RS113904A - Ribofuranozil-citidinski estar 2'-c- metil-3'-0-l-valina za lečenje flaviridae infekcije - Google Patents

Abstract

3'-L-valinski estar ?-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina daje izvanredne rezultate protiv flavivirusa i pestivirusa, uključujući virus hepatitisa C. Na osnovu ovog otkrića obezbedjuju se jedinjenja, smeše, postupci i upotrebe za lečenje od flavivirida, po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U alternativnom vidu, val. mCyd se kroisti za lečenje od svakog virusa koji se replicira preko RNK-zavisne RNK-polimeraze.

Description

l'-C-METIL-S'-O-L-VALINSKI ESTAR RIBOFURANOZIL CITIDINA

ZA LEČENJE INFEKCIJA KOJE IZAZIVAJUFLA VIVIRIDAE

Upućivanje na srodne prijave

Ova prijava zahteva prioritet na osnovu U. S. Provisional application No. 60/392,351, podnete 28. juna 2002; U. S. Provisional application No. 60/466,194, podnete 28. aprila 2003; i U. S. Provisional application No. 60/470,949 pod naslovom "Nukleozidi za lečenje infekcija koronavirusima, togavirusima i pikornavirusima" ("Nucleosides for the Treatment of Infections by Coronaviruses, Togaviruses and Picornaviruses"), podnete 14. maja 2003; otkrića svake od njih su ovde uključena kao referenca.

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak je iz oblasti farmaceutske hernije i, preciznije, to je 2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estar, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, derivati i prolekovi, njihova sinteza i njihova upotreba kao antiflaviviridnih sredstava za lečenje domaćina, naročito ljudi, inficiranihFlaviviridae- ama,i naročito virusom hepatitisa C.

Osnova pronalaska

Flaviviridaevirusi

Familija virusaFlaviviridaeobuhvata bar tri zasebna roda: pestiviruse, koji prouzrokuju oboljenje kod goveda i svinja; flaviviruse koji su primarni izazivači oboljenja kao što su tropska (kostolomna) groznica i žuta groznica: i hepaciviruse čiji je jedini član HCV. Rod flavivirusa uključuje preko 68 članova svrstanih u grupe na osnovu serološke srodnosti (Calisher et al.,J. Gen. Virol.1993,70,37-43). Klinički simptomi su različiti i uključuju groznicu, encefalitis i hemoragičnu groznicu( Fields Virology,Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M. and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959). Flavivirusi od globalnog značaja su oni koji su vezani za oboljenja ljudi i obuhvataju viruse tropske (kostolomne) hemoragične groznice( dengue hemorrhagic fever,DHF), viruse žute groznice, sindroma šoka i virus japanskog encefalitisa (Halstead, S. B.,Rev. Infect. Dis.1984,6,251-264; Halstead, S. B.,Science 239,476-481, 1988; Monath, T. P.,New Eng. J. Med. 319,641-643, 1988).

Rod pestivirusa uključuje virus goveđe virusne dijaree( bovine viral diarrhea virus,BVDV), virus klasične svinjske groznice{ classical sM' ine fever virus,CSFV, nazvan još i virus svinjske kolere), i virus pogranične bolesti ovaca( border disease virus,BDV) (Moenning, V. et al.,Adv. Vir. Res.1992,41,53-98). Infekcije domestifikovane stoke (goveda, svinje i ovce) pestivirusima mogu širom sveta izazvati značajne ekonomske gubitke. BVDV prouzrokuje mukozno oboljenje goveda i od velikog je ekonomskog značaja za stočnu industriju (Mevers, G. and Thiel, H.-J.,Advances in Virus Research,1996,47,53-118; Moenning, V. et al.,Adv. Vir. Res.1992,41,53-98). Humani pestivirusi nisu tako ekstenzivno okarakterisani kao životinjski pestivirusi. Međutim, serološka ispitivanja ukazuju na značajnu izloženost ljudi pestivirusima.

Pestivirusi i hepacivirusi su blisko povezane grupe virusa koji pripadaju familijiFlaviviridae.Drugi srodni virusi iz ove familije su GB virus A, GB virusu A slični agensi, GB virus-B i GB virus-C (takođe nazvani i virus hepatitisa G, HGV). Grupa hepacivirusa (virus hepatitisa C,hepatitis C virus,HCV) sastoji se od brojnih blisko povezanih ali genotipski različitih virusa koji inficiraju ljude. Postoji približno 6 HCV genotipova i više od 50 subtipova. Usled sličnosti između pestivirusa i hepacivirusa, zajedno sa lošom sposobnošću hepacivirusa da efikasno rastu u kulturi ćelija, virus goveđe virusne dijaree (BVDV) često se koristi kao surogat pri proučavanju HCV virusa

Genetička organizacija pestivirusa i hepacivirusa je veoma slična. Ovi virusi sa pozitivnim lancem RNK poseduju jedan veliki otvoreni ram čitanja{ ppen readingframe,ORF) koji kodira sve virusne proteine neophodne za replikaciju virusa. Ovi proteini se eksprimiraju u vidu poliproteina koji se ko- i post-translaciono procesuju ćelijskim i virusnim proteazama da bi se dobili gotovi virusni proteini. Proteini virusa odgovorni za replikaciju virusnog RNK-genoma locirani su u blizini karboksi-terminusa. Dve trećine ORF odnosi se na nestrukturne (NS) proteine. Genetička organizacija i procesovanje poliproteina nestrukturno-proteinskog dela ORF, veoma su slični kod pestivirusa i hepacivirusa. I kod pestivirusa i kod hepacivirusa, gotovi nestrukturni (NS) proteini, redom od amino-terminusa regiona koji kodira nestrukturni protein, prema karboksi-terminusu ORF-a, sadrže p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B.

NS proteini pestivirusa i hepacivirusa imaju iste sekvence domena karakterističnih za specifične funkcije proteina. Na primer, NS3 proteini virusa iz obe grupe poseduju amino-kiselinske sekvencione motive koji su karakteristika serin-proteinaza i helikaza (Gorbalenva et al. (1988)Nature 333,22; Bazan and Fletterick (1989)Virology 171, 637-639;Gorbalenva et al. (1989)Nucleic Acid Res. 17,3889-3897). Slično, NS5B proteini pestivirusa i hepacivirusa imaju karakteristike motiva RNK-usmerenih RNK polimeraza (Koonin, E. V. and Dolja, V. V.

(1993)Cril. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28,375-430).

Aktuelne uloge NS proteina pestivirusa i hepacivirusa u životnom ciklusu virusa, direktno su analoge. U oba slučaja, NS3 serin proteinaza odgovorna je za čitavu proteolitičku obradu poliproteinskih prekursora nishodno od svoje pozicije u ORF (Wiskerchen and Collett

(1991)Virology 184,341-350; Bartenschlager et al. (1993)J. Virol. 67,3835-3844; Eckart et al. (1993)Biochem. Biophys. Res. Comm. 192,399-406; Grakoui et al. (1993)J. Virol. 67,2832-2843; Grakoui et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,10583-10587; Hijikata et al.

(1993) J. Virol. 67,4665-4675; Tome et al. (1993)J. Virol.67, 4017-4026). Protein NS4A, u oba slučaja, deluje kao kofaktor saNS3 serin proteazom (Bartenschlager et al. (1994)J. Virol.68, 5045-5055; Failla et al. (1994)J. Virol.68, 3753-3760; Lin et al. (1994) 68, 8147-8157; Xu et al. (1997)J. Virol.71, 5312-5322). Protein NS3 oba virusa funkcioniše i kao helikaza (Kim et al. (1995)Biochem. Biophys. Res. Comm.215, 160-166; Jin and Peterson (1995)Arch. Biochem. Biophys.323, 47-53; Warrener and Collett (1995)J. Virol.69, 1720-1726). Konačno, NS5B proteini pestivirusa i hepacivirusa imaju predviđenu aktivnost RNK-usmerenih RNK polimeraza (Behrens et al. (1996)EMBO J.15, 12-22; Lchmannet et al. (1997)J. Virol. 71,8416-8428; Yuan et al. (1997)Biochem. Biophys. Res. Comm.232, 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al.(1998) J. Virol.72, 9365-9369).

Virus hepatitisa C

Virus hepatitisa C (HCV) vodeći je uzročnik hroničnog oboljenja jetre, širom sveta (Boyer, N. et al.,J. Hepatol.32, 98-112, 2000). HCV izaziva spororazvijajuću virusnu infekciju i glavni je prouzrokovač ciroze i hepatocelularnog karcinoma (Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. RScientific American,Oct., 80-85, (1999); Boyer, N. et al.,J. Hepatol.32, 98-112, 2000). Procenjuje se da je 170 miliona ljudi širom sveta inficirano HCV-om (Boyer, N. et al.,J. Hepatol.32, 98-112, 2000). Ciroza izazvana hroničnom infekcijom hepatitisom C odgovorna je za 8,000-12,000 smrtnih slučajeva godišnje u Sjedinjenim Američkim Državama, a HCV-infekcija je vodeća indikacija za transplantaciju jetre.

Poznato je da HCV izaziva bar 80% posttransfuzionih hepatitisa i značajan broj slučajeva sporadičnog akutnog hepatitisa. Preliminarni podaci takođe povezuju HCV sa mnogim slučajevima "idiopatskog" hroničnog hepatitisa, "kriptogene" ciroze, i verovatno hepatocelularnog karcinoma koji nisu u vezi sa drugim virusima hepatitisa na pr. virusom hepatitisa B (HBV). Izgleda da među zdravim ljudima postoji mali broj hroničnih nosilaca HCV, u zavisnosti od geografskih i drugih epidemioloških faktora. Moguće je da njihov broj nadmašuje onaj za HBV, iako su podaci još uvek preliminarni; nije jasno koliko od ovih osoba ima hronično subkliničko oboljenje jetre (The Merck Manual, ch. 69, p. 901, 16th ed., (1992)).

HCV je virus sa omotačem, sadrži pozitivni jednolančani RNK genom od približno 9.4 kb. Virusni genom se sastoji od 5'-netranslatujućeg regiona( untranslated region,UTR), dugog otvorenog rama čitanja koji kodira poliproteinski prekursor od približno 3011 amino-kiselina, i kratkog 3' UTR. 5' UTR je najviše konzervisan deo genoma HCV-a i važan je za inicijaciju i kontrolu translacije poliproteina. Translacija HCV genoma inicirana je cap-nezavisnim mehanizmom poznatim kao unutrašnji ulazak ribozoma. Ovaj mehanizam uključuje vezivanje ribozoma za RNK sekvencu poznatu kao mesto unutrašnjeg ulaska ribozoma( internal ribosome entry site,IRES). Nedavno je determinisano da je RNK-pseudopetljasta struktura esencijalni strukturni element IRES-a HCV-a. Virusni strukturni proteini uključuju sržni protein nukleokapsida (C) i dva glikoproteina omotača, El i E2. HCV takođe kodira dve proteinaze, cink-zavisnu metal oprote i nazu kodiranu NS2-NS3 regionom i serin proteinazu kodiranu u NS3 regionu. Ove proteinaze su potrebne za cepanje specifičnih regiona prekursornog poliproteina u zrele peptide. Karboksilna polovina nestrukturnog proteina 5, NS5B, sadrži RNK-zavisnu RNK polimerazu. Funkcija ostalih nestrukturnih proteina, NS4A i NS4B, kao i NS5A (amino-terminalna polovina nestrukturnog proteina 5) ostaje nepoznata.

Sadašnja interesovanja u antivirusnim studijama u značajnoj meri su usmerena na razvoj i poboljšanje metoda za lečenje hroničnih HCV-infekcija kod ljudi (Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. RScientific American,Oct., 80-85, (1999)).

Lečenje HCV- infekcija interferonom

Interferoni (IFNs) su gotovo deset godina komecijalno dostupni za lečenje hroničnog hepatitisa. IFNs su glikoproteini koje proizvode imune ćelije u odgovoru na infekciju virusom. IFNs inhibiraju replikaciju velikog broja virusa, uključujući HCV, i kada se koriste kao jedini tretman za infekcije hepatitisom C, IFN mogu u nekim slučajevima da svedu HCV-RNK u serumu do nedetektabilnih nivoa. Pored toga, IFN može da normalizuje nivoe amino-transferaza u serumu. Na žalost, efekat IFN je privremen i produženi odgovor se sreće kod samo 8%-9% pacijenata hronično inficiranih HCV-om (Gary L. Daviš,Gastroenterology118, S104-S114, 2000). Većina pacijenata, međutim, ima problema sa podnošenjem lečenja interferonom, koji izaziva jake simptome slične gripu, gubitak težine i nedostatak energije i izdržljivosti.

Mnogi patenti otkrivaju načine lečenja od flavivirida, uključujući HCV, korišćenjem terapija zasnovanih na interferonu. Na primer, U. S. Patent No. 5,980,884, Blatt et al. otkriva postupke za lečenje pacijenata pogođenih HCV-om uz korišćenje konsenzusnog interferona. U. S. Patent No. 5,942,223, Bazer et al., otkriva anti-HCV terapiju uz korišćenje ovčijeg ili goveđeg interferona-tau. U. S. Patent No. 5,928,636, Alber et al., otkriva kombinacionu terapiju interleukinom-12 i interferonom alfa za lečenje infektivnih bolesti, uključujući HCV. U. S. Patent No. 5,849,696, Chretien et al., otkriva korišćenje timozina, samog ili u kombinaciji sa interferonom, za lečenje HCV. U. S. Patent No. 5,830,455, Valtuena et al., otkriva kombinacionu terapiju za lečenje HCV u kojoj se upotrebljavaju interferon i sakupljač slobodnih radikala. U. S. Patent No. 5,738,845, Imakavva, otkriva korišćenje humanih interferon-tau proteina za lečenje HCV. Drugi načini lečenja HCV zasnovani na interferonu otkriveni su u U. S. Patent No. 5,676,942, Testa et al., U. S. Patent No. 5,372,808, Blatt et al., i U. S. Patent No. 5,849,696. Brojni patenti takođe otkrivaju pegilisane forme interferona, na pr. U. S. Patent Nos. 5,747,646, 5,792,834 i 5,834,594, Hoffmann-La Roche Ine; PCT Publication No. WO 99/32139 i WO 99/32140, Enzon; WO 95/13090 i U. S. Patent Nos. 5,738,846 i 5,711944, Schering; i U. S. Patent No.5.908,621, Glue et al.

Interferon alfa-2a i interferon alfa-2b trenutno su priznati kao monoterapija za lečenje HCV. ROFERON<®->A (Roche) je rekombinantna forma interferona alfa-2a. PEGASYS<®>

(Roche) je pegilisana (tj. poletilenglikolom modifikovana) forma interferona alfa-2a. INTRON<®>A (Schering Corporation) je rekombinantna forma interferona alfa-2b, i PEG-INTRON<®>(Schering Corporation) je pegilisana forma interferona alfa-2b.

Druge forme interferona alfa, kao i interferona beta, gama, tau i omega, trenutno se klinički razvijaju, za lečenje HCV-a. Na primer, razvijaju se INFERGEN (interferon alfakon-1), Inter Mune, OMNIFERON (prirodni interferon), Viragen, ALBUFERON, Human Genome Sciences, REBIF (interferon beta-la), Ares Serono, Omega interferon, BioMedicine, Oralni interferon alfa, Amarillo Biosciences, i interferon gama, interferon tau i interferon gama-lb, Inter Mune.

Ribavirin

Ribavirin (l-P-D-ribofuranozil-l-l,2,4-triazol-3-karboksamid) je sintetski, interferon-neindukujući antivirusni nukleozidni analog širokog spektra koji se prodaje pod zaštićenim imenom Virazole (The Merck Index, 1 lth edition. Editor: Budavari, S., Merck&Co., Inc., Rahway, NJ, p.1304, 1989). United States Patent No. 3,798,209 i RE29,835 otkriva i zahteva ribavirin. Ribavirin je strukturno sličan guanozinu, i pokazujein vitroaktivnost protiv nekoliko DNK i RNK virusa uključujućiFlaviviridae(Gary L. Daviš,Gastroenterology118, S104-S114, 2000).

Ribavirin snižava nivoe amino-transferaza u serumu na normalu kod 40% pacijenata, ali ne snižava serumske nivoe HCV-RNK (Gary L. Daviš,Gastroenterology118, S104-S114, 2000). Prema tome, ribavirin sam nije efikasan u smanjenju nivoa virusne RNK. Pored toga, ribavirin ispoljava značajnu toksičnost i poznato je da indukuje anemiju.

Ribavirin nije odobren kao monoterapija protiv HCV. Odobren je u kombinaciji sa interferonom-2a ili interferonom-2b, za lečenje HCV.

Kombinacija interferona i ribavirina

Trenutni standard u kontroli hroničnog hepatitisa C je kombinovana terapija alfa interferonom i ribavirinom. Saopšteno je da je kombinacija interferona i ribavirina za lečenje HCV-infekcija efikasna u lečenju pacijenata koji ranije nisu lečeni interferonom (Battaglia, A. M. et al.,Ann. Pharmacother.34, 487-494, 2000) kao i za lečenje pacijenata kod kojih je prisutno histološko oboljenje (Berenguer, M. etal., Antivir. Ther.3 (Suppl. 3): 125-136, 1998). Ispitivanja su pokazala da veći broj pacijenata sa hepatitisom C odgovara na kombinovanu terapiju pegilisanim interferonom-alfa/ribavirinom nego na kombinovanu terapiju nepegilisanim interferonom alfa. Međutim, kao i kod monoterapije, tokom kombinovane terapije javljaju se značajni sporedni efekti, uključujući hemolizu, simptome slične gripu, anemiju, i zamor (Gary L. Daviš,Gastroenterology118, S104-S114, 2000).

Kombinovana terapija sa PEG-INTRON<®>(peginterferon alfa-2b) i REBETOL<®>

(Ribavirin, USP) kapsulama, dostupna je preko Schering Corporation. REBETOL<®>(Schering Corporation) takođe je odobren u kombinaciji sa INTRON<®>A (interferon alfa-2b, rekombinantni, Schering Corporation). Roche-ov PEGASYS<®>(pegilisani interferon alfa-2a) i COPEGUS<®>(ribavirin) takođe su odobreni za lečenje od HCV-a.

PCT Publication Nos. WO 99/59621, WO 00/37110, WO 01/81359, WO 02/32414 i WO 03/024461, Schering Corporation, otkrivaju korišćenje kombinovane terapije pegilisanim interferonom alfa i ribavirinom za lečenje od HCV-a. PCT Publication Nos. WO 99/15194, WO 99/64016, i WO 00/24355, Hoffmann-La Roche Inc., takođe otkrivaju upotrebu kombinovane terapije pegilisanim interferonom alfa i ribavirinom za lečenje od HCV-a.

Dodatni postupci za lečenje infekcija flaviviridama

Trenutno je u toku razvoj novih antivirusnih sredstava za infekcije flaviviridama, naročito za hepatitis C. Razvijeni su specifični inhibitori enzima poreklom iz HCV-a, kao što su inhibitori proteaze, helikaze, i polimeraze. Lekovi koji inhibiraju druge korake u replikaciji HCV-a takođe su u razvoju, na primer, lekovi koji blokiraju produkciju HCV antigena sa RNK (inhibitori IRES-a), lekovi koji preveniraju normalnu obradu HCV proteina (inhibitori glikozilacije), lekovi koji blokiraju ulazak HCV u ćelije (blokiranjem njegovih receptora) i nespecifična citoprotektivna sredstva koja blokiraju oštećenje ćelije prouzrokovana virusnom infekcijom. Dalje, takođe se razvijaju i molekularni pristupi lečenju hepatitisa C, na primer, ispituju se ribozimi, enzimi koji razgrađuju specifične virusne RNK molekule, kao i besmisleni( antisense)oligonukleotidi, mali komplementarni segmenti DNK koji se vezuju za virusnu RNK i inhibiraju replikaciju virusa. Pregled većeg broja načina lečenja od HCV-a dali su Bvmock et al.,Antiviral Chemistry & Chemiotherapy,11,2; 79-95 (2000) i De Francesco et al.,Antiviral Research,58, 1-16 (2003).

Primeri klasa lekova koji se razvijaju za lečenje infekcija flaviviridama uključuju sledeće:

(1) Inhibitori proteaze

Ispituju se na supstratu bazirani inhibitori NS3-proteaze (Attvvood et al.,Antiviral peptide derivatives,PCT WO 98/22496, 1998; Attvvood et al.,Antiviral Chemistry & Chemiotherapy1999,10, 259-273; Attwood et al.,Preparation and use of amino acid derivatives as anti- viral agents,German Patent Pub. DE 19914474; Tung et al.,Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3 protease,PCT WO 98/17679), uključujući alfaketoamide i hidrazinouree, i inhibitore koji se završavaju elektrofilom kao boronska kiselina( boronic acid))ili fosfonat (Llinas-Brunet et al.,Hepatitis C inhibitor peptide analogues.PCT WO 99/07734).

Isto tako, ispituju se inhibitori NS3-proteaze koji nisu bazirani na supstratu, na pr. derivati 2,4,6-trihidroksi-3-nitro-benzamida (Sudo, K. et al.,Biochemical and Biophysical research Communications,1997,238,643-647; Sudo, K. et al.,Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9,186), uključujući RD3-4082 i RD3-4078, prvi supstituisan naamidu sa 14-ugljeničnim lancem, a drugi obrađen para-fenoksifenil grupom.

Sch 68631, fenantrenhinon, je inhibitor proteaze HCV-a (Chu, M. et al.,Tetrahedron Letters37, 7229-7232, 1996). U drugom primeru istih autora, Sch 351633, izolovan iz gljivicePenicillium griseofulvum,identifikovan je kao inhibitor proteaze (Chu, M. et al.,Bioorganic and Medical Chmistry Letters 9,1949-1952). Nanomolarna potentnost protiv NS3 proteaznog enzima HCV-a postiže se dizajniranjem selektivnih inhibitora zasnovanih na makromolekulu eglin c. Eglin c, izolovan iz pijavice, snažan je inhibitor nekoliko serin-proteaza kao što su proteaze S. griseus A i B, a-himotripsin, himaza i subtilizin. Qasim, M. A. et al.,Biochemistrv36, 1598-1607, 1997.

Nekoliko U. S. patenata otkriva inhibitore proteza za lečenje od HCV-a. Na primer, U. S. Patent No. 6,004,933, Spruce et al., otkriva klasu inhibitora cistein-proteaze za inhibiciju HCV-endopeptidaze 2. U. S. Patent No. 5,990,276, Zhang et al., otkriva sintetičke inhibitore NS3-proteaze virusa hepatitisa C. Inhibitor je subsekvenca supstrata NS3-proteaze ili supstrata NS4A kofaktora. Korišćenje restrikcionih enzima za lečenje od HCV-a opisano je u U. S. Patent No. 5,538,865, Reyes et al. Peptidi kao inhibitori NS3 serin-proteaze otkriveni su u WO 02/008251, Corvas International, Ine, i WO 02/08187 i WO 02/008256, Schering Corporation. HCV inhibitorni tripeptidi otkriveni su u U. S. Patent Nos. 6,534,523, 6,410,531, i 6,420,380, Boehringer Ingelheim i WO 02/060926, Bristol Myers Squibb. Diaril peptidi kao inhibitori NS3 serin-proteaze HCV-a otkriveni su u WO 02/48172, Schering Corporation. Imidazolidinoni kao inhibitori NS3 serin-proteaze HCV-a otkriveni su u WO 02/08198, Schering Corporation i WO 02/48157, Bristol Myers Squibb. WO 98/17679, Vertex Pharmaceuticals i WO 02/48116, Bristol Myers Squibb, takođe otkrivaju inhibitore HCV-proteaze. (2) Derivati tiazolidina koji pokazuju relevantnu inhibiciju u reverzno-faznom HPLC testu sa NS3/4A fuzionim proteinom i NS5A/5B supstratom (Sudo K. et al.,Antiviral Research,1996, 32, 9-18), naročito jedinjenje RD-1-6250, koje poseduje fuzionisani cinamoilski deo supstituisan sa dugim alkil lancem, RD4 6205 i RD4 6193; (3) Tiazolidini i benzanilidi identifikovani u Kakiuchi N, et al.,J. EBS Letters 421,217-220; Takeshita N. et al.,Analytical Biochemistrj, 1997, 247, 242-246;(4) Fenantrenhinon koji poseduje aktivnost protiv proteaze u SDS-PAGE i autoradiografskom testu, izolovan iz fermentacionog medijuma kultureStreptomyces sp.,Sch 68631 (Chu M. et al.,Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232),i Sch 351633, izolovan iz gljivicePenicillium griseofulvumkoji pokazuje aktivnost u blizinsko-scincilacionom testu (Chu M., et al.,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9,1949-1952); (5) Inhibitori helikaze (Diana G. D. et al.,Compounds, compositions and methods for treatment of hepatitis C,U. S. Pat. No. 5,633,358; Diana G. D. et al.,Piperidine derivatives, pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C,PCT WO 97/36554); (6) Nukleotidni polimerazni inhibitori i gliotoksin (Ferrari R. et al.,Journal of Virologv,1999,73,1649-1654), i prirodni produkt cerulenin (Lohmann V. et al.,Virology, 1998, 249,108-118); (7) Besmisleni( antisense)fosforotioat oligodeoksinukelotidi (S-ODN) komplementarni sekvencionim nizovima u 5' nekodirajućem regionu (NCR) virusa (Alt M. et al.,Hepatologv,1995, 22, 707-717), ili nukleotidima 326-348 koji uključuju 3' kraj NCR i nukleotidima 371-388 smeštenim u srž-kodirajućem regionu RNK HCV-a (Alt M. et al.,Archives of Virologv,1997, 142, 589-599; Galderisi U. etal., Journal ofCellular Physiology,1999, 181, 251-257); (8) Inhibitori IRES-zavisne translacije (Ikeda N., et al.,Agent for the prevention and treatment og hepatitis C,Japanese Patent Pub. JP-08268890; Kai Y. et al.,Prevention and treatment of viral diseases,Japanese Patent Pub. JP-10101591); (9) Ribozimi, na pr. nukleaza-rezistentni ribozimi (Maccjak, D..1. et al.,Hepatology1999,30,abstract 995) i oni opisani u U. S. Patent No. 6,043,077, Barber et al., i U. S. Patent Nos. 5,869,253 i 5,610,054, Draper et al.; i

(10) Za lečenje infekcija flaviviridama takođe su razvijeni nukleozidni analozi.

U International Publication Nos. WO 01/90121 i WO 01/92282 Idenix Pharmaceuticals otkrivaju korišćenje granatih nukleozida za lečenje od flavivirusa (uključujući HCV) i pestivirusa. Specifično, postupak za lečenje hepatitis C-infekcije (i od flavivirusa i pestivirusa) kod ljudi i drugih životinjskih domaćina otkriven u Idenix-ovim publikacijama uključuje primenu efikasne količine biološki aktivnih 1', 2', 3' ili 4-granatih P-D ili P-L nukleozida ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ili derivata, koji se primenjuju sami ili u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredstvom, po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

Druge patentne prijave koje otkrivaju korišćenje nekih nukleozidnih analoga za lečenje od virusa hepatitisa C uključuju PCT/CAOO/01316 (WO 01/32153; podneto 3. novembra 2000.) i PCT/CAO1/00197 (WO 01/60315; podneto 19. februara 2001.), podneli BioChem Pharma Inc.

(sada Shire Biochem. Ine); PCT/US02/01531 (WO 02/057425; podneto 18. januara 2002.) i PCT/US02/03086 (WO 02/057287; podneto 18. januara 2002.), podneli Merck & Co. Inc., PCT/EP01/09633 (WO 02/18404; objavljeno 21. avgusta 2001.), podneli Roche, i PCT Publication Nos. WO 01/79246 (podneto 13. aprila 2001.), WO 02/32920 (podneto 18. oktobra 2001.) i WO 02/48165, podneli Pharmasset Ltd.

PCT Publication No. WO 99/43691, Emory University, pod naslovom "2'-Fluoronucleosides" otkriva upotrebu nekih 2'-fiuoronukleozida za lečenje od HCV-a.

Eldrup et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16<th>International Conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, Ga.)) opisuje povezanost strukture i aktivnosti 2'-modifikovanih nukleozida u inhibiciji HCV-a.

Bhat et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae, 2003; (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16<th>International Conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, Ga.); p A75) opisuje sintezu i farmakokinetička svojstva nukleozidnih analoga kao mogućih inhibitora replikacije RNK HCV-a. Autori saopšatavju da 2'-modifikovani nukleozidi pokazuju jaku inhibitornu aktivnost u replikonskim testovima baziranim na ćelijama.

Olsen et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16<th>International Conference on Antiviral Research (April 27, 2003, Savannah, Ga.) p A76) takođe opisuje efete 2'-modifikovanih nukleozida na replikaciju RNK HCV-a. (11) Druga raznolika jedinjenja, uključujući 1-amino-alkilcikloheksane (U. S. Patent No. 6,034,134, Gold et al.), alkil-lipide (U. S. Patent No. 5,922,757, Chojkier et al.), vitamin E i druge antioksidante (U. S. Patent No. 5,922,757, Cojkier et al.), skvalen, amantadin, žučne kiseline (U. S. Patent No. 5,846,964, Ozeki et al.), N-(fosfonoacetil)-L-asparaginsku kiselinu, (U. S. Patent No. 5,830,905, Diana et al.), benzendikarboksamide (U. S. Patent No. 5,633,388, Diana et al.), derivate poliadenilne kiseline (U. S. Patent No. 5,496,546, Wang et al.), 2',3'-dideoksinozin (U. S. Patent No. 5,026,687, Yarchoan et al), benzimidazole (U. S. Patent No. 5.891,874, Colacino et al.), biljne ekstrakte (U. S. Patent No. 5,837,257, Tsai et al, U. S. Patent No. 5,725,859, Omer et al, i U. S. Patent No. 6,056,961), i piperidene (U. S. Patent No. 5,830,905, Diana et al.). (12) Druga jedinjenja koja su trenutno u fazi prekliničkih ili kliničkih ispitivanja za lečenje od virusa hepatitisa C uključuju: Interleukin-10 od Schering-Plough, IP-501 od Interneuron, Merimebodib (VX-497) od Vertex, AMANTADINE<®>(Svmmetrel) od Endo Labs Solvav, HEPTAZYME<®>od RPI, IDN-6556 od Idun Pharma., XTL-002 od XTL., HCV/MF59 od Chiron, CIVACIR<®>(hepatitis C imuni globulin) od NABI, LEVOVIRIN<®>od ICN/Ribapharm, VIRAMIDINE<®>od ICN/Ribapharm, ZADAXIN<®>(timozin-alfa) od Sci Clone, timozin plus pegilisani interferon od Sci Clone, CEPLENE<®>(histamin dihidrohlorid) od Maxim, VX 950 / LY 570310 od Vertex/Eli Lilly, ISIS 14803 od Isis Pharmaceutical/Elan, IDN-6556 od Idun Pharmaceuticals, Inc., JTK 003 od AKROS Pharma, BILN-2061 od Boehringer Ingelheim, CellCept (mikofenolat mofetil) od Roche, T67, inhibitor p-tubulina od Tolarik, terapijsku vakcinu usmerenu na E2 od Innogenetics, FK788 od Fujisawa Healthcare, Inc., IdB 1016 (Siliphos, oralni silibin-fosfatidilholin fitozom), inhibitore replikacije RNK (VP50406) od ViroPharma/Wyeth, terapijsku vakcinu od Intercell, terapijsku vakcinu od Epimmune/Genencor, inhibitor IRES-a od Anadys, ANA 245 i ANA 246 od Anadys, imunoterapiju (Therapore) od Avant, inhibitor proteaze od Corvas/Schering, inhibitor helikaze od Vertex, inhibitor fuzije od Trimeris, terapiju T ćelijama od CellExSys, inhibitor polimeraze od Biocryst, herniju uperenu na RNK od PTC Therapeutics, Dication od Immtech, Int, inhibitor proteaze od Agouron, inhibitor proteaze od Chiron/Medivir, "antisense" terapiju od AVI Biopharma, "antisense" terapiju od Hvbridon, hemoprečistače od Aethion Medical, terapisjku vakcinu od Merix, inhibitor proteaze od Bristol-Myers Squibb/Axys, Chron-VacC, terapijsku vakcinu od Tripep, UT 231B od United Therapeutics, inhibitore proteaze, helikaze i polimeraze od Genelabs Technologies, IRES-inhibitore od Immusol, R803 od Rigel Pharmaceuticals, INFERGEN<®>(interferon alfakon-1) od InterMune, OMNIFERON<®>(prirodni interferon) od Viragen, ALBUFERON<®>od Human Genome Sciences, REBIF (interferon beta-la) od Ares Serono, Omega Interferon od BioMedicine, oralni interferon alfa od Amarillo Biosciences, interferon gama, interferon tau, i interferon gama-lb od InterMune.

Ranije su za lečenje drugih formi hepatitisa opisani nukleozidni prolekovi. WO 01/96353 (podneto 15. juna 2001.), za Idenix Pharmaceuticals, otkriva 2'-deoksi-P-L-nukleozide i njihove 3'-prolekove za lečenje HBV-a. U. S. Patent No. 4,957,924 za Beauchamp otkriva različite terapijske estre aciklovira.

U svetlu činjenice da je infekcija HCV-om dostigla nivoe epidemije širom sveta, i da ima tragične posledice po inficiranog pacijenta, postoji velika potreba da se obezbede nova efikasna farmaceutska sredstva za lečenje hepatitisa C koja su nisko toksična za pacijenta.

Dalje, s obzirom na rastuću opasnost od infekcije drugim flaviviridama, postoji velika potreba da se obezbede nova efikasna farmaceutska sredstva sa niskom toksičnošću za domaćina.

Prema tome, cilj datog pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja, postupka i smeše za lečenje domaćina inficiranog virusom hepatitisa C.

Drugi cilj predmetnog pronalaska je obezbeđivanje postupka i smeše za lečenje pacijenata inficiranih pestivirusima, flavivirusima, ili hepacivirusima, uopšte.

Kratak opis pronalaska

Nađeno je da 3'-L-valin estar [3-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina (niže alternativno označen kao val-mCyd) pokazuje izvanredne rezulate protiv flavivirusa i pestivirusa, uključujući virus hepatitisa C. Na osnovu ovog otkrića, data su jedinjenja, smeše, postupci i uslovi upotrebe, za lečenje od flavivirida, uključujući HCV, koji obuhvataju primenu efikasne količine val-mCyd-a ili njegove soli, proleka ili derivata, po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U alternativnom vidu, val-mCyd se koristi za lečenje od svakog virusa koji se replicira pomoću RNK-zavisne RNK-polimeraze.

Prema tome, prvi vid obezbeđuje jedinjenje Formule (I), P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i njegovu upotrebu u medicinskoj terapiji i izradi leka za lečenje domaćina, posebno ljudi, inficiranih flavivirusom ili pestivirusom, uključujući HCV.

Jedinjenje val-mCyd konvertuje se u matični MCyd deesteriifkacijom u gastrointestinalnoj mukozi, krvi ili jetri, i posle oralnog dostavljanja, aktivno se transportuje iz gastrointestinalnog lumena u krvotok, funkcijom amino-kiselinskih transportera u mukozi gastrointestinalnog trakta. Ovo objašnjava porast oralne bioraspoloživosti u poređenju sa matičnim 2'-granatim nukleozidom koji se transportuje prvenstveno funkcijom nukleozidnih transportera. Isto tako, redukovana je i kompeticija sa drugim nukleozidima ili nukleozidnim analozima koji se transportuju nukleozidnim transporterima, a ne amino-kiselinskim transporterima. Kako se parcijalna deesterifikacija obavlja pre potpune apsorpcije, mono ili divalin estar nastavlja da biva apsorbovan korišćenjem amino-kiselinske transporterske funkcije. Dakle, postiže se odličan rezultat bolje apsorpcije, bioraspoloživosti, i smanjene kompeticije sa drugim nukleozidima ili nukleozidnim analozima, za preuzimanje u krvotok.

Kod šimpanzi inficiranih virusom hepatitisa C, val-mCyd smanjuje srednju vrednost nivoa HCV RNK za 0.83 logiokopija/ml (8.3 mg/kg/dan) i 1.05 logiokopija/ml (16.6 mg/kg/dan) za sedam dana. Šimpanze pokazuju od leka nezavisne bezbednosne ishode.

Matično-nukleozidna (mCyd) osnova može postojati kao P-D ili P-L nukleoizid. U poželjnom vidu, farmaceutski prihvatljivo jedinjenje se primenjuje u formi koja je bar 90% P-D-enantiomer. U drugom vidu, val-mCyd je bar 95% P-D-enantiomer. Valinski estar takođe ima enantiomerne forme. U poželjnom vidu, valinski deo je bar 90% L-enatiomer. U drugom vidu valinski deo je bar 95% L-enatiomer. U alternativnim vidovima, jedinjenja se koriste kao racemske smeše ili kao bilo koja kombinacija P-D ili P-L matičnog nukleoizida i L ili D amino-kiseline.

U jednom specifičnom vidu, jedinjenje Formule (I) je P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estar «HC1 so. U drugom specifičnom vidu, jedinjenje Formule (II), P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin dihidrohloridna so, obezbeđeno je za primenu kod domaćina, posebno čoveka, zaraženog flavivirusnom ili pestivirusnom infekcijom. U drugim vidovima, obezbeđuju se tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, a-ketoglutarat, i a-glicerofosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, salicilat, sulfat, sulfonat, nitrat, bikarbonat, hidrobromat, hidrobromid, hidrojodid, karbonat i soli fosforne kiseline. Naročito poželjan vid je mono ili dihidrohloridna so.

U drugom vidu, obezbeđuje se farmaceutska smeša koja uključuje 2'-C-metil-citidin-3'-O-L-valin estar ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, uključujući mono ili di HCl-so, njegov estar, prolek ili derivat, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentom ili diluentom.

U alternativnom vidu, 5'-hidroksil grupa je zamenjena sa 5'-OR, gde je R fosfat (uključujući monofosfat, difosfat, trifosfat, ili stabilisani fosfatni prolek); acil (uključujući niži acil); alkil (uključujući niži alkil); sulfonatni estar uključujući alkil ili arilalkil-sulfonil uključujući metansulfonil i benzil, gde je fenil grupa po slobodnom izboru supstituisana sa jednim ili više supstituenata kako je opisano u definiciji arila koja je ovde data; lipid, uključujući fosfolipide; amino-kiselina; ugljeni hidrat; peptid; holesterol; ili druga farmaceutski prihvatljiva odlazeća grupa koja je, kada se primeniin vivo,sposobna da obezbedi jedinjenje gde je R nezavisno H ili fosfat.

Aktivna jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da se primene u kombinaciji ili alternaciji sa drugim sredstvom koje je aktivno protiv flavivirusa ili pestivirusa, uključujući HCV (uključujući svako opisano ili pomenuto u Osnovi pronalaska), ili drugo korisno biološko sredstvo. Tako drugi glavni vid predstavlja farmaceutska smeša koja uključuje P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estar ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so (uključujući mono- ili di-HCl so), njegov estar, prolek ili farmaceutski prihvatljivi derivat, zajedno sa jednim ili više drugih efikasnih antivirusnih sredstava, po slobodnom izboru sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom. U drugom vidu, daje se postupak koji uključuje primenu |3-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estra ili soli, estra, proleka ili derivata ovoga, u kombinaciji ili alternaciji sa jednim ili više drugih antivirusnih sredstava, po slobodnom izboru sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom.

Može se odabrati bilo koje drugo antivirusno sredstvo koje daje željeni biološki efekat. Neograničavajući primeri uključuju interferon, ribavirin, interleukin, inhibitor NS3-proteaze, inhibitor cistein-proteaze, fenantrenhinon, derivat tiazolidina, tiazolidin, benzanilid, inhibitor helikaze, inhibitor polimeraze, nukleotidni analog, gliotoksin, cerulenin, besmislene fosforotioat oligodeoksinukleotide, inhibitor IRES-zavisne translacije, ili ribozim. U jednom posebnom vidu, drugo antivirusno sredstvo se bira između prirodnog interferona, interferona alfa (uključujući interferon alfa-2a i interferon alfa-2b), interferona beta (uključujući interferon beta-la), interferona omega, interferona gama (uključujući interferon gama-lb), interferona tau i konsenzusnog interferona. Svaki od ovih interferona može da se stabilizuje ili na drugi način modifikuje da bi mu se poboljšale tolerancija i biološka stabilnost ili druga biološka svojstva. Jedna česta modifikacija je pegilacija (modifikacija polietilen-glikolom). U jednom posebnom vidu, drugo antivirusno sredstvo je pegilisani ili nepegilisani interferon 2-alfa.

U alternativnom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-amino-kiselinski estar P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, gde amino-kiselina može biti prirodna ili sintetska i može biti u D ili L stereokonfiguraciji. U drugom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-acil estar P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina.

Kratak opis slika

Slike la i lb predstavljaju ilustraciju dva procesa za pripremanje dihidrohlorida P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estra, kako je opisano u Primeru 1.

Slika 2 je fotokopija gela koja ilustruje specifično mesto terminacije lanca prim vitroRNK sintezi, P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin trifosfatom na specifičnim guaninskim reziduama u RNK templatu, kako je opisano u Primeru 9.

Slika 3 predstavlja grafikon titra virusa goveđe virusne dijaree (BVDV) tokom više pasaža MDBK ćelija inficiranih BVDV-om, koji ukazuje na iskorenjivanje perzistentne infekcije BVDV-om putem produženog tretmana [3-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom (16 uM) kako je opisano u Primeru 10. Strelice ukazuju na tačke na kojima deo ćelija prestaje da bude tretiran lekom.

Slike 4a i 4b predstavljaju grafikone koncentracije virusa goveđe virusne dijaree (BVDV) u MDBK ćelijama perzistentno inficiranim virusom, kako je opisano u Primeru 11. Ovi grafikoni ukazuju na sinergizam između P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina i interferona alfa 2b (IntronA) u redukovanju titra virusa. Slika 4a predstavlja grafikon efekta p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina i IntronA na titre BVDV-a (linija NY-1) u perzistentno inficiranim MDBK ćelijama, tokom vremena. Slika 4b predstavlja grafikon efekta P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina u kombinaciji sa IntronA na titre BVDV-a (linija I-N-dins) u perzistentno inficiranim MDBK ćelijama.

Slike 5a-d ilustruju rezultate eksperimenata u kojima se izučava razvoj rezistencije u MDBK

ćelijama tretiranim P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom, inficiranih virusom goveđe virusne dijaree (BVDB), kako je opisano u Primeru 12. Slika 5a predstavlja grafikon reprezentativnog eksperimenta koji pokazuje efekat tokom dvadesetosmodnevnog tretmana p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom ili Intrn-omA na titre BVDV (linija 1-N-dins) u perzistentno inficiranim MDBK ćelijama. Slika 5b je fotokopija posude prevučene inficiranim MDBK ćelijama koja ilustruje veličinu fokusa formiranih fenotipovima BVDV (linija I-N-dins) divljeg tipa, prema P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-rezistentnim BVDV (I-N-dins 107R), ukazujući na to da rezistentan virus formira mnogo manje fokuse nego divlji tip, linija I-N-dins. Slika 5c predstavlja grafikon titra BVDV linija I-N-dins ili I-N-dins-107R u satima posle infekcije, u inficiranim MDBK ćelijama. Slika 5d predstavlja grafikon efekta Intron-a A na BVDV virusni titar ude novoinficiranim MDBK ćelijama tretiranim sa IntronA.

Slika 6 predstavlja grafikon koncentracije virusa hepatitisa C (Logio) kod pojedinačnih šimpanzi tokom dana kada su lečeni P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estrom kako je opisano u Primeru 13.

Slika 7 predstavlja grafikon koncentracije virusa hepatitisa C kod pojedinačnih šimpanzi tokom dana kada su lečeni (3-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estrom, u poređenju sa bazalnim nivoom, kako je opisano u Primeru 13.

Slika 8 predstavlja grafikon procenta ukupnog p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estra koji preostaje u uzorcima tokom vremena posle inkubacije leka u humanoj plazmi na 4°C, 21°C, i 37°C, kako je opisano u Primeru 14.

Slika 9a predstavlja grafikon koji pokazuje relativne nivoe di- i trifosfatnih derivata P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina i p-D-2'-C-metil-ribofuranozil uridina (mUrd) posle inkubiranja HepG2 ćelija sa 10 uM P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom, tokom vremena, kako je opisano u Primeru 14. Slika 9b prikazuje grafikon razgradnje trifosfatnog derivata P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina posle inkubacije HepG2 ćelija sa 10 uM P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom, tokom vremena. Slika 9c prikazuje grafikon koncentracije di- i tri-fosfatnih derivata P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina i P-D-2'-C-metil-ribofuranozil uridina (mUrd) posle inkubacije HepG2 ćelija sa 10 uM p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidinom, pri rastućim koncentracijama leka (fiM).

Slika 10 prikazuje grafikon koncentracije (ng/ml) p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina u humanom serumu posle primene P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estra kod pacijenata, kako je opisano u Primeru 17.

Slika 11 predstavlja grafikon srednje vrednosti promene titra virusa hepatitisa C kod humanih pacijenata posle primene P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidin-3'-0-L-valin estra, kako je pokazano u Primeru 17. Grafikon ukazuje na odstupanje od bazalnog nivoa u LogioHCV RNK, po pregledu pacijenta.

Detaljan opis pronalaska

Otkriveno je da 3'-L-valin estar<p->D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina (dole alternativno označen kao val-mCyd) pruža odlične rezultate protiv flavivirusa i pestivirusa, uključujući virus hepatitisa C. Na osnovu ovog otkrića, data su jedinjenja, smeše, postupci i uslovi upotrebe, za lečenje od flavivirida, uključujući HCV, koji obuhvataju primenu efikasne količine val-mCyd-a ili njegove soli, proleka ili derivata, po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U alternativnom vidu, val-mCyd se koristi za lečenje od svakog virusa koji se replicira pomoću RNK-zavisne RNK-polimeraze.

Otkrivena jedinjenja ili njihovi farmaceutski prihvatljivi derivati ili soli ili farmaceutski prihvatljive formulacije koje sadrže ova jedinjenja korisni su u prevenciji i lečenju od infekcija flaviviridama (uključujući HCV) i drugih sličnih stanja kao što su pozitivnost na HCV-antitela i HCV-pozitivna stanja, i kancer jetre povezan sa hepatitisom C (na pr. hepatocelularni karcinom) i tumori jetre. Pored toga, ova jedinjenja ili formulacije mogu da se koriste profilaktički za prevenciju ili usporavanje razvoja kliničkog oboljenja kod individua koje su pozitivne na anti-HCV (ili opštije anti-flaviviridna) antitela ili HCV-antigen ili koje su pozitivne na flaviviviridni antigen, ili koje su bile izložene HCV-u ili drugom virusu iz familije flavivirida.

Ukratko, glavne crte predmetnog pronalaska su:

(a) 3'-L-valin estar p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, i njegovi farmaceutski prihvatljivi prolekovi, derivati i soli, uključujući specifično mono- i di-hidrohloridne soli; (b) 3'-L-valin estar p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, i njegovi farmaceutski prihvatljivi prolekovi, derivati i soli za upotrebu u medicinskom lečenju, na primer za lečenje ili profilaksu flaviviridnih infekcija (uključujući HCV); (c) upotreba 3'-L-valin estra P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, i njegovih farmaceutski prihvatljivih prolekova, derivata i soli u izradi medikamenata za lečenje flaviviridnih infekcija (uključujući HCV); (d) farmaceutske formulacije koje uključuju 3'-L-valin estar P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, i njegove farmaceutski prihvatljive prolekove, derivate i soli zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom; (e) postupak za pripremanje 3'-L-valin estra P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina; (f) upotreba 3'-L-valin estra p-D-2'-C-metil-ribofuranozila za lečenje infekcija izazvanih virusima koji se repliciraju pomoću RNK-zavisne RNK-polimeraze; i (g) upotreba 3'-L-valin estra p-D-2'-C-metil-ribofuranozila za lečenje virusnih infekcija primcnom u kombinaciji ili alternaciji sa drugim antivirusnim sredstvom.

U alternativnom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-aminokiselinski estar P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, gde amino-kiselina može biti prirodna ili sintetska i može biti u D ili L stereokonifguraciji. U drugom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-acil estar P-D- ili p-L-2'-C-metil-ribofuranozil citidina. Jedinjenja ovog pronalaska ili poseduju antivirusnu aktivnost ili se metabolišu ujedinjenje koje ispoljava takvu aktivnost.

Bez vezivanja za teoriju,in vitroizučavanja mehanizama delovanja ukazuju daje mCyd specifični inhibitor replikacije genomske RNK. Pored toga, unutarćelijski 5'-trifosfatni oblik, mCyd-TP, izgleda da direktno inhibira NS5B RNK-zavisnu-RNK-polimerazu. Analiza sinteze RNK u prisustvu mCyd-TP ukazuje da mCyd-TP, putem još neidentifkovanih mehanizama, deluje kao specifični blokator sinteze lanca virusne RNK. Antivirusni nukleozidi i nukleozidni analozi se unutarćelijskim kinazama obično konvertuju u aktivni metabolit, 5'-trifosfatne (TP) derivate. Nukleozid-TP-i zatim ispoljavaju svoj antivirusni efekat inhibicijom virusne polimeraze tokom replikacije virusa. U ćelijama u kulturi, unutarćelijska fosforilacija konvertuje mCyd pretežno u aktivne vrste, mCyd-trifosfat (mCyd-TP), i u maloj meri u mCyd-difosfat. Pored toga, sreće se i drugi TP proizvod, 2'-C-metil-uridin TP (mUrd-TP), i misli se da on nastaje unutarćelijskom deaminacijom mCyd ili mCyd-5'-fosfatnih vrsta.

Flavivirusi obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska razmatrani su uopšteno uFields Virologv,Editors: Fields, N., Knipe, D. M. and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, (1996). Specifični flavivirusi uključuju bez ograničenja, Absettarov; Alfuy; Apoi; Aroa; Bagaza; Banzi; Bououi; Bussuquara; Cacipacore; Carey Island; virus dakarskog slepog miša; viruse kostolomne groznice 1, 2, 3 i 4; Edge Hill; virus Entebbe-skog slepog miša; Gadgets Gully; Hanzalova; Hypr; Ilheus; virus izraelskog ćurećeg meningoencefalitisa; virus japanskog encefalitisa; Jugra; Jutiapa; Kadam; Karshi; Kedougou; Kokoera; Koutango; Kumlinge; Kunjin; virus Kyasanur šumskog oboljenja; Langat; virus Louping-ove bolesti; Meaban; Modoc; virus Montana miotičkog leukoencefalitisa; virus Murray valley encefalitisa; Naranjal; Negishi; Ntaya; virus Omsk-hemoragične groznice; virus Phnom-Penh-skog slepog miša; Powassan; Rio Bravo; Ročio; Royal Farm; virus ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa; Saboya; virus St. Louis-encefalitisa; Sal Vieja; San Perlita; Saumarez Reef; Sepik; Sokuluk; Spondweni; Stratford; Temusu; Tyuleniy; Uganda S, Usutu, Wesselsbron; West Nile; Yaounde; virus žute groznice; i Zika.

Pestivirusi obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska takođe su uopšteno razmatrani uFields Virologv(Id.). Specifični pestivirusi uključuju, bez ograničavanja: virus goveđe virusne dijaree ("VDV"); virus klasične svinjske groznice ("CSFV") takođe poznat i kao virus svinjske kolere; i virus pogranične bolesti ("DV").

Definicije

Pojam alkil kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije specifikovano, odnosi se na zasićene linearne, granate, ili ciklične, primarne, sekundarne ili tercijarne ugljovodonike od tipično Cido Cioi specifično uključuje CF3, CC13, CFC12, CF2C1, CH2CF3, CF2CF3, metil, etil, propil, izopropil, ciklopropil, butil, izobutil, secbutil, r-butil, pentil, ciklopentil, izopentil, neopentil, heksil, izoheksil, cikloheksil, cikloheksilmetil, 3-metilpentil, 2,2-dimetilbutil, i 2,3-dimetilbutil. Pojam uključuje supstituisane i nesupstituisane alkil grupe, i posebno, uključuje halogenisane alkil grupe, i još posebnije, fluorinisane alkil grupe. Neograničavajući primeri ostataka kojima može biti supstituisana alkil grupa biraju se iz grupe koja sadrži halogen

(fluoro, hloro, bromo ili jodo), hidroksil, amino, alkilamino, arilamino, alkoksi, ariloksi, nitro, cijano, sulfonsku kiselinu, sulfat, fosforastu kiselinu, fosfat ili fosfonat, neprotektovane ili protektovane kako je potrebno, i kako je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, na primer kao što je navedeno u Greene et al., Protective Groups in Or<g>anic Svnthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991, ovim uključeno kao referenca.

Pojam niži alkil, kako se ovde koristi, i ako nije drugačije specifikovano, odnosi se na Cido C4zasićenu linearnu, granatu, ili cikličnu (na primer, ciklopropil) alkil grupu, uključujući supstituisane i nesupstituisane forme. Ukoliko nije specifično drugačije izneto u ovoj prijavi, kada je pogodan deo alkil, poželjan je niži alkil. Slično, kada je alkil ili niži alkil pogodan deo, poželjan je nesupstituisani alkil ili niži alkil.

Pojam alkilamino ili arilamino odnosi se na amino grupu koja ima jedan ili dva alkil ili aril supstituenta, respektivno.

Pojam "protektovana" kako se ovde koristi, i ako nije drugačije definisano, odnosi se na grupu koja je dodata na atom kiseonika, azota ili fosfora da bi se sprečilo njegovo dalje reagovanje ili u druge svrhe. Stručnjacima u oblasti organske sinteze poznat je širok spektar različitih protektivnih grupa na kiseoniku ili azotu.

Pojam aril kako se ovde koristi i ako nije drugačije specifikovano, odnosi se na fenil, bifenil, ili naftil, i poželjno je fenil. Pojam uključuje supstituisane i nesustituisane delove. Aril grupa može biti supstituisana bilo kojim željenim delom, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više odabranih iz grupe koja sadrži halogen (fluoro, hloro, bromo ili jodo), hidroksil, amino, alkilamino, arilamino, alkoksi, ariloksi, nitro, cijano, sulfonsku kiselinu, sulfat, fosforastu kiselinu, fosfat ili fosfonat, neprotektovane ili protektovane kako je potrebno, i kako je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, na primer prema uputstvima iz Greene et al., Protective Groups in Organic Svnthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991.

Pojam alkaril ili alkilaril odnosi se na alkil grupu sa aril supstituentom. Pojam aralkil ili arilakil odnosi se na aril grupu sa alkil supstituentom.

Pojam halo, kako se ovde koristi, uključuje specifičan opis hloro, bromo, jodo i fluoro, ponaosob.

Pojam purinska ili pirimidinska baza uključuje, ali se ne ograničava na adenin, N<6->alkilpurine, N<6->acilpurine, (gde je acil C(0)(alkil, aril, alkilaril, ili arilalkil), N<6->benzilpurin, N<6->halopurin, N<6->vinilpurin, N<6->acetilenski purin, N<6->acil purin, N<6->hidroksialkil purin, N<6->alkilaminopurin, N<5->tioalkil purin, N<2->alkilpurine, N<2->alkil-6-tiopurine, timin, citozin, 5-fluorocitozin, 5-metilcitozin, 6-azapirimidin, uključujući 6-azacitozin, 2- i/ili 4-merkaptopirimidin, uracil, 5-halouracil, uključujući 5-fluorouracil, C<5->alkilpirimidine, 5-jodo-pirimidin, 6-jodo-pirimidin, 2-Br-vinil-5-pirimidin, 2-Br-vinil-6-pirimidin, C<5->benzilpirimidine, C<5->halopirimidine, C<5->vinilpirimidin, C<5->acetilenski pirimidin, C<5->acil pirimidin, C<3->hidroksialkil purin, C<5->amidopirimidin, C<5->cijanopirimidin, C<5->nitropirimidin, C<5->amino-pirimidin, N<2->alkilpurine, N<2->alkil-6-tiopurine, 5-azacitidinil, 5-azauracilil, triazolopiridinil, imidazolopiridinil, pirolopirimidinil, i pirazolopirimidinil. Purinske baze uključuju, ali se ne ograničavaju na guanin, adenin, hipoksantin, 2,6-diaminopurin, i 6-hloropurin. Funkcionalne kiseoničke i azotne grupe na bazi mogu biti protektovane ako je neophodno ili ako se tako želi. Pogodne protektivne grupe su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti, i uključuju trimetilsilil, dimetilheksilsilil, f-butildimetilsilil, i/-butildifenilsilil, tritil, alkil grupe, i acil grupe kao acetil i propionil, metansulfonil, i p-toluensulfonil.

Pojam acil ili O-vezani estar odnosi se na grupu sa formulom C(0)R', gde je R' linearni, granati ili ciklični alkil (uključujući niži alkil), karboksilatni ostatak amino-kiseline, aril uključujući fenil, heteroaril, alkaril, aralkil uključujući benzil, alkoksialkil uključujući metoksimetil, ariloksialkil kao fenoksimetil; ili supstituisani alkil (uključujući niži alkil), aril uključujući fenil po slobodnom izboru supstituisan sa hloro, bromo, fluoro, jodo, Cido C4 alkil ili Cido C4alkoksi, sulfonatni estri kao alkil ili aralkil sulfonil uključujući metansulfonil, mono, di ili trifosfatni estar, tritil ili monometoksi-tritil, supstituisani benzil, alkaril, aralkil uključujući benzil, alkoksialkil uključujući metoksimetil, ariloksialkil kao fenoksimetil. Aril grupe u estrima optimalno uključuju fenil grupu. U neograničavajućim primerima, acil grupe uključuju acetil, trifluoroacetil, metilacetil, ciklopropilacetil, ciklopropil-karboksi, propionil, butiril, izobutiril, heksanoil, heptanoil, oktanoil, neo-heptanoil, fenilacetil, 2-acetoksi-2-fenilacetil, difenilacetil, a-metoksi-a-trifluorometil-fenilacetil, bromoacetil, 2-nitro-benzenacetil, 4-hloro-benzenacetil, 2-hloro-2,2-difenilacetil, 2-hloro-2-fenilacetil, trimetilacetil, hlorodifluoroacetil, perfluoroacetil, fluoroacetil, bromodifluoroacetil, metoksiacetil, 2-tiofenacetil, hlorosulfonilacetil, 3-metoksifenilacetil, fenoksiacetil, tert-butilacetil, trihloroacetil, monohloroacetil, dihloroacetil, 7H-dodekafluoro-heptanoil, perfluoro-heptanoil, 7H-dodeka-fluoroheptanoil, 7-hlorododekafluoro-heptanoil, 7-hloro-dodekafluoro-heptanoil, 7H-dodekafluoroheptanoil, 7H-dodeka-fluoroheptanoil, nona-fluoro-3,6-dioksa-heptanoil, nonafluoro-3,6-dioksaheptanoil, perfluoroheptanoil, metoksibenzoil, metil 3-amino-5-feniltiofen-2-karboksil, 3,6-dihloro-2-metoksi-benzoil, 4-(l, 1,2,2-tetrafluoro-etoksi)-benzoil, 2-bromo-propionil, omega-aminokapril, dekanoil, n-pentadekanoil, stearil, 3-ciklopentil-propionil, 1-benzen-karboksil, O-acetilmandelil, pivaloil acetil, 1-adamantan-karboksil, cikloheksan-karboksil, 2,6-piridindikarboksil, ciklopropan-karboksil, ciklobutan-karboksil, perfluorocikloheksil karboksil, 4-metilbenzoil, hlorometil izoksazolil karbonil, perfluorocikloheksil karboksil, krotonil, l-metil-lH-indazol-3-karbonil, 2-propenil, izovaleril, 1 -pirolidinkarbonil, 4-fenilbenzoil.

Pojam amino-kiselina uključuje prirodno-srećuće i sintetske a, p\ y, ili 5 amino-kiseline, i uključuju ali se ne ograničavaju na amino-kiseline koje se nalaze u proteinima, tj. glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan, prolin, serin, treonion, cistein, tirozin, asparagin, glutamin, aspartat, glutamat, lizin, arginin i histidin. U poželjnom vidu, amino-kiselina je u L-konfiguraciji, ali može da se koristi i D-konfiguracija. Alternativno, amino-kiselina može biti alanil, valinil, leucinil, izoleucinil, prolinil, fenilalaninil, triptofanil, metioninil, glicinil, serinil, treoninil, cisteinil, tirozinil, asparaginil, glutaminil, aspartoil, glutaroil, lizinil, argininil, histidinil, P-alanil, |3-valinil, P-leucinil, P-izoleucinil, P-prolinil,P-fenilalaninil, P-triptofanil, P-metioninil, P-glicinil, P-serinil, P-treoninil, R-cisteinil, p-tirozinil, P-asparaginil, p-glutaminil, P-aspartoil, p-glutaroil, P-lizinil, P-argininil, ili P-histidinil.

Kako se ovde koristi, pojam "suštinski slobodan od" ili suštinski u odsustvu", odnosi se na nukleozidnu smešu koja uključuije bar 85 do 90% po težini, poželjno 95%, 98%, 99% ili 100% po težini naznačenog enantiomera tog nukleozida.

Slično, pojam "izolovan" odnosi se na nukleozidnu smešu koja uključuje bar 85 ili 90% po težini, poželjno 95%, 98%, 99% ili 100% po težini, nukleozida.

Pojam domaćin, kako se ovde koristi, odnosi se na jednoćelijski ili višećelijski organizam u kome virus može da se replicira, uključujući ćelijske linije i životinje, i poželjno, čoveka. Alternativno, domaćin može biti onaj koji nosi deo virusnog genomaFlaviviridae,čija replikacija ili funkcija mogu biti izmenjene jedinjenjima predmetnog pronalaska. Pojam domaćin specifično se odnosi na inficirane ćelije, ćelije transfektovane sa celim ili delom genomaFlaviviridae,i životinje, posebno, primate (uključujući šimpanze) i ljude. U većini aplikacija predmetnog pronalaska na životinjama, domaćin je humani pacijent. Primene u veterini, u nekim indikacijama, ipak su jasno predviđene predmetnim pronalskom (na pr. kod šimpanzi).

Pojam "farmaceutski prihvatljiva so ili prolek" koristi se u specifikaciji da opiše svaku farmaceutski prihvatljivu formu (kao estar, fosfatni estar, so estra ili srodne grupe) nukleozidnog jedinjenja koja, po primeni kod pacijenta, obezbeđuje nukleozidno jedinjenje. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje su izvedene iz farmaceutski prihvatljivih organskih ili neorganskih baza i kiselina. Pogodne soli uključuju one izvedene iz alkalnih metala kao kalijum i natrijum, zemno-alkalnih metala kao kalcijum i magnezijum, sa brojnim kiselinama poznatim u farmaceutskoj struci. Farmaceutski prihvatljivi prolekovi odnose se na jedinjenje koje se metaboliše, na primer, hidrolizuje ili oksidiše, u domaćinu da bi se formiralo jedinjenje predmetnog pronalaska. Tipični primeri prolekova uključuju jedinjenja koja imaju biološki labilne protektivne grupe na funkcionalnom delu aktivnog jedinjenja. Prolekovi uključuju jedinjenja koja mogu biti oksidovana, redukovana, aminisana, deaminisana, hidroksilisana, dehidroksilisana, hidrolizovana, dehidrolizovana, alkilisana, dealkilisana, acilisana, deacilisana, fosforilisana, defosforilisana, da bi se proizvelo aktivno jedinjenje. Jedinjenja ovog pronalaska poseduju antivirusnu aktivnost protivFlaviviridae- a.,ili se metabolišu do jedinjenja koja pokazuju takvu aktivnost.

L Aktivna jedinjenja, njihove fiziološki prihvatljive soli i prolekovi

Opisani su postupci i smeše za lečenje od infekcija pestivirusima, flavivirusima i virusom hepatitisa C, koji uključuju primenu efikasne količine 2'-C-metil-citidin-3'-0-L-valina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, estra ili proleka, kod domaćina kome je to potrebno.

U jednom vidu, koristi se hidrohloridna so jedinjenja sa Formulom (I). U drugom vidu, poželjna je dihidrohloridna so jedinjenja sa Formulom (I). Međutim, aktivno jedinjenje može da se primeni kao bilo koja so ili prolek koji su sposobni da posle primene kod primaoca daju, direktno ili indirektno, matično jedinjenje, ili da sami ispolje aktivnost. Neograničavajući primeri su farmaceutski prihvatljive soli, koje su alternativno označene kao "fiziološki prihvatljive soli", i jedinjenja koja su alkilisana, acilisana ili na drugi način modifikovana na 5'-poziciji ili na purinskoj ili pirimidinskoj bazi, formirajući na taj način tip "farmaceutski prihvatljivog proleka". Dalje, modifikacije mogu da utiču na biološku aktivnost jedinjenja, u nekim slučajevima pojačavajući aktivnost u odnosu na matično jedinjenje. Ovo može jednostavno da se proceni pripremanjem soli ili proleka i ispitivanjem njegove antivirusne aktivnosti prema ovde opisanim postupcima, ili na druge načine koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

U prvom glavnom vidu, obezbeđuje se jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili prolek:

Treba razumeti da su ovde uključene sve stereoizomerne, tautomerne i polimorfne forme jedinjenja. 2'-metil supstitucija mogu biti i druge alkil grupe kao etil, propil, ili, alternativno, etenil.

U alternativnom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-amino-kiselinski estar p-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina, gde amino-kiselina može biti prirodna ili sintetska i može biti u D ili L stereokonfiguraciji. U drugom vidu, aktivno jedinjenje je 3'-acil estar P-D-2'-C-metil-ribofuranozil citidina.

U drugom alternativnom vidu, 5'-hidroksil grupa je zamenjena sa 5'-OR gde je R fosfat (uključujući monofosfat, difosfat, trifosfat, ili stabilisani fosfatni prolek); stabilisani fosfatni prolek; acil (uključujući niži acil); alkil (uključujući niži alkil); sulfonatni estar uključujući alkil ili arilalkil sulfonil uključujući metansulfonil i benzil, gde je fenil grupa po slobodnom izboru supstituisana sa jednim ili više supstituenata kako je opisano u ovde datoj definiciji arila; lipid, uključujući fosfolipide; amino-kiselina; ugljeni hidrat; peptid; holesterol; ili druga farmaceutski prihvatljiva odlazeća grupa koja je, kada se primeniin vivo,sposobna da obezbedi jedinjenje gde je R nezavisno H ili fosfat.

II. Sinteza aktivnih jedinjenja

Jedinjenje predmetnog pronalaska može da se sintetiše na načine koji su poznati u struci. Na primer, u jednom vidu, priprema se nukleozid, nukleozidni analog, ili njegova so, prolek, stereoizomer ili tautomer, koji je disupstituisan na 2' C. U drugom vidu, priprema se 0-D-2'-C-metil-citidin (4-amino-l-(3,4-dihidroksi-5-hidroksimetil-3-C-metil-tetrahidro-furan-2-il)-i//-pirimidin-2-on), koji ima vrednost aktivnog nukleozida ili se koristi kao procesni intermedijar. U još jednom vidu, priprema se 3'-0-valinil estar P-D-2'-C-metil-citidin (2-amino-3-metil-buterna kiselina 5-(4-amino-2-okso-2#-pirimidin-l -il)-4-hidroksi-4-C-metil-2-hidroksimetil-tetrahidro-furan-3-il estar) ili forma hidrohloridne soli. Pripremljeni nukleozidi, nukleozidni analozi, soli ili estarski prolekovi mogu da se koriste kao intermedijari u pripremanju mnogih drugih nukleozidnih analoga, ili mogu da se koriste direktno kao antivirusna i/ili antineoplastična sredstva.

PRIMER 1: SINTEZA B- D- 2'- C- METIL- RIBOFURANOZIL CITIDIN- 3' O- L- VALIN ESTRA

U jednom postupku sinteze prikazanom na Slici la, sinteza uključuje reakciju citozina, BSA i SnCU/acetonitrila sa l,2,3,5-tetra-0-benzoil-2-C-metil-P-D-ribofuranozom (J_) da se formira 4-amino-l-(3,4-dibenzoiloksi-5-benzoiloksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-i//- pirimidin-2-on (2); i reakciju (2) sa NaOMe/MeOH da se dobije 4-amino-l-(3,4-dihidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-7/]r-pirimidin-2-on (3), poznat i kao 2-C-metil-P-D-ribofuranoza. Korišćenje citozina kao polaznog materijala umesto benzoil-citozina poboljšava "atomsku ekonomiku" procesa i pojednostavljuje prečišćavanje u kasnijim stupnjevima.

Sledeći korak u ovom procesu podrazumeva reakciju (3) sa Me2NCH(OMe)2u DMF da se formira (4), N-[ 1 -(3,4-dihidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-2-okso-1,2-dihidro-pirimidin-4-ilJ-A^A-dimetil-formamidin, koji je amino-protektovana forma (3); reakciju (4) sa TBDPSC1 i imidazolom u DCM da se dobije 5'-silil-protektovana forma (4) kao N'-{l-[5-(ter/-butil-difenil-silaniloksimetil)-3,4-dihidroksi-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-2-okso-l,2-dihidro-pirimidin-4-il}-iV,A<f->dimetil-formamidin (5), gde korišćenje DCM pruža prednost posedovanja veće kontrole formiranja disilil sporednog proizvoda; reakciju (5) sa N-Boc-Z-valinom, EDC i DMAP u DCM na sobnoj temperaturi da se formira 2-(/er/-butil-difenil-silaniloksi-metil)-5-[4-(dimetilamin^ metil-tetrahidrofuran-3-il estar 2-to^butoksikarbonil-amino-3-metil-buterne kiseline (6); uklanjanje silil i amino-protektivne grupe reakcijom (6) saNH4F u MeOH u prisustvu približno 10 mol ekvivalenata etil acetata da se spreči cepanje 3'-0-valinil estra oslobađanjem amonijaka, i refluktovanje smeše da se dobije 5-(4-amino-2-okso-2#-pirimidin-l-il)-4-hidroksi-2-hidroksimetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-il estar 2-tert-butoksi-karbonilamino-3-metil-buteme kiseline da se dobije (7); i konačno, reakciju (7) sa HC1 u EtOH da se dobije dihidrohloridna so 5-(4-amino-2-okso-27/-pirimidin-l-il)-4-hidroksi-2-hidroksimetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-il

estar 2-amino-3-metil-buterne kiseline (8) kao finalni proizvod.

Alternativna sinteza

U drugom postupku za sintetisanje jedinjenja pronalaska, pokazanom na Slici 2b, benzoilcitozin, BSA i SnCl4/acetonitril reaguju sa l,2,3,5-tetra-0-benzoil-2-C-metil-p-D-ribofuranozom (1) da se formira 4-benzoilamino-l-(3,4-dibenzoiloksi-5-benzoiloksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-///-pirimidin-2-on (2a); (2a) reaguje sa NH3u metanolu i hromatografski se izdvaja produkt, 4-amino-l-(3,4-dihidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-7//-pirimidin-2-on (3) poznat i kao P-D-2'-C-metil-citidin; (3) reaguje sa Me2NCH(OMe)2u DMF na sobnoj temperaturi, 1.5 sat da se formira 7^-[l-(3,4-dihidroksi-5-hidroksimetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-2-okso-l,2-dihidro-pirimidin-4-il]-7Y,jV-dimetil-formamidin (4); (4) reaguje sa TBDPSC1 i piridinom na sobnoj temperaturi, 6 sati, da se dobije A/'-{l-[5-(efr/-butil-difenil-silaniloksimetil)-3,4-dihidroksi-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-2-okso-l^-dihidro-pirimidin^-ilJ-A^A^-dimetil-formamidin (5); (5) reaguje sa /V-Boc-Z-valinom, DEC i DMAP u THF/DMF na sobnoj temperaturi, 2 dana, i proizvod formiran u ovoj reakciji podvrgava se HPLC-u da bi se dobio 2-(/ert-butil-difenil-silaniloksi-metil)-5-[4-(dimetilaminometilenamino)-2-okso-2i/-pirimidin-l-il]-4-hidroksi-4-metil-tetrahidro-furan-3-il estar 2-/er/-butoksikarbonilamino-3-metil-buterne kiseline (6); (6) se refluktuje sa NH4F u MeOH oko 3 sata da se uklone silil i amino-protektivne grupe, i proizvod se izlaže hromatografskom prečišćavanju da se dobije 5-(4-amino-2-okso-2//-pirimidin-l-il)-4-hidroksi-2-hidroksimetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-il estar 2-/e/t-butoksi-karbonilamino-3-metil-buterne kiseline (7); i konačno (7) reaguje sa HC1 u EtOAc na sobnoj temperaturi da se dobije dihidrohloridna so 5-(4-amino-2-okso-2//-pirimidin-l-il)-4-hidroksi-2-hidroksimetil-4-rnetil-tetrahidro-furan-3-il estar 2-amino-3-metil-buterne kiseline (8) kao finalni proizvod.

PRIMER2: SINTEZA 2'-C-METIL-CITIDIN-3'-O L-VALIN ESTRA (VAL-mCyd)

Šema 1

Korak 1:Sinteza jedinjenja 9:2- C- metil- D- ribono- Y- laktona

Dejonizovana voda (100 ml) meša se u trogrlom 250 ml-skom flakonu sa okruglim dnom, odozgo opremljenim mešalicom, osovinom za mešanje, digitalnim čitačem temperature i dovodom argona. Argon se u vidu mehurića uvodi u vodu trideset minuta, doda se D-fruktoza (20.0 g, 0.111 mol) i rastvor se izbistri za nekoliko minuta. Kalcijum oksid (12.5 g, 0.223 mol) dodaje se u porcijama tokom pet minuta i smeša se snažno meša. Dolazi do egzotermije i temperatura reakcije dostiže 39.6°C, 10 minuta od početka dodavanja kalcijum oksida. Posle oko petnaest minuta, reakciona smeša razvija žutu boju koja se vremenom pojačava. Posle tri sata, izdvaja se alikvot za TLC analizu. Alikvot se acidifikuje do pH 2 korišćenjem zasićenog vodenog rastvora oksalne kiseline. Dobijena bela suspenzija evaporiše pod sniženim pritiskom da se ukloni voda. Rezidui se doda toluen (2 ml) i smeša evaporiše pod sniženim pritiskom (na 45-50°C) da se ukloni svaki trag vode. Čvrsta rezidua se rekonstituiše u 2 ml smeše tetrahidrofuran:metanol 1:1. Posle temeljnog mešanja, suspenzija se ostavi da se slegne i supernatantni bistri rastvor se nanese u vidu tačke za TLC (silika-ploča se razvija u 2% metanolu u etil acetatu i boji uranjanjem u 1% alkalni kalijum permanganat; ploča se zatim zagreje uz korišćenje grejača koji radi po principu fena, dok se ne pojave žute tačke na ružičastoj osnovi). Željeni lakton se tipično uočava na Rfvrednosti od 0.33 pod gornjim uslovima. Polarniji sporedni produkti i neodreagovali materijal detektuju se na Rf vrednostima u opsegu od 0.0 do 0.2.

lako se formiranje proizvoda zapaža posle 3 sata, reakcija se nastavlja 22 sata tokom kog vremena se reakciona smeša meša na 25°C. Na kraju ovog perioda, pH smeše iznosi 13.06. Gasoviti ugljen-dioksid se u vidu mehurića uvodi u reakcionu smešu tokom 2.5 sata (pH je 7.25). Formirani čvrsti kalcijum-karbonat se ukloni vakuumskom filtracijom, filter-kolač se ispere sa 50 mi dejonizovane vode. Vodeni slojevi se kombinuju i tretiraju oksalnom kiselinom (5.0 g, 0.056 mol) i smeša se snažno meša na 25°C, 30 minuta. (Inicijalna tamna boja se u velikoj meri gubi i smeša prelazi u mlečno belu pastu). Na ovom stupnju, pH smeše tipično iznosi 2-3. Smeša u vidu paste meša se na 45-50°C preko noći. Smeša zatim evaporiše na sniženom pritisku i na 45-50°C, da bi se uklonilo 75 ml vode. Natrijum hlorid (30 g) i tetrahidrofuran (100 ml) se zatim dodaju vodenom rastvoru paste (oko 75 ml) i smeša se snažno meša na 25°C, 30 minuta. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj se meša 10 minuta sa 75 ml svežeg tetrahidrofurana. Ovaj postupak se ponovi tri puta i tetrahidrofuranski rastvori se kombinuju i mešaju sa 10 g anhidrovanog magnezijum-sulfata, 30 minuta. Smeša se filtrira i magnezijum-sulfatni filter-kolač se ispere sa 60 ml tetrahidrofurana. Filtrat evaporiše na sniženom pritisku i na 40°C dajući 10.86 g sirovog proizvoda u vidu tamno-narandžaste polučvrste supstance. (Za proces u većim razmerama, tetrahidrofuran će biti zamenjen acetonom umesto evaporisanja sirovog produkta do suvog). Sirovi produkt se meša sa acetonom (20 ml) na 20°C, 3 sata. Proizvod se sakuplja vakuumskom filtracijom i filter-kolač se ispere sa 12 ml acetona da se dobije željeni proizvod 9 u vidu bele kristalinske čvrste supstance. Proizvod se suši u vakuumu dajući 2.45 g (13.6% prinos). Tačka topljenja jedinjenja 9: 158-162°C (prema literaturi, tačka topljenja je 160-161°C). ]H NMR (DMSO-J6) 5 ppm 5.69 (s, IH, razm. sa D20), 5.41 (d, IH, razm. sa D20), 5.00 (t, IH, razm. sa D20), 4.15 (m, IH), 3.73 (m, 2H), 3.52 (m, IH), 1.22 (s, 3H).<13>C NMR(DMSO-J6)5 ppm 176.44, 82.95, 72.17, 72.02, 59.63, 20.95. (C6H,0O5izrač. C, 44.45; H: 6.22. Nađeno: C: 44.34; H:6.30).

Korak 2: Sinteza jedinjenja 10: 2, 3, 5- tri- 0- benzoil- 2- C- rnetil- D- ribono- y- lakton

Mešavina laktona 1 (3.0 g, 18.50 mmol), 4-dimetilaminopiridina (0.45 g, 3.72 mmol) i trietilamina (25.27 g, 249.72 mmol) u 1,2-dimetoksi etanu (50 ml) meša se na 25°C u atmosferi argona, trideset minuta. Ova bela suspenzija se ohladi na 5°C i dodaje se benzoil hlorid (11.7 g, 83.23 mmol) tokom petnaest minuta. Smeša se meša na 25°C, dva sata. TLC analiza (silicijum-dioksid, 2% metanol u etil acetatu), ukazuje na potpuni utrošak polaznog materijala. U reakcionu smešu se doda ledeno hladna voda (100 g) i mešanje se nastavlja trideset minuta. Formirane bele čvrste supstance se sakupe vakuumskom filtracijom i filter-kolač se ispere hladnom vodom (50 ml). Ovaj sirovi proizvod se meša sa tert-butil metil etrom (60 ml) na 20°C, trideset minuta, zatim filtrira, filter-kolač se ispere tert-butil metil etrom (25 ml) i suši u vakuumu dajući 7.33 g (83.4% prinos) jedinjenja 10 u vidu bele čvrste supstance sa čistoćom 97.74% (HPLC/AUC). Tačka topljenja jedinjenja 10: 137-140°C (prema literaturi, tačka topljenja: 141-142°C). 'H NMR (CDC13) 8 ppm 8.04 (d, 2H), 7.92 (d, 2H), 7.73 (d, 2H), 7.59 (t, IH), 7.45 (m, 4H), 7.32 (t, 2H), 7.17 (t, 2H), 5.51 (d, IH), 5.17 (m, IH), 4.82-4.66 (d AB kvarteta, 2H), 1.95 (s, 3H).<I3>C NMR (CDC13) 8 ppm 172.87, 166,17, 166.08, 165.58, 134.06, 133.91, 133.72, 130.09, 129.85, 129.80, 129.37, 128.78, 128.60, 128.49, 127.96, 127.89, 79.67, 75.49, 72.60, 63.29, 23.80. TOF MS ES+ (M+l: 475).

Korak 3: Sinteza jedinjenja 11: 2, 3. 5- tri- Q- benzoil- 2- C- metil-[ 3- D- ribofuranoza

Rastvor Red-Al (65 tež.% u toluenu, 2 ml, 6.56 mmol) u anhidrovanom toluenu (2.0 ml) meša se na 0°C u atmosferi argona. Rastvor anhidrovanog etanola (0.38 ml, 6.56 mmol) u anhidrovanom toluenu (1.6 ml) dodaje se u toluenski rastvor tokom perioda od pet minuta. Dobijena smeša se meša na 0°C petnaest minuta i 2 ml (2.18 mmol) ovog Red-Al/etanol reagensa dodaje se u hladni (-5°C) rastvor 2,3,5-tri-0-benzoil-2-C-metil-D-ribonolaktona 2 (475 mg, 1.0 mmol) u anhidrovanom toluenu (10 ml) tokom perioda od 10 minuta. Reakciona smeša se meša na -5°C, četrdeset minuta. TLC analiza (silika-ploče, 35% etil acetat u heptanu) ukazuje na potpuni utrošak polaznog materijala. HPLC ukazuje daje preostalo samo 0.1% polaznog materijala. Reakcija se gasi acetonom (0.2 ml), vodom (15 ml), i IN HC1 (15 ml) na 0°C i ostavi se da se zagreje na sobnu temperaturu. IN HC1 (5 ml) doda se da bi se rastvorile neorganske soli (pH: 2-3). Smeša se ekstrahuje etil-acetatom (3x25 ml) i organski rastvor se ispere slanom vodom (25 ml), suši (anhidrovani natrijum sulfat, 10 g) i solvent se ukloni pod sniženim pritiskom i na temperaturi od 40°C, da bi se dobio željeni proizvod 11 u kvantitativnom prinosu (480 mg). Ovaj materijal se koristi kao takav u sledećem koraku.

Korak 4: Sinteza jedinjenja 12: l, 2, 3. 5- tetra- Q- benzoil- 2- C- metil- [ 3- D- ribofuranoza:

Benzoil hlorid (283 mg, 2.0 mmol) dodaje se tokom perioda od pet minuta, u hladan rastvor (5°C) jedinjenja 11 (480 mg, 1.0 mmol), 4-dimetilaminopiridina (12.3 mg, 0.1 mmol) i trietilamina (506 mg, 5.0 mmol) u anhidrovanom tetrahidrofuranu (5 ml). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi i u atmosferi argona preko noći. HPLC analiza ukazuje na 0.25% neodreagovalog polaznog materijala. Reakcija se gasi dodavanjem ledeno hladne vode (10 g) i zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata. Tetrahidrofuran se ukloni pod sniženim pritiskom i smeša se ekstrahuje etil acetatom (50 ml). Organski rastvor se ispere vodom (25 ml), slanom vodom (25 ml), suši (anhidrovani natrijum sulfat, 12 g) i solvent se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije 650 mg gustog uljanog proizvoda. Ovaj sirovi proizvod se meša sa 5 ml tert-butil metil etra, 5 minuta, dodaju se heptan (5 ml) i voda (0.1 ml) i mešanje se nastavi dodatna dva sata na 20°C. Čvrste supstance se sakupe vakuumskom filtracijom i filter-kolač se ispere 1:1 rastvorom heptan:tert-butil metil etar (6 ml) i tert-butil metil etrom (2 ml). Sušenje čvrste supstance u vakuumu daje 300 mg (52%) željenog proizvoda 12 (98.43% čistoće, po HPLC/AUC) u vidu bele čvrste supstance koja se topi na 154-156.3°C (prema literaturi, tačka topljenja: 155-156°C). 'H NMR (CDC13) 5 ppm 8.13 (m, 4H), 8.07 (d, 2H), 7.89 (d, 2H), 7.63 (m, 3H), 7.48 (m, 6H), 7.15 (m, 3H), 7.06 (s, IH), 5.86 (dd, IH), 4.79 (m, IH), 4.70-4.52 (d AB kvarteta, 2H), 1.95 (s, 3H).<I3>C NMR (CDC13) 5 ppm 166.31, 165.83, 165.01, 164.77, 134.01, 133.86, 133.70, 133.17, 130.44, 130.13, 129.97, 129.81, 129.59, 129.39, 129.07, 128.84, 128.76, 128.37, 98.01, 86.87, 78.77, 76.35, 64.05, 17.07. (C34H2809: izrač. C, 70.34; H: 4.86. Nađeno: C, 70.20; H: 4.95).

Korak 5: Sinteza jedinjenja 13: 4- amino- l-( 3. 4- dibenzoiloksi- 5- benziloksimetil- 3- metil-

tetrahidro- furan- 2- il)- 7//- pirimidin- 2- on

Citozin (89 g, 0.80 mol) suspenduje se u acetonitrilu (900 ml) u 12 1-skom flakonu sa okruglim dnom opremljenom refluksnim kondenzatorom, mešalicom odozgo i adapterom za ulaz argona. Suspenzija se meša na 20°C u atmosferi argona i doda joj se u jednoj porciji N,0-bis(trimetilsilil)acetamid (537 ml, 2.2 mol). Dobijeni rastvor se zagreva na 80°C i meša još jedan sat na istoj temperaturi. l,2,3,5-tetra-0-benzoil-2-C-metil-P-D-ribofuranoza (425.0 g, 0.73 mol) suspenduje se u acetonitrilu (4000 ml) i doda se u reakcionu smešu. Reakciona smeša se izbistri posle nekoliko minuta i temperatura padne na ca. 50°C. Kalaj(IV) hlorid (154 ml, 1.31 mol) dodaje se tokom perioda od 15 minuta i mešanje se nastavlja na 80°C. Posle jednog sata, alikvot reakcione smeše se gasi dodavanjem vodenog rastvora natrijum-bikarbonata i vodeni sloj se ekstrahuje etil-acetatom. Etil-acetatni sloj se ispita TLC-om (silika gel, 20% etil-acetat u heptanu, Rfza šećerni derivat: 0.40). TLC analiza ukazuje na potpuni utrošak šećernog derivata. Željeni proizvod se detektuje TLC-om uz korišćenje 10% metanola u dihlorometanu (Rf. 0.37). Reakcija se takođe prati HPLC-om (Postupak # 2). Reakciona smeša se ohladi na 20°C i gasi dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum-bikarbonata (3000 ml) tokom perioda od 30 min (zapažena egzotermija kada se doda prvih nekoliko kapi rastvora natrijum-bikarbonata). Čvrsti natrij um-bikarbonat (1350 g) doda se u porcijama da bi se izbeglo penušanje. Smeša se kontroliše da bi se osiguralo da pH bude<>>7. Agitacija se zaustavi i ostavi se 20 minuta da se slojevi razdvoje. Vodeni sloj se istoči i meša sa etil-acetatom (1500 ml) i smeša se ostavi da se razdvoji (30 minuta). Organski sloj se izoluje i kombinuje sa acetonitriInim rastvorom. Organski rastvor se ispere slanom vodom (500 ml) i solvent se svede na zapreminu od ca. 750 ml. Proizvod može da se koristi kao takav u sledećoj reakciji. Isto tako, može da se dalje svede do bele penaste čvrste supstance, u kvantitativnom prinosu. Struktura jedinjenja 10 potvrđena je 'H NMR analizom.

Korak 6: Sinteza jedinjenja mCyd: 4- amino- l-( 3, 4- dihidroksi- 5- hidroksimetil- 3- metil-

tetrahidro- furan- 2- il)- 7//- pirimidin- 2- on

Natrijum metoksid (13.8 g, 0.26 mol) se doda u rastvor jedinjenja 10 (416 g, 0.73 mol) u metanolu (2000 ml). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi i prati se TLC-om (silika gel, 10% metanol u dihlorometanu, Rfjedinjenja 9: 0.53) i (silika gel, 30% metanol u dihlorometanu, Rf jedinjenja 11: 0.21). Proizvod počinje da precipitira posle 30 minuta i TLC ukazuje daje reakcija okončana posle dva sata. Reakcija se prati i HPLC-om (Postupak # 2). Metanol se ukloni na sniženom pritisku do zapremine od ca. 500 ml, a zatim etanol (2x500 ml), do zapremine od ca. 500 ml. Rezidualna gusta pasta se razblaži sa 750 ml etanola i smeša se meša na 20°C, jedan sat. Proizvod se sakupi filtracijom, filter-kolač se ispere etanolom (100 ml) i tert-butil-metil etrom (100 ml) i suši dajući 168 g (90% prinos za dva koraka) proizvoda 11 sa čistoćom od >97% (HPLC/AUC). Proizvod se takođe analizira sa<]>H i<13>C NMR.

Korak 7: Sinteza jedinjenja 14: 5-( 4- amino- 2- okso- 2//- pirimidin- l- il)- 4- hidroksi- 2-

hidroksimetil- 4- metil- tetrahidro- furan- 3- il estar 2- fert- butoksikarbonilamino- 3- metil buterne

kiseline

Rastvor N-(tert-butoksikarbonil)-L-valina (46.50 g, 214 mmol), karbonildiimidazola (34.70 g, 214 mmol), i anhidrovanog tetrahidrofurana (1000 ml) u 2 1-skom flakonu sa okruglim dnom, meša se na 25°C pod argonom, 1.5 sat, i zatim na 40-50°C, 20 minuta. U zasebnom 5 1-skom 5-grlom flakonu sa okruglim dnom opremljenom mešalicom odozgo, rashladnom kulom, temperaturnom sondom, adicionim levkom, i dovodom argona, doda se 4-amino-l-(3,4-dihidroksi-5-hidroksimctil-3-metil-tctrahidro-furan-2-il)-///-pirimidin-2-on (50.0 g, 195 mmol) i anhidrovani N,N-dimetilformamid (1000 ml). Ova smeša se zagreva na 100°C, 20 minuta dok svo pirimidin-2-on-izvedeno jedinjenje ne uđe u rastvor, a zatim se u rastvor dodaju trietil amin (500 ml) i 4-dimetilaminopiridin (2.38 g, 19 mmol). Smeša se potom zagreva na 97°C, 20 minuta i rastvor tetrahidrofurana se polako dodaje kroz adicioni levak tokom 2 sata, uz održavanje temperature ne niže od 82°C. Reakciona smeša se zagreva na 82°C, 1 sat i prati se pomoću HPLC (proizvod = 68%, SM = 11% i nečistoća na oko 12 min = 17%, isključujući dimetilaminopiridin). Reakciona smeša se ohladi na sobnu temperaturu i zatim se trietilamin i tetrahidrofuran uklone pod vakuumom na 30°C. Rastvor se zatim neutrališe sirćetnom kiselinom do pH 7.69. N,N-dimetilformamidin se ukloni pod vakuumom na 35°C, posle čega sledi etil acetat (2x200 ml). Sirovi proizvod se meša sa etil-acetatom (500 ml) i vodom (300 ml). Dva sloja se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahuje etil-acetatom (500 ml). Kombinovani organski slojevi se isperu vodenim zasićenim slanim rastvorom (500 ml). Zatim se organski sloj ekstrahuje vodenim rastvorom malonske kiseline (4x400 ml, 10 tež.%). Organski sloj se kontroliše TLC-om (silika, 20% metanol u dihlorometanu) da se osigura uklanjanje svog željenog proizvoda iz organskog sloja. Kiselinski vodeni ekstrakti se kombinuju i hlade u ledenom kupatilu i neutrališu trietilaminom do pH 7.40, tako da čvrste supstance izađu iz rastvora. Vodenom sloju se zatim doda etil-acetat. Bele čvrste supstance se sakupe vakuumskom filtracijom. Sušenjem dobijenih čvrstih supstanci u vakuumu dobija se 81.08 g prvog prinosa sa čistoćom 99.01 (HPLC).

Korak 8: Sinteza 5-( 4- amino- 2- okso- 2/ 7- pirimidin- l- il)- 4- hidroksi- 2- hidroksi- metil- 4- metil-

tetrahidro- furan- 3- il estra val- mCyd- 2- amino- 3- metil- buterne kiseline ( dihidro- hloridna so)

Rastvor jedinjenja 14 (21.0 g, 0.046 mol) u etanolu (168 ml) meša se u flakonu sa okruglim dnom opremljenim mešalicom odozgo, temeparturnom sondom, dovodom argona i uređajem za uvođenje gasovitog hlorovodonika u vidu mehurića. Gasoviti hlorovodonik (22 g) u vidu mehurića se uvodi u bistar rastvor tokom perioda od jednog sata. Reakciona temperatura se održava ispod 30°C korišćenjem ledenog vodenog kupatila. Formiranje čvrste supstance počinje posle nekoliko minuta od uvođenja gasovitog hlorovodonika. Posle 4 sata, HPLC (Postupak # 3) pokazuje samo 0.8% polaznog materijala. Čvrste supstance se sakupe filtarcijom i filter-kolač se ispere ctanolom (20 ml) i di-etil etrom (100 ml). Posle sušenja proizvoda pod vakuumom, 16 sati, dobija se 19.06 g (96.5%) val-mCyd-a sa čistoćom 97.26% (HPLC, Postupak # 3); m. p. 210°C (braon), 248-250T (istopljeno);<*>H NMR(DMSO-<4)8 ppm 10.0 (s, IH,\/ 7NH2,D20 razmenljivo), 8.9-8.6 (2 br s, 4H,\/ 2NH2, N/f3,D20 razmenljivo), 8.42 (d, IH,H- 6,J5.6=7.9 Hz), 6.24 (d, IH,H- 5,J5-6=7.9 Hz), 5.84 (s, IH,H- V),5.12 (d, IH,H- 3',J3-4=8.8 Hz), 4.22 (d, IH,H- 4,J3..4=8.7 Hz), 4.0-3.9 (m, IH,CH),3.8-3.5 (m, 2H,H- 5', H- 5"), 23- 2A(m, IH,CH),1.16 (s, 3H,Cr73),1.0 (m, 6H, (C//3)2CH); FAB>0 (GT) 713 (2M+H)<+>, 449 (M+G+H)<+>, 357 (M+Hf, 246 (S)<+>, 112 (B+2H)<+>; FAB<0 (GT) 747 (2M+C1V, 483 (M+G+CIV, 391 (M+Cl)", 355 (M-HV, 116 (Val)", 110 (BV, 35 (Cl). ;Dva različita HPLC postupka koriste se za analizu gornjih jedinjenja. Oba postupka koriste sledeću reverzno-faznu kolonu: ;Postupak 1 ;254 nm. 1.00 ml/min stopa protoka acetonitril/voda linearnog gradijenta kako je opisano dole. Vreme prolaza 20 minuta. Petominutna ekvilibracija između prolaza. ; ;Postupak 2: ;Identifikacija je obavljena na 272 nm. Korišćena je kolona VVaters Novapak<®>Cl8, 3.9x150 mm ID, 4 um veličina čestica, 60 A veličina pora, ili ekvivalentno. Hromatografski uslovi su sledeći: injekcioni volumen=10 u.1, temperatura kolone=25°C, stopa protoka=1.00 ml/min, ultraljubičasti detektor na 272 nm, vreme prolaza je 35 min. Uslov pogodnosti sistema za procentnu relativnu standardnu devijaciju za referentni standard nije više od 1.0%. ; ;Stereohemija;Razume se da nukleozidi predmetnog pronalaska imaju nekoliko hiralnih centara i mogu postojati i biti izolovani u optički aktivnim i racemskim formama. Neka jedinjenja mogu pokazivati polimorfizam. Treba shvatiti da predmetni pronalazak obuhvata svaku racemsku, optički aktivnu, dijastereomernu, polimorfnu, ili stereoizomernu formu, ili njihove mešavine, jedinjenja pronalaska koje poseduju ovde opisana korisna svojstva. U struci je dobro poznato kako se pripremaju optički aktivne forme (na primer, rezolucijom racemske forme tehnikama rekristalizacije, sintezom iz optički aktivnih polaznih materijala, hiralnom sintezom, ili hromatografskom separacijom korišćenjem hiralne stacionare faze). ;Preciznije, kako su 1' i 4' ugljenici nukleozida hiralni, njihovi nevodonični supstituenti (bazne i CHOR grupe, respektivno) mogu biti cis (na istoj strani) ili trans (na suprotnim stranama) u odnosu na prstenasti sistem šećera. Četiri optička izomera su tako predstavljena sledećim konfiguracijama (kada se šećerni deo orijentiše u horizontalnoj ravni tako daje atom kiseonika pozadi): cis (sa obe grupe "gore", što odgovara konfiguraciji (3-D-nukleozida koji se prirodno sreću), cis (sa obe grupe "dole", što je (3-L-konfiguracija koja se ne sreće prirodno), trans (sa C2' supstituentom "gore" i C4' supstituentom "dole), i trans (sa C2' supstituentom "dole" i C4' supstituentom "gore"). "D-nukleozidi" su cis nukleozidi u priodnoj konfiguraciji i "L-nukleozidi" su cis nukleozidi u konfiguraciji koja se ne sreće prirodno. ;Isto tako, većina amino-kiselina su hiralne (označene kao L ili D, gde L enantiomer predstavlja konfiguraciju koja se prirodno sreće) i mogu postojati kao zasebni enantiomeri. ;Primeri postupaka za dobijanje optički aktivnih materijala poznati su u struci, i uključuju bar sledeće. ;i) fizičko razdvajanje kristala - tehnika kojom se makroskopski kristali pojedinačnih enantiomera ručno razdvajaju. Ova tehnika može da se koristi ako postoje kristali različitih enantiomera, tj. materijal je konglomerat, i kristali se vizuelno razlikuju; ;ii) simultana kristalizacija - tehnika kojom se pojedinačni enantiomeri pojedinačno kristalizuju iz rastvora racemata, moguća samo ako je ovo drugo konglomerat u čvrstom stanju; ;iii) enzimske rezolucije - tehnika u kojoj postoji delimično ili potpuno razdvajanje racemata na osnovu različitih stopa reakcije enantiomera sa enzimom; ;iv) enzimska asimetrična sinteza - tehnika sinteze u kojoj bar jedan korak u sintezi koristi enzimsku reakciju za dobijanje enantiomerski čistog ili obogaćenog sintetskog prekursora željenog enantiomera; ;v) hemijska asimetrična sinteza - tehnika sinteze u kojoj se željeni enantiomer sintetiše od ahiralnog prekursora pod uslovima koji ;proizvode asimetriju (tj. hiralitet) kod proizvoda, što može da se postigne ;korišćenjem hiralnih katalizatora ili hiralnih pomoćnih sredstava; ;vi) dijastereomerne separacije - tehnika u kojoj racemsko jedinjenje reaguje sa enantiomerski čistim reagensom (hiralnim pomoćnim sredstvom) koji konvertuje pojedinačne enantiomere u dijastereomere. Dobijeni dijastereomeri se zatim razdvajaju hromatografijom ili kristalizacijom na osnovu njihovih sada izrazitijih strukturnih razlika, a hiralno pomoćno ;sredstvo se kasnije uklanja da se dobije željeni enantiomer; ;vii) asimetrične transformacije prvog i drugog reda - tehnika kojom se dijastereomeri racemata uravnotežavaju tako da se u rastvoru dobije prevaga dijastereomera željenog enantiomera ili gde preferencijalna kristalizacija dijastereomera željenog enantiomera narušava ekvilibrijum tako da se konačno u principu sav materijal konvertuje u kristalinski dijastereomer željenog enantiomera. Željeni enantiomer se zatim ;oslobađa iz dijastereomera. ;viii) kinetičke rezolucije - ova tehnika se odnosi na postizanje delimične ili potpune rezolucije racemata (ili dalje rezolucije delimično razdvojenog jedinjenja) na osnovu nejednakih stopa reakcije enantiomera sa hiralnim, ;neracemskim reagensom ili katalizatorom pod kinetičkim uslovima; ;ix) enantiospecifična sinteza iz neracemskih prekursora - tehnika sinteze u kojoj se željeni enantiomer dobija iz nehiralnih polaznih materijala i gde stereohemijski integritet nije ili je minimalno kompromitovan tokom ;sinteze; ;x) hiralnatečna hromatografija - tehnika u kojoj se enantiomeri racemata razdvajaju u tečnoj mobilnoj fazi na osnovu njihovih različitih interakcija sa stacionarnom fazom. Stacionarna faza može biti načinjena od hiralnog materijala ili mobilna faza može da sadrži dodatni hiralni materijal za ;izazivanje razlikujućih interakcija; ;xi) hiralna gasna hromato grafija - tehnika u kojoj racemat isparava i ;enantiomeri se razdvajaju na osnovu različitih interakcija u gasovitoj mobilnoj fazi sa kolonom koja sadrži fiksiranu neracemsku hiralnu adsorbentsku fazu; ;xii) ekstrakcija sa hiralnim solventima - tehnika kojom se enantiomeri razdvajaju na osnovu preferencijalne rastvorljivosti jednog enantiomera u određenom hiralnom solventu; ;xiii) transport kroz hiralne membrane - tehnika u kojoj se racemat dovodi u kontakt sa tankom membranskom barijerom. Barijera tipično razdvaja dve tečnosti koje se mešaju, jedna od njih sadrži racemat, i pokretačka snaga kao što je razlika u koncentraciji ili pritisku izaziva preferencijalni transport kroz membransku barijeru. Do razdvajanja dolazi kao rezultat neracemske hiralne prirode membrane koja dozvoljava da samo jedan enantiomer racemata prođe. ;III. Farmaceutskesmeše ;Domaćini, uključujući ljude, inficirani pestivrusom, flavivirusom, HCV-om ili drugim organizmom koji se replicira preko virusne RNK-zavisne RNK-polimeraze, ili koje treba lečiti od bilo kog drugog ovde opisanog poremećaja, mogu biti lečeni primenom, kod pacijenta, efikasne količine aktivnog jedinjenja ili njegovog farmaceutski prihvatljivog proleka ili soli u prisustvu farmaceutski prihvatljivog nosača ili diluenta. Aktivni materijali mogu da se primene bilo kojim pogodnim putem, na primer, oralno, parenteralno, intravenski, subkutano, ili površinski, u tečnoj ili čvrstoj formi. ;Poželjna doza jedinjenja za pestivirus, flavivirus ili HCV biće u opsegu od oko 1 do 50 mg/kg, poželjno 1 do 20 mg/kg, telesne težine dnevno, opštije, 0.1 do oko 100 mg po kilogramu telesne težine primaoca dnevno. Niže doze mogu biti poželjne, na primer doze od 0.5-100 mg, 0.5-50 mg, 0.5-10 mg, ili 0.5-5 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Mogu biti korisne čak i niže doze, tako da opseg može uključuti 0.1 do 0.5 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Efikasni dozni opseg farmaceutski prihvatljivih soli i prolekova može da se izračuna na osnovu težine matičnog nukleozida koji se dostavlja. Ukoliko so ili prolek ispoljavaju aktivnost po sebi, efikasna doza može da se proceni kao gore korišćenjem težine soli ili proleka, ili na druge načine koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. ;Jedinjenje se uobičajeno primenjuje u svakoj pogodnoj jediničnoj doznoj formi, uključujući ali se ne ograničavajući na onu koja sadrži 7 do 3000 mg, poželjno 70 do 1400 mg aktivnog sastojka po jediničnoj doznoj formi. Oralna doza od 50-1000 mg obično je pogodna, sadržana u jednoj ili više doznih formi od 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ili 1000 mg. Mogu biti poželjne niže doze, na primer, od 10-100 ili 1-50 mg. Imaju se u vidu i doze od 0.1-50 mg, ili 0.1-20 mg ili 0.1-10.0 mg. Pored toga, niže doze mogu da se koriste u slučaju primene neoralnim putem, na primer, injekcijom ili inhalacijom. ;Idealno, aktivni sastojak treba da se primeni da se postigne pik koncentracije aktivnog jedinjenja u plazmi od oko 0.2 do 70 uM, poželjno oko 1.0 do 10 uM. Ovo može da se postigne, na primer, intravenskom injekcijom 0.1 do 5% rastvora aktivnog sastojka, po slobodnom izboru u slanom rastvoru, ili primenom aktivnog sastojka u vidu bolusa. ;Koncentracija aktivnog jedinjenja u smeši leka zavisiće od stope apsorpcije, inaktivacije i ekskrecije leka kao i od drugih faktora poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Treba napomenuti da će vrednosti doza takođe varirati u zavisnosti od oboljenja koje treba ublažiti. Treba dalje razumeti da za svakog subjekta ponaosob, specifični dozni režimi treba da se podese tokom vremena prema individualnoj potrebi, i po profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili nadgleda primenu smeša, i da ovde izloženi opsezi koncentracija predstavljaju samo primere, bez namere da se ograniče okvir ili praktična primena zahtevane smeše. Aktivni sastojak može da se primeni odjednom, ili može da se podeli u veći broj manjih doza koje se primenjuju u različitim intervalima vremena, sa ili bez drugih antivirusnih sredstava. ;Poželjni način primene aktivnog jedinjenja je oralnim putem. Oralne smeše obično uključuju inertni diluent ili jestivi nosač. Mogu biti zatvorene u želatinske kapsule ili komprimovane u tablete. Za oralnu terapijsku primenu, aktivno jedinjenje može da bude udruženo sa ekscipijentima i upotrebljeno u vidu tableta, troheja ili kapsula. Farmaceutski kompatibilna povezujuća sredstva, i/ili adjuvansni materijali mogu biti uključeni kao deo smeše. ;Tablete, pilule, kapsule, troheje i slično mogu sadržati bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: povezivač kao mikrokristalin celuloza, tragantovu smolu, želatin; ekscipijent kao škrob ili laktoza, dezintegrišuće sredstvo kao alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni škrob; lubrikant kao magnezijum-stearat ili Sterotes; glidans kao koloidni silicijum-dioksid; sredstvo za zaslađivanje kao saharoza ili saharin; sredstvo za poboljšanje ukusa kao pepermint, metil-salicilat, ili aroma pomorandže. Kada je jedinična dozna forma kapsula, ona može da sadrži, pored materijala gore navedenog tipa, tečni nosač kao masno ulje. Pored toga, jedinične dozne forme mogu da sadrže različite druge materijale koji modifikuju fizički oblik dozne jedinice, na primer, omotače od šećera, šelaka, ili drugih enetričnih sredstava. ;Jedinjenje može da se primeni kao komponenta eliksira, suspenzije, sirupa, oblande, žvakaće gume ili slično. Sirup može da sadrži, pored aktivnih jedinjenja, saharozu kao sredstvo za zaslađivanje i neke prezervanse, boje i sredstva za obojenje i aromate. ;Jedinjenje ili njegov farmaceutski prihvatljivi prolek ili so mogu takođe da se pomešaju sa drugim aktivnim materijalima koji ne umanjuju željeno dejstvo, ili sa materijalima koji dopunjavaju željeno dejstvo, kao što su antibiotici, antifungalna sredstva, antiinflamatorna sredstva, ili druga antivirusna sredstva, uključujući druga nukleozidna jedinjenja. Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu, subkutanu ili površinsku promenu mogu da sadrže sledeće komponente: sterilni diluent kao što su voda za injekciju, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen-glikole, glicerin, propilen-glikol ili druge sintetske rastvarače; antibakterijska sredstva kao što su benzil-alkohol ili metil-parabeni; antioksidante kao askorbinska kiselina ili natrijum-bisulfit; helirajuća sredstva kao etilendiamintetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao natrijum-hlorid ili dekstroza. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampule, jednokratne špriceve ili višestruke dozne bočice napravljene od stakla ili plastike. ;Ukoliko je primena intravenska, poželjni nosači su fiziološki slani rastvor ili fosfatom puferisani slani rastvor( phosphate buffered saline,PBS). ;U poželjnom vidu, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će štititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, na pr. formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane dostavne sisteme, mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri na pr. etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Materijali mogu da se nabave i komercijalno, od Alza Corporation. ;Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome sa monoklonskim antitelima na virusne antigene, usmerene ka inficiranim ćelijama) takođe su poželjni kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Mogu se pripremiti postupcima koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, na pr. kako je opisano u U. S. Patent No. 4,522,811 (koji je ovde uključen kao referenca u celini). Na primer, lipozomske formulacije mogu da se pripreme rastvaranjem odgovarajućeg (odgovarajućih) lipida kao što su sterol fosfatidil etanolamin, stearoil fosfatidil holin, arahadoil fosfatidil holin i holesterol, u neorganskom solventu koji zatim evaporiše ostavljajući tanku prevlaku osušenog lipida na površini kontejnera. Vodeni rastvor aktivnog jedinjenja ili njegovi monofosfatni, difosfatni, i/ili trifosfatni derivati zatim se unesu u kontejner. Kontejner se zatim provrti rukom da se lipidni materijal oslobodi sa stranica kontejnera i da se disperguju lipidni agregati, čime se formira lipozomska suspenzija. ;IV. Prolekovi i derivati;Formulacije soli ;Primena nukleozida kao farmaceutski prihvatljive soli obuhvaćena je okvirom pronalaska. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli su organsko-kiselinske adicione soli formirane sa kiselinama, što obezbeđuje fiziološki prihvatljivi anjon. One uključuju, na primer, tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, a-ketoglutarat i a-glicerofosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, i salicilat. Mogu takođe da se formiraju pogodne neorganske soli, uključujući sulfatne, nitratne, bikarbonatne, hidrobromatne, karbonatne soli i soli fosforne kiseline. Posebno poželjan vidje mono ili dihidrohloridna so. ;Farmaceutski prihvatljive soli mogu da se dobiju korišćenjem standardnih postupaka dobro poznatih u struci, na primer reakcijom dovoljno baznog jedinjenja kao što je amin sa pogodnom kiselinom koja daje fiziološki prihvatljivi anjon. Karbonsko-kiselinske soli alkalnog metala (na primer, natrijum kalijum ili litijum) ili zemno-alkalnog metala (na pr. kalcijum), takođe mogu da se pripreme. U jednom vidu, so je hidrohloridna so jedinjenja. U daljem vidu, farmaceutski prihvatljiva so je dihidrohloridna so jedinjenja Formule (I). Jedinjenja ovog pronalaska poseduju antivirusnu aktivnost protiv flavivirusa, pestivirusa ili HCV, ili se metabolišu do jedinjenja koja ispoljavaju takvu aktivnost. ;Nukleotidni prolekovi ;Ovde opisani nukleozidi mogu da se primene kao nukleotidni prolekovi da bi se poboljšala aktivnost, bioraspoloživost, stabilnost ili na drugi način izmenile osobine nukleozida. Poznat je veći broj liganda nukleotidnog proleka. U principu, alkilacija, acilacija ili druga lipofilna modifikacija mono-, di- ili trifosfata nukleozida redukuje polarnost i dopušta prolaz u ćelije. Primeri supstituentnih grupa koje mogu da zamene jedan ili više vodonika na fosfatnom delu su alkil, aril, steroidi, ugljeni hidrati, uključujući šećere, i alkoholi, kao 1,2-diacilglicerol. Mnogi su opisani u R. Jones and N. Bischoferger,Antiviral Research, 1995, 27:1-17. Svaki od njih može da se koristi u kombinaciji sa otkrivenim nukleozidima da bi se postigao željeni efekat. ;Aktivni nukleozid takođe može da se obezbedi kao 5'-fosfoetarski lipid ili 5'-etarski lipid. Neograničavajući primeri su otkriveni u sledećim referencama, koje su ovde uključene kao reference: Kucera, L. S., N. Iyer, E. Leake, A. Raen, Modest E. K., D. L. W, and C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation".A1DS Res. Hum. Retro Viruses.6: 491-501; Piantadosi, C, J. Marasco C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K. S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi, and E. J. Modest. 1991. "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity".J. Med. Chem.34: 1408-1414; Hosteller, K. Y., D. D. Richman, D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. van Wijk, and H. van den Bosch, 1992. "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3-deoxythymidine".Antimicro. Agents Chemother.36: 2025-2029; Hosetler, K. Y., L. M. Stuhmiller, H. Lenting, H. van den Bosch, and D. D. Richman, 1990. "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides".J. Biol. Chem.265: 61127. ;Neograničavajući primeri U. S. patenata koji otkrivaju pogodne lipofilne supstituente koji mogu biti kovalentno inkorporisani u nukleozid, poželjno na 5'-OH poziciji nukleozida ili njegovog lipofilnog preparata, uključuju U. S. Patent Nos. 5,149,794 (22. sept.1992, Yatvin et al.); 5,194,654 (16. mart 1993, Hostetler et al.); 5,223,263 (29. jun 1993, Hostetler et al.); 5,256,641 (26. okt. 1993, Yatvin et al.); 5,411,947 (2. maj 1995, Hostetler et al.); 5,463,092 ;(31. okt. 1995, Hostetler et al.); 5,543,389 (6. avg. 1996, Yatvin et al.); 5,543,390 (6. avg. 1996, Yatvin et al.); 5,543,391 (6. avg. 1996, Yatvin et al.); i 5,554,728 (10. sept. 1996, Basava et al.), koji su svi ovde uključeni po referenci. Inostrane patentne prijave koje otkrivaju lipofilne supstituente koji mogu da se prikače za nukleozide predmetnog pronalaska, ili lipofilne preparate,uključuju WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, i WO 91/19721. ;V. Kombinaciona ili alternaciona terapija;Aktivna jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da se primene u kombinaciji ili alteranaciji sa drugim antiflavivirusnim ili antipestivirusnim sredstvom, ili posebno, anti-HCV sredstvom. U kombinacionoj terapiji, efikasne doze dva ili više sredstava primenjuju se zajedno, dok se u alternacionoj ili terapiji sekvencijalnih koraka, efikasna doza svakog sredstva primenjuje serijski ili sekvencijalno. Date doze zavisiće od stope apsorpcije, inaktivacije i ekskrecije leka kao i od drugih faktora poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Treba napomenuti da dozne vrednosti variraju takođe i sa jačinom oboljenja koje treba ublažiti. Dalje treba razumeti da tokom vremena specifični dozni režimi i rasporedi za svakog subjekta ponaosob treba da budu podešeni prema individualnoj potrebi i po profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili nadgleda primenu smeša. U poželjnim vidovima, poželjno je anti-HCV (ili antipestivirusno ili antiflavivirusno) jedinjenje koje ispoljava EC5ood 10-15 uM, ili poželjno manje od 1-5 uM. ;Treba reći da posle produženog lečenja antivirusnim sredstvom može doći do pojave varijanti flavivirusa, pestivirusa ili HCV rezistentnih na lek. Do rezistencije na lek tipično dolazi zbog mutacije gena koji kodira enzim koji se koristi u replikaciji virusa. Efikasnost leka protiv virusne infekcije može da se produži, poveća ili obnovi primenom jedinjenja u kombinaciji ili alternaciji sa drugim, i moguće trećim antivirusnim jedinjenjem koje indukuje mutacije različite od onih koje su izazvane glavnim lekom. Alternativno, farmakokinetika, biodistribucija ili drugi parametri leka mogu da se promene ovakvom kombinacionom ili alternacionom terapijom. U principu, kombinaciona terapija tipično ima prednost u odnosu na alternacionu zato što indukuje višestruke istovremene napade na virus. ;Bilo koji od virusnih tretmana opisanih u Osnovi pronalaska može da se koristi u kombinaciji ili alternaciji sa jedinjenjima opisanim u ovoj specifikaciji. Neograničavajući primeri uključuju sledeće: ;(1) Inhibitori proteaze ;Primeri uključuju na supstratu bazirane inhibitore NS3 proteaze (Attvvood et al.,Antiviral peptide derivatives,PCT WO 98/22496, 1998; Attvvood et al.,Antiviral Chemistrv and Chemotherapv1999,10,259-273; Attvvood et al.,Preparation and use of amino acid derivatives as anti- viral agents,German Patent Pub. DE 19914474; Tung et al.,Inhibitors of serine proteases, particularlv hepatitis C virus NS3 protease,PCT WO 98/17679), uključujući alfaketoamide i hidrazinouree, i inhibitore koji se završavaju eletrofilom kao boronska kiselina( boronic acid)ili fosfonat (Llinas-Brunet et al.,Hepatitis C inhibitor peptide analogues.PCT WO 99/07734); inhibitore NS3 proteaze koji nisu bazirani na supstratu, na pr. derivati 2,4,6-trihidroksi-3-nitro-benzamida (Sudo, K. et al.,Biochemical and Biophvsical research Communications, 1997, 238,643-647; Sudo, K. et al.,Antiviral Chemistrv and Chemotherapv, 1998, 9,186), uključujući RD3-4082 i RD3-4078, prvi supstituisan na amidu sa 14-ugljeničnim lancem, a drugi obrađen para-fenoksifenil grupom; i Sch 68631, fenantrenhinon, inhibitor proteaze HCV-a (Chu, M. et al.,Tetrahedron Letters37, 7229-7232, 1996). ;Sch 351633, izolovan iz gljivicePenicillium griseofulvum,identifikovan je kao inhibitor proteaze (Chu, M. et al.,Bioorganic and Medicinal Chemistiy Letters9: 1949-1952). Eglin c izolovan iz pijavice, snažnije inhibitor nekoliko serin-proteaza, kao što su proteaza S. griseus A i B, a-himotripsin, himaza i subtilizin. Qasim M. A. et al.,Biochemistry36: 1598-1607, 1997. ;U. S. patenti koji otkrivaju proteazne inhibitore za lečenje HCV uključuju na primer, U. S. Patent No. 6,004,933, Spruce et al., koji otkriva klasu inhibitora cistein-proteaze za inhibiciju HCV-endopeptidaze 2. U. S. Patent No. 5,990,276, Zhang et al., koji otkriva sintetičke inhibitore NS3-proteaze virusa hepatitisa C; U. S. Patent No. 5,538,865, Reyes et al.; WO 02/008251, Corvas International, Ine, i WO 02/08187 i WO 02/008256, Schering Corporation. HCV-inhibitomi tripeptidi otkriveni su u U. S. Patent Nos. 6,534,523, 6,410,531, i 6,420,380, Boehringer Ingelhcim i WO 02/060926, Bristol Myers Squibb. Diaril peptidi kao inhibitori NS3 serin-proteaze HCV-a otkriveni su u WO 02/48172, Schering Corporation. Imidazolidindioni kao inhibitori NS3 serin-proteaze HCV-a otkriveni su u WO 02/08198, Schering Corporation i WO 02/48157. Bristol Myers Squibb. WO 98/17679, Vertex Pharmaceuticals i WO 02/48116, Bristol Myers Squibb takođe otkrivaju inhibitore HCV-proteaze. (2) Derivati tiazolidina koji pokazuju relevantnu inhibiciju u reverzno-faznom HPLC testu sa NS3/4A fuzionim proteinom i NS5A/5B supstratom (Sudo K. et al.,Antiviral Research,1996,32,9-18), naročito jedinjenje RD-1-6250, koje poseduje fuzionisani cinamoilski deo supstituisan sa dugim alkil lancem, RD4 6205 i RD4 6193; (3) Tiazolidini i benzanilidi identifikovani u Kakiuchi N, et al.,J. EBS Letters 421,217-220; Takeshita N. et al.,Analytical Biochemistry, 1997, 247, 242-246;(4) Fenantrenhinon koji poseduje aktivnost protiv proteaze u SDS-PAGE i autoradiografskom testu, izolovan iz fermentacionog medijuma kultureStreptomyces sp.,Sch 68631 (Chu M. et al.,Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232),i Sch 351633, izolovan iz gljivicePenicillium griseofulvumkoji pokazuje aktivnost u blizinsko-scincilacionom testu (Chu M., et al.,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9,1949-1952); (5) Inhibitori helikaze (Diana G. D. et al.,Compounds, compositions and methods for treatment of hepatitis C,U. S. Pat. No. 5,633,358; Diana G. D. et al.,Piperidine derivatives, pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C,PCT WO 97/36554); (6) Nukleotidni inhibitori polimeraze i gliotoksin (Ferrari R. et al.,Journal of Virology,1999,73,1649-1654), i prirodni produkt cerulenin (Lohmann V. et al.,Virology, 1998, 249,108-118); (7) Besmisleni( antisense)fosforotioat oligodeoksinukelotidi (S-ODN) komplementarni sa sekvencionim nizovima u 5' nekodirajućem regionu (NCR) virusa (Alt M. et al.,Hepatology,1995,22,707-717), ili nukleotidima 326-348 koji uključuju 3' kraj NCR i nukleotidima 371-388 smeštenim u srž-kodirajućem regionu RNK HCV-a (Alt M. et al.,Archives of Virologv,1997,142,589-599; Galderisi U. et al.,Journal of Cellular Physiolog<y>,1999, 181, 251-257); (8) Inhibitori IRES-zavisne translacije (Ikeda N., et al.,Agent for the prevention and treatment of hepatitis C,Japanese Patent Pub. JP-08268890; Kai Y. et al.,Prevention and treatment of viral diseases,Japanese Patent Pub. JP-10101591); (9) Ribozimi, na pr. nukleaza-rezistentni ribozimi (Maccjak, D. J. et al.,Hepatology 1999, 30.abstract 995) i oni opisani u U. S. Patent No. 6,043,077, Barber et al., i U. S. Patent Nos. 5,869,253 i 5,610,054, Draper et al.; i ;(10) Nukleozidni analozi su takođe razvijeni za lečenje infekcija flaviviridama. ;(11) Svako od jedinjenja koje su opisali Idenix Pharmaceuticals u International Publication Nos. WO 01/90121 i WO 01/92282; (12) Druge patentne prijave koje otkrivaju neke nukleozidne analoge za lečenje od virusa hepatitisa C uključuju: PCT/CA00/01316 (WO 01/32153, podneto 3. novembra 2000) i PCT/CA01/00197 (WO 01/60315; podneto 19. februara 2001), podneli BioChem Pharma, Inc. (sada Shire Biochem., Inc.); PCT/US02/01531 (WO 02/057425; podneto 18. januara 2002) i PCT/US02/03086 (WO 02/057287; podneto 18. januara 2002) podneli Merck & Co., Inc., PCT/EP01/09633 (WO 02/18404; objavljeno 21. avgusta 2001), podneli Roche, i PCT Publication Nos. WO 01/79246 (podneto 13. aprila 2001), WO 02/32920 (podneto 18. oktobra 2001) i WO 02/48165, Pharmasset, Ltd. (13) PCT Publication No. WO 99/43691, za Emory University, pod nazivom "2'-Fluoronucleosides" otkriva upotrebu nekih 2'-fluoronukleozida za lečenje od HCV-a. (14) Druga raznolika jedinjenja, uključujući 1-amino-alkilcikloheksane (U. S. Patent No. 6,034,134, Gold et al.), alkil-lipide (U. S. Pat. No. 5,922,757, Chojkier et al.), vitamin E i druge antioksidante (U. S. Pat. No. 5,922,757, Cojkier et al.), skvalen, amantadin, žučne kiseline (U. S. Pat. No. 5,846,964, Ozeki et al.), N-(fosfonoacetil)-L-asparaginsku kiselinu, (U. ;S. Pat. No. 5,830,905, Diana et al.), benzendikarboksiamide (U. S. Pat. No. 5,633,388, Diana et al.), derivate poliadenilne kiseline (U. S. Pat. No. 5,496,546, Wang et al.), 2',3'-dideoksinozin (U. S. Pat. No. 5,026,687, Yarchoan et al), benzimidazole (U. S. Pat. No. 5.891,874, Colacino et al.), biljne ekstrakte (U. S. Pat. No. 5,837,257, Tsai et al, U. S. Patent No. 5,725,859, Omer et al, i U. S. Patent No. 6,056,961), i piperadine (U. S. Patent No. 5,830,905, Diana et al.). ;(15) Svako drugo jedinjenje koje je trenutno u fazi prekliničkog ili kliničkog razvoja za lečenje od virusa hepatitisa C uključujući: Interleukin-10 za Schering-Plough, IP-501 za Interneuron, Merimebodib (VX-497) za Vertex, AMANTADINE<®>(Svmmetrel) za Endo Labs Solvav, HEPTAZYME® za RPI, IDN-6556 za Idun Pharma., XTL-002 za XTL., HCV/MF59 za Chiron, CIVACIR (hepatitis C imuni globulin) za NABI, LEVOVIRIN<®>za ICN/Ribapharm, VIRAMIDINE<®>za ICN/Ribapharm, ZADAXIN<®>(timozin-alfa) za Sci Clone, timozin plus pegilisani interferon za Sci Clone, CEPLENE<®>(histamin dihidrohlorid) za Maxim, VX 950 / LY 570310 za Vertex/Eli Lilly, ISIS 14803 za Isis Pharmaceutical/Elan, IDN-6556 za Idun Pharmaceuticals, Inc., JTK 003 za AKROS Pharma, BILN-2061 za Boehringer Ingelheim, CellCept (mikofenolat mofetil) za Roche, T67, inhibitor P-tubulina za Tularik, terapijsku vakcinu usmerenu na E2 za Innogenetics, FK788 za Fujisawa Healthcare, Inc., IdB 1016 (Siliphos, oralni silibin-fosfatidilholin fitozom), inhibitorei replikacije RNK (VP50406) za ViroPharma/Wyeth, terapijsku vakcinu za Intercell, terapijsku vakcinu za Epimmune/Genencor, inhibitor IRES-a za Anadys, ANA 245 i ANA 246 za Anadys, imunoterapiju (Therapore) za Avant, inhibitor proteaze za Corvas/Schering, inhibitor helikaze za Vertex, inhibitor fuzije za Trimeris, terapiju T-ćelijama za CellExSys, inhibitor polimeraze za Biocryst, herniju uperenu na RNK za PTC Therapeutics, Dication za Immtech, Int, inhibitor proteaze za Agouron, inhibitor proteaze za Chiron/Medivir, "antisense" terapiju za AVI Biopharma, "antisense" terapiju za Hybridon, hemoprečistače za Aethion Medical, terapisjku vakcinu za Merix, inhibitor proteaze za Bristol-Myers Squibb/Axys, Chron-VacC, terapijsku vakcinu za Tripep, UT 231B za United Therapeutics, inhibitore proteaze, helikaze i polimeraze za Genelabs Technologies, IRES-inhibitore za Immusol, R803 za Rigel Pharmaceuticals, INFERGEN<®>;(interferon alfakon-1) za InterMune, OMNIFERON<®>(prirodni interferon) za Viragen, ALBUFERON<®>za Human Genome Sciences, REBIF (interferon beta-la) za Ares-Serono, ;Omega Interferon za BioMedicine, oralni interferon alfa za Amarillo Biosciences, interferon gama, interferon tau, i interferon gama-lb za InterMune. ;V. Biološki podaci;Sistemi ćelijskih kultura za određivanje antivirusne aktivnosti;Koristan test za detektovanje HCV i njegove inhibicije zasnovan na ćelijama procenjuje nivoe replikonske RNK iz Huh7 ćelija koje nose HCV-replikon. Ove ćelije mogu da se kultivišu u standardnom medijumu, na primer DMEM medijumu (visoki nivo glukoze, bez piruvata), dopunjenom sa 10% fetalnim goveđim serumom, 1<*>neesencijalnim amino-kiselinama, Pen-Strep-Glu (100 jed./litru, 100 mikrograma/litru, i 2.92 mg/litru, respektivno), i G418 (C20H40N4O10; 500-1000 miligrama/mililitru). Antivirusni skrining testovi mogu da se obave u istom medijumu bez G418. Da bi se zadržale u logaritamskoj fazi rasta, ćelije se zaseju na ploče sa 96 rezervoarčića pri niskoj gustini (na pr. 1000 ćelija po rezervoarčiću). Zatim se odmah posle uvođenja ćelija doda testno jedinjenje i vrši se inkubacija 3 do 7 dana na 37°C u inkubatoru. Zatim se medijum ukoloni, i ćelije pripreme za totalnu ekstrakciju RNK (replikonska RNK + RNK domaćina). Replikonska RNK se zatim amplifikuje premareal- timeRT-PCR (Q-RT-PCR) protokolu i kvantifikuje.

Zapažene razlike pri kvantifikaciji replikonske RNK jedan su način za izražavanje antivirusnog potencijala testnog jedinjenja. U tipičnom eksperimentu, komparabilna količina replikona proizvodi se u negativnoj kontroli i sa neaktivnim jedinjenjima. Ovo se može izvršiti ako je mereni prag ciklusa za HCV RT-PCR u obe postavke približno isti. U takvim eksperimentima način da se iskaže antivirusna efikasnost jedinjenja je oduzeti srednji prag RT-PCR ciklusa negativne kontrole (Ctnegativno) od praga RT-PCR ciklusa testnog jedinjenja (Cttestnojedinjenje)- Ova vrednost se naziva ACt (ACt<=>Cttestnojedinjenje- Ctnegativno). Vrednost ACt od 3.3 predstavlja 1-log redukciju u produkciji replikona. Kao pozitivna kontrola, može da se koristi rekombinantni interferon alfa-2a (na primer, Roferon-A, Hoffmann-Roche, NJ, USA), pored testnog jedinjenja. Pored toga, jedinjenja mogu biti testirana u serijskim razblaženjima (tipično pri 100, 33, 10, 3 i 1 uM).

ACt vrednosti za svaku koncentraciju omogućavaju izračunavanje 50%-no efikasne koncentracije (EC50).

Gore opisani test može da se prilagodi drugim članovimaFlaviviridae- apromenom ćelijskog sistema i virusnog patogena. Postupci za određivanje efikasnosti ovih antivirusnih jedinjenja uključuju modifikacije standardnih tehnika kako su opisali Holbrook MR et al. Virus Res.2000,69, 3\ ;Markland W et al. Antimicrob. Agents Chemother.2000,44,859; Diamond MS et al., J. Virol.2000,74, 7814;Jordan I et al., J. Infect. Dis.2000, 182,1214; Sreenivasan V et al., J. Virol. Methods.1993,45(1), 1; ili Baginski SG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2000,97,(14), 7981 ilireal- timeRT-PCR tehnologiju. Na primer, mogu se koristiti HCV-replikonski sistem u HuH7 ćelijama (Lohmann V et al., Science,1999,285(5424), 110) ili njegove modifikacije (Blight et al., 2000).

Testovi koji nisu zasnovani na ćelijama, prilagođeni za đetektovanje HCV

Tehnika amplifikacije nukleinskih kiselina danas je metod izbora za identifikaciju velikog i još uvek rastućeg broja mikroorganizama kao što suMycobacterium tuberculosis,virus humane imunodeficijencije (HIV), i virus hepatitisa C (HCV) u biološkim uzorcima. Tehnike amplifikacije nukleinskih kiselina uključuju polimeraznu reakciju lančanog umnožavanja( polvmerase chain reaction,PCR), ligaznu reakciju lančanog umnožavanja( Ugase chain reaction,LCR), amplifikaciju baziranu na sekvenci nukelinske kiseline( nucleic acid sequence- based amplification,NASBA), amplifikaciju zamenom lanca( strand-displacement amplification,SDA), i amplifikaciju posredovanu transkripcijom( transcription-mediated amplification,TMA). U nekoliko dijagnostičkih proizvoda koje je odobrila FDA inkorporisani su ovi molekularno-dijagnostički postupci (videti donju Tabelu). Testovi tehnologije amplifikacije nukleinskih kiselina uključuju ne samo amplifikaciju, nego i postupke detekcije. Mogućnosti unapređenja molekularne dijagnostike leže u poboljšanju koraka obrade uzorka, amplifikacije i detekcije cilja, kao i u integraciji ovih koraka u automatizovani format.

Šeme za detektovanje amplifikovanih produkata

Postoje dva osnovna tipa šema za detektovanje amplifikovanih produkata: heterogeni i homogeni. Heterogena detekcija se karakteriše zasebnim koracima, kao što su ispiranje, da bi se nehibridizovane probe izdvojile od hibridizovanih, dok u homogenoj detekciji nema koraka fizičke separacije za izdvajanje slobodne od vezane probe. Postoji više heterogenih i homogenih detekcionih postupaka. Svaki od ovih homogenih ili heterogenih testova može da se koristi za procenu efikasnosti jedinjenja predmetnog pronalaska prema virusu koji se replikuje pomoću RNK-zavisne RNK-polimeraze, kao što je HCV.

Heterogena detekcija: Southern blotovanje( Southern blotting)na primer, je heterogena tehnika detekcije. U Southern blotovanju, elektroforeza se koristi za razdvajanje amplifikacionih produkata po veličini i naelektrisanju. Produkti frakcionisani po veličini se prenose na membranu ili filter putem difuzije, vakuumiranja ili elektroblotovanja. Obeležene detekcione probe se zatim hibridizuju sa ciljevima vezanim za membranu u rastvoru, filteri se isperu da bi se uklonila nehibridizovana proba, i hibridizovana proba na membrani se detektuje bilo kojim od raznovrsnih metoda.

Drugi tipovi heterogene detekcije zasnivaju se na specifičnom zadržavanju produkata amplifikacije putem enzim-vezanih imunosorbent testova( enzvme- linked immunosorhentassays,ELISAs). Jedan metod koji se koristi sa PCR uključuje obeležavanje jednog prajmera haptenom ili Ugandom, kao što je biotin, i, posle amplifikacije, njegovo zadržavanje sa mikorpločama obloženim antitelom ili streptavidinom. Drugi prajmer je obeležen reporterom kao što je fluorescein, i detekcija se postiže dodavanjem antifluoresceinskih antitela, konjugovanih sa peroksidazom rena( horseradish peroxidase,HRP). Ovaj tip metoda nije tako specifičan kao korišćenje detekcionih proba koje se hibridizuju za određene produkte amplifikacije od intersa.

Sistemi LCx proba (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL) i Amplicor HIV-1 test (Roche Molecular Svstems, INC, Pleasanton, CA) su sistemi koji koriste heterogene detekcione metode. U LCx sistemu, haptenom obeležene oligonukleotidne probe termocikliraju u ligaznoj lančanoj reakciji. Kaptirajući hapten ili detekcioni hapten vezanje kovalentno za svaki od četiri prajmerska oligonukleotida. Posle amplifikacije, svaki amplifikovani produkt (amplikon) ima jedan kaptirajući hapten i jedan detekcioni hapten. Kada je amplifikacija završena, instrument LCx sistema prenosi reakciju u novi rezervoarčić gde se antitelom obložene mikropartikule vezuju za kaptirajuće haptene. Svaka mikropartikula se zatim ireverzibilno vezuje za matriks od staklenih vlakana. Korakom ispiranja uklanjaju se iz mikropartikula probe koje sadrže samo detekcioni hapten. Instrument za LCx dodaje konjugat alkalna fosfataza (AP)-anitelo koji se vezuje za detekcioni hapten. Fluorigeni supstrat za AP je 4-metilumbeliferil. Defosforilacija 4-metilumbeliferila AP-om konvertuje ga u 4-metilumbeliferon, koji je fluorescentan.

Amplicor HIV-1 test koristi ELISA format. Posle amplifikacije PCR-om, amplikon se hemijski denaturiše. Amplikon-specifične oligonukleotidne probe zadržavaju denaturisane lance na obloženoj ploči. Operator spira neinkorporisane prajmere i nehibridizovani materijal u koraku ispiranja i zatim u svaki rezervoarčić dodaje avidin-HRP konjugat. Konjugat se vezuje za amplikon zadržan na ploči, obeležen biotinom. Operator zatim dodaje 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB), hromogeni supstrat za HRP. U prisustvu vodonik-peroksida, HRP oksidiše TMB. Signal se determiniše kolorimetrijski.

Homogena detekcija: Pošto se u homogenim detekcionim sistemima fizički ne razdvajaju hibridizovane i nehibridizovane detekcione probe, ovi postupci se odvijaju u manje koraka nego heterogeni postupci i tako su manje podložni kontaminaciji. Među komercijalno dostupnim kitovima koji koriste homogenu detekciju fluorescentnih i hemiluminiscentnih označivača su TaqMan svstem (Applied Biosvstems; Foster City, CA), BDProbe TecET system

(Boston Dickinson; Franklin Lakes, NJ), QPCR System 5000 (Perkin-Elmer Corp.; Norvvalk, CT), i Hvbridization Protection Assay (Gen-Probe Inc.; San Diego).

TaqMan system detektuje amplikon tokom amplifikacije( real time).Detekciona proba, koja se hibridizuje sa regionom unutar amplikona, sadrži donorski fluorofor kao što je fluorescein na svom 5' kraju i gaseći deo, na primer rodamin, na svom 3' kraju. Kada su gasilac i fluorofor na istom oligonukleotidu, donor fluorescencije je inhibiran. Tokom amplifikacije proba je vezana za cilj. Taq polimeraza izmešta i odvaja detekcionu probu kako sintetiše zamenjujući lanac. Odvajanje detekcione probe rezultuje razdvajanjem fluorofora i gasioca, što dovodi do povećanja fluorescentnog signala donora. Tokom svakog ciklusa amplifikacije proces se ponavlja. Količina fluorescentnog signala raste sa porastom količine amplikona.

Molekularni farovi takođe koriste gasioce i fluoro fore. Farovi su probe koje su komplementarne sa ciljnim amplikonom, a sadrže kratke komplementarne nizove (približno 5 nukleotida) oligonukleotida na svakom kraju. 5' i 3' kraj farova obeleženi su fluoroforom i gasiocem, respektivno. Struktura u obliku ukosnice formira se kada far nije hibridizovan za cilj, dovodeći u kontakt fluorofor i gasilac, zbog čega dolazi do gašenja fluorescencije. Region petlje sadrži region komplementaran amplikonu. Posle hibridizacije sa ciljem, struktura u obliku ukosnice se otvara i gasilac i fluorofor se razdvajaju, omogućavajući razvoj fluorescentnog signala.<14>A fluorometar meri signal u toku amplifikacije( real time)

BDProbe TecET sistem koristireal- timedetekcioni metod koji kombinuje aspekte TaqMan-a i molekularnih farova. Proba ima petljastu strukturu u obliku ukosnice i sadrži fluorescein i rodamin kao obeleživače. U ovom sistemu, međutim, region komplementaran ciljnom molekulu ne nalazi se u petlji nego u regionu 3' prema rodaminskom obeleživaču. Umesto da sadrži sekvencu komplementarnu cilju, jednolančana petlja sadrži restrikciono mesto za restrikcioni enzim BsoBI. Jednolančana sekvenca nije supstrat za enzim. Pre amplifikacije fluorescein i rodamin su blizu jedan drugome što gasi fluorescenciju fluoresceina. Amplifikacija izmeštanjem lanca konvertuje probu u dvolančani molekul. Restrikcioni enzim BsoBI tada može da čepa molekul, čime dolazi do razdvajanja obeleživača i porasta fluorescentnog signala.

QPCR sistem 5000 koristi elektrohemiluminiscenciju sa rutenijumskim obeleživačima. Koristi se biotinisani prajmer. Posle amplifikacije biotinski produkti se zadržavaju na paramagnetnim perlicama obloženim streptavidinom. Perlice se prebacuju u komoru sa elektrohemijskim protokom i magnetički se zadržavaju na površini elektrode. Posle električne stimulacije, proba obeležena rutenijumom emituje svetio.

Hvbridization Protection Assay koristi se u Gen-Probe-ovim neamplifikacijskim PACE testovima kao i u amplifikacijskim testovima saMvcobacterium tuberculosisiChlamvdia trachomatis.Detekcione oligonukleotidne probe u HPA obeležene su hemiluminiscentnim akridijum estrom (AE) pomoću veznih ručica. Hibridizacija se odvija 15 minuta na 60°C u istoj epruveti u kojoj se dešava i amplifikacija. Selekcioni reagens, blago bazno puferisani rastvor dodat posle hibridizacije, hidrolizuje AE na svakoj nehibridizovanoj probi, čineći je nehemiluminiscentnom. AE na hibridizovanim probama povija se unutar malog žleba dvostrukog heliksa, štiteći se time od hidrolize selekcionim reagensom. AE emituje hemiluminiscentni signal po hidrolizi vodonik-peroksidom, praćeno natrijum-hidroksidom. Luminometar beleži hemiluminiscentni signal za 2 sekunde (period označen kao "isključeno svetio") i saopštava emitovane fotone izražavajući ih kao relativne jedinice svetlosti( relative light units,RLU).

Dizajn detekcione probe kritičan je za sve metodologije koje koriste probe za detekciju amplifikacionih produkata. Dobre detekcione probe hibridizuju se samo sa specifičnim produktom amplifikacije i ne hibridizuju se sa nespecifičnim produktima. Druge ključne tačke u optimizovanju metodologija detekcije, obuhvataju obeležavanje proba i maksimizaciju uzoračkog materijala.

Postupci obeležavanja i reporterski molekuli. Detekcione probe mogu da se obeleže na više različitih načina. Enzimska inkorporacija<32>P ili<35>S u probe najčešći je metod izotopskog obeležavanja. Posle hibridizacije i ispiranja, signal se detektuje na autoradiografskom filmu.

Da bi se vršila neradioaktivna detekcija, probe mogu da se enzimski obeleže različitim molekulima. Biotin može enzimski da se inkorporiše i zatim detektuje streptavidin-konjugovanom alkalnom fosfatazom, uz korišćenje AP supstrata kao što su 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfat (BCIP) i nitroplavi tetrazolijum (NBT). Hemiluminiscentni supstrati kao Lumi-Phos 530 ili Lumi-Phos Plus (Lumigen, Southfield, MI) takođe mogu da se koriste sa AP. Pored toga, digoksigenin-11-dUTP može enzimski da se inkorporiše u DNK ili RNK, i antidigoksigenin-AP konjugati mogu da se koriste uz kolorimetrijsku ili hemiluminiscentnu detekciju.

Postoje brojni drugi tipovi reporter molekula, koji uključuju hemiluminiscentne delove, kao što su akridinujum estri. Mnogi fluorescentni delovi takođe su dostupni. Elektrohemiluminiscentna jedinjenja kao tris (2,2'-bipiridin) rutenijum (II), takođe mogu da se koriste. Dalja razmatranja ovih i sličnih tehnika mogu se naći u Schiff ER, de Medina M, Kahn RS.Semin. Liver Dis. 1999;19 (Suppl. 1: 3-15).

PRIMER 3: ĆELIJSKA FARMAKOLOGU 2'-C-METIL-CITIDIN-3'-0-L-VALIN

ESTRA (VAL-mCyd)

Test fosforilacije nukleozida u aktivni trifosfat

Za određivanje unutarćelijskog metabolizma jedinjenja, HepG2 ćelije dobijene od American Type Culture Collection (Rockville, MD), rasle su u 225 cm<2->skim flakonima za kulturu tkiva u minimalnom esencijanom medijumu dopunjenom neesencijalnim amino-kiselinama, 1% penicilin-streptomicinom. Medijum je obnavljan svaka tri dana, a ćelije su subkultivisane jednom nedeljno. Posle odvajanja adherentnog monosloja putem 10-minutnog izlaganja 30 ml tripsin-EDTA-u i tri uzastopna ispiranja medijumom, konfluentne HepG2 ćelije se zaseju pri gustini od 2.5xl0<6>ćelija po rezervoarčiću na ploči sa 6 rezervoarčića i izlože lOuM [ H] obeleženog aktivnog jedinjenja (500 dpm/pmol) tokom određenih vremenskih perioda. Ćelije se drže na 37°C pod atmosferom 5% C02. U odabranim prescima vremena, ćelije se tri puta ispiraju ledeno-hladnim fosfatom puferisanim slanim rastvorom (PBS). Unutarćelijski aktivno jedinjenje i njegovi respektivni metaboliti ekstrahuju se inkubiranjem ćelijskog peleta preko noći na -20°C sa 60% metanolom, praćeno ekstrakcijom sa dodatnih 20 ul hladnog metanola, jedan sat, u ledenom kupatilu. Ekstrakti se zatim kombinuju, suše na blagom filtriranom protoku vazduha i skladište na -20°C do HPLC analize.

Antivirusni nukleozidi i nukleozidni analozi obično se, uopšteno govoreći, konvertuju u aktivni metabolit, 5'-trifosfatne (TP) derivate, putem unutarćelijskih kinaza. Nukelozid-TP-i tada ispoljavaju svoj antivirusni efekat inhibirajući virusnu polimerazu tokom replikacije virusa. U kulturama primarnih humanih hepatocita, u ćelijskoj liniji humanog hepatoma (HepG2), i u liniji ćelija bubrega govečeta (MDBK), mCyd se konvertuje u glavni metabolit, 2'-C-metil-citidin-5'-trifosfat (mCyd-TP), zajedno sa manjom količinom uridin 5'-trifosfatnog derivata, 2'-C-metil-uridin-5'-trifosfatom (mUrd-TP). mCyd-TP je inhibitoran kad se testirain vitroprotiv BVDV replikacionog enzima, NS5B RNK-zavisne RNK-polimeraze, i misli se da je odgovoran za antivirusnu aktivnost mCyd-a.

Unutarćelijski metabolizam mCyd-a ispituje se korišćenjem MDBK ćelija, HepG2 ćelija i humanih primarnih hepatocita izloženih lOuM [<3>H]-mCyd-u. Analizom tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom( high- pressure liquid chromatographv,HPLC) pokazuje se da se mCyd fosforiliše u sva tri tipa ćelija, sa mCyd-TP kao preovlađujućim metabolitom, posle 24 h. Ispitivan je metabolički profil dobijen tokom 48-časovnog izlaganja ćelija humanog hepatoma HepG2 10 uM [<3>H]-mCyd-u. U HepG2 ćelijama, nivoi mCyd-TP dostižu pik na 41.5±13.4 uM, posle 24 sata (videti Tabelu 3) i posle toga sporo opadaju. U primarnim humanim hepatocitima, pik mCyd-TP koncentracije na 24 sata, 4 puta je niži, 10.7±6.7 uM. MDBK ćelije bubrega govečeta pokazuju intermedijarne nivoe mCyd-TP (30.1±6.9uM, na 24 sata).

Izlaganje hepatocita mCyd-u dovodi do produkcije drugog 5'-trifosfatnog derivata, mUrd-TP. U HepG2 ćelijama, izloženim 10 uM [<3>H]-mCyd-u, mUrd-TP nivo dostiže 1.9±1.6 uM, posle 24 sata, u poređenju sa 8.1±3.4 u.M u MDBK ćelijama i 3.2±2.0 uM u primarnim humanim hepatocitima. Dok MDBK i HepG2 ćelije produkuju komparabilne ukupne količine fosforilisanih vrsta (približno 43 prema 47 uM, respektivno), na 24 h, mUrd-TP iznosi 19% ukupnog produkta u MDBK ćelijama, prema samo 4% u HepG2 ćelijama. Koncentracija mUrd-TP stabilno raste tokom vremena, dostižući plato, ili opada posle 24 sata.

Prividni unutarćelijski poluživot mCyd-TP je 13.9±2.2 sata u HepG2 ćelijama i 7.6±0.6 sati u MDBK ćelijama: podaci nisu pogodni za izračunavanje poluživota mUrd-TP. Izuzev specifičnih gore pomenutih razlika, obrazac fosforilacije detektovan u humanim hepatocitima kvalitativno je sličan zapaženom korišćenjem HepG2 ili MDBK ćelija.

PRIMER 4: ĆELIJSKA CITOTOKSIČNOST

Test toksičnosti za mitohondrije

HepG2 ćelije gajene su u kulturi na pločama sa 12 rezervoarčića kako je gore opisano i izlagane su različitim koncentracijama leka prema Pan-Zhou X-R, Cui, L., Zhou X-J, Sommadossi J-P, Darley-Usmer V. M. "Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells"Antimicrob. Agents Chemother.2000; 44: 496-503. Nivoi mlečne kiseline u medijumu kulture posle 4 dana izlaganja leku mereni su korišćenjem Boehringer-ovog testnog kita za mlečnu kiselinu. Nivoi mlečne kiseline su normalizovani prema broju ćelija izmerenom hemocitometarskim brojanjem.

Test citotoksičnosti

Ćelije su zasejane pri stopi od 5xl0<3>do 5xl0<4>/rezervoarčiću, na pločama sa 96 rezervoarčića u medijumu za rast, preko noći, na 37°C u humidifikovanoj atmosferi CO2(5%). Zatim je dodat novi medijum za rast koji je sadržao serijska razblaženja lekova. Posle 4 dana inkubacije, kulture su fiksirane u 50% TCA i bojene sulforodaminom B. Optička gustina je očitavana na 550 nm. Citotoksična koncentracija je izražena kao koncentracija potrebna da se broj ćelija redukuje za 50% (CC50).

Uobičajeni testovi proliferacije ćelija korišćeni su za procenu citotoksičnosti mCyd-a i njegovih unutarćelijskih metabolita u ćelijama koje se brzo dele. Određeno je daje inhibitorni efekat mCyd-a citostatičan po prirodi pošto mCyd ne pokazuje toksičnost u konfluentnim ćelijama pri koncentracijama koje daleko prevazilaze odgovarajuće CC50za specifičnu ćelijsku liniju. mCyd nije citotoksičan za brzorastuće Huh7 ćelije humanog hepatoma ili H9c2 ćelije miokarda pacova pri najvišim testnim koncentracijama (CC5o>250 uM). mCyd CC50vrednosti su 132 i 161 uM u BHK-21 ćelijskoj liniji bubrega hrčka i HepG2 ćelijskoj liniji humanog hepatoma, respektivno. CC50za mCyd u HepG2 ćelijama raste na 200 uM kada ćelije rastu na pločama obloženim kolagenom, 4 ili 10 dana. Radi poređenja, CC50vrednosti od 35-36 uM dobijene su kada je testiran ribavirin u HepG2 i Huh7 ćelijama. U MDBK ćelijama bubrega govečeta korišćenim za BVDV antivirusna ispitivanja CC50mCyd-a bila je 36 uM. Slična CC50vrednost (34 uM) određena je za mCyd protiv MT-4 humanih T-limfocitnih ćelija. Pored toga, mCyd je uglavnom necitotoksičan ili slabo citotoksičan (CC50>50 do >200 uM) za brojne druge linije ćelija koje su poreklom od čoveka ili drugih sisara, uključujući nekoliko ćelijskih linija humanog karcinoma, u testiranju koje je sprovedeno od strane National Institutes of Health (NIH) Antiviral Research and Antimicrobial Chemistry Program. Izuzetak od ovoga su brzoproliferišući HFF humani prepucijalni fibroblasti i MEF fibroblasti embriona miša, gde mCyd pokazuje veću citotoksičnost (CC5016.9 i 2.4 uM, respektivno). I ovde je mCyd znatno manje toksičan za fibroblaste u stacionarnoj fazi.

Citotoksični efekat rastućih količina mCyd na sintezu ćelijske DNK ili RNK ispitivanje u HepG2 ćelijama izloženim [<3>H]-timidinu ili [<3>H]-uridinu. U HepG2 ćelijama, CC50vrednosti mCyd potrebnog za izazivanje 50% smanjenja u inkorporisanju radioaktivno obeleženog timidina i uridina u ćelijsku DNK i RNK, bile su 112 i 186 uM, respektivno). CC50vrednosti određene za ribavirin (RBV), za sintezu DNK i RNK, respektivno, bile su 3.16 i 6.85 uM. Ove vrednosti u principu odražavaju CC50od 161 i 36 uM određene za mCyd i RBV, respektivno, u konvencionalnim ćelijsko-proliferativnim testovima citotoksičnosti. Za procenu inkorporisanja mCyd u ćelijsku RNK i DNK, HepG2 ćelije su izložene 10 uM [<J>H]-mCyd ili kontrolnim nukleozidima (specifična aktivnost 5.6-8.0 Ci/mmol, obeleženo na bazi), 30 sati. Obeležene ćelijske RNK ili DNK vrste zasebno su izolovane i scincilacionim brojačem je određivana inkorporacija. Izlaganje HepG2 ćelija mCyd-u dovela je do veoma niskih nivoa inkorporacije ribonukelozidnog analoga u ćelijsku DNK ili RNK (0.0013-0.0014 pmol/ug nukleinske kiseline). Ovi nivoi su slični vrednostima od 0.0009 i 0.0013 pmol/ug određenim za inkorporaciju ZDV i ddC, respektivno, u RNK: kako se ne očekuje da se ovi deoksinukelozidi inkorporišu u RNK, ovi nivoi verovatno odražavaju pozadinski efekat testa( background).Inkorporacija ZDV i ddC u DNK je značajno viša (0.103 i 0.0055 pmol/ug, respektivno). Ribavirin (RBV) je inkorporisan u DNK i RNK na nivoima koji su 10 puta viši nego za mCyd.

Efekat na humane progenitorske ćelije iz koštane srži

Test toksičnosti za koštanu srž

Ćelije humane koštane srži sakupljene su iz zdravih dobrovoljaca i izdvojena je mononuklearna populacija centrifugiranjem na Ficoll-Hypaque gradijentu kako su ranije opisali Sommadossi J-P, Carlisle R. "Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hematopoietic progenitor cellsin vitro", Antimicrobial Agents and Chemotherapv1987; 31: 452-454; i Sommadossi J-P, Schinazi RF, Chu CK, Xie M-Y. "Comparison of cytotoxicity of the (-) and (+)-enantiomer of 2',3'-dideoxy-3<!->thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells"Biochemical Pharmacologv1992; 44: 1921-1925. Testovi za kulturu CFU-GM i BFU-E sprovođeni su korišćenjem metoda mekog dvoslojnog agara ili metilceluloze. Lekovi su razblaženi u medijumu za kulturu tkiva i filtrirani. Posle 14 do 18 dana na 37°C u humidifikovanoj atmosferi sa 5% CO2u vazduhu, kolonije veće od 50 ćelija brojane su korišćenjem invertovanog mikroskopa. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije formiranja kolonija u prisustvu leka u poređenju sa kontrolnim kulturama sa solventom.

Test zaštite ćelija ( cell prote ction assay, CP A)

Test je obavljen suštinski kako su opisali Baginski, S. G.; Pevear, D. C; Seipel, M.; Sun, S. C. C; Benetatos, C. A.; Chounduru, S. K.; Rice, C. M. and M. S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound"PNAS USA2000, 97 (14), 7981-7986. MDBK ćelije (ATCC) zasejane su na ploče sa 96 rezervoarčića za kulturu (4,000 ćelija po rezervoarčiću), 24 sata pre upotrebe. Posle infekcije BVDV-om (linija NADL, ATCC) pri multiciplitetu infekcije( multiplicitv of infection,MOI) od 0.02 plaka-formirajuće jedinice{ plaque forming unit,PFU) po ćeliji, serijska razblaženja testnih jedinjenja dodata su i inficiranim i neinficiranim ćelijama, u finalnoj koncentraciji od 0.5% DMSO u medijumu za rast. Svako razblaženje je testirano u kvadriplikatu. Gustine ćelija i virusna inokulacija podešene su da osiguraju kontinuirani rast ćelija tokom eksperimenta i da se postigne preko 90% destrukcije ćelija indukovane virusom, u netretiranim kontrolama, posle 4 dana po infekciji. Posle četiri dana, ploče su fiksirane sa 50% TCA i bojene sulforodaminom B. Optička gustina rezervoarčića očitavana je u čitaču mikroploča na 550 nm. Vrednosti koncentracija sa 50% efikasnošću (EC50) definisane su kao koncentracija jedinjenja kojom se postiže 50% smanjenje citopatogenog efekta virusa.

Mijelosupresivni efekti nekih nukelozidnih analoga ukazali su na potrebu za testiranjem potencijalnih efekata ispitivanih lekova na rast humanih progenitorskih ćelija iz koštane srži u klonogenskim testovima. Preciznije, anemija i neutropenija su najčešći vidovi kliničke toksičnosti vezane za lek, udružene sa anti-HIV lekom zidovudinom (ZDV) ili ribavirinom (RBV) kao komponentom standardne kombinovane terapije koja se koristi za lečenje od HCV. Ovi toksični efekti su bili model uin vitrotestovima u kojima se koriste ćelije iz koštane srži dobijene od zdravih dobrovoljaca (Sommadossi J-P, Carlisle R.Antimicrobial Agents and Chemotherapv1987; 31 (3): 452-454). Ranije je pokazano da ZDV direktno inhibir aktivnost humanih jedinica koje formiraju kolonije granulocita-makrofaga,( granulocvte- macrophage colonv- forming units,CFU-GM) i jedinica koje formiraju eritroide "u naletu"( ervthroid burst-formingunits, BFU-E) pri klinički relevantnim koncentracijama od 1-2 u.M u ovom modelu (Berman E. et al.,Blood1989, 74 (4): 1281-1286; Yoshida Y, Yoshida C,AIDS Res Hum. Retroviruses1990, 6 (7): 929-932; Lerza R. et al.Exp. Hematol.1997; 25 (3): 252-255; Dornsife RE, AverettDR. Antimicrob. Agents Chemother.1996, 40 (2): 514-519; Kurtzberg J, Čarter SG.Exp. Heamtol.1990; 18 (10) 1094-1096; Weinberg RS. et al.Mt. Sinai J. Med.1998, 65 (1): 5-13). Korišćenjem humanih koštano-sržnih kolonigenih testova, CC50vrednosti mCyd u CFU-GM i BFU-E su bile 14.1±4.5 i 13.9 ±3.2 uM (videti Tabelu 5). mCyd je značajno manje toksičan za ćelije koštane srži nego ZDV i RBV (Tabela 5).

Efekat na funkciju mitohondrija

Antivirusni nukleozidni analozi odobreni za lečenje HlV-a, kao ZDV, stavudin (d4T), didanozin (ddl) i zalcitabin (ddC) povremeno su udrženi sa klinički ograničavajućom odloženom toksičnošću, kao što su periferna neuropatija, miopatija, i pankreatitis (Brown MJ, et al.J. Infect. Dis.1993; 167 (1), 21-29; Fischl MA, et al.Ann. Intern. Med.1993; 18 (10): 762-769; Richman DD, et al.N. Engl. J. Med.1987; 317 (4): 192-197; Yarchoan R, et al.Lancet1990; 336 (8714): 526-529). Ove klinički nepovoljne događaje neki stručnjaci pripisuju inhibiciji mitohondrijalne funkcije usled redukcije sadržaja mitohondrijalne DNK (mtDNK) i inkorporacije nukelozidnog analoga u mtDNK. Pored toga, jedan poseban nukleozidni analog, fialuridin (l,-2'-deoksi-2'-fluoro-l-P-D-arabinofuranozil-5-jodouracil; FIAU) izaziva otkazivanje jetre, pankreatitis, neuropatiju, miopatiju i laktičku acidozu usled direktnih toksičnih efekata na mitohondrije (McKenzie R. et al.N. Engl. J. Med.1995; 333 (17): 1099-1105). Porast produkcije mlečne kiseline udružena sa lekom može se smatrati markerom ometene funkcije mitohondrija ili oksidativne fosforilacije (Colacino, J. M.,Antiviral Res.1996; 29 (2-3): 125-39).

Za procenu potencijala mCyd da izazove mitohondrijalnu toksičnost, sprovedeno je nekolikoin vitrostudija uz korišćenje ćelijskih linija humanog hepatoma HepG2 ili Huh7. Ove studije uključile su analizu produkcije mlečne kiseline, sadržaja mtDNK, i određivanje pramena u morfologiji (na pr. gubitak kristi, prosvetljavanje matriksa i bubrenje, i formiranje lipidnih kapi) mitohondrijalne ultrastrukture.

Efekti mCyd-a na mitohondrije prikazani su u Tabeli 6. Nisu zapažene razlike u produkciji mlečne kiseline kod ćelija tretiranih mCyd-om u poređenju sa netretiranim ćelijama na do 50 uM mCyd u Huh7 ćelijama ili 10 uM mCyd u HepG2 ćelijama. Umereno (38%) povećanje produkcije mlečne kiseline uočeno je u HepG2 ćelijama tretiranim sa 50 uM mCyd. Značaj ovog podatka nije jasan, naročito s obzirom na to da je malo verovatno da mCyd klinički dostigne koncentraciju u plazmi od 50 uM. Radi poređenja, produkcija mlečne kiseline raste za 100% u odnosu na kontrolne ćelije, u ćelijama tretiranim sa 10 uM FIAU (Cui L., Yoon, et al.,J. Clin. Invest.1995; 95: 555-563). Izlaganje HepG2 ćelija mCyd-u 6 ili 14 dana pri koncentracijama do 50 uM nema negativan efekat na sadržaj mitohondrijalne DNK u poređenju sa 56 ili 80% redukcije u ddC-tretiranim ćelijama, respektivno.

Posle 14 dana izlaganja 10 uM mCyd-u, ultrastruktura HepG2 ćelija, i posebno mitohondrija, ispitivana je transmisionom elektronskom mikroskopijom. U većini ćelija nisu zapažene promene u ćelijskoj arhitekturi, ili broju ili morfologiji mitohondrija (uključujući kriste). U 17% ćelija, 1 do 2 mitohondrije od prosečno 25 po ćeliji, bile su uvećane. Nije verovatno da bi ovako male promene mogle imati bilo kakvog značajnog uticaja na funkciju mitohondrija. Ćelije tretirane ddC-om pokazuju abnormalnu morfologiju mitohondrija uz gubitak kristi, i akumulaciju lipidnih kapi. (Medina, D. J., C. H. Tsai, et al.Antimicrob. Agents Chemother.199438 (8): 1824-8; Lewis W. et al.J. Clin. Invest.1992; 89 (4): 1354-1360; Lewis, L. D., F. M. Hamzeh, et al.Antimicrob. Agents Chemother.199236 (9): 2061-5).

Efekat na humane DNKpolimeraze a, p, i y

Celijska DNK polimeraze odgovorne su za normalnu sintezu i reparaciju DNK u nukleusu i mitohondrijama. Trifosfati nukleozidnih analoga potencijalni su inhibitori DNK polimeraza i tako mogu da naruše kritične ćelijske funkcije. Posebno, inhibicija humane polimeraze y, enzima odgovornog za sintezu mitohondrijalne DNK, vezana je za defekte u funkciji mitohondrija (Lewis, W., E. S. Levine, et al.Proceedings of the National Academv of Sciences, USA1996 93(8): 3592-7). Sprovedeni su eksperimenti da bi se utvrdilo da li mCyd-TP inhibira humane DNK polimeraze. Kako je pokazano u Tabeli 7, mCyd-TP nije supstrat za humane DNK polimeraze a, P, i y. U većini replikacionih testova, čak ni lmM mCyd-TP ne uspeva da inhibira ove enzime za 50% i IC50vrednosti mogu jedino da se determinišu da su više od 880-1000 uM. Nasuprot tome ddC je snažni inhibitor sve tri humane DNK polimeraze i posebno polimeraze P i y (IC504.8 i 2.7 uM, respektivno). Snažna inhibicija se takođe zapaža za kontrolni lek, aktinomicin D, koji je poznat kao inhibitor DNK-zavisnih DNK-polimeraza.

PRIMER 5:IN VITROANTIVIRUSNA AKTIVNOST PROTIV BVDV

Jedinjenja mogu da pokažu antiflavivirusnu ili antipestivirusnu aktivnost inhibiranjem flavivirusne ili pestivirusne polimeraze, inhibiranjem drugih enzima potrebnih za ciklus replikacije, ili drugim putevima.

Test redukcije plaka

Za svako jedinjenje efikasna koncentracija se određuje u duplikatu na pločama sa 24 rezervoarčića, testovima redukcije plaka. Ćelijski monoslojevi inficirani su sa 100 PFU/rezervoarčiću virusa. Zatim se monoslojevima dodaju serijska razblaženja testnih jedinjenja u MEM dopunjenom sa 2% inaktivisanog seruma i 0.75% metil celuloze. Kulture se dalje inkubiraju na 37°C, 3 dana, zatim fiksiraju sa 50% etanolom i 0.8% kristal-violetom, isperu i suše na vazduhu. Zatim se broje plake da se odredi koncentracija za dobijanje 90% supresije virusa.

Test redukcije prinosa

Za svako jedinjenje u duplikatu se određuje koncentracija za dobijanje 6-log redukcije oslobađanja virusa, na pločama sa 24 rezervoarčića, testovima redukcije prinosa. Test se izvodi kako je opisano u Baginski, S. G.; Pevear, D. C.; Seipel, M.; Sun, S. C. C.; Benetatos, C. A.; Chounduru, S. K.; Rice, C. M. and M. S. Collett "Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound"PNAS USA2000, 97 (14), 7981-7986, uz male modifikacije. Ukratko, MDBK ćelije se zaseju na ploče sa 24 rezervoarčića (2xl0<5>ćelija po rezervoarčiću), 24 sata pre infekcije sa BVDV (NADL linija) sa multiplicitetom infekcije (MOI) od 0.1 PFU po ćeliji. Serijska razblaženja testnih jedinjenja dodaju se ćelijama u finalnoj koncentraciji od 0.5% DMSO u medijumu za rast. Svako razblaženje se testira u triplikatu. Posle tri dana, ćelijske kulture (ćelijski monoslojevi i supenatanti) liziraju se pomoću tri ciklusa zamrzavanja i topljenja, i prinos virusa se kvantifikuje plaka-testom. Ukratko, MDBK ćelije se zaseju na ploče sa 6 rezervoarčića (5x10<5>ćelija po rezervoarčiću), 24 sata pre korišćenja. Ćelije se inokulišu sa 0.2 ml testnih lizata, 1 sat, i oblože sa 0.5% agarozom u medijumu za rast. Posle 3 dana, ćelijski monoslojevi se fiksiraju 3.5% formaldehidom i boje 1% kristal-violetom (m/v u 50% etanolu), za vizuelizaciju plaka. Plake se broje da se odredi koncentracija za dobijanje 6-log redukcije u oslobađanju virusa.

Sprovođene su studije antivirusne aktivnosti mCyd na ćelijama u kulturi. Primarni test korišćen za određivanje mCyd antivirusnog potencijala bio je na BVDV-u baziran test zaštite ćelija( cell- protection assay,citoprotektivni test, CPA). Ovaj test meri sposobnost mCyd-a da zaštiti rastuće MDBK ćelije bubrega govečeta, od destrukcije citopatogenom NADL linijom BVDV-a. Paralelno je merena citotoksičnost testnog jedinjenja na neinficirane ćelije. Antivirusne aktivnosti mCyd-a i ribavirina u CPA upoređene su u Tabeli 8a. mCyd efikasno štitide novoinficirane MDBK ćelije na način zavisan od koncentracije, sa EC50= 0.67±0.22 uM (Tabela 8a). mCyd pruža potpunu citoprotekciju pri koncentracijama dosta ispod CC50za mCyd u ovom testu (38±9 uM). U CPA kao i u drugim dole opisanim testovima, ribavirin ne pokazuje jasne antivirusne efekte: značajna (50% ili više) zaštita ćelija se u većini testova ne postiže, pošto se citotoksičnost ribavirina preklapa i maskira zaštitini efekat. Tako, ribavirin daje CC50od 4.3±0.6 uM i EC50>4.3 uM u CPA.

Napomena: Korišćene ćelijske linije uključuju MT-4 za HIV; Vero 75, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna( African green monkcy kidney cells)za SARS; BHK za virus goveđe virusne dijaree; Sb-1 za poliovirus Sabin tip-1; CVB-2, CVB-3, CVB-4, i CVA-9 za koksaki viruse B-2, B-3, B-4 i A-9; i REO-1 za dvolančane RNK viruse.

Napomena: Korišćene ćelijske linije uključuju MT-4 za HIV; Vero 75, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna{ African green monkey kidney cells)za SARS; BHK za virus goveđe virusne dijaree; Sb-1 za poliovirus Sabin tip-1; CVB-2, CVB-3, CVB-4, i CVA-9 za koksaki viruse B-2, B-3, B-4 i A-9; i REO-1 za dvolančane RNK viruse.

Ukupni antivirusni potencijal mCyd-a određivan je u odnosu na različite linije BVDV i citopatogenih (cp) i necitopatogenih (ncp) biotipova, u testovima zaštite ćelija kao i u testovima redukcije plaka i redukcije prinosa. Poslednji testovi mere oslobađanje infektivnog virusa iz ćelija i tako obezbeđuju strogi test antivirusne efikasnosti. Različite grupe podataka iz sva tri testa u saglasnosti su, kako je sumirano u Tabeli 9. Opsezi vrednosti 50% do 90% inhibitorne koncentracije (EC50i EC90) za mCyd su 0.3 do 2.8 uM i 0.87 do 4.8 uM, respektivno.

U BVDV testu redukcije prinosa, subtoksične koncentracije (otprilike 20 uM) mCyd suprimirale sude novoprodukciju BVDV za do 6 logio, do tačke gde nisu detektovani infektivni virusi. 4 logio-efikasnost redukcije produkcije BVDV (EC4iogioili EC99.99) postiže se između 6.0 i 13.9 uM mCyd-a. Nasuprot tome, interferon alfa 2b (IFN a2b), iako aktivan protiv BVDV u ovom testu (EC502.6 IU po ml), nikada ne daje više od 2 log virusne redukcije, čak ni pri 1000 IU po ml. Prema tome, antivirusni efekat mCyd protiv BVDV je mnogo veći nego onaj IFN a2b ili RBV.

PRIMER 6:IN VITROANTIVIRUSNA AKTIVNOST PROTIV DRUGIH VIRUSA SA

POZITIVNIM LANCEM RNK

Testirana je efikasnost cMyd-a protiv pozitivno-lančanih RNK virusa različitih od BVDV. Dobijeni podaci zbirno su prikazani u Tabelama 9 i 10. Protiv flavivirusa, mCyd pokazuje umerenu aktivnost. Kombinovani opsezi EC50(u uM) determinisani iz obe tabele bili su: West Nile virus (46-97); virus žute groznice (9-80); i virus kostolomne groznice (59-95). Za mCyd protiv alfa virusa, virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa, EC50vrednosti su 1.3-45 uM. mCyd pokazuje široku aktivnost protiv pikornavirusa kao poliovirus (EC50= 6 uM), koksaki virusa (EC50= 15 uM), rinovirusa, tipovi 5 i 14 (EC50= <0.1 i 0.6 ug/ml), i rinovirusa tip 2 (EC50= 2-10 uM). mCyd je u principu neaktivan prema svim testiranim RNK i DNK virusima osim prema pozitivno-lančanim RNK virusima. Isto tako, nađeno je da mCyd ne pokazuje aktivnost protiv HIV u MT-4 humanim T-limfocitnim ćelijama ili HBV u HepG2.2.15 ćelijama.

PRIMER 7: MULTIPLICITET INFEKCIJE (MOI) I ANTIVIRUSNA EFIKASNOST

Format testa zaštite ćelija korišćen je za testiranje efekta rasta količine BVDV virusa na EC50mCyd-a. Povećanje multipliciteta infekcije (MOI) BVDV-a u ovom testu od 0.04 do 0.16, prouzrokuje da EC50mCyd-a raste linearno od 0.5 uM do približno 2.2 uM.

PRIMER 8: POVRAĆAJ VIRUSA U ĆELIJAMA TRETIRANIM MCYD-OM

Efekat diskontinuiranog tretmana mCyd-om testiran je na MDBK ćelijama perzistentno inficiranim necitopatogenom linijom (linija I-N-dins) BVDV. Posle pasaže u kulturi ćelija, ove ćelije produkuju negde od IO6 do >107 infektivnih virusnih čestica po ml medijuma. Virus se može meriti dodavanjem supernatanata kulture iz tretiranih MDBK (BVDV) ćelija neinficiranim MDBK ćelijama i brojanjem nastalih virusnih fokusa posle otkrivanja imunobojenjem sa BVDV-specifičnim antitelima. Tretman perzistentno inficirane ćelijske linije sa 4 uM.mCvd za jednu ćelijsku pasažu (3 dana) redukuje titar BVDV za približno 3 logiou odnosu na nivoe pretretiranih i kontrolnih ćelija od nešto ispod IO<7>infektivnih jedinica po ml. U ovom trenutku prekida se tretman mCyd-om. Unutar jedne pasaže, BVDV titri dostižu nivoe netretirane kontrole od nešto preko IO<7>infektivnih jedinica po ml.

PRIMER 9: MEHANIZAM DEJSTVA

U standardnim BVDV CPA testovima, mCyd tretman dovodi do značajnog porasta ukupnog ćelijskog sadržaja RNK, dok ćelije rastu, zaštićene od citopatogenih efekata BVDV-a. Ovo je povezano sa značajnim smanjenjem u produkciji BVDV RNK usled mCyd-a. Obrnuto, u odsustvu mCyd-a, ukupna ćelijska RNK zapravo opada dok BVDV RNK raste usled destrukcije ćelija citopatogenim virusom. Da bi se dalje testirao efekat mCyd-a na virusne i ćelijske RNK, praćena je unutarćelijska akumulacija BVDV RNK u MDBK ćelijama 18 sati posle infekcije (posle približno jednog ciklusa replikacije virusa), korišćenjem Real Time RT-PCR. Paralelno, ćelijska "huosekeeping" mRNK za ribozomalni protein (rig SI5 mRNK) takođe je kvantifikovana pomoću RT-PCR uz korišćenje specifičnih prajmera. Rezultati su pokazali da mCyd dramatično smanjuje nivoe BVDV RNK ude novoinficiranim MDBK ćelijama sa EC50od 1.7 uM i EC90od 2.3 uM. Maksimim smanjenja virusne RNK bio je 4 logio pri najvišim testiranim inhibitornim koncentracijama (125 uM). Nije zapažen efekat na kontrolu nivoa rig SI5 ćelijske mRNK. Prethodni nalazi, zajedno, ukazuju da mCyd inhibira BVDV specifično interferirajući sa sintezom virusnog RNK genoma, bez uticaja na sadržaj ćelijske RNK. Ovu ideju dalje podržava zapažanje (Tabela 4a) da inhibicija sinteze RNK, merena preuzimanjem [<3>H]-uridina u HepG2 ćelijama zahteva visoke koncentracije mCyd-a (EC50= 186 uM).

Uin vitrostudijama uz korišćenje prečišćene BVDV NS5B RNK-zavisne RNK polimeraze (Kao, C. C, A. M. Del Vecchio, et al., (1999)," De novoinitiation of RNA svnthesis by recombinant flaviviridae RNA-dependent RNA polymerase"".Virologv253 (1): 1-7) i sintetskih RNK templata, mCyd-TP inhibira RNK sintezu sa IC50od 0.74 uM i kompetitivni je inhibitor BVDV NS5B RNK-zavisne RNK polimeraze u odnosu na prirodni CTP supstrat. Inhibiciona konstanta (K,) za mCyd-TP je 0.16 uM, a Michaelis-Menten-ova konstanta (Km) za CTP je 0.03 uM. Inhibicija sinteze RNK m-Cyd-TP-om zahteva prisustvo srodne G rezidue u RNK templatu. Efekat mCyd-TP na sintezu RNK u odsustvu CTP ispitivan je detaljnije uz korišćenje serije kratkih (21-mer) sintetskih RNK templata koji sadrže jednu G reziduu, koja se progresivno kreće duž templata. Analiza novosintetisanih transkripata nastalih od ovih templata u prisustvu mCyd-TP otkriva da se RNK elongacija nastavlja samo do G rezidua, zatim se zaustavlja (Slika 2). U templatima koji sadrže više od jedne G rezidue, RNK sinteza se zaustavlja kod prve G rezidue na koju naiđe polimeraza. Ovi podaci snažno ukazuju da mCyd-TP deluje kao neobligatorni okončivač lanca. Mehanizam ove očigledne terminacije lanca dalje se ispituje.

PRIMER 10: ISKORENJIVANJE PERZISTENTNE INFEKCIJE BVDV-OM

Sposobnost mCyd-a da iskoreni virusnu infekciju testirana je na MDBK ćelijama perzistentno inficiranim necitopatogenom linijom BVDV (linija I-N-dins). (Vassilev, V. B. and R. O. DonisVirus Res.200069 (2): 95-107). U poređenju sa nelretiranim ćelijama, tretman perzistentno inficiranih ćelija sa 16 uM mCyd redukuje produkciju virusa sa preko 6 log virusa po ml do nedetektabilnih nivoa unutar dve ćelijske pasaže (3 do 4 dana po pasaži). Dalja produkcija virusa nije zapažena po produžetku tretmana mCyd-om tokom 12 pasaža. Pri pasažama 8, 9 i 10 (strelice, Slika 3), deo ćelija kultivisan je za dve dalje pasaže u odsustvu leka da bi se dalo dovoljno vremena da se mCyd-TP razloži i virusna replikacija obnovi. Medijum za kulturu ćelija ponavljano je testiran na ponovno pojavljivanje virusa tako što su supernatanti kulture tretiranih MDBK (BVDV) ćelija dodavani neinficiranim MDBK ćelijama i brojani su nastali virusni fokusi, posle otkrivanja imunobojenjem sa BVDV-specifičnim antitelom. Iako ovaj test može da detektuje pojedinačne virusne čestice, posle tretmana lekom iz ćelija se nisu oslobađali virusi. Prema tome, tretman mCyd-om kroz 8 ili više pasaža dovoljan je da eliminiše virus iz perzistentno inficiranih ćelija.

PRIMER 11: KOMBINACIONE STUDIJE SA INTERFERONOM ALFA 2B

Prva studija, sprovedena u MDBK ćelijama perzistentno inficiranim New York-l (NY-1) linijom BVDV, upoređuje efekat monoterapije mCyd-om (8 uM ) ili interferonom alfa 2b (200 IU/ml), ili terapije kombinacijom dva leka (Slika 4A). U ovom eksperimentu 8 uM mCyd sam redukuje titre virusa za približno 3.5 logioposle jedne pasaže do nivoa koji se održava kroz dve sledeće pasaže. Interferon alfa 2 b sam, suštinski je neaktivan protiv perzistentne BVDV infekcije (približno 0.1 logioredukcija virusnog titra) uprkos tome što je aktivan protivde novoBVDV infekcije. Međutim, kombinacija mCyd-a i interferona alfa 2b redukuje virus do nedetektabilnih nivoa do druge pasaže i jasno pokazuje bolju efikasnost od obe monoterapije.

U studiji praćenja (Slika 4B) MDBK ćelija perzistentno inficiranih I-N-dins necitopatogenom linijom BVDV, mCyd je davan u fiksnim dozama od 0, 2, 4, i 8 uM, dok je interferon alfa 2b titrovan od 0 do 2,000 IU po ml. Ponovo, interferon alfa 2b bio je suštinski neaktivan (0.1 log redukcija virusnog titra), dok je mCyd sam inhibirao propagaciju BVDV (linija I-N-dins) na način zavisan od doze. mCyd pri 8 uM redukuje produkciju virusa za 6.2 logio, gotovo do nivoa background-a.

PRIMER 12: RAZVOJ REZISTENCIJE

U ranim studijama sa kulturama ćelija, ponavljana pasaža citopatogenih linija BVDV u MDBK ćelijama u prisustvu mCyd-a nije proizvodila rezistentne mutante, što je ukazivalo daje izolovanje mCyd-rezistentnih BVDV mutanata teško. Međutim, studije na ćelijskim linijama koje su perzistentno inficirane necitopatogenim formama BVDV dovele su do selekcije rezistentnih virusa posle relativno produženih tretmana sa mCyd pri suboptimalnim terapijskim koncentracijama leka (2 do 8 uM, zavisno od eksperimenta). U reprezentativnom eksperimentu pokazanom na Slici 5A, virus nije više detektabilan posle dve pasaže u prisustvu 8 uM mCyd-a, ali se ponovo javlja pri pasaži 6. Niži titar virusa pri ponovnom pojavljivanju vidi se iz podataka: rezistentan virus tipično ima 10 ili više puta niži titar nego divlji tip virusa i lako se suprimira koterapijom sa Intronom A (Slika 5A). Fenotip ovog virusa koji se ponovo pojavio, upadljivo se razlikuje od inicijalnog virusa divljeg tipa: kako je pokazano na Slici 5B, on stvara mnogo manje fokuse (tipično 3 do 10 puta manjeg dijametra od onih divljeg tipa virusa). Ovaj fenotip se ne menja posle duže pasaže u kulturi u prisustvu inhibitora (bar 72 dana), međutim, on se brzo preobraća u divlji tip (veći fokusi) posle diskontinuacije tretmana.

RT-PCR sekvencioniranje rezistentnog mutanta koristi se za identifikovanje mutacije odgovorne za rezistenciju. Pokušaji sekvencioniranja usmereni su na region NS5B RNK-zavisne RNK-polimeraze BVDV-a, za koji se pretpostavlja da je verovatni cilj za nukleozidni inhibitor. Specifična S405T amino-kiselinska supstitucija identifikovana je na početku visoko konzervisanog B domenskog motiva polimeraze. B domen je deo aktivnog centra i misli se da je uključen u vezivanje nukleozida (Lesburg, C. A., M. B. Cable, et al.Nature Structural Biologv19996 (10): 937-43). Rezistencija na nukleozide mapirana je na ovom domenu kod drugih virusa, na pr. HBV (Ono et al.J. Clin. Invest.2001Feb; 107 (4): 449-55). Da bi se potvrdilo da je ova mutacija odgovorna za uočenu rezistenciju, mutacija je reintrodukovana u rekombinantni molekularni klon BVDV. Dobijeni klon se po fenotipskim svojstvima ne razlikuje od izolovanog mutantnog virusa, što potvrđuje da je S405T mutacija odgovorna za rezistenciju i da je NS5B RNK-zavisna RNK-polimeraza molekularni cilj za mCyd. Visoko konzervisana priroda ovog motiva u pogledu nukleotidne sekvence (Lai, V. C, C. C. Kao, et al.J. Virol.1999 73(12): 10129-36) i strukturnog nivoa među pozitivno-lančanim RNK virusima (uključujući HCV) dopušta predviđanje da bi ekvivalentna mutacija u HCV NS5B RNK-zavisnoj RNK-polimerazi bila verovatno S282T.

S405T mutant BVDV otporan je na mCyd do najviših koncentracija koje su mogle biti testirane (ECso>32 uM), ali ima takođe značajno ometnu vijabilnost u poređenju sa divljim tipom virusa. Kako je gore napomenuto, S405T mutant ispoljava 1-2 logioniži titar nego divlji tip BVDV i produkuje mnogo manje virusne plake. Pored toga, mutantni virus pokazuje upadljivu redukciju u stopi replikacije u jednom ciklusu (>1000 puta niži titar virusa na 12 h) i oko 100 puta niže nivoe akumulacije nego divlji tip virusa čak i posle 36 h replikacije (Slika 5C). Posle prekida tretmana lekom, virus se takođe brzo preobraća u divlji tip. Konačno, mutant je takođe osetljiviji (-40 puta) na tretman IFN alfa 2b nego divlji tip, kako je pokazano na Slici 5D.

Druga, dodatna mutacija, C446S, zapažena je posle daljih pasaža S405T mutantnog virusa u prisustvu leka. Ova mutacija se nalazi neposredno ispred esencijalnog GDD motiva u C domenu BVDV NS5B RNK-zavisne RNK-polimeraze. Preliminarne studije nagoveštavaju da se virus koji nosi obe mutacije ne replicira značajno bolje nego S405T mutant, pa tako doprinos ove muatcije sposobnosti virusa ostaje nejasna.

PRIMER 13:IN VIVOANTIVIRUSNA AKTIVNOST VAL-MCYD-A U ANIMALNIM

MODELIMAEFIKASNOSTI

Šimpanze hronično inficirane HCV-om najšire su prihvaćeni animalni model HCV-infekcije kod humanih pacijenata (Lanford, R. E., C. Bigger, et al.Mar J.200142 (2): 117-26; Grakoui, A. H., L. Hanson, et al.Hepatology200133 (3): 489-95). Sprovedena je jednain vivostudija oralne primene val-mCyd-a u modelu hronične infekcije virusom hepatitisa C kod šimpanze.

HCV-genotipizaciju sprovedena je kod 5 šimpanzi Southwest Foundation Primate Center u sklopu njima poverenog međunarodnog Health and Maintenance Program, osmišljenog da utvrdi zdravstveni status svih životinja kako bi se olakšalo identifikovanje potencijalnih opasnosti za zaposlene. Pet šimpanzi korišćenih u ovoj studiji ispoljilo je visok titar HCV u genotipizirajućem RT PCR testu koji razlikuje genotip 1 HCV od svih drugih genotipova, ali ne razlikuje genotip la od lb. Ovo je ukazalo da su šimpanze korišćene u ovoj studiji bile inficirane genotipom 1 HCV-a (HCV-1)

Studija sedmodnevne antivirusne aktivnosti u modelu hronične infekcije virusom hepatitisa C

kod šimpanze

Četiri šimpanze (2 životinje po doznoj grupi 10 mg/kg/dnevno ili 20 mg/kg/dnevno) primale su val-mCyd dihidrohlorid, sveže rastvoren u prenosniku koji se pije, sa prijatnim voćnim ukusom. Ove doze ekvivalentne su 8.3 i 16.6 mg/kg/dnevno slobodne baze val-mCyd, respektivno. Petoj životinji davan je samo prenosnik i ona je predstavljala placebo kontrolu. Dizajn studije obuhvatio je tri analize krvi pre tretmana kako bi se uspostavila linija bazalnih fluktuacija oslobađanja virusa i tri analize krvi tokom jedne nedelje trajanja tretmana (2., 5. i 7. dana lečenja) da bi se procenila antivirusna efikasnost. Analiza je obavljena na kraju jednonedeljnog perioda doziranja, bez daljeg praćenja.

Određivanje HCV RNK

Nivoi HCV RNK u serumu tokom studije određivani su nezavisno u dve kliničke bolničke laboratorije. HCV RNK testirana je uz korišćenje kvantitativnog RT-PCR amplifikacionog testa za nukleinske kiseline (Roche Amplicor HCV Monitor Test, version 2.0). Donji limit detekcije ovog testa( lower limit of detection,LLOD) je 600 IU/ml i linerani opseg je 600-850,000 IU/ml.

Da bi se pomoglo u tumačenju pada oslobađanja virusa koji je uočen tokom lečenja, naglasak je stavljen na određivanje (i) obima fluktuacija u oslobađanju HCV virusa kod pojedinačnih životinja na bazalnom nivou i (ii) inherentne varijabilnosti i ponovljivosti testa oslobađanja HCV virusa. Da bi se odgovorilo ovim zahtevima, upoređivane su grupe gotovih podataka iz dve laboratorije. Nađeno je da su rezultati sa oba mesta blisko uporedljivi i potvrđena je stabilnost oslobađanja HCV virusa pre tretmana kao i pouzdanost HCV Roche Amplicor testa. Da bi se dao najbolje uravnotežen prikaz studije, srednje vrednosti izvedene kombinovanjem obe grupe podataka upotrebljene su za dobijanje rezultata prikazanih na Slikama 6 i 7. Slika 6 prikazuje srednje rezultate za dozne kohorte, dok Slika 7 predstavlja podatke za pojedinačne životinje. Promene u oslobađanju virusa u odnosu na bazalni nivo zapažene tokom lečenja za svaku životinju, sa svakog mesta, takođe su prikazane zbirno u Tabeli 12.

Analiza oslobađanja HCV virusa, sa dva mesta, pokazala je da su pre tretmana oslobađanja virusa bila (i) veoma slična kod svih pet životinja i sve tri dozne grupe, i (ii) veoma stabilna tokom tronedeljnog perioda pretretmana. Srednja vrednost logiooslobađanja virusa tokom pretretmana i standardne devijacije kod pet pojedinačnih životinja bile su 5.8±0.1 (mesto 1) i 5.6± 0.1 (mesto 2). Ovi podaci pokazuju daje c. v. (koeficijent varijacije) testa samo oko 2% na oba mesta. Najveća fluktuacija oslobađanja HCV virusa viđena kod neke životinje tokom pretretmana bila je približno 0.3 logio-

Kao što se vidi na slikama 6 i 7, dostava val-mCyd-a jednom dnevno dovela je do brzog antivirusnog efekta koji nije zapažen kod placebo-životinje, niti tokom perioda pretretmana. Virusni titri su suštinski smanjeni u odnosu na bazalni nivo, posle dva dana lečenja kod svih životinja koje su primale val-mCyd, i težili su ka daljem padu tokom produžetka lečenja, u dva ogranka eksperimenta. Do kraja lečenja (dan 7), srednja smanjenja oslobađanja HCV virusa u odnosu na bazalni nivo bile su 0.83 logioi 1-05 logioza dozne grupe od 8.3 i 16.6 mg/kg/dnevno, respektivno. Titar kod placebo-životinje ostao je tokom perioda lečenja suštinski nepromenjen u odnosu na bazalni nivo.

Analiza podataka o promenama u oslobađanju HCV virusa u odgovoru na lečenje, sa dva kvantifikaciona mesta, prikazana je u Tabeli 12. Ukupno, dve grupe podataka su u saglasnosti, potvrđujući pouzdanost testa. Sa izuzetkom životinje 501, razlike u oslobađanju virusa između dva mesta bile su 0.3 logioHi manje, slično fluktuacijama zapaženim tokom perioda pretretmana. Za životinju 501, neslaganje je bilo bliže 0.5 logio. Pad oslobađanja virusa zapažen u odgovoru na lečenje varirao je od 0.436 (životinja 501, mesto 1) do 1.514 logio(životinja 497, mesto 2). Ovo drugo odgovara promeni u oslobađanju virusa sa 535,000 (pretretman) na 16,500 (dan 7) genoma po ml.

Izlaganje šimpanzi mCyd- u

Ograničene HPLC analize sprovedene su za određivanje koncentracije mCyd-a dostignute u serumu šimpanzi posle doziranja val-mCyd. U serumima uzetim od tretiranih životinja, 1 do 2 sata posle doziranja, dana 2. i 5., nivoi mCyd-a bili su tipično između 2.9 i 12.1 uM (750 i 3100 ng/ml, respektivno). U serumu tokom pretretmana ili u placebo-kontrolnom serumu nije detektovano prisustvo mCyd-a. U okviru 24 sata od poslednje doze, nivoi mCyd-a u serumu pali su na 0.2 do 0.4 uM (50 i 100 ng/ml, respektivno). mUrd nije detektovan ni u jednom uzorku seruma iako je korišćena metodologija koja ima donji limit kvantifikacije od 0.4 uM (100 ng/ml) za mUrd.

Bezbednost mCvd- a u modelu hronične infekcije HCV- om kod šimpanzi

Obučeni veterinari pratili su šimpanze tokom studije u pogledu gubitka težine, temperature, apetita i opšteg stanja, kao i profila hemijske analize krvi i CBC. Tokom lečenja nisu zapaženi negativni događaji. Izgleda da su sve četiri lečene životinje dobro podnele lek. Svih pet životinja izgubilo je nešto na težini i pokazale su malo povišenje aspartat aminotransferaze (AST), ali ovo se normalno dešava u vezi sa postupcima sedacije koji su korišćeni, a ne sa upotrebom leka. Kod jedne životinje došlo je do porasta alanin aminotransferaze (ALT) u toku perioda pretretmana pre početka doziranja, ali su se ovi nivoi ALT snizili tokom lečenja. Prema tome, ovaj izolovani ALT-događaj ne pripisuje se dejstvu leka.

PRIMER 14:IN VITROMETABOLIZAM

Sprovedene su studije za ispitivanje stabilnosti val-mCyd-a i mCyd-a u humanoj plazmi. Val-mCyd je inkubiran u humanoj plazmi na 0, 21 ili 37°C i uzorci su analizirani posle različitih vremenskih perioda, tokom do 10 sati (Slika 8). Na 37°C, val-mCyd se efikasno konvertovao u mCyd, uz samo 2% val-mCyd-a zaostalog od unosa posle 10 sati.In vitropoluživot val-mCyd-a u humanoj plazmi na 37°C bio je 1.81 sat. Uin vitrostudijama stabilnosti mCyd-a u humanoj plazmi, ili posle tretmana sa sirovim preparatom obogaćenim humanim citidin/deoksicitidin-deaminaznim enzimima, mCyd ostaje suštinski neizmenjen i, posle inkubacije na 37°C, ne zapaža se deaminacija u uridinski derivat mCyd-a (mUrd). Samo kod rezus i cinomologus majmuna zapažena je ograničena deaminacija u plazmi. Inkubacija mCyd-a na 37°C u plazmi cinomologus majmuma dala je 6.7 i 13.0% mUrd-deaminacionog produkta posle 24 i 48 sati, respektivno, pod uslovima u kojima su kontrolni citidinski analozi ekstenzivno deaminisani.

Pored TP derivata mCyd-a i mUrd-a, male količine mCyd-5'-difosfata, mCyd-DP, grubo oko 10% količine odgovarajućeg TP, viđene su kod sva tri tipa ćelija. Manje količine mUrd-DP detektovane su samo u dva tipa ćelija, primarnim humanim hepatocitima i MDBK ćelijama. Ni u jednom tipu ćelija nisu detektovani monofosfatni (MP) metaboliti. Nije bilo tragova mUrd unutar ćelija i nije bilo dokaza o formiranju liponukleotidnih metabolita kao što su 5'-difosfoholinske vrste, viđenih posle unutarćelijskog metabolisanja drugih citidinskih analoga.

Slika 9 pokazuje profil razgradnje mCyd-TP-a određivan posle izlaganja HepG2 ćelija 10 uM [<3>H]-mCyd-u, 24 sata. Zapažen unutarćelijski poluživot mCyd-TP bio je 13.9±2.2 sata u HepG2 ćelijama i 7.6±0.6 sati u MDBK ćelijama; podaci nisu bili pogodni za izračunavanje poluživota mUrd-TP. Dugi poluživot mCyd-TP u ćelijama humanog hepatoma podržava mišljenje o doziranju val-mCyd-a jednom dnevno u kliničkim ispitivanjima, za lečenje od HCV-a. Fosforilacija mCyd-a odvija se na način zavisan od doze do 50 uM leka kod sva tri tipa ćelija, kako je pokazano za HepG2 ćelije na Slici 9C. Osim specifičnih gore navedenih razlika, obrazac fosforilacije detektovan u primarnim humanim hepatocitima kvalitativno je sličan onome koji je dobijen korišćenjem HepG2 ili MDBK ćelija.

Doprinos mUrd- a

Pored unutarćelijski aktivne komponente, mCyd-TP, pokazano je da ćelije iz različitih vrsta produkuju promenljive i niže količine drugog trifosfata, mUrd-TP, putem deaminacije unutarćelijskih mCyd vrsta. Aktivnost mUrd-TP protiv BVDV NS5B RNK- zavisne RNK-polimeraze nije do danas ispitivana ali je to u planu. Do danas, podaci probnih studija na ćelijama u kulturi o antivirusnoj efikasnosti i citotoksičnosti mUrd ukazuju da je mUrd (a) oko 10 puta manje potentan nego mCyd protiv BVDV; (b) suštinski bez aktivnosti prema širokom spektru drugih virusa; i (c) negativan kada se testira pri visokim koncentracijama u različitim testovima citotoksičnosti (uključujući testove koštane srži, testove mitohondrijalne funkcije i inkorporacije u ćelijske nukleinske kiseline). Na osnovu ovih rezultata, izgleda daje doprinos mUrd-a verovatno vrlo mali. Postoje ekstenzivni toksikološki podaci za mUrd-metabolite mCyd-a, izvedena iz subhroničnih studija sprovedenih sa val-mCyd-om kod majmuna.

PRIMER 15: ĆELIJSKI PUTEVI METABOLIČKE AKTIVACIJE

Priroda enzima odgovornog za fosforilaciju mCyd-a ispitivana je u eksperimentima kompeticije supstrata. Citidin (Cyt) je prirodni supstrat za citosolnu uridin-citidin kinazu (UCK), enzim za iskorišćavanje pirimidina odgovoran za konverziju Cyd-a u Cyd-5'-monofosfat (CMP). Unutarćelijska fosforilacija mCyd-a u mCyd-TP redukovana je u prisustvu citidina ili uridina na način zavisan od doze, sa EC50vrednostima od 19.17±4.67 uM za citidin i 20.92±7.10 uM za uridin. Nasuprot tome, deoksicitidin, supstrat za enzim deoksicitidin kinazu (dCK) ima malo uticaja na formiranje mCyd-TP sa EC50> 100 uM. Inhibicija fosforilacije mCyd citidinom i uridinom, ali ne i deoksicitidinom, ukazuje na to da se mCyd fosforiliše enzimom za iskorišćavanje pirimidina, uridin-citidin kinazom (Van Rompay, A. R., A. Norda et al.,Mol. Pharmacol.200159 (5): 1181-6). Potrebna su dalja ispitivanja da bi se potvrdila pretpostavljena uloga ove kinaze u aktivaciji mCyd-a.

PRIMER 16: PUTEVI UNUTARĆELIJSKE BIOSINTEZE mURD-TP

Kako je gore u glavnim crtama opisano, mUrd-TP je minorni metabolit koji se stvara u različitom stepenu u ćelijama poreklom iz različitih vrsta. mUrd ne nastaje vanćelijskom deaminacijom mCyd-a pošto mUrd nije nađen u ćelijskom medijumu koji, uz to, ne pokazuje nikakve deaminacione aktivnosti. Podaci o ćelijskom metabolizmu konzistentni su sa idejom da mUrd-TP nastaje biotransformacijom unutarćelijskih mCyd vrsta. Razmatranje poznatih ribonukleozidnih metaboličkih puteva ukazuje da najverovatniji put podrazumeva deaminaciju jedne od dve mCyd vrste putem dva različita deaminaciona enzima: ili mCyd-MP-a citidilat-deaminazom (na pr. deoksicitidilat-deaminaza, dCMPD), ili mCyd-a citidin-deaminazom (CD). Dalji koraci fosforilacije vode ka mUrd-TP. Ove mogućnosti se dalje ispituju.

PRIMER 17: KLINIČKA EVALUACIJA VAL-MCYD-a

Pacijenti koji su ispunjavali kriterijume pogodnosti raspoređeni su po principu slučajnosti u studiju na bazalnom nivou (dan 1), prvog dana praćenja primene leka. Svaki dozni kohort imao je 12 pacijenata, po principu slučajnosti određenih u odnosu 10:2 da primaju lek odnosno odgovarajući placebo. Pacijenti su posećivali centar u kome je sprovođena studija za evaluaciju protokola na dan 1, 2, 4, 8, 11, i 15. Posle 15. dana, prekinuto je davanje ispitivanog leka. Posle toga, pacijenti su produžili da dolaze na studije praćenja dana 16, 17, 22, i 29. Farmakokinetičko uzorkovanje obavljeno je prvog i poslednjeg dana lečenja (dan 1 i dan 15), za sve pacijente, u uslovima gladovanja.

Antivirusni efekat val-mCyd-a procenjivan je na osnovu (i) proporcije pacijenata kod kojih je pad nivoa HCV RNK 15. dana bio > 1.0 logiou odnosu na bazalni nivo, (ii) vremena do<>>1.0 logiosmanjenja nivoa HCV RNK u serumu, (iii) promene nivoa HCV RNK od dana 1 do dana 15, (iv) promene nivoa HCV RNK od dana 1 do dana 29, (v) proporcije pacijenata kod kojih je do dana 29 došlo do vraćanja nivoa HCV RNK u serumu na vrednosti zabeležene na bazalnom nivou, i (vi) odnosa doze val-mCyd prema promeni HCV RNK od dana 1 do dana 15.

Klinička farmakokinetika mCyd- a posle oralne primene rastućih doza val- mCyd- a

Farmakokinetička ispitivanja su vršena tokom perioda od 8 sati posle prve doze na dan 1 i posle poslednje doze na dan 15, uz 24-h praćenje tokom dana 2, 4, 8, 11 i 16 i 48-h na dan 17. Koncentracije mCyd-a, mUrd-a i val-mCyd-a u plazmi merene su pomoću HPLC/MS/MS metodologije sa donjim limitom kvantifikovanja (LOQ) na 20 ng/ml.

Farmakokinetika mCyd-a analizirana je korišćenjem nekompartmentacionog pristupa. Kako je prikazano u donjim tabelama, glavni farmakokinetički parametri bili su uporedivi na dan 1 i dan 15, ukazujući da nije došlo do akumulacije leka posle ponovljenog doziranja. Izlaganje plazmi izgleda daje takođe bilo linearno zavisno od doze. Kako je pokazano u donjim tabelama, glavni farmakokinetički parametri izlaganja leku (Cmax i AUC) udvostručeni su sa porastom doze od 50 na 100 mg.

Srednje vrednosti kinetičkih profila mCyd-a u plazmi na dan 1 i dan 15, pri dozama od 50 i 100 mg prikazane su na Slici 10.

Ukratko, posle oralne primene val-mCyd-a matično jedinjenje mCyd je detektabilno u plazmi subjekata inficiranih HCV-om. mCyd pokazuje lineranu farmakokinetiku u plazmi kod ovih subjekata, za dva ispitivana dozna nivoa. Nije uočena akumulacija mCyd-a u plazmi subjekata posle 15 dana doziranja, pri dozama koje su ispitivane.

Antivirusna aktivnost mCyd- a posle oralne primene rastućih doza val- mCvd- a počevši od 50

mg/ dan tokom 15 dana, kod pacijenata inficiranih HCV- om

Nivoi HCV RNK u serumu određivani su korišćenjem Amplicor HCV Monitor™ testa v. 2.0 (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA) u kojem se koristi metod lančanog umnožavanja polimerazom (PCR). Donji limit kvantifikacije (LLOQ) ovim testom procenjen je na približno 600 IU/ml, a gornji limit kvantifikacije( upper limit of quantiifcation,ULOQ) ovim testom procenjen je na 500,000 IU/ml.

Uzorci seruma za HCV RNK uzeti su u tokom skrininga (dan -42 do -7) da se utvrdi podobnost za studiju. Vrednosti HCV RNK u serumu pri skriningu moraju biti >5 logioIU/ml, određeno Amplicor HBV Monitor™ testom u centralnoj studijskoj laboratoriji.

Tokom ispitivanja, uzorci seruma za HCV RNK dobijeni su na bazalnom nivou (dan 1) i pri svakoj poseti predviđenoj protokolom posle početka (dani 2, 4, 8, 11, 15, 16, 17, 22 i 29). Uzorci seruma za HCV RNK sakupljani su i tokom protokolom predviđenih pregleda praćenja( follow- up visits)od pacijenata koji su prerano napustili studiju.

Antivirusna aktivnost udružena sa prva dva kohorta (50 i 100 mg na dan) tokom studije zbirno je prikazana u sledećim tabelama i grafikonima Iako je trajanje doziranja bilo kratko (15 dana), a inicijalni dozni nivoi niski, bio je vidljiv efekat na nivoe HCV RNK u plazmi inficiranih pacijenata.

Slika 11 prikazuje promene medijane u odnosu na bazalni nivo u logioHCV RNK po poseti.

Predmetni pronalazak je opisan, za ilustraciju, pratećim primerima. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da ovi primeri ni na koji način nisu ograničavajući i da mogu biti načinjene varijacije detalja bez udaljavanja od smisla i okvira predmetnog pronalaska.

Claims (82)

1. Jedinjenje sa Formulom (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,naznačeno time,što je:

2. Jedinjenje iz zahteva 1,naznačeno time,što je farmaceutski prihvatljiva so hidrohloridna so.

3. Jedinjenje iz zahteva 1,naznačeno time,što je farmaceutski prihvatljiva so dihidrohloridna so sa Formulom (II).

4. Farmaceutska smeša,naznačena time,što uključuje efikasnu količinu jedinjenja sa Formulom (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za lečenje infekcija flaviviridama, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

5. Farmaceutska smeša iz zahteva 4,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljiva so hidrohloridna so.

6. Farmaceutska smeša iz zahteva 4,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljiva so dihidrohloridna so.

7. Farmaceutska smeša iz zahteva 4,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljivi nosač pogodan za dostavu oralnim putem.

8. Farmaceutska smeša iz zahteva 4,naznačena time,što podrazumeva drugo antivirusno sredstvo.

9. Farmaceutska smeša iz zahteva 8,naznačena time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži interferon, ribavirin, interleukin, inhibitor NS3 proteaze, inhibitor cistein proteaze, fenantrenhinon, derivat tiazolidina, tiazolidin, benzanilid, inhibitor helikaze, inhibitor polimeraze, nukleotidni analog, gliotoksin, cerulenin, besmislene fosforotioat oligodeoksinukleotide, inhibitore IRES-zavisne translacije, i ribozim.

10. Farmaceutska smeša iz zahteva 8,naznačena time,što je drugo sredstvo interferon.

11. Farmaceutska smeša iz zahteva 8, naznačena time, što je drugo sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži pegilisani interferon alfa 2a, interferon alfakon-1, prirodni interferon, albuferon, interferon beta-la, omega interferon, interferon alfa, interferon gama, interferon tau, interferon delta i interferon gama-lb.

12. Farmaceutska smeša iz zahteva 8, naznačena time, što je drugo sredstvo interferon alfa 2.

13. Farmaceutska smeša iz zahteva 4, naznačena time, što je jedinjenje u formi dozne jedinice.

14. Jedinjenje iz zahteva 13, naznačeno time, što dozna jedinica sadrži .01 do 50 mg jedinjenja.

15. Jedinjenje iz zahteva 13, naznačeno time, što je pomenuta dozna jedinica tableta ili kapsula.

16. Smeša iz zahteva 4, naznačena time, što je jedinjenje u suštinski čistoj formi.

17. Jedinjenje iz zahteva 1-3, naznačeno time, što je jedinjenje bar 90% po težini (3-D-izomer.

18. Jedinjenje iz zahteva 1-3, naznačeno time, što je jedinjenje bar 95% po težiniP-D-izomer.

19. Postupak za lečenje domaćina inficiranog flavivirusom ili pestivirusom, naznačen time, što uključuje primenu kod domaćina kome je to potrebno efikasne količine jedinjenja koje ima strukturu Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili proleka po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

20. Postupak prema zahtevu 19,naznačen time,što je farmaceutski prihvatljiva so hidrohloridna so.

21. Postupak prema zahtevu 19,naznačen time,što je farmaceutski prihvatljiva so dihidrohloridna so.

22. Postupak prema zahtevu 19,naznačen time,što dalje uključuje primenu jedinjenja u farmaceutski prihvaljivom nosaču, diluentu ili ekscipijentu.

23. Postupak prema zahtevu 19,naznačen time,što se jedinjenje primenjuje u kombinaciji ili alternaciji sa drugim antivirusnim sredstvom.

24. Postupak prema zahtevu 23,naznačen time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži interferon, ribavirin, interleukin, inhibitor NS3 proteaze, inhibitor cistein proteaze, derivat tiazolidina, tiazolidin, benzanilid, fenantrenhinon, inhibitor helikaze, inhibitor polimeraze, nukleotidni analog, gliotoksin, cerulenin, besmislene fosforotioat oligodeoksinukleotide, inhibitor IRES-zavisne translacije, i ribozim.

25. Postupak prema zahtevu 23,naznačen time,što je drugo antivirusno sredstvo interferon.

26. Postupak prema zahtevu 19, naznačen time, što je drugo sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži pegilisani interferon alfa 2a, interferon alfakon-1, prirodni interferon, albuferon, interferon beta-la, omega interferon, interferon alfa, interferon gama, interferon tau, interferon delta i interferon gama-1 b.

27. Postupak iz zahteva 26, naznačen time, što je drugo antivirusno sredstvo interferon alfa 2.

28. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je domaćin čovek.

29. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je jedinjenje u formi dozne jedinice.

30. Postupak iz zahteva 29, naznačen time, što dozna jedinica sadrži 10 do 500 mg jedinjenja.

31. Postupak iz zahteva 29, naznačen time, što je pomenuta dozna jedinica tableta ili kapsula.

32. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je farmaceutski prihvatljivi nosač pogodan za dostavu oralnim ili intravenskim putem.

33. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što se jedinjenje primenjuje u suštinski čistoj formi.

34. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je jedinjenje bar 90% po težini p-D-izomer.

35. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je jedinjenje bar 95% po težini P-D-izomer.

36. Postupak iz zahteva 19, naznačen time, što je virus HCV.

37. Jedinjenje sa Formulom I ili II,naznačeno time,što je 5'-hidroksil grupa zamenjena sa 5'-OR, gde je R fosfat; stabilisani fosfatni prolek; acil; alkil; sulfonatni estar uključujući alkil ili arilalkil sulfonil uključujući metansulfonil i benzil, gde je fenil grupa po slobodnom izboru supstituisana; lipid; amino-kiselina; ugljeni hidrat; peptid; holesterol; ili druga farmaceutski prihvatljiva odlazeća grupa koja je, kada se primeniin vivo,sposobna da obezbedi jedinjenje gde je R nezavisno H ili fosfat.

38. Farmaceutska smeša,naznačena time,što uključuje jedinjenje sa Formulom I ili II u farmaceutski prihvatljivom nosaču, gde je 5'-hidroksil grupa zamenjena sa 5'-OR, gde je R fosfat; stabilisani fosfatni prolek; acil; alkil; sulfonatni estar uključujući alkil ili arilalkil sulfonil uključujući metansulfonil i benzil, gde je fenil grupa po slobodnom izboru supstituisana; lipid, amino-kiselina; ugljeni hidrat; peptid; holesterol; ili druga farmaceutski prihvatljiva odlazeća grupa koja je, kada se primeniin vivo,sposobna da obezbedi jedinjenje gde je R nezavisno H ili fosfat.

39. Postupak za lečenje domaćina inficiranog RNK-zavisnim RNK-polimeraznim virusom,naznačen time,što uključuje primenu efikasne količine jedinjenja Formule I ili II u farmaceutski prihvatljivom nosaču, gde je 5'-hidroksil grupa zamenjena sa 5'-OR, gde je R vodonik, fosfat; stabilisani fosfatni prolek; acil; alkil; sulfonatni estar uključujući alkil ili arilalkil sulfonil uključujući metansulfonil i benzil, gde je fenil grupa po slobodnom izboru supstituisana; lipid; amino-kiselina; ugljeni hidrat; peptid; holesterol; ili druga farmaceutski prihvatljiva odlazeća grupa koja je, kada se primeniin vivo,sposobna da obezbedi jedinjenje gde je R nezavisno H ili fosfat.

40. Postupak iz zahteva 39,naznačen time,što je virus iz porodiceFlaviviridae.

41. Postupak iz zahteva 39 ili 40,naznačen time,što je virus iz porodiceFlaviviridaevirus hepatitisa C.

42. Postupak iz zahteva 39, 40 ili 41,naznačen time,što je domaćin čovek.

43. Upotreba jedinjenja koje ima strukturu Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili proleka,naznačena time,što se po slobodnom izboru upotrebljava za izradu medikamenta za lečenje domaćina inficiranog flavivirusom ili pestivirusom:

44. Upotreba prema zahtevu 43,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljiva so hidrohloridna so.

45. Upotreba prema zahtevu 43,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljiva so dihidrohloridna so.

46. Upotreba prema zahtevu 43,naznačena time,što dalje uključuje primenu jedinjenja u farmaceutski prihvaljivom nosaču, diluentu ili ekscipijentu.

47. Upotreba prema zahtevu 43,naznačena time,što se jedinjenje izrađuje u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredstvom.

48. Upotreba prema zahtevu 47,naznačena time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži interferon, ribavirin, interleukin, inhibitor NS3 proteaze, inhibitor cistein proteaze, derivat tiazolidina, tiazolidin, benzanilid, fenantrenhinon, inhibitor helikaze, inhibitor polimeraze, nukleotidni analog, gliotoksin, cerulenin, besmislene fosforotioat oligodeoksinukleotide, inhibitor IRES-zavisne translacije, i ribozim.

49. Upotreba prema zahtevu 47,naznačena time,što je drugo antivirusno sredstvo interferon.

50. Upotreba prema zahtevu 47,naznačena time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži pegilisani interferon alfa 2a, interferon alfakon-1, prirodni interferon, albuferon, interferon beta-la, omega interferon, interferon alfa, interferon gama, interferon tau, interferon delta i interferon gama-lb.

51. Upotreba iz zahteva 47,naznačena time,što je drugo antivirusno sredstvo interferon 2 alfa.

52. Upotreba iz zahteva 47,naznačena time,što je domaćin čovek.

53. Upotreba iz zahteva 47,naznačena time,što je jedinjenje u formi dozne jedinice.

54. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što dozna jedinica sadrži 10 do 500 mg jedinjenja.

55. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što je pomenuta dozna jedinica tableta ili kapsula.

56. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljivi nosač pogodan za dostavu oralnim putem.

57. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što se jedinjenje primenjuje u suštinski čistoj formi.

58. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što je jedinjenje bar 90% po težini (3-D-izomer.

59. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,što je jedinjenje bar 95% po težini P-D-izomer.

60. Upotreba iz zahteva 43,naznačena time,stoje virus HCV.

61. Jedinjenje koje ima strukturu Formule (1) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili prolek po slobodnom izboru u farmaceutski prihvatljivom nosaču,naznačeno time,što se koristi za lečenje domaćina inficiranog flavivirusom ili pestivirusom:

62. Jedinjenje prema zahtevu 61,naznačeno time,što je farmaceutski prihvatljiva so hidrohloridna so.

63. Jedinjenje prema zahtevu 61,naznačeno time,što je farmaceutski prihvatljiva so dihidrohloridna so.

64. Jedinjenje prema zahtevu 61,naznačeno time,što dalje uključuje farmaceutski prihvatljivi nosač, diluent ili ekscipijent.

65. Jedinjenje prema zahtevu 61,naznačeno time,što dalje uključuje drugo antivirusno sredstvo.

66. Jedinjenje prema zahtevu 65,naznačeno time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži interferon, ribavirin, interleukin, inhibitor NS3 proteaze, inhibitor cistein proteaze, derivat tiazolidina, tiazolidin, benzanilid, fenantrenhinon, inhibitor helikaze, inhibitor polimeraze, nukleotidni analog, gliotoksin, cerulenin, besmislene fosforotioat oligodeoksinukleotide, inhibitor IRES-zavisne translacije, i ribozim.

67. Jedinjenje prema zahtevu 65,naznačeno time,što je drugo antivirusno sredstvo interferon.

68. Jedinjenje prema zahtevu 65,naznačeno time,što je drugo antivirusno sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži pegilisani interferon alfa 2a, interferon alfakon-1, prirodni interferon, albuferon, interferon beta-la, omega interferon, interferon alfa, interferon gama, interferon tau, interferon delta i interferon gama-lb.

69. Jedinjenje iz zahteva 65,naznačeno time,što je drugo antivirusno sredstvo interferon 2 alfa.

70. Jedinjenje iz zahteva 65,naznačeno time,što je domaćin čovek.

71. Jedinjenje iz zahteva 65,naznačeno time,što je jedinjenje u formi dozne jedinice.

72. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što dozna jedinica sadrži 10 do 500 mg jedinjenja.

73. Jedinjenje iz zahteva 72,naznačeno time,što je pomenuta dozna jedinica tableta ili kapsula.

74. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što je farmaceutski prihvatljivi nosač pogodan za dostavu oralnim putem.

75. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što se jedinjenje primenjuje u suštinski čistoj formi.

76. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što je jedinjenje bar 90% po težini p~D-izomer.

77. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što je jedinjenje bar 95% po težini P-D-izomer.

78. Jedinjenje iz zahteva 61,naznačeno time,što je virus HCV.

79. Jedinjenje iz zahteva 1 ili 61,naznačeno time,što se farmaceutski prihvatljiva so bira iz grupe koja sadrži tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, ot-ketoglutarat, i a-glicerofosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, salicilat, sulfat, sulfonat, nitrat, bikarbonat, hidrobromat, hidrobromid, hidrojodid, karbonat i soli fosforne kiseline.

80. Smeša iz zahteva 4,naznačena time,što je farmaceutski prihvatljiva so odabrana iz grupe koja sadrži tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, ct-ketoglutarat, i a-glicero fosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, salicilat, sulfat, sulfonat, nitrat, bikarbonat, hidrobromat, hidrobromid, hidrojodid, karbonat i soli fosforne kiseline.

81. Postupak iz zahteva 19, naznačentime,što je farmaceutski prihvatljiva so odabrana iz grupe koja sadrži tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, a-ketoglutarat, i a-glicerofosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, salicilat, sulfat, sulfonat, nitrat, bikarbonat, hidrobromat, hidrobromid, hidrojodid, karbonat i soli fosforne kiseline.

82. Upotreba iz zahteva 42,naznačena time,što se farmaceutski prihvatljiva so bira iz grupe koja sadrži tozilat, metansulfonat, acetat, citrat, malonat, tartarat, sukcinat, benzoat, askorbat, a-ketoglutarat, i a-glicerofosfat, format, fumarat, propionat, glikolat, laktat, piruvat, oksalat, maleat, salicilat, sulfat, sulfonat, nitrat, bikarbonat, hidrobromat, hidrobromid, hidrojodid, karbonat i soli fosforne kiseline.