RS51026B

RS51026B - Derivati 3-(4-amidopirol-2-ilmetiliden)-2-indolinona kao inhibitori protein kinaze

Info

Publication number: RS51026B
Application number: YUP-717/03A
Authority: RS
Inventors: Congxin Liang; Li Sun; Peng Cho Tang; Chung Chen Wei; Michael A. Mauragis; Tomas Vojkovsky; Qingwu Jin; Paul Mattew Herrinton; Huiping Guan
Original assignee: Sugen Inc.; Pharmacia & Upjohn Company
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2010-10-31
Also published as: YU71703A; MXPA03007367A; DE60206736T2; BR0207494A; AR042586A1; SK11332003A3; US20080045709A1; EE200300385A; MY126235A; US6653308B2; CA2438314C; ES2251580T3; JP3677501B2; DE60206736D1; EP1370554B1; TWI324155B; HUP0303146A2; CZ20032414A3; KR100884858B1; PE20021006A1

Description

PRIORITETNE PRIJAVE

Ovom prijavom zahteva se prioritet prema prethodnim prijavama 60/312,361 podnesena 15. avgusta 2001 i 60/268,683 podnesena 15. februara 2001, a ovde je uključen sadržaj obe prijave na osnovu reference.

OSNOVA PRONALASKA

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na izvesne derivate 3-(4-amidopirol-2-ilmetiliden)-2-indolinona koji moduliraju aktivnost protein kinaza ("PKs"). Jedinjenja ovog pronalaska se prema tome korisna u lečenju poremećaja koji su povezani sa abnormalnom aktivnošću PK. Takođe su date farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja, postupci za lečenje bolesti korišćenjem farmaceutskih kompozicija koje sadrže ova jedinjenja i postupci za njihovo pripremanje.

Stanje tehnike

PKs su enzimi koji katalizuju fosforilaciju hidroksi grupa na tirozinskim, serinskim

i treoninskim ostacima proteina. Posledice ove naizgled jednostavne aktivnosti su iznenađujući; ćelijski rast, diferencijacija i proliferacija, tj., zapravo svi aspekat ćelijskog života na jedan ili drugi način zavise od aktivnosti PK. Dalje, abnormalna aktivnost PK je povezana sa velikim brojem poremećaja, u opsegu od nesmrtonosnih bolesti kao što su psorijaza do ektremno teških bolesti kao što je glioblastoma (tumor mozga).

PKs se konvencionalno mogu podeliti u dve klase, protein tirozin kinaze (PTKs) i

serin-treonin kinaze (STKs).

Jedan od najvažnijih aspekata aktivnosti PTK je njihova veza sa receptorima faktora rasta. Receptori faktora rasta su proteini ćelijske površine. Receptori faktora rasta kada su vezani sa ligandom faktora rasta su prevedeni u aktivan oblik koji interaguje sa proteinima na unutrašnjoj površini ćelijske membrane. Ovo vodi ka fosforilaciji tirozinskih ostataka receptora i drugih proteina i ka formiranju kompleksa u unutrašnjosti ćelije sa nizom različitih signalnih molekula citoplazme koji, zauzvrat, utiču na brojne ćelijske odgovore kao što su deoba ćelija (proliferacija), ćelijska diferencijacija, ćelijski rast, ekspresija metaboličkih efekata na ekstraćelijsku sredinu, itd. Za kompletnije razmatranje pogledati Schlessinger and Ullrich, Neuron, 9:303-391

(1992) što je ovde obuhvaćeno, uključujući crteže, na osnovu reference, kao što je u potpunosti ovde dato.

Receptori faktora rasta sa PTK aktivnošću su poznati kao receptori tirozin kinaze ("RTKs"). Oni obuhvataju veliku familiju transmembranskih receptora sa različitom biološkom aktivnošću. Trenutno je identifikovano devetnaest (19) posebnih podfamilija RTKs. Primer je podfamilija označena kao "HER" RTKs, koja obuhvata EGFR (receptor za epitelijalni faktor rasta), HER2, HER3 i HER4. Ove RTKs se sastoje od ekstraćelijskog glikozilovanog domena koji se vezuje za ligand, transmembranskog domena i unutarćelijskog katalitičkog domena koji može da fosforiliše tirozinske ostatke na proteinima.

Druga RTK podfamilija se sastoji od insulinskog receptora (IR), receptora za faktor rasta I koji je sličan insulinu (IGF-1R) i receptor koji povezan sa insulinskim receptorom (IRR). IR i IGF-1R interaguju sa insulinom, IGF-I i IGF-II tako da formiraju heterotetramer od dve u potpunosti ekstraćelijske glikozilovane a subjedinice i dve p subjedinice koje prolaze kroz ćelijsku membranu i koje sadrže domen tirozin kinaze.

Treća RTK podfamilija se odnosi na grupu receptora za faktor rasta izveden iz trombocita ("PDGFR"), koja obuhvata PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit i c-fms. Ovi receptori se sastoje od glikozilovanih ekstraćelijskih domena koji su sastavljeni od različitog broja petlji nalik imunoglobulinima i od unutarćelijskog domena gde je domen tirozin kinaze prekinut nesrodnim amino kiselinskim sekvencama.

Sledeća grupa koja je zbog svoje sličnosti sa PDGFR podfamilijom ponekad svrstana u prethodnu grupu je podfamilija receptora za kinazu jetre fetusa ("flk"). Veruje se da je ova grupa formirana od domena sa umetkom kinaze-receptora kinaze-1 jetre fetusa (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1 R, flk-4 i tirozin kinaze 1 koja je slična fms (flt-1).

Sledeći član familije receptora tirozin kinaze faktora rasta je podgrupa receptora za faktor rasta fibroblasta ("FGF"). Ova grupa se sastoji od četiri receptora, FGFR1-4 i sedam liganada, FGF1-7. lako još uvek nije tačno određeno, čini se da se receptori sastoje od glikozilovanog ekstraćelijskog domena koji sadrži različit broj petlji nalik imunoglobinima i intraćelijski domen u kome je sekvenca tirozin kinaze prekinuta regionima nesrodnih amino kiselinskih sekvenci.

Sledeći član familije receptora tirozin kinaza faktora rasta je podgrupa receptora vaskularnog endotelijalnog faktora rasta ("VEGF"). VEGF je dimerni glikoprotein koji je sličan PDGF ali ima različite biološke funkcije i specifičnost za ciljne ćelijein vivo.Trenutno se smatra da VEGF ima glavnu ulogu u vaskulogenezi i angiogenezi.

Kompletniji spisak poznatih podfamilija RTK je opisan u Plovvman et al., DN& P, 7(6):334-339 (1994) koji je ovde obuhvaćen, uključujući i crteže, na osnovu reference.

Pored RTKs, takođe postoji i familija u potpunosti unutarćelijskih PTKs koje su nazvane "ne-receptorne tirozin kinaze" ili "ćelijske tirozin kinaze". Ovde će se koristiti poslednji navedeni naziv, označen skraćenicom "CTK". CTKs ne sadrže ekstraćelijske i transmembranske domene. Trenutno je identifikovano preko 24 CTKs u 11 podfamilija (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak i Ack). Src podfamilija izgleda da je do sada najveća grupa CTKs i obuhvata Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Bik, Hck, Fgr i Yrk. Radi detaljnijeg razmatranja CTKs pogledati Bolen, Oncogene. 8:2025-2031 (1993), koji je ovde obuhvaćen, uključujući i crteže, na osnovu reference.

Serin/treonin kinaze, STKs, kao i CTKs, su pretežno unutarćelijske, iako postoji nekoliko receptor kinaza koje su STK tipa. STKs su najčešće citosolne kinaze; tj., kinaze koje obavljaju svoju funkciju u delu citolpazme van citoplazmatičnih organela i citoskeleta. Citosol je region unutar ćelije gde se odigrava veliki deo ćelijske intermedijerne metaboličke i biosintetičke aktivnosti; npr., u citosolu se proteini sintetišu na ribozomima.

RTKs, CTKs i STKs su svi uključeni u brojna patogena stanja uključujući, u značajnom stepenu, kancer. Druga patogena stanja koja su povezana sa PTKs obuhvataju, bez ograničavanja, psorijazu, cirozu jetre, djabetes, angiogenezu, restenozu, očne bolesti, reumatoidni artritis i druge inflamatorne poremećaje, imunološke poremećaje kao što je autoimuna bolest, kardiovaskularna bolest kao što je ateroskleroza i različite bolesti bubrega.

U pogledu kancera, dve glavne hipoteze razvijene u cilju objašnjavanja prekomerne ćelijske proliferacije koja vodi razvoju tumora odnose se na funkcije za koje se zna da su PK regulisane. To jest, sugerisano je da rast malignih ćelija nastaje kao rezultat poremećaja u mehanizmima koji kontrolišu deobu ćelija i/ili diferencijaciju. Pokazano je da su proteinski proizvodi čitavog niza proto-onkogena uključeni u puteve prenošenja signala koji regulišu ćelijski rast i diferencijaciju. Ovi proteinski proizvodi proto-onkogena obuhvataju ekstraćelijske faktore rasta, receptore transmembranskog faktora rasta PTK (RTKs), citoplazmatične PTKs (CTKs) i citosolne STKs, razmatrane u prethodnom tekstu.

Sa aspekta očigledne veze između PK-povezanih ćelijskih aktivnosti i širokog opsega različitih humanih poremećaja, ne iznenađuje ulaganje velikih napora u cilju identifikacije načina moduliranja PK aktivnosti. Neka od ovih istraživanja su obuhvatala biomimetičke pristupe korišćenjem velikih molekula zasnovanih na molekulima koji su uključeni u stvarne ćelijske procese (npr., mutantni ligandi (U.S. App. No. 4,966,849); rastvorljivi receptori i antitela (App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Nat' l Acad. Sci., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); RNK ligandi (Jelinek, et al., Biochemistrv, 33:10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4: 358A

(1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56:62 (1992); VVright, et al., J. Cellular Phvs., 152:448-57) i inhibitori tirozin kinaze (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268(1994)).

Pored već navedenog u prethodnom tekstu, vršeni su pokušaji da se identifikuju mali molekuli koji se ponašaju kao inhibitori PK. Na primer, bis- monociklična, biciklična i heterociklična aril jedinjenja (PCT WO 92/20642), derivati vinilenazaindola (PCT WO 94/14808) i 1-ciklopropil-4-piridilhinoloni (U.S. Pat. No. 5,330,992) su opisani kao inhibitori tirozin kinaze. Stiril jedinjenja (U.S. Pat. No. 5,217,999), stiril-supstituisana piridil jedinjenja (U.S. Pat. No. 5,302,606), derivati hinazolina (EP App. No. 0 566 266 A1), selenindoli i selenidi (PCT WO 94/03427), triciklična polihidroksilna jedinjenja (PCT W0 92/21660) i jedinjenja benzilfosfinske kiseline (PCT WO 91/15495) su opisani kao inhibitori PTK koji su korisni u lečenju kancera.

REZIME PRONALASKA

Ovaj pronalazak je usmeren na izvesne derivate 3-(4-amidopirol-2-ilmetiliden)-2-indolinona koji pokazuju spoobnost da moduliraju PK i prema tome su korisni u lečenju poremećaja koji su povezani sa abnormalnom aktivnošću PK.

Jedan oblik ovog pronalaska je jedinjenje Formule (I):

gde:

R<1>je izabran iz gupe koju čine vodonik, halo, alkil, haloalkoksi, cikloalkil, heteroaliciklična grupa, hidroksi, alkoksi, -C(0)R<8>, -NR<9>R<10>i -C(0)NR12R13;

R<2>je izabran iz gupe koju čine vodonik, halo, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR9R<10>, -NR<9>C(0)R<10>, -C(0)R<8>, -S(0)2NR<9>R<1>° i -S02R<14>(gde je R<14>alkil, aril, aralkil, heteroaril i heteroaralkil);

R<3>,R<4>i R<5>sunezavisno vodonik ili alkil;

Z je aril, heteroaril, heterociklična grupa, ili -NR<15>R<16>gde su R<15>i R<16>nezavisno vodonik ili alkil; ili R<15>i R16zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju heterocikloamino grupu;

R6 je izabran iz grupe koju čine vodonik ili alkil;

R7 je izabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>;

R<8>je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi i ariloksi;

R<9>i R<10>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, alkil, cijanoalkil, cikloalkil, aril i heteroaril; ili

R<9>i R<10>se s<p>ajaju tako da formiraju heterocikloamino grupu;

R12i R<13>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, alkil, hidroksialkil i aril; iliR12i R<13>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju heterocikloamino;

R17 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkil, cikloalkil, aril i heteroaril;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Sledeći oblik je jedinjenje formule I gde

R<1>je izabran iz gupe koju čine vodonik, halo, alkil, cikloalkil, heteroaliciklična grupa, hidroksi, alkoksi, -C(0)R<8>, -NR<9>R<10>i -C(0)NR12R13;

R<2>je izabran iz gupe koju čine vodonik, halo, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR<9>R<10>, -NR<9>C(0)R<1>°, -C(0)R<8>, -S(0)2NR<9>R<1>° i -S02R14(gde je R<14>alkil, aril, aralkil, heteroaril i heteroaralkil);

R<3>,R<4>iR<5>sunezavisno vodonik ili alkil;

Z je aril, heteroaril, heterociklična grupa, ili -NR<15>R<16>gde su R<15>i R<16>nezavisno vodonik ili alkil; ili R<15>i R<16>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju heterocikloamino grupu;

R<6>je izabran iz grupe koju čine vodonik ili alkil;

R<8>je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi i ariloksi;

R<9>iR<10>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, alkil, cijanoalkil, cikloalkil, aril i heteroaril; ili

R<9>i R<10>se spajaju tako da formiraju heterociklo grupu;

R<12>i R<13>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik, alkil, i aril; ili R12iR13zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju heterocikličnu grupu;

R<17>je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkil, cikloalkil, aril i heteroaril;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Sledeći oblik je jedinjenje formule (la):

gde:

R\ R3, R4 i R5 su vodonik;

R2 je fluoro i nalazi se na položaju-5 prstena indolinona;

Z je morfolin-4-il;

R<6>i R<7>su metil.

Poželjno, stereohemija na<*>C je (S).

Sledeći oblik je jedinjenje Formule (II):

gde:

R je vodonik ili alkil;

R<2>je izabran iz gupe koju čine vodonik, halo, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR<9>R<10>, -NR<9>C(0)R<10>, -C(0)R<8>, -S(0)2NR<9>R<1>° i -S02R<14>(gde je R<14>alkil, aril, aralkil, heteroaril i heteroaralkil);

R<3>,R<4>i R<5>su nezavisno vodonik ili alkil;

R6 je izabran iz grupe koju čine vodonik ili alkil;

R<7>je izabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>;

R<8>je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi i ariloksi;

R<9>i R<10>se s<p>ajaju tako da formiraju heterocikloamino grupu;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Sledeći oblik je farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje ili so Formula I, la, ili II i farmaceutski prihvatljiv nosač ili inertni punioc.

Sledeći oblik je postupak za moduliranje katalitičke aktivnosti protein kinaze, koji sadrži spajanje protein kinaze sa jedinjenjem ili soli Formula I, la, ili II. Protein kinaza za ovaj postupak može biti receptorna tirozin kinaza, ne-receptorna tirozin kinaza i serin-treonin kinaza.

Sledeći oblik je postupak za lečenje ili prevenciju poremećaja u organizmu koji su povezani sa protein kinazom, koji obuhvata primenu na organizam terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje ili so formula I, la ili II i farmaceutski prihvatljiv nosač ili inertni punilac. Protein kinaza za ovaj postupak može biti receptorna tirozin kinaza, ne-receptorna tirozin kinaza i serin-treonin kinaza. Poremećaj koji je povezan sa protein kinazom može biti poremećaj povezan sa EGFR, poremećaj povezan sa PDGFR, poremećaj povezan sa IGFR i poremećaj povezan sa flk. Poremećaj koji je povezan sa protein kinazom može takođe biti karcinom skvamoznih ćelija, astrocitom, Kapošijev sarkom, glioblastom, kancer pluća, kancer bešike, kancer glave i vrata, melanom, kancer jajnika, kancer prostate, kancer dojke, kancer malih ćelija pluća, gliom, kolorektalni karcer, genitourinarni kancer i gastrointestinalni kancer. Pored toga, poremećaj koji je povezan sa protein kinazom takođe može biti dijabetes, autoimuni poremećaj, poremećaj hiperproliferacije, restenoza, fibroza, psorijaza, von Heppel-Lindau-ova bolest, osteoartritis, reumatoidni artritis, angiogeneza, inflamatorni poremećaj, imunološki poremećaj i kardiovaksularni poremećaj. Ovi postupci se mogu upotrebiti za lečenje ljudi.

U sledećem obliku, ovaj pronalazak je usmeren na postupke za pripremanje jedinjenja Formule (I).

Najzad, ovaj pronalazak je takođe usmeren na identifikovanje hemijskog jedinjenja koje modulira katalitičku aktivnost protein kinaze omogućavanjem kontakta ćelija koje eksprimiraju protein kinazu sa jedinjenjem ili solju ovog pronalaska i zatim na posmatranje ćelija u pogledu efekta.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

Ukoliko nije drugačije naglašeno sledeći termini koji su upotrebljeni u specifikaciji i patentnim zahtevima imaju značenja koja su razmatrana u daljem tekstu: "Alkil" se odnosi na zasićeni alifatični ugljovodonični radikal uključujući prave ili granate lance grupa od 1 do 20 atoma ugljenika (u bilo kom numeričkom opsegu; npr. "1-20" označava grupu, u ovom slučaju alkil grupu, koja može da sadrži 1 atom ugljenika, 2 atoma ugljenika, 3 atoma ugljenika, itd. sve do i uključujući 20 atoma ugljenika). Poželjnije, srednje veličine je alkil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika npr., metil, atil, propil, 2-propil, n-butil, /zo-butil, terc-butil, pentil i tome slično. Najpoželjnije, niži alkil je onaj koji ima 1 do 4 atoma ugljenika npr., metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, /zo-butil ili ferc-butil i tome slično. Alkil može biti supstituisan ili nesupstituisan i kada je supstituisan grupa (grupe) supstituenti su poželjno halo, hidroksi, niži alkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroarilciklična grupa, C(0)R<8>, NR<9>R<10>i C(0)NR<9>R<10.>

"Cikloalkil" se odnosi na 3 do 8 člani monocikličan prsten kod koga su svi članovi prstena atomi ugljenika, 5-člani/6-člani ili 6-člani/6-člani fuzionisani bicikličan prsten ili multicikličan fuzionisani prsten kod koga su svi članovi prstena atomi ugljenika ("fuzionisani" sistem prstena označava da svaki prsten u sistemu deli susedni par atoma ugljenika sa svakim drugim prstenom u sistemu) gde jedan ili više prstenova mogu da sadrže jednu ili više dvogubih veza, ali nijedan od prstenova nema kompletno konjugovan pi-elektron sistem. Primeri, bez ograničavanja, cikloalkil grupa su ciklopropanon, ciklobutan, ciklopentan, ciklopenten, cikloheksan, cikloheksadien, adamantan, cikloheptan, cikloheptatrien i tome slično. Cikloalkil grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, grupa (grupe) supstituenti su poželjno jedan ili dva supstituenta, nezavisno izabrana iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, aril izborno supstituisani sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, ariloksi izborno supstitusan sa jednom ili dve, poželjno jednom ili dve grupe koje su nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, 6-člani heteroaril koji ima 1 do 3 atoma azota u prstenu, gde su atomi ugljenika u prstenu izborno supstituisani sa jednom ili dve grupe koje su nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, 5-člani heteroaril koji ima od 1 do 3 heteroatoma izabrana iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, gde su atomi ugljenika i azota iz grupe izborno supstituisani sa jednom ili više, poželjno sa jednom ili dve grupe gde su one nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, 5- ili 6-člana heteroaliciklična grupa koja ima od 1 do 3 heteroatoma koji su izabrani iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, gde su atomi ugljenika i azota (ako su prisutni) u grupi izborno supstituisani sa jednom ili dve, poželjno jednom ili dve grupe koje su nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, merkapto, (niži alkil)tio, ariltio izborno supstituisan sa jednom ili dve, poželjno jednom ili dve grupe koje su nezavisno jedna od druge halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro,

N-sulfonamido, R<9>S(0)-, R<9>S(0)2-, -C(0)OR<9>, R<9>C(0)0- i -NR<9>R<10>su kao što je definisano u prethodnom tekstu.

"Alkenil" se odnosi na alkil grupu, kao što je ovde definisano, koju čine najmanje dva atoma ugljenika i najmanja jedna ugljenik-ugljenik dvoguba veza. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, etenil, 1-propenil, 2-propenil, 1-, 2-, ili 3-butenil i tome slično.

"Alkinil" se odnosi na alkil grupu, kao što je ovde definisana, koju čine najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jedna ugljenik-ugljenik troguba veza. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, etinil, 1-propinil, 2-propinil, 1-, 2-, 3-butinil i tome slično.

"Aril" se odnosi na monocikličan ili fuzionisan policikličan prsten gde su svi članovi prstena atomi ugljenika (tj., prstenovi koji dele susedne parove atoma ugljenika) od 1 do 12 atoma ugljenika koji imaju kompletno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, aril grupa su fenil, naftalenil i antracenil. Aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, supstituisana grupa (grupe) je poželjno jedna ili više, poželjnije jedna, dve ili tri, ili čak poželjnije jedna ili dve, nezavisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<9>S(0)-, R<9>S(0)2-, -C(0)OR<9>, R<9>C(0)0- i -NR<9>R<10>, sa R<9>i R<10>kao što je definisano u prethodnom tekstu. Poželjno, aril grupa je izborno supstituisana sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od halo, nižeg alkila, tioalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamido, karboksi, ili N-sulfonamido.

"Heteroaril" se odnosi na monocikličan ili fuzionisani prsten (tj., prstenove koji dele susedni par atoma) od 5 do 12 atoma u prstenu koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri heteroatoma u prstenu koji su izabrani od N, O ili S, gde su preostali atomi prstena C i pored toga imaju kompletno konjugovan sistem pi-elektora. Primeri, bez ograničavanja, nesupstituisanih heteroaril grupa su pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, pirazol, piridin, pirimidin, hinolin, izohinolin, purin, tetrazol, triazin i karbazol. Heteroaril grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana. Kada je supstituisana, grupa supstituent (grupe supstituenti) je poželjno jedna ili više, poželjnije jedna, dve, ili tri, čak poželjnije

jedna ili dve, nezavisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<9>S(0)-, R<9>(0)2-, -C(0)OR<9>, R<9>C(0)0- i -NR<9>R<10>, sa R<9>i R<10>kao što je definisano u prethodnom tekstu. Poželjno, heteroaril grupa je izborno supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani od halo, nižeg alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili n-sulfonamido.

"Heteroaliciklična grupa" se odnosi na monociklični ili fuzionisani prsten koji ima u prstenu (prstenovima) od 5 do 9 atoma prstena gde su jedan ili dva atoma prstena heteroatomi izabrani od N, O ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), gde su preostali atomi prstena C. Prstenovi mogu takođe imati jednu ili više dvogubih veza. Međutim, prstenovi nemaju kompletno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, nesupstituisanih heteroalicilkličnih grupa su pirolidino, piperidino, piperazino, morfolino, tiomorfolino, homopiperazino i tome slično. Heteroalicikličan prsten može biti supstituisan ili nesupstituisan. Kada je supstituisan, supstituisana grupa (grupe) je poželjno jedna ili više, poželjnije jedna, dve ili tri, čak poželjnije jedna ili dve, nezavisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<9>S(0)-, R<9>S(0)2-, -C(0)OR9, R<9>C(0)0- i -NR<9>R<10>, sa R<9>i R<10>kao što je definisano u prethodnom tekstu. Poželjno, heteroaliciklična grupa je izborno supstituisana sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od halo, nižeg alkila, trihaloalkila, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamido, karboksi, ili N-sulfonamido.

"Heterocilkilčna grupa" ozanačava zasićeni ciklični radikal od 3 do 8 atoma u prstenu gde su jedan ili dva atoma prstena heteroatomi izabrani od n, O ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), gde su preostali atomi u prstenu C, gde jedan ili dva C atoma mogu izborno biti zamenjena sa karbonil grupom. Heterociklil prsten može biti izborno supstituisan nezavisno sa jednim, dva ili tri supstituenta izabrana od nižeg alkila koji je izborno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od karboksi ili estarske gupe, haloalkil, cijanoalkil, halo, nitro, cijano, hidroksi, alkoksi, amino, monoalkilamino, dialkilamino, aralkil, heteroaralkil i -COR (gde je R alkil). Posebno

termin heterociklična grupa obuhvata, ali nije ograničen na, tetrahidropiranil, 2,2-dimetil-1,3-dioksolan, piperidino, N-metilpiperidin-3-il, piperazino, N-metilpirolidin-3-il, pirolidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1-oksid, tiomorfolino-1,1-dioksid, 4-etiloksikarbonilpiperazino, 3-oksopiperazino, 2-imidazolidon, 2-pirolidinon, 2-oksohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-on i njihovih derivata. Poželjno, hetrociklična grupa je izborno supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani od halo, nižeg alkila, nižeg alkila koji je supstituisan sa karboski, estar, hidroksi, ili mono ili dialkilamino.

"Heterocikloamino" označava zasićeni ciklični radikal od 3 do 8 atoma prstena gde je najmanje jedan od atoma u prstenu azot i izborno gde su jedan ili dva dodatna atoma prstena heteroatomi izabrani od N, O, ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), gde su preostali atomi prstena C, gde jedan ili dva atoma C mogu biti izborno zamenjeni karbonil grupom. Heterocikloamino prsten može biti izborno supstituisan nezavisno sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su izabrani os nižeg alkil akoji je izbornoi supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od karboksi ili estarske grupe, haloalkil, cijanoalkil, halo, nitro, cijano, hidroksi, alkoksi, amino, monoalkilamino, dialkilamino, aralkil, heteroaralkil i -COR (gde je R alkil). Posebno, termin hetrocikloamiono obuhvata, ali nije ograničen na, piperidinil-il, piperazin-1-il, pirolidin-1-il, morfolin-4-il, tiomorfolin-4-il, tiomorfolino-1-oksid, tiomorfolino-1,1-dioksid, 4-etiloksikarbonilpiperazin-1-il, 3-oksopiperazin-1-il, 2-imidazolidon-1-il, 2-pirolidinon-1-il, 2-oksomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-on i njihove derivate. Poželjno, heterociklična grupa je supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani od halo, nižeg alkila, nižeg alkila koji je supstituisan sa karboksi ili estrom, hidroksi, ili mono ili dialkilamino. Heterocikloamino grupa je podgrupa heterociklične grupe definisane u prethodnom tekstu.

"Hidroksi" se odnosi na -OH grupu.

"Alkoksi" se odnosi i na -O-(alkil) i na -0-(nesupstituisana cikloalkil) grupa. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, npr., metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, ciklopropoksi, ciklobutiloksi, ciklopentiloksi, cikloheksiloksi i tome slično.

"Haloalkoksi" se odnosi i na -O-(haloalkil) grupu. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, npr., trifluorometoksi, tribromometoksi i tome slično.

"Ariloksi" se odnosi i na -O-aril i na -O-heteroaril grupu, kao što je ovde definisano. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, fenoksi, piridiniloksi, furaniloksi, tieniloksi, pirimidiniloksi, piraziniloksi i tome slično i na njihove derivate.

"Merkapto" se odnosi na -SH grupu.

"Alkiltio" se odnosi i na -S-(alkil) i na -S-(nesupstituianu cikloalkil) grupu. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, npr., metiltio, etiltio, propiltio, butiltio, ciklopropiltio, ciklobutiltio, ciklopentiltio, cikloheksiltio i tome slično.

"Ariltio" se odnosi i na -S-aril i na -S-heteroaril grupu, kao što su ovde definisane. Reprezentativni primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, feniltio, piridiniltio, furaniltio, tieniltio, pirimidiniltio i tome slično kao i njihove derivate.

"Acil" se odnosi na -C(0)-R" grupu, gde je R" izabran iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, trihalometil, nesupstituisani cikloalkil, aril izborno supstituisan sa jednim ili više, poželjno sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su izabrani iz grupe koju čine niži alkil, trihalometil, niži alkoksi, halo i -NR<9>R<10>grupa, heteroaril (vezan preko atoma ugljenika u prstenu) koji su izborno supstituisani sa jednim ili više, poželjno sa jednim, dva ili tri supstituenta koji su izabrani iz grupe koju čine niži alkila, trihalolakil, niži alkoksi, halo i - NR<9>R<10>grupa i heterociklične grupe (vezana preko atoma ugljenika u prstenu) koji su izborno supstituisani sa jednim ili više, poželjno sa jedan, dva ilu tri supstituenta koji su izabrani iz grupe koju čine niži alkil, trihaloaklila, niži alkoksi, halo i -NR<9>R<10>grupa. Reprezentativne acil grupe obuhvataju, ali nisu ograničene na, acetil, trifluoroacetil, benzoil i tome slično.

"Aldehid" se odnosi na acil grupu kod koje je R" vodonik.

"Tioacil" se odnosi na -C(0)0-R" grupu, sa R" kao što je definisano ovde.

"Estar" se odnosi na -C(0)0-R grupu sa R" kao što je ovde definisano sa izuzetkom da R" ne može biti vodonik.

"Acetil" grupa se odnosi na -C(0)CH3grupu.

"Halo" grupa se odnosi na fluor, hlor, brom ili jod, poželjno fluor ili hlor.

"Trihalometil" grupa se odnosi na -CX3grupu gde je X halo kao što je definisano u prethodnom tekstu.

"Trihalometansulfonil" grupa se odnosi na X3CS(=0)2- grupe sa x kao što je definisan u prethodnom tekstu.

"Cijano" se odnosi na -C=N grupu.

"S-sulfonamido" se odnosi na -S(0)2NR<9>R<1>° grupu, a R<9>i R<10>kao što je ovde definisano.

"N-sulfonamido" se odnosi na -NR<9>S(0)2R<10>grupu, sa R<9>i R<10>kao što je ovde definisano.

"O-karbamil" grupa se odnosi na -OC(0)NR<12>R<13>grupu sa R<12>i R<13>kao što su ovde definisani.

"N-karbamil" se odnosi na R<9>OC(0)NR<10->grupu, sa R<9>i R<10>kao što su ovde definisani.

"O-tiokarbamil" se odnosi na -OC(S)NR<12>R<13>grupu sa R<12>i R<13>kao što su ovde definisani.

"N-tiokarbamil" se odnosi na R<9>OC(S)NR<10->grupu, sa R<9>iR10kao što su ovde definisani.

"Amino" se odnosi na -NR<9>R<10>grupu, gde su iR<9>i R<10>vodonici.

"C-amido" se odnosi na -C(0)NR<9>R<10>grupu saR<9>i R<10>kao što su ovde definisani.

"N-amido" se odnosi na R<9>C(0)NR<10->grupu, sa R<9>i R<10>kao što su ovde definisani.

"Nitro" se odnosi na -N02grupu.

"Haloalkil" označava alkil, poželjno niži alkil kao što je definisano u prethodnom tekstu koji je supstituisan sa jednim ili više halo atoma, npr., -CH2CI, -CF3, -CH2CF3, - CH2CCI3i tome slično.

"Hidroksilakil" označava alkil, poželjno niži alkil kao što je definisano u prethodnom tekstu koji je supstituisan sa jednom, dve ili tri hidroksi grupe, npr., hidroksimetil, 1 ili 2-hidroksietil, 1,2-, 1,3-, ili 2,3-dihidroksipropil i tome slično.

"Aralkil" označava alkil, poželjno niži alkil kao što je definisan u prethodnom tekstu koji je supstituisan sa aril grupom kao što je definisana u prethodnom tekstu,

npr., -CH2fenil, -(CH2)2fenil, -(CH2)3fenil, CH3CH(CH3)CH2feniil i tome slično ili njihovim derivatima.

"Heteroalkil" grupa označava alkil, poželjno niži alkil kao što je definisano u prethodnom tekstu koji je supstituisan sa heteroaril grupom, npr., -CH2piridinil, -

(CH2)2pirimidinil, -(CH2)3imidazolil i tome slično ili njihovim derivatima.

"Monoalkilamino" označava radikal -NHR gde je R alkil ili nesupstituisana cikloalkil grupa kao što je definisano u prethodnom tekstu, npr., metilamino, (1-metiletil)amino, cikloheksilamino i tome slično.

"Dialkilamino" označava radikal -NRR gde je svako R nezavisno alkil ili nesupstiuisana cikloaklil grupa kao što je definisano u prethodnom tekstu, npr., dimetilamino, dietilamino, (l-metiletil)-etilamino, cikloheksilmetilamino, ciklopentilmetilamino i tome slično.

"Izborno" označava da se opisani događaj ili okolnost može ili ne mora javiti i da opis obuhvata slučajeve gde se javljaju događaji ili okolnosti i slučajeve gde se ne javljaju. Na primer, "heterociklična grupa je izborno supstituisana sa alkil grupom" označava da alkil može ali ne mora biti prisutana i opis obuhvata situacije gde je hetericiklična grupa supstituisana sa alki gripom i situacije gde heterociklična grupa nije supstituisana sa alkil grupom.

Termini "2-indolinon", "indolin-2-on" i "2-oksindol" su ovde upotrebljeni naizmenično da označe molekul koji ima sledeću hemijsku strukturu:

Termin "pirol" se odnosi na molekul koji ima sledeću hemijsku strukturu:

Jedinjenja koja imaju istu molekulsku fomulu, ali se razlikuju po prirodi ili sekvenci koja vezuje njihove atome ili po rasporedu njihovih atoma u prostoru su označena kao "izomeri". Izomeri koji se razlikuju po rasporedu njihovih atoma u prostoru su označeni terminom "stereoizomeri". Stereoizomeri koji ne predstavljaju odraz jedan drugog u ogledalu su označeni terminom "diastereoizomeri" i oni koji su nepodudarni odrazi jedan drugog u ogledalu su označeni terminom "enantiomeri". Kada jedinjenje ima asimetrični centar, na primer, kada je vezano za četiri različite grupe, moguć je par enantiomera. Enantiomer se može okarakterisati apsolutnom konfiguracijom svog asimetričnog centra i opisan je pomoću pravila za R- i S-sekvenciranje koja su dali Cahn i Prelog, ili na način gde molekul rotira ravan polarizovane svetlosti i označeni su kao desnogiri ili levogiri (tj., kao (+) ili (-)-izomeri, respektivno). Hiralno jedinjenje može biti u obliku bilo pojedinačnog enantiomera ili njegove smeše. Smeša koja sadrži iste delove enantiomera je nazvana "racemska smeša".

Jedinjenja ovog pronalska mogu posedovati jedan ili više asimetričnih centara; takva jedinejnja se prema tome mogu proizvesti kao pojdinačni (R)- ili (S)- stereoizomeri ili njihove smeše. Na primer, atom ugljenika koji nosi hidroksi grupu u -CONHCHR<3->CR<4>(OH)CR<5>Z u jedinjenju formule (I) je asimetrični centar i prema tome jedinjenje Formule (I) može biti u obliku (R)- ili (S)-stereoizomera. Ukoliko nije naglašeno drugačije, opis ili davanje imena određenom jedinjenju u specifikaciji i patentnim zahtevima bi trebalo da obuhvataju i pojedinačne enantiomere i njihove smeše, racemske ili druge. Postupci za određivanje stereohemije i razdvajanje stereoizomera su dobro poznati u tehnici (pogledati razmatranje u Poglavlju 4 u "Advanced Organic Chemistrv", 4th edition J. March, john Wiley and Sons, New York, 1992).

Jedinjenja Formule (I) mogu pokazivati tautomerizam i strukturni izomerizam. Na primer, jedinjenja koja su ovde opisana mogu da budu u E ili Z konfiguraciji oko dvogube veze koja povezuje 2-indolinon grupu za pirol grupu ili mogu biti smeše E i Z. Ovaj pronalazak obuhvata sve tautomerne ili strukturno izomerne oblike i njihove smeše koji poseduju sposobnost da moduliraju RTK, CTK i/ili STK aktivnost i nije ograničen na bilo koju tautomerni ili strukturno izomerni oblik.

"Farmaceutska kompozicija" se odnosi na smešu jednog ili više jedinjenja koja su ovde opisana, ili njihovih fiziološki/farmaceutski prihvatljivih soli ili profarmaka, sa drugim hemijskim komponentama, kao što su fiziološki/farmaceutski prihvatljivi nosači i inertni punioci. Svrha farmaceutske kompozicije je da olakša primenu jedinjenja na organizam.

Jedinjenje Formule (I) se može takođe ponašati kao profarmak. "Profarmak" se odnosi na agens koji je preveden u ishodni lekin vivo.Profarmaci su često korisni zbog toga što ih je u nekim situacijama moguće lakše primeniti od ishodnog leka. Oni mogu, na primer, da budu biodostupni oralnom primenom dok ishodni lek nije. Profarmak može takođe da ima poboljšanu rastvorljivost u farmaceutskim kompozicijama u odnosu na ishodni lek. Primer profarmaka bez ograničavanja bi bilo jedinjenje ovog pronalaska koje je primenjeno kao estar ("profarmak") da bi se olakšalo prenošenje kroz ćelijsku membranu gde rastvorljivost u vodi nepovoljno utiče na pokretljivost, ali je zatim metabolički hidrolizovan do karboksilne kiseline, aktivnog entiteta, koji je sada unutar ćelije gde je rastvorljivost u vodi korisna.

Sledeći primer profarmaka može biti kratak polipeptid, na primer, bez ograničavanja, peptid sa 2-10 amino kiselina, koji je vezan preko terminalne amino grupe za karboksi grupu jedinjenja ovog pronalaska gde je polipeptid hidrolizovan ili metaboizovan in vivo da bi se oslobodio aktivan molekul. Profarmaci jedinjenja Formule (I) su unutar delokuga ovog pronalaska.

Pored toga, razmatrano je da bi jedinjenje Formule (I) bilo metabolizovano enzimima u telu organizma kao što je ljudski organizam da bi se stvorio metabolit koji može da modulira aktivnost protein kinaza. Takvi metaboliti su unutar delokruga ovog pronalaska.

Kao što je ovde korišćeno "fiziološki/farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na nosač ili razblaživač koji ne izaziva značajnu iritaciju kod organizma i koji ne anulira biološku aktivnost i osobine primenjenog jedinjenja.

"Farmaceustki prihvatljiv inertni punioc" se odnosi na inertnu supstancu koja je dodata farmaceutskoj kompoziciji da bi se dodatno olakšala primena jedinjenja. Primeri inertnih punilaca bez ograničavanja obuhvataju kalcijumkarbonat, kalcijumfosfat, različite šećere i tipove škroba, derivate celuloze, želatin, biljna ulja i polietilenglikole.

Kao što je ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i osobine ishodnog jedinjenja. Takve soli obuhvataju: (1) kisele soli koje su dobijene reakcijom slobodne baze ishodnog jedinjenja sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perhlorna kiselina i tome slično, ili sa organskim kiselinama kao štos u sirćetna kiselina, oksalna kiselina, (D) ili (L) jabučna kiselina, maleinska kiselina, metansulfo kiselina, etansulfo kiselina, p-toluensulfo kiselina, salicilna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, ćilibarna kiselina ili malonska kiselina i tome slično, poželjno hlorovodonična kiselina ili (L)-jabučna; ili (2) soli koje su formirane kada je kiselinski proton koje je prisutan u ishodnom jedinjenju bilo zamenjen metalnim jonom, npr., jonom alkalnog metala, jonom zemnoalkalnog metala, ili jonom aluminijuma; ili koordinacionih jedinjenja sa organskom bazom kao što je etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metilglukamin i tome slično. "PK" se odnosi na receptorni protein tirozin kinaze (PTKs), ne-receptornu ili "ćelijsku" tirozin kinazu (CTKs) i serin-treonin kinaze (STKs). "Postupak" se odnosi na načine, sredstva, tehnike i metode za postizanje datog cilja uključujući, ali ne ograničavajući se na one načine, sredstva, tehnike i metode koji su ili poznati hemijskim, farmaceutskim, biološkim, biohemijskim i medicinskim tehničarima ili koji se lako mogu razviti od poznatih načina, sredstava, tehnika i metoda od strane hemijskih, farmaceutskih, bioloških, biohemijskih i medicinskih tehničara. "Modulacija" ili "moduliranje" se odnosi na promenu katalitičke aktivnosti PTKs, CTKs i STKs. Posebno, moduliranje se odnosi na aktivaciju katalitičke aktivnosti RTKs, CTKs i STKs, poželjno na aktivaciju ili inhibiciju katalitičke aktivnosti RTKs, CTKs i STKs, u zavisnosti od koncentracije jedinjenja ili soli kome su izložene RTKs, CTKs ili STKs, ili, poželjnije, na inhibiciju katalitičke aktvnosti RTKs, CTKs i STKs. "Katalitička aktivnost" se odnosi na stopu fosforilacije tirozina pod direktnim ili indirektnim uticajem RTKs i/ili CTKs ili na fosforilaciju serina i teonina pod direktnim ili indirektnim uticajem STKs. "Dovođenje u kontakt" se odnosi na dovođenje jedinjenja ovog pronalaska u dodir sa ciljnom PK na takav način da jedinjenje može da utiče na katalitičku aktivnost PK, bilo direktno, tj., interakcijom sa samom kinazom, ili indirektno, tj., interakcijom sa drugim molekulom od koga zavisi katalitička aktivnost kinaze. Takvo "spajanje" se može postići" in vitro",tj., u test epruveti, petri šolji ili tome slično. U test epruveti, dovođenje u kontakt može obuhvatati samo jedinjenje i PK od interesa ili može obuhvatati cele ćelije. Ćelije se takođe mogu održavati ili rasti u sudovima sa kulturom ćelija i dovoditi u kontakt sa jedinjenjem u toj sredini. U ovom kontekstu, sposobnost određenog jedinjenja da utiče na poremećaj koji je povezan sa PK, tj., IC50jedinjenja koji je definisan u daljem tekstu, može se odrediti pre pokušaja upotrebe jedinjenjain vivosa složenijim organizmima. Da bi se PKs iz ćelija van organizma dovele u kontakt sa jedinjenjima postoji više postupaka dobro poznatih tehničarima, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, direktnu mikroinjekciju u ćeliju i brojne tehnike sa trasmembranskim nosačem. " In vitro"se odnosi na postupke koji se izvode u veštačkoj sredini kao što su, npr., bez ograničavanja, u test epruveti ili medijumu kulture. " In vivo"se odnosi na postupke koji se izvode unutar živog organizma kao što je, bez ograničavanja, miš, pacov ili zec. "Poremećaj povezan sa PK", "PK izveden poremećaj" i "abnormalna aktivnost PK" se odnose na stanje koje karakteriše neodgovarajuća, tj., PK katalitička aktivnost koja je niska ili češće prekomerna, gde svaka posebna PK može biti RTK, CTK ili STK. Neodgovarajuća katalitička aktivnost može nastati kao rezultat bilo: (1) PK eksresije u ćelijama koje normalno ne eksprimiraju PKs, (2) povećane ekspresije PK koja vodi ka neželjenoj proliferaciji, diferencijaciji i/ili rastu ćelija, ili (3) smanjene ekspresije PK koja vodi ka neželjenom smanjenju u proliferaciji, diferencijaciji i/ili rastu ćelija. Prekomerna aktivnost PK se odnosi bilo na amplifikaciju gena koji kodira određenu PK ili na određen nivo aktivnosti PK koji može biti u skladu sa poremećajem proliferacije, diferencijacije i/ili rasta ćelija (to jest, kako se nivo PK povećava, težina jednog ili više simptoma ćelijskog poremećaja se povećava). Kod niske aktivnosti slučaj je naravno suprotan, gde se težina jednog ili više simptoma ćelijskog poremećaja povećava kako se nivo PK aktivnosti smanjuje. "Lečiti" i "Lečenje" odnosi se na postupak za ublažavanje ili poništavanje ćelijskog poremećaja koji je povezan sa PK i/ili njegovih pratećih simptoma. Posebno u vezi sa kancerom, ovi termini jednostavno označavaju da će očekivana dužina života osobe koja je pogođena kancerom biti produžena ili to da će jedan ili više simptoma bolesti biti redukovan. "Organizam" se odnosi na bilo koje živo biće koje se sastoji od najmanje jedne ćelije. Živi organizam može biti prost kao na primer pojednačna eukariotska ćelija ili složen kao sisar, uključujući čoveka. "Terapeustki efikasna količina" se odnosi na količinu jedinjenja koja se primenjuje i koja će olakšati do izevsne mere jedan ili više simptoma poremećaja koje se leči. U vezi sa lečenjem kancera, terapeutski efikasna količina se odnosi na količinu koja ima sledeći efekat: (1) smanjuje veličinu tumora; (2) inhibira (to jest, usporava do izvesne mere, poželjno zaustavlja) metastazu tumora; (3) inhibira do izvesne mere (to jest, usporava do izvesne mere, poželjno zaustavlja) rast tumora i/ili, (4) olakšava do izvesne mere (ili, poželjno, eliminiše) jedan ili više simptoma koji

su povezani sa kancerom.

"Praćenje", "Monitoring" označava otkrivanje, zapažanje efekta dovođenja u kontakt jedinjenja sa ćelijom koja eksprimira određenu PK. Otkriveni ili zapaženi efekat može biti pramena u fenotipu ćelije, u katalitičkoj aktivnosti PK ili pramena u interakciji PK sa prirodnim vezujućim partnerom. Tehnike za otkrivanje ili zapažanje takvih efekata su dobro poznate u tehnici.

Gorenavedeni efekat je izabran od promene ili odsustva promene u fenotipu ćelije, promene ili odsustva promene u katalitičkoj aktivnosti pomenute protein kinaze ili promene ili odsustva promene u interakciji pomenute protein kinaze sa prirodnim vezujućim partnerom u krajnjem aspektu ovog pronalaska.

"Fenotip ćelije" se odnosi na spoljašnji izgled ćelije ili tkiva ili biološku funkciju ćelije ili tkiva. Primeri ćelijskog fenotipa bez ograničavanja su veličina ćelije, ćelijski rast, ćelijska proliferacija, ćelijska diferencijacija, ćelijsko preživljavanje, apoptoza i uzimanje i

upotreba hranljivih sastojaka. Takve fenotipske karakteristike se mogu meriti pomoću tehnika koje su dobro poznate u tehnici.

"Prirodni vezujući partner" se odnosi na polipeptid koji se veuje za određenu PK u ćeliji. Prirodni vezujući partneri mogu imati ulogu u prenošenju signala u PK-posredovanom procesu prenosa signala. Promena u interakciji prirodnog vezujućeg partnera sa PK može se manifestovati kao povećana ili smanjena koncentracija kompleksa PK/prirodnog vezujućeg partnera i kao rezultat toga, u uočljivoj promeni u sposobnosti PK da posreduje u prenošenju signala.

Reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska su prikazana u Tabeli 1a u daljem tekstu.

Druga reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska prikazana su u Tabeli 1b koja sledi.

Druga reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska prikazana su u Tabeli 1c koja sledi.

Jedinjenja predstavljena u Tabelama 1 a-1 c data su samo primera radi i ne treba ih shvatiti kao ograničavanje delokruga pronalaska na bilo koji način.

POŽELJNI OBLICI

Dok je najšira definicija data u Rezimeu pronalaska, poželjna su izvesna jedinjenja Formule (I) koja su data u daljem tekstu.

Poželjna grupa jedinjenja Formule (I) je ona gde:

R<6>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i alkil, poželjno vodonika, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil, ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i

R<7>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, cikloalkil, aril ili heteroaril i poželjnije R<7>je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil.

2. Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona gde:

R6 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i alkil, poželjno vodonika, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil, ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil, najpoželjnije metil;

R<7>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, ili aril, a poželjnije R7 je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil; i R<3>, R<4>i R<5>su vodonik; i

Z je aril.

3. Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona gde:

R7 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, ili aril, a poželjnije R<7>je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil, najpoželjnije metil; i

iR3,R<4>iR<5>su vodonik; i

Z je heteroaril, poželjno triazinil, tetrazolil, imidazolil, piridinil, pirimidinil ili pirazinil.

4. Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona gde:

R7 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, ili aril, a poželjnije R7 je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil; i

R<3>,R<4>iR<5>su vodonik; i

Z je heterociklična grupa.

5. Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona gde:

R7 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, ili aril, a poželjnije R7 je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil, najpoželjnije metil; i

R<3>, R<4>iR<5>su vodonik; i

Z je -NR15R<16>gde seR15i R<16>spajaju tako da formiraju heterocikloamino, poželjno piperidin-1-il, N-metilpiperidin-1-il, piperazin-1-il, N-metilpirolidin-1-il, pirolidin-1-il, morfolin-4-il, tiomorfolin-4-il, tiomorfolino-1-oksid, tiomorfolino-1,1-dioksid, 4-etiloksikarbonilmetilpiperazin-1-il, 3-ksopiperazin-1-il, imidazolidin-1-il-2-on, pirolidin-1-il-2-on, 2-oksohomopiperazin-1-il, ili tetrahidropirmidin-1-il-2-on, poželjnije morfolin-4-il.

6. Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona gde:

R<6>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i alkil, poželjno vodonika, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil, ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil;

R7 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>gde je R<17>hidroksi, alkil, ili aril, a poželjnije R<7>je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, čak poželjnije metil, vodonik ili fenil; i

R<3>,R<4>iR<5>su vodonik; i

Z je -NR<15>R<16>gde su R<15>i R<16>alkil, poželjno dietilamino, dimetilamino, ili etilamino. 7. Unutar gorenavedenih poželjnih i poželjnijih grupa (1)-(6), još poželjnija je grupa jedinjenja gde: R<1>je vodonik, alkil, -C(0)NR12R<13>, nesu<p>stituisani cikloalkil, poželjno vodonik, 3,4-dimetoksifenilaminokarbonil, 4-metoksi-3-hlorofenil-aminokarbonil, čak poželjnije vodonik ili metil, napoželjnije vodonik; i

R<2>je vodonik, cijano, halo, niži alkoksi, ili -S(0)2NR<9>R<10>gde je R<9>vodonik i R10 je vodonik, aril ili alkil i nalazi se na položaju-5 prstena oksindola, poželjno R<2>je vodonik, hloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, 3-hlorofenil-aminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, izopropilamino-sulfonil, poželjnije vodonik, fluoro ili bromo. Najpoželjnije R<2>je fluoro i nalazi se na položaju-5 prstena indolinona.

U gorenavedenim poželjnim, poželjnijim i još poželjnijim jedinjenjima stereohemija na atomu ugljenika koji nosi hidroksi grupu u lancu -CONHCH(R<3>)

<*>CR<4>)OH)CR<5>Z koja je predstavljena sa<*>je iliRS, Rili S, poželjnije S.

Upotreba

PKs čija je katalitička aktivnost modulirana jedinjenjima ovog pronalaska obuhvataju proteinske tirozin kinaze od kojih postoje dva tipa receptorne tirozin kinaze (RTKs) i ćelijske tirozin kinaze (CTKs), kao i serin-treonin kinaze (STKs). RTK posredovano prenošenje signala je inicirano ekstraćelijskom interakcijom a spcifičnim faktorom rasta (ligand), iza čega sledi dimerizacija receptora, privremena stimulacija unutrašnje aktivnosti protein tirozin kinaze i fosforilacije. Vezujuća mesta su prema tome stvorena za unutarćelijske molekule za prenošenje signala što vodi formiranju kompleksa sa čitavim spektrom citoplazmatičnih signalnih molekula koji olakšavaju odgovarajući ćelijski odgovor (npr., ćelijsku deobu, metaboličke efekte na ekstraćelijsku sredinu, itd.). Pogledati, Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.

Pokazano je da mesta fosforilacije tirozina na receptorima za faktor rasta funkcionišu kao mesta sa visokim afinitetom za vezivanje SH2 (src homologija) domena signalnih molekula. Fantl et al., 1992, CeJI 69:413-423, Songvang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songvang et al., 1993, Cell 72:767-778 i Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Identidfikovano je nekoliko proteina intraćelijskog supstrata koji su povezani sa RTKs. Oni mogu biti podeljeni u dve glavne grupe: (1) supstrate koji imaju katalitički domen i (2) supstrati kojima nedostaje takav domen, ali koji služe kao adapteri i povezani su sa katalitički aktivnim molekulima. Songvang et al., 1993, Cell 72:767-778. Specifičnost interakcija između receptora i SH2 domena njihovih supstrata je određena amino kiselinskim ostacima koji neporedno okružuju fosforilovane tirozinske ostatke. Razlike u afinitetima za vezivanje između SH2 domena i amino kiselinskih sekvenci koje okružuju fosfotirozinske ostatke na određenim receptorima su u skladu sa primećenim razlikama u njihovim profilima fosforilacije supstrata. Songvang et al., 1993, Cell 72:767-778. Ova posmatranja sugerišu da je funkcija svake RTK određena ne samo preko njenog obrasca ekspresije i dostupnosti liganda, već takođe i preko niza nizvodnih puteva prenošenja signala koji su aktivirani određenim receptorom. Prema tome, fosforilacija obezbeđuje važan regulatorni korak koji određuje selektivnost puteva signalizacije koji su pokrenuti pomoću receptora koji su specifični za faktor rasta, kao i preko receptora za faktor diferencijacije.

STKs, koji je primarno citosolni, utiče na unutrašnje biohemijske procese unutar ćelije, često kao nishodni odgovor na PTK događaj. STKs su uključeni i u proces signalizacije koji inicira sintezu DNK i zatim mitozu koja vodi ka ćelijskoj proliferaciji.

Prema tome, PK prenošenje signala rezultira u, između ostalih odgovorima, ćelijskoj proliferaciji, diferencijaciji, rastu i metabolizmu. Abnormalna proliferacija ćelija može rezultirati u širokom nizu poremećaja i bolesti, uključujući razvoj neoplazije kao što su karcinom, sarkom, glioblastom i hemangiom, poremećaji kao što su leukemija, psorijaza, arterioskleroza, artritis i dijabetska retinopatija i drugi poremećaji koji su povezani sa nekontrolisanom angiogenezom i/ili vaskulogenezom.

Tačno razumevanje mehanizma pomoću koga jedinjenja ovog pronalaska inhibiraju PKs nije potrebno da bi se praktično koristio ovaj pronalazak. Međutim, veruje se da jedinjenja interaguju sa amino kiselinama u katalitičkom regionu PKs, iako se ovim ne povezuje sa bilo kojim određenim mehanizmom ili teorijom. PKs u tipičnom slučaju poseduju strukturu u vidu dva lobusa pri čemu izgleda da se ATP vezuje u na mestu rascepa između dva lobusa u regionu gde se nalaze konzervativne amino kiseline kod različitih PKs. Veruje se da se inhibitori PKs vezuju preko ne-kovalentnih interakcija kao što su vodonične veze, van der Waals-ova sila i jonske intrakcije u opštem slučaju u istom regionu gde se gorepomenuti ATP vezuje za PKs. Posebno, smatra se da se 2-indolinon komponenta jedinjenja ovog pronalaska vezuje u prostoru koji je normalno zauzet adeninskim prstenom ATP-a. Specifičnost određenog molekula za određenu PK se zatim može javiti kao rezultat dodatnih interakcija između različitih supstituenata na 2-indolinolnom jezgru i amino kiselinskih domena koji su specifični za određene PKs. Prema tome, različiti indolinonski supstituenti mogu doprineti preferencijalnom vezivanju za određene PKs. Sposobnost da selektuju jedinjenja koja su aktivna na različitim mestima vezivanja ATP-a (ili nekog drugog nukleotida) čini jedinjenja ovog pronalska korisnim za targeting bilo kog proteina sa takvim mestom. Jedinjenja koja su ovde data prema tome imaju upotrebu uin vitroanalizama za takve proteine kao što pokazujuin vivoterapeustke efekte preko interakcije sa takvim proteinima.

Pored toga, jedinjenja ovog pronalaska obezbeđuju terapeustki pristup lečenju mnogih vrsta tumora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinome, sarkome uključujući Kapošijev sarkom, eritroblastom, glioblastom, meningiom, astrocitom, melanom i mioblastom. Lečenje ili prevencija ne-čvrstih tumor kancera kao što je leukemija su takođe razmatrani u ovom pronalasku. Indikacije mogu da obuhvataju, ali nisu ograničene na kancere mozga, kancere bešike, kancere jajnika, želudačne kancere, kancere pankreasa, kancere debelog creva, kancere krvi, kancere pluća i kancere kostiju.

Sledeći primeri tipova poremećaja koji su povezani sa neadekvatnom aktivnšću PK i za čiju prevenciju, lečenje i proučavanje mogu biti korisna jedinjenja koja su ovde opisana, bez ograničavanja, su poremećaji proliferacije ćelija, fibrotički poremećaji i metabolički poremećaji.

Poremećaji proliferacije ćelija, koji se mogu sprečiti, lečiti ili dodatno proučavati pomoću ovvog pronalaska obuhvataju kancer, proliferativne poremećaje krvnih sudova i proliferativne poremećaje mezangialnih ćelija.

Proliferativni poremećaji krvnih sudova se odnose na poremećaje koji su povezani sa abnormalnom vaskulogenezom (formiranjem krvnih sudova) i sa angiogenezom (širenjem krvnih sudova). Vaskulogeneza i angiogeneza imaju važne uloge u nizu različitih normalnih fizioloških procesa kao što su embrionalni razvoj, formiranje žutog tela, zalečenje rana i regeneracija organa, ali istovremeno vaskulogeneza i angiogeneza imaju osnovnu ulogu u razvoju kancera gde se javljaju kod formiranja novih kapilara koji su potrebni da održavaju tumor u životu. Drugi primeri poremećaja proliferacije krvnih sudova obuhvataju artritis, gde novi kapilarni krvni sudovi zauzimaju zglob i uništavaju hrskavicu i očne bolesti, kao što je dijabetska retinopatija, gde novi kapilari u retini zauzimaju staklasto telo, krvare i izazivaju slepilo.

Identifikovane su dve strukturno povezane RTKs koje se vezuju za VEGF sa visokim afinitetom: fms-slični tirozin 1 (flt-1) receptor (Shibuva et al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science. 255:989-991) i KDR/FLK-1 receptor, takođe poznat kao VEGF-R2. Objavljeno je da je vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) specifičan mitogen za podsticanje rasta endotelijalnih ćelijain vitro.Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophvs. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. Informacije koje su date u U.S. prijavi Ser. Nos. 08/193,829, 08/038,596 i 07/975,750 snažno sugerišu da VEGF nije odgovoran samo za proliferaciju endotelijalnih ćelija, već je takođe i najvažniji regulator normalne i patološke angiogeneze. Pogledati generalno, Klagsburn & soker, 1993, Current Biologv, 3(10)699-702; Houck et al., 1992, J. Biol. Chem.. 267:26031-26037.

Normalna vaskulogeneza i angiogeneza imaju važne uloge u nizu različitih fizioloških procesa kao što su embrionalni razvoj, zalečenje rana, regeneracija organa i procesi ženkog reproduktivnog trakta kao što je razvoj folikula u žutom telu u toku ovulacije i rast placente posle trudnoće. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931-34. Nekontrolisana vaskulogeneza i/ili angiogeneza je povezana sa bolestima kao što je dijabetes, kao i sa malignim čvrstim tumorima koji se pri rastu oslanjaju na vaskularizaciju. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; VVeidner et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Pretpostavljena uloga VEGF u proliferaciji endotelijalnih ćelija i migraciji u toku angiogeneze i vaskulogeneze ukazuje na važnu ulogu KDR/FLK-1 receptora u ovim procesima. Bolesti kao što je diabetes mellitus (Folkman, 198, in Xl<m>Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) i artritis, kao i rast malignog tumora mogu nastati kao posledica nekontrolisane angiogeneze. Pogledati npr., Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Receptori za koje se specifično vezuje VEGF su važno i izrazito terapeutski ciljno mesto za regulaciju i modulaciju vaskulogeneze i/ili angiogeneze i niza teških bolesti koje obuhvataju abnormalni rast ćelija izazvan ovim procesima. Plovvman et al., 1994, DN& P, 7(6):334-339. Posebno, visoko specifična uloga KDR/FLK-1 receptora u neovaskularizaciji čini ga izbornim ciljnim mestom za terapeutske pristupe za lečenje kancera i drugih bolesti koje obuhvataju nekontrolisano formiranje krvnih sudova.

Prema tome, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja su sposobna da regulišu i/ili moduliraju prenošenje signala tirozin kinaze uključujući prenošenje signala preko KDR/FLK-1 receptora da bi se inhibirala ili podstakla angogeneza i/ili vaskulogeneza, to jest, jedinjenja koja inhibiraju, sprečavaju, ili utiču na signal koji prenosi KDR/FLK-1 kada je aktiviran ligandima kao što je VEGF. lako se veruje da jedinjenja ovog pronalska deluju na receptor ili neku drugu komponentu duž puta prenošenja signala tirozinkinaze, ona takođe mogu delovati direktno na ćelije tumora koje nastaju nekontrolisanom angiogenezom.

lako se nomenklatura humanih i mišjih kopija generičkog "flk-l" receptora razlikuje, one su u mnogim pogledima zamenjive. Mišji receptor, Flk-1 i njegova humana kopija, KDR, dele homologiju sekvenci od 93.4% u okviru unutarćelijskog domena. Tome slično, mišji FLK-I se vezuje za humani VEGF sa istim afinitetom kao mišji VEGF i prema tome je aktiviran ligandom koji je izveden iz bilo koje od ove dve vrste. Miliauer et al., 1993, Cejl, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 se vezuje i nakon toga fosforiliše tirozin humanih RTK supstrata (npr., PLC-y ili p85) kada se istovremeno ekspirmira u 293 ćelije (humani embrionalni fibroblasti bubrega).

Modeli koji se oslanjaju na FLK-1 receptor se prema tome mogu direktno upotrebiti radi razumevanja KDR receptora. Na primer, upotreba mišjeg FLK-1 receptora u postupcima koji identifikuju jedinjenja koja regulišu prenos signala kod miša se diektno može upotrebiti za identifikaciju jedinjenja koja se mogu upotrebiti za regulaciju prenošenja signala kod čoveka, to jest, koja regulišu aktivnost povezanu sa KDR receptorom. Prema tome, hemijska jedinjenja koja su identifikovana kao inhibitori KDR/FLK-1in vitro,se mogu potvrditi u pogodnimin vivomodelima.In vivoživotinjski modeli na miševima i pacovima pokazali su se kao izuzetno vredni za ispitivanje kliničkog potencijala agenasa koji deluju na KDR/FLK-1 indukovan put prenošenja signala.

Prema tome, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja regulišu, moduliraju i/ili inhibiraju vaskulogenezu i/ili angiogenezu delovanjem na enzimatsku aktivnost KDR/FLK-1 receptora i uticanjem na signal koji se prenosi pomoću KDR/FLK-1. Prema tome ovaj pronalazak daje terapeutski pristup lečenju mnogih vrsta čvrstih tumora uključujući, ali ne ograničavajući se na, glioblastom, melanom i Kapošijev sarkom i karcinom jajnika, pluća, dojke, prostate, pankreasa, debelog creva i epidermisa. Pored toga, podaci sugerišu da se takođe može iskoristiti primena jedinjenja koja inhibiraju KDR/Flk-1 posredovan put prenošenja signala u lečenju hemangioma, restenoze i dijabetske retinopatije.

Dalje, pronalazak se odnosi na inhibiciju vaskulogeneze i angiogeneze preko drugih receptor-posredovanih puteva, uključujući put koji sadrži flt-1 receptor.

Prenošenje signala koje je posredovano receptorom za tirozin kinazu je inicirano ektraćelijskom inetrakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligand), iza koje sledi dimerizacija receptora, privremena stimulacija unutrašnje aktivnosti protein tirozin kinaze i autofosforilacije. Time se stvaraju vezujuća mesta za unutarćelijske molekule koji prenose signale što vodi ka formiranju kompleksa sa čitavim spektrom citoplazmatičnih signalnih molekula koji olakšavaju odgovarajući ćelijski odgovor, npr., deoba ćelija i metabolički efekti na ekstraćelijsku sredinu. Pogledati, Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

Izražena homologija unutarćelijskih regiona KDR/FLK-1 i regiona PDGF-P receptora (50.3% homologija) i/ili srodnog flt-1 receptora ukazuje na indukciju preklapajućih puteva prenošenja signala. Na primer, za PDGF-p receptor, pokazano je da se članovi src familije (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), fosfatidilinozitol-3'-kinaza (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipaza cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTPaza-aktivirajući protein, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Ardvisson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) i adapter molekuli Shc i Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896), vezuju za regione koji obuhvataju različita autofosforilaciona mesta. Pogledati generalno, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Prema tome, verovatno je da putevi prenošenja signala koje aktivira KDR/FLK-1 obuhvataju ras put (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), puteve koji su posredovani sa PI-3'-kinazom, src-posredovane puteve i plcy-posredovane puteve. Svaki od ovih puteva može imati kritičnu ulogu u efektima KDR/FLK-1 na angiogenezu i/ili vaskulogenezu u endotelijalnim ćelijama. Kao posledica toga, sledeći aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotrebu organskih jedinjenja koja su ovde opisana za modulacju angiogeneze i vaskulogeneze s obzirom da su ovi procesi kontrolisani navedenim putevima.

Nasuprot tome, poremećaji koji su povezani sa sakupljanjem, kontrakcijom ili zatvaranjem krvnih sudova, kao što je restenoza, su takođe uključeni i mogu se lečiti ili sprečiti pomoću postupaka ovog pronalska.

Fibrotički poremećaji se odnose na abnormalno formiranje vanćelijskog matriksa. Primeri fibrotičkih poremećaja obuhvataju cirozu jetre i poremećaj proliferacije mezangialnih ćelija. Cirozu jetre karakteriše povećanje sastavnih delova vanćelijskog matriksa što rezultira u formiranju hepatičkog ožiljka. Povećani vanćelijski matriks koji stvara hepatički ožiljak može biti izazvan virusnom infekcijom kao što je hepatitis. Izgleda da lipociti imaju glavnu ulogu kod ciroze jetre. Drugi fibrotički poremećaji u ovom smislu obuhvataju aterosklerozu.

Poremećaji proliferacije mezangialnih ćelija se odnose na poremećaje koji nastaju kao posledica abnormalne proliferacije mezangialnih ćelija. Mezangioproliferacioni poremećaji obuhvataju različite humane bolesti bubrega kao što su glomerulonefritis, dijabetska nefropatija i maligna nefroskleroza kao i takvi poremećaji kao što su trombotički mikroangiopatski sindromi, odbcivanje transplatanta i glomerulopatije. RTK PDGFR su uključene u održavanje proliferacije mezangialnih ćelija. Floege et al., 1993, Kidnev International 43:47S-54S.

Mnogi kanceri su poremećaji proliferacije ćelija i kao što je prethodno napomenuto, PKs su povezane sa poremećajima proliferacije ćelija. Prema tome, ne iznenađuje to što su PKs, kao što su, na primer, članovi RTK familije povezane sa razvojem kancera. Neki od ovih receptora, kao što su EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) i PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) su prekomerno eksprimirani u mnogim tumorima i/ili trajno aktivirani autokrinim petljama. Ustvari, kod najčešćih i najtežih kancera demonstrirani su ova prekomerna ekspresija receptora (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci.. 111:119-133, Dickon et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Kore et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) i autokrine petlje (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.. 118:1057-1070, Kore et al., supra, Akbasak and Suner Akbasak et al., supra). Na primer, EGFR je povezan sa karcinomom skvamoznih ćelija, astrcitomom, glioblstomom, kancerom glave i vrata, kancerom pluća i kancerom bešike. HER2 je povezan sa kancerom dojke, jajnika, želuca, pluća, pankreasa i bešike. PDGFR je povezan sa glioblastomom i melanomom kao i sa kancerom pluća, jajnika i prostate. RTK c-met je takođe povezan sa formiranjem malignih tumora. Na primer, c-met je povezan sa, između ostalih kancera, kolorektalnim, tiroidnim karcinomima, karcinomom pankreasa, želuca, hepatocelulanim kancerom i limfomima. Pored toga c-met je povezan sa leukemijom. Prekomerna ekspresija c-met gena je takođe detektovana kod pacijenata sa Hodgkin-ovom bolešću i Burkitt-ovom bolešću.

IGF-IR, pored toga što je uključen u nutricionim procesima i tipu-ll dijabetesa, takođe je povezan sa nekoliko tipova kancera. Na primer, IGF-I je uključen kao autokrini stimulator rasta za nekoliko tipova tumora, npr., karcionoma ćelija humanog kancera dojke (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) i tumora pluća sa malim ćelijama (Macaulev et al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Pored toga što je IGF-I uključen u normalni rast i diferencijaciju nervnog sistema, izgleda da je takođe autokrini stimulator humanih glioma. Sandberg-Nordvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Značaj IGF-IR i njegovih liganada u proliferaciji ćeliji je dodatno podržan činjenicom da IGF-I stimuliše na rast mnoge tipove ćelija u kulturi (fibroblaste, epitelijalne ćelije, ćelije glatkih mišića, T-limfocite, mijeloidne ćelije, hodrocite i osteoblaste (stem ćelije koštane srži)). Goldring and Goldring, 1991, Eukarvotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga i Coppola sugerišu da IGF-IR ima centralnu ulogu u mehanizmu transformacije i, kao takav, mogao bi biti poželjno ciljno mesto za terapeustke intervencije za široki spektar humanih maligniteta. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola etal., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.

STKs su uključene u više tipova kancera uključujući, naročito, kancer dojke (Cance et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Veza između abnormalne aktivnosti PK i bolesti nije ograničena na kancer. Na primer, RTKs su povezane sa bolestima kao što su psorijaza, diabetes mellitus, endometrioza, angiogeneza, ateromski razvoj plaka, Alchajmerova bolest, restenoza, von Hippel-Lindau-ova bolest, epidermlna hiperproliferacija, neurodegenerativne bolesti, makularna degeneracija povezana sa starenjem i hemangiomi. Na primer, EGFR je uključen u kornealno i dermalno zaceljivanje rana. Defekti RTKs i njihove terapeutske indikacije su date u Plovvman et al., 1994, DN& P 7:334-339.

Kao što je prethodno napomenuto, nisu samo RTKs, već su i CTKs uključujući i, ali ne ograničavajući se na, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, bik, hek, fgr i yrk (opisane od strane Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) uključene u proliferativni i metabolički put prenošenja signala i prema tome može se očekivati, a i pokazano je, da su uključene u mnoge PTK-posredovane poremećaje na koje je usmeren ovaj pronalazak. Na primer, pokazano je da je mutirani src (v-src) kod pilića onkoprotein (pp60<v>"<src>). Takođe, njegov ćelijski homolog, proto-onkogen pp60<v>"<src>prenosi onkogene signale mnogih receptora. Prekomerna ekspresija EGFR ili Her2/neu u tumorima vodi ka konstitutivnoj aktivaciji pp60<v>"<src>, koj<a>je karakteristična za maligne ćelije, a nema je kod normalnih ćelija. Sa druge strane, miševi sa deficijencijentnom ekspresijom c-src pokazuju osteopetrozni fenotip, ukazujući na ključno učešće c-src u funkciji osteoklasta i moguće učešće u srodnim poremećajima.

Slično tome, Zap70 je uključen u signalne puteve T-ćelija što može biti povezano sa autoimunim poremećajima.

STKs su povezane sa inflamacijom, autoimunom bolešću, imunim odgovorima i poremećajima hiperproliferacije kao što su restenoza, fibroza, psorijaza, osteoartritis i reumatoidni artritis.

PKs su takođe uključene u implantaciju embriona. Prema tome, jedinjenja ovog pronalaska mogu obezbediti efikasan postupak za prevenciju takve implantacije embriona i time mogu bit korisna kao agensi za kontrolu rađanja. Dodatni poremećaji koji se mogu lečiti ili sprečiti korišćenjem jedinjenja ovog pronalaska su imunološki poremećaji kao što je automuna bolest, AIDS i kardiovaskularni poremećaji kao što je ateroskleroza.

Konačno, trenutno se smatra da su i RTKs i CTKs uključene u hiperimune poremećaje.

Ova jedinjenja i podaci ne bi trebalo da ograničavaju delokrug ovog pronalaska na bilo koji način.

Primena i farmaceutska kompozicija

Jedinjenje ovog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se može primeniti kao takvo na pacijenta ili se može pimeniti u farmaceutskoj kompoziciji u kojoj su gorepomenuti materijali pomešani sa pogodnim nosačima i inertnim puniocem (puniocima). Tehnike za formulaciju i primenu lekova se mogu naći u "Remington's Pharmacological Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., poslednje izdanje.

Kao što je ovde korišćeno, "primena" ili "primeniti" se odnosi na isporuku jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvaljive soli ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so iz ovog pronalaska organizmu radi prevencije ili lečenja poremećaja koji je povezan sa

PK.

Pogodni putevi primene mogu obuhvatati, bez ograničavanja oralnu, rektalnu, transmukozalnu ili intestinalnu primenu ili intramuskularne, subkutane, intramedularne, intratrahealne, direktne intraventrikularne, intravenozne, intravitrealne, intraperitonealne, intranazalne, ili intraokularne injekcije. Poželjni putevi primene su oralni i parenteralni.

Alternativno, moguće je preferiranje primene jednjenja na lokalni nego na sistemski način, na primer, injekcijom jedinjenja direktno u čvrsti tumor, često u formulaciji depoa ili formulaciji sa produženim oslobađanjem.

Dalje, moguće je primeniti lek u ciljnom sistemu za primenu leka, na primer, u lipozomu koji je obložen tumor-specifičnim antitelom. Lipozomi će biti dovedeni do i preuzeti selektivno od strane tumora.

Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska se mogu proizvesti pomoću postupaka koji su dobro poznati u tehnici, npr., pomoću procesa konvencionalnog mešanja, rastvaranja, granulisanja, stvaranja dražeja, pretvaranja u prah, emulzifikovanja, enkapsuliranja ili liofilizacije.

Farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom se mogu formulisati na konvenconalan način korišćenjem jednog ili više prihvatljivih nosača koji sadrže inertne punioce i pomoćna sredstva koji olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparatima koji se mogu upotrebiti farmaceutski. Pogodna formulacija zavisi od izabranog načina primene.

Za injekciju, jedinjenja pronalaska se mogu formulisati u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hank-ov rastvor, Ringerov rastvor, ili fiziološki slani rastvor pufera. Za transmukozalnu primenu, u formulaciji su upotrebljena sredstva za omekšavanje koja omogućavaju propustljivost barijere.

Za oralnu primenu, jedinjenja se mogu formulisati spajanjem aktivnih jedinjenja sa farmaceutski prihvaljivim nosačima koji su dobro poznati u tehnici. Takvi nosači omogućavaju da se jedinjenja pronalaska formulišu kao tablete, pilule, tablete sa šećerom, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, taloži, suspenzije i tome slično, za oralnu primenu na pacijenta. Farmaceustki preparati za oralnu upotrebu se mogu formirati korišćenjem čvrstog inertnog punioca, izbornim mlevenjem dobijene smeše i obradom smeše granula, posle dodavanja drugih pogodnih pomoćnih sredstava ako je poželjno, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Korisni inertni punioci su posebno punioci kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol, ili sorbitol, preparati celuloze kao što su na primer kukuruzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob i škrob krompira i drugi materijali kao što su želatin, tragakant, metilceluloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijumkarboksimetilceluloza i/ili polivinil-pirolidon (PVP). Ako je poželjno, mogu se dodati dezintegranti kao što su unakrsno vezani polivinilpirolidon, agar, ili alginska kiselina. Takođe se može upotrebiti so kao što je natrijumalginat.

Jezgra dražeja se oblažu pogodnim omotačima. Za ovu svrhu mogu se upotrebiti rastvori šećera koji mogu izborno da sadrže gumu arabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilenglikol i/ili titanijumdioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvore ili smeše rastvora. Bojene materije ili pigmenti se mogu dodati tabletama ili omotačima dražeja za identifikaciju ili karaktrizaciju različitih kombinacija doza aktivnog jedinjenja.

Farmaceutske kompozicije koje se mogu koristiti oralno obuhvataju kapsule formirane od želatina, kao i mekane, zatvorene kapsule formirane od želatina i omekšivača kao što je glicerol ili sorbitol. Kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke u smeši sa puniocem kao što je laktoza, vezujućim sredstvom kao što je škrob i/ili lubrikantom kao što je talk ili magnezijumstearat i izborno, sa stabilizatorom. U mekanim kapsulama, aktivna jedinjenja se mogu rastvoriti ili suspendovati u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja tečni parafin, ili tečni polietilenglikoli. U ove formulacije takođe se mogu dodati i stabilizatori.

Farmaceutske kompozicije koje se takođe mogu upotrebiti obuhvataju tvrde želatinozne kapsule. Kao primer koji ne predstavlja ograničavanje, proizvodna formulacija kapsule oralnog leka aktivnog jedinjenja može biti dozne jačine od 50 i 200 mg. Dve dozne jačine su stvorene iz istih granula punjenjem tvrdih želatinoznih kapslula različite veličine, veličine 3 za 50 mg kapsule i veličine 0 za 200 mg kapsule. Kompozicija formulacije može biti, na primer, kao što je prikazano u Tabeli 2.

Kapsule mogu biti upakovane u boce od braon stakla ili plastične boce da bi se aktivno jedinjenje zaštitilo od svetla. Kontejneri koji sadrže formulacije kapsula sa aktivnim jedinjenjem se moraju čuvati na kontrolisanoj sobnoj temperaturi (15-30°C).

Za primenu inhalacijom, jedinjenja za upotrebu na osnovu ovog pronalaska se konvencionalno primenjuju u obliku aerosol spreja korišćejem pakovanja pod pritiskom ili raspršivača i pogodnog reaktivnog goriva (propelenta), npr., bez ograničavanja, dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetra-fluoroetana ili ugljendioksida. U slučaju aerosola pod pritiskom jedinica dozaže se može kontrolisati tako što se obezbedi da se preko ventila primeni određena merena količina. Kapsule i ulošci se mogu formulisati na taj način da sadrže smešu jedinjenja u prahu i pogodnu osnovu u prahu kao što je laktoza ili škrob.

Jedinjenja se takođe mogu formulisati za parenteralnu primenu, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekciju mogu biti prisutne u jediničnom obliku dozaže, npr., u ampulama ili više-doznim kontejnerima, sa dodatnim zaštitnim sredstvom. Kompozicije mogu biti date u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima i mogu da sadrže matrijale za formulisanje kao što su suspendujući, stabilizujući i/ili dispergujući agensi.

Farmaceutske kompozicije za pareneteralnu primenu obhvataju vodene rastvore oblika koji su rastvorljivi u vodi, kao što je, bez ograničavanja, so aktivnog jedinjenja. Pored toga, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripremiti u lipofilnom nosaču. Pogoni lipofilni nosači obuhvataju masna ulja kao što su sezamovo ulje, sinteteičke estre masnih kiselina kao što su etiloleat i trigliceridi, ili materijale kao što su lipozomi. Vodene suspenzije injekcija mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijumkarboksimetlceluloza, sorbitol, ili dekstran. Izborno, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore i/ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi se omogućilo pripremanje visoko koncentrovanih rastvora.

Alternatvno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za spajanje sa pogodnim nosačem, npr., sterilnom vodom koja je oslobođena pirogena, pre upotrebe.

Jedinjenja se takođe mogu formulisati u rektalne kompozicije kao što su supozitorije ili retencioni klistiri, korišćenjem, npr., konvencionalnih osnova za supozitorije kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.

Pored formulacija koje su prethodno opisane, jedinjenja takođe mogu biti formulisana kao preparati u obliku depoa. Takve formulacije koje dugotrajno deluju mogu se primeniti implantacijom (na primer, subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Jedinjenje ovog pronalaska se može formulisati za ovaj način primene sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, u emulziji sa farmakološki prihvatljivim uljem) sa jono-izmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljiv derivat kao što je, bez ograničavanja, slabo rastvorljiva so.

Ne-ograničavajući primer farmaceutskog nosača za hidrofobna jedinjenja pronalaska je sistem ko-rastvarača koji sadrži benzilalkohol, nepolarno površinsko sredstvo, organski polimer koji se meša sa vodom i vodenu fazu kao što je VPD sistem ko-rastvarača. VPD je rastvor 3% w/v benzilalkohola, 8% w/v nepolarnog površinskog sredstva Polvsorbate 80 i 65% w/v polietilenglikola 300, koji su dopunjeni do krajnje zapremine u apsolutnom etanolu. VPD sistem korastvarača (VPD:D5W) se sastoji od VPD koji je razblažen 1:1 sa 5% dekstrozom u vodenom rastvoru. Ovaj sistem korastvarača dobro rastvara hidrofobna jedinjenja i sam proizvodi nisku toksičnost posle sistemske primene. Prirodno, proporcije takvog sistema korastvarača mogu značajno da variraju bez poništavanja njegovih osobina rastvorljivosti i toksičnosti. Dalje, identitet komponenti korastvarača može varirati: na primer, umesto polvsorbate 80 mogu se upotrebiti druga nisko-toksična nepolarna površinska sredstva, veličina frakcija polietilenglikola može da varira, polietilenglikol se može zameniti drugim biokompatibilnim polimerima, npr., polivnilpirolidonom, a drugi šećeri ili polisaharidimi mogu da zamene dekstrozu.

Alternativno, mogu se korisiti drugi sistemi primene za hidrofobna farmaceutska jedinjenja. Lipozomi i emulzje su dobro poznati primeri prenosioca ili nosača za hidrofobne lekove. Pored toga, takođe se mogu koristiti izvesni organski rastvarači kao što je dimetilsulfoksid, iako često po cenu veće toksičnosti.

Pored toga, jedinjenja se mogu primeniti korišćenjem sistema sa produženim-oslobađanjem, kao što su polupropustljive mreže čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže terapeutski agens. Stvoreni su različiti materijali sa produženim oslobađanjem koji su dobro poznati tehničarima. Kapsule sa produženim oslobađanjem mogu, u zavisnosti od njihove hemijske prirode, da oslobađaju jedinjenja nekoliko nedelja do preko 100 dana. U zavisnosti od hemijske prirode i biološke stabilnosti tearpeutskog reagensa, mogu se upotrebiti dodatne strategije za stablizaciju proteina.

Farmaceutske kompozicije ovde mogu da sadrže nosače ili inertne punioce u čvrstoj ili gel fazi. Primeri takvih nosača ili inertnih punilaca obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kalcijumkarbonat, kalcijumfosfat, različite šećere, škrobove, derivate celuloze, želatin i polimere kao što su polietilenglikoli.

Mnoga od jedinjenja koja moduliraju PK iz ovog pronalaska se mogu obezbediti kao fiziološki prihvatljive soli gde jedinjenje iz patentnih zahteva može da formira negativno ili pozitivno naelektrisane vrste. Primeri soli u kojima jedinjenje formira pozitivno naelektrisanu grupu obuhvataju, bez ograničavanja, kvaternarne amonijum soli (definisane u ovom tekstu), soli kao što su hidrohlorid, sulfat, karbonat, laktat, tartarat, malat, maleat, sukcinat gde je atom azota kvaternarne amonijum grupe azot izabranog jedinjenja ovog pronalaska koji je reagovao sa odgovarajućom kiselinom. Soli u kojima jedinjenja ovog pronalaska formira negativno naelektrisane vrste obuhvataju, bez ograničavanja, soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma koje su formirane pomoću reakcije karboksilne grupe u jedinjenju sa odgovarajućom bazom (npr. natrijumhidroksidom (NaOH), kalijumhidroksidom (KOH), kalcijumhidroksidom (Ca(OH)2), itd.).

Farmaceutske kompozicije koje su pogodne za upotrebu u ovom pronalasku obuhvataju kompozicije kod kojih su aktivni sastojci prisutni u količini koja je dovoljna da se postigne nameravani cilj, npr., modulacija aktivnosti PK ili lečenje ili prevencija PK-povezanog poremećaja.

Posebno, terapeutski efikasna količina označava količinu jedinjenja koja je efikasna u prevenciji, ublažavanju ili poboljšavanju simptoma bolesti ili produžavnju preživljavanja subjekta koji se tretira.

Određivanje terapeutski efikasne količine može sprovesti tehničar, posebno u svetlu detaljnog opisa koji je ovde dat.

Za bilo koje jedinjenje koje je upotrebljeno u postupcima pronalaska, moguće je odrediti terapeutski efiksnu količinu ili dozu inicijalno iz analiza kulture ćelija. Zatim, dozaža se može formulisati za upotrebu u životinjskim modelima tako da se postigne koncentracija u cirkulaciji u opsegu koji obuhvata IC50kao što je određeno u kulturi ćelija (tj., koncentracija test jedinjenja kojom se postiže polu-maksimalna inhibicija aktivnosti PK). Ta informacija se zatim može upotrebiti da bi se tačnije odredile korisne doze kod ljudi.

Toksičnost i terapeutska efikasnost jedinjenja koja su opisana ovde mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u kulturama ćelija ilii kod ekspermentalnih životinja, npr., određivanjem IC5oi LD5o(oba su razmatrana u ovom tekstu) za dotično jedinjenje. Podaci dobjeni iz ovih analiza kultura ćelija i studija na životinjama se mogu upotrebiti u formulisanju opsega dozaže za korišćenje kod ljudi. Dozaža može da varira u zavisnosti od oblika dozaže koji se koristi i od upotrebljenog načina primene. Tačnu formulaciju, način primene i dozažu može izabrati svaki lekar posebno i to s obzirom na stanje pacijenta. (Pogledati npr., Fingl et al., 1975, u "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

Količina i interval dozaže se mogu podesiti prema svakom pojedinačnom slučaju tako da se obezbede nivoi aktivnih vrsta u plazmi koji su dovoljni da se održe modulirajući efekti na kinazu. Ovi nivoi u plazmi se označavaju kao minimalne efikasne koncetracije (MECs). MEC će varirati za svako jedinjenje, ali se može odrediti na osnovuin vivopodataka, npr., koncentracija koja je neophodna da bi se postiglo 50-90% inhibicije kinaze može se utvrditi korišćenjem analiza koje su ovde opisane. Dozaže koje su neophodne da bi se postigla MEC će zavisiti od pojedinačnih osobina i načina primene. HPLC analize ili bioanalize se mogu upotrebiti za određivanje koncentracija u plazmi.

Intervali dozaže se takođe mogu odrediti korišćenjem MEC vrednosti. Jedinjenja bi trebalo primeniti korišćenjem režima koji održava nivoe u plazmi iznad MEC u toku 10-90% vremena, poželjno između 30-90% i najpoželjnije između 50-90%.

Trenutno, terapeutski efikasne količine jedinjenja iz formula I, la ili II se mogu kretati u opsegu od približno 25 mg/m<2>do 1500 mg/m<2>na dan; poželjno oko 3 mg/m<2>/dan. Čak poželjnije 50 mg/qm qd do 400 mg/qd.

U slučajevima lokalne primene ili selektivnog preuzimanja, efikasna lokalna koncentracija leka ne mora biti povezana sa koncentracjom u plazmi i moguće je upotrebiti druge postupke koji su poznati u tehnici da bi se odredila tačna količina dozaže i interval.

Količina kompozicije koja se primenjuje će, naravno, zavisiti od subjekta koji se tretira, težine stanja, načina primene, mišljenja nadležnog lekara, itd.

Ako je poželjno, kompozicije se mogu pripremiti u pakovanjima ili aparatima za kontrolisanu primenu, kao što je kit koji je odobrila FDA, koji može da sadrži jedan ili više jediničnih oblika dozaže koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili aparat za kontrolisanu primenu mogu imati prateća uputstva za primenu. Pakovanje ili aparat za kontrolisanu primenu mogu takođe imati prateću napomenu koja je povezana sa kontejnerom u obliku koji je propisala vladina agencija za regulisanje proizvodnje, upotrebe ili prodaje farmaceutika, gde ta napomena odražava odobrenje agencije za oblik kompozicije ili humanu ili veterinarsku primenu. Takva napomena, na primer, može biti na etiketi koju je odobrilo U.S. Food and Drug Administration for prescription drugs ili kao odobreni dodatak proizvodu. Kompozicije koje sadrže jedinjenje pronalaska koje je formulisano u kompatibilnom farmaceutskom nosaču, može se takođe pripremiti, postaviti u odgovarajući kontejner i može se dodeliti etiketa za lečenje naznačenog stanja. Pogodna stanja naznačena na etiketi mogu obuhvatati lečenje tumora, inhibiciju angiogeneze, tretman fibroze, dijabetes i tome slično.

Ovaj pronalazak se može primeniti sa nosačem CMC suspenzije. Primeri CMC suspenzija su dati u nastavku u Tabeli 3.

Protokol za 1.0 litar nosača CMC suspenzije je kao što sledi u daljem tekstu.

Izračunati odgovarajuću količinu inertnih punilaca koja je potrebna da se pripremi formulacija nosača korišćenjem tabele koja pokazuje kompoziciju formulacije nosača i ukupnu veličinu. Izmeriti pogodan prazan kontejner, kao što je čista staklena boca sa širokim grlićem ili polietilenska boca. Dodati oko 600 ml vode u kontejner. Izmeriti karboksimetilcelulozanatrijum (5 g) i preneti ga u kontejner. Mešati korišćenjem magnetne mešalice ili laboratorijske mešalice sa propelerom sve dok rastvor ne postane homogen (oko 2-3 časa). Izmeriti NaCI i dodati u kontejner. Nastaviti sa mešanjem sve do rastvaranja (oko 10 minuta). Dodati polisorbat-80. Mešati sve dok rastvor ne postane homogen (oko 20 minuta). Dodati benzilalkohol. Mešati sve dok rastvor ne postane homogen (oko 10 minuta). Dodati preostalu vodu da bi se težina rastvora dovela do tražene ukupne veličine bilo po težini ili po zapremini (1010 g ili 1000 ml, gustina na 22°C je 1.01). Čuvati na 2-8°C (hlađenje).

Formulacija suspenzije se može proizvesti na sledeći način. Samleti API korišćenjem avana i tučka da bi se dobio homogeni prah sa malom veličnom čestica (bez grudvica ili krupnih čestica - idealno bi trebalo da prođe kroz US Standard rešetku

>80 tj. veličina od <180fam). Izmeriti izračunatu količinu API u kontejneru. Dodati oko 90% ukupne željene količine nosača MC suspenzije u kontejner. Suspendovati jedinjenja u nosač korišćenjem laboratorijske mešalice sa propelerom ili ekvivalentnog aparata. Prečnik oštrica propelera bi trebalo da se poklapa sa prečnikom dna kontejnera da bi se osiguralo efikasno mešanje. Mešati na 50 rpm 30 minuta ili dok se lek ne suspenduje dobro. Dodati formulaciju nosača u "qs" (dopremiti vodu ) (dovoljan kvalitet) do odgovarajuće težine koja odgovara ukupnoj veličini. Mešati na 50 rpm još 30 minuta. Odmah prebaciti alikvote suspenzije u staklo boje ćilibara ili propilenske kontejnere. Kontejnere bi trebalo zaštiti od svetla. Mešati na 2-8°C (hlađenje, ne zamrzavati).

Aspekat ovog pronalaska je takođe i to što se jedinjenje koje je ovde opisano, ili njegova so ili profarmak mogu spajati sa drugim terapeutskim agensima za lečenje bolesti i poremećaja koji su razmatrani u prethodnom tekstu. Na primer, jedinjenje, so ili profarmak ovog pronalaska se može spajati sa alkilujućim agensima kao što je sam fluorouracil (5-FU) ili dodatno kombinovan sa lekovorinom; ili drugi alkilujući agensi kao što su, bez ograničavanja, drugi analozi pirimidina kao što su UFT, kapecitabin, gemcitabin i citarabin, alkilsulfonati, npr., busulfan (upotrebljen u lečenju hronične granulocitne leukemije), improsulfan i piposulfan; aziridina, npr., benzodepa, karbohuon, meturedepa i uredepa; etilenimini i metilmelamini, npr., altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolmelamin; i bis (2-hloroetil) etilamini, npr., hlorambucil (upotrebljen u lečenju hronične leukemije limfocita, primarne makroglobulinemije i ne-Hodgkin-ovog limfoma), ciklofosfamid (upotrebljen u lečenju Hodgkin-ove bolesti, multiplog mijeloma, neuroblastoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera pluća, VVilm-ovog tumora i rabdomiosarkoma), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin i 5-(bis(2-hloroetil)amino)-2,4(1H,3H)-pirimidindioni (upotrebljeni u lečenju primarne trombocitoze, ne-Hodgkin-ovog limfoma, Hodgkin-ove bolesti i kancera jajnika); i triazini, npr., dacarbazin (upotrebljen u lečenju sarkoma mekih tkiva).

Jedinjenje, so ili profarmak iz ovog pronalaska se takođe može upotrebiti zajedno sa drugim antimetaboličkim hemoterapeutskim agensima kao što su, bez ograničavanja, analozi folne kiseline, npr. metotreksat (upotrebljen u lečenju akutne limfocitne leukemije, horiokarcinoma, mvcosis fungiodes kancera dojke, kancera glave i vrata i osteogenog sarkoma) i pteropterin; i analozi purina kao što su merkaptopurin i tioguanin koji nalaze svoju upotrebu u lečenju akutne granulocitne, akutne limfocitne i hronične granulocitne leukemije.

Predviđeno je da se jedinjenje, so ili profarmak iz ovog pronalaska takođe mogu upotrebiti zajedno sa hemoterapeutskim agensima na bazi prirodnih proizvoda kao što su, bez ograničavanja, alkaloid iz biljke rodaVinca,npr., vinblastin (upotrebljen u lečenju kancera dojke i kancera testisa), vinkristin i vindesin; epipodofilotoksini, npr., etoposid i teniposid, oba su korisna u lečenju kancera testisa i Kapošijevog sarkoma; antibiotički hemoterapeutski agensi, npr., daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, mitomicin (upotrebljeni za lečenje kancera želuca, grlića materice, debelog creva, dojke, bešike i pankreasa), daktinomicin, temozolomid, plikamicin, bleomicin (upotrebljen u lečenju kancera kože, jednjaka i genitalnog trakta); i enzimatski hemoterapeutski agensi kao što je L-asparaginaza.

Poreci onoga što je navedeno u prethodnom tekstu, jedinjenje, so ili profarmak ovog pronalska bi takođe trebalo ubotrebiti zajedno sa koordinacionim kompleksima sa platinom (cisplatin, itd); derivatima metilhidrazina, npr., prokarbazin; adrenokortikalnim supresantima, npr., mitotan, aminoglutetimid; i antagonistima hormona kao što su adrenokortikosteroidi (npr., prednizon), progestini (npr., hidroksiprogesteronkaproat); estrogeni (npr., dietilstilbesterol); antiestrogeni kao što je tamoksifen; androgeni, npr., testosteronpropionat; i inhibitori aromataze kao što je anastrozol.

Konačno, takođe je predviđeno da će kombinacija jedinjenja ovog pronalaska biti efikasna zajedno sa mitoksantronom, paklitakselom, inhibitorima ciklooksigenaze-2 koji su poznati u tehnici, posebno Celebrex®, Paracoxib®, Vioxx®, Abotov Cox-189 dat u PCT Publication No. WO 99/11605, inhibitorima topoizomeraze kao što su Camptosar®, antagonist receptora Her-2 kao što je Herceptin®, endostatin, Gleevac®, IMC antagonist ImCIone VEGF receptora C225® za lečenje čvrstih tumora ili leukemija kao što je, bez ograničavanja, akutna mijelogena (ne-limfocitna) leukemija.

Opšti postupak sinteze

Sledeća opšta metodologija se može upotrebiti za pripremanje jedinjenja ovog pronalaska: Odgovarajuće supstituisan 2-oksindol (1 ekviv.), odgovarajuće supstituisan 3-karboksi-5-formilpirol (1.2 ekviv.) i baza (0.1 ekviv.) su pomešani u rastvaraču (1-2 ml/mmol 2-oksindola) i smeša je zatim zagrevana od oko 2 do oko 12 časova. Posle hlađenja, talog koji se formira je filtriran, ispiran hladnim etanolom ili etrom i sušen u vakuumu da bi se dobila odgovarajuća 5-(2-okso-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil)-1-H-pirol-3-karboksilna kiselina. Ako se ne formira nikakav talog, reakciona smeša se koncentruje i ostatak se pretvara u prašak sa dihloromtanom/etrom, dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i zatim sušena. Proizvod izborno može biti dodatno prečišćen hromatografijom.

Baza može biti organska ili neorganska baza. Ako je upotrebljena organska baza, to je poželjno azotna baza. Primeri organskih azotnih baza obuhvataju, ali nisu ograničeni na, diizopropilamin, trimetilamin, trietzilamin, anilin, piridin, 1,8-diazabiciklo[5.4.1]andek-7-en, pirolidin i piperidin.

Primeri neorganskih baza su, bez ograničavanja, amonijak, hidroksidi, fosfati, karbonati, bikarbonati, bisulfati i amidi alkalnih i zemnoalkalnih metala. Alkalni metali obuhvataju litijum, natrijum i kalijum, dok zemnoalkalni metali obuhvataju kalcijum, magnezijum i barijum.

U trenutno poželjnom obliku ovog pronalaska, kada je rastvarač protonski rastvarač, kao što su voda ili alkohol, baza je neorganska baza alkalnog ili zemnoalkalnog metala, poželjno hidroksid alkalnog ili zemnoalkalnog metala.

Tehničarima će biti jasno, na osnovu poznatih opštih principa organske sinteze i na osnovu otkrića koja su ovde data, koja će baza biti najpogodnija za razmatranu reakciju.

Rastvarač u kome se izvodi reakcija može biti protonski ili aprotonski rastvarač, poželjno to je protonski rastvarač. "Protonski rastvarač" je rastvarač koji ima atom(e) vodonika kovalentno vezan za atom kiseonika ili azota koji čini atome vodonika znatno kiselim i prema tome sposobnim da se "deli" sa rastvorljivim sredstvom preko vodoničnih veza. Primeri protonskih rastvarača obuhvataju, bez ograničavanja, vodu i alkohole.

"Aprotonski rastvarač" može biti polarni i ne-polarni, ali u svakom slučaju ne sadrži kisele vodonike i prema tome nije sposoban za formiranje vodoničnih veza sa rastvorljivim sredstvom. Primeri ne-polarnih aprotonskih rastvarača, bez ograničavanja, su pentan, heksan, benzen, toluen, metilenhlorid i ugljeniktetrahlorid. Primeri polarnih aprotoskih rastvarača su hloroform, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i dimetilformamid.

U trenutno poželjnom obliku ovog pronalaska rastvarač je protonski rastvarač, poželjno voda ili alkohol kao što je etanol.

Reakcija je izvedena na temperaturama iznad sobne temperature. Temperatura je u opštem slučaju od oko 30°C do oko 150°C, poželjno oko 80°C do oko 100°C, najpoželjnije oko 60°C do oko 85°C, što je otprilike oko tačke ključanja etanola. "Oko" označava da je temperaturni opseg poželjno unutar 10 stepeni Celzijusa od naznačene temperature, poželjnije unutar 5 stepeni Celzijusa od naznačene temperature i najpoželjnije unutar 2 stepena Celzijusa od naznačene temperature. Prema tome, na primer, "oko 75°C" označava 75°C ± 10°C, poželjno 75°C ± 5°C i najpoželjnije 75°C ± 2°C.

2-Oksiindoli i 3-karboksi-5-formilpirol se lako mogu sintetisati upotrebom tehnika koje su dobro poznate u hemijskoj praksi upotrebom lako dostupnih početnih materijala.

Kuplovanje 5-(2-okso-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil)-1 -H-pirol-3-karboksilne kiseline sa aminom formule ZCH(R<5>)-CR<4>(OH)-CHR<3>NH2u organskom rastvaraču kao što su dimetilformamid, tetrahidrofuran i tome slično i prisustvo pogodnog kuplujućeg agensa kao što su dicikloheksilkarbodiimid, DEAD, EDC i HOBt zatim daje jedinjenje Formule (I). Amini formule ZCH(R<5>)-CR<4>(OH)-CHR<3>NH2su komercijalno dostupni ili se mogu pripremiti pomoću postupka koji je dobro poznat u tehnici. Neki takvi postupi su ovde opisani u daljem tekstu.

Tehničari će shvatiti da su drugi putevi sinteze za formiranje jedinjenja pronalaska dostupni i da je ono što sledi ponuđeno u vidu primera, a ne ograničenja.

PRIMERI

Sledeće preparacije i primeri su dati da bi tehničarima omogućili da jasnije razumeju i praktično isprobaju ovaj pronalazak. Te preparacije i primere ne bi trebalo smatrati kao ograničavajuće za delokrug pronalaska, već jedino kao ilustrativne i repezentativne.

Primeri sinteze

Primer 1

Sinteza 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3- karboksilne kiseline

Korak 1

Dimetilformamid (25 ml, 3 ekv.) je hlađen uz mešanje u ledenom kupatilu. Njemu je dodat POCI3(1.1 ekv., 10.8 ml). Posle 30 minuta, reakciji je dodat rastvor 3,5-dimetil-4- etilestarpirol (17.7 g, 105.8 mmo!) u DMF (2 M, 40 ml) i mešanje je nastavljeno. Posle 2 časa, reakcija je razblažena sa vodom (250 ml) i bazifikovana do pH=11sa 1N vodenim rastvorom NaOH. Bela čvrsta supstanca je uklonjena fltracijom, ispiranje vodom i zatim heksanima i sušenje je dalo etilestar 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (19.75 g, 95%) u obliku čvrste braon supstance. 1H NMR (360 MHz, DMS0-d6) 5 12.11 (br s, 1H, NH), 9.59 (s, 1H, CHO), 4.17 (q,J =6.7Hz, 2H, OCH2CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3), 1.26 (d,J =6.7Hz, 3H, OCH2CH3).

Korak 2

Etilestar 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (2 g, 10 mmol) je dodat rastvoru kalijumhidroksida (3 g, 53 mmol) koji je rastvoren u metanolu (3 ml) i vodi (10 ml). Smeša je refluksovana 3 časa, hlađena do sobne temperature i acidifikovana sa 6 N hlorovodoničnom kiselinom do pH 3. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, ispirana sa vodom i sušena u vakuumu u toku noći da bi se dobila 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (1.6 g, 93%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 12.09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9.59 (s, 1H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3).

Korak 3

5-Fluorostatin (8.2 g, 49.7 mmol) je rastvoren u 50 ml hidrazinhidrata i refluksovan je 1 čas. Reakcione smeše su zatim sipane u ledenu vodu. Talog je zatim filtriran, ispiran vodom i sušen pod vakuumskom peći da bi se dobio 5-fluoro-2-oksinsol (7.5 g).

Korak 4

Reakciona smeša 5-fluorooksindola (100 mg, 0.66 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (133 mg, 0.79 mmol) i 10 kapi piperidina u etanolu (3 ml) je mešana na 60°C u toku noći i filtrirana. Čvrsta supstanca je ispirana sa 1 M vodenim rastvorom hidrohlorida, vodom i sušena da bi se dobila 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (201 mg, kvantitativno) u obliku žute čvrste supstance. MS m/z (relativna jačina, %) 299 ([M-1]+ , 100).

Primer 2

Sinteza (3-dietilamino-2-hidroksi-propil)-amida 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

Korak 1

2-Hlorometiloksiranu (95 g, 1.03 mola) je dodata smeša vode (3.08 g, 0.17 mola) i dietilamina (106.2 ml, 1.03 mola) na 30°C. Reakciona smeša je zatim mešana na 28-35°C 6 časova i hlađena do 20-25°C da bi se dobio 1-hloro-3-dietilamino-propan-2-ol.

Korak 2

Rastvoru natrijumhidroksida (47.9 g, 1.2 mola) u 78 ml vode je dodat 1-hloro-3-dietilamino-propan-2-ol. Dobijeni rastvor je mešan na 20-25°C 1 čas, razblažen sa 178 ml vode i ekstrahovan sa etrom dva puta. Kombinovani etarski rastvor je sušen sa čvrstim kalijumhidroksidom i uparavan da bi se dobilo 135 g sirovog proizvoda koji je prečišćen frakcionom destilacijom da bi se dobio čisti glicidildietilamin (98 g, 76%) u obliku ulja.

Korak 3

U ledeno-hladni rastvor amonijumhidroksida (25 ml, 159 mmola) od 25% (w/w) je u kapima dodavan glicidildietilamin (3.2 g, 24.8 mmol) u toku 10 minuta. Reakciona smeša je mešana na 0-5°C 1 čas i zatim na sobnoj temeparturi 14 časova. Dobijena reakciona smeša je uparavana i destilovana (84-90°C na 500-600 mT) da bi se dobio 1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol (3.3 g, 92%). MS m/z 147 ([M+1]<+>).

Korak 4

Rastvoru 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (100 mg, 0.43 mmol), EDC (122.7 mg, 0.64 mmol) i HOBt (86.5 mg, 0.64 mmol u 1.0 ml DMF je dodat 1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol (93.2 mg, 0.64 mmol). Dobijeni reakcioni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi u toku noći i uparavan. Ostatak je suspendovan u 10 ml vode i filtriran. Čvrsta supstanca je ispirana zasićenim rastvorom natrijumbikarbonata i vode i sušena u visokoj vakuumoskoj peći u toku noći da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni eluiranjem sa 6% metanolom-dihlorometanom koji sadrži trietilamin (2 kapi/100 ml 6% metanol-dihlorometana) da bi se dobio (3-dietilamino-2-hidroksi-propil)-amid 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline (62 mg, 34%) u obliku žute čvrste supstance.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13.70 (s, 1H, NH-1'), 10.90 (s, 1H, NH-1), 7.76 (dd,J= 2.38, 9.33 Hz, 1H, H-4), 7.72 (s, 1H, vinil-H), 7.60 (m, br., 1H, CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4'), 6.93 (dt,J= 2.38, 8.99 Hz, 1H, H-5), 6.85 (dd,J =4.55, 8.99 Hz, 1H, H-6), 3.83 (m, br, 1H, OH), 3.33 (m, 4H), 2.67 (m, br, 5H), 2.46 (s, 3H, CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 1.04 (m, br, 6H, CH3X2). MSm/ z (relativna jačina,%) 427 ([M+1]<+>\100).

Primer 3

Sinteza (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

Korak 1

Smeša morfolina (2.6 ml, 30 mmol) i epihlorohidrina (2.35 ml, 30 mmol) u etanolu (50 ml) je mešana na 70°C u toku noći. Posle uklanjanja rastvarača, ostatak je razblažen sa metilenhloridom (50 ml). Čista nataložena čvrsta supstanca je sakupljena vakuumskom filtracijom da bi se dobio 1-hloro-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (2.0 g, 37%).<1>H NMR (DMSO-d6) 5 3.49 (t, J=4.8Hz, 2H), 3.60 (t, J=4.6Hz, 2H), 3.75 (m, 4H, 2XCH2), 4.20 (dd, J=5.2, 12 Hz, 2H), 4.54 (m, 2H), 4.62 (m, 1H, CH), 6.64 (d, J=6.4 Hz, 1H, OH). MS (m/z) 180.2 (M+1).

Korak 2

1-Hloro-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (2.0 g, 11 mmol) je tretiran sa rastvorom NH3u metanolu (25% po težini, 20 ml) na sobnoj temperaturi. Azot je uveden u reakcionu smešu da bi se uklonio amonijak. Uparavanje rastvarača je dalo hidrohloridnu so 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ola (2.0 g, 91%).<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.30 (d, J=6.0Hz, 2H), 2.36 (m, 4H, NCH2), 2.65 (dd, J=8.4, 12.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J=3.6, 12.8 Hz, 1H), 3.52 (m, 4H, OCH2), 3.87 (m, 1H, CH), 5.32 (s, 1H, OH), 8.02 (brs., 3H, NH3<+>). MS (m/z) 161.1 (M+1).

Korak 3

5-(5-Fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (120 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-olom (74 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amid 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (65 mg, 36%). Ishodna tečnost je uparavana do sušenja i ostatak je prečišćen brzom hromatografijom da bi se dobilo dodatnih 2N (70 mg, 39%).<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.28 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.40 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.31 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.78 (m, 1H), 4.73 (brs, 1H, OH), 6.82 (dd, J=4.5, 8.4 Hz, 1H), 6.90 (td,<2>J=2.8,<3>J=10.0Hz, 1H), 7.53 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.74 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H), (aromatičan i vinil), 10.87 (s, 1H, CONH), 13.66 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 441.4 (M-1).

Sinteza 2-hidroksi-7-oksa-4-azoniaspiro[3.5]nonanhlorida

Posuda od 1 I sa tri grlića i sa okruglim dnom, opremljena termoelementom, otvorom za azot i 250 ml levkom za dodavanje je napunjena sa morfolinom (91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mola, 1.0 ekv.) i 100 ml etanola. Rastvor je brzo mešan uz istovremeno dodavanje epihlorohidrina (100 g, 84.5 ml, 1.08 mola, 1.03 ekv.) iz levka za dodavanje u toku 30 minuta. Temperatura je praćena i kada je temperatura dostigla 27°C reakcija je hlađena sa ledenim vodenim kupatilom. Bistar rastvor je je mešan 18 časova. Reakcija je analizirana pomoću GC (razblažiti 5 kapi reakcione smeše u 1 ml etanola i injektirati na 15m DB-5 kapilarnu GC kolonu sa sledećim parametrima prolaska, injektor 250°C, detektor 250°C, početna temperatura peći 28°C zagrevanje do 250°C sa 10°C u minuti.). Reakcija je završena sa manje od 3% preostalog morfolina. Reakcija je koncentrovana na rotacionom evaporatoru na 50°C sa potpunim vakuumom sve dok nije bilo više destilata za kondenzovanje. Dobijeno ulje je čuvano na sobnoj temperaturi 24-48 časova ili dok se nije primetila značajna količina kristala (ubačeni kristal će ubrzati postupak). Talog je razblažen sa 250 ml acetona i filtriran. Čvrste supstance su sušene u vakuumskoj peći na 60°C 18-24 časa. Ovo je dalo 84 g kristalnog proizvoda. Ishodne tečnosti bi se mogle koncentrovati i postupak kristalizacije bi se mogao ponavljati sa većim prinosom.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-c/6) 5 6.55 (d, 1 H), 4.64 (m, 1 H), 4.53 (m, 2 H), 4.18 (m, 2 H), 3.74 (m, 4 H), 3.60 (m, 2 H), 3. 48 (m, 2H).<13>C NMR(100 MHz, DMSO-d6) 5 70.9, 61.39, 61.04, 60.25, 58.54, 57.80.

Sinteza 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanola (racemski)

3 I posuda sa jednim grlićem i sa okruglim dnom sa štapićem za magnetnu mešalicu je napunjena sa 2-hidroksi-7-oksa-4-azoniaspiro[3.5]nonanhloridom (150 g, 835 mmola), a zatim i sa 23 wt. % anhidrovanim amonijakom u metanolu (2120 ml). Posuda je zatvorena i dobijeni bistri rastvor je mešan na 20-23°C 18 časova. GC pod uslovima koji su dati u prethodnom tekstu nije pokazala nikakav početni materijal. Zapušač je uklonjen i dozvoljeno je penušanje amonijaka van rastvora 30 minuta. Posuda je zatim prenešena u rotacioni evaporator i koncentrovana do bele čvrste supstance sa kupatilom od 45°C i potpunim vakuumom.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-c/6) 5 3.57 (dd, 2H), 3.3-3.5 (m, 6H), 2.59 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 6 H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-đ6) 6 70.8, 67.1, 60.1, 53.8, 48.1.

Prateći postupak koji je opisan u Primeru 3 u prethodnom tekstu, ali zamenom 2-(RS)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ola sa 2-(S)-1-amino-3-morfolin-4-il-2-olom koji je pripremljen kao što je opisano u daljem tekstu dobijeno je željeno jedinjenje (2-(S)-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amid 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline.

Sinteza 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanola (ne-racemski)

Posuda od 1 I sa tri grlića i sa okruglim dnom, sa mehaničkom mešalicom, termoelementom i levkom za dodavanje je napunjena sa morfolinom (91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mola, 1.0 ekv.) i 45 ml t-butanola. Rastvor je brzo mešan uz istovremeno dodavanje R-epihlorohidrina (100 g, 84.5 ml, 1.08 mola, 1.03 ekv.) iz levka za dodavanje u toku 30 minuta. Temperatura je praćena i kada je temperatura dostigla 27°C reakcija je hlađena sa ledenim vodenim kupatilom. Bistar rastvor je je mešan 18 časova. Reakcija je analizirana pomoću GC (razblažiti 5 kapi reakcione smeše u 1 ml etanola i injektirati na 15m DB-5 kapilarnu GC kolonu sa sledećim parametrima prolaska, injektor 250°C, detektor 250°C, početna temperatura peći 28°C zagrevanje do 250°C sa 10°C u minuti.). Reakcija je završena sa manje od 3% preostalog morfolina. Rastvor je hlađen do 10°C i u kapima je dodavan 20 wt% rastvor kalijum t-butoksida u THF (576 g) održavajući temperaturu ispod 15°C. Dobijeni beli talog je mešan na 10-15°C 2 časa i proveren pomoću GC upotrebom gorenavedenih uslova. Nije se moglo primetiti nimalo hlorhidrina. Smeša je koncentrovana na rotacionom evaporatoru upotrebom kupatila od 50°C i potpunim vakuumom. Dobijena smeša je razblažena sa vodom (500 ml) i metilenhloridom. Faze su se razdvojile i vodena faza je ispirana metilenhloridom (500 ml). Spojeni organski slojevi su sušeni pomoću natrijumsulfata i koncentrovani do bistrog, bezbojnog ulja. Ovo je dalo 145 g, 97% prinosa epoksida.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-c/6) 8 3.3 (dd, 4 H), 3.1 (m, 1 H), 2.6 (dd, 1 H), 2.5 (dd, 1 H), 2.4 (m, 4 H), 2.2 (dd, 2 H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-c/6) 8 65.4, 60.1, 53.1, 48.9, 43.4.

Gorenavedeni sirovi epoksid je sipan u 3 I posudu sa jednim grlićem i sa okruglim dnom sa šipkom za magnetnu mešalicu. Dodat je anhidrovani amonijak u metanolu (24% w/w 2.5 I), posuda je zatvorena zapušačem i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 časa. GC pod uslovima koji su navedeni u prethodnom tekstu nije pokazala nikakav preostali početni materijal. Zapušač je uklonjen i dozvoljeno je da amonijak penuša van rastvora 30 minuta. Posuda je zatim premeštena u rotacioni evaporator i koncentrovana do bistrog bezbojnog ulja sa kupatilom od 45°C i potpunim vakuumom. Ovo je dalo 124 g proizvoda.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-c/6) 5 3.57 (dd, 2 H), 3.3-3.5 (m, 6 H), 2.59 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 6 H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-c/6) 6 70.8, 67.1, 60.1, 53.8,48.1.

Sinteza 1 -amino-3-(4-morfolinil)-2-(S)-propanola

Posuda od 1 I sa tri grlića i sa okruglim dnom, sa mehaničkom mešalicom, termoelementom i levkom za dodavanje je napunjena sa morfolinom (91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mola, 1.0 ekv.) i 200 ml metanola. Rastvor je brzo mešan uz istovremeno dodavanje R-epihlorohidrina (100 g, 84.5 ml, 1.08 mola, 1.03 ekv.) iz levka za dodavanje u toku 30 minuta. Temperatura je praćena i kada je dostigla 27°C reakcija je hlađena sa ledenim vodenim kupatilom. Bistar rastvor je mešan 18 časova. Reakcija je analizirana pomoću GC (razblažiti 5 kapi reakcione smeše u 1 ml etanola i injektirati na 15m DB-5 kapilarnu GC kolonu sa sledećim parametrima prolaska, injektor 250°C, detektor 250°C, početna temperatura peći 28°C zagrevanje do 250°C sa 10°C u minuti.). Reakcija je završena sa manje od 3% preostalog morfolina. Rastvor je hlađen do 10°C i u kapima je dodavan 25 wt% rastvor natrijummetoksida u metanolu (233g, 1.08 mola, 247 ml) održavajući temperaturu ispod 15°C. Dobijeni beli talog je mešan na 10-15°C 2 časa i proveren pomoću GC upotrebom gorenavedenih uslova. Nije se moglo primetiti nimalo hlorhidrina. Smeša je koncentrovana na rotacionom evaporatoru upotrebom kupatila od 50°C i potpunim vakuumom. Dobijena smeša je razblažena sa vodom (500 ml) i metilenhloridom. Faze su se razdvojile i vodena faza je ispirana metilenhloridom (500 ml). Spojeni organski slojevi su sušeni pomoću natrijumsulfata i koncentrovani do bistrog, bezbojnog ulja. Ovo je dalo 145 g, 97% prinosa 1,2-epoksi-3-morfolin-4-ilpropana.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 3.3 (dd, 4 H), 3.1 (m, 1 H), 2.6 (dd, 1 H), 2.5 (dd, 1 H), 2.4 (m, 4 H), 2.2 (dd, 2 H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 65.4, 60.1, 53.1,48.9,43.4.

Gorenavedeni sirovi 1,2-epoksi-morfolin-4-ilpropan je sipan u 3 I posudu sa jednim grlićem i sa okruglim dnom sa šipkom za magnetnu mešalicu. Dodat je anhidrovani amonijak u metanolu (24% w/w 2.5 I), posuda je zatvorena zapušačem i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 časa. GC pod uslovima koji su navedeni u prethodnom tekstu nije pokazala nikakav preostali početni materijal. Zapušač je uklonjen i dozvoljeno je da amonijak penuša van rastvora 30 minuta. Posuda je zatim premeštena u rotacioni evaporator i koncentrovana do bistrog bezbojnog ulja sa kupatilom od 45°C i potpunim vakuumom. Ovo je dalo 124 g 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-(S)-propanola.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-c/6) 8 3.57 (dd, 2 H), 3.3-3.5 (m, 6 H), 2.59 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 6 H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-c/6) 8 70.8, 67.1, 60.1, 53.8, 48.1.

Imidazolamid (7.0 g, 32.3 mmol), amin (15.0 g, 64.6 mmol), 5-fluorooksindol (4.93 g, 32.6 mmol), trietilamin (9.79 g, 96.9 mmol) i THF (88 ml) su mešani i zagrevani do 60°C. Formirao se rastvor braon boje. Posle mešanja od 24 časa na 60°C, žuti talog je hlađen do sobne temperature i filtriran. Kolač je ispiran sa 80 ml THF i sušen u toku noći na 50°C pod vakuumom. Dobijena je čvrsta supstanca braon boje (23.2 g). Čvrsta supstanca je taložena u 350 ml vode 5 časova na sobnoj temperaturi i filrtirana. Kolač je ispiran sa 100 ml vode i supen na 50°C pod vakuumom u toku noći. Dobijeno je 8.31 g sa 56% hemijskog prinosa.

Posuda od 0.25 I koja je opremljena sa termometrom, kondenzatorom, magnetnom mešalicom i ulaznom cevi za azot je napunjena sa 4.92 g 5-fluorooksindola, 7.0 g imidazolamida, 15.5 g (R)-1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanola, 9.78 g trietilamina i 88 ml tetrahidrofurana. Smeša je zagrevana do 60°C 16.5 časova. Reakcija je hlađena do temperature sredine i filtrirana. Dobijene čvrste supstance su taložene uzastopno (3) tri puta u acetonitrilu u 11 ml/g, sušene in vacuo da bi se dobilo 3.6 g (25.25%). [HPLC, Hvpersil BDS, C-18, 5u., (6:4), Acetonitril:0.1M Amonijumhlorid, PHA-571437=4.05min.] H<1>NMR (DMSO): 5 10.86 (1H, bs); 7.75 (1H, d); 7.70 (1H, s); 7.50 (1H, m); 6.88 (1H, m); 4.72 (1H, bs); 3.78 (1H, bs); 3.56 (4H, m); 3.32 (6H, m); 3.15 (1H,m); 2.43 (8H, bm).

Primer 4

Sinteza (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 2,4-dimetil-5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(2-Okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (113 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-olom (74 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amid 2,4-dimetil-5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (77 mg,45.3%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.27 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.40 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs,

6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.8Hz, 1H, OH), 6.86 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.96 (t, J=7.2Hz, 1H), 7.10 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.49 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.77 (d, J=8.0 Hz, 1H) (aromatičan i vinil), 10.88 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425.4 (M+1).

Primer 5

Sinteza (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(5-Hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/^-pirol-3-karboksilna kiselina (126.6 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-olom (74 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amid 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (107 mg, 58%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.29 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H) (aromatičan i vinil), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 457.4 (M-1).

R i S stereoizomeri se mogu pripremiti na sledeći način.

Imidazolamid (7.0 g, 32.3 mmol), amin (15.5 g, 96.9 mmol), 5-hlorooksindol (5.48 g, 32.6 mmol), trietilamin (14 ml) i THF (88 ml) su mešani i zagrevani do 60°C. Formiran je crveni rastvor. Posle mešanja od 16 časova na 60°C, žuti talog je hlađen do sobne temperature i filtriran. Kolač je ispiran 2 x 50 ml THF i sušen u toku noći na 50°C pod vakuumom. Dobijeno je 4.36 g sa 29% hemijskog prinosa.

Imidazolamid (6.8 g, 31.3 mmol), amin (10.0 g, 62.5 mmol), 5-hlorooksindol (5.3 g, 31.6 mmol) i THF (100 ml) su mešani i zagrevani do 60°C. Formiran je crveni rastvor. Posle mešanja od 68 časova na 60°C dodat je trietilamin (14 ml) i izvršeno je mešanje u trajanju od 5 časova na 60°C. Reakcija nije završena. Dodato je 4.6 g bočnog lanca amina i mešanje je vršeno 20 časova na 60°C. Žuti talog je hlađen do sobne temperature i filtriran. Kolač je ispiran 2 x 50 ml THF i sušen u toku noći na 50°C pod vakuumom. Dobijeno je 5.48 g sa 38% hemijskog prinosa.

Primer 6

Sinteza (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(5-Bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (72.2 mg, 0.2 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-olom (38 mg, 0.24 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-amid 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (55 mg, 55%).<1>H NMR (DMSO-d6) 6 2.27 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.41, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.13 (s, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.4 Hz, 1H, OH), 6.80 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.51 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H) (aromatičan i vinil), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 503.4 (M-1).

Primer 7

Sinteza (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amida 2,4-dimetil-5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

Korak 1

Smeša 3-[1,2,3]triazola (2.0 g, 29 mmol), epihlorhidrina (3.4 ml, 43.5 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (2.6 ml, 15 mmol) u etanolu (50 ml) je mešana na sobnoj temperaturi u toku noći. Posle uklanjanja rastvarača, ostatak je prečišćen brzom hromatogrfaijom (CH2CI2/CH3OH=100/1 -100/2-100/4) da bi se dobio 1-hloro-3-(1,2,3)-triazol-2-ilpropan-2-ol (2.1 g, 45%). 1H NMR (CDCI3) 5 3.52 (m, 2H, OH i CH2), 3.60 (dd, J=5.2, 11.2 Hz, 1H), 4.36 (m, 1H, CH), 4.68 (m, 2H), 7.67 (s, 2H). MS (m/z) 162.1 (M+1) i 1-hloro-3-(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ol (2.3 g, 49%).<1>H NMR (CDCI3) 8 3.56 (s, 1H), 3.57 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.53 (dd, J=7.2, 14 Hz, 1H), 4.67 (dd, J=3.8, 14 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.71 (s, 1H). MS (m/z) 162.1 (M+1).

Korak 2

1-Hloro-3(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ol (2.3 g, 13 mmol) je tretiran rastvorom NH3u metanolu (25% po težini, 20 ml) na 60°C u toku noći u zatvorenoj posudi pod pritiskom. Posle hlađenja na sobnoj temperaturi, azot je uveden u reakcionu smešu da bi se uklonio amonijak. Uparavanje rastvarača je dalo hlorovodoničnu so 1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ola (2.57 g, 100%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.68 (dd, J=8.8, 12.8 Hz, 1H), 2.97 (dd, J=3.6, 12.8 Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.44 (dd, J=6.4, 14 Hz, 1H), 4.57 (dd, J=4.6, 14 Hz, 1H), 5.95 (d, J=5.2 Hz, 1H, OH), 7.77 (s, 1H), 8.01 (brs., 3H, NH3<+>), 8.12 (s, 1H). MS (m/z) 143.1 (M+1).

Korak 3

5-(2-Okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (113 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-olom (85 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amid 2,4-dimetil-5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (70 mg, 41%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.45, 2.48 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.35 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 4.32 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.53 (dd, J=3.4, 14 Hz, 1H), 5.43 (d, J=5.6, Hz, 1H, OH), 6.91 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.01 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.15 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.12 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.77 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405.4 (M-1).

Primer 8

Sinteza (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amida 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(5-Fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (120 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-olom (85 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amid 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (100 mg, 62%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.42, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.98 (m, 1H), 4.27 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.4, 13.6 Hz, 1H), 5.38 (d, J=5.6, Hz, 1H, OH), 6.82 (dd, J=4.4, 8.4 Hz, 1H), 6.91 (td,<2>J=2.4,<3>J=9.0Hz, 1H), 7.70 (m, 3H), 7.75 (dd, J=2.4, 9.2 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423.4 (M-1).

Primer 9

Sinteza (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amida 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(5-Hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (126.6 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3(1,2,3)triazol-1 -il-propan-2-olom (85 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amid 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 ft-pirol-3-karboksilne kiseline (48 mg, 27%).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.42, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.28 (dd, J=7.8, 14 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=3.2, 14 Hz, 1H), 5.39 (d, J=6.0, Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.12 (d, J=2.0, 8.2 Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.74 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 439.4 (M-1).

Primer 10

Sinteza (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amida 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline

5-(5-Bromo-2-okso-1,2-dihi^ karboksilna kiselina (144.4 mg, 0.4 mmol) je kondenzovana sa 1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-olom (85 mg, 0.48 mmol) da bi se istaložio (2-hidroksi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-amid 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (130 mg, 67%).<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.41, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.28 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.6, 13.6 Hz, 1H), 5.40 (d, J=5.6, Hz, 1H, OH), 6.81 (dd, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.77 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.10 (d, J=1.6 Hz, 1H), 11.0 (s, 1H, CONH), 13.64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485.4 (M-1).

Sinteza 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline, 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline, 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline je opisana u prijavi koja je u predata u isto vreme kada i ova prijava, 14. februara 2001, a pod nazivom "PVRROLE SUBSTITUTED 2-INDOLINONE -PROTEIN KINASE INHIBITORS". Serial no. 09/783,264, čije je otkriće ovde uključeno u celini.

Primer 11

Sinteza 1-amino-3-(1,1-dokso-X6-tiomorfolin-4-il)-propan-2-ola

Rastvoru tiomorfolina (5.0 g, 48.7 mmol) u HOCH3(200 ml) je dodat rastvor oksona (36.0 g, 58.5 mmol) u H2O (100 ml). Smeša je dobro mešana na 40°C 48 časova i zatim je hlađena do 0°C. Vodeni rastvor NaOH je dodavan u kapima da bi se pH podesila do 12. Čvrsta supstanca je otfiltrirana i ispirana sa HOCH3(3x40 ml). Spojene tečnosti su kondenzovane i prečišćene sa brzom hromatografijom na silika gelu (CH3/CH3OH/NH3.H2O=3/1/0.1-2/1/0.1) da bi se dobio tiomorfolin 1,1-dioksid (6.2 g) u 93% prinosu.<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.42 (brs, 1H), MS (m/z) 136 (M+1).

Smeša tiomorfolin 1,1-dioksida (2.5 g, 18.5 mmol) i (R)-(-)epihlorhidrina (1.55 ml, 20 mmol) u smeši rastvarača etanola (50 ml) i H20 (5 ml) je mešana na 25°C 24 časa. Posle uklanjanja rastvarača, ostatak je prečišćen brzom hromatografijom da bi se dobio (R)-1-hloro-3-(1,1-diokso-^<6->tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol (4.0 g, 96%).<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.50 (m, 2H), 2.94 (m, 4H), 3.05 (m, 4H), 3.54 (dd, J=5.8, 11.2 Hz, 1H), 3.63 (dd, J=4.4, 11.2 Hz, 1H), 3.78 (m, 'H, CH), 5.10 (d, J=5.2 Hz, 1H, OH). MS (m/z) 228.2 (M+1).

(R)-1-hloro-3-(1,1-diokso-X<6->tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol (2.27 g, 10 mmol) je tretiran rastvorom NH3u metanolu (25% po težini, 20 ml) na 50°C 12 časova. Posle uparavanja rastvarača, ostatak je tretiran sa jono-izmenjivačkom smolom (AG1x8, OH oblik) u vodi da bi se dobio sirovi (S)-1-amino-3-(1,1-diokso-X<6->tiomorfolin-4-il)-propan-2- ol (2.0 g). On je bio kontaminiran sa oko 30% njegovog dimera i jedva da se mogao prečistiti hromatografijom na koloni. MS (m/z) 209.2 (M+1). Kondenzacija (S)-1-amino-3- (1,1-diokso-X,6-tiomorfolin^-il)-propan-2-ola sa oksindolima je dala indolinone (prinos 50-80% posle prečišćavanja).

[3-(1,1-diokso-?i6-tiomorfolin-4-il)-2-hidroksi-propil3-amid (R)-5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

<1>H NMR (DMSO-de) 8 2.39, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.49 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.16 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.86 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.97 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.11 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.50 (t,

J=5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.76 (d, J=7.6 Hz, 1H) (aromatičan i vinil), 10.88 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 473.4 (M+1).

[3-(1,1-diokso-X<6->tiomorfolin-4-il)-2-hidroksi-propil]-amid (R)-5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline

<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.47 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4 Hz, 1H), 6.82 (t, J=4.0Hz, 1H), 6.91 (td,<2>J=2.8,<3>J=9.0Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.75 (dd, J=2.4, 9.2 Hz, 1H), 10.88 (s, 1H), 13.67 (s, 1H). LC-MS (m/z) 491.4 (M+1). [3-(1,1-diokso-X<6->tiomorfolin-4-il)-2-hidroksi-propil]-amid (R)-5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline <1>H NMR (DMSO-de) 8 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.45 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.96 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4 Hz, 1H, OH), 6.85 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=2.2, 8.2 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s, 1H). LC-MS (m/z) 507.2 (M+1). [3-(1,1 -diokso-A,6-tiomorfolin-4-il)-2-hidroksi-propil]-amid (R)-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline

<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2.41, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.47 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.18 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8Hz, 1H), 6.81 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=1.8, 8.2 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s, 1H). LC-MS (m/z) 553.6 (M+1).

Primer 12

Sinteza (S) ili (R)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ola

Smeša morfolina (1.74 ml, 20 mmol) i (R)-epihlorhidrina (1.56 ml, 20 mmol) u etanolu (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi 48 časova. Posle uklanjanja rastvarača, ostatak je tretiran rastvorom CH3NH2u vodi (40% po težini, 20 ml) na sobnoj temperaturi 14 časova. Uklanjanje rastvarača je dalo sirovi (S)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol, koji se mogao prečistiti pomoću vakuumske destilacije ili hromatografije na koloni (2.4 g, 70%). (R)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol je pripremljen od (S)-epihlorhidrina u 76% prinosu.<1>H NMR (CDCI3) 5 2.33 (dd, J=3.6, 12.4 Hz, 1H), 2.42 (m, 1H), 2.44 (dd, J=2.8, 9.8 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.53 (dd, J=7.6, 11.8 Hz, 1H), 2.62 (m, 2H), 2.65 (dd, J=3.6, 12.0 Hz, 1H), 3.71 (m, 4H), 3.85 (m, 1H),<13>C NMR (CDCI3) 6 67.06, 65.58, 62.80, 55.87, 53.94, 36.72, MS (m/z) 175 (M+1).

(S)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol kondenzovan sa (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-metil-arnidom (R)-5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline sa 5-fluoroksindolom.

<1>H NMR (DMSO-de) 6 2.0 (s, 3H), 2.15 (m, 1H), 2.25 (m, 6H), 2.28 (m, 2H), 2.42 (s, 1H), 2.95 (s, 1H), 3.0 (s, 3H), 3.25 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.97 & 3.68 (2xbrs, 1H), 4.80 & 4.74 (2xbrs, 1H), 6.82 (dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H), 6.90 (td,<2>J=2.3,<3>J=8.7Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.71 (dd, J=2.2, 9.0 Hz, 1H), 10.86 (s, 1H), 13.57 (s, 1H). LC-MS (m/z) 457.2 (M+1). (2-hidroksi-3-morfolin-4-il-propil)-metil-amid (S)-5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline sa (R)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-olom

<1>H NMR (DMSO-de) 5 2.0 (m, 3H), 2.10 (m, 1H), 2.22 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.38 (m, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.96 (s, 3H), 3.27 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.93 & 3.64 (2xbrs, 1H), 4.75 & 4.70 (2xbrs, 1H), 6.77 (dd, J=4.6, 8.2 Hz, 1H), 6.85 (td,<2>J=2.5,<3>J=8.8Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.67 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H), 10.81 (s, 1H), 13.52 (s, 1H). LC-MS (m/z) 457.2 (M+1).

Primer 13

Priprema bočnog lanca amina

3-(1 -H-tetrazol-1 -il)]-2-hidroksi-1 -hloropropan i 3-(2-H-tetrazol-2-il)-2-hidroksi-1 - hloropropan

6.905 g tetrazola (100 mmol) i 1.75 ml diizopropiletilamina (10 mmol) i 11.73 ml epihlorhidrina (150 ml) u anhidrovanom acetonitrilu (30 ml) je mešano na 60°C 4 časa. Dobijeni rastvor je uparavan, sušen na highvac (visokom vakuumu) i prečišćen na koloni silika gela u hloroformu:metanolu 100:8. Prva frakcija je dala čist 3-(2-H-tetrazol-2-il)-2-hidroksi-1 -hloropropan, 6.215 g (bezbojno ulje, 38% prinos), druga frakcija je dala 9.208 g čistog 3-(1-H-tetrazol-1-il)]-2-hidroksil-1-hloropropana (lepljiva guma; 57% prinos).

3-(1-H-tetrazol-1-il)]-2-hidroksi-1-aminopropan

9.110 g 3-(1-H-tetrazol-1-il)]-2-hidroksi-1-hloropropana, 15 g kalijumkarbonata i 130 ml zasićenog rastvora amonijaka u metanolu su mešani 21 čas, zatim su filtrirani i uparavani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela u hloroform-metanol-vodeni rastvor amonijaka 80:35:4. Prinos=7.326 g bele lepljive gume (91.5% th).

3-(2-H-tetrazol-1 -il)]-2-hidroksi-1 -aminopropan

6.105 g 3-(2-H-tetrazol-1-il)]-2-hidroksi-1-hloropropana, 10 g kalijumkarbonata i 95 ml zasićenog rastvora amonijaka u metanolu su mešani 21 čas, zatim su filtrirani i uparavani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela u hloroform-metanol-vodeni rastvor amonijaka 60:25:2. Prinos=3.726 g bele kristalne čvrste supstance (69.5% th).

3-[(2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]-2-hidroksi-1-aminopropan

4.7 ml epihlorhidrina (60 mmol) je dodat u ledeno hladan rastvor cis-2,6-dimetilmorfolina (4.607 g, 40 mmol) u trifluoroetanolu (5 ml). Rastvor je mešan na 0-5°C 1 čas, kupatilo za hlađenje je uklonjeno i nastavljeno je mešanje na sobnoj temperaturi još 5 časova. Smeša je uparavana na highvac, dobijeni uljasti ostatak je rastvoren u anhidrovanom etanolu (50 ml), rastvor je hlađen na ledenom kupatilu, čvrsti natrijummetoksid (2.27 g) je dodat u dva dela i smeša je mešana na 0-5°C 2 časa. Reakciona smeša je zatim filtrirana, soli su ispirane etanolom (30 ml) i spojeni filtrati su dodati u ledeno hladni koncentrovani vodeni rastvor amonijaka (200 ml). Smeša je

mešana na sobnoj temperaturi 12 časova, zatim je uparavana na highvac. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela u smeši hloroform-metanol-7M rastvor amonijaka u metanolu 80:15:3. Prinos=5.75 g bele kristalne higroskopne čvrste supstance (76.3% th).

(2S)-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)-2-hidroksi-1-hloropropan i (2S)-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)-2-hidroksi-1-aminopropan

3.423 g 3-metil-2,5-dioksoimidazolidina (3.423 g) i 3.60 ml R-epihlorhidrina (-)

(99% e.e.) i 0.30 ml Barton baze (1.5 mmol) u anhidrovanom acetonitrilu je mešano na 60°C 20 časova. Dobijeni rastvor je uparavan na highvac i prečišćen na koloni silika gela u smeši hloroform-metanol (gradijent 5 do 20 % metanola) da bi se dobilo 5.572 g hloro-jedinjenja u obliku bele amorfne čvrste supstance (90% prinos), hlorid je transformisan u amin na sledeći način. Dobijeni hidroksi-hloro intermedijer je rastvoren u metanolskom rastvoru amonijaka (zasićen sa gasom amonijaka), dodat je kalijumkarbonat i smeša je mešana u zatvorenoj posudi 2Vtdana. Reakciona smeša je filtrirana, filtrati su uparavani. Ostatak je prečišćen na silika koloni u smeši hloroform-metanol-koncentrovani vodeni rastvor amonijaka 80:15:1.5.

Primer 14

5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroksi-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 22) (opšti postupak)

72 mg 3-(2-H-tetrazol-2-il)]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato u talog 105 mg (0.25 mmol) 1-oksi-7-azabenztriazolestra 5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-({3,3-dimetil-4-karboksi-1 -H-pirol-2-il}metilen)-5-fluoro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (480 mg; 1.6 mmol) sa HATU reagensom (570 mg; 1.5 mmol) u prisustvu Hunig baze (3.0 mol; 0.525 ml) u DMF (5 ml) i izolovan u čistom obliku taloženjem sa hloroformom (5 ml) i sušenjem na visokom vakuumu u 92% prinosu (579 mg)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da

kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=106 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.Primer 15 5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroksi-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 23) (opšti postupak) 72 mg 3-(2-H-tetrazol-2-il)]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato u talog 109 mg (0.25 mmol) 1-oksi-7-azabenztriazolestra 5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-([3,3-dimetil-4-karboksi-1 -H-pirol-2-il}metilen)-5-hloro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1.520 g; 4.8 mmol) sa HATU reagensom (1.768 g; 4.65 mmol) u prisustvu Hunig baze (9.0 mmol; 1.58 ml) u DMF (20 ml) i izolovan u čistom obliku taloženjem sa hloroformom (20 ml) i sušenjem na visokom vakuumu u 94% prinosu (1.907 mg)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=109 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.Primer 16N-[2-hidroksi-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-5-[(Z)-(2-okso-5-(trifluorometoksi)-l ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil)-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 24) (opšti postupak) 72 mg 3-(2-H-tetrazol-2-il)]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato u talog 121.5 mg (0.25 mmol) 1 -oksi-7-azabenztriazolestra 5-[(Z)-(5-trifluorometoksi-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-((3,3-dimetil-4-karboksi-1-H-pirol-2-il)metilen)-5-trifluorometoksi-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1.768 g; 4.8 mmol) sa HATU reagensom (1.758 g; .4.8 mmol) u prisustvu Hunig baze (9.0 mmol; 1.58 ml) u DMF (25 ml) i izolovan u čistom obliku uparavanjem i taloženjem sa anhidrovanim acetonitrilom i sušenjem na visokom vakuumu u 85.5% prinosu (1.929 g)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=113mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 17

5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroksi-3-(1H-tetraazol-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 25)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 14 od 72 mg ogovarajućeg amina. Prinos=113 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 18

5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroksi-3-(1H-tetraazol-1-il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 26)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 15 od 72 mg ogovarajućeg amina. Prinos=122 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 19

N-[2-hidroksi-3-(1H-tetraazol-1-il)propil]-2,4-dimetil-5-[(Z)-[2-okso-5-(trifluorometoksi)-l ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 27)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 16 od 72 mg ogovarajućeg amina. Prinos=118 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 20

N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]-2-hidroksipropil)-5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 28)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 14 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=99 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 21

5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3Hliden)metil]-N-[3-(2R, 6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]-2-hidroksipropil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje29)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 15 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=101 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 22

N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]-2-hidroksipropil]-2,4-dimetil-5-[(Z)-[2-okso-5-(trifluorometoksi)-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil]-1H-pirol-3-karboksamid

(Jedinjenje 30)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 16 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=89 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 23

5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[(2S)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 34)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 14 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=109 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 24

5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[(2S)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 36)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 15 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=107 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 25

N-[(2S)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-dimetil-5-{(Z)-[2-okso-5-(trifluorometil)-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil}-1H-pirol-3-karboksamid

(Jedinjenje 35)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 16 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=123 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 26

5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[(2R)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 31)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 14 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=110 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 27

5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[(2R)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksamid (Jedinjenje 32)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 15 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=103 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 28

N-[(2R)-2-hidroksi-3-(3-metil-2,5-dioksoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-dimetil-5-{(Z)-[2-okso-5-(trifluorometoksi)-1,2-dihidro-3H-indol-3-ilidenelmetil}-1H-pirol-3-karboksamid

(Jedinjenje 33)

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 16 od 95 mg ogovarajućeg amina. Prinos=120 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 29

Etilestar 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline

DMF (4 ml, 3 ek.) je hlađen uz mešanje u ledenom kupatilu. Ovome je dodat POCI3(1.1 ek., 1.8 ml). Posle 30 minuta reakciji je dodat rastvor 3,5-dimetil-4-etilestarpirola (4 g, 17.4 mmol) u DMF (2 M, 9 ml) i mešanje je nastavljeno. Posle 10 minuta reakciona smeša je očvrsla. Razbalžena je sa 5 ml DMF i zagrevana u 90°C uljanom kupailu. Posle 1 časa, reakcija je hlađena do sobne temperature i razblažena sa vodom (100 ml) i bazifikovana do pH=11 sa 1N NaOH. Proizvod je ekstrahovan u metilenhloridu (3x200 ml) i organski slojevi su ispirani slanim rastvorom (200 ml), sušeni (MgS04) i koncentrovani da bi se dobilo 4.3 g (95%) etilestra 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline u obliku čvrste supstance braon boje.<1>H NMR (DMSO-d5) § 12.5 (br s, 1H, NH), 9.11 (s, 1H, CHO), 7.35 (s, 5H, ArH), 3.98 (q,J =6.8 i 7.2 Hz, 2H, OCH^CHa), 2.48 (s, 3H, CH3), 0.98 (t,J= 7 Hz, 3H, OCHj>CH3).

5-formil-2-metil-4-fenil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina

Etilestar 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline je rastvoren u vodi (100 ml) i metanolu (45 ml) uz mešanje. Dodat je KOH (2 ek., 1.9 g) i zagrevano je na 100°C. Posle 2.5 časa, hlađen je do sobne temperature i preostali estar je uklonjen ekstrahovanjem u etilacetatu (200 ml), sušen i koncentrovan. Vodeni sloj je acidifikovan do pH=3 korišćenjem 2N HCI. Bela čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom i ispirana vodom. Čvrsta supstanca je re-koncentrovana iz toluena, pretvorena u prah sa heksanima i sušena da bi se dobilo 2 g (52%) prljavo bele čvrste supstance.<1>H NMR

(360 MHz, DMSO-d6) 8 12.46 (br s, 1H, C02H), 11.95 (s, 1H, NH), 9.08 (s, 1H, CHO), 7.36 (s, 5H, ArH), 2.49 (s, 3H, CH3). MS m/z (relativna jačina %, jon) nađeno 229 (100, M<+>); izralunato 229.2.

(3-dietilamino-2-hidroksi-propil)-amid 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline

Smeša 5- formil- 2- metil- 4- fenil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline (1.0 gm, 4.36 mmol), 1-amino-3-dietilamino-2-propanola (950 mg, 6.54 mmol), DDC (900 mg, 4.36 mmol) i HOBt (884 mg, 6.54 mol) u hloroformu (60 I) je mešana na sobnoj temperaturi 12 časova. Reakcija je sipana u zasićeni rastvor natrijumbikarbonata (60 I) i ovome je dodat 1N NaOH (8 ml). On je zatim ekstrahovan sa EtOAc (3x100 ml), ispiran vodom i slanim rastvorom, sušen i koncentrovan da bi se dobilo 400 mg (3-dietilamino-2-hidroksi-propil)-amida 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline.

Primer 30

Postupak za sintezu Jedinjenja 11-21

0.36 M rastvor svakog oksindola je pripremljen u DMSO kao i 0.576 M rastvor svakog aldehida. 300 ul_ odgovarajućeg oksindola je pomešano sa 300 ul odgovarajućeg aldehida u prisustvu 200 ul DMSO. Zatim je dodato 40 mg dietilentriamin smole za prečišćavanje. Smeša je postavljena u Robbins Block i blok (kalup) je zatvoren i postavljen u peć na 60°C gde je mućkan 18 časova.

Posle 18 časova, Robbins Block je uklonjen iz peći. Uklonjen je gornji zatvarač kalupa i smeši je dodato 800 ul DMSO. Zatim je kalup ponovo zatvoren i ponovo postavljen u peć na 60°C gde je kontinirano rotiran 1 čas.

Posle 1 časa, Robbins Block je uklonjen iz peći i ostavljen da se ohladi. Donji zatvarač Robbins Block-a je pažljivo uklonjen i ceo kalup je postavljen u filtracioni aparat, koji omogućava da se novo-sitetisana jedinjenja filtriraju van smole.

Primer 31

3- M - H-( 7- azabenztriazolil)- oksfl- 2- hidroksi- 1 - aminopropan

4.083 g 1-hidroksi-7-azabenztriazola (30 mmol) i 0.53 ml diizopropilamina (3 mmol) i 4.70 ml epihlorhidrina u anhidrovanom hloroformu je mešano na 60°C 2 časa. Reakciona smeša je sipana na kolonu silika gela i eluirana sa smešom hloroform-metanol 100:3. Dobijeni hidroksi-hloro intermedijer (4.83 g, bledo žuto ulje, 70% prinos) je rastvoren u metanolsokm rastvoru amonijaka (100 ml, zasićen sa gasom amonijaka), dodato je 8.3 g kalijumkarbonata i smeša je mešana u zatvorenoj posudi 2 14 dana. Reakciona smeša je filtrirana, filtrati su uparavani. Ostatak je prečišćen na silika koloni u smeši hloroform-metanol-koncentrovani vodeni rastvor amonijaka 80:15:1.5. Prinos=2.793 g bele kristalne čvrste supstance (63% th. Iz hlorida).

3- f 1 - H-( benztriazolil)- oksi1- 2- hidroksi- 1 - hloropropan i 3- f 1 - H-( benztriazolil- 3- N-oksido) l- 2- hidroksi- 1- hloropropan

12.162 g hidroksiazabenztriazola (90 mmol), 1.59 ml diizopropiletilamina (9 mmol) i 14.1 ml epihlorhidrina (180 mmol) u anhidrovanom hloroformu je mešano na 55°C 2 časa. Reakciona smeša je uparavana, ostatak je sušen na highvac, zatim je prečišćen na silika koloni u smeši hloroform-metanol 100:5. Prve dobijene frakcije su dale 3-[1-H-(benztriazolil)-oksi]-2-hidroksi-1-hloropropan 10.570 g (bledo žuti med; 51.5% prinos), a iza toga frakciju 3-[1-H-(benztriazolil-3-N-oksido)]-2-hidroksi-1-hloropropana 9.990 g (bela kristalna čvrsta supstanca, 48.5% prinos).

3- f1- H-( benztriazolil- 3- N- oksido) l- 2- hidroksi- 1- aminopropan

Pripremljen je aminolizom 3-[1-H-(benztriazolil-3-N-oksido)]-2-hidroksi-1-hloropropana analogno sintezi 3-[1-H-(7-azabenztriazolil)-oksi]-2-hidroksi-1-aminopropana.

Primer 32

54( ZH5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden) metin- N42- hidro

f1, 2, 3ltriazolof4, 5- blpiridin- 3- iloksi) propill- 2l4- dimetil- 1H- pirol- 3- karboksamid (opšti postupak)

105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolil)-oksi]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato talogu 105 mg (0.25 mmol) 1-oksi-7-azabenztriazolestara 5-[(Z)-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-({3,3-dimetil-4-karboksi-1-H-pirol-2-il}metilen)-5-fluoro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (480 mg; 1.6 mmol) mmol; 0.525 ml) u DMF (5 ml) i izolovan u čistom obliku taloženjem sa hloroformom (5 ml) i sušenjem na visokom vakuumu u 92% prinosu (579 mg)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=121 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 33

5- r( Z)-( 5- hloro- 2- okso- 1. 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden) metil1- N- r2- hidroksi- 3-( 3H-f 1, 2. 3] triazolof4, 5- b] piridin- 3- iloksi) propin- 2, 4- dimentil- 1 H- pirol- 3- karboksamid (opšti postupak)

105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolil)-oksi]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato talogu 109 mg (0.25 mmol) 1-oksi-7-azabenztriazolestra 5-[(Z)-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimentil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-({3,3-dimetil-4-karboksi-1 -H-pirol-2-il}metilen)-5-hloro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1.520 mg; 4.8 mmol) sa HATU reagensom (1.768 g; 4.65 mmol) u prisustvu Hunig baze (9.0 mmol; 1.58 ml) u DMF (20 ml) i izolovan u čistom obliku taloženjem sa hloroformom (20 ml) i sušenjem na visokom vakuumu u 94% prinosu (1.907 g)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno

hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=130 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 34

5- f( Z)-( 5- trifluorometoksi- 2- okso- 1, 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden) metin- N- r2- hidroksi-3-( 3H- ri. 2, 3ltriazolof4, 5- b1piridin- 3- iloksi) propin- 2, 4- dimentil- 1H- pirol- 3- karboksamid

(opšti postupak)

105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolil)-oksi]-2-hidroksi-1-aminopropana je dodato talogu 121.5 mg (0.25 mmol) 1-oksi-7-azabenztriazolestra 5-[(Z)-(5-trifluorometoksi-2-okso-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimentil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline [pripremljen aktivacijom (3Z)-3-({3,3-dimetil-4-karboksi-1 -H-pirol-2-il}metilen)-5-trifluorometoksi-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1.768 g; 4.8 mmol) sa HATU reagensom (1.758 g; 4.8 mmol) u prisustvu Hunig baze (9.0 mmol; 1.58 ml) u DMF (25 ml) i izolovan u čistom obliku uparavanjem i taloženjem sa anhidrovanim acetonitrilom i sušenjem na visokom vakuumu u 85.5% prinosu (1.929 g)] u anhidrovanom dimetilacetamidu (1.5 ml). Smeša je mešana 30 minuta i uparavana na highvac. Ostatak je suspendovan u smeši metanol-dietilamin 20:1 (3 ml), ostavljen je da kristališe u fižideru (5°C) 1 čas, zatim je filtriran, talog je ispiran ledeno hladnim metanolom i sušen na highvac. Prinos=142 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 35

5-[( Z)-( 5- fluoro- 2- okso- 1. 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden) metin- N- r2- hidroksi- 3-( 3-

oksido- 1 H- 1, 2, 3- benzotriazol- l - iQpropin- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksamid

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 32 od 105 mg ogovarajućeg amina. Prinos=120 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer 36

5- f( Z)-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden) metin- N- r2- hidroksi- 3-( 3-

oksido- 1 H- 1, 2, 3- benzotriazol- 1 - il) propin- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksamid

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 33 od 105 mg ogovarajućeg amina. Prinos=127 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Primer37

N- f2- hidroksi- 3-( 3- oksido- 1 H- 1, 2, 3- benzotriazol- 1 - il) propin- 2, 4- dimetil- 5-[( ZH2-

okso- 5-( trifluorometoksi)- 1, 2- dihidro- 3H- indol- 3- iliden1metilV1H- pirol- 3- karboksamid

Ovo jedinjenje je pripremljeno na osnovu postupka iz Primera 34 od 105 mg ogovarajućeg amina. Prinos=141 mg narandžaste kristalne čvrste supstance.

Biološki primeri

Sledeće analize su upotrebljene da bi se otkrila ona jedinjenja koja pokazuju optimalan stepen željene aktivnosti.

A. Postupci analiza

Sledeće analize se mogu upotrebiti za određivanje nivoa aktivnosti i efekta različitih jedinjenja ovog pronalaska na jednu ili više PKs. Slične analize se mogu po istom principu projektovati za bilo koju PK korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici.

Nekoliko analiza od onih koje su ovde opisane su izvedene u ELISA (Enzvme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) formatu (Voller et al., 1980, "Enzvme-Linked Immunosorbent Assay," Manual of Clinical lmmunology, 2d ed., Rose and Friedman, am. Soc. Of Microbiology, VVashington, D.C., pp. 359-371). Opšti postupak je kao što sledi: jedinjenje je uvedeno u ćelije koje eksprimiraju test kinazu, bilo prirodno ili rekombinantno, u toku izabranog vremenskog perioda posle koga je, ako je test kinaza receptor, dodat ligand za koji je poznato da aktivira receptor. Ćelije su lizirane i lizat je prenešen u komore ELISA ploče koje su prethodno obložene specifičnim antitelom koji prepoznaje supstrat reakcije enzimatske fosforilacije. Ne-supstratne komponente ćelijskog lizata su isprane i detektovana je količina fosforilacije na supstratu sa antitelom koje specifično prepoznaje fosfotirozin u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje nisu spojene sa test jedinjenjem.

U daljem tekstu su dati trenutno poželjni protokoli za izvođenje ELISA eksperimenata za specifične PKs. Međutim, prilagođavanje ovih protokola za određivanje aktivnosti jedinjenja na druge RTKs, kao i na CTKs i STKs, ne predstavlja problem za iskusnog tehničara. Druge analize koje su opisane ovde mere količinu DNK koja je stvorena kao odgovor na aktivciju test kinaze, što predstavlja opštu meru proliferativnog odgovora. Opšti postupak za ovu analizu je kao što sledi: jedinjenje je uvedeno u ćelije koje eksprimiraju test kinazu, bilo prirodno ili rekombinantno, u toku izabranog vremenskog perioda posle koga je, ako je test kinaza receptor, dodat ligand za koji je poznato da aktivira receptor. Posle inkubacije najmanje u toku noći, dodat je reagens za obeležavanje DNK kao što je 5-bromodeoksiuridin (BrdU) ili H<3->timidin. Količina obeležene DNK je određena sa ili anti-Brdl) antitelom ili merenjem radioaktivnosti i poređena je sa kontrolnim ćelijama koje nisu spajane sa test jedinjenjem.

GST-FLK-1 BIOLOŠKA ANALIZA

Ovom analizom se ispituje aktivnost tirozinkinaze GST-Flk1 na poli(glu,tyr) peptide.

Materijal i reagensi:

1. Corning ELISA 96-komorne ploče (Corning Catalog No. 5805-96).

2. poli(glu, tyr) 4:1, liofilizat (Sigma Catalog # P0275).

3. Priprema poli(glu, tyr) (pEY) obloženih ploča za analizu: omotač od 2 ug/well poli(glu, tyr) (pEY) u 100 ul PBS, držan na sobnoj temperaturi 2 časa ili na 4°C u toku noći. Pokriti komorice ploča da bi se sprečila evaporacija. 4. PBS pufer: za 1 I, smeša 0.2 KH2P04, 1.15 g Na2P04, 0.2 g KCI i 8 g NaCI u približno 900 ml dH20. Kada su dodati svi reagensi, podesiti pH do 7.2 sa HCI. Ukupnu zapreminu dopuniti do 1 I sa dH20.

5. PBST pufer: u 1 I PBS pufera dodati 1.0 ml Tween-20.

6. TBB-blokirajući pufer: za 1 I, pomešati 1.21 g TRIS, 8.77 g NaCI, 1 ml TWEEN-20 u približno 900 ml dH20. Podesiti pH do 7.2 sa HCI. Dodati 10 g BSA, mešati da bi se rastvorio. Dopuniti ukupnu zapreminu do 1 I a dH20. Filtrirati da bi se uklonio deo sa krupnijim česticama. 7. 1% BSA u PBS: da bi se napravio 1x radni rastvor dodati 10 g BSA u približno 990 ml PBS pufera, mešati da bi se rastvorio. Podesiti ukupnu zapreminu do 1 I sa PBS puferom, filtrirati da bi se uklonio deo sa krupnijim česticama.

8. 50 mM Hepes pH 7.5.

9. GST-Flk1cd prečišćen iz transformacije sf9 rekombinantnog baculovirus-a

(SUGEN, Inc.).

10.4% DMSOudH20.

11.10 mM ATP u dH20.

12.40 mM MnCI2.

13. Pufer za razblažavanje kinaze (KDB): pomešati 10 ml Hepes (pH 7.5), 1 ml 5M NaCI, 40^l 100 mM natrijumortovanadata i 0.4 ml 5% BSA u dH20 sa 88.56 ml dH20. 14. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V obika, Applied Scientific Catalog #

AS-72092. 15. EDTA: pomešati 14.12 g etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) do približno 70 ml dH20. Dodavati 1N NaOH sve dok se ne rastvori EDTA. Podesiti pH do 8.0. Podesiti ukupnu zapreminu do 100 ml sa dH20. 16. Pufer za razblaženje antitela 1°: pomešati 10 ml 5% BSA u PBS puferu sa 89.5 ml TBST. 17. Anti-fosfotirozin monoklonalno antitelo konjugovano sa peroksidazom iz biljke

Armoracia lapathifolia(ren) (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

18.2,2'-Azinobis(3-etilenbenztiazolin-6-sulfo kiselina( (ABTS, Moss, Cat. No.

ABST).

19.10% SDS.

Postupak:

1. Obložiti Corning ELISA 96-komorne ploče sa 2 ng poliEY peptida u sterilnom PBS kao što je opisano u koraku 3 Materijala i reagenasa. 2. Ukloniti nevezanu tečnost iz komorica okretanjem ploče. Ispirati jednom sa TBST. Tapkati ploču po papirnom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti. 3. Dodati 10 pil 1% BSA u PBS u svaku komoricu. Inkubirati, uz mućkanje, 1 čas na sobnoj temperaturi.

4. Ponoviti korak 2.

5. Nakvasiti komorice sa 50 mM HEPES (pH 7.5) (150 ul/komorici).

6. Razblažiti test jedinjenje sa dH20/4% DMSO do 4 puta željene krajnje koncentracije u polipropilenskim 96-komornim pločama. 7. Dodati 25y.\razblaženog test jedinjenja u ELISA ploče. U kontrolne komorice staviti 25 uJ dH20/4% DMSO.

8. Dodati 25 u.1 40 mM MnCI2sa 4x ATP (2 u.M) u svaku komoricu.

9. Dodati 25 \ x\ 0.5 M EDTA u komorice sa negativnom kontrolom.

10. Razblažiti GST-Flk1 do 0.005^g (5 ng)/komorici sa KDB.

11. Dodati 50 |xl razblaženog enzima u svaku komoricu.

12. Inkubirati, uz mućkanje, 15 minuta na sobnoj temperaturi.

13. Zaustaviti reakciju dodavanjem 50 ul 250 mM EDTA (pH 8.0).

14. Ispirati 3X sa TBST i potapkati ploču na papirni ubrus da bi se uklonio višak tečnosti. 15. Dodati 100 (xl po komorici sa anti-fosfotirozin HRP konjugatom, 1:5,000 razblaženje u puferu sa razblaženim antitelom. Inkubirati, uz mućkanje, 90 minuta, na sobnoj temperaturi.

16. Ispirati kao u koraku 14.

17. U svaku komoricu dodati po 100 u.l rastvora ABTS na sobnoj temperaturi.

18. Inkubirati, uz mućkanje, 10 do 15 minuta. Ukloniti sve mehuriće.

19. Zaustaviti reakciju dodavanjem 20 ul 10% SDS u svaku komoricu.

20. Očitati rezultate na Dvnatech MR7000 ELISA čitaču sa test filterom na 410 nM i referentni filterom na 630 nM.

PYK2 BIOLOŠKA ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena za merenjein vitrokinazne aktivnosti pyk2 pune dužine sa označenim HA epitopom (FL.pyk2-HA) u ELISA analizi.

Materijal i reagensi:

1. Corning ELISA 96-komorne ploče.

2. 12C5 monoklonalno anti-HA antitelo (SUGEN, Inc.)

3. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline-Dulbecco-ov slani rastvor puferisan fosfatnim puferom (Gibcko Catalog # 450-1300EB) 4. TBST pufer: za 1 I, pomešati 8.766 g NaCI, 6.057 g TRIS i 1 ml 0.1% Triton X-100 u približno 900 ml dH20. Podesiti pH do 7.2, dopuniti zapreminu do 1 I. 5. Blokirajući pufer: za 1 I, pomešati 100 g 10% BSA, 12.1 g 100 mM TRIS, 58.44 g 1 M NaCI i 10 ml 1% TVVEEN-20.

6. FL.pyk2-HA iz lizata sf9 ćelija (SUGEN, Inc.).

7. 4% DMSO u MilliOue H20.

8. 10 mM ATPudH20.

9. 1MMnCI2.

10.1MMgCI2.

11.1Mditiotreitol (DTT).

12.10X fosforilacija kinaznog pufera: pomešati 5.0 ml 1M Hepes (pH 7.5), 0.2 ml 1M MnCI2, 1.0 ml 1M MgCI2, 1.0 ml 10% Triton X-100 u 2.8 ml dH20. Neposredno pre upotrebe dodati 0.1 ml 1M DTT. 13. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika.

14.500 mM EDTA u dH20.

15. Pufer za razblaženje antitela: za 100 ml, 1 ml 5% BSA/PBS i 1 ml 10%

Tween-20 u 88 ml TBS.

16. HRP-konjugovan anti-Ptyr PY99), Santa Cruz Biotech Cat. No. SC-7020.

17. ABTS, moss, Cat. No. ABST-2000.

18.10% SDS.

Postupak:

1. Obložiti Corning ELISA 96-komorne ploče sa 0.5 ng po komorici 12CA5 anti-HA antitela u 100ul PBS. Čuvati u toku noći na 4°C. 2. Ukloniti nevezana HA antitela iz komorica okretanjem ploče. Ispirati ploču sa dH20. Potapkati ploču po papirnom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti. 3. Dodati 150 jul blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati, uz mućkanje,

30 minuta na sobnoj temperaturi.

4. Ispirati ploču 4x sa TBS-T.

5. Razblažiti lizat u PBS (1.5 jag lizata/100 ? PBS).

6. Dodati 100ul razblaženog lizata u svaku komoricu. Mućkati ih na sobnoj temperaturi 1 čas.

7. Ispirati kao u koraku 4.

8. Dodati 50 ul 2X kinaznog pufera u ELISA ploču koja sadrži vezane pyk2-HA. 9. Dodati 25 ul 400 uM test jedinjenja u 4% DMSO u svaku komoricu. Kao kontrolne komorice upotrebiti samo 4% DMSO.

10. Dodati 25 ul 0.5 M EDTA u komorice za negativnu kontrolu.

11. Dodati 25 ul u 20 uM ATP u sve komorice. Inkubirati, uz mućkanje, 10 minuta. 12. Zaustaviti reakciju dodavanjem 25 ul 500 mM EDTA (pH 8.0) u sve komorice.

13. Ispirati kao u koraku 4.

14. Dodati 100 ul HRP konjugovanog anti-Ptyr koji je razblažen 1:6000 u puferu sa razblaženim antitelom u svaku komoricu. Inkubirati, uz mućkanje, 1 čas, na sobnoj temperaturi.

15. Isprati ploču 3X sa TBST i 1X sa PBS.

16 U svaku komoricu dodati po 100 ul rastvora ABTS.

17. Ako je neophodno, zaustaviti reakciju dodavanjem 20 ul 10% SDS u svaku komoru. 18. Očitati rezultate na ELISA čitaču sa test filterom na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

FGFR1 BIOLOŠKA ANALIZA

Ovom analizom se meriin vitroaktivnost kinaze FGF1-R u ELISA analizi.

Materijal i reagensi:

1. Costar ELISA 96-komorne ploče (Corning Catalog # 3369).

2. Poli(glu-tvr) (Sigma Catalog # P0275).

3. PBS (Gibco Catalog # P0275).

4. 50 mM Hepes puferskog rastvora.

5. Blokirajući pufer (5% BSA/PBS).

6. Prečišćeni GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.).

7. Kinazni razblažujući pufer. Pomešati 500 ul 5% BSA/PBS, 10 ul 100 mM natrijumortovanadata i 50 ul 5M NaCI.

8. 10 mM ATP.

9. ATP/MnCI2fosforilacione smeše: pomešati 20 ul ATP, 400 ul 1M MnCI2i 9.56 ml dH20. 10. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika (Applied Scientific Catalog

# AS-72092).

11.0.5 M EDTA.

12.0.05% TBST. Dodati 500 ul TVVEEN u 1 litarTBS.

13. Poliklonalni anti-fosfotirozin serum zeca (SUGEN, Inc.).

14. Kozji anti-lgG zeca peroksidazni konjugat (Biosource, Catalog # ALI0404).

15. ABT rastvor.

16. ABTS/H202 rastvor.

Postupak:

1. Obložiti Costar ELISA 96-komorne ploče sa 1 ug po komorici Poli(glu, tyr) u 100 ul PBS. Držati u toku noći na 4°C.

2. Jednom ispirati obložene ploče sa PBS.

3. Dodati 150 ul 5% BSA/PBS blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati uz mućkanje 1 čas na sobnoj temperaturi. 4. Ispirati ploču 2 x sa PBS, a zatim jednom sa 50 mM Hepes. Potapkati ploče po pairnom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti i mehurići. 5. Dodati u ploču 25 ul 0.4 mM test jedinjenja u 4% DMSO ili sam 4% DMSO (kontrole). 6. Razblažiti prečišćeni GST-FGFR1 u pufer za razređivanje kinaze (5 ng kinaze/50 ul KDB/komorici).

7. Dodati 50 ul razblažene kinaze u svaku komoricu.

8. Početi kinaznu reakciju dodavanjem 25 ul/komorici sveže pripremljenog ATP/Mn++ (0.4 ml 1M MnCI2, 40 ul 10 mM ATP, 9.56 ml dH20, sveže pripremljen). 9. Ovo je brza reakcija kinaze i mora se zaustaviti sa 25 ul 0.5M EDTA na način sličan dodavanju ATP.

10. Ispirati ploču 4x sa svežim TBST.

11. Napraviti pufer za razređivanje antitela: na 50 ml: Pomešati 5 ml 5% BSA, 250 ul 5% mleka i 50 ul 100 mM natrijumvanadata, dopuniti do krajnje zapremine sa 0.05% TBST. 12. Dodati 100 ul po komorici anti-fosfotirozina (1:10000 razblaženje u ADB). Inkubirati, uz mućkanje 1 čas na sobnoj temperaturi.

13. Ispirati kao u koraku 10.

14. Dodati 100 ul po komorici Biosource kozjeg anti-lgG zeca peroksidaznog konjugata (1:6000 razblaženje u ADB). Inkubirati, uz mućkanje 1 čas na sobnoj temperaturi. 15. Ispirati kao u koraku 10 i zatim sa PBS da bi se uklonili mehurići i višak

TVVEEN.

16. Dodati 100 ul ABTS/H2O2rastvora u svaku komoricu.

17. Inkubirati, uz mućkanje 10 do 20 minuta. Ukloniti sve mehuriće.

18. Očitati analizu na Dvnatech MR7000 elisa čitaču: test filter na 410 nM, referentni filter 630 nM.

EGFR BIOLOŠKA ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena zain vitroaktivnost kinaze FGF1-R u ELISA analizi.

Materijal i reagensi:

1. Corning Elisa 96-komorne ploče.

2. SUM01 monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN, Inc.).

3. PBS

4. TBST pufer

5. Blokirajući pufer: za 100 ml, pomešati 5.0 g Carnation Instant Non-fat Milk®

(instant mleka bez masti) sa 100 ml PBS.

6. Lizat A431 ćelija (SUGEN, Inc.).

7. TBS pufer:

8. TBS + 10% DMSO: za 1 I, pomešati 1.514 g TRIS, 2.192 g NaCI i 25 ml DMSO; ukupnu zapreminu dopuniti do 1 litra sa dH20. 9. ATP (adenozin-5-trifosfat, iz mišića konja, Sigma Cat. No. A-5394), 1.0 mM rastvor u dHaO.

10. 1.0 mM MnCI2.

11. ATP/MnCI2fosforilaciona smeša: za 10 ml, pomešati 300 jul 1 mM ATP, 500 ul MnCI2i 9.2 ml dH20. Pripremiti neposredno pre upotrebe, čuvati na ledu.

12. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika.

13. EDTA.

14. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).

15. Kozji anti-lgG zeca peroksidazni konjugat (Biosource Cat. No. ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% vodonikperoksid.

18. ABTS/H202.

19. 0.2 M HCI.

Postupak:

1. Obložiti Corning ELISA 96-komorne ploče sa 0.5 ug SUM01 u 100 ul PBS po komorici, čuvati u toku noći na 4°C. 2. Ukloniti nevezani SUM01 iz komorica okretanjem ploče da bi se uklonila tečnost. Ispirati 1x sa dH20. Potapkati ploču po papirnatom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti. 3. Dodati 150 ul blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. 4. Ispirati ploču 3 x sa dejonizovanom vodom, a zatim jednom sa TBST. Potapkati ploče po papirnom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti i mehurići.

5. Razblažiti lizat u PBS (7 ug lizata/100 ul PBS).

6. Dodati 100 ul razblaženg lizata u svaku komoricu. Mućkati na sobnoj temperaturi 1 čas.

7. Ispirati ploče kao pod 4, iz prethodnog teksta.

8. Dodati 120 ul TBS u ELISA ploču koja sadrži vezan EGFR.

9. Razblažiti test jedinjenje 1:10 u TBS, sipati u komoricu.

10. Dodati 13.5 ul razblaženog test jedinjenja u ELISA ploču. U kontrolne komorice dodati 13.5 ul TBS u 10% DMSO.

11. Inkubirati, uz mućkanje, 30 minuta na sobnoj temperaturi.

12. Dodati 15 ul fosforilacione smeše u sve komorice osim komorica sa negativnom kontrolom. Krajnja zapremina komorice bi trebalo da bude približno 150 ul sa 3 uM ATP/5 mM MnCI2krajnje koncentracije u svakoj komorici. Inkubirati, uz mućkanje 5 minuta. 13. Zaustaviti reakciju dodavanjem 16.5 ul EDTA rastvora uz istovremeno mućkanje. Mućkati još 1 minut.

14. Ispirati 4x sa dejonizovanom vodom, 2x sa TBST.

15. Dodati 100 ul anti-fosfotirozina (1:3000 razblaženje u TBST) po komorici. Inkubirati, uz mućkanje, 30-45 minuta, na sobnoj temperaturi.

16. Ispirati kao u 4, iz prethodnog teksta.

17. Dodati 100 ul Biosource kozjeg anti-lgG zeca peroksidaznog konjugata (1:2000 razblaženje u TBST) u svaku komoricu. Inkubirati uz mućkanje 30 minuta, na sobnoj temperaturi.

18. Ispirati kao u 4, iz prethodnog teksta.

19. Dodati 100 ul ABTS/H202rastvora u svaku komoricu.

20. Inkubirati 5 do 10 minuta uz mućkanje. Ukloniti sve mehuriće.

21. ako je neophodno, zaustaviti reakciju dodavanjem 100 ul 0.2 M HCI po komorici. 22. Očitati analizu na Dynatech MR7000 ELISA čitaču: test filter na 410 nM, referentni filter na 630 nM.

PDGFR BIOLOŠKA ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena zain vitroaktivnost kinaze FGF1-R u ELISA analizi.

Materijal i reagensi:

1. Corning Elisa 96-komome ploče.

2. 28D4C10 monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN, Inc.).

3. PBS.

4. TBST pufer.

5. Blokirajući pufer (isti kao za EGFR biološku analizu).

6. Lizat NIH 3T3 ćelija koje eksprimiraju PDGFR-B (SUGEN, Inc.).

7. TBS pufer.

8. TBS + 10% DMSO.

9. ATP.

10. MnCI2.

11. Fosforilaciona smeša kinaznog pufera: za 10 ml, pomešati 250 ul 1 M TRIS, 200 ul 5M NaCI, 100 ul 1M MnCI2 i 50 ul 100 mM Triton X-100 u toliko dH20 da bi se napravilo 10 ml.

12. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika.

13. EDTA.

14. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).

15. Kozji anti-lgG zeca peroksidazni konjugat (Biosource Cat. No. ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% rastvor vodonikperoksida.

18. ABTS/H202.

19. 0.2 M HCI.

Postupak:

1. Obložiti Corning ELISA 96-komorne ploče sa 0.5 ug 28D4C10 u 100 ul PBS po komorici, čuvati u toku noći na 4°C. 2. Ukloniti nevezani 28D4C10 iz komorica okretanjem ploče da bi se uklonila tečnost. Ispirati 1x sa dH20. Potapkati ploču po papirnatom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti. 3. Dodati 150 ul blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. 4. Ispirati ploču 3 x sa dejonizovanom vodom, a zatim jednom sa TBST. Potapkati ploče po papirnom ubrusu da bi se uklonio višak tečnosti i mehurići.

5. Razblažiti lizat u HNTG (10 ug lizata/100 ul HNTG).

7. Ispirati ploče kao pod 4, iz prethodnog teksta.

8. Dodati 80 ul smeše radnog kinaznog pufera u ELISA ploču koja sadrži vezan

PDGFR.

9. Razblažiti test jedinjenje 1:10 u TBS u polipropilenskim 96-komornim pločama. 10. Dodati 10 ul razblaženog test jedinjenja u ELISA ploču. U kontrolne komorice dodati 10 ul TBS + 10% DMSO. Inkubirati, uz mućkanje, 30 minuta na sobnoj temperaturi. 11. Dodati 10 ?) ATP direktno u sve komorice osim komorica za negativnu kontrolu (krajnja zapremina komorice bi trebalo da bude približno 100 ul sa 20 uM ATP u svakoj komorici. Inkubirati, uz mućkanje 30 minuta.

12. Zaustaviti reakciju dodavanjem 10 ul EDTA rastvora u svaku komoricu.

13. Ispirati 4x sa dejonizovanom vodom, 2x sa TBST.

14. Dodati 100 ul anti-fosfotirozina (1:3000 razblaženje u TBST) po komorici. Inkubirati, uz mućkanje, 30-45 mniuta, na sobnoj temperaturi.

15. Ispirati kao u 4, iz prethodnog teksta.

16. Dodati 100 ul Biosource kozjeg anti-lgG zeca peroksidaznog konjugata (1:2000 razblaženje u TBST) u svaku komoricu. Inkubirati uz mućkanje 30 minuta, na sobnoj temperaturi.

17. Ispirati kao u 4, iz prethodnog teksta.

18. Dodati 100 ul ABTS/H2O2rastvora u svaku komoricu.

19. Inkubirati 10 do 30 minuta uz mućkanje. Ukloniti sve mehuriće.

20. Ako je neophodno, zaustaviti reakciju dodavanjem 100 ul 0.2 M HCI po komorici. 21. Očitati analizu na Dvnatech MR7000 ELISA čitaču sa test filterom na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

ANALIZA ĆELIJSKE HER-2 KINAZE

Ova analiza je upotrebljena za merenje HER-2 kinazne aktivnosti u celim ćelijama u ELISA formatu.

Materijal i reagensi:

1. DMEM (GIBCO Catalog #11965-092).

2. Fetalni goveđi serum (FBS, GIBCO Catalog #16000-044), koji je inaktiviran toplotom u vodenom kupatilu 30 minuta na 56°C.

3. Tripsin (GIBCO Catalog #25200-056).

4. L-glutamin (GIBCO Catalog #25030-081).

5. HEPES (GIBCO Catalog #15630-080).

6. Podloga za rast

Pomešati 500 ml DMEM, 55 ml FBS koji je inaktiviran toplotom, 10 ml HEPES i 5.5 ml L-glutamina.

7. Podloga za izgladnjivanje

pomešati 500 ml DMEM, 2.5 ml FBS koji je inaktiviran toplotom, 10 ml HEPES i 5.5 ml L-glutamina.

8. PBS.

9. Mikrotitarske 96-komorne ploče kulture tkiva sa ravnim dnom (Corning Catalog # 25860).

10. 15 cm sudovi sa kulturom tkiva (Corning Catalog #08757148).

11. Corning ELISA 96-komorne ploče.

12. NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika.

13. Costar ulošci za prenos za Transtar 96 (Costar Catalog #7610).

14. SUMO 1: monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN, Inc.).

15. TBST pufer.

16. Blokirajući pufer: 5% Carnation Instant Milk® u PBS.

17. EGF Ligand: EGF-201, Shinko American, Japan.

Suspendovati prah u 100 uL 10 mM HCI. Dodati 100 uL 10 mM NaOH. Dodati 800 uL PBS i preneti u ependorf, čuvati na -20°C do njegove upotrebe.

18. HNTG lizirajući pufer

Za stok 5X HNTG, pomešati 23.83 g Hepes, 43.83 g NaCI, 500 ml glicerola i 100 ml Triton X-100 i dH20 toliko da se napravi 1 I ukupnog rastvora.

Za 1X HNTG<*>, pomešati 2 ml HNTG, 100 ul 0.1 M Na3V04, 250 ul 0.2M Na4P207i 100 ul EDTA.

19. EDTA.

20. Na3V04. Za formiranje stok rastvora, pomešati 1.84 g Na3V04sa 90 ml CIH2O. Podesiti pH do 10. Kuvati u mikrotalasnoj peći 1 minut (rastvor postaje bistar). Hladiti do sobne temperature. Podesiti pH do 10. Ponavljati ciklus zagrevanja/hlađenja sve dok je pH 10. 21. 200 mM Na4P207. 22. Zečji poliklonalni antiserum koji je specifičan za fosfotirozin (anti-Ptyr antitelo, SUGEN, Inc.). 23. Antiserum prečišćen prema afinitetu, kozje anti-lgG zeca antitelo, peroksidazni konjugat (Biosource Cat # ALI0404).

24. ABTS rastvor.

25. 30% rastvor vodonikperoksida.

26. ABTS/H2O2.

27. 0.2 M HCI.

Postupak:

1. Obložiti Corning ELISA 96-komorne ploče sa SUM01 u 1.0 ug po komorici u PBS, 100 ul krajnje zapremine/komorici. Čuvati u toku noći na 4°C. 2. Na dan uporebe, ukloniti pufer za oblaganje i ispirati ploču 3 puta sa dH20 i jednom sa TBST puferom. Sva ispiranja u ovoj analizi bi trebalo da se obave na ovaj način, ukoliko nje drugačije naglašeno. 3. Dodati 10 ul blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati ploču, uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi.

4. Za ovu analizu upotrebiti EGFr/HER-2 chimera/3T3-C7 ćelijsku liniju.

5. Izabrati posude koje imaju 80-90 % konfluence. Sakupiti ćelije tripsinizacijom i centrifugiranjem na 1000 rpm na sobnoj temperaturi 5 minuta. 6. Resuspendovati ćelije u podlozi za gladovanje i brojati sa tripan plavim. Potrebna je vijabilnost iznad 90%. Staviti ćelije u podlogu za gladovanje sa gustinom od 2500 ćelija po komorici, 90 ul po komorici, u mikrotitarskoj 96-komornoj ploči. Inkubirati zasejane ćelije u toku noći na 37°C pod 5% C02.

7. Započeti analizu dva dana posle zasejavanja.

8. Test jedinjenja su rastvorena u 4% DMSO. Uzorci su zatim dalje razblaženi direktno na pločama sa DMEM-za izgladnjivanje. U tipičnom slučaju, ovo razblaženje će biti 1:10 ili veće. Sve komorice su zatim prebačene u ćelijsku ploču u daljem 1:10 razblaženju (10 ul uzorka i podloge u 96 ul podloge za izgladnjivanje. Krajnja koncentracija DMSO bi trebalo da bude 1% ili niža. Standardno serijsko razblaženje se takođe može upotrebiti.

9. Inkubirati pod 5% C02na 37°C 2 časa.

10. Pripremiti EGF ligand razblaživanjem stoka EGF (16.5 uM) u vrelom DMEM do 150 nM. 11. Pripremiti svežeg HNTG<*>toliko da bude dovoljno za 100 ul po komorici; postaviti na led. 12. Posle 2 časa inkubacije sa test jedinjenjem, ćelijama dodati pripremljeni EGF ligand, 50 ul po komorici, za krajnju koncentraciju od 50 nM. Komorice sa pozitivnom kontrolom primaju istu količinu EGF. Negativne kontrole ne primaju EGF. Inkubirati na 37°C 10 minuta.

13. Ukloniti test jedinjenje, EGF i DMEM. Ispirati ćelije jednom sa PBS.

14. Preneti HNTG<*>u ćelije, 100 ul po komorici. Postaviti na led 5 minuta. U međuvremenu, ukloniti blokirajući pufer iz ELISA ploče i ispirati. 15. Ostrugati ćelije sa ploče mikropipetom i homogenizovati ćelijski materijal ponavljanjem aspiriranja i primenom HNTG<*>lizirajućeg pufera. Preneti lizat u obloženu, blokiranu, ispranu ELISA ploču. Ili, upotrebiti Costar uložak za prenošenje da bi se preneo lizat u ploču.

16. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi 1 čas.

17. Ukloniti lizat, ispirati. Preneti sveže razblaženo anti-Ptyr antitelo (1:3000 u TBST) u ELISA ploču, 100 ul po komorici.

18. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi, 30 minuta.

19. Ukloniti anti-Ptyr antitelo, ispirati. Preneti sveže razblaženo BIOSOURCE antitelo u ELISA ploču (1:8000 u TBST, 100 ul po komorici).

20. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi, 30 minuta.

21. Ukloniti BIOSOURCE antitelo, ispirati. Preneti sveže pripremljeni ABTS/H202rastvor u ELISA ploču, 100 ul po komorici.

22. Inkubirati, uz mućkanje, 5-10 minuta. Ukloniti sve mehuriće.

23. Zaustaviti reakciju uz dodavanje 100 ul 0.2M HCI po komorici.

24. Očitati analizu na Dvnatech MR7000 ELISA čitaču sa test filterom postavljenim na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

CDK2/CIKLIN A ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena da bi se izmerilain vitroserin/treonin kinazna aktivnost humanog cdk2/ciklina A u Scintillation Proximity Assay (SPA) (scintilaciona analiza).

Materijal i reagensi:

1. VVallac polietilenske tereftalne (flexi) 96-komorne ploče (VVallac Catalog # 1450-401).

2. Amersham Redivue [y<33>P] ATP (Amersham catalog #AH 9968).

3. Amersham poliviniltoluen SPA kuglice obložne streptavidinom (Amersham catalog #RPNQ0007). Kuglice bi trebalo rekonstituisati u PBS bez magnezijuma ili kalcijuma, u 20 mg/ml. 4. Aktivirani cdk2/ciklin A enzimski kompleks prečišćen iz Sf9 ćelija (SUGEN, Inc.). 5. Biotinizovani peptidni supstrat (Debtide). Peptid biotin-X-PKTPKKAKKL je rastvoren u dH20 u koncentraciji od 5 mg/ml. 6. Peptid/ATP smeša: za 10 ml, pomešati 9.979 ml dH20, 0.00125 ml "hladnog" ATP, 0.010 ml Debtide i 0.010 ml y33P ATP. Krajnja koncentracija po komorici će biti 0.5 uM "hladnog" ATP, 0.1 ug Debtide i 0.2 uCi y<33>P ATP. 7. Kinazni pufer: za 10 ml, pomešati 8.85 ml dH20, 0.625 ml TRIS (pH 7.4), 0.25 ml 1M MgCI2, 0.25 ml 10% NP40 i 0.025 ml 1M DDT, koji se dodaje svež, neposredno pre upotrebe.

8. 10 mM ATP u dH20.

9. 1M Tris, pH podešen do 7.4 sa HCI.

10. 1M MgCI2.

11. 1M DTT.

12. PBS (Gibco Catalog # 14190-144).

13. 0.5M EDTA.

14. Stop rastvor: za 10 ml, pomešati 9.25 ml PBS, 0.005 ml 100 mM ATP, 0.1 ml 0.5 M EDTA, 0.1 ml 10% Triton X-100 i 1.25 ml 20 mg/ml SPA kuglica.

Postupak:

1. Pripremiti rastvore test jedinjenja u 5x željene krajnje koncentracije u 5% DMSO. Dodati 10 ul u svaku komoricu. Za negativne kontrole, upotrebiti samo 10 ul 5% DMSO u komoricama.

2. Razblažiti 5 ul cdk2/ciklin A rastvora sa 2.1 ml 2x kinaznog pufera.

3. Dodati 20 ul enzima u svaku komoricu.

4. Dodati 10 ul 0.5 M EDTA u komorice za negativnu kontrolu.

5. Da bi se započela kinazna reakcija, dodati 20 ul smeše peptida/ATP u svaku komoricu. Inkubirati 1 čas bez mućkanja.

6. Dodati 200 ul stop rastvora u svaku komoricu.

7. Držati najmanje 10 minuta.

8. Vrteti ploču na približno 2300 rpm 3-5 minuta.

9. Očitati ploču korišćenjem Trilux ili sličnog čitača.

MET TRANSFOSFORILACIONA ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena da bi se izmerili nivoi fosfotirozina na poli(glutaminska kiselina:tirozin (4:1)) supstratu kao sredstvo za identifikaciju agonista/antagonista met transfosforilacije supstrata.

Materijal i reagensi:

20. Corning ELISA 96-komorne ploče, Corning Catalog # 25805-96.

21. poli(glu, tyr) 4:1, Sigma, Cat. No. P 0275.

22. PBS, Gibco Catalog # 450-1300EB.

23.50 mM HEPES.

24. Blokirajući pufer: rastvoriti 25 g goveđeg serum albumina, Sigma Cat. No A-7888, u 500 ml PBS, filtrirati kroz 4 um filter. 25. Prečišćeni GSTfuzioni protein koji sadrži Met kinazni domen, Sugen, Inc.

26. TBST pufer.

27.10% vodeni (Millique H20) DMSO.

28.10 mM vodeni (dH20) adenozin-5'-trifosfat, Sigma, Cat. No. A-5394.

29.2X pufer za razređivanje kinaze: za 100 ml, pomešati 10 ml 1M HEPEPS na pH 7.5 sa 0.4 ml 5% BSA/PBS, 0.2 ml 0.1 M natrijumortovanadata i 1 ml 5M natrijumhlorida u 88.4 ml dH20.

30.4X ATP Reakciona smeša: za 10 ml, pomešati 0.4 ml 1 M manganhlorida i

0.02 ml 0.1 M ATP u 9.56 ml dH20.

31.4X smeše negativne kontrole: za 10 ml, pomešati 0.4 ml 1M manganhlorida u

9.6 ml dH20.

32.NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika, Applied Scientific Catalog

# S-72092.

33.500 mM EDTA.

34. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 ml, pomešati 10 ml 5% BSA/PBS, 0.5 ml 5% Carnation Instant Milk® u PBS i 0.1 ml 0.1 M natrimuortovanadata u 88.4 ml TBST.

35. Zečje poliklonalno antofosfotirozin antitelo, Sugen, Inc.

36. Kozje anti-zečje sa peroksidazom rena konjugovano antitelo, Biosource, Inc. 37. ABTS Rastvor: za 1 I, pomešati 19.21 g limunske kiseline, 35.49 g Na2HP04i 500 mg ABTS sa toliko dH20 da bi se formirao 1 I. 38. ABTS/H202: pomešati 15 ml ABTS rastvora sa 2 ul H202pet minuta pre

upotrebe.

39.0.2 M HCI.

Postupak:

1. Obložiti ELISA ploče sa 2 ug poli(Glu-Tvr) u 100 ul PBS, čuvati u toku noći na 4°C.

2. Blokirati ploču sa 150 ul 5% BSA/PBS 60 minuta.

3. Ispirati ploču dva puta sa PBS, jednom sa 50 mM Hepes puferom pH 7.4.

4. Dodati 50 ul razblažene kinaze u sve komorice (prečišćena kinaza je razblažena sa puferom za razblaživanje kinaze. Krajnja koncentracija bi trebalo da bude

10 ng/komorici).

5. Dodati u ploče 25 ul test jedinjenja (u 4% DMSO) ili sam DMSO (4% u dH20) za kontrole.

6. Inkubirati smešu kinaze/jedinjenja 15 minuta.

7. Dodati 25 ul 40 mM MnCI2u komorice za negativnu konrolu.

8. Dodati 25 ul ATP/MnCl2smeše u sve komorice (osim komorica za negativnu kontrolu). Inkubirati 5 minuta.

9. Dodati 25 ul 500 mM EDTA da bi se zaustavila reakcija.

10. Ispirati ploču 3X sa TBST.

11. Dodati 100ulu svaku komoricu zečji antiPtvr razblaženja 1:10000 u pufer za razblaživanje antitela. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi 1 čas.

12. Ispirati ploče 3x sa TBST.

13. Razblažiti Biosource HRP konjugovano anti-zečje antitelo 1:6000 u puferu za razblaživanje antitela. Dodati 100 ul po komorici i inkubirati na sobnoj temperaturi, uz mućkanje, 1 čas.

14. Ispirati ploču 1X sa PBS.

15. Dodati 100 ul ABTS/H202rastvora u svaku komoricu.

16. ako je neophodno, zaustaviti razvoj reakcije dodavanjem 100 ul 0.2M HCI po

komorici.

17. Očitati ploču na Dvnatech MR7000 ELISA čitaču sa test filterom na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

IGF-1 TRANSFOSFORILACIONA ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena da bi se izmerio nivo poli(glutaminska kiselina:tirozin)

(4:1) za identifikaciju agonista/antagonista gst-IGF-1 transfosforilacije supstrata.

Materijal i reagensi:

1. Corning ELISA 96-komorne ploče.

2. poli(glu, tyr) 4:1, Sigma, Cat. No. P 0275.

3. PBS, Gibco Catalog # 450-1300EB.

4. 50 mM HEPES.

5. TBB Blokirajući pufer: za 1 I, pomešati 100 g BSA, 12.1 g TRIS (pH 7.5), 58.44 g natrijumhlorida i 10 ml 1% TvVEEN-20. 6. Prečišćeni GSTfuzioni protein koji sadrži IGF-1 kinazni domen, Sugen, Inc. 7. TBST pufer: za 1 I, pomešati 6.057 g Tris, 8.766 g natrijumhlorida i 0.5 ml

TVVEEN-20 sa toliko dH20 koliko je potrebno za formiranje 1 I.

8. 10% DMSO u Milli-Q H20.

9. 10 mM ATPudH20.

10.2X pufer za razblaživanje kinaze: za 100 ml, pomešati 10 ml 1M HEPEPS

(pH 7.5), 0.4 ml 5% BSA u dH20, 0.2 ml 0.1 M natrijumortovanadata i 1 ml 5M natrijumhlorida sa toliko dH20 koliko je potrebno za formiranje 100 ml.

11.4X ATP Reakciona smeša: za 10 ml, pomešati 0.4 ml 1 M MnCI2i 0.008 ml

0.01 M ATP u 9.56 ml dH20.

12.4X negativna kontrola - smeša: pomešati 0.4 ml 1M manganhlorida u 9.6 ml

dH20.

13.NUNC polipropilenske 96-komorne ploče V oblika.

14.500 mM EDTA dH20.

15. Pufer za razređivanje antitela: za 100 ml, pomešti 10 ml 5% BSA u PBS, 0.5 ml 5% Carnation Instant Non-fat Milk® u PBS i 0.1 ml 0.1 M natrtmuortovanadata u 88.4 ml TBST.

16. Zečje poliklonalno antofosfotirozin antitelo, Sugen, Inc.

17. Kozje anti-HRP zeca konjugovano antitelo, Biosource, Inc.

18. ABTS Rastvor.

19. ABTS/H202: pomešati 15 ml ABTS sa 2 ul H202pet minuta pre upotrebe.

20.0.2 M HCI u dH20.

Postupak:

1. Obložiti ELISA ploče sa 2.0 ug/komorici poli(Glu-Tvr) 4:1 (Sigma P0275) u 100 ul PBS. Čuvati ploče u toku noći na 4°C.

2. Isprati ploču jednom sa PBS.

3. Dodati 100 ul TBB blokirajućeg pufera u svaku komoricu. Inkubirati ploču 1 čas uz mućkanje na sobnoj temperaturi. 4. Ispirati ploču jednom sa PBS, zatim dva puta sa 50 mM Hepes puferom pH 7.5. 5. Dodati ploči 25 ul test jedinjenja u 4% DMSO (dobijen razblaživanjem stok rastvora 10 mM test jedinjenja u 100% DMSO sa dH20). 6. Dodati u svaku komoricu 10.0 ng gst-IGF-1 kinaze u 50 ul pufera za razblaživanje kinaze. 7. Započeti kinaznu reakciju dodavanjem 25 ul 4X ATP reakcione smeše u sve komorice i komorice sa pozitivnom kontrolom. Dodati 25ul 4X smeše negativne kontrole u sve komorice za negativnu kontrolu. Inkubirati 10 minuta uz mućkanje na sobnoj temperaturi.

8. dodati 25 ul 0.5M EDTA (pH 8.0) u sve komorice.

9. Isprati ploču 4x sa TBST puferom.

10. U sve komorice dodati zečje poliklonalne anti-fosfotirozinske antiserume u razblaženju od 1:10000 u 100 ul pufera za razblaživanje antitela. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi 1 čas.

11. Isprati ploču kao u koraku 9.

12. U sve komorice dodati 100 ul Biosource anti-HRP zeca razblaženja od

1:10000 u puferu za razblaživanje antitela. Inkubirati, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi 1 čas.

13. Isprati ploču kao u koraku 9, a zatim jednom isprati sa PBS da bi se uklonili

mehurići i višak Tween-20.

14. Razviti dodavanjem u sve komorice 100 ul/komorici ABTS/H202.

15. Posle oko 10 minuta, očitatai na ELISA čitaču sa test filterom na 410 nm i referentnom filteru na 630 nm.

ANALIZE UGRAĐIVANJA BRDU

Sledeće analize koriste ćelije koje su dizajnirane tako da eksprimiraju izabrani receptor nakon čega se procenjuje efekat jedinjenja od interesa na aktivnost ligand-indukovane sinteze DNK određivanjem ugrađivanja BrdU u DNK.

Sledeći matrijali, reagensi i postupci su opšti za sve sledeće analize ugrađivanja BrdU. Odstupanja u određenim analizama su naglašena.

Materijali i reagensi:

1. Odgovarajući ligand.

2. Odgovarajuće dizajnirane ćelije.

3. Reagens za obeležavanje BrdU: 10 mM, u PBS (pH 7.4) (Boehringer Mannheim, Germanv). 4. FixDenat: fiksacioni rastvor (spreman za upotrebu) (Boehringer Mannheim, Germanv). 5. Anti-BrdU-POD: monoklonalno antitelo miša konjugovano sa peroksidazom (Boehringer Mannheim, Germanv). 6. TMB rastvor supstrata: tetrametilbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Germanv).

7. PBS ispirajući rastvor: 1X PBS, pH 7.4.

8. albumin, goveđi (BSA), prah frakcije V (Sigma, Chemical Co., USA).

Opšti postupak:

1. Ćelije su zasejane u 8000 ćelija/komorici u 10% CS, 2mM Gln u DMEM, u 96-komornu ploču. Ćelije su inkubirane u toku noći na 37°C u 5% C02. 2. Posle 24 časa, ćelije su ispirane sa PBS i zatim su izgladnjivane u podlozi bez seruma (0% CS DMEM sa 0.1% BSA) 24 časa. 3. Na dan 3, odgovarajući ligand i test jedinjenje su istovremeno dodati ćelijama. U komorice za negativnu kontrolu je sipan slobodan DMEM sa 0.1% BSA; ćelije za pozitivnu kontrolu su primile ligand, ali bez test jedinjenja. Test jedinjenja su pripremljena u DMEM bez seruma sa ligandom u 96-komornoj ploči i serijski su razblažena za 7 test koncentracija. 4. Posle 18 časova aktivacije liganda, razblaženi reagens za obeležavanje BrdU (1:100 u DMEM, 0.1% BSA) je dodat u ćelije i inkubiran sa BrdU (krajnja koncentracija=10 uM) 1.5 čas. 5. Posle inkubacije uz reagens za obeležavanje, medijum je uklonjen dekantovanjem i tapkanjem okrenute ploče po papirnom ubrusu. FixDenat rastvor je dodat (150 ul/komorici) i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 45 minuta na mućkalici. 6. FixDenat rastvor je pažljivo uklonjen dekantovanjem i tapkanjem okrenute ploče po papirnom ubrusu. Mleko je dodato (5% dehidratizovano mleko u PBS, 200ul/komorici) kao blokirajući rastvor i ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi na mućkalici. 7. Blokirajući rastvor je uklonjen dekantovanjem i komorice su ispirane jednom sa PBS. Anti-BrdU-POD rastvor (1:200 razblaženje u PBS, 1% BSA) je dodat (50 ul/komorici) i ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi na mućkalici. 8. Konjugat antitela je pažljivo uklonjen dekantovanjem i ispiranjem komorica 5 puta sa PBS, a ploča je sušena okretanjem i tapkanjem po paprinom ubrusu. 9. Rastvor TMB supstrata je dodat (100 ul/komorici) i inkubiran je 20 minuta na sobnoj temperaturi na mućkalici sve dok se nije razvilo dovoljno boje za fotometrijsku detekciju. 10. Absorbanca uzoraka je merena na 410 nm (u modu "dvostruke talasne dužine" sa očitavanjima filtera na 490 nm, kao referentne talasne dužine) na Dvnatech ELISA čitaču ploče.

Analiza EGF-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. EGF Miša, 201 (Tovobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFRC7.

Analiza EGF-indukovanog Her-2-izvedenog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. EGF Miša, 201 (Tovobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr sa Her-2 kinaznim domenom).

Analiza EGF-indukovanog Her-4-»zvedenog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. EGF Miša, 201 (Tovobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr sa Her-4 kinaznim domenom).

Analiza PDGF-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. Humani PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Germanv).

2. 3T3/EGFrc7.

Analiza FGF-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. Humani FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).

2. 3T3c7/EGFr.

Analiza IGF1-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. Humani, rekombinantni (G511, Promega Corp., USA).

2. 3T3/IGF1r.

Analiza insulin-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. Insulin, kristalni, goveđi, Cink (13007, Gibco BRL, USA).

2. 3T3/H25.

Analiza HGF-indukovanog ugrađivanja BrdU

Materijal i reagensi:

1. Rekombinantni humani HGF (Cat. No. 249-HG, R&D Svstems, Inc., USA).

2. BxPC-3 ćelije (ATCC CRL-1687).

Postupak:

1. Ćelije su zasejane u 9000 ćelija/komorici u RPMI 10% FBS u 96-komornu ploču. Ćelije su inkubirane u toku noći na 37°C u 5% C02. 2. Posle 24 časa, ćelije su ispirane sa PBS i zatim su izgladnjivane u 100 ul podloge bez seruma (RPMI sa 0.1% BSA) 24 časa. 3. Na dan 3, 25 ul rastvora sa ligandom (pripremljen u 1 ul/ml u RPMI sa 0.1% BSA; krajnja HGF koncentracija je 200 ng/ml) i test jedinjenja su dodati ćelijama. U komorice za negativnu kontrolu je sipano 25 ul RPMI bez seruma sa 0.1% BSA; ćelije za pozitivnu kontrolu su primile ligand (HGF), ali bez test jedinjenja. Test jedinjenja su pripremljena u 5 puta njihove krajnje koncentracije u RPMI bez seruma sa ligandom u 96-komornoj ploči i serijski su razblažena za 7 test koncentracija. U tipičnom slučaju, najviša krajnja koncentracija test jedinjenja je 100 uM i upotrebljena su razblaženja od 1:3 (tj., opseg krajnje koncentracije test jedinjenja je 0.137-100 uM). 4. Posle 18 časova aktivacije liganda, u svaku komoricu je dodato 12.5ul razblaženog reagensa za obeležavanje BrdU (1:100 u RPMI, 0.1% BSA) i ćelije su inkubirane sa BrdU (krajnja koncentracija je 10 uM) 1 čas.

5. Isto kao kod opšteg postupka.

6. Isto kao kod opšteg postupka.

7. Blokirajući rastvor je uklonjen dekantovanjem i komorice su ispirane jednom sa PBS. Anti-BrdU-POD rastvor (1:100 razblaženje u PBS, 1% BSA) je dodat (100 ul/komorici) i ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi na mućkalici.

8. Isto kao kod opšteg postupka.

9. Isto kao kod opšteg postupka.

10. Isto kao kod opšteg postupka.

Analiza HUV- EC- C

Ova analiza je upotrebljena za merenje aktivnosti jedinjenja na PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ili Flk-1/KDR, pri čemu su svi prirodno eksprimirani u HUV-EC ćelijama.Dan0

1. Isprati i tripsinizovati HUV-EC-C ćelije (humane endotelijalne ćelije vene pupčane vrpce, (American Type Culture Collection, catalogue no. 1730 CRL). Ispirati sa Dulbecco-ovim fosfatno-puferisanim slanim rastvorom (D-PBS, dobijen iz Gibco BRL, catalogue no. 14190-029) 2 puta u oko 1 ml/10 cm<2>posude sa kulturom tkiva. Tripsinizovati sa 0.05% tripsin-EDTA u rastvoru za neenzimatsko razdvajanje ćelija (Sigma Chemical Company, Catalogue no. C-1544). 0.05% tripsin je formiran razblaživanjem 0.25% tripsin/1 mM EDTA (Gibco, catalogue no. 25200-049) u rastvoru za razdvajanje ćelija. Tripsinizovati sa oko 1 ml/25-30 cm<2>posude sa kulturom tkiva oko 5 minuta na 37°C. Pošto su se ćelije odvojile od posude, dodati istu zapreminu podloge za analizu i preneti u 50 ml sterilnu epruvetu za centrifugu (Fisher Scientific, catalogue no. 05-539-6). 2. Ispirati ćelije sa oko 35 ml podloge za analizu u 50 ml sterilnoj epruveti za centrifuhu dodavanjem podloge za analizu, centrifugirati 10 minuta na približno 200x g, aspirirati supematant i resuspendovati sa 35 ml D-PBS. Ponoviti ispiranje još dva puta sa D-PBS, resuspendovati ćelije u oko 1 ml podloge za analizu/15 cm<2>posude za kulturu tkiva. Podloga za analizu se sastoji od F12K podloge (Gibco BRL, catalogue no. 21127-014) i 0.5% fetalnog goveđeg seruma koji je inaktivisan toplotom. Brojati ćelije pomoću Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) i dodati podlogu za analizu ćelijama da bi se dobila koncentracija od 0.8-1.0 x 105 ćelija/ml. 3. Dodati ćelije u 96-komorne ploče sa ravnim dnom u 100 ul/komorici ili 0.8-1.0 x 10<4>ćelija/komorici, inkubirati -24 časa na 37°C, 5% CO2.

Dan1

1. Pripremiti dvostruke titracije test jedinjenja u odvojenim 96-komomim pločama, generalno od 50 uM pa do 0 uM. Upotrebiti istu podlogu za analizu kao što je pomenuto za dan 0, korak 2 iz prethodnog teksta. Titracije su napravljene dodavanjem 90 ul/komorici test jedinjenja na 200 uM (4X krajnje koncentracije komorice) u gornju komoricu određene kolone ploče. S obzirom da je stok test jedinjenja obično 20 mM u DMSO, koncentracija leka od 200 uM sadrži 2% DMSO.

Razblaživač sa do 2% DMSO u podlozi za analizu (F12K+0.5% fetalnog goveđeg seruma) je upotrebljen kao razblaživač za titracije test jedinjenja da bi se razblažilo test jedinjenje, ali da se održi konstantnom koncentracija DMSO. Dodati ovaj razblaživač u preostale komorice u koloni u 60 ul/komorici. Uzeti 60 ul iz 120 ul od 200 uM razblaženja test jedinjenja u gornjoj komorici kolone i pomešati sa 60 ul u drugoj komorici kolone. Uzeti 60 ul iz ove komorice i pomešati sa 60 ul u trećoj komorici kolone i tako redom sve dok se ne završe duple titracije. Kada je poslednja komorica pomešana sa prethodnom, uzeti 60 ul iz 120 ul u ovoj komorici i baciti ih. Ostaviti poslednju komoricu sa 60 ul DMSO/razblaženje podloge kao kontrolu koja ne sadrži test jedinjenje. Napraviti 9 kolona titriranog test jedinjenja, dovoljno za trostruke komorice gde je svaka za: (1) VEGF (dobijen iz Pepro Tech Inc., catalogue no. 100-200), (2) faktor rasta endotelijalnih ćelija (ECGF) (takođe poznat kao kiseli faktor rasta fibroblasta, ili aFGF) (dobijen iz Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600), ili (3) humani PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Germanv) i kontrola podloge za analizu. ECGF dolazi kao preparat sa natrijumheparinom. 2. Preneti 50 ul/komorici razblaženja test jedinjenja u 96-komorne ploče koje sadrže 0.8-1.0x10<4>ćelija/100 ul/komorici HUV-EC-C ćelija od dana 0 i inkubirati~2 časa na 37°C, 5% C02. 3. U triplikatu, dodati 50ul/komorici 80 ul/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF, ili kontrolne podloge u svako posebno test jedinjenje. Kao sa test jedinjenjima, koncentracije faktora rasta su 4X željene krajnje koncentracije. Upotrebiti podlogu za analizu od dana 0 korak 2 da bi se napravile koncentracije faktora rasta. Inkubirati približno 24 časa na 37°C, 5% C02. Svaka komorica će imati 50 ul razblaženja test jedinjenja, 50 ul faktora rasta ili podloge i 100 ul ćelija, što daje do 200 ul/komorici ukupno. Prema tome 4X koncentracije test jedinjenja i faktora rasta postaju 1X kada je sve dodato u komorice.

Dan 2

1. Dodati<3>H-timidin (Amersham, catalogue no. TRK-686) u 1 uCi/komorici (10 ul/komorici 100 uCi/ml rastvora koji je pripremljen u RPMI podlozi+10% fetalni goveđi serum inaktivisan toplotom) i inkubirati -24 časa na 37°C, 5% C02. RPMI je dobijen iz Gibco BRL, catalogue no. 11875-051.

Dan3

1. Zamrznuti ploče u toku noći na -20°C.

Dan 4

Odmrznuti ploče i prikupiti materijal sa harvesterom za 96-komorne ploče (Tomtec Harvester 96<®>) na filter brisačima (VVallac, catalogue no. 1205-401), očitati brojne vrednosti na VVallac Betaplate™ tečnom scincilacionom brojaču.

Biološke analize koje su upotrebljene ili koje se mogu upotrebiti za procenu jedinjenja su opisane detaljno u daljem tekstu. Jedinjenja 1-9 su testirana i nađeno je da su aktivna u flkGST, FGFR1 i PDGF analizama.

IN VIVOANIMALNI MODELI

KSENOGRAFT ANIMALNI MODELI

Sposobnost humanih tumora da rastu kao ksenograftovi kod atimusnih miševa (bez timusa) (npr., Balb/c, nu/nu) daje koristanin vivomodel za proučavanje biološkog odgovora na terapije za humane tumore. Od prve uspešne ksenotransplantacije humanih tumora u atimusnog miša, (Rvgaard and Povišen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), mnoge različite ćelijske linije humanih tumora (npr., tumor dojke, tumor pluća, genitourinani tumor, gastrointestinalni tumor, tumor glave i vrata, glioblastom, tumor kostiju i maligni melanomi) su transplantirane i uspešno su rasle kod «nude» miševa (miševa bez dlake). Sledeće analize se mogu koristiti za određivanje nivoa aktivnosti, specifičnosti i efekta različitih jedinjenja ovog pronalaska. Tri opšta tipa analiza su korisni za procenu jedinjenja: ćelijske/katalitičke, ćelijske/biološke iin vivo.Cilj ćelijskih/katalitičkih analiza je određivanje efekta jedinjenja na sposobnost TK da fosforiliše tirozine na poznatom supstratu u ćeliji. Cilj ćelijskih/bioloških analiza je određivanje efekta jedinjenja na biološki odgovor koji je stimulisan sa TK u ćeliji. Ciljin vivoanaliza je određivanje efekta jedinjenja u animalnom modelu određenog poremećaja kao što je kancer.

Pogodne ćelijske linije za subkutane ksenograft eksperimente obuhvataju C6 ćelije (gliom, ATCC # CCL 107), A375 ćelije (melanom, ATCC # CRL 1619), A413 ćelije (epidermoidni karcinom, ATCC # CRL 1555), Calu 6 ćelije (pluća, ATCC # HTB 56), PC3 ćelije (prostata, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5 ćelije i NIH 3T3 fibroblasta genetičkim inžinjeringom formirani tako da prekomerno eksprimiraju EGFR, PDGFR, IGF-1 R ili bilo koju drugu test kinazu. Sledeći protokol bi se mogao upotrebiti da bi se izveli ksenograft eksperimenti: Ženke atimusnog miša (BALB/c, nu/nu) su dobijene iz Simonsen Laboratories (Gilrov, CA). Sve životinje su održavane pod korektnim higijenskim uslovima u mikro-izolacionim kavezima sa Alpha-dri prostirkom. Oni su primili sterilnu glodarsku hranu i voduad libitum.

Ćelijske linije su gajene na odgovarajućoj podlozi (na primer, MEM, DMEM, Ham-ova F10, ili Ham-ova F12 plus 5% -10% fetalni goveđi serum (FBS) i 2 mM glutamina (GLN)). Podloga za ćelijsku kulturu i glutamin i fetalni goveđi serum su nabavljeni u Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) osim ukoliko nije naglašeno drugačije. Sve ćelije su gajene u vlažnoj atmosferi od 90-95% vazduha i 5-10% C02na 37°C. Sve ćelijske linije su rutinski prebacivane u podkulture dva puta nedeljno i negativne su za mikoplazmu kao što je određeno pomoću Mvcotest metode (Gibco).

Ćelije su prikupljane na ili blizu konfluence sa 0.05% Tripsin-EDTA i taložene na 450 x g 10 minuta. Taloži su resuspendovani u sterilni PBS ili podlozi (bez FBS) do određene koncentracije i ćelije su implantirane u zadnji deo slabine miševa (8-10 miševa po grupi, 2-10 x 10<6>ćelija/životinji). Rast tumora je meren u toku 3 do 6 nedelja korišćenjem noniusa. Zapremine tumora su izračunavane kao proizvod dužina x širina x visina, osim ukoliko nije drugačije naglašeno. P vrednosti su izračunavane korišćenjem Studentovog t-testa. Test jedinjenja u 50-100 jal inertnog punioca (DMSO, ili VPD:D5W) se mogu primeniti IP injekcijom u različitim koncentracijama, generalno počevši na dan jedan posle implantacije.

MODEL INVAZIJE TUMORA

Razvijen je sledeći model invazije tumora koji se može koristiti za procenu terapeutske vrednosti i efikasnosti jedinjenja za koja je nađeno da selektivno inhibiraju KDR/FLK-1 receptor.

Postupak

«Nude» miševi stari 8 nedelja (ženke) (Simonsen Inc.) su upotrebljeni kao eksperimentalne životinje. Implantacija ćelija tumora se može izvesti u komori sa prečišćenim vazduhom. Za anesteziju primenjen je ksilazin/ketamin koktel (100 mg/kg ketamina i 5 mg/kg ksilazina) intraperitonealno. Izveden je središnji rez da bi se otkrila abdominalna duplja (približno 1.5 cm u dužinu) da bi se injektiralo 10<7>ćelija tumora u zapremini od 100 ul sredine. Ćelije su injektirane bilo u dudenalni lobus pankreasa ili ispod seroze debelog creva. Peritoneum i mišići su zatvoreni 6-0 svilenim kontinuiranim šavom i koža je zatvorena korišćenjem kopči za rane. Životinje su posmatrane na dnevnoj bazi.

Analiza

Posle 2-6 nedelja, u zavisnosti od tipa posmatranja životinja, miševi su žrtvovani i metastaze lokalnog tumora u različitim organima (pluća, jetra, mozak, želudac, slezna, srce, mišići) su izvađene i analizirane (merenja veličine tumora, stepena invazije, imunohemija, određivanja sain situhibridizacijom, itd.).

C- KIT ANALIZA

Ova analiza je upotrebljena za određivanje nivoa c-kit tirozin fosforilacije.

Mo7E (humana akutna mijeloidna leukemija) ćelije su serum-izgladnjivane u toku noći u 0.1% serumu. Ćelije su pretretirane jedinjenjem (istovremeno sa serumskim izgladnjivanjem), pre stimulacije ligandom. Ćelije su stimulirane sa 250 ng/ml rh-SCF 15 minuta. Posle stimulacije, ćelije su lizirane i imunoistaložene sa anti-c-kit antitelom. Nivoi fosfotirozina i proteina su određivani pomoću VVestern blotting-a.

ANALIZA MTT PROLIFERACIJE

Mo7E ćelije su serum-izgladnjivane i pre-tretirane jedinjenjem kao što je opisano za fosforilacione eksperimente. Ćelije su postavljene @ 4X10<5>ćelija/komorici u 96-komornu posudu, u 100 ul RPMI + 10% serum. rh-SCF (100 ng/ml) je dodat i ploča je inkubirana 48 časova. Posle 48 časova, 10 ul 5 mg/ml MTT [3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijumbromida) je dodato i ostavljeno je da se inkubira 4 časa. Kiseli izopropanol (100 ul 0.04 N HCI u izopropanolu) je dodat i optička gustina je merena na talasnoj dužini od 550 nm.

ANALIZA APOPTOZE

M07E ćelije su inkubirane +/- SCF i +/- jedinjenje u 10% FBS sa rh-GM-CSF (10 ng/ml) i rh-IL-3 (10 ng/ml). Uzorci su analizirani na 24 i 48 časova. Da bi se merila aktivirana kaspaza-3, uzorci su ispirani sa PBS i permealizovani sa ledeno hladnim 70% etanolom. Ćelije su zatim bojene sa PE-konjugovanim poliklonalnim zečjim anti-aktivna kaspaza-3 antitelima, i analizirane su pomoću FACS. Za merenje razloženog PARP, uzorci su lizirani i analizirani vvestern blotting-om sa anti-PARP antitelom.

Dodatne analize

Dodatne analize koje se mogu koristiti za procenu jedinjenja ovog pronalaska obuhvataju, bez ograničenja, analizu bio-flk-1, analizu EGF receptor-HER2 himerni receptor u celim ćelijama, analizu bio-src, analizu bio-lck i analizu merenja fosforilacione funkcije raf. Protokol za svaku od ovih analiza se može naći u U.S. Application Ser. No. 09/099,842, koja je ovde obuhvaćena na osnovu reference uključujući i sve crteže.

Merenja ćelijske toksičnosti

Terapeutska jedinjenja bi trebalo da jače inhibiraju tirozin kinazne aktivnosti receptora nego što ispoljavanju citotoksični efekat. Mera efektivnosti i ćelijske toksičnosti jedinjenja se može dobiti odeđivanjem terapeutskog indeksa, tj., IC50/LD50. IC50, doza koja je potrebna da bi se postiglo 50% inhibicije, se može meriti korišćenjem standardnih tehnika kao što su one ovde opisane. LD50, dozaža koja kao rezultat ima 50% toksičnosti, se takođe može meriti standardnim tehnikama (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), merenjem količine oslobođenog LDH (Korzenievvski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods. 64:313, Decker and Lohmann-Matths, 1988, X Immunol. Methods, 115:61), ili merenjem letalne doze u animalnim modelima. Poželjna su jedinjenja sa velikim terapeutskim indeksom. Terapeutski indeks bi trebalo da bude veći od 2, poželjno najmanje 10, poželjnije najmanje 50.

Tehničaru će biti jasno da je ovaj pronalazak dobro prilagođen za ostvarivanje pomenutih krajnjih ciljeva i prednosti, kao i onih koji iz ovoga proističu. Molekularni kompleksi i metode, postupci, tretmani, molekuli, specifična jedinjenja ovde opisani su sada tipični predstavnici poželjnih oblika, dati su kao primeri i nije namera da predstavljaju ograničenja delokruga ovog pronalaska. Tehničari će moći da uoče moguće promene i druge upotrebe koji su obuhvaćeni duhom ovog pronalaska i definisani su delokrugom patentnih zahteva.

Tehničaru će biti jasno da se mogu praviti promenljive supstitucije i modifikacije pronalaska koji je ovde dat bez odvajanja od delokruga i duha pronalaska.

Svi patenti i publikacije koji su pomenuti u specifikaciji su indikativni tehničarima za nivoe na koje se pronalazak odnosi. Svi patenti i publikacije su ovde dati u istom opsegu kao da je svaka pojedinačna publikacija specifično i pojedinačno naznačena da je ovde data.

Pronalazak koji je ovde ilustrativno opisan pogodno se može praktično isprobati bez bilo kog elementa ili elemenata, jednog ili više ograničenja koje ovde nije posebno dato. Prema tome, na primer, u svakom od slučajeva ovde bilo koji od termina "sadrži", "esencijalno se sastoji se od" i "sastoji se od" mogu se zameniti sa bilo kojim od druga dva termina. Termini i izrazi koji su upotrebljeni su korišćeni kao termini opisa i nisu ograničavajući i ne postoji namera da se upotrebom takvih termina i izraza isključe bilo koji ekvivalenti karakteristika koje su prikazane i opisane ili njihovi delovi, ali prepoznaje se da su moguće različite modifikacije unutar delokruga pronalaska za koji su dati patentni zahtevi. Prema tome, podrazumeva se da iako je ovaj pronalazak specifično dat pomoću poželjnih oblika i izbornih karakteristika, modifikacije i varijacije koncepata koji su ovde dati se mogu ponovo razvrstati od strane tehničara i smatra se da su ovakve modifikacije i varijacije unutar delokruga ovog pronalaska određenog u priključenim patentnim zahtevima.

Pored toga, tamo gde su karakteristike ili aspekti pronalaska opisani prema Markush grupama, tehničari će prepoznati da je pronalazak takođe u vezi s tim opisan prema bilo kom pojedinačnom članu ili podgrupi članova Markush grupe. Na primer, ako je X opisan kao da je izabran iz grupe koja se sastoji od broma, hlora i joda, patentni zahtevi za X da je brom i patenti zahtevi za X da je brom i hlor su u potpunosti opisani.

Drugi oblici su unutar sledećih patentnih zahteva.

Claims

1.Jedinjenje Formule (I): gde: R<1>je odabran iz grupe koju čine vodonik, halo, C^Ckj alkil, CVC4haloalkoksi, C3-C8monocikličan cikloalkil, [5,6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, adamantil, 5-9-člana heteroaliciklična grupa sa 1 ili 2 heteroatoma odabrana od N, O ili -S(0)ngde n = 0-2, hidroksi, d-C10 alkoksi, nesupstituisan C3-C8cikloalkoksi, -C(0)-R<8>,-NR<9>R10i -C(0)NR12R<13>; R<2>je odabran iz grupe koju čine vodonik, halo, Ct-Cwalkil, trihalometil, hidroksi, CrCi0alkoksi, nesupstituisan C3-C8cikloalkoksi, cijano, -NR<9>R<10>, -NR<9>C(0)R<10>, -C(0)R<8>, -S(0)2NR<9>R<1>° i -S02Ru (gde R<14>is CrC10alkil, C6-C12aril, CrC4 alkil supstituisan C6-C12arilom, 5-12 člani heteroaril sa 1-4 prstenastih heteroatoma odabranih od N, 0 ili S, i Cr C4alkil supstituisan sa 5-12 članim heteroarilom sa 1-4 heteroatoma u prstenu, odabrana od N, O ili S);R<3>,R<4>iR<5>sunezavisno vodonik ili CrC10 alkil; Z je C6-C12aril, 5-12 člani heteroaril sa 1-4 heteroatoma u prstenu, odabrana od N, O ili S, 3-8 člani zasićen heterociklil sa 1 ili 2 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O, ili S(0)ngde n = 0-2, i -NR15R16gde R<15>i R16su nezavisno vodonik ili CrC10 alkil; iliR15iR16zajedno sar atomom azota za koji su vezani formiraju 3-8 članu heterocikloamino grupu po izboru sa 1 ili 2 dodatna heteroatoma u prstenu odabrana od N, O, ili S(0)ngde n = 0-2; R<6>je odabran iz grupe koju čine vodonik ili d-do alkil; R<7>je odabran iz grupe koju čine vodonik, CrCi0alkil, C6-Ci2aril, 5-12-ćlani heteroaril sa 1-4 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O ili S, i -C(0)R17 kao što je definisano u daljem tekstu; R8 je odabran iz grupe koju čine hidroksi, CrCm alkoksi, nesupstituisan C3-C8cikloalkoksi, C6-C12ariloksi, i 5-12 - člani heteroariloksi having 1-4 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O ili S; R<9>i R<10>su nezavisno odabrani iz grupe koju čine vodonik, Ci-C10 alkil, CrC10cijanoalkil, C3-C8monocikličan cikloalkil, [5,6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, adamantil, C6-Ci2aril i 5-12 - člani heteroaril sa 1-4 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O ili S; ili R<9>i R<10>zajedno formiraju 3-8 članu heterocikloamino grupu po izboru sa 1 ili 2 dodatna heteroatoma u prstenu odabrana od N, O, ili S(0)ngde n = 0-2; R<12>i R<13>su nezavisno odabrani iz grupe koju čine vodonik, CrC10 alkil, d-C™ hidroksialkil, i C6-Ci2aril; ili R<12>i R<13>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 3-8 članu heterocikloamino grupu po izboru sa 1 ili 2 dodatna heteroatoma u prstenu odabrana od N, O, ili S(0)ngde n = 0-2; R17 je odabran iz grupe koju čine CrC10 alkil, C3-C8monocikličan cikloalkil, [5,6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, adamantil, C6-Ci2aril, hidroksi i 5-12 člani heteroaril sa 1-4 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O ili S; Ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; pod uslovom da jedinjenje nije i gde C1-C10alkil može da bude supstituisan ili nesupstituisan , i u slučaju kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je odabrana od halo, hidroksi, C1-C4alkoksi, C6-Ci2aril, C6-C12ariloksi, 5-12 članog heteroarila sa 1-4 heteroatoma u prstenu, odabrana od N, O ili S, 5-9 člana heteroaliciklična grupa sa 1 ili 2 heteroatoma odabrana od N, O ili -S(0)ngde n = 0-2, -C(0)R<8>, -NR<9>R<10>i -C(0)NR<9>R10;C3-C8monocikličan cikloalkil, [5,6]- ilir [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, i adamantil mogu da budu supstituisani ili nesupstituisani, i kada su supstituisane , supstituentna grupa (grupe) je jedna ili dve grupe nezavisno odabrane od CrC4alkil, CrC4trihaloalkil, halo, hidroksi, CrC4alkoksi, C6-Ci2aril, C6-Ci2ariloksi, 6 člani heteroaril sa 1-3 atoma azota u prstenu, 5 člani heteroaril sa 1-3 heteroatoma odabrana od N, O ili S, 5 ili 6 člana heteroaliciklična grupa sa 1-3 heteroatoma odabrana od N, O ili S, merkapto, C^-dS-alkil, C6-C12S-aril, cijano, -C(0)-R", -C(S)-R", -OC(0)NR<12>R<13>, R<9>OC(0)NR<10->, - OC(S)NR12R<1>3,R9OC(S)NR<10->, -C(0)NR<9>R<10>, R<9>C(0)NR<10->, nitro, NR<9>S(0)2R<10>, - S(0)2NR<9>R<10>, R<9>S(0)-, R<9>S(0)2-, C(0)OR<9>, R<9>C(0)0-, i -NR<9>R<10>; C6-C12aril može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je jedna ili dve grupe nezavisno odabrane od halo, CrC4alkil, CrC4 trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, karboksi, NR<9>S(0)2R<1>°, R<9>C(0)NR<10->, -NHR ili -NRR gde R je CrC4 alkil, C3-C8monocikličan cikloalkil; [5,6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, ili adamantil; 5-12 člani heteroaril može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je definisana kao za C6-Ci2aril prethodno dato; 5-9 čllani heteroalicikl može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je definisana kao za C6-C12aril, prethodno dato; 3-8 člani zasićen heterociklil može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je jedna ili dve grupe nezavisno odabrane od =0(kao C-supstituent tako da formira karbonilnu grupu), halo, C1-C4alkil, CrC4alkil supstituisan sa karboksi ili -C(0)0-R" sa R" kao što je ovde definisano, izuzev što R" ne može da buide vodonik, hidroksi, i -NHR ili -NRR gde R je d-C4alkil ili C3-C8monocikličan cikloalkil, [5,6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, ili adamantil; 3-8 člani heterocikloamino može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je definisana kao za prethodno dati 3-8 člani zasićeni heterociklil; d-do alkoksi može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je definisana kao za prethodno dati C1-C10alkil; C6-C12ariloksi i 5-12 člani heteroariloksi može da bude supstituisan ili nesupstituisan, i kada je supstituisan, supstituentna grupa (grupe) je definisana kao za prethodno dato C6-C12aril; R" je odabran iz grupe koju čine vodonik, CrC4alkil, trihalomethil, C3-C8monocikličan cikloalkil, C6-Ci2aril, 5-12 člani heteroaril sa 1-4 heteroatoma u prstenu odabrana od N, O ili S, i 5-9 člana heteroaliciklična grupa sa 1 ili 2 heteroatoma odabrana od N, O ili -S(0)„ gde n = 0-2.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što: R<1>je odabran iz grupe koju čine vodonik, halo, CrC10 alkil, C3-C8monocikličan cikloalkil, [5, 6]- ili [6,6]-kondenzovan bicikličan cikloalkil, adamantil, 5-9 člana heteroaliciklična grupa sa 1 ili 2 heteroatoma odabrana od N, O ili -S(0)ngde n = 0-2, hidroksi, Ci-Ci0alkoksi, nesupstituisan C3-C8cikloalkoksi, -C(0)-R<8>, -NR<9>R<10>i -C(0)NR12R13;R<2>, R<1>4,R<3>,R<4>, R<5>, Z, R<15>, R<16>, R<6>, R<7>, R6,R9, R<10>su kao što je definisano u zahtevu 1;R12i R<13>su nezavisno odabrani iz grupe koju čine vodonik, C-|-Ci0 alkil, i C6-C12aril; ili R<12>i R<13>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 3-8 članu heterocikloamino grupu po izboru sa 1 ili 2 dodatna heteroatoma u prstenu, odabrana od N, O, ili S(0)ngde n = 0-2; R<17>je kao što je definisano u zahtevu 1; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

3. Jedinjenje ili salt prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačeno time što je jedinjenje odabrano iz grupe koju čine:

4. Jedinjenje ili so prema zahtevu1 ili zahtevu 2, naznačeno time, što je jedinjenje odabrano iz grupe koju čine::

5. Jedinjenje ili so prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačeno time što je jedinjenje Formule (la): gde: R1, R3, R4, i R5 su vodonik; R2 je fluor i nalazi se na položaju 5 prstena indolinona; i Z je morfolin-4-il;R<6>i R<7>su metil; i stereohemija na *C je (S).

6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje ili so prema jednom od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili eksipijens.

7. Metoda zain vitromodulaciju katalitičke aktivnosti protein kinaze, koja obuhvata reakciju protein-kinaze sa jedinjenjem ili soli prema jednom od zahteva 1 do 5.

8. Metoda prema zahtevu 7, naznačena time, što je protein kinaza odabrana iz grupe koju čine receptorska tirozin-kinaza, ne-receptorska tirozin kinaza{ nespecifični protein tirozin- kinaze)i serin-treonin kinaza.

9. Upotreba farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje ili so prema jednom od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili eksipijens za proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanih sa protein- kinazom, u organizmu.

10. Uporeba prema zahtevu 9, gde je poremećaj povezan sa protein- kinazom odabran iz grupe koju čine: poremećaji povezani sa receptorskom tirozin -kinazom, poremećaji povezani sa ne-receptorskom tirozin-kinazom i poremećaji povezani sa serin-treonin kinazom.

11. Upotreba prema zahtevu 9 ili 10, gde je poremećaj povezan sa protein- kinazom odabran iz grupe koju čine poremećaji povezani sa EGFR, PDGFR poremećaji povezani sa IGFR i poremećaji povezani sa flk.

12. Upotreba prema jednom od zahteva 9 do 11, gde je poremećaj povezan sa protein-kinazom, je kancer odabran iz grupe koju čine: karcinom skvamoznih ćelija, astrocitom, Kapošijev sarkom, glioblastom, rak pluća, rak bešike, rak glave i vrata, melanom, rak jajnika, rak prostate, rak dojke, rak malih ćelija pluća, gliom, kolorektalni kancer, genitournarni kancer i gastrointstinalni kancer.

13. Upotreba prema jednom od zahteva 9 do 11, gde je poremećaj koji je povezan sa protein-kinazom odabran iz grupe koju čine: dijabetes, autoimuni poremećaj, hiperproliferativni poremećaj, restenoza, fibroza, psorijaza, bolesti fon Heppel-Lindau-a, osteoartritis, reumatoidni artritis, angiogeneza, inflamatorni poremećaj, imunološki poremećaj i kardiovaskularni poremećaj.

14. Upotreba prema jednom od zahteva 9 do 13, gde je organizam, čovek.