úplný předběžný sled prekursoru růstového hormonu vepře, aniž by se přitom odchýlil od způsobu podle vynálezu* Klony, které byly identifikovány, mohou být vyhledávány na základě vzorku, odebraného z 5-zakončení včleněného sledu SGH-93). Vzorek tohoto typu je například možno přpravit tak, že se rozštěpí SGH-9D působením Nar I a izoluje se fragment mezi nukleotidy -5 a -60, jak je zřejmé z obr. 4. Tento fragment je pak možno značit svrchu uvedeným způsobem a použít k selekci klonu s obsahem úplnějšího 5-zakončení SGH. Tento klon je možno v případě, že neobsahuje také úplné 3-i.akončení SGH-9D kombinovat s 3GH-9D nebo s částí tohoto včleněného Sledu v běžném místě působení restrikčního enzymu, tak jak je to v oboru běžné, čímž je možno získat sled DNA s jednoduchým řetězcem, který obsahuje celou kodovou i nekodovou oblast SGH.

Struktura polypeptidu, znázorněného na obr» 4 a 5 pro SGH-9D ovšem nepočítá s jakýmikoliv modifikacemi polypeptidu nebo bílkoviny, které by mohly být způsobeny in vivo interakcí těchto látek s enzymy, které se in vivo vaskytují, jde například o glykosylaci. Je tedy zřejmé, že struktura pak nemusí být totožná se strukturou SGH vepře, má látka však stále má velmi podobné nebo zcela totožné biologické vlastnosti*. Bílkovinná sturktura, znázorněná na obr. 4 a 5 také nevylučuje možnost dalších modifikací, a to na úrovni genu nebo v samotných aminokyselinách, například mutace včetně jednoduchých nebo vícenásobných substitucí bází, vynechání baží, včlenění dalších bází nebo změny sledu bází, chemickou derivatizaci nebo selekci aktivních fragmentů těchto strukturo Všemi těmito změnami je rovněž možno získat další látka, jejichž biologická účinnost je ob-dobn&nebo totožná s účinností SGH.

Byl také analyzován nukleotidový sled SGH-9D počítačem za účelem stanovení identity a umístění některých míst působení restrikčních edonukleáz. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v následujícím obr. 6. 31

Syntéza peptidu, obdobného SGH Úroveň produkce bílkoviny závisí na dvou hlavních faktorech, a to na počtu kopií genu v buňce a na účinnosti, s níž dochází k transkripci a translaci těchto genových kopií. Účinnost transkripce a translace opět závisí (protože jde vlastně o úplnou expresi) na sledu nukleotidů, který je za normálních podmínek u-ložen před sledem, který je kódem pro požadovanou bílkovinu. Tento nukleotidový sled (řídící sled pro expresi) definuje mimo jiné místo, v němž působí RNA polyme-ráza při počátku transkripce ( sled promotoru) a v němž se ribosomy váží za vzniku vzájemného působení ribosomů a mKNA, která je produktem transkripce, čímž dochází k translaci. Všechny řídící sledy pro expresi nepůsobí se stejnou účinností. Je tedy výhodné oddělit specifický sled, který je kódem pro požadovanou bílkovinu od přilehlých sledů a spojit několik těchto sledů místo jejich spojování s jinými řídícími sledy pro expresi, čímž je možno ód sáhnout vyšší úroveň exprese. Jakmile je tohoto 32 cíle dosaženo, je možno včlenit nový konstruovaný sled DNA do plasmidu nebo bakteriofágu za účelem zvýšení počtu kopií genu v buňce, což vede k vyššímu výtěžku bílkoviny při expresi. Při výrobě polypeptidů, podobných SGH je tedy možno užít širokou škálu hostitelů a řídících sledů pro expresi ve vektoru, aniž by přitom došlo k odchylkám od smyslu vynálezu. Použitelné vektory mohou například sestávat z částí chromo^omélních, nechromo£omálních a syntetických sledů DNA, jako například z různých známých plasmidů bakterií, jako E. coli včetně col El, pCRl, pBR322 a jejich derivátů, dále může jít o plasmidy širší hostitelské oblasti, například BP4, fág DNA, například četné deriváty fégu lambda a vektorů, odvezených od svrchu uvedených kombinací, například vektorů, které obsahují část pBR322, část fágu lambda a synthetickou část. Použitelným hostitelem jsou zejména bakteriální hostitelé, například kmeny E. coli, například E. coli K12 MC1061, E. coli HB 101, E.coli X1776, E.coli X2282, E.coli IvIRCI a kmeny $ Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus a další bacily, kvasinky a jiné houby, hostitelé živočišného nebo rostlinného pů- 33 vodu jako živočišné buňky ( včetně lidských) nebo rostlinné buňky v kultuře nebo může jít ještě o jiné hostitele. Použitelné řídící sledy pro expresi mohou obsahovat operátor, promotor, sledy pro vazbu ribosomů a interakční sledy ( včetně sledů typu Shine-Dalgarnova) laktozového operonu E. coli ("lac-systém"), odpovídající sledy tryptofansynthetázového systému E.coli ("trp-sys-tém"), hlavní oblasti operátoru a promotoru fágu lambda (0LPL a ), řídící sled pro obalovou fd bílkovinu fágu nebo jiné sledy, které řídí expresi genů prokaryotic kých nebo eukaryotických buněk a jejich virů nebo této expresi napomáhají a různé jejich kombinace.

Je samozřejmé, že ne všechny kombinace hostitele, řídícího sledu pro expresi a vektoru nejsou stejně účinné v případě určitého kódového sledu DNA. Při provádění způsobu podle vynálezu je však vždy možno zvolit vhodnou kombinaci s ohledem na biologickou bezpečnost, na místa, která dovolují zvláštní konstrukce při použití sledu DNA, který je kódem pro SGH, na velikost polypep-tidů, podobných SGH, k jejichž expresi má dojít, na citlivost těchto polypeptidů na proteolytickou degradaci působením enzymů hostitelské buňky, na možnost znečištění těchto polypeptidů bílkovinami buňky hostitele, 34 které je pak nesnadné odstranit v průběhu čištění, na vlastnosti exprese sledů, které jsou kódem pro SGH nebo podobné látky, na strukturu sledu DNA a umístění kodonu pro počátek a konec vzhledem k řídícím sledům pro expresi a na další faktory#

Existuje také celá řada způsobů pro včlenění sledu DNA a expresi řídícího sledu ve vektoru. Jde například o přímou vazbu, syntetické vazebné sledy, reakce s použitím exonukleáť^a pak polymeréz s následnou vazbou, o rozšíření řetězce DNA působením DNA-polymerá-zy a příslušného templétu s jednoduchým řetězcem s následnou vazbou, a podobně. Kterýkoliv z těchto způsobů je možno použít při syntéze polypeptidů, podobných SGH způsobem podle vynálezu.

Je nutno také uvést, že při dosažení exprese sledu DNA ve zvolené kombinaci hostitele, řídícího sledu pro expresi a vektoru může dojít ke vzniku produktů, které nejsou totožné s SGH. Například může dojít k tomu, že sled DNA, jehož exprese je dosaženo je kódem pro SGH je vlastně kódem pro SGH a methionin nebo část nebo celý signální sled SGH nebo pro jiné Aminokyseliny, které se v SGH nevyskytují. Může také dojít k tomu, že 35 sled DNA, k jehož expresi dojde, je kódem pouze pro část nebo části samotného SGH nebo SGH spolu s/methioninem nebo jinými aminokyselinami. Obě tyto možnosti jsou zahrnuty do způsobu podle vynálezu.Například hostitel, transformovaný sledem nukleotidů pro prekursor růstového hormonu vepře f-met-SGH může produkovat tuto sloučeninu, podobnou SGH jako takovou nebo spojenou s dalšími aminokyselinami nebo může produkovat přímo SGH. Vše, čeho je zapotřebí jeřáby produkt po izolaci z fermentační-ho prostředí nebo po giném běžném zpracování jako Štěpení, syntetické vazbě nebo jiném postupu;měl biologickou účinnost SGH.

Je také nutno uvést, že f-Met nebo jiné aminokyseliny, nevyskytující se v SGH nebo některé ami-> nokyseliny, vlastní SGH, avšak neovlivňující jeho účinnost je možno odstranit chemicky nebo enzjnaaticky před použitím produktu. Je také možné, že tyto látky budou odštěpeny buňkou hostitele v průběhu exprese. Při provádění způsobu podle vynálezu byla pro expresi polypeptidu, podobného růstovému hormonu vepře zvolena konstrukce SGH-&7· Struktura takto připravené molekuly je znázorněna na obr. 7·

Nejprve byla z E.coli K12 Λ (pBGH-^9(Ser)) (dar Gary Buella) izolována část pBGH-^9(Ser) a kultura 36 byla uložena do American Type Collection 16* srpna 1982 pod číslem 39 174. $lo o izolaci plasmidu v podstatě způsobem podle publikace R.D. Klein a další, Plasmid, 3» str/. 88 až 91 (1980). Pak byl tento plasmid rozštěpen restrikčními endonukleázami EcoRI a BamHI a fragment EcoRI-BamHI byl izolován jako fragment A, jak je zřejmé z obr.7. Pak byl tentýž plasmid rozštěpen působením enzymů EcoRI a HgiA^ a byl izolován fragment EcoEI-HgiA^ o 88 párech baží jako fragment B, jak je rovněž zřejmé z obr. 7. Pak byl tentýž plasmid rozštěpen enzymy PvuII a BamHI a byl izolován fragment PvuII-BamHI o 103 pórech baží jak fragment C, znázorněný.rovněž na obr. 7.

Pak byl rozštěpen pSGK-9D, popsaný svrchu, působením HgiA^ a PvuII při použití v podstatě týchž podmínek a byla izolována část sledu SGH od místa pro působení HgiA^ (GTGCT^C) do místa působení PvuII (CAG^CTG), jak je zřejmé z obr. 7 a 8. Pak byl tento fragment navázán na svrchu uvedené tři fragmenty A, B a C, připravené I z pBGH-^9(Ser) za použití standardních podmínek a enzymu T4 DNA-ligézy při teplotě 16^C přes noc.

Protože existuje podobnost sledů pro BGH ( pBGH-^9(Ser) a pSGH-9E]Z ^ může také dojít k de-

37 generaci genetického koňů. Patrně v kůstečku toho rekcm-binantní molekula DKA, která je výsledkem svrchu uvedené vazbyje kočen prc polypeptid podobný £GH, který je uspořádán tak, že po počáteční skupině f-Met chybí prvních 7 auinckyselin, jak je zřejmé z obr* 7 a §.

Sled, který je kódem pr© SGH obsahuje tri nukleotidy, které jscu odlišné od kódu -'i r*. -r-v. O pl G MO Z Π ώ zorněného ηε obr. 4 a 5« dva z těchto 1 ?©zdílů působeny re zdíle/a o .ez-i kód C-lí: pro EGK a pro SGH (řrag- enty A a C na obr. S). Třetí rozčil p r arení ze zvláštní onstrukce, nterý bv da u žita, aby bylo možno získat PďGHA-9 (Ser), jak je zřejmé z řragnentu C na obr. 6, Ani jeden z těchto rozdílů není příčinou změn ve slet aminokyselin, polypeptidu, pcdchnáho SGH, pro nějž je kódem včleněný sledí DKA v pSGH-. {\ 7» jť&k .o trsnsfornováno 2CG /ul E. coli za přítomnosti 10 yu± K12 lambda (der \.alter Piers) p oinuty při 10' 0; Ί 10 řinut při tepl ct onu L o buňky se po C_j. 0,lk chloridu hořečnatého zchlazením buněk v ledu ia 15 minut s následnou inkubací j a rab c následnou inrubac hodinu při teplotě 37(°C s pak se vždy 200 ^ul nanese co Petřino misky s obsaher: bujónu L·· ε 50 ^ug/nl anpicilinu* 38

Byly pěstovány kultury každého z těchto klonů, v 5 ml bujónu L, doplněného 50 ^ug/ml ampicillinu po dobu 12 hodin při teplotě 3^0 a pak byla čištěná plasmidová DHA z 1 ml buněk z každé kultury způsobem miniprep, popsa- ným ve svrchu uvedené publikaci kleina a dalších. Pak byla zjištěna dékla fragmentů včleněných ve 24 plasmidech po restrikci restrikčními endonukleázami BcoRI-BamHI s následnou frakcionací na polyakrjflamidovém gelu. Bylo zvoleno 5 fragmentů, které obsahovaly včleněné sledy příslušné délky. Pak byl kmen Escherichia coli MC1061 transformován v podstatě způeobem, uvedeným v publikaci G.N.Buell a další, J. Biol. Chem. 254, str. 9270-83 (1979) jedním z těchto klonů, který byl označen pSGH-ZÍ7. Pak byly buňky transformovány rovněž pcI857 (dar W.Pierse). [pcI857 je malý plasmid, který nese represor P^, citlivý na teplotu a gen, který přenáší odolnost proti kanamycinuj. Buňky, transformované plasmidy pSGH-^ 7 a pcI857 byly podrobeny selekci tak, že kolonie byly pěstovány 16 hodin při teplotě 3o|°C v bujónu I», doplněném ampicillinem v dávce 50 yul/ml a kanamycinem v dávce 40 ^ul/ml.

Pak byly náhodně izolovány kolonie, které byly 39 odolné proti ampicillinu a kanamycinu a tyto kolonie byly pěstovány p^/jšes noc v bujónu 1, doplněném ampicillinem a kanamycinem ve svrchu uvedených dávkách při teplotě 3o(°0. Pak byly kultury zředěny 25 ml bujónu L při teplotě 42(0 C a pak byly pěstovány 2 hodiny při teplotě 42^C, (O.D.=l)o

Aby bylo možno izolovat polypeptidy, produkované takto transformovanými buňkami, byl odebrán vždy 1 ml buněk, toto množství bylo odstředěno při 8000 otáčkách za minutu, pak bylo přidáno 50 ^ul laanliho pufru i s 1 % SDS , pufr byl popsán v publikaci Laemmli, Nátuře, 227, str. 681 a následující (1970), pak byla směs povařena 15 minut a buňky byly opět odstředěny při 8000 otáčkách za minutu k odstranění buněčné drti (4 minuty). Pak byl supernatant sledován kompetitivní radioimunologickou zkouškou na SGH při použití králičího antiséra proti autentickému BGH. Výtěžek účinnosti SGH v mg/litr je 32. Bylo možno prokázat 1,6 . 10^ SGH-podobných molekul v jedné buňce.

Je tedy zřejmé, že sledy DNA a rekombinantní molekuly DNA, získané způsobem podle vynálezu dovolují produkci pólypeptidd, podobných SGH ve vysokém výtěžku. 40

Mimoto sledy, molekuly a způsoby podle vynálezu dovolují výrobu nových polypeptidů, podobných SGH a použitelných po příslušném Čištění běžným způsobem jako obecná anabo-lika u vepřů, zvláště ke zvýšení rychlosti růstu, přírůst ků na hmotnosti a produkce masa u těchto zvířat* Při svrchu uvedeném provedení způsobu podle vynálezu pro výrobu polypeptidů podobných SGH je možno získat polypeptid uvedeného typu, jemuž chybí prvních 7 aminokyselin autentického hormonu a který obsahuje f-Met, je však zřejmé, že je možno uskutečnit celou řadu dalších konstrukcí a tak získat další polypaptidy, podobné SGH, aniž by přitom došlo k odchýlení od způsobu podle vynálezu. Je například možno provést konstrukci, v níž kodon ATG $x.et&peěúš?! pro počátek translace nebo kodon ATG spolu s dalšími kodony jsou přímo spojeny s kodonem TTC, který je kódem pro první aminokyselinu autentického SGH0 Tato •konstrukce by dovolila produkci zralého SGH, spojeného s f-Met nebo přes další aminokyseliny spojeného s f-Met.

[ Je nutno uvést, že jakákoliv aminokyselina, která není částí zralého SGH nebo jakákoliv neaktivní aminokyselina, obvykle obsažená v SGH může být odstraněna v průběhu exprese nebo po expresi před použitím polypeptidů k podání zvířatům^ 41

Je vsak výhodné užít pSGETvE.ccli HB101 pro výrobu pólypa tidů způsobem podle vynálezu, protože při jejich použití je možno získat vyšší výtěžky.

Jeden ze způsobů, vhodných pro přípravě konstrukcí, které jsou kódem pro f-Met-zralý SGH je znázorněn na obr. $ a 10. Při tomto provedení byla uskutečněna restrikce p-SGH-9D pomocí enzymu Haell, pak byly odstraněny nukleotidy, zbývající před kodonem TTC, který je kódem pro a aminokyselinu 1 zralého SGH a zbývající fragment byl podroben restrikci působením Ava I k izolaci 5-zakončení zralého SGH, které začíná kodonem TT.C*

Pak byl tento fragment spojen s fragmentem Aval-BamHI z pSGH- ά7, který je kódem pro zakončení 3- zralého SGH. Pak byl tento fragment včleněn do vektoru pro klonování, odvozeného od pBGK- A9(Ser), jak bylo svrchu popsáno, takže kodon TTC je spojen s kodcram ATG. Tato konstrukce umožňuje [pSGH-Ulet-Phe)] produkci f-Mat-zra-lého SGH v příslušných hostitelíche

Je zřejmé, že je možno získat nové polypeptidy, podobné SGH a obsahující změny v aminokyselinách nebo vypuštěné aminokyseliny ve srovnání s autentickým SGH příslušnou konstrukcí DNA nebo chemickou nebo enzymatickou 42 reakcí po výrobě polypeptidu. Svrchu uvedeným způsobem byl například připraven Δ 3-SGH. Tyto konstrukce a výsledné polypetidy rovněž tvoří součást vynálezu.

Je zřejmé, že ne všechny konstrukce tohoto typu budou stejně účinné při produkci požadovaných polypep tidů, podobných SGH. Odborník však snadno může zvolit konstrukci a polypeptid, vhodný pro určitý systém pro expresi, hostitele a aplikaci při použití svrchu popsaných postupů.

Svrchu uvedené polypeptidy, podobné SGH je možno užít po příslušném čištění k aplikaci vepřům běžným způsobem pro podávání růstového hormonu zvířatům, jak bylo popsáno například ve svrchu uvedené publikaci E.J0 'lýrju^nana a dalších ke zvýšení rychlosti růstu a produkce masa u těchto zvířat. Například SGH-A7, vyrobený svrchu uvedeným způsobem zajištuje u krys stejný přírůstek jako přírodní SGH.

Mikroorganismy a rekombinantní molekuly DNA, připravené způsobem podle vynálezu byly uloženy do sbírky American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA 15. září 1982 a byly označeny jako SGH-A a B: 43 Λ: B.coli Κ12 MC1061 (pSGH-9D) B: Bo co li K12 lambda (pSGH- Δ 7)

Tyto kultury byly označeny podle poradí svého uložení čísly ATCC 39191 a ATCC 39192.

Vynález byl svrchu popsán na základe některých provedení, je vsak zřejmé, že základní konstrukce může být pozměněna za získání dalších provedení, která budou rovněž spadat do oboru vynálezu.

Claims (7)

1. - I - ?(/ </} -η Η 1 L g Ρ # Τ' Τ) Iif U' Γ Γι *J J JHi i. Způsob výroby polypeptid,u s biologickou účinností růstového hormonu vepře, vjy/zjh^-č}jfj}φ(ί(1 s(e((tjí^n, že se pěstuje hostitel, transformovaný rekombinantní molekulou DNA, charakterizovanou sledem DNA ze skupiny a) včleněných sledů pS3K-SI>, pSGK-^ 7 a pSGK-(Met-Fhe), b) včleněných sledů, v nichž je vypuštěna část sledu ns 5#-terminálním zakončení sledu úplného růstového hormonu, vepře a které jsou při expresi kódem pro polypeptid s biologickou účinností růstového hormonu vepře a c) sledů DMA, které degenrují v důsledku genetického kódu na některý ze svrchu uvedených řetězců DNA nebo včleněných sledů a které jsou při expresi kódem pro polypeptid s biologickou účinností růstového hormonu vepře, přičemž tento sled je operativně vázán na řídící sled exprese v rekombinantní molekule DNA a při jeho expresi dochází k produkci uvedeného polypeptidu v případě pěstování hostitele, transfer mcvoného touto?rekombinantní molekulovou DM. i - TT -
2. 2. Způsob podle Φΐ°Ι^ll> %e se polypeptid volí ze skupiny póly-’* pepwidu Met-AA^ sz Aá-^q růstového hormonu vepře, AÁl“AAl$0 letového.hormonu vepře, Met-AAg-AA^ OQ růstového hormonu vepře, AAg-AA.,růstového hormonu vepře a dalších polypeptidů s biologickou účinností růstového hormonu vepře, pro něž jsou kódem řetězce DM s vypuštěnou částí sledu na 5^-terainélníu zákonce ní sledu DM, který je kódem pro úplný růstový hormon vepře. /yvA
3. 3- Způsob podle fer&éřu 2, že se polypeptid volí ze skupiny polypeptidů Met.-AA.g-AA. růstového hormonu vepře a AAg -A.A. růstového hormonu vepřed', ibu
4. 4. Způsob podle boču 1, fs/é^t^m, že se řídící sled pro expresi volí ze skupiny lac, systému, trp systému, oblasti hlavního promotoru a operátoru íégu lambda, řídící oblasti obalové bílkoviny íd 3 jiných sledů, které řídí. expresi genu prokaryotických nebe eukaryotických buněk a jejich virů s jejich kombinací. /t&rofcn
5. 5. Způsob podle -fce-áw- 1, Mí Ne Nik, že se transformovaný hostitel volí ze III skupiny E. coli, Fseudcmonss, Becillus subtilis, Βε-cillus stearothermophilus a dalších bacilů, kvasinek a jiných xtstk hub, nebo hostitelů živočišného nebo rostlinného původu.

   mmcAJí
6. 6. Způsob podle -hniu 5, j(£^|íl[^eK1j^m, že se transformovaný hostitel volí z kmenů E. coli K12, identifikovaných čísly ATCC 39191 a 39192. /vdírofíM.
7. 7- Způsob podle "bodu 1, vfytyrjkjČjU-^ίΙΙψ/^φι, že se jako rekombinantní molekuly užije pSGH-A 7 ♦ 6. Způsob podle 'betSi* 1, že se jako rekombinantní molekuly užije molekuly pSGH-(Ket-Fhe).