JP3677501B2 - 蛋白質キナーゼ阻害剤としての３−（４−アミドピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体 - Google Patents

蛋白質キナーゼ阻害剤としての３−（４−アミドピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体 Download PDF

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Description

優先権主張の基礎となる出願
本出願は，米国特許仮出願６０／３１２，３６１（２００１年８月１５日出願）および６０／２６８，６８３（２００１年２月１５日出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願の全内容を本明細書の一部としてここに引用する。
発明の分野
本発明は，蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）の活性を調節するある種の３−（４−アミドピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体に関する。したがって，本発明の化合物は，異常なＰＫ活性に関連する疾患の治療に有用である。これらの化合物を含む医薬組成物，これらの化合物を含む医薬組成物を用いて疾病を治療する方法，およびこれらを製造する方法も開示される。
ＰＫは，蛋白質のチロシン，セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシ基のリン酸化を触媒する酵素である。この外観上は単純な活性の結果は圧倒的である。細胞成長，分化および増殖，すなわち，細胞生命のほぼすべての観点が種々の仕方でＰＫ活性に依存する。さらに，異常なＰＫ活性は，比較的生命を脅かさない疾患（例えば乾癬）から，非常に悪性の疾患（例えば神経膠細胞腫（脳癌））までの範囲の疾患の宿主と関連づけられてきた。
ＰＫは，慣用的に２種類に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。
ＰＴＫ活性の主な観点の１つは，成長因子レセプターに対するその関与である。成長因子レセプターは細胞表面蛋白質である。成長因子リガンドが結合すると，成長因子レセプターは活性型に変換され，これが細胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用する。この相互作用は，レセプターおよび他の蛋白質のチロシン残基のリン酸化を引き起こし，細胞内部で種々の細胞質シグナリング分子との複合体を形成する。次にこれらの複合体は多くの細胞性応答，例えば，細胞分裂（増殖），細胞分化，細胞成長，細胞外微細環境への代謝的効果の発現等を行う。さらに詳しい議論については，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，９：３０３−３９１，１９９２（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。
ＰＫ活性を有する成長因子レセプターは，レセプターチロシンキナーゼ（"ＲＴＫ"）として知られている。これらは，多様な生物学的活性を有する貫膜レセプターの大きなファミリーを含む。現在のところ，ＲＴＫの少なくとも１９個の異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は，"ＨＥＲ"ＲＴＫと称されるサブファミリーであり，これにはＥＧＦＲ（上皮成長因子レセプター），ＨＥＲ２，ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。これらのＲＴＫは，細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン，貫膜ドメイン，および蛋白質上のチロシン残基をリン酸化しうる細胞内細胞質触媒ドメインから構成される。
別のＲＴＫサブファミリーは，インスリンレセプター（ＩＲ），インスリン様成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリンレセプター関連レセプター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒはインスリン，ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと相互作用して，２つの完全に細胞外のグリコシル化されたαサブユニットと，細胞膜を横断しチロシンキナーゼドメインを含有する２つのβサブユニットのヘテロ４量体を形成する。
第３のＲＴＫサブファミリーは，血小板由来成長因子レセプター（"ＰＤＧＦＲ"）群と称され，これにはＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，ｃ−ｋｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。これらのレセプターは，可変数のイムノグロビン様ループからなるグリコシル化された細胞外ドメイン，およびチロシンキナーゼドメインが関連のないアミノ酸配列により分断されている細胞内ドメインから構成される。
別の群は，そのＰＤＧＦＲサブファミリーとの類似性のため，しばしばＰＤＧＦＲサブファミリーに包摂される，胎児肝キナーゼ（"ｆｌｋ"）レセプターサブファミリーである。この群は，キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎児肝キナーゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１，ＶＥＧＦ−Ｒ２），ｆｌｋ−１Ｒ，ｆｌｋ−４およびｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。
チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別のメンバーは，繊維芽細胞成長因子（"ＦＧＦ"）レセプターサブグループである。この群は，４つのレセプター，ＦＧＦＲ１−４，および７つのリガンド，ＦＧＦ１−７から構成される。まだあまり明確にされていないが，レセプターは，可変数のイムノグロビン様ループを含有するグリコシル化された細胞外ドメイン，およびチロシンキナーゼ配列が関係のないアミノ酸配列の領域により分断されている細胞内ドメインから構成されるようである。
チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーのさらに別のメンバーは血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ"）レセプターサブグループである。ＶＥＧＦは，ＰＤＧＦに類似する二量体の糖蛋白質であるが，異なる生物学的機能およびインビボでの標的細胞特異性を有する。特に，ＶＥＧＦは，現在，脈管形成および新脈管形成において必須の役割を果たすと考えられている。
既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
ＲＴＫに加え，"非レセプターチロシンキナーゼ"または"細胞性チロシンキナーゼと称される，完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書においては"ＣＴＫ"と略されるこの後者の定義を用いる。ＣＴＫは細胞外および貫膜ドメインを含有しない。現在のところ，１１個のサブファミリー（Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，Ｚａｐ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，ＪａｋおよびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサブファミリーは，これまでのところ，ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであり，Ｓｒｃ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋを含む。ＣＴＫのより詳細な議論については，Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２０２３−２０３１（１９９３）（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。
セリン／トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは，ＣＴＫと同様に，主として細胞内にあるが，ＳＴＫタイプのレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも一般的なサイトゾルキナーゼである。すなわち，細胞質オルガネラおよび細胞骨格以外の，細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは，細胞の中間代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例えば，蛋白質がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。
ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて，病原性状態，特に癌を含む状態の宿主であることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の病原性状態には，限定されないが，乾癬，肝硬変，糖尿病，動脈硬化，新脈管形成，再狭窄，眼性疾患，慢性関節リウマチおよび他の炎症性疾患，自己免疫疾患等の免疫疾患，アテローム性動脈硬化等の心臓血管疾患，および種々の腎臓疾患が含まれる。
癌に関しては，腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の２つは，ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち，悪性細胞成長は細胞分裂および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は，細胞成長および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これらのプロトオンコジンの蛋白質産物には，上で議論した，細胞外成長因子，貫膜成長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ），細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾルＳＴＫが含まれる。
ＰＫに関連する細胞活性と広範な種類のヒト疾患との間の見かけ上の連結の観点から，ＰＫ活性を調節する方法を同定しようとする試みに多大な努力が払われていることは驚くべきことではない。これらのいくつかには，実際の細胞プロセスに関与する分子を模倣する大きな分子を用いるバイオミメティック方法が含まれる（例えば，変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプターおよび抗体（ＷＯ９４／１０２０２，Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：１０７０５−０９（１９９４），Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４１−８４４（１９９３））；ＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１０４５０−５６）；Ｔａｋａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ，４：３５８Ａ（１９９３）；Ｋｉｎｓｅｌｌａ， ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９：５６６−６２（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ．，１５２：４４８−５７）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；ＷＯ９１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍａｒｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：２２６８（１９９４））。
上述に加え，ＰＫ阻害剤として作用する小分子を同定する試みがなされている。例えば，ビス単環，二環およびヘテロ環アリール化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２），ビニレンアザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８）および１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン類（米国特許５，３３０，９９２）が，チロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），キナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１），セレナインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７），三環ポリヒドロキシル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０）およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）はすべて，癌の治療において有用なＰＴＫ阻害剤として記載されている。
本発明は，ＰＫ調節能力を示し，したがって異常なＰＫ活性に関連する疾患の治療に有用な，ある種の３−（４−アミドピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体に関する。
本発明の１つの態様は，式（Ｉ）：
Figure 0003677501
 ［式中，
Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，ハロアルコキシ，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；
Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され；
Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシ，およびアリールオキシからなる群より選択され；
Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
Ｒ9およびＲ10は，一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキル，ヒドロキシアルキル，およびアリールからなる群より選択され；またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し；
Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される］
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
別の態様は，
Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；
Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され；
Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシ，およびアリールオキシからなる群より選択され；
Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
Ｒ9およびＲ10は，一緒になってヘテロシクロ基を形成し；
Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキルおよびアリールからなる群より選択され，またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される，
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
別の態様は，式（Ｉａ）：
Figure 0003677501
 ［式中，
Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；
Ｒ2は，フルオロであり，これはインドリノン環の５位に存在し；
Ｚはモルホリン−４−イルであり；
Ｒ6およびＲ7はメチルである］
の化合物である。
好ましくは，＊Ｃの立体化学は（Ｓ）である。
別の態様は，式（ＩＩ）：
Figure 0003677501
 ［式中，
Ｒは，水素またはアルキルであり；
Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，ハロアルコキシ，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；
Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され；
Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシ，およびアリールオキシからなる群より選択され；
Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
Ｒ9およびＲ10は，一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキル，ヒドロキシアルキル，およびアリールからなる群より選択され；またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し；
Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される］
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
別の態様は，式Ｉ，Ｉａ，またはＩＩの化合物または塩および薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
別の態様は，蛋白質キナーゼを式Ｉ，Ｉａ，またはＩＩの化合物または塩と接触させることを含む，蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する方法である。この方法のための蛋白質キナーゼは，レセプターチロシンキナーゼ，非レセプターチロシンキナーゼおよびセリン−トレオニンキナーゼでありうる。
別の態様は，式Ｉ，Ｉａ，またはＩＩの化合物または塩および薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む治療上有効量の医薬組成物を生物に投与することを含む，生物において蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法である。この方法のための蛋白質キナーゼは，レセプターチロシンキナーゼ，非レセプターチロシンキナーゼおよびセリン−トレオニンキナーゼでありうる。蛋白質キナーゼ関連疾患は，ＥＧＦＲ関連疾患，ＰＤＧＦＲ関連疾患，ＩＧＦＲ関連疾患およびｆｌｋ関連疾患でありうる。蛋白質キナーゼ疾患はまた，扁平上皮癌，星状細胞腫，カポジ肉腫，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭頚部癌，黒色腫，卵巣癌，前立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，神経膠腫，結腸直腸癌，尿生殖器癌および胃腸癌でありうる。さらに，蛋白質キナーゼ疾患はまた，糖尿病，自己免疫疾患，過増殖性疾患，再狭窄，繊維症，乾癬，フォン・ヒッペル・リンダウ症候群，変形性関節症，慢性関節リウマチ，新脈管形成，炎症性疾患，免疫学的疾患および心臓血管疾患でありうる。これらの方法は，ヒトを治療するために用いることができる。
別の態様においては，本発明は，式（Ｉ）の化合物を製造する方法に関する。
さらに，本発明はまた，蛋白質キナーゼを発現する細胞を本発明の化合物または塩と接触させ，次に影響について細胞をモニターすることにより，蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する化学化合物を同定することに関する。
定義
特に記載しない限り，明細書および特許請求の範囲において用いられる以下の用語は，以下に議論される意味を有する。
"アルキル"とは，直鎖または分枝鎖の１−２０個の炭素原子を含む飽和脂肪族炭化水素ラジカルを表す（本明細書において数値範囲，例えば"１−２０"と記載される場合，これはその基（この場合はアルキル基）が，１個の炭素原子，２個の炭素原子，３個の炭素原子，以下同様に，２０個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する）。より好ましくは，アルキル基は，１−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキル，例えば，メチル，エチル，プロピル，２−プロピル，ｎ−ブチル，イソブチル，ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル等である。最も好ましくは，これは１−４個の炭素原子を有する低級アルキル，例えば，メチル，エチル，プロピル，２−プロピル，ｎ−ブチル，イソブチル，またはｔｅｒｔ−ブチル等である。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロ，ヒドロキシ，低級アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式，Ｃ（Ｏ）Ｒ8，ＮＲ9Ｒ10，およびＣ（Ｏ）ＮＲ9Ｒ10である。
"シクロアルキル"とは，３−８員の全炭素単環，全炭素５員／６員または６員／６員の縮合二環または多環縮合環（"縮合"環系とは，系の各環が系の他の環と隣接する１対の炭素原子を互いに共有することを意味する）基を表し，ここで，１またはそれ以上の環は１またはそれ以上の二重結合を含んでいてもよいが，いずれの環も完全に共役したパイ電子系を有しない。シクロアルキル基の例は，限定されないが，シクロプロパン，シクロブタン，シクロペンタン，シクロペンテン，シクロヘキサン，シクロヘキサジエン，アダマンタン，シクロヘプタン，シクロヘプタトリエン等である。シクロアルキル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，低級アルキル，トリハロアルキル，ハロ，ヒドロキシ，低級アルコキシ，アリール（互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている），アリールオキシ（互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている），環中に１−３個の窒素原子を有し，環中の炭素が互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている６員のヘテロアリール，窒素，酸素およびイオウからなる群より選択される１−３個の複素原子を有し，基の炭素および窒素原子が互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている５員のヘテロアリール，窒素，酸素およびイオウからなる群より選択される１−３個の複素原子を有し，基の炭素および窒素（存在する場合には）原子が互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている５員または６員のヘテロ脂環式基，メルカプト，（低級アルキル）チオ，アリールチオ（互いに独立して，ハロ，ヒドロキシ，低級アルキルまたは低級アルコキシ基の１またはそれ以上，好ましくは１または２個の基で任意に置換されている），シアノ，アシル，チオアシル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，Ｎ−スルホンアミド，Ｓ−スルホンアミド，Ｒ9Ｓ（Ｏ）−，Ｒ9Ｓ（Ｏ）2−，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ9，Ｒ9Ｃ（Ｏ）Ｏ−，および−ＮＲ9Ｒ10（上で定義したとおりである）からなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，より好ましくは１または２個の置換基である。
"アルケニル"基とは，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合から構成される，本明細書において定義されるアルキル基を表す。代表的例には，限定されないが，エテニル，１−プロペニル，２−プロペニル，１−，２−，または３−ブテニル等が含まれる。
"アルキニル"基とは，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合から構成される，本明細書において定義されるアルキル基を表す。代表的例には，限定されないが，エチニル，１−プロピニル，２−プロピニル，１−，２−，または３−ブチニル等が含まれる。
"アリール"とは，完全に共役したパイ電子系を有する，１−１２個の炭素原子を有する，全炭素単環または縮合多環（すなわち，隣接する炭素原子対を共有する環）基を表す。アリール基の例としては，限定されないが，フェニル，ナフタレニルおよびアントラセニルが挙げられる。アリール基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合には，置換基は，好ましくは，低級アルキル，トリハロアルキル，ハロ，ヒドロキシ，低級アルコキシ，メルカプト，（低級アルキル）チオ，シアノ，アシル，チオアシル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，Ｎ−スルホンアミド，Ｓ−スルホンアミド，Ｒ9Ｓ（Ｏ）−，Ｒ9Ｓ（Ｏ）2−，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ9，Ｒ9Ｃ（Ｏ）Ｏ−，および−ＮＲ9Ｒ10（Ｒ9およびＲ10は上で定義したとおりである）からなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，より好ましくは１，２または３個，さらにより好ましくは１または２個の基である。好ましくは，アリール基は，ハロ，低級アルキル，トリハロアルキル，ヒドロキシ，メルカプト，シアノ，Ｎ−アミド，モノまたはジアルキルアミノ，カルボキシ，またはＮ−スルホンアミドから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されている。
"ヘテロアリール"とは，Ｎ，Ｏ，またはＳから選択される１，２，３または４個の環複素原子を含み，残りの環原子がＣであり，かつ，完全に共役したパイ電子系を有する，５−１２個の環原子の単環式または縮合環（すなわち，隣接する１対の原子を共有する複数の環）を表す。未置換ヘテロアリール基の例には，限定されないが，ピロール，フラン，チオフェン，イミダゾール，オキサゾール，チアゾール，ピラゾール，ピリジン，ピリミジン，キノリン，イソキノリン，プリン，テトラゾール，トリアジンおよびカルバゾールが含まれる。ヘテロアリール基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，低級アルキル，トリハロアルキル，ハロ，ヒドロキシ，低級アルコキシ，メルカプト，（低級アルキル）チオ，シアノ，アシル，チオアシル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，Ｎ−スルホンアミド，Ｓ−スルホンアミド，Ｒ9Ｓ（Ｏ）−，Ｒ9Ｓ（Ｏ）2−，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ9，Ｒ9Ｃ（Ｏ）Ｏ−，および−ＮＲ9Ｒ10（Ｒ9およびＲ10は上で定義したとおりである）からなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，より好ましくは１，２または３個の，さらにより好ましくは１または２個の基である。好ましくは，ヘテロアリール基は，ハロ，低級アルキル，トリハロアルキル，ヒドロキシ，メルカプト，シアノ，Ｎ−アミド，モノまたはジアルキルアミノ，カルボキシ，またはＮ−スルホンアミドから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されている。
"ヘテロ脂環式"とは，５−９個の環原子を有し，１または２個の環原子がＮ，Ｏ，またはＳ（Ｏ）n（ｎは０−２の整数）から選択される複素原子であり，残りの環原子がＣである，単環または縮合環基を表す。環はさらに１またはそれ以上の二重結合を有していてもよい。しかし，環は完全に共役したパイ電子系を有しない。未置換ヘテロ脂環式基の例には，限定されないが，ピロリジノ，ピペリジノ，ピペラジノ，モルホリノ，チオモルホリノ，ホモピペラジノ等が含まれる。ヘテロ脂環式環は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，低級アルキル，トリハロアルキル，ハロ，ヒドロキシ，低級アルコキシ，メルカプト，（低級アルキル）チオ，シアノ，アシル，チオアシル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，Ｎ−スルホンアミド，Ｓ−スルホンアミド，Ｒ9Ｓ（Ｏ）−，Ｒ9Ｓ（Ｏ）2−，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ9，Ｒ9Ｃ（Ｏ）Ｏ−，および−ＮＲ9Ｒ10（Ｒ9およびＲ10は上で定義したとおりである）からなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，より好ましくは１，２または３個，さらにより好ましくは１または２個の基である。好ましくは，ヘテロ脂環式基は，ハロ，低級アルキル，トリハロアルキル，ヒドロキシ，メルカプト，シアノ，Ｎ−アミド，モノまたはジアルキルアミノ，カルボキシ，またはＮ−スルホンアミドから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されている。
"複素環"とは，３−８個の環原子を有する飽和環状ラジカルを意味し，ここで，１または２個の環原子はＮ，Ｏ，またはＳ（Ｏ）n（ｎは０−２の整数である）から選択される複素原子であり，残りの環原子はＣであり，ここで，１または２個のＣ原子は任意にカルボニル基で置き換えられていてもよい。複素環は，独立して，カルボキシまたはエステルから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されている低級アルキル，ハロアルキル，シアノアルキル，ハロ，ニトロ，シアノ，ヒドロキシ，アルコキシ，アミノ，モノアルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アラルキル，ヘテロアラルキル，−ＣＯＲ（Ｒはアルキルである）から選択される１，２または３個の置換基で任意に置換されていてもよい。より詳細には，複素環との用語には，限定されないが，テトラヒドロピラニル，２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン，ピペリジノ，Ｎ−メチルピペリジン−３−イル，ピペラジノ，Ｎ−メチルピロリジン−３−イル，ピロリジノ，モルホリノ，チオモルホリノ，チオモルホリノ−１−オキシド，チオモルホリノ−１，１−ジオキシド，４−エチルオキシカルボニルピペラジノ，３−オキソピペラジノ，２−イミダゾリドン，２−ピロリジノン，２−オキソホモピペラジノ，テトラヒドロピリミジン−２−オン，およびその誘導体が含まれる。好ましくは，複素環基は，ハロ，低級アルキル，およびカルボキシ，エステルヒドロキシ，モノまたはジアルキルアミノで置換されている低級アルキルから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されていてもよい。
"ヘテロシクロアミノ"とは，３−８個の環原子を有し，環原子の少なくとも１つが窒素であり，さらに任意に１または２個の環原子がＮ，Ｏ，またはＳ（Ｏ）ｎ（ｎは０−２の整数である）からなる群より選択される複素原子であり，残りの環原子が炭素である飽和環状ラジカルを意味し，ここで，１または２個のＣ原子は，任意にカルボニル基により置き換えられていてもよい。ヘテロシクロアミノ環は，カルボキシまたはエステル基から独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換されていてもよい低級アルキル，ハロアルキル，シアノアルキル，ハロ，ニトロ，シアノ，ヒドロキシ，アルコキシ，アミノ，モノアルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アラルキル，ヘテロアラルキル，および−ＣＯＲ（Ｒはアルキルである）からなる群より選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい。より詳細には，ヘテロシクロアミノとの用語には，限定されないが，ピペリジン−１−イル，ピペラジン−１−イル，ピロリジン−１−イル，モルホリン−４−イル，チオモルホリン−４−イル，チオモルホリノ−１−オキシド，チオモルホリノ−１，１−ジオキシド，４−エチルオキシカルボニルピペラジン−１−イル，３−オキソピペラジン−１−イル，２−イミダゾリドン−１−イル，２−ピロリジノン−１−イル，２−オキソホモピペラジノ，テトラヒドロピリミジン−２−オン，およびその誘導体が含まれる。好ましくは，複素環基は，独立して，ハロ，低級アルキル，カルボキシまたはエステルで置換されている低級アルキル，ヒドロキシ，またはモノまたはジアルキルアミノから選択される１または２個の置換基で任意に置換されていてもよい。ヘテロシクロアミノ基は上で定義した複素環の部分集合である。
"ヒドロキシ"とは−ＯＨ基を表す。
"アルコキシ"とは，−Ｏ−（アルキル）および−Ｏ−（未置換シクロアルキル）基の両方を表す。代表例には，限定されないが，例えば，メトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキシ，シクロプロピルオキシ，シクロブチルオキシ，シクロペンチルオキシ，シクロヘキシルオキシ等が含まれる。
"ハロアルコキシ"とは，−Ｏ−（ハロアルキル）基を表す。代表例には，限定されないが，トリフルオロメトキシ，トリブロモメトキシ等が含まれる。
"アリールオキシ"とは，本明細書において定義される−Ｏ−アリールおよび−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を表す。代表的例には，限定されないが，フェノキシ，ピリジニルオキシ，フラニルオキシ，チエニルオキシ，ピリミジニルオキシ，ピラジニルオキシ等，およびその誘導体が含まれる。
"メルカプト"とは，−ＳＨ基を表す。
"アルキルチオ"とは，−Ｓ−（アルキル）および−Ｓ−（未置換シクロアルキル）基の両方を表す。代表的例には，限定されないが，例えば，メチルチオ，エチルチオ，プロピルチオ，ブチルチオ，シクロプロピルチオ，シクロブチルチオ，シクロペンチルチオ，シクロヘキシルチオ等が含まれる。
"アリールチオ"とは，本明細書において定義される−Ｓ−アリールおよび−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を表す。代表的例には，限定されないが，フェニルチオ，ピリジニルチオ，フラニルチオ，チエニルチオ，ピリミジニルチオ等，およびその誘導体が含まれる。
"アシル"とは，−Ｃ（Ｏ）−Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は，水素；低級アルキル；トリハロメチル；未置換シクロアルキル；低級アルキル，トリハロメチル，低級アルコキシ，ハロおよび−ＮＲ9Ｒ10基からなる群より選択される１またはそれ以上の，好ましくは１，２または３個の置換基で任意に置換されていてもよいアリール；低級アルキル，トリハロアルキル，アルコキシ，ハロおよび−ＮＲ9Ｒ10基からなる群より選択される１またはそれ以上の，好ましくは１，２または３個の置換基で任意に置換されていてもよいヘテロアリール（環炭素を介して結合）；および低級アルキル，トリハロアルキル，低級アルコキシ，ハロおよび−ＮＲ9Ｒ10基からなる群より選択される１またはそれ以上の，好ましくは１，２または３個の置換基で任意に置換されていてもよいヘテロ脂環式（環炭素を介して結合）からなる群より選択される。代表的なアシル基には，限定されないが，アセチル，トリフルオロアセチル，ベンゾイル等が含まれる。
"アルデヒド"とは，Ｒ"が水素であるアシル基を表す。
"チオアシル"とは，−Ｃ（Ｓ）−Ｒ"基を表し，Ｒ"は本明細書において定義されるとおりである。
"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ"基を表し，Ｒ"は本明細書において定義されるとおりであるが，ただし，Ｒ"は水素ではありえない。
"アセチル"基とは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3基を表す。
"ハロ"基は，フッ素，塩素，臭素またはヨウ素を表し，好ましくはフッ素または塩素を表す。
"トリハロメチル"基とは，−ＣＸ3基を表し，ここで，Ｘは，本明細書において定義されるハロ基である。
"トリハロメタンスルホニル"基とは，Ｘ3ＣＳ（＝Ｏ）2−基を表し，ここでＸは上で定義したとおりである。
"シアノ"基とは−Ｃ≡Ｎ基を表す。
"Ｓ−スルホンアミド"とは，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｎ−スルホンアミド"とは，−ＮＲ9Ｓ（Ｏ）2Ｒ10基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｏ−カルバミル"基とは，−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13基を表し，Ｒ12およびＲ13は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｎ−カルバミル"とは，Ｒ9ＯＣ（Ｏ）ＮＲ10−基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｏ−チオカルバミル"とは，−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ12Ｒ13基を表し，Ｒ12およびＲ13は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｎ−チオカルバミル"とは，Ｒ9ＯＣ（Ｓ）ＮＲ10−基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"アミノ"とは，Ｒ9およびＲ10が両方とも水素である−ＮＲ9Ｒ10を表す。
"Ｃ−アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）ＮＲ9Ｒ10基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"Ｎ−アミド"とは，Ｒ9Ｃ（Ｏ）ＮＲ10−基を表し，Ｒ9およびＲ10は本明細書において定義されるとおりである。
"ニトロ"とは，−ＮＯ2基を表す。
"ハロアルキル"とは，１またはそれ以上の同じまたは異なるハロ原子で置換された上述したアルキル，好ましくは低級アルキルを意味し，例えば，−ＣＨ2Ｃｌ，−ＣＦ3，−ＣＨ2ＣＦ3，−ＣＨ2ＣＣｌ3等である。
"ヒドロキシアルキル"とは，１，２，または３個のヒドロキシ基で置換された上で定義したアルキル，好ましくは低級アルキルを意味し，例えば，ヒドロキシメチル，１または２−ヒドロキシエチル，１，２−，１，３−，または２，３−ジヒドロキシプロピル等である。
"アラルキル"とは，上で定義したアリール基で置換されている，上で定義したアルキル，好ましくは低級アルキルを意味し，例えば，−ＣＨ2フェニル，−（ＣＨ2）2フェニル，−（ＣＨ2）3フェニル，ＣＨ3ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2フェニル等，およびその誘導体である。
"ヘテロアラルキル"基とは，ヘテロアリール基で置換されている，上で定義したアルキル，好ましくは低級アルキルを意味し，例えば，−ＣＨ2ピリジニル，−（ＣＨ2）2ピリミジニル，−（ＣＨ2）3イミダゾリル等，およびその誘導体である。
"モノアルキルアミノ"とは，ラジカル−ＮＨＲ（Ｒは上で定義したアルキルまたは未置換シクロアルキル基である）を意味し，例えば，メチルアミノ，（１−メチルエチル）アミノ，シクロヘキシルアミノ等である。
"ジアルキルアミノ"とは，ラジカル−ＮＲＲ（各Ｒは，独立して，上で定義したアルキルまたは未置換シクロアルキル基である）を意味し，例えば，ジメチルアミノ，ジエチルアミノ，（１−メチルエチル）−エチルアミノ，シクロヘキシルメチルアミノ，シクロペンチルメチルアミノ等である。
"任意"または"任意に"とは，その後に記載される事象または状況が生じてもよいが生じる必要はないこと，およびその記述がその事象または状況が生ずる場合と生じない場合とを含むことを意味する。例えば，"アルキル基で任意に置換されている複素環基"とは，アルキルが存在してもよいが存在する必要はないこと，およびその記述が複素環基がアルキル基で置換されている状況と複素環基がアルキル基で置換されていない状況とを含むことを意味する。
"２−インドリノン"，"インドリン−２−オン"および"２−オキシインドール"との用語は，化学構造：
Figure 0003677501
 を有する分子を表すために本明細書において互換的に用いられる。
"ピロール"との用語は，化学構造：
Figure 0003677501
 を有する分子を表す。
同じ分子式を有するが，その原子の結合の種類または順序またはその原子の空間の配置が異なる化合物は，"異性体"と称される。その原子の空間の配置が異なる異性体は，"立体異性体"と称される。互いに鏡像ではない立体異性体は，"ジアステレオマー"と称され，互いに重ね合わせられない鏡像であるものは"エナンチオマー"と称される。化合物が不斉中心を有する場合，例えば，これが４つの異なる基と結合している場合，１対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは，その不斉中心の絶対コンフィギュレーションにより特徴づけることができ，ＣａｈｎおよびＰｒｅｌｏｇのＲ−およびＳ−の順序規則により，または分子が偏光平面のまわりに回転して，右旋性または左旋性として（すなわち，それぞれ（＋）または（−）−異性体として）示されることにより記述される。キラル化合物は個々のエナンチオマーとして，またはそれらの混合物として存在しうる。同じ割合のエナンチオマーを含む混合物は"ラセミ混合物"と称される。
本発明の化合物は，１またはそれ以上の不斉中心を有するかもしれない。したがって，そのような化合物は，個々の（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として，またはそれらの混合物として製造することができる。例えば，式（Ｉ）の化合物において，−ＣＯＮＨＣＨＲ3−ＣＲ4（ＯＨ）ＣＲ5Ｚ中の，ヒドロキシ基を有する炭素原子は不斉中心であり，したがって，式（Ｉ）の化合物は（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として存在しうる。特に記載しない限り，本明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の記述または命名は，個々のエナンチオマーおよびその混合物（ラセミまたはそれ以外）の両方を含むことが意図される。立体異性体の立体化学の決定および分離の方法は当該技術分野においてよく知られている（"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２の第４節の考察を参照）。
式（Ｉ）の化合物は，互変異性および構造的異性の現象を示すかもしれない。例えば，本明細書に記載される化合物は，２−インドリノン成分をピロール成分につなぐ二重結合のまわりにＥまたはＺコンフィギュレーションをとることができるか，またはＥおよびＺの混合物でありうる。本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫ活性を調節する能力を有するすべての互変異性および構造的異性型およびそれらの混合物を包含し，特定の１つの互変異性および構造的異性型に限定されない。
"医薬組成物"とは，本明細書に記載される１またはそれ以上の化合物またはその生理学的に／薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグと，他の化学成分，例えば，生理学的に／薬学的に許容しうる担体および賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は，化合物の生物への投与を容易にすることである。
式（Ｉ）の化合物はまたプロドラッグとしても作用することができる。"プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に変換される薬剤を表す。プロドラッグは，場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが，親薬剤はそうではない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定されないが，エステル（"プロドラッグ"）として投与されて，水溶性であることが移動に不利である細胞膜の通過を容易にし，次に，水溶性であることが有利である細胞内に入った後，代謝的に加水分解されて活性種のカルボン酸となるような，本発明の化合物であろう。
プロドラッグのさらに別の例は，短いポリペプチド，例えば，限定されないが，末端アミノ基を介して本発明の化合物のカルボキシ基に結合した２−１０アミノ酸のポリペプチドであり，ポリペプチドはインビボで加水分解されるかまたは代謝されて活性分子を放出する。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは本発明の範囲内である。
さらに，式（Ｉ）の化合物が生物，例えばヒトの体内で酵素により代謝されて，代謝産物を生成し，これが蛋白質キナーゼの活性を調節しうることが企図される。そのような代謝産物は本発明の範囲内である。
本明細書において用いる場合，"生理学的に／薬学的に許容しうる担体"とは，生物に有意な刺激を引き起こさず，投与された化合物の生物学的活性および特性を排除しない担体または希釈剤を表す。
"薬学的に許容しうる賦形剤"とは，医薬組成物に添加して化合物の投与をさらに容易にする不活性物質を表す。賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖および各種のデンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる塩"との用語は，親化合物の生物学的効力および特性を保持している塩を表す。そのような塩には，以下のものが含まれる：（ｉ）親化合物の遊離塩基を，例えば塩酸，臭化水素酸，硝酸，リン酸，硫酸，および過塩素酸等の無機酸と，または酢酸，シュウ酸，（Ｄ）または（Ｌ）リンゴ酸，マレイン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，サリチル酸，酒石酸，クエン酸，コハク酸またはマロン酸等の有機酸と，好ましくは，塩酸または（Ｌ）−リンゴ酸と反応させることにより得られる酸付加塩；または（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが，金属イオン，例えば，アルカリ金属イオン，アルカリ土類金属イオン，またはアルミニウムイオンで置き換えられるか，または有機塩基，例えばエタノールアミン，ジエタノールアミン，トリエタノールアミン，トロメタミン，Ｎ−メチルグルカミン等と配位することにより形成される塩。
"ＰＫ"とは，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプターまたは"細胞性"チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリントレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）を表す。
"方法"とは，所与の作業を遂行するための様式，手段，技術，および手順を表し，限定されないが，化学，薬理学，生物学，生化学，および医学的技術の従業者には周知の，あるいは既に該従業者によって既知の様式，手段，技術，および手順から容易に開発される様式，手段，技術，および手順を含む。
"調節"または"調節する"とは，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が変化することを表す。特に，調節するとはＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化されることを表し，好ましくは，ＲＴＫ，ＣＴＫまたはＳＴＫが暴露される化合物または塩の濃度に依存してＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化または阻害され，またはより好ましくは，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が阻害されることを表す。
"触媒活性"とは，ＲＴＫおよび／またはＣＴＫの直接的または間接的な影響下におけるチロシンのリン酸化の速度，またはＳＴＫの直接的または間接的な影響下におけるセリンおよびトレオニンのリン酸化の速度を表す。
"接触させる"とは，本発明の化合物と標的ＰＫとを，当該化合物がＰＫの触媒活性を直接に，すなわちキナーゼ自体と相互作用することによるか，または間接に，すなわち当該キナーゼの触媒活性が依存している別の分子と相互作用することにより，影響することが可能な様式で一緒に合わせることを表す。このような"接触させる"ことは，インビトロで，すなわち試験管，ペトリ皿等において行うことができる。試験管内では，接触させることは，化合物と目的とするＰＫのみが関与してもよく，あるいは全細胞が関与してもよい。細胞は培養皿中で維持または成長させ，その環境において化合物と接触させることができる。この文脈においては，特定の化合物がＰＫ関連疾患に影響を及ぼす能力，すなわち当該化合物のＩＣ50（以下に定義される）を，より複雑な生体を用いてのインビボでの使用を試みる前に測定することが可能である。生体の外の細胞については，ＰＫを当該化合物と接触させるための多様な方法が存在し，かつ当業者には周知であり，例えば，限定されないが，直接の細胞マイクロインジェクションおよび多数の貫膜担体技術を含む。
"インビトロ"とは，人工的環境，例えば，限定されないが，試験管または培養培地中で行われる手順を表す。
"インビボ"とは，生きている生物，例えば，限定されないが，マウス，ラットまたはウサギの中で行われる手順を表す。
"ＰＫ関連疾患"，"ＰＫ推進性疾患"，および"異常なＰＫ活性"とは，すべて不適切な，すなわち不完全な，あるいはより一般的には過剰な，ＰＫ触媒活性によって特徴づけられる状態を表し，ここで特定のＰＫはＲＴＫ，ＣＴＫ，またはＳＴＫでありうる。不適切な触媒活性は；（１）正常にはＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現，（２）望ましくない細胞増殖，分化および／または成長に導くＰＫ発現の増加，または（３）細胞増殖，分化および／または成長の望ましくない減少に導くＰＫ発現の減少，のいずれかの結果として生じることができる。ＰＫの過剰な活性は，細胞増殖，分化および／または成長と相関しうる，特定のＰＫをコードしている遺伝子の増幅またはあるレベルのＰＫ活性の産生を表す（すなわち，ＰＫのレベルが増加すると，細胞性障害による１またはそれ以上の症状の激しさが増す）。低い活性は，もちろんその逆であり，ＰＫ活性のレベルが低下すると，細胞性障害による１またはそれ以上の症状の激しさが増加する。
"治療する"，"治療すること"または"治療"とは，ＰＫ媒介性細胞疾患および／またはその付随する症状を軽減または排除することを表す。特に癌に関しては，これらの用語は単に，癌に罹患した個体の予測生存率が増加するか，または疾病の１またはそれ以上の症状が軽減することを意味する。
"生物"との用語は少なくとも１つの細胞からなる任意の生きているものを表す。生物は，１つの真核生物細胞程度の単純なものであってもよく，ヒトを含む哺乳動物等の複雑なものであってもよい。
"治療上有効量"とは，治療される疾患の１またはそれ以上の症状をある程度緩和するであろう，投与される化合物の量を表す。癌の治療に関しては，治療上有効量は，（１）腫瘍の大きさを減少させる，（２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停止する），（３）腫瘍の成長をある程度阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停止する），および／または（４）癌に関連した１またはそれ以上の症状をある程度緩和する（または，好ましくは除去する）という効果を有する量を表す。
"モニターする"とは，化合物を特定のＰＫを発現する細胞と接触させる影響を観察または検出することを意味する。観察されるまたは検出される影響は，細胞表現型の変化，ＰＫの触媒活性，またはＰＫと天然の結合パートナーとの相互作用の変化でありうる。そのような影響を観察または検出する手法は当該技術分野においてよく知られている。
本発明の最後の観点において，上述の影響は，細胞表現型の変化または無変化，前記蛋白質キナーゼの触媒活性の変化または無変化，または前記蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの相互作用の変化または無変化から選択される。
"細胞表現型"との用語は，細胞もしくは組織の外観または細胞もしくは組織の機能を表す。細胞表現型の例は，細胞サイズ，細胞増殖，細胞分化，細胞生存，アポトーシス，および栄養の取り込みおよび利用である。そのような細胞表現型の特徴は，当該技術分野においてよく知られる手法により容易に測定することができる。
"天然の結合パートナー"とは，細胞内で特定のＰＫに結合するポリペプチドを表す。天然の結合パートナーは，ＰＫ媒介性シグナル伝達プロセスにおいてシグナルを伝播する役割を果たすことができる。天然の結合パートナーとＰＫとの相互作用の変化は，ＰＫ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として，およびその結果，ＰＫがシグナル伝達を媒介する能力の観察可能な変化として現れることができる。
本発明の代表的化合物は以下の表１ａに示される。
表１ａ
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本発明の別の代表的化合物は以下の表１ｂに示される。
表１ｂ
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本発明の別の代表的化合物は以下の表１ｃに示される。
表１ｃ
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表１ａ−１ｃに示される化合物は例示のためのみのものであり，いかなる意味においても本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
好ましい態様
発明の概要においては最も広い定義を記載したが，以下に記載されるある種の式（Ｉ）の化合物が好ましい。
１．式（Ｉ）の化合物の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチルであり；および
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここでＲ17は，ヒドロキシ，アルキル，シクロアルキル，アリール，またはヘテロアリールであり，より好ましくは，Ｒ7は，水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらにより好ましくは，メチル，水素またはフェニルである。
２．式（Ｉ）の化合物の別の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチルであり，最も好ましくはメチルであり；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここでＲ17は，ヒドロキシ，アルキルまたはアリールであり，およびＲ7は，より好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらに好ましくは，メチル，水素またはフェニルであり；および
Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；および
Ｚはアリールである。
３．式（Ｉ）の化合物の別の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチルであり，最も好ましくはメチルであり；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここで，Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキルまたはアリールであり，およびＲ7は，より好ましくは，水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらに好ましくはメチル，水素またはフェニルであり，最も好ましくはメチルであり；および
Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；および
Ｚはヘテロアリールであり，好ましくはトリアジニル，テトラゾリル，イミダゾリル，ピリジニル，ピリミジニルまたはピラジニルである。
４．式（Ｉ）の化合物の別の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチルであり，最も好ましくはメチルであり；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここで，Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキルまたはアリールであり，およびＲ7は，より好ましくは，水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらに好ましくはメチル，水素またはフェニルであり；および
Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；および
Ｚは複素環である。
５．式（Ｉ）の化合物の別の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチル，最も好ましくはメチルであり；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここで，Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキルまたはアリールであり，およびＲ7は，より好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらに好ましくは，メチル，水素またはフェニルであり，最も好ましくはメチルであり；および
Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；および
Ｚは−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，一緒になってヘテロシクロアミノ，好ましくはピペリジン−１−イル，Ｎ−メチルピペリジン−１−イル，ピペラジン−１−イル，Ｎ−メチルピロリジン−１−イル，ピロリジン−１−イル，モルホリン−４−イル，チオモルホリン−４−イル，チオモルホリノ−１−オキシド，チオモルホリノ−１，１−ジオキシド，４−エチルオキシカルボニルメチルピペラジン−１−イル，３−オキソピペラジン−１−イル，イミダゾリジン−１−イル−２−オン，ピロリジン−１−イル−２−オン，２−オキソホモピペラジン−１−イル，またはテトラヒドロピリミジン−１−イル−２−オン，より好ましくはモルホリン−４−イルを形成する。
６．式（Ｉ）の化合物の別の好ましい群は以下のとおりである：
Ｒ6は，水素およびアルキル，好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｔｅｒｔ−ブチル，イソブチル，またはｎ−ブチルからなる群より選択され，より好ましくは水素またはメチルであり；
Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17からなる群より選択され，ここで，Ｒ17は，ヒドロキシ，アルキルまたはアリールであり，およびＲ7は，より好ましくは水素，メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチル，イソブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル，フェニル，ベンゾイル，アセチルまたはカルボキシであり，さらに好ましくはメチル，水素またはフェニルであり；および
Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；および
Ｚは−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，アルキルであり，好ましくはジエチルアミノ，ジメチルアミノ，またはエチルアミノである。
７．上述の好ましいおよびより好ましい群（１）−（６）の中で，さらに好ましい化合物の群は以下のとおりである：
Ｒ1は，水素，アルキル，−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13，未置換シクロアルキルであり，好ましくは水素，３，４−ジメトキシフェニルアミノカルボニル，４−メトキシ−３−クロロフェニル−アミノカルボニルであり，さらに好ましくは水素またはメチルであり，最も好ましくは水素であり；および
Ｒ2は，水素，シアノ，ハロ，低級アルコキシ，または−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10であり，ここで，Ｒ9は水素であり，およびＲ10は，水素，アリールまたはアルキルであり，これはオキシインドール環の５位に存在し，好ましくはＲ2は，水素，クロロ，ブロモ，フルオロ，メトキシ，エトキシ，フェニル，ジメチルアミノスルホニル，３−クロロフェニル−アミノスルホニル，カルボキシ，メトキシ，アミノスルホニル，メチルアミノスルホニル，フェニルアミノスルホニル，ピリジン−３−イル−アミノスルホニル，ジメチルアミノスルホニル，イソプロピルアミノ−スルホニルであり，より好ましくは水素，フルオロ，またはブロモである。最も好ましくは，Ｒ2はフルオロであり，これはインドリノン環の５位に存在する。
上述の好ましい，より好ましい，およびさらに好ましい化合物において，−ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ3）＊ＣＲ4（ＯＨ）ＣＲ5Ｚ鎖中のヒドロキシ基を有する炭素原子における立体化学は＊により表され，ＲＳ，Ｒ，またはＳのいずれかであり，より好ましくはＳである。
用途
その触媒活性が本発明の化合物により調節されるＰＫには，蛋白質チロシンキナーゼが含まれ，これには２つのタイプがある：レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）および細胞性チロシンキナーゼ（ＣＴＫ），およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）である。ＲＴＫに媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因子（リガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプターが二量化し，固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され，リン酸化する。このことにより，内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され，種々の細胞質シグナリング分子との複合体の形成につながり，これは，適切な細胞応答（例えば，細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等）を促進する。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−３９１を参照。
成長因子レセプターのチロシンリン酸化部位がシグナリング分子のＳＨ２（ｓｒｃホモロジー）ドメインの高親和性結合部位として機能することが示されている（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４２３，Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２７７７−２７８５），Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ７２：７６７−７７８，およびＫｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８）。ＲＴＫと会合するいくつかの細胞内基質蛋白質が同定されている。それらは二つの主要なグループに分けられる：（１）触媒ドメインを有する基質，および（２）そのようなドメインを欠くが，アダプターとして働き，触媒活性のある分子と会合する。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。レセプターとその基質のＳＨ２ドメインとの間の相互作用の特異性は，リン酸化されたチロシン残基を直接取囲んでいるアミノ酸残基によって決定される。ＳＨ２ドメインと，特定のレセプターのホスホチロシン残基を取り囲んでいるアミノ酸配列との間の結合親和性の差異は，それらの基質リン酸化のプロファイルに見られる差異と一致している。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。これらの知見は，各々のＲＴＫの機能が，その発現パターンならびにリガンド利用可能性によるのみならず，特定のレセプターによって活性化される下流の一連のシグナル伝達経路によっても決定されることを示唆している。したがって，リン酸化は特異的な成長因子レセプター，ならびに分化因子レセプターによってリクルートされる，シグナリング経路の選択性を決定する重要な段階を提供する。
ＳＴＫは，本来細胞質ゾル性であり，しばしばＰＴＫ事象についての下流方向の応答として，細胞内部の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは，細胞増殖に導くＤＮＡ合成とそれに続く細胞分裂とを開始する，シグナリング過程に関与することが示唆されている。
したがって，ＰＫシグナル伝達は，種々の応答の中で特に，細胞増殖，分化，成長，および代謝をもたらす。異常な細胞増殖は，癌腫，肉腫，神経膠芽細胞腫，および血管腫等の新生物，白血病，乾癬，動脈硬化症，関節炎，および糖尿病性網膜炎，および制御されない新脈管形成および／または脈管形成に関連する他の疾患を含む，広い範囲の疾患および疾病という結果をもたらしうる。
本発明の化合物がＰＫを阻害するメカニズムについての正確な理解は，本発明の実施のためには必要ではない。しかしながら，本発明においてはいかなる特定のメカニズムまたは理論にも束縛されるものではないが，化合物はＰＫの触媒領域のアミノ酸と相互作用すると考えられている。ＰＫは典型的には２葉構造を有しており，ＡＴＰは，ＰＫの中でアミノ酸が保存されている領域内の，２つの葉の間の裂け目に結合するように見える。ＰＫの阻害剤は，前記のＡＴＰがＰＫに結合するのと同じ普遍領域において，水素結合，ファン−デル−ワールス力，およびイオン相互作用等の非共有結合によって結合すると考えられる。さらに具体的には，本発明の化合物の２−インドリノン成分が，通常はＡＴＰのアデニン環によって占められる普遍区域に結合すると考えられている。このように，ある特定の分子の特定のＰＫに対する特異性は，２−インドリノンコア上の種々の置換基と，特定のＰＫに特異的なアミノ酸ドメインとの間の，付加的な相互作用の結果として生じるのであろう。すなわち，異なるインドリノン置換基が，特定のＰＫに対する優先的な結合に寄与するかもしれない。異なるＡＴＰ（または他のヌクレオチド）結合部位において活性のある化合物を選択する能力は，本発明の化合物を，そのような部位を有する任意の蛋白質を標的とするのに有用なものにする。したがって本明細書において開示される化合物は，かかる蛋白質についてのインビトロでのアッセイ用としての有用性を有すると同時に，かかる蛋白質との相互作用を通じてインビボでの治療効果を示すものでありうる。
さらに，本発明の化合物は，多くの種類の固形腫瘍，例えば，限定されないが，癌腫，肉腫，例えばカポジ肉腫，赤芽球腫，神経膠芽細胞腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫および筋原細胞腫の治療に対する治療方法を提供する。非固形腫瘍癌，例えば白血病の治療又は予防もまた本発明により企図される。適応症には，限定されないが，脳癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，肺癌および骨癌が含まれる。
本明細書に記載される化合物がその予防，治療および研究に有用であろう，不適切なＰＫ活性に関連する疾患のタイプのさらなる例には，限定されないが，細胞増殖性疾患，繊維性疾患および代謝性疾患が含まれる。
本発明により予防，治療またはさらに研究することができる細胞増殖性疾患には，癌，血管増殖性疾患およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。
血管増殖性疾患とは，異常な脈管形成（血管の形成）および新脈管形成（血管の拡散）に関連する疾患を表す。脈管形成および新脈管形成は胚発生，黄体形成，創傷治癒，および臓器再生等の種々の正常な生理学的過程において重要な役割を果たすが，それらはまた腫瘍を生かしておくために必要な新しい毛細血管をそれらが形成させる癌の発生においても中枢的な役割を演じる。血管増殖疾患の他の例は，新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎，および糖尿病性網膜炎のように，網膜内の新しい毛細血管が硝子体に侵入し，出血させ，さらに失明を引起す眼性疾患を含む。
高い親和性をもってＶＥＧＦに結合する２つの構造的に関連するＲＴＫが同定されている：ｆｍｓ様チロシン１（ｆｉｔ−１）レセプター（Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９−５２４；ＤｅＶｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：９８９−９９１）およびＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプター（ＶＥＧＦ−Ｒ２としても知られる）。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は，インビトロ内皮細胞成長促進活性を有する内皮細胞特異的有糸分裂促進物質であることが報告されている（Ｆｅｒｒａｒａ＆Ｈｅｎｚｅｌ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｉｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１：８５１−８５８；Ｖａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１９４６１−１９５６６）。米国特許出願０８／１９３，８２９，０８／０３８，５９６および０７／９７５，７５０に記載される情報は，ＶＥＧＦが内皮細胞増殖の原因となるのみならず，正常および病的な新脈管形成の主要な調節剤であることを強く示唆する。一般に，Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ＆Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１０）６９９−７０２；Ｈｏｕｃｋ， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２６０３１−２６０３７を参照。
正常な脈管形成および新脈管形成は，種々の生理学的プロセス，例えば，胚発生，創傷治癒，臓器再生等の種々の生理学的過程，および排卵期の黄体における濾胞形成と妊娠後の胎盤の成長等の女性の生殖過程において重要な役割を果たしている（Ｆｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ，１９９２，Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．，２６７（１６）：１０９３１−３４）。制御されない脈管形成および／または新脈管形成は，糖尿病等の疾病ならびに成長が血管形成に依存する悪性固形腫瘍に関連づけられてきた（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ＆Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１０）：６９９−７０２；Ｆｏｌｋｈａｍ，１９９１，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２：４−６；Ｗｅｉｄｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４：１−５）。
新脈管形成および脈管形成の間の内皮細胞増殖および移動におけるＶＥＧＦの推測される役割は，これらのプロセスにおけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターの重要な役割を示す。真性糖尿病（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８，ＸＩｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔａ， ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．５８３−５９６，ＬｅｕｖｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ）および関節炎等の疾病，ならびに悪性腫瘍成長は，制御されない新脈管形成により引き起こされうる。例えば，Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５：１１８２−１１８６を参照。ＶＥＧＦが特異的に結合するレセプターは，そのようなプロセスにより引き起こされる異常な細胞成長が関与する脈管形成および／または新脈管形成，および種々の重症の疾病の制御および調節の重要かつ強力な治療標的である（Ｐｌｏｗｍａｎ， ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９）。より詳細には，血管新生におけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターの高度に特異的な役割のため，これは，血管の制御されない形成が関与する癌および他の疾病の治療に対する治療方法の選択すべき標的であろう。
すなわち，本発明は，新脈管形成および／または脈管形成を阻害または促進するために，チロシンキナーゼシグナル伝達，例えばＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターシグナル伝達を制御および／または調節しうる化合物，すなわち，ＶＥＧＦ等のリガンドにより活性化されたときにＫＤＲ／ＦＬＫ−１により伝達されるシグナルを阻害，妨害または干渉する化合物を提供する。本発明の化合物はレセプターまたはチロシンキナーゼシグナル伝達経路に沿った他の成分で作用すると考えられるが，これらはまた，制御されない新脈管形成に起因する腫瘍細胞に直接作用することができる。
一般的な"ｆｌｋ−１"レセプターの，ヒトおよびマウスの同等物の命名は異なるが，それらは多くの点において交換可能である。マウスのレセプターＦｌｋ−Ｉと，ヒトにおけるその同等物であるＫＤＲは，細胞内ドメインのうちの９３．４％の配列相同性を共有している。同様に，マウスＦｌｋ−１は，マウスＶＥＧＦと同じ親和性をもってヒトＶＥＧＦと結合し，したがっていずれの種に由来するリガンドによっても活性化される。Ｍｉｌｌａｕｅｒら，１９９３，Ｃｅｌｌ，７２：８３５−８４６；Ｑｕｉｎｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７５３３−７５３７。Ｆｌｋ−Ｉはまた，２９３細胞（ヒト胚性腎臓の線維芽細胞）において同時発現された場合，ヒトＲＴＫの基質（例えばＰＬＣ−γまたはｐ８５）と結合し，続いてチロシンをリン酸化する。
したがって，Ｆｌｋ−１レセプターに依存したモデルは，ＫＤＲレセプターの理解に直接適用することができる。例えば，マウスのシグナル伝達経路を調節する化合物を同定する方法においてマウスＦｌｋ−１レセプターを使用することは，ヒトのシグナル伝達経路を調節するために用いることができる化合物，すなわちＫＤＲレセプターに関連した活性を調節する化合物の同定に直接適用することができる。すなわち，インビトロにおいてＫＤＲ／ＦＬＫ−１の阻害剤として同定された化学的化合物は，適当なインビボのモデルにおいて確認すことが可能である。インビボでのマウスおよびラット双方の動物モデルは，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１に誘導されるシグナル伝達経路に作用する薬剤の，臨床上の潜在能力を調べるために優れた価値があることが証明されている。
すなわち，本発明は，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターの酵素活性を変化させ，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１により伝達されるシグナルを妨害することにより脈管形成および／または新脈管形成を制御，調節および／または阻害する化合物を提供する。すなわち，本発明は，多くの種類の固形腫瘍，例えば，限定されないが，神経膠芽細胞腫，黒色腫およびカポジ肉腫，および卵巣，肺，乳，前立腺，膵臓，結腸および類表皮癌腫を治療するための治療方法を提供する。さらに，データは，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１媒介性シグナル伝達経路を阻害する化合物の投与はまた，血管腫，再狭窄，および糖尿病性網膜症の治療にも用いられることを示唆する。
さらに，本発明は，他のレセプターが媒介する経路，例えば，ｆｌｔ−１レセプターを含む経路による脈管形成および新脈管形成の阻害に関する。
レセプターチロシンキナーゼにより媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因子（リガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプターが二量化し，固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され，自己リン酸化する。このことにより，内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され，種々の細胞質シグナリング分子との複合体の形成につながり，これは，適切な細胞応答（例えば，細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等）を促進する。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−３９１を参照。
ＫＤＲ／ＦＬＫ−１の細胞内領域と，ＰＤＧＦ−βレセプターの細胞内領域（５０．３％の相同性），および／または関連するｆｌｔ−１レセプターとの緊密な相同性は，重複したシグナル伝達経路の誘導を示している。例えばＰＤＧＦ−βレセプターについては，ｓｒｃファミリーのメンバー（Ｔｗａｍｌｅｙら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７６９６−７７００），ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ（Ｈｕら，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：９８１−９９０），ホスホリパーゼｃγ（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎ＆Ｃｏｏｐｅｒ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：４９−５１），ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎら，１９９２，ＥＭＢＯＪ．，１１：１３７３−１３８２），ＰＴＰ−ＩＤ／ｓｙｐ（Ｋａｚｕｌａｕｓｋａｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９０：６９３９−６９４３），Ｇｒｂ２（Ａｒｖｉｄｓｓｏｎら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：６７１５−６７２６），およびアダプター分子ＳｈｃおよびＮｕｋ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：６８８９−６８９６）が，異なる自己リン酸化部位に関与する領域に結合することが示されている。全般的には，Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．，５：３７−５４参照のこと。したがって，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１により活性化されるシグナル伝達経路は，ｒａｓ経路（Ｒｏｚａｋｉｓら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：６８９−６９２），ＰＩ−３’−キナーゼ，ｓｒｃ介在性，およびｐｌｃγ介在性の経路を含むと考えられる。これらの経路の各々は，内皮細胞におけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１の新脈管形成および／または脈管形成効果において，重大な役割を演じることができる。したがって本発明のまたさらなる特徴は，本文に述べた有機化合物を，新脈管形成および脈管形成を調節するべく用いることに関するが，それはかかる過程がこれらの経路によって調節されるためである。
逆に，再狭窄などの，血管の収縮，狭窄，または閉鎖に関連した疾患にも関与することが示唆されており，本発明の方法により治療または予防することができる。
繊維性疾患とは，細胞外マトリックスの異常な形成を表す。繊維性疾患の例には，肝硬変およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。肝硬変は，肝臓瘢痕の形成を引き起こす細胞外マトリックスの組成の増加を特徴とする。肝臓瘢痕を引き起こす細胞外マトリックスの増加はまた，肝炎ウイルス等のウイルス感染に起因する。脂肪細胞は，肝硬変において主要な役割を果たすようである。示唆されている他の繊維性疾患には，アテローム性動脈硬化症が含まれる。
メサンギウム細胞増殖疾患とは，メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起こされる疾患を表す。メサンギウム増殖疾患には，種々のヒト腎臓疾病，例えば，糸球体腎炎，糖尿病性腎症，悪性腎硬化症，ならびに血栓性細小血管症候群，移植拒絶，および糸球体症が含まれる。ＲＴＫ ＰＤＧＦ−Ｒは，メサンギウム細胞増殖の維持に関与することが示唆されている（Ｆｌｏｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４７Ｓ−５４Ｓ）。
多くの癌は細胞増殖性疾患であり，先に記載されるように，ＰＫは細胞増殖性疾患と関連づけられてきた。すなわち，ＰＫ，例えば，ＲＴＫファミリーのメンバーが癌の発達と関連づけられてきたことも驚くべきことではない。ＥＧＦＲ（Ｔｕｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７−２３３，Ｔｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＰＭＩＳ １００：７１３−７１９），ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７−７１２），およびＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：６２７−６３３）等のこれらのレセプターのいくつかは多くの腫瘍において過剰発現され，および／またはオートクリンループにより持続的に活性化される。事実，ほとんどの一般的かつ重症の癌においては，これらのレセプターの過剰発現（Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１１１：１１９−１３３，Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ．６１：２４９−２７３，Ｋｏｒｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，１３５２−１３６０），およびオートクリンループ（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：１０５７−１０７０，Ｋｏｒｃ ｅｔ ａｌ．，前掲，Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ．，前掲）が示されている。例えば，ＥＧＦＲは扁平上皮癌，星状細胞腫，神経芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌，および膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ２は乳，卵巣，胃，肺，膵臓，および膀胱の癌と関連づけられている。ＰＤＧＦ−Ｒは神経芽細胞腫，黒色腫，ならびに肺，卵巣および前立腺の癌と関連づけられている。ＲＴＫｃ−ｍｅｔはまた，悪性腫瘍形成と関連づけられている。例えば，ｃ−ｍｅｔは，他の癌の中でも特に，結腸直腸，甲状腺，膵臓，胃および造血細胞癌腫およびリンパ腫と関連づけられている。さらに，ｃ−ｍｅｔは白血病と結びつけられている。ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はまた，ホジキン病およびバーキット病を有する患者において検出されている。
ＩＧＦ−ＩＲは，栄養上の支持およびＩＩ型糖尿病に関係づけられていることに加えて，いくつかの型の癌に関係づけられている。例えば，ＩＧＦ−Ｉはいくつかの型の腫瘍，例えばヒト乳癌の癌腫細胞（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８−１４２３），および小細胞肺腫瘍（Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：２５１１−２５１７）のオートクリン成長刺激因子として示唆されている。さらに，ＩＧＦ−Ｉは神経系の正常な成長および分化に完全に関与しており，ヒトの神経膠腫のオートクリン刺激因子であるように見える。Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２４７５−２４７８。細胞増殖におけるＩＧＦ−ＩＲとそのリガンドの重要性は，培養されている多くの細胞型（線維芽細胞，上皮細胞，平滑筋細胞，Ｔリンパ球，骨髄性細胞，軟骨細胞，および骨芽細胞（骨髄の幹細胞）がＩＧＦ−Ｉによって成長するよう刺激されるという事実によってさらに支持される。Ｇｏｌｄｒｉｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，１９９１，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１：３０１−３２６。ＢａｓｅｒｇａおよびＣｏｐｐｏｌａは，ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の機構において中心的な役割を果たしていること，またそれ自体がヒトの広範囲の悪性腫瘍に対する治療的介入のための好ましい標的となり得ることを示唆している。Ｂａｓｅｒｇａ，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２４９−２５２，Ｂａｓｅｒｇａ，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：９２７−９３９，Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４５８８−４５９５。
ＳＴＫは，特に乳癌を含む多くの型の癌に関与することが示唆されている（Ｃａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：５７１−７７（１９９３））。
異常なＰＫ活性と疾病との関連性は，癌に限られない。例えば，ＲＴＫは，疾病，例えば，乾癬，糖尿病，子宮内膜症，新脈管形成，じゅく状斑の発達，アルツハイマー疾病，再狭窄，フォン・ヒッペル−リンダウ症候群，表皮過増殖および神経変性性疾病，加齢性黄斑変性および血管腫と関連づけられている。例えば，ＥＧＦＲは，角膜および皮膚の創傷治癒における関与が示唆されている。タイプＩＩ糖尿病においてインスリン−ＲおよびＩＧＦ−１Ｒの欠陥が示されている。特定のＲＴＫとその治療適応症との間のより完全な相関はＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＤＮ＆Ｐ７：３３４−３３９に記載されている。
先に記載されているように，ＲＴＫのみならず，ＣＴＫ，例えば，限定されないが，ｓｒｃ，aｂ１，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆｙｎ，ｌｙｎ，Ｉｃｋ，ｂｌｋ，ｈｃｋ，ｆｇｒおよびｙｒｋ（Ｂｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６：３４０３−３４０９により概説）もまた，増殖および代謝性シグナル伝達経路に関与しており，したがって，本発明にかかる多くのＰＴＫ媒介性疾患に関与することが予測され，このことが実際に示されている。例えば，変異したｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は，トリにおいて発癌蛋白質（ｐｐ６０v-src）であることが示されている。さらに，その細胞性ホモログであるプロトオンコジンｐｐ６０c-srcは，多くのレセプターの発癌シグナルを伝達する。腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は，悪性細胞に特徴的であるが正常細胞では見られないｐｐ６０c-srcの構成的活性化につながる。一方，ｃ−ｓｒｃの発現に欠陥を有するマウスは大理石骨病的表現型を示し，このことは，ｃ−ｓｒｃが破骨細胞機能において鍵となるよう関与していること，および関連する疾患に関与している可能性を示唆する。
同様に，Ｚａｐ７０は，自己免疫疾患に関連するかもしれないＴ−細胞シグナリングにおける関与が示唆されている。
ＳＴＫは，炎症，自己免疫疾患，免疫応答，および過増殖疾患，例えば再狭窄，繊維症，乾癬，変形性関節症および慢性関節リウマチと関連づけられている。
ＰＫはまた，胚着床における関与も示唆されている。すなわち，本発明の化合物は，そのような胚着床を防止する有効な方法を提供することができ，したがって，産児調節剤として有用であろう。本発明の化合物を用いて治療または予防しうるさらなる疾患は，免疫学的疾患，例えば自己免疫疾病，ＡＩＤＳおよび心臓血管疾患，例えばアテローム性動脈硬化症である。
最後に，現在，ＲＴＫおよびＣＴＫの両方とも過剰免疫疾患に関与していることが疑われている。
本発明の多数の例示的化合物がいくつかのＰＴＫに及ぼす影響の例は，以下の表２に示される。示される化合物およびデータは，いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
投与および医薬組成物
本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩は，そのままでヒト患者に，または，上述の物質が適当な担体または賦形剤と混合されている医薬組成物中で投与することができる。薬剤の処方および投与の手法は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，の最新版に見いだすことができる。
本明細書において用いる場合，"投与する"または"投与"とは，本発明の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩，または式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を含む医薬組成物を，ＰＫ関連疾患の予防または治療の目的で生物に輸送することを表す。
適当な投与経路には，限定されないが，経口，直腸内，経粘膜，または腸内投与，または筋肉内，皮下，骨髄内，鞘内，直接心室内，静脈内，硝子体内，腹腔内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。好ましい投与経路は経口および非経口である。
あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固形癌内に直接，しばしばデポ剤または持続放出処方中で注射することにより投与してもよい。
さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使用することができる製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で処方することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
注射用には，本発明の化合物を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
経口投与のためには，活性化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより化合物を処方することができる。そのような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することを可能とする。経口で使用するための医薬製剤は，固体賦形剤を用いて，得られた混合物を任意にすりつぶし，所望の場合には適当な助剤を加えた後に，顆粒の混合物を加工して，錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤には，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のためには，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加してもよい。
経口で使用することができる医薬組成物は，ゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁することができる。これらの処方にはさらに安定剤を添加してもよい。
用いることができる医薬組成物にはまた硬質ゼラチンカプセルが含まれる。非限定的例として，活性化合物カプセルの経口薬剤製品は，５０および２００ｍｇの用量強度（それぞれ処方コードＪ−０１１２４８−ＡＡ−００およびＪ−０１１２４８−ＡＡ−０１）である。２つの用量強度は同じ顆粒から作成し，異なるサイズの硬質ゼラチンカプセル，すなわち，５０ｍｇカプセル用にはサイズ３に，２００ｍｇカプセル用にはサイズ０に充填する。処方の組成は，例えば，表２に示したものであることができる。
Figure 0003677501
カプセルは，褐色のガラスまたはプラスチック瓶中に包装して，活性化合物を光から保護することができる。活性化合物のカプセル処方を含む容器は調節された室温（１５−３０℃）で保存しなければならない。
吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたはネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性または水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，親油性ベヒクル中に製造することができる。適切な親油性ベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤および／または薬剤を含んでいてもよい。
あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか，または筋肉内注射により投与することができる。本発明の化合物は，この投与経路用に，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として，処方することができる。
本発明の疎水性化合物のための薬学的担体の非限定的例は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系，例えばＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，そのような共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
あるいは，疎水性の医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。
さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が確立されており，当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
本明細書に記載される医薬組成物は，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，デンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
本発明のＰＫ調節化合物の多くは，本発明の化合物が負にまたは正に荷電した種を形成する，生理学的に許容しうる塩として提供することができる。化合物が正に荷電した成分を形成する塩の例には，限定されないが，四級アンモニウム（本明細書において定義される），四級アンモニウム基の窒素原子が適切な酸と反応させた本発明の選択された化合物の窒素である塩，例えば，塩酸，硫酸，炭酸，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハク酸の塩が含まれる。本発明の化合物が負に荷電した種を形成している塩には，限定されないが，化合物中のカルボン酸基を適当な塩基（例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ），水酸化カリウム（ＫＯＨ），水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）等）と反応させることにより形成されるナトリウム，カリウム，カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図される目的，例えば，ＰＫ活性の調節またはＰＫ関連疾患の治療または予防を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。
治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な量または用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。次に，動物モデルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちＰＫ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。次にそのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験動物における標準的な薬理学的方法により，例えば対象化合物についてＩＣ50およびＬＤ50（いずれも本明細書において議論される）を決定することにより，決定することができる。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方するために用いることができる。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十分な血漿レベルを与えるよう調節することができる。このような血漿レベルは最小有効濃度（ＭＥＣ）と称される。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決定することができる。
投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
現在のところ，式Ｉ，ＩａまたはＩＩの化合物の治療上有効量は，１日あたり約２５ｍｇ／ｍ2−１５００ｍｇ／ｍ2の範囲内であり，好ましくは約３ｍｇ／ｍ2／ｄａｙである。さらにより好ましくは５０ｍｇ／ｑｍ ｑｄから４００ｍｇ／ｑｄである。
局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ないであろう。当該技術分野において知られる他の方法を用いて，正確な投与量および間隔を決定することができる。
投与される組成物の量は，もちろん，治療中の患者，苦痛の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置，例えばＦＤＡに認可されたキット中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用の化合物の形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置され，さらに指示された状態の治療のためにラベルを付すことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
本発明は，ＣＭＣ懸濁液ベヒクルとともに投与することができる。ＣＭＣ懸濁液の例は以下の表３に示される。
表３
Figure 0003677501
 ＊必要な濃度（日）により異なる
１．０リットルのＣＭＣ懸濁液ベヒクルのプロトコルは以下のとおりである。ベヒクル処方の組成およびバッチサイズを示す表を用いて，ベヒクル処方を作製するのに必要な適当な量の賦形剤を計算する。清浄な広口ガラス瓶またはポリエチレン瓶等の適当な空の容器を秤量する。容器に約６００ｍＬの水を加える。カルボキシメチルセルロースナトリウム（５ｇ）を秤量し，容器に移す。磁気撹拌子またはプロペラ付きラボラトリースターラーを用いて均一になるまで撹拌する（約２−３時間）。ＮａＣｌを秤量し，容器に加える。溶解するまで混合を続ける（約１０分間）。ポリソルベート−８０を加える。溶液が均一になるまで混合する（約２０分間）。ベンジルアルコールを加える。溶液が均一になるまで混合する（約１０分間）。溶液の重量（重量または容量）が必要なバッチサイズとなるように残りの水を加える（１０１０ｇまたは１０００ｍＬ，２２℃における密度＝１．０１）。２−８℃で保存する（冷蔵下）。
懸濁液処方は以下のようにして製造することができる。乳鉢および乳棒を用いてＡＰＩをすりつぶして，均一な外観の小さい粒子サイズの粉体を得る（大きい塊または大きい粒子がないこと−理想的にはＵＳ標準シーブ＞８０，すなわち＜１８０μｍのサイズを通過すべきである）。計算量のＡＰＩを秤量して容器に入れる。必要な総量の約９０％のＣＭＣ懸濁液ベヒクルを容器に加える。プロペラ付きラボラトリースターラーまたは同等物を用いて化合物をベヒクル中に懸濁する。効率的な混合を確実にするために，プロペラブレードの直径は容器の底の直径と適合させなければならない。５０ｒｐｍで３０分間または薬剤がよく懸濁するまで撹拌する。ベヒクル処方をバッチサイズに対応する適当な重量まで“ｑｓ”で（十分な量まで）加え，水を加える。５０ｒｐｍでさらに３０分間撹拌する。懸濁液を直ちに琥珀色ガラスまたはポリプロピレン容器に小分けする。容器は光から保護する。２−８℃で撹拌する（冷蔵下，冷凍してはならない）。
本発明の１つの観点においては，上述した疾病および疾患の治療のために，本明細書に記載される化合物またはその塩またはプロドラッグを他の化学療法剤と組み合わせることができる。例えば，本発明の化合物，塩またはプロドラッグは，アルキル化剤，例えば，フルオロウラシル（５−ＦＵ）単独で，またはさらにロイコボリンと組み合わせて；または，他のアルキル化剤，例えば，限定されないが，他のピリミジン類似体，例えば，ＵＦＴ，カペシタビン，ゲムシタビンおよびシタラビン，アルキルスルホネート，例えばブルスファン（慢性顆粒球性白血病の治療に用いられる），イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類，例えばベンゾデパ，カルボコン，メツレデパおよびウレデパ；エチレンイミン類およびメチルメラミン類，例えばアルトレタミン，トリエチレンメラミン，トリエチレンホスホルアミド，トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン，およびナイトロジェンマスタード類，例えばクロラムブシル（慢性リンパ性白血病，原発性マクログロブリン血症および非ホジキンリンパ腫の治療において用いられる），シクロホスファミド（ホジキン病，多発性骨髄腫，神経芽細胞腫，乳癌，卵巣癌，肺癌，ウイルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療において用いられる），エストラムスチン，イフォスファミド，ノベムブリチン，プレドニムスチンおよびウラシルマスタード（原発性血小板増加症，非ホジキンリンパ腫，ホジキン病および卵巣癌用）；およびトリアジン類，例えばダカルバジン（軟組織肉腫用）と組み合わせることができる。
本発明の化合物，塩またはプロドラッグはまた，他の抗代謝化学療法剤，例えば，限定されないが，葉酸類似体（例えば，メトトレキセート（急性リンパ性白血病，絨毛癌腫，菌状息肉腫，乳癌，頭頸部癌および肺癌，骨形成性肉腫の治療に用いられる）およびプテロプテリン），プリン類似体，例えばメルカプトプリンおよびチオグアニン（急性顆粒球性白血病，急性リンパ性白血病および慢性顆粒球性白血病の治療に用いられる）と組み合わせて用いることができる。
さらに，本発明の化合物，塩またはプロドラッグは，天然産物化学療法剤，例えば，限定されないが，ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン（乳癌および精巣癌に用いられる），ビンクリスチン，ビンデシン），エピポドフィロトキシン類（例えばエトポシド，テニポシド（両方とも精巣癌およびカポジ肉腫の治療に用いられる）），抗生物質化学療法剤（例えばダウノルビシン，ドキソルビシン，エピルビシン，マイトマイシン（胃癌，子宮頸癌，結腸癌，乳癌，膀胱癌および膵臓癌に用いられる），ダクチノマイシン，テモゾロミド，プリカマイシン，ブレオマイシン（皮膚癌，食道癌および尿生殖器管癌に用いられる）および酵素的化学療法剤，例えばＬ−アスパラギナーゼと組み合わせて用いることができる。
上述に加えて，本発明の化合物，塩またはプロドラッグは，化学療法剤，例えば白金配位錯体（例えばシスプラチン），置換尿素（例えばヒドロウレア），メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン），副腎皮質抑制剤（例えばミトーテン，アミノグルテチミド），ならびにホルモンおよびアンタゴニスト，例えばアドレノコルチコステロイド（例えばプレドニゾン），プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンカプロネート），エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール），抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）およびアンドロゲン（例えばテストステロンプロピオネート），およびアロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール）と組み合わせて用いることができる。
最後に，本発明の化合物の組み合わせは，当該技術分野において知られるミトザントロン，パクリタキセル，当該技術分野において知られるシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤，特に，Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標），Ｐａｒａｃｏｘｉｂ（登録商標），Ｖｉｏｘｘ（登録商標），ＷＯ９９／１１６０５に開示されるＡｂｂｏｔｔ社のＣｏｘ−１８９，トポイソメラーゼ阻害剤，例えばＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標），Ｈｅｒ−２レセプターアンタゴニスト，例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），エンドスタチン，Ｇｌｅｅｖａｃ（登録商標），ＩｍＣｌｏｎｅＶＥＧＦレセプターアンタゴニストＩＭＣＣ２２５（登録商標）との組み合わせにおいて，固形腫瘍癌または白血病，例えば，限定されないが，急性骨髄性（非リンパ球）白血病の治療に有効であることが企図される。
一般的合成方法
以下の一般的方法論を用いて本発明の化合物を製造することができる：
適切に置換された２−オキシインドール（１当量），適切に置換された３−カルボキシ−５−ホルミルピロール（１．２当量）および塩基（０．１当量）を溶媒（１−２ｍｌ／ｍｍｏｌ２−オキシインドール）中で混合し，次に混合物を約２から約１２時間加熱する。冷却した後，形成する沈澱物を濾過し，冷エタノールまたはエーテルで洗浄し，真空乾燥して，対応する５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−（３Ｚ）−イリデンメチル）−１−Ｈ−ピロール−３−カルボン酸を得る。沈澱物が形成しない場合には，反応混合物を濃縮し，残渣をジクロロメタン／エーテル中で砕き，得られる固体を濾過により回収し，乾燥する。生成物は任意にクロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。
塩基は有機塩基でも無機塩基でもよい。有機塩基を用いる場合には，好ましくはこれは窒素塩基である。有機窒素塩基の例には，限定されないが，ジイソプロピルアミン，トリメチルアミン，トリエチルアミン，アニリン，ピリジン，１，８−ジアザビシクロ［５．４．１］ウンデセ−７−エン，ピロリジンおよびピペリジンが含まれる。
無機塩基の例としては，限定されないが，アンモニア，アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物，リン酸塩，炭酸塩，重炭酸塩，酢酸塩，重硫酸塩およびアミドが挙げられる。アルカリ金属には，リチウム，ナトリウムおよびカリウムが含まれ，アルカリ土類金属にはカルシウム，マグネシウムおよびバリウムが含まれる。
本発明の現在好ましい態様においては，溶媒がプロトン性溶媒，例えば水またはアルコールであるとき，塩基はアルカリ金属またはアルカリ土類の無機塩基，好ましくは，アルカリ金属またはアルカリ土類の水酸化物である。
当業者には，有機合成の既知の一般原則と本明細書の記載の両方に基づいて，意図される反応にはいずれの塩基が最も適当であるかが明らかであろう。
反応を実施する溶媒は，プロトン性溶媒であっても非プロトン性溶媒であってもよい。好ましくは，プロトン性溶媒である。"プロトン性溶媒"は，酸素または窒素原子に共有結合した水素原子を有する溶媒であり，これは水素原子をかなり酸性にし，このため水素結合を介して溶質と"共有"されることができる。プロトン性溶媒の例としては，水およびアルコールが挙げられるが，これらに限定されない。
"非プロトン性溶媒"は，極性であっても非極性であってもよいが，いずれの場合も，酸性水素を含まず，したがって，溶質と水素結合を形成することができない。非極性非プロトン性溶媒の例としては，限定されないが，ペンタン，ヘキサン，ベンゼン，トルエン，塩化メチレンおよび四塩化炭素が挙げられる。極性非プロトン性溶媒の例は，クロロホルム，テトラヒドロフラン，ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドである。
本発明の現在好ましい態様においては，溶媒はプロトン性溶媒，好ましくは，水またはエタノール等のアルコールである。
反応は，室温より高い温度で行う。温度は一般に約３０℃−約１５０℃，好ましくは，約８０℃−約１００℃，最も好ましくは約７５℃−約８５℃であり，これはおよそエタノールの沸点である。"約"とは，温度範囲が，好ましくは示される温度の１０℃以内，より好ましくは示される温度の５℃以内，最も好ましくは示される温度の２℃以内であることを意味する。すなわち，例えば，"約７５℃"とは，７５℃±１０℃，好ましくは７５℃±５℃，最も好ましくは７５℃±２℃である。
２−オキシインドールおよび３−カルボキシ−５−ホルミルピロールは，容易に入手可能な出発物質を用いて，化学の技術分野においてよく知られる手法を用いて容易に合成することができる。
５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−（３Ｚ）−イリデンメチル）−１−Ｈ−ピロール−３−カルボン酸と式ＺＣＨ（Ｒ5）−ＣＲ4（ＯＨ）−ＣＨＲ3ＮＨ2のアミンとを，有機溶媒，例えばジメチルホルムアミド，テトラヒドロフラン等の中で，適当な結合剤，例えばジシクロヘキシルカルボジイミド，ＤＥＡＤ，ＥＤＣおよびＨＯＢｔ等の存在下でカップリングさせて，式（Ｉ）の化合物を得る。式ＺＣＨ（Ｒ5）−ＣＲ4（ＯＨ）−ＣＨＲ3ＮＨ2のアミンは，市販されているか，または当該技術分野においてよく知られる方法により製造することができる。いくつかのそのような方法が以下に記載される。
本発明の化合物を形成するための他の合成経路が利用可能であり，以下の記載は例示のためにのみ提供され限定ではないことが当業者には明らかであろう。
以下の製造例および実施例は，当業者が本発明をより明確に理解し，これを実施することを可能とするために提供される。これらの実施例は，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではなく，単に例示的なものであり，本発明の代表例である。
合成例
実施例１
５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ンドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸の合成
工程１
ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ，３ｅｑ．）を氷浴中で撹拌しながら冷却した。これにＰＯＣｌ3（１．１ｅｑ．，１０．８ｍＬ）を加えた。３０分後，ＤＭＦ（２Ｍ，４０ｍＬ）中の３，５−ジメチル−４−エチルエステルピロール（１７．７ｇ，１０５．８ｍｍｏｌ）の溶液を反応液に加え，撹拌を続けた。２時間後，反応液を水（２５０ｍＬ）で希釈し，１Ｎ水性ＮａＯＨでｐＨ＝１１に塩基性にした。白色固体を濾過により除去し，水，次にヘキサンですすぎ，乾燥して，５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（１９．７５ｇ，９５％）を褐色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．１１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．５９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），４．１７（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ 2ＣＨ3），２．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3），２．４０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ 3）
工程２
５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（２ｇ，１０ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）および水（１０ｍＬ）に溶解した水酸化カリウム（３ｇ，５３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を３時間還流し，室温に冷却し，６Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性にした。固体を濾過により回収し，水で洗浄し，真空オーブン中で一夜乾燥して，５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１．６ｇ，９３％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０９（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ＆ＣＯＯＨ），９．５９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），２．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）
工程３
５−フルオロイサチン（８．２ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのヒドラジン水和物に溶解し，１時間還流した。次に反応混合物を氷水に注加した。次に沈殿物を濾過し，水で洗浄し，真空オーブンで乾燥して，５−フルオロ−２−オキシインドール（７．５ｇ）を得た。
工程４
エタノール（３ｍＬ）中の５−フルオロオキシインドール（１００ｍｇ，０．６６ｍｍｏｌ），５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１３３ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ），および１０滴のピペリジンの反応混合物を６０℃で一夜撹拌し，濾過した。固体を１Ｍの水性塩酸溶液，水で洗浄し，乾燥して，５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２０１ｍｇ，定量的）を黄色固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度，％）２９９（［Ｍ−１］+.，１００）
実施例２
５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン−メチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アミドの合成
工程１
２−クロロメチルオキシラン（９５ｇ，１．０３ｍｏｌｅ）に３０℃で水（３．０８ｇ，０．１７ｍｏｌｅ）およびジエチルアミン（１０６．２ｍＬ，１．０３ｍｏｌｅ）の混合物を加えた。次に反応混合物を２８−３５℃で６時間撹拌し，２０−２５℃に冷却して，１−クロロ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オールを得た。
工程２
７８ｍＬの水中の水酸化ナトリウム（４７．９ｇ，１．２ｍｏｌｅ）の溶液に１−クロロ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オールを加えた。生成物を２０−２５℃で１時間撹拌し，１７８ｍＬの水で希釈し，エーテルで２回抽出した。合わせたエーテル溶液を固体水酸化カリウムで乾燥し，蒸発させて，１３５ｇの粗生成物を得，これを分留して，純粋なグリシジルジエチルアミン（９８ｇ，７６％）を油状物として得た。
工程３
２５％（ｗ／ｗ）の水酸化アンモニウム（２５ｍＬ，１５９ｍｍｏｌｅ）の氷冷溶液にグリシジルジエチルアミン（３．２ｇ，２４．８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴加した。反応混合物を０−５℃で１時間撹拌し，次に室温で１４時間撹拌した。得られた反応混合物を蒸発させ，蒸留（８４−９０℃，５００−６００ｍＴ）して，１−アミノ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オール（３．３ｇ，９２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ１４７（［Ｍ＋１］+.）
工程４
１．０ｍＬのＤＭＦ中の５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ），ＥＤＣ（１２２．７ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（８６．５ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）の溶液に１−アミノ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オール（９３．２ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で一夜撹拌し，蒸発させた。残渣を１０ｍＬの水に懸濁し，濾過した。固体を飽和炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄し，高真空オーブンで一夜乾燥して，粗生成物を得，これをカラムクロマトグラフィーで精製し，トリエチルアミンを含む６％メタノール−ジクロロメタン（２滴／１００ｍＬの６％メタノール−ジクロロメタン）で溶出して，５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アミド（６２ｍｇ，３４％）を黄色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−１’），１０．９０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−１），７．７６（ｄｄ，Ｊ＝２．３８，９．３３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），７．７２（ｓ，１Ｈ，ビニル−Ｈ），７．６０（ｍ，ｂｒ．，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2−４’），６．９３（ｄｔ，Ｊ＝２．３８，８．９９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝４．５５，８．９９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），３．８３（ｍ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），３．３３（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｍ，ｂｒ，５Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．０４（ｍ，ｂｒ，６Ｈ，ＣＨ3ｘ２）．ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度，％）４２７（［Ｍ＋１］+.，１００）
実施例３
５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミドの合成
工程１
エタノール（５０ｍＬ）中のモルホリン（２．６ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）およびエピクロロヒドリン（２．３５ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で一夜撹拌した。溶媒を除去した後，残渣を塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈した。沈殿した透明固体を真空濾過により回収して，１−クロロ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（２．０ｇ，３７％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．４９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７５（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝５．２，１２Ｈｚ，２Ｈ），４．５４（ｍ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），６．６４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）１８０．２（Ｍ＋１）
工程２
１−クロロ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（２．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）をメタノール中ＮＨ3（２５重量，２０ｍＬ）の溶液で室温で処理した。窒素を反応混合物中に吹き込んでアンモニアを除去した。溶媒を蒸発させて，１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（２．０ｇ，９１％）の塩酸塩を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．３０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３６（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ2），２．６５（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ2），３．８７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），５．３２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），８．０２（ｂｒｓ．，３Ｈ，ＮＨ3 +）．ＭＳ（ｍ／ｚ）１６１．１（Ｍ＋１）
工程３
５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１２０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（７４ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミド（６５ｍｇ，３６％）を沈殿させた。母液を蒸発乾固させ，残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して，追加の２Ｎ（７０ｍｇ，３９％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２８（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．４０，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．１５（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｍ，１Ｈ），４．７３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝４．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｔｄ，2Ｊ＝２．８，3Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ）（芳香族およびビニル），１０．８７（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４４１．４（Ｍ−１）
塩化２−ヒドロキシ−７−オキサ−４−アゾニアスピロ［３．５］ノナンの合成
Figure 0003677501
 熱電対，窒素入口および２５０ｍｌの滴下漏斗を備えた１Ｌの３ツ口丸底フラスコに，モルホリン（９１．５ｇ，９１．５ｍｌ，１．０５ｍｏｌｅ，１．０ｅｑ．）および１００ｍｌのエタノールを入れた。エピクロロヒドリン（１００ｇ，８４．５ｍｌ，１．０８ｍｏｌｅ，１．０３ｅｑ．）を滴下漏斗から約３０分間かけて加えながら溶液を急速に撹拌した。温度をモニターし，フラスコの温度が２７℃に達したときに，反応液を氷水浴で冷却した。透明溶液を１８時間撹拌した。反応はＧＣにより測定した（５滴の反応混合物を１ｍｌのエタノールで希釈し，１５ｍＤＢ−５キャピラリーＧＣカラムに注入し，以下のパラメータで運転した：インジェクター２５０℃，検出器２５０℃，初期オーブン温度２８℃，１０℃／分で２５０℃に加熱）。反応が完了したとき，３％未満のモルホリンが残存していた。反応液を５０℃の浴およびフルハウスバキュームを用いて回転蒸発器で蒸発物が凝縮しなくなるまで濃縮した。得られた油状物を室温で２４−４８時間，または有意な量の結晶が観察されるまで保存した（種晶を入れることにより工程を加速することができる）。スラリーを２５０ｍｌのアセトンで希釈し，濾過した。固体を真空オーブン中で６０℃で１８−２４時間乾燥した。８４ｇの結晶生成物が得られた。母液を濃縮し，結晶化工程を繰り返すことにより，回収率を増加することができる。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ６．５５（ｄ，１Ｈ），４．６４（ｍ，１Ｈ），４．５３（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｍ，２Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７０．９，６１．３９，６１．０４，６０．２５，５８．５４，５７．８０
１−アミノ−３−（４−モルホリニル）−２−プロパノール（ラセミ体）の合成
Figure 0003677501
 機械的撹拌子を備えた３Ｌの１ツ口丸底フラスコに塩化２−ヒドロキシ−７−オキサ−４−アゾニアスピロ［３．５］ノナン（１５０ｇ，８３５ｍｍｏｌｅ）を入れ，次にメタノール中２３重量％の無水アンモニア（２１２０ｍｌ）を加えた。フラスコに栓をし，得られた透明溶液を２０−２３℃で１８時間撹拌した。上述の条件のＧＣは，出発物質が残存していないことを示した。栓をはずし，アンモニアを溶液から３０分間曝気した。次にフラスコを回転蒸発器に移し，４５℃の油浴中でフルハウスバキュームで濃縮して，白色固体を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．５７（ｄｄ，２Ｈ），３．３−３．５（ｍ，６Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ），２．２−２．４（ｍ，６Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７０．８，６７．１，６０．１，５３．８，４８．１
上述の実施例３に記載される方法にしたがって，２−（ＲＳ）−１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールを２−（Ｓ）−１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（以下に記載されるようにして製造）で置き換えて，所望の化合物５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−（Ｓ）−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミドを得た。
１−アミノ−３−（４−モルホリニル）−２−プロパノール（非ラセミ体）の合成
Figure 0003677501
 機械的撹拌，熱電対および滴下漏斗を備えた１Ｌの３ツ口丸底フラスコにモルホリン（９１．５ｇ，９１．５ｍｌ，１．０５ｍｏｌｅ，１．０ｅｑ．）および４５ｍｌのｔ−ブタノールを入れた。Ｒ−エピクロロヒドリン（１００ｇ，８４．５ｍｌ，１．０８ｍｏｌｅ．１．０３ｅｑ．）を滴下漏斗から約３０分間かけて加えながら溶液を急速に撹拌した。温度をモニターし，フラスコの温度が２７℃に達したときに，反応液を氷水浴で冷却した。透明溶液を１８時間撹拌した。反応はＧＣにより測定した（５滴の反応混合物を１ｍｌのエタノールで希釈し，１５ｍＤＢ−５キャピラリーＧＣカラムに注入し，以下のパラメータで運転した：インジェクター２５０℃，検出器２５０℃，初期オーブン温度２８℃，１０℃／分で２５０℃に加熱）。反応が完了したとき，３％未満のモルホリンが残存していた。溶液を１０℃に冷却し，温度を１５℃未満に保持しながらＴＨＦ（５７６ｇ）中のカリウムｔ−ブトキシドの２０重量％溶液を滴加した。得られた白色スラリーを１０−１５℃で２時間撹拌し，上述の条件を用いてＧＣで調べた。クロロヒドリンは認められなかった。混合物を５０℃の浴およびフルハウスバキュームを用いて回転蒸発器で濃縮した。得られた混合物を水（５００ｍｌ）および塩化メチレンで希釈した。相を分離し，水性相を塩化メチレン（５００ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮して，透明無色油状物を得た。１４５ｇ（収率９７％）のエポキシドが得られた。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．３（ｄｄ，４Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．６（ｄｄ，１Ｈ），２．５（ｄｄ，１Ｈ），２．４（ｍ，４Ｈ），２．２（ｄｄ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨz，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ６５．４，６０．１，５３．１，４８．９，４３．４
上述の粗エポキシドを機械的撹拌子を備えた３Ｌの１ツ口丸底フラスコに入れた。メタノール中の無水アンモニア（２４％ｗ／ｗ２．５Ｌ）を加え，フラスコに蓋をして，混合物を室温で２４時間撹拌した。上述の条件でのＧＣは，出発物質が残存していないことを示した。蓋をはずし，３０分間アンモニアを溶液から曝気した。次に，フラスコから回転蒸発器に移し，４５℃の浴およびフルハウスバキュームを用いて濃縮して，透明無色油状物を得た。１２４ｇの生成物が得られた。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨz，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．５７（ｄｄ，２Ｈ），３．３−３．５（ｍ，６Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ），２．２−２．４（ｍ，６Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨz，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７０．８，６７．１，６０．１，５３．８，４８．１
１−アミノ−３−（４−モルホリニル）−２−（Ｓ）−プロパノールの合成
機械的撹拌，熱電対および滴下漏斗を備えた１Ｌの３ツ口丸底フラスコに，モルホリン（９１．５ｇ，９１．５ｍｌ，１．０５ｍｏｌｅ，１．０ｅｑ．）および２００ｍｌのメタノールを入れた。Ｒ−エピクロロヒドリン（１００ｇ，８４．５ｍｌ，１．０８ｍｏｌｅ，１．０３ｅｑ．）を滴下漏斗から約３０分間かけて加えながら溶液を急速に撹拌した。温度をモニターし，フラスコの温度が２７℃に達したときに，反応液を氷水浴で冷却した。透明溶液を１８時間撹拌した。反応はＧＣにより測定した（５滴の反応混合物を１ｍｌのエタノールで希釈し，１５ｍＤＢ−５キャピラリーＧＣカラムに注入し，以下のパラメータで運転した：インジェクター２５０℃，検出器２５０℃，初期オーブン温度２８℃，１０℃／分で２５０℃に加熱）。反応が完了したとき，３％未満のモルホリンが残存していた。溶液を１０℃に冷却し，温度を１５℃未満に保持しながらメタノール（２３３ｇ，１．０８ｍｏｌｅ，２４７ｍｌ）中のナトリウムメトキシドの２５重量％溶液を滴加した。得られた白色スラリーを１０−１５℃で２時間撹拌し，ＧＣにより上述の条件を用いて調べた。クロロヒドリンは認められなかった。混合物を５０℃の浴およびフルハウスバキュームを用いて回転蒸発器で濃縮した。得られた混合物を水（５００ｍｌ）および塩化メチレンで希釈した。相を分離し，水性相を塩化メチレン（５００ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮して，透明な無色油状物を得た。これにより，１４５ｇ，収率９７％の１，２−エポキシ−３−モルホリン−４−イルプロパンを得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．３（ｄｄ，４Ｈ），３．１（ｍ，１Ｈ），２．６（ｄｄ，１Ｈ），２．５（ｄｄ，１Ｈ），２．４（ｍ，４Ｈ），２．２（ｄｄ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ６５．４，６０．１，５３．１，４８．９，４３．４
上述の粗１，２−エポキシ−３−モルホリン−４−イルプロパンを磁気撹拌子を有する３Ｌの１ツ口丸底フラスコに入れた。メタノール（２４％ｗ／ｗ２．５Ｌ）中の無水アンモニアを加え，フラスコに栓をし，混合物を室温で２４時間撹拌した。上述の条件のＧＣは，出発物質が残存していないことを示した。栓をはずし，アンモニアを３０分間溶液から曝気した。次にフラスコから回転蒸発器に移し，４５℃の浴でフルハウスバキュームで濃縮して，透明無色油状物を得た。１２４ｇの１−アミノ−３−（４−モルホリニル）−２−（Ｓ）−プロパノールが得られた。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ３．５７（ｄｄ，２Ｈ），３．３−３．５（ｍ，６Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ），２．２−２．４（ｍ，６Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７０．８，６７．１，６０．１，５３．８，４８．１
Figure 0003677501
 イミダゾールアミド（７．０ｇ，３２．３ｍｍｏｌ），アミン（１５．０ｇ，６４．６ｍｍｏｌ），５−フルオロオキシインドール（４．９３ｇ，３２．６ｍｍｏｌ），トリエチルアミン（９．７９ｇ，９６．９ｍｍｏｌ），およびＴＨＦ（８８ｍｌ）を混合し，６０℃に加熱した。茶色溶液が形成した。６０℃で２４時間撹拌した後，黄色スラリーを室温に冷却し，濾過した。ケークを８０ｍｌのＴＨＦで洗浄し，５０℃でハウスバキュームで一夜乾燥した。茶色固体（２３．２ｇ）が得られた。固体を３５０ｍｌの水中で室温で５時間スラリー化し，濾過した。ケークを１００ｍｌの水で洗浄し，５０℃でハウスバキュームで一夜乾燥した。８．３１ｇが得られ，化学収率は５６％であった。
Figure 0003677501
 温度計，凝縮器，磁気撹拌，および窒素入口を備えた０．２５Ｌフラスコに４．９２ｇの５−フルオロオキシインドール，７．０ｇのイミダゾールアミド，１５．５ｇの（Ｒ）−１−アミノ−３−（４−モルホリニル）−２−プロパノール，９．７８ｇのトリエチルアミンおよび８８ｍｌのテトラヒドロフランを入れた。混合物を６０℃で１６．５時間加熱した。反応液を周囲温度に冷却し，濾過した。得られた固体をアセトニトリル中で１１ｍｌ／ｇで３回連続してスラリー化し，真空下で乾燥して，３．６ｇ（２５．２５％）を得た［ＨＰＬＣ，ＨｙｐｅｒｓｉｌＢＤＳ，Ｃ−１８，５μ，（６：４），アセトニトリル：０．１Ｍ塩化アンモニウム，ＰＨＡ−５７１４３７＝４．０５分間］。Ｈ1ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ１０．８６（１Ｈ，ｂｓ）；７．７５（１Ｈ，ｄ）；７．７０（１Ｈ，ｓ）；７．５０（１Ｈ，ｍ）；６．８８（２Ｈ，ｍ）；４．７２（１Ｈ，ｂｓ）；３．７８（１Ｈ，ｂｓ）；３．５６（４Ｈ，ｍ）；３．３２（６Ｈ，ｍ）；３．１５（１Ｈ，ｍ）；２．４３（８Ｈ，ｂｍ）
実施例４
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１１３ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（７４ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミド（７７ｍｇ，４５．３％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２７（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．４０，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．１５（ｓ，１Ｈ），３．３２（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）（芳香族およびビニル），１０．８８（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４２５．４（Ｍ＋１）
実施例５
５−［５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１２６．６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（７４ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミド（１０７ｍｇ，５８％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２９（ｍ，１Ｈ），２．３３（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｍ，４Ｈ），２．４０，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．１５（ｓ，１Ｈ），３．３７（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）（芳香族およびビニル），１０．９９（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４５７．４（Ｍ−１）
ＲおよびＳ立体異性体は以下のようにして製造することができる。
Figure 0003677501
 イミダゾールアミド（７．０ｇ，３２．３ｍｍｏｌ），アミン（１５．５ｇ，９６．９ｍｍｏｌ），５−クロロオキシインドール（５．４８ｇ，３２．６ｍｍｏｌ），トリエチルアミン（１４ｍｌ），およびＴＨＦ（８８ｍｌ）を混合し，６０℃に加熱した。赤色溶液が形成された。６０℃で１６時間撹拌した後，黄色スラリーを室温に冷却し，濾過した。ケークを２ｘ５０ｍｌのＴＨＦで洗浄し，ハウスバキュームで５０℃で一夜乾燥した。４．３６ｇが得られ，化学収率は２９％であった。
Figure 0003677501
 イミダゾールアミド（６．８ｇ，３１．３ｍｍｏｌ），アミン（１０．０ｇ，６２．５ｍｍｏｌ），５−クロロオキシインドール（５．３ｇ，３１．６ｍｍｏｌ），およびＴＨＦ（１００ｍｌ）を混合し，６０℃に加熱した。赤色溶液が形成された。６０℃で６８時間撹拌した後，トリエチルアミン（１４ｍｌ）を加え，６０℃で５時間撹拌した。反応は完了しなかった。４．６ｇのアミン側鎖を加え，６０℃で２０時間撹拌した。黄色スラリーを室温に冷却し，濾過した。ケークを２ｘ５０ｍｌのＴＨＦで洗浄し，５０℃でハウスバキュームで一夜乾燥した。５．４８ｇが得られ，化学収率は３８％であった。
実施例６
５−［５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（７２．２ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オール（３８ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−アミド（５５ｍｇ，５５％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２７（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｍ，４Ｈ），２．４１，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．１３（ｓ，１Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）（芳香族およびビニル），１０．９９（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５０３．４（Ｍ−１）
実施例７
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミドの合成
工程１
エタノール（５０ｍＬ）中の３−［１，２，３］トリアゾール（２．０ｇ，２９ｍｍｏｌ），エピクロロヒドリン（３．４ｍｌ，４３．５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン（２．６ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一夜撹拌した。溶媒を除去した後，残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝１００／１−１００／２−１００／４）により精製して，１−クロロ−３−（１，２，３）−トリアゾール−２−イルプロパン−２−オール（２．１ｇ，４５％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．５２（ｍ，２Ｈ，ＯＨおよびＣＨ2），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝５．２，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．６８（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｓ，２Ｈ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）１６２．１（Ｍ＋１）および１−クロロ−３−（１，２，３）トリアゾール−１−イルプロパン−２−オール（２．３ｇ，４９％）．1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．５６（ｓ，１Ｈ），３．５７（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｍ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄｄ，Ｊ＝３．８，１４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）１６２．１（Ｍ＋１）
工程２
１−クロロ−３（１，２，３）トリアゾール−１−イルプロパン−２−オール（２．３ｇ，１３ｍｍｏｌ）を密封圧力容器中でメタノール（２５重量％，２０ｍＬ）中のＮＨ3の溶液で６０℃で一夜処理した。室温に冷却した後，反応混合物中に窒素を曝気して，アンモニアを除去した。溶媒を蒸発させて，１−アミノ−３−（１，２，３）トリアゾール−１−イルプロパン−２−オール（２．５７ｇ，１００％）の塩酸塩を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９７（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．５７（ｄｄ，Ｊ＝４．６，１４Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），７．７７（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｂｒｓ．，３Ｈ，ＮＨ3 +），８．１２（ｓ，１Ｈ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）１４３．１（Ｍ＋１）
工程３
５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１１３ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３（１，２，３）トリアゾール−１−イル−プロパン−２−オール（８５ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド（７０ｍｇ，４１％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４５，２．４８（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．３５（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１４Ｈｚ，１Ｈ），５．４３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．９１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），１０．９３（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４０５．４（Ｍ−１）
実施例８
５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１２０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３（１，２，３）トリアゾール−１−イル−プロパン−２−オール（８５ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド（１００ｍｇ，６２％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４２，２．４４（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．２７（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝４．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｔｄ，2Ｊ＝２．４，3Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｍ，３Ｈ），７．７５（ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｓ．１Ｈ），１０．９３（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．７３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４２３．４（Ｍ−１）
実施例９
５−［５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１２６．６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３（１，２，３）トリアゾール−１−イル−プロパン−２−オール（８５ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド（４８ｍｇ，２７％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４２，２．４４（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．２７（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，Ｊ＝３．２，１４Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４３９．４（Ｍ−１）
実施例１０
５−［５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデン−メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミドの合成
５−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１４４．４ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を１−アミノ−３（１，２，３）トリアゾール−１−イル−プロパン−２−オール（８５ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）と縮合させて，５−［５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド（１３０ｍｇ，６７％）を沈殿させた。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４１，２．４４（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），３．２７（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１４Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｓ．１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），１１．０（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４８５．４（Ｍ−１）
５−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸，５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸，５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸の合成は，“ＰＹＲＲＯＬＥ ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ ２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥ−−ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ”と題する米国特許出願０９／７８３，２６４（本出願人の出願，２００１年２月１４日出願）に記載されており，その開示をすべて本明細書の一部としてここに引用する。
実施例１１
１−アミノ−３−（１，ｌ−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−プロパン−２−オールの合成
Figure 0003677501
 ＨＯＣＨ3（２００ｍＬ）中のチオモルホリン（５．０ｇ，４８．７ｍｍｏｌ）の溶液に，Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）中のオキソン（３６．０ｇ，５８．５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を４０℃で４８時間よく撹拌し，次に０℃に冷却した。水性ＮａＯＨを滴加してｐＨ＝１２に調節した。固体を濾別し，ＨＯＣＨ3（３ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。合わせた液体を凝縮し，シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して（ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ／ＮＨ3・Ｈ2Ｏ＝３／１／０．１−２／１／０．ｌ），チオモルホリン１，１−ジオキシド（６．２ｇ）を収率９３％で得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．９７（ｍ，４Ｈ），３．０７（ｍ，４Ｈ），３．４２（ｂｒｓ，１Ｈ），ＭＳ（ｍ／ｚ）１３６（Ｍ＋ｌ）。
エタノール（５０ｍＬ）とＨ2Ｏ（５ｍｌ）との混合溶媒中のチオモルホリン１，１−ジオキシド（２．５ｇ．，１８．５ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−（−）エピクロロヒドリン（１．５５ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）の混合物を２５℃で２４時間撹拌した。溶媒を除去した後，残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して，（Ｒ）−１−クロロ−３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−プロパン−２−オール（４．０ｇ，９６％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．５０（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），３０５（ｍ，４Ｈ），３．５４（ｄｄ，Ｊ＝５．８，１１．２，Ｈｚ，１Ｈ），３．６３（ｄｄ，Ｊ＝４．４，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｍ，｀Ｈ，ＣＨ），５．１０（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），ＭＳ（ｍ／ｚ）２２８．２（Ｍ＋１）
（Ｒ）−１−クロロ−３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−プロパン−２−オール（２．２７ｇ，１０ｍｍｏｌ）をメタノール中のＮＨ3の溶液（２５重量％，２０ｍＬ）で５０℃で１２時間処理した。溶媒を蒸発させた後，残渣を水中でアニオン交換樹脂（ＡＧ１ｘ８，ＯＨ形）で処理して，粗（Ｓ）−１−アミノ−３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−プロパン−２−オール（２．０ｇ）を得た。これには，約３０％のダイマーが夾雑しており，単にカラムクロマトグラフィーにより精製することができた。ＭＳ（ｍ／ｚ）２０９．２（Ｍ＋１）。（Ｓ）−１−アミノ−３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−プロパン−２−オールをオキシインドールと縮合させて，所望のインドリノンを得た（精製後収率５０−８０％）。
（Ｒ）−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸［３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−アミド
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．３９，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．４９（ｍ，１Ｈ），２．５６（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），３．０７（ｍ，４Ｈ），３．１６（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，ＩＨ，ＯＨ），６．８６（ｄ，＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）（芳香族およびビニル），１０．８８（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４７３．４（Ｍ＋１）
（Ｒ）−５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸［３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−アミド
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４０，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．５４（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｍ，４Ｈ），３．１７（ｍ，１Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）６．９１（ｔｄ，2Ｊ＝２．８，3Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ）７．７５（ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．２Ｈｚ，１Ｈ），１０．８８（ｓ，１Ｈ），１３．６７（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４９１．４（Ｍ＋１）
（Ｒ）−５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸［３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−アミド
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４０，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．４５（ｍ，１Ｈ），２．５３（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｍ，４Ｈ），３．１７（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），６．８５（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．９８（ｓ，１Ｈ），１３．６２（ｓ，１Ｈ），ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５０７．２（Ｍ＋１）
（Ｒ）−５−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル），２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸［３−（１，１−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−アミド
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．４１，２．４２（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．５４（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），３．０６（ｍ，４Ｈ），３．１８（ｍ，１Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝５．８，１Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．９８（ｓ，１Ｈ）１３．６２（ｓ，１Ｈ），ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）５５３．６（Ｍ＋１）
実施例１２
（Ｓ）または（Ｒ）−１−メチルアミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールの合成
Figure 0003677501
 エタノール（１０ｍＬ）中のモルホリン（１．７４ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−エピクロロヒドリン（１．５６ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で４８時間撹拌した。溶媒を除去した後，残渣を，水中のＣＨ3ＮＨ2の溶液（４０重量％，２０ｍＬ）で室温で１４時間で処理した。溶媒を除去して，粗（Ｓ）−１−メチルアミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールを得，これは真空蒸留またはカラムクロマトグラフィーにより精製することができた（２．４ｇ．７０％）。（Ｒ）−１−メチルアミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールは，（Ｓ）−エピクロロヒドリンから収率７６％で生成した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３３（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４２（ｍ，１Ｈ），２．４４（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｍ，４Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ６７．０６，６５．５８，６２．８０，５５．８７，５３．９４，３６．７２，ＭＳ（ｍ／ｚ）１７５（Ｍ＋１）
（Ｓ）−１−メチルアミノ−３−モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールを５−フルオロキシインドールと縮合させて，（Ｒ）−５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−メチル−アミドを得た。
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．０（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，６Ｈ），２．２８（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｓ，１Ｈ），２．９５（ｓ，１Ｈ），３．０（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，２Ｈ），３．９７＆３．６８（２ｘｂｒｓ，１Ｈ），４．８０＆４．７４（２ｘｂｒｓ，１Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝４．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｔｄ，2Ｊ＝２．３，3Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．０Ｈｚ，１Ｈ），１０．８６（ｓ，１Ｈ），１３．５７（ｓ，１Ｈ），ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４５７．２（Ｍ＋１）
（Ｒ）−１−アミノ−３モルホリン−４−イル−プロパン−２−オールから（Ｓ）−５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−３−モルホリン−４−イル−プロピル）−メチル−アミドを得た。
Figure 0003677501
 1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．０（ｍ，３Ｈ），２．１０（ｍ，１Ｈ），２．２２（ｍ，６Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），２．９０（ｓ，１Ｈ），２．９６（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，２Ｈ），３．９３＆３．６４（２ｘｂｒｓ，１Ｈ），４．７５＆４．７０（２ｘｂｒｓ，１Ｈ），６．７７（ｄｄ，Ｊ＝４．６，８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｔｄ，2Ｊ＝２．５，3Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７６７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ），１０．８１（ｓ，１Ｈ）１３．５２（ｓ，１Ｈ），ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）４５７．２（Ｍ＋１）
実施例１３
アミン側鎖の製造
３−（１−Ｈ−テトラゾール−１−イル）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパンおよび３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン
無水アセトニトリル（３０ｍｌ）中の６．９０５ｇのテトラゾール（１００ｍｍｏｌ）および１．７５ｍｌのジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｍｏｌ）および１１．７３ｍｌのエピクロロヒドリン（１５０ｍｍｏｌ）を６０℃で４時間撹拌した。得られた溶液を蒸発させ，ハイバックで乾燥し，シリカのカラムでクロロホルム−メタノール１００：８で精製した。第１の画分から純粋な３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン，６．２１５ｇ（無色油状物，収率３８％）が得られ，第２の画分から９．２０８ｇの純粋な３−（１−Ｈ−テトラゾール−１−イル）］−２−ヒドロキシｌ−１−クロロプロパン（粘着性ガム；収率５７％）を得た。
３−（１−Ｈ−テトラゾール−１−イル）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパン
９．１１０ｇの３−（１−Ｈ−テトラゾール−１−イル）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン，１５ｇの炭酸カリウムおよび１３０ｍｌの飽和メタノール性アンモニアを２１時間撹拌し，次に濾過し，蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−水性アンモニア８０：３５：４で精製した。７．３２６ｇの白色粘着性ガム（９１．５％（ｔｈ））を得た。
３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパン
６．１０５ｇの３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン，１０ｇの炭酸カリウムおよび９５ｍｌの飽和メタノール性アンモニアを２１時間撹拌し，次に濾過し，蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−水性アンモニア６０：２５：２で精製して，３．７２６ｇの白色結晶固体（６９．５％（ｔｈ））を得た。
３−［（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジメチルモルホリン−４−イル］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパン
４．７ｍｌのエピクロロヒドリン（６０ｍｍｏｌ）を，トリフルオロエタノール（５ｍｌ）中のｃｉｓ−２，６−ジメチルモルホリン（４．６０７ｇ，４０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に加えた。溶液を０−５℃で１時間撹拌し，冷浴をはずし，室温でさらに５時間撹拌した。混合物をハイバックで蒸発させ，得られた油状残渣を無水エタノール（５０ｍｌ）に溶解し，溶液を氷浴で冷却し，固体ナトリウムメトキシド（２．２７ｇ）を２回に分けて加え，混合物を０−５℃で２時間撹拌した。次に反応混合物を濾過し，塩をエタノール（３０ｍｌ）で洗浄し，合わせた濾液を氷冷濃水性アンモニア（２００ｍｌ）に加えた。混合物を室温で１２時間撹拌し，次にハイバックで蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−７Ｍメタノール性アンモニア８０：１５：３の混合物で精製して，５．７５ｇの白色結晶吸湿性固体を得た（７６．３％（ｔｈ））。
（２Ｓ）−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパンおよび（２Ｓ）−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−ヒドロキシ−１−アミノプロプロパン
無水アセトニトリル中の３．４２３ｇの３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン（３．４２３ｇ）および３．６０ｍｌのＲエピクロロヒドリン（−）（９９％ｅ．ｅ．）および０．３０ｍｌのバートン（Ｂａｒｔｏｎ）塩基（１．５ｍｍｏｌ）を６０℃で２０時間撹拌した。得られた溶液をハイバックで蒸発させ，シリカのカラムでクロロホルム−メタノールの混合物（５−２０％メタノールの勾配）で精製して，５．５７２ｇのクロロ−化合物を白色非晶質固体（収率９０％）として得た。塩化物は以下のようにしてアミンに変換した。得られたヒドロキシ−クロロ中間体をメタノール性アンモニア（アンモニアガスで飽和）に溶解し，炭酸カリウムを加え，混合物を密封フラスコ中で２．５日撹拌した。反応混合物を濾過し，濾液を蒸発させた。残渣をシリカカラムでクロロホルム−メタノール−濃水性アンモニア８０：１５：１．５の混合物で精製した。
実施例１４
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（２Ｈ−テトラゾール−２−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２２）（一般的方法）
７２ｍｇの３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１０５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜（３Ｚ）−３−（｛３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（４８０ｍｇ；１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）でヒューニッヒ塩基（３．０ｍｏｌ；０．５２５ｍｌ）の存在下でＨＡＴＵ試薬（５７０ｍｇ；１．５ｍｍｏｌ）で活性化し，クロロホルム（５ｍｌ）で沈殿させ，高真空で乾燥することにより収率９２％（５７９ｍｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥して，１０６ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例１５
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（２Ｈ−テトラゾール−２−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２３）（一般的方法）
７２ｍｇの３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１０９ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜（３Ｚ）−３−（［３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）−５−クロロ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（１．５２０ｇ；４．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）中でヒューニッヒ塩基（９．０ｍｍｏｌ；１．５８ｍｌ）の存在下でＨＡＴＵ試薬（１．７６８ｇ；４．６５ｍｍｏｌ）で活性化し，クロロホルム（２０ｍｌ）で沈殿させ，高真空で乾燥して収率９４％（１．９０７ｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥して，１０９ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例１６
Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（２Ｈ−テトラゾール−２−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−５−［（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２４）（一般的方法）
７２ｍｇの３−（２−Ｈ−テトラゾール−２−イル）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１２１．５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−トリフルオロメトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜（３Ｚ）−３−（（３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）−５−トリフルオロメトキシ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（１．７６８ｇ；４．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）中のヒューニッヒ塩基（９．０ｍｍｏｌ；１．５８ｍｌ）の存在下でＨＡＴＵ試薬（１．７５８ｇ；４．８ｍｍｏｌ）で活性化し，蒸発させ，無水アセトニトリルで沈殿させ，高真空中で乾燥することにより収率８５．５％（１．９２９ｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥した。収率１１３ｍｇで橙色結晶固体を得た。
実施例１７
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２５）
実施例１４の方法にしたがって，７２ｍｇの対応するアミンから１１３ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例１８
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２６）
実施例１５の方法にしたがって，７２ｍｇの対応するアミンから１２２ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例１９
Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−５−［（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２７）
実施例１６の方法にしたがって，７２ｍｇの対応するアミンから１１８ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２０
Ｎ−［３−［（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジメチルモルホリン−４−イル］−２−ヒドロキシプロピル）−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２８）
実施例１４の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから９９ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２１
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［３−［（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジメチルモルホリン−４−イル］−２−ヒドロキシプロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物２９）
実施例１５の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１０１ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２２
Ｎ−［３−［（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジメチルモルホリン−４−イル］−２−ヒドロキシプロピル］−２，４−ジメチル−５−［（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３０）
実施例１６の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから８９ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２３
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）］２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３４）
実施例１４の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１０９ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２４
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３６）
実施例１５の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１０７ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２５
Ｎ−［（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−５−｛（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル｝−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３５）
実施例１６の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１２３ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２６
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３１）
実施例１４の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１１０ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２７
５［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３２）
実施例１５の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１０３ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２８
Ｎ−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−５−｛（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデンメチル｝−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（化合物３３）
実施例１６の方法にしたがって，９５ｍｇの対応するアミンから１２０ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例２９
５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル
Figure 0003677501
 ＤＭＦ（４ｍＬ，３ｅｑ）を氷浴中で撹拌しながら冷却した。これにＰＯＣＬ3（１．１ｅｑ．，１．８ｍＬ）を加えた。３０分後，ＤＭＦ（２Ｍ，９ｍＬ）中の３，５−ジメチル−４−エチルエステルピロール（４ｇ，１７．４ｍｍｏｌ）の溶液を反応液に加え，撹拌を続けた。１０分後，反応混合物は固化した。これを５ｍＬのＤＭＦで希釈し，９０℃の油浴中で加熱した。１時間後，反応液を室温に冷却し，水（１００ｍＬ）で希釈し，１ＮＮａＯＨでｐＨ＝１１に塩基性にした。生成物を塩化メチレン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出し，有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し，乾燥し（ＭｇＳＯ4），濃縮して，４．３ｇ（９５％）の５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルを茶色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１１（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），７．３５（ｓ，５Ｈ，ＡｒＨ），３．９８（ｑ，Ｊ＝６．８および７．２Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ 2ＣＨ3），２．４８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3），０．９８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ 3）
５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸
Figure 0003677501
 ５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルを水（１００ｍＬ）およびメタノール（４５ｍＬ）に撹拌しながら溶解した。ＫＯＨ（２ｅｑ．１．９ｇ）を加え，１００℃に加熱した。２．５時間後，室温に冷却し，酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出することにより残存エステルを除去し，乾燥し，濃縮した。水層を２ＮＨＣｌを用いてｐＨ＝３に酸性にした。白色固体を濾過により除去し，水ですすいだ。固体をトルエンから再濃縮し，ヘキサン中で破砕し，乾燥して，２ｇ（５２％）の灰白色固体を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ），１１．９５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．０８（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），７．３６（ｓ，５Ｈ，ＡｒＨ），２．４９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ 3）．ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度％，イオン）実測値２２９（１００，Ｍ+）；計算値２２９．２
５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アミド
Figure 0003677501
 クロロホルム（６０ｍＬ）中の５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１．０ｇｍ，４．３６ｍｍｏｌ），１−アミノ−３−ジエチルアミノ−２−プロパノール（９５０ｍｇ，６．５４ｍｍｏｌ），ＤＤＣ（９００ｍｇ，４．３６ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（８８４ｍｇ，６．５４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で１２時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム（６０ｍＬ）に注加し，これに１ＮＮａＯＨ（８ｍＬ）を加えた。次にこれをＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し，水およびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，４００ｍｇの５−ホルミル−２−メチル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アミドを得た。
実施例３０
化合物１１−２１の合成の方法
ＤＭＳＯ中に，各オキシインドールの０．３６Ｍ溶液および各アルデヒドの０．５７６Ｍ溶液を調製する。２００μＬのＤＭＳＯの存在下で３００μＬの適当なオキシインドールを３００μＬの適当なアルデヒドと混合する。次に，４０ｍｇのジエチレントリアミンスカベンジャー樹脂を加える。混合物をロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ブロックに入れ，ブロックを密封し，６０℃のオーブン中に入れ，１８時間振盪する。
１８時間後，ロビンズブロックをオーブンから取り出す。ブロックの上部シールを除き，８００μＬのＤＭＳＯを混合物に加える。次に，ブロックを再び密封し，６０℃のオーブンに入れ，１時間連続して回転させる。
１時間が経過した後，ロビンズブロックをオーブンから取り出し，冷却させる。ロビンズブロックの下部シールを注意深く除き，ブロック全体を濾過装置に取り付け，ここで，新たに合成された化合物を樹脂から濾別する。
実施例３１
３−［１−Ｈ−（７−アザベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパン
無水クロロホルム中の４．０８３ｇの１−ヒドロキシ−７−アザベンズトリアゾール（３０ｍｍｏｌ）および０．５３ｍｌのジイソプロピルアミン（３ｍｍｏｌ）および４．７０ｍｌのエピクロロヒドリンを６０℃で２時間撹拌した。反応混合物をシリカのカラムに負荷し，クロロホルム−メタノール混合物１００：３で溶出した。得られたヒドロキシ−クロロ中間体（４．８３ｇ，淡黄色油状物，収率７０％）をメタノール性アンモニア（１００ｍｌ，アンモニアガスで飽和）に溶解し，８．３ｇの炭酸カリウムを加え，混合物を密封フラスコ中で２．５日間撹拌した。反応混合物を濾過し，濾液を蒸発させた。残渣をクロロホルム−メタノール−濃水性アンモニア８０：１５：１．５の混合物でシリカカラムで精製して，２．７９３ｇの白色結晶固体を得た（塩化物から合計６３％）。
３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパンおよび３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル−３−Ｎ−オキシド）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン
無水クロロホルム中の１２．１６２ｇのヒドロキシアザベンズトリアゾール（９０ｍｍｏｌ），１．５９ｍｌのジイソプロピルエチルアミン（９ｍｍｏｌ）および１４．１ｍｌのエピクロロヒドリン（１８０ｍｍｏｌ）を５５℃で２時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ，残渣をハイバックで乾燥し，次にシリカカラムでクロロホルム−メタノール１００：５の混合物で精製した。第１の画分から３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン１０．５７０ｇ（淡黄蜂蜜色；収率５１．５％）を，次に３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル−３−Ｎ−オキシド）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパン９．９９０ｇ（白色結晶固体，収率４８．５％）を得た。
３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル−３−Ｎ−オキシド）］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパン
３−［１−Ｈ−（ベンズトリアゾリル−３−Ｎ−オキシド）］−２−ヒドロキシ−１−クロロプロパンのアミノ分解により，３−［１−Ｈ−（７−アザベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンの合成と同様にして表題化合物を製造した。
実施例３２
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（一般的方法）
１０５ｍｇの３−［１−Ｈ−（７−アザベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１０５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜ＤＭＦ（５ｍｌ）中の（３Ｚ）−３−（｛３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（４８０ｍｇ；１．６ｍｍｏｌ）ｍｍｏｌ；０．５２５ｍｌ）をクロロホルム（５ｍｌ）で沈殿させ，高真空下で乾燥することにより収率９２％（５７９ｍｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）中で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥して，１２１ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例３３
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（一般的方法）
１０５ｍｇの３−［１−Ｈ−（７−アザベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１０９ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜（３Ｚ）−３−（｛３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−５−クロロ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（１．５２０ｇ；４．８ｍｍｏｌ）をヒューニッヒ塩基（９．０ｍｍｏｌ；１．５８ｍｌ）の存在下でＤＭＦ（２０ｍｌ）中でＨＡＴＵ試薬（１．７６８ｇ；４．６５ｍｍｏｌ）で活性化し，クロロホルム（２０ｍｌ）で沈殿させ，高真空下で乾燥することにより収率９４％（１．９０７ｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥して，１３０ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例３４
５−［（Ｚ）−（５−トリフルオロメトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（一般的方法）
１０５ｍｇの３−［１−Ｈ−（７−アザベンズトリアゾリル）−オキシ］−２−ヒドロキシ−１−アミノプロパンを，１２１．５ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の５−［（Ｚ）−（５−トリフルオロメトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸１−オキシ−７−アザベンズトリアゾールエステル＜（３Ｚ）−３−（｛３，３−ジメチル−４−カルボキシ−１−Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−５−トリフルオロメトキシ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（１．７６８ｇ；４．８ｍｍｏｌ）をヒューニッヒ塩基（９．０ｍｍｏｌ；１．５８ｍｌ）の存在下でＤＭＦ（２５ｍｌ）中でＨＡＴＵ試薬（１．７５８ｇ；４．８ｍｍｏｌ）で活性化し，蒸発させ，無水アセトニトリルで沈殿させ，高真空下で乾燥することにより収率８５．５％（１．９２９ｇ）で純粋な形で単離することにより製造した＞の無水ジメチルアセトアミド（１．５ｍｌ）中のスラリーに加えた。混合物を３０分間撹拌し，ハイバックで乾燥した。残渣をメタノール−ジエチルアミン２０：１（３ｍｌ）の混合物に懸濁し，冷蔵庫（５℃）で１時間放置して結晶化させ，濾過し，沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し，ハイバックで乾燥して，１４２ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例３５
５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３−オキシド−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
実施例３２の方法にしたがって，１０５ｍｇの対応するアミンから１２０ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例３６
５−［（Ｚ）−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３−オキシド−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
実施例３３の方法にしたがって，１０５ｍｇの対応するアミンから１２７ｍｇの橙色結晶固体を得た。
実施例３７
Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（３−オキシド−１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル）プロピル］−２，４−ジメチル−５−［（Ｚ）−［２−オキソ−５−（トリフルオロメトキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン］メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
実施例３４の方法にしたがって，１０５ｍｇの対応するアミンから１４１ｍｇの橙色結晶固体を得た。
生物学的実施例
以下のアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化合物を見いだす。
Ａ．アッセイ方法
以下のアッセイを用いて，活性のレベルおよび本発明の種々の化合物が１またはそれ以上のＰＫに及ぼす影響を決定することができる。任意のＰＫについて，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて同じように同様のアッセイを設計することができる。
本明細書に記載されるアッセイのいくつかは，ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントサンドイッチアッセイ）フォーマットで行う（Ｖｏｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９８０，"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，"Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｄ ｅｄ．，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．３５９−３７１）。一般的方法は以下のとおりである：試験キナーゼを発現する（天然にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。細胞を溶解させ，溶解物を酵素的リン酸化反応の基質を認識する特定の抗体で予め被覆したＥＬＩＳＡプレートのウエルに移す。細胞溶解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で基質上のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触していない対照細胞と比較する。
特定のＰＫについてのＥＬＩＳＡ実験を実施するための現在好ましいプロトコルを以下に記載する。しかし，他のＲＴＫ，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を決定するためにこれらのプロトコルを適合させることは，十分に当業者の技術の範囲内である。本明細書に記載される他のアッセイは試験キナーゼの活性化に応答して作成されたＤＮＡの量を測定するものであり，これは増殖性応答の一般的尺度である。このアッセイの一般的方法は以下のとおりである：試験キナーゼを発現する（天然にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。少なくとも一夜インキュベートした後，ＤＮＡ標識試薬，例えば５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）またはＨ3−チミジンを加える。抗ＢｒｄＵ抗体を用いて，または放射活性を測定することにより標識ＤＮＡの量を検出し，試験化合物と接触していない対照細胞と比較する。
ＧＳＴ−ＦＬＫ−１バイオアッセイ
このアッセイは，ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）ペプチドにおけるＧＳＴ−Ｆｌｋｌのチロシンキナーゼ活性を分析する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮｏ．５８０５−９６）
２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５）
３．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）（ｐＥＹ）被覆アッセイプレートの調製：１００μｌＰＢＳ中の２μｇ／ウエルのポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）（ｐＥＹ）を加え，室温で２時間保持するか，４℃で一夜保持する。プレートをよく覆って蒸発を防ぐ。
４．ＰＢＳ緩衝液：１Ｌにつき，０．２ｇＫＨ2ＰＯ4，１．１５ｇＮａ2ＨＰＯ4，０．２ｇＫＣｌおよび８ｇＮａＣｌを約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。すべての試薬が溶解したとき，ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。ｄＨ2Ｏで総容量を１Ｌとする。
５．ＰＢＳＴ緩衝液：１ＬのＰＢＳ緩衝液に１．０ｍｌＴｗｅｅｎ２０を加える。
６．ＴＢＢ−ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１．２１ｇＴＲＩＳ，８．７７ｇＮａＣｌ，１ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。１０ｇＢＳＡを加え，撹拌して溶解させる。ｄＨ2Ｏで総容量を１Ｌとする。濾過して粒子状物質を除去する。
７．１％ＢＳＡ，ＰＢＳ中：１ｘ作業溶液を作成するためには，１０ｇＢＳＡを約９９０ｍｌのＰＢＳ緩衝液に加え，撹拌して溶解させる。ＰＢＳ緩衝液で総容量を１Ｌに調節し，濾過して，粒子状物質を除去する。
８．５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５
９．ｓｆ９組換えバキュロウイルストランスフォーメーションから精製したＧＳＴ−Ｆｌｋｌｃｄ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）。
１０．４％ＤＭＳＯ，ｄＨ2Ｏ中
１１．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中
１２．４０ｍＭＭｎＣｌ2
１３．キナーゼ希釈緩衝液（ＫＤＢ）：１０ｍｌＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），１ｍｌ５ＭＮａＣｌ，４０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび０．４ｍｌの５％ＢＳＡ（ｄＨ2Ｏ中）を８８．５６ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。
１４．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２
１５．ＥＤＴＡ：１４．１２ｇエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を約７０ｍｌｄＨ2Ｏに混合する。ＥＤＴＡが溶解するまで１０ＮＮａＯＨを加える。ｐＨを８．０に調節する。ｄＨ2Ｏで総容量を１００ｍｌに調節する。
１６．１抗体希釈緩衝液：１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡを８９．５ｍｌのＴＢＳＴと混合する。
１７．西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ＰＹ９９ＨＲＰ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
１８．２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ，Ｍｏｓｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢＳＴ）
１９．１０％ＳＤＳ
方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレートを無菌ＰＢＳ中の２μｇのポリＥＹペプチドで，材料および試薬の工程３に記載されるように被覆する。
２．プレートを逆さにすることにより未結合液体をウエルから除去する。ＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１００μｌの１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
４．工程２を繰り返す。
５．ウエルを５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（１５０μｌ／ウエル）に浸漬する。
６．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でｄＨ2Ｏ／４％ＤＭＳＯで所望の最終アッセイ濃度の４倍に希釈する。
７．２５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエルには，２５μｌのｄＨ2Ｏ／４％ＤＭＳＯを加える。
８．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ2および４ｘＡＴＰ（２μＭ）を各ウエルに加える。
９．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。
１０．ＧＳＴ−Ｆｌｋｌを０．００５μｇ（５ｎｇ）／ウエルでＫＤＢで希釈する。
１１．５０μｌの希釈酵素を各ウエルに加える。
１２．振盪しながら室温で１５分間インキュベートする。
１３．５０μｌの２５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えることにより反応を停止する。
１４．ＴＢＳＴで３回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
１５．抗体希釈緩衝液中で１：５，０００に希釈した１００μｌ／ウエルの抗ホスホチロシンＨＲＰコンジュゲートを加える。振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。
１６．工程１４と同様に洗浄する。
１７．１００μｌのｒｔＡＢＴＳ溶液を各ウエルに加える。
１８．振盪しながら１０−１５分間インキュベートする。泡を除去する。
１９．２０μｌの１０％ＳＤＳを各ウエルに加えることにより反応を停止する。
２０．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭで結果を読む。
ＰＹＫ２バイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいて，ＨＡエピトープタグ付け全長ｐｙｋ２（ＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ）のインビトロキナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．１２ＣＡ５モノクローナル抗ＨＡ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ）
４．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，８．７６６ｇＮａＣｌ，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を約９００ｍｌｄＨ2Ｏ中で混合する。ｐＨを７．２に調節し，容量を１Ｌとする。
５．ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇ１０％ＢＳＡ，１２．１ｇ１００ｍＭＴＲＩＳ，５８．４４ｇ１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＬの１％ＴＷＥＥＮ２０を混合する。
６．ｓｆ９細胞溶解物からのＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．４％ＤＭＳＯ，ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ2Ｏ中
８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中
９．１ＭＭｎＣｌ2
１０．１ＭＭｇＣｌ2
１１．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
１２．１０Ｘキナーゼ緩衝液リン酸化：５．０ｍｌ１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），０．２ｍｌ１ＭＭｎＣｌ2，１．０ｍｌ１ＭＭｇＣｌ2，１．０ｍｌ１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２．８ｍｌｄＨ2Ｏ中で混合する。使用直前に０．１ｍｌ１ＭＤＴＴを加える。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１４．５００ｍＭＥＤＴＡ，ｄＨ2Ｏ中
１５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳおよび１ｍＬ１０％Ｔｗｅｅｎ−２０を８８ｍＬＴＢＳ中で混合する。
１６．ＨＲＰ−コンジュゲート化抗ＰｔｙｒＰＹ９９），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈＣａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−７０２０
１７．ＡＢＴＳ，Ｍｏｓｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢＳＴ−２０００
１８．１０％ＳＤＳ
方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの１２ＣＡ５抗ＨＡ抗体で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにすることにより未結合ＨＡ抗体をウエルから除去する。プレートをｄＨ2Ｏで洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。
５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（１．５μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。
７．工程４と同様に洗浄する。
８．５０μｌの２Ｘキナーゼ緩衝液を捕捉ｐｙｋ２−ＨＡを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中４００μＭ試験化合物を各ウエルに加える。対照ウエルには４％ＤＭＳＯのみを用いる。
１０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。
１１．２５μｌの２０ｐＭＡＴＰをすべてのウエルに加える。振盪しながら１０分間インキュベートする。
１２．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加えることにより反応を停止する。
１３．工程４と同様に洗浄する。
１４．１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｐｔｙｒ（１：６０００に希釈，抗体希釈緩衝液中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１５．プレートをＴＢＳＴで３回，ＰＢＳで１回洗浄する。
１６．１００μｌのＡＢＳＴ溶液を各ウエルに加える。
１７．必要ならば，２０μｌの１０％ＳＤＳを各ウエルに加えることにより発色反応を停止する。
１８．ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでプレートを読む。
ＦＧＦＲ１バイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイでＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｓｔａｒ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃３３６９）
２．ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５）
３．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ）
４．５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液溶液
５．ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）
６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．キナーゼ希釈緩衝液：５００μｌの１ＭＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ），２０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，１０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０μｌの５ＭＮａＣｌを混合する。
８．１０ｍＭＡＴＰ
９．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化ミックス：２０μｌのＡＴＰ，４００μｌの１ＭＭｎＣｌ2および９．５６ｍｌのｄＨ2Ｏを混合する。
１０．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２）
１１．０．５ＭＥＤＴＡ
１２．０．０５％ＴＢＳＴ
５００μｌのＴＷＥＥＮを１リットルのＴＢＳに加える。
１３．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１４．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，カタログ＃ＡＬＩ０４０４）
１５．ＡＢＴＳ溶液
１６．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液
方法：
１．Ｃｏｓｔａｒ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ウエルの１００μｌＰＢＳ中ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．被覆したプレートをＰＢＳで１回洗浄する。
３．１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳで２回，次に５０ｍＭＨｅｐｅｓで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
５．２５μｌの０．４ｍＭ試験化合物（４％ＤＭＳＯ中），または４％ＤＭＳＯ単独（対照）をプレートに加える。
６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１を希釈緩衝液（５μキナーゼ／５０μｌＫＤＢ／ウエル）で希釈する。
７．５０μｌの希釈キナーゼを各ウエルに加える。
８．２５μｌ／ウエルの新たに調製したＡＴＰ／Ｍｎ＋＋（０．４ｍｌ１ＭＭｎＣｌ2，４０μｌ１０ｍＭＡＴＰ，９．５６ｍｌｄＨ2Ｏ，新たに調製）を加えることによりキナーゼ反応を開始する
９．これは迅速なキナーゼ反応であり，ＡＴＰの添加と同様の様式で２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることにより停止しなければならない。
１０．プレートを新たなＴＢＳＴで４回洗浄する。
１１．抗体希釈緩衝液を作成する：５０ｍｌにつき，５ｍｌの５％ＢＳＡ，２５０μｌの５％ミルクおよび５０μｌの１００ｍＭバナジン酸ナトリウムを混合し，０．０５％ＴＢＳＴで最終容量とする。
１２．１００μｌ／ウエルの抗ホスホチロシン（１：１００００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１３．工程１０と同様に洗浄する。
１４．１００μｌ／ウエルのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：６０００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１５．工程１０と同様に洗浄し，次にＰＢＳで洗浄して泡および過剰のＴＷＥＥＮを除去する。
１６．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。
１７．振盪しながら１０−２０分間インキュベートする。泡を除去する。
１８．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００Ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
ＥＧＦＲバイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．ＳＵＭＯ１モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ
４．ＴＢＳＴ緩衝液
５．ブロッキング緩衝液：１００ｍｌにつき，５．０ｇカーネーションインスタント無脂ミルクを１００ｍｌＰＢＳと混合する。
６．Ａ４３１細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．ＴＢＳ緩衝液：
８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ：１Ｌにつき，１．５１４ｇＴＲＩＳ，２．１９２ｇＮａＣｌおよび２５ｍｌＤＭＳＯを混合物し，ｄＨ2Ｏで総容量１リットルとする。
９．ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸，ウマ筋肉，ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ａ−５３９４），１．０ｍＭ溶液，ｄＨ2Ｏ中。この試薬は，使用直前に作成し氷上に保持しなければならない。
１０．１．０ｍＭＭｎＣｌ2
１１．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化ミックス：１０ｍｌを作成するには，３００μｌの１ｍＭＡＴＰ，５００μｌのＭｎＣｌ2および９．２ｍｌのｄＨ2Ｏを混合する。使用直前に調製し，氷上に保持する。
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．ＥＤＴＡ
１４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）
１６．ＡＢＴＳ
１７．３０％過酸化水素
１８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2
１９．０．２ＭＨＣｌ
方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇのＳＵＭ０１で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合ＳＵＭＯ１をウエルから除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。
５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（７μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。
７．プレートを上述の４と同様に洗浄する。
８．１２０μｌのＴＢＳを捕捉ＥＧＦＲを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．試験化合物をＴＢＳ中に１：１０で希釈し，ウエル中に入れる。
１０．１３．５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに入れる。対照ウエルには１０％ＤＭＳＯ中１３．５μｌのＴＢＳを加える。
１１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１２．１５μｌのリン酸化ミックスを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに加える。最終ウエル容量は約１５０μｌであり，各ウエル中３μＭＡＴＰ／５ｍＭＭｎＣｌ2の最終濃度となるはずである。振盪しながら５分間インキュベートする。
１３．振盪しながら１６．５μｌのＥＤＴＡ溶液を加えることにより反応を停止させる。さらに１分間振盪する。
１４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。
１５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳＴ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。
１６．上述の４と同様に洗浄する。
１７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１８．上述の４と同様に洗浄する。
１９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。
２０．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。
２１．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌ／ウエルを加えることにより反応を停止させる。
２２．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む：試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭ。
ＰＤＧＦＲバイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．２８Ｄ４Ｃ１０モノクローナル抗ＰＤＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ
４．ＴＢＳＴ緩衝液
５．ブロッキング緩衝液（ＥＧＦＲバイオアッセイと同じ）
６．ＰＤＧＦＲ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．ＴＢＳ緩衝液
８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
９．ＡＴＰ
１０．ＭｎＣｌ2
１１．キナーゼ緩衝液リン酸化ミックス：１０ｍｌにつき，２５０μｌ１ＭＴＲＩＳ，２００μｌ５ＭＮａＣｌ，１００μｌ１ＭＭｎＣｌ2および５０μｌ１００ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００を十分なｄＨ2Ｏ中で混合して，１０ｍｌとする。
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．ＥＤＴＡ
１４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）
１６．ＡＢＴＳ
１７．過酸化水素，３０％溶液
１８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2
１９．０．２ＭＨＣｌ
方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌのＰＢＳ中０．５μｇ２８Ｄ４Ｃ１０で被覆し，４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合２８Ｄ４Ｃ１０をウエルから除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。
５．溶解物をＨＮＴＧ中で希釈する（１０μｇ溶解物／１００μｌＨＮＴＧ）
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
７．プレートを工程４に記載されるように洗浄する。
８．８０μｌの作業キナーゼ緩衝液ミックスを捕捉ＰＤＧＦＲを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳ中で１：１０に希釈する。
１０．１０μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエルには，１０μｌのＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１１．１０μｌのＡＴＰを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加える（最終ウエル容量は約１００μｌであり，各ウエルは２０μＭＡＴＰであるはずである）。振盪しながら３０分間インキュベートする。
１２．１０μｌのＥＤＴＡ溶液を各ウエルに加えることにより反応を停止する。
１３．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。
１４．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳＴ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。
１５．工程４と同様に洗浄する。
１６．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１７．工程４と同様に洗浄する。
１８．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。
１９．振盪しながら１０−３０分間インキュベートする。泡を除去する。
２０．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより反応を停止させる。
２１．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
細胞性ＨＥＲ−２キナーゼアッセイ
このアッセイを用いて，全細胞におけるＨＥＲ−２キナーゼ活性をＥＬＩＳＡフォーマットで測定する。
材料および試薬：
１．ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１１９６５−０９２）
２．ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯカタログ＃１６０００−０４４），水浴中で５６℃で３０分間熱不活性化する。
３．トリプシン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５２００−０５６）
４．Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５０３０−０８１）
５．ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１５６３０−０８０）
６．成長培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，５５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合する。
７．血清飢餓培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，２．５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合物する。
８．ＰＢＳ
９．平底９６−ウエル組織培養マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃２５８６０）
１０．１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃０８７５７１４８）
１１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジ，Ｔｒａｎｓｔａｒ９６（Ｃｏｓｔａｒカタログ＃７６１０）用
１４．ＳＵＭＯ１：モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ＴＢＳＴ緩衝液
１６．ブロッキング緩衝液：５％カーネーションインスタントミルク，ＰＢＳ中
１７．ＥＧＦリガンド：ＥＧＦ−２０１，Ｓｈｉｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊａｐａｎ．。粉体を１００μｌの１０ｍＭＨＣｌに懸濁する。１００μｌの１０ｍＭＮａＯＨを加える。８００μｌのＰＢＳを加え，エッペンドルフチューブに移し，使用するまで−２０℃で保存する。
１８．ＨＮＴＧ溶解緩衝液：保存５ＸＨＮＴＧ用には，２３．８３ｇＨｅｐｅｓ，４３．８３ｇＮａＣｌ，５００ｍｌグリセロールおよび１００ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００および十分なｄＨ2Ｏを混合して１Ｌの溶液とする。１ＸＨＮＴＧ＊用には，２ｍｌＨＮＴＧ，１００Ｌ０．１ＭＮａ3ＶＯ4，２５０μｌ０．２ＭＮａ4Ｐ2Ｏ7および１００μｌＥＤＴＡを混合する。
１９．ＥＤＴＡ
２０．Ｎａ３ＶＯ４．保存溶液を作成するためには，１．８４ｇＮａ３ＶＯ４を９０ｍｌｄＨ2Ｏと混合する。ｐＨを１０に調節する。電子レンジで１分間沸騰させる（溶液は透明になる）。室温に冷却する。ｐＨを１０に調節する。ｐＨが１０で安定するまで加熱／冷却のサイクルを繰り返す。
２１．２００ｍＭＮａ４Ｐ２Ｏ７
２２．ホスホチロシン特異的ウサギポリクローナル抗血清（抗Ｐｔｙｒ抗体，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
２３．アフィニティー精製抗血清，ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体，ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅカタログ＃ＡＬＩ０４０４）
２４．ＡＢＴＳ溶液
２５．３０％過酸化水素溶液
２６．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2
２７．０．２ＭＨＣｌ
方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１．０μｇ／ウエルのＳＵＭ０１で被覆する。最終容量１００μｌ／ウエル。４℃で一夜保存する。
２．使用の日に，被覆緩衝液を除去し，プレートをｄＨ2Ｏで３回，ＴＢＳＴ緩衝液で１回洗浄する。このアッセイにおいては，特に記載しない限り，すべての洗浄はこのように行う。
３．１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。使用直前にプレートを洗浄する。
４．このアッセイにはＥＧＦｒ／ＨＥＲ−２キメラ／３Ｔ３−Ｃ７細胞株を用いる。
５．８０−９０％コンフルエントの皿を選択する。トリプシン処理により細胞を回収し，１０００ｒｐｍで室温で５分間遠心分離する。
６．細胞を血清飢餓培地に懸濁し，トリパンブルーで計数する。９０％より高い生存度が必要である。細胞を血清飢餓培地に２，５００細胞／ウエルの密度で，９０μｌ／ウエルで９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した細胞を３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。
７．播種の２日後にアッセイを開始する。
８．試験化合物を４％ＤＭＳＯに溶解する。次に試料をプレート上で直接血清飢餓ＤＭＥＭでさらに希釈する。典型的には，この希釈は１：１０またはそれより高い。次にすべてのウエルを細胞プレートにさらに１：１０希釈して加える（１０μｌの試料および培地を９０μｌの血清飢餓培地に加える。最終ＤＭＳＯ濃度は１％以下でなければならない。標準的連続希釈を用いてもよい。
９．５％ＣＯ2，３７℃で２時間インキュベートする。
１０．保存ＥＧＦ（１６．５μＭ）を暖めたＤＭＥＭで１５０ｎＭに希釈することによりＥＧＦリガンドを調製する。
１１．１００μｌ／ウエルに十分な量のＨＮＴＧ＊を新たに調製する。氷上に置く。
１２．試験化合物とともに２時間インキュベートした後，調製したＥＧＦリガンドを細胞に５０μｌ／ウエルで加える。最終濃度は５０ｎＭである。陽性対照ウエルには同量のＥＧＦを加える。陰性対照にはＥＧＦを加えない。３７℃で１０分間インキュベートする。
１３．試験化合物，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで１回洗浄する。
１４．ＨＮＴＧ＊を細胞に１００μｌ／ウエルで移す。氷上に５分間置く。この間にブロッキング緩衝液をＥＬＩＳＡプレートから除去し，洗浄する。
１５．細胞をマイクロピペッターでプレートから掻き取り，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝液を繰り返し吸引分配することにより細胞材料をホモジナイズする。溶解物を，被覆しブロッキングし洗浄したＥＬＩＳＡプレートに移す。あるいは，Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジを用いて溶解物をプレートに移す。
１６．振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１７．溶解物を除去し，洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体（１：３０００，ＴＢＳＴ中）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。
１８．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１９．抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，洗浄する。新たに希釈したＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体をＥＬＩＳＡプレートに加える（１：８０００，ＴＢＳＴ中，１００μｌ／ウエル）。
２０．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
２１．ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体を除去し，洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。
２２．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。
２３．１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停止する。
２４．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタセット４１０ｎＭおよび参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
ＣＤＫ２／サイクリンＡアッセイ
このアッセイを用いて，シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）におけるヒトｃｄｋ２／サイクリンＡのインビトロセリン／トレオニンキナーゼ活性を測定する。
材料および試薬：
１．Ｗａｌｌａｃ９６−ウエルポリエチレンテレフタレート（ｆｌｅｘｉ）プレート（Ｗａｌｌａｃカタログ＃１４５０−４０１）
２．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒｅｄｉｖｕｅ［γ33Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＡＨ９９６８）
３．Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＲＰＮＱ０００７）。ビーズはＰＢＳ中でマグネシウムまたはカルシウムなしで２０ｍｇ／ｍｌで再構成しなければならない。
４．Ｓｆ９細胞から精製した活性化ｃｄｋ２／サイクリンＡ酵素複合体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
５．ビオチニル化ペプチド基質（Ｄｅｂｔｉｄｅ）．ペプチドビオチン−Ｘ−ＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬをｄＨ2Ｏに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。
６．ペプチド／ＡＴＰ混合物：１０ｍｌにつき，９．９７９ｍｌｄＨ2Ｏ，０．００１２５ｍｌ"コールド"ＡＴＰ，０．０１０ｍｌＤｅｂｔｉｄｅおよび０．０１０ｍｌγ33Ｐ−ＡＴＰを混合する。ウエルあたり最終濃度は，０．５μＭ"コールド"ＡＴＰ，０．１μｇＤｅｂｔｉｄｅおよび０．２μＣｉγ33Ｐ−ＡＴＰである。
７．キナーゼ緩衝液：１０ｍｌにつき，８．８５ｍｌｄＨ2Ｏ，０．６２５ｍｌＴＲＩＳ（ｐＨ７．４），０．２５ｍｌ１ＭＭｇＣｌ2，０．２５ｍｌ１０％ＮＰ４０を混合し，使用直前に０．０２５ｍｌ１ＭＤＴＴを新たに加える。
８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中
９．１ＭＴｒｉｓ，ＨＣｌでｐＨを７．４に調節する。
１０．１ＭＭｇＣｌ2
１１．１ＭＤＴＴ
１２．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１４１９０−１４４）
１３．０．５ＭＥＤＴＡ
１４．停止溶液：１０ｍｌにつき，９．２５ｍｌＰＢＳ，０．００５ｍｌ１００ｍＭＡＴＰ，０．１ｍｌ０．５ＭＥＤＴＡ，０．１ｍｌ１０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および１．２５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌＳＰＡビーズを混合する。
方法：
１．試験化合物の溶液を５％ＤＭＳＯ中に所望の最終濃度の５倍で調製する。各ウエルに１０μｌを加える。陰性対照用には，１０μｌの５％ＤＭＳＯ飲みをウエルに加える。
２．５μｌのｃｄｋ２／サイクリンＡ溶液を２．１ｍｌ２ｘキナーゼ緩衝液で希釈する。
３．２０μｌの酵素を各ウエルに加える。
４．１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。
５．キナーゼ反応を開始させるため，２０μｌのペプチド／ＡＴＰ混合物を各ウエルに加える。振盪せずに１時間インキュベートする。
６．２００μｌの停止溶液を各ウエルに加える。
７．少なくとも１０分間保持する。
８．プレートを約２３００ｒｐｍで３−５分間回転させる。
９．Ｔｒｉｌｕｘまたは類似のリーダーを用いてプレートを計数する。
ＭＥＴトランスリン酸化アッセイ
このアッセイを用いて，基質のｍｅｔトランスリン酸化のアゴニスト／アンタゴニストを同定する手段として，ポリ（グルタミン酸：チロシン（４：１））基質のホスホチロシンレベルを測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート，Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃２５８０５−９６
２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ；Ｐ０２７５
３．ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ
４．５０ｍＭＨＥＰＥＳ
５．ブロッキング緩衝液：２５ｇのウシ血清アルブミン，ＳｉｇｍａＣａｔ．ＮｏＡ−７８８８，を５００ｍｌＰＢＳに溶解し，４μｍフィルターを通して濾過する。
６．Ｍｅｔキナーゼドメインを含む精製ＧＳＴ融合蛋白質，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
７．ＴＢＳＴ緩衝液
８．１０％水性（ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ2Ｏ）ＤＭＳＯ
９．１０ｍＭ水性（ｄＨ2Ｏ）アデノシン−５’−三リン酸，ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ａ−５３９４
１０．２Ｘキナーゼ希釈緩衝液：１００ｍｌにつき，１０ｍＬ１ＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，０．４ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．２ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムおよび１ｍＬ５Ｍ塩化ナトリウムを８８．４ｍＬｄＨ2Ｏ中で混合する。
１１．４ＸＡＴＰ反応混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンおよび０．０２ｍＬ０．１ＭＡＴＰを９．５６ｍＬｄＨ2Ｏ中で混合する。
１２．４Ｘ陰性対照混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンを９．６ｍＬｄＨ2Ｏ中に混合する。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃Ｓ−７２０９２
１４．５００ｍＭＥＤＴＡ
１５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．５ｍＬ５％カーネーションインスタントミルク，ＰＢＳ中，および０．１ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを８８．４ｍＬＴＢＳＴ中で混合する。
１６．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
１７．ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ
１８．ＡＢＴＳ溶液：１Ｌにつき，１９．２１ｇクエン酸，３５．４９ｇＮａ２ＨＰＯ4および５００ｍｇＡＢＴＳを十分なｄＨ2Ｏ中で混合し，１Ｌとする。
１９．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2：１５ｍＬＡＢＳＴ溶液と２μｌＨ2Ｏ2を使用の５分前に混合する。
２０．０．２ＭＨＣｌ
方法：
１．ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中２μｇのポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）で被覆し，４℃で一夜保存する。
２．プレートを１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳで６０分間ブロッキングする。
３．プレートをＰＢＳで２回，５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．４で１回洗浄する。
４．５０μｌの希釈キナーゼをすべてのウエルに加える。
（精製キナーゼはキナーゼ希釈緩衝液中で希釈する。最終濃度は１０ｎｇ／ウエルとなるはずである）。
５．２５μｌの試験化合物（４％，ＤＭＳＯ中）または対照にはＤＭＳＯ単独（４％，ｄＨ2Ｏ中）をプレートに加える。
６．キナーゼ／化合物混合物を１５分間インキュベートする。
７．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ2を陰性対照ウエルに加える。
８．２５μｌのＡＴＰ／ＭｎＣｌ2混合物を他のすべてのウエル（陰性対照を除く）に加える。５分間インキュベートする。
９．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
１０．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。
１１．抗体希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した１００μｌのウサギポリクローナル抗Ｐｔｙｒを各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１２．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。
１３．ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体を抗体．希釈緩衝液中に１：６，０００で希釈する。１００μｌ／ウエルを加え，振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１４．プレートをＰＢＳで１回洗浄する。
１５．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。
１６．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより発色反応を停止させる。
１７．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでプレートを読む。
ＩＧＦ−１トランスリン酸化アッセイ
このアッセイを用いて，基質のｇｓｔ−ＩＧＦ−１トランスリン酸化のアゴニスト／アンタゴニストを同定するために，ポリ（グルタミン酸：チロシン）（４：１）中のホスホチロシンレベルを測定する。
材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．ポリ（Ｇｌｕ−ｔｙｒ）（４：１），ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ｐ０２７５
３．ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ
４．５０ｍＭＨＥＰＥＳ５．ＴＢＢブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．５），５８．４４ｇ塩化ナトリウムおよび１０ｍＬ１％ＴＷＥＥＮ−２０を混合する。
６．ＩＧＦ−１キナーゼドメインを含む精製ＧＳＴ融合蛋白質（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．）
７．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，６．０５７ｇＴｒｉｓ，８．７６６ｇ塩化ナトリウムおよび０．５ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を混合し，ｄＨ2Ｏで１リットルとする。
８．４％ＤＭＳＯ，Ｍｉｌｌｉ−ＱＨ2Ｏ中
９．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中
１０．２Ｘキナーゼ希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），０．４ｍＬ５％ＢＳＡ，ｄＨ2Ｏ中，０．２ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムおよび１ｍＬ５Ｍ塩化ナトリウムを混合し，ｄＨ2Ｏで１００ｍＬとする。
１１．４ＸＡＴＰ反応混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１ＭＭｎＣｌ2および０．００８ｍＬ０．０１ＭＡＴＰおよび９．５６ｍＬｄＨ2Ｏを混合する。
１２．４Ｘ陰性対照混合物：０．４ｍＬの１Ｍ塩化マンガンを９．６０ｍＬｄＨ2Ｏと混合する。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１４．５００ｍＭＥＤＴＡ，ｄＨ2Ｏ中
１５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中），０．５ｍＬ５％カーネーションインスタント無脂ミルク（ＰＢＳ中）および０．１ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを８８．４ｍＬＴＢＳＴと混合する。
１６．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
１７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗体，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ
１８．ＡＢＴＳ溶液
２０．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2：使用の５分前に１５ｍＬＡＢＴＳを２μｌＨ2Ｏ2と混合する。
２１．０．２ＭＨＣｌｄＨ2Ｏ中
方法：
１．ＥＬＩＳＡプレートを２．０μｇ／ウエルのポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１（ＳｉｇｍａＰ０２７５）１００μｌＰＢＳで．被覆する。プレートを４℃で一夜保存する。
２．プレートをＰＢＳで１回洗浄する。
３．１００μｌのＴＢＢブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳで１回，５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で２回洗浄する。
５．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中の試験化合物（１０ｍＭ試験化合物の１００％ＤＭＳＯ中の保存溶液をｄＨ2Ｏで希釈することにより得る）をプレートに加える。
６．１０．０ｎｇのｇｓｔ−ＩＧＦ−１キナーゼ（５０μｌキナーゼ希釈緩衝液中）をすべてのウエルに加える。
７．２５μｌの４ＸＡＴＰ反応混合物をすべての試験ウエルおよび陽性対照ウエルに加えることによりキナーゼ反応を開始させる。２５μｌの４Ｘ陰性対照混合物をすべての陰性対照ウエルに加える。振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。
８．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加える。
９．プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄する。
１０．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清を，１００μｌの抗体希釈緩衝液中１：１０，０００の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１１．プレートを工程９と同様に洗浄する。
１２．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅ抗ウサギＨＲＰを抗体希釈緩衝液中１：１０，０００の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１３．プレートを工程９と同様に洗浄し，さらにＰＢＳで１回洗浄して，泡および過剰のＴｗｅｅｎ−２０を減少させる。
１４．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2を各ウエルに加えることにより発色させる。
１５．約５分後，試験フィルタ４１０ｎｍ，参照フィルタ６３０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを読む。
ＢＲＤＵ取り込みアッセイ
以下のアッセイは，選択されたレセプターを発現するよう遺伝子工学的に改変された細胞を使用して，ＤＮＡ中へのＢｒｄＵ取り込みを決定することにより，リガンド−誘導性ＤＮＡ合成の活性に及ぼす目的化合物の影響を評価する。
以下の材料，試薬および方法は，以下のＢｒｄＵ取り込みアッセイのそれぞれについて一般的である。特定のアッセイにおける変更は特に記載される。
材料および試薬：
１．適当なリガンド
２．工学的に改変した適当な細胞
３．ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
４．ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
５．抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：マウスモノクローナル抗体，ペルオキシダーゼとコンジュゲート化（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
６．ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
７．ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４
８．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）
一般的方法：
１．細胞を８０００細胞／ウエルで，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ，ＤＭＥＭ中で９６ウエルプレートに播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。
２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．第３日に，適当なリガンドおよび試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞にはリガンドを加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．リガンド活性化の１８時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＤＭＥＭ中，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．標識試薬とともにインキュベートした後，デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５分間インキュベートする。
６．デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことによりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ミルク（５％脱水ミルク，ＰＢＳ中，２００μｌ／ウエル）をブロッキング溶液としてを加え，プレートをプレート振盪器で室温で３０分間インキュベートする。
７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：２００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ）を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で９０分間インキュベートする。
８．デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し，プレートを逆さにし，ペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥する。
９．ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０分間，発色が光学的検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．試料の吸収をＤｙｎａｔｅｃｈＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍで測定する（"デュアル波長"モード，参照波長として４９０ｎｍでフィルターを読む）。
ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−２−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ２／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−２キナーゼドメイン）
ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−４−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ４／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−４キナーゼドメイン）
ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．ヒトＰＤＧＦＢ／Ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）
２．３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ
ＩＧＦ１−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．ヒト，組換え（Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）
２．３Ｔ３／ＩＧＦｌｒ
インスリン−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．インスリン，結晶，ウシ，亜鉛（１３００７，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）
２．３Ｔ３／Ｈ２５
ＨＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．組換えヒトＨＧＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２４９−ＨＧ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）
２．ＢｘＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６８７）
方法：
１．細胞をＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中で９６ウエルプレートに９０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2中で一夜インキュベートする
２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に１００μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．第３日に，リガンド（１μｇ／ｍｌでＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ中で調製；最終ＨＧＦ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および試験化合物を含有する２５μｌを細胞に加える。陰性対照ウエルには２５μｌの無血清ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド（ＨＧＦ）を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，９６ウエルプレートで，リガンドを含む無血清ＲＰＭＩ中でその最終濃度の５倍で調製し，一連の希釈を作成して７種類の試験濃度とする。典型的には，試験化合物の最高最終濃度は１００μＭであり，１：３希釈を用いる（すなわち，最終試験化合物濃度範囲は０．１３７−１００μＭである）。
４．リガンド活性化の１８時間後，１２．５μｌの希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）を各ウエルに加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度は１０ｐＭ）とともに１時間インキュベートする。
５．一般的方法と同じ。
６．一般的方法と同じ。
７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：１００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で９０分間インキュベートする。
８．一般的方法と同じ。
９．一般的方法と同じ。
１０．一般的方法と同じ。
ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ
このアッセイを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然に発現されている）に対する化合物の活性を測定する。
第０日
１． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約１ｍｌ／１０ｃｍ2組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ 化学 Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシンは，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／２５−３０ｃｍ2組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６）に移す。
２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ2のアッセイ培地に再懸濁する。アッセイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０5細胞／ｍｌの濃度とする。
３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．０ｘ１０4細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベートする。
第１日
１． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％ＤＭＳＯを含む。
したがって，ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッセイ培地中（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに６０μｌ／ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試験化合物希釈物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混合する。このウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μｌと混合し，２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが混合されたとき，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄する。最後のウエルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を加える。以下のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つのカラムを作成する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入手，カタログＮｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸性繊維芽細胞成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３９６００）；または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。
２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞０．８−１．０ｘ１０4細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセイプレートに移し，３７℃，５％ＣＯ2で約２時間インキュベートする。
３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物については，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのアッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエルとする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および成長因子は１倍となる。
第２日
１． 3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カタログＮｏ．１１８７５−０５１
第３日
１． プレートを−２０℃で一夜凍結する。
第４日
１． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）液体シンチレーション計数機で計数する。
化合物を評価するために用いられてきたかまたは用いることができるバイオアッセイを如何に詳細に記載する。化合物１−９を試験し，これらがｆｌｋＧＳＴ，ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦアッセイにおいて活性であることが見いだされた。
インビボ動物モデル
Ａ．異種移植片動物モデル
ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，乳房，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性および効果のレベルを決定することができる。３種類の一般的アッセイ，すなわち細胞／触媒，細胞／生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用である。細胞／触媒アッセイの目的は，ＴＫが細胞中の既知の基質上のチロシンをリン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞／生物学的アッセイの目的は，細胞中でＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は，特定の疾患，例えば癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。
皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ４３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），およびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過剰発現するように遺伝子工学処理されたＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うことができる。
雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手する。すべての動物は，クリーンルーム条件下で，マイクロアイソレーターケージでアルファドライ敷きわらで維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。
細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，またはＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，およびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ2の湿潤環境下で３７℃で成長させる。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。
細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌ＰＢＳまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１群あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０6細胞／動物）の後側腹部内に移植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。腫瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ値は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤（ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日から初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。
Ｂ．腫瘍侵襲モデル
以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを選択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために用いることができる。
方法
８週齢のヌードマウス（雌）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｉｎｃ．）を実験動物として用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キシラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５ｃｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０7個の腫瘍細胞を注入する。細胞は，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０絹連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観察する。
分析
動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定等）。
Ｃ−ＫＩＴアッセイ
このアッセイを用いて，ｃ−ｋｉｔチロシンリン酸化のレベルを検出する。ＭＯＰＥ（ヒト急性骨髄性白血病）細胞を０．１％血清中で一夜血清飢餓とした。リガンド刺激の前に細胞を化合物で前処理した（血清飢餓と同時）。細胞を２５０ｎｇ／ｍｌｒｈ−ＳＣＦで１５分間刺激した。刺激後，細胞を溶解させ，抗−ｃ−ｋｉｔ抗体で免疫沈澱させた。ホスホチロシンおよび蛋白質レベルはウエスタンブロッティングにより決定した。
ＭＴＴ増殖アッセイ
Ｍ０７Ｅ細胞を血清飢餓とし，リン酸化実験について記載したように，化合物で前処理した。細胞を１００μｌＲＰＭＩ＋１０％血清中で４Ｘ１０5細胞／ウエルで９６ウエル皿に播種した。ｒｈ−ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え，プレートを４８時間インキュベートした。４８時間後，１０μｌの５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）を加え，４時間インキュベートした。酸イソプロパノール（１００μｌのイソプロパノール中０．０４ＮＨＣｌ）を加え，波長５５０ｎｍで光学密度を測定した。
アポトーシスアッセイ
Ｍ０７Ｅ細胞を１０％ＦＢＳ中でｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈ−ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに＋／−ＳＣＦおよび＋／−化合物でインキュベートした。試料は２４および４８時間にアッセイした。活性化カスパーゼ−３を測定するためには，試料をＰＢＳで洗浄し，氷冷７０％エタノールで透過性にした。次に，細胞をＰＥ−コンジュゲート化ポリクローナルウサギ抗活性カスパーゼ−３で染色し，ＦＡＣＳにより分析した。切断されたＰＡＲＰを測定するためには，試料を溶解させ，抗ＰＡＲＰ抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。
追加のアッセイ
本発明の化合物を評価するために用いることができる追加のアッセイには，限定されないが，ｂｉｏ−ｆｌｋ−１アッセイ，全細胞におけるＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ，ｂｉｏ−ｓｒｃアッセイ，ｂｉｏ−ｌｃｋアッセイおよびｒａｆのリン酸化機能を測定するアッセイが含まれる。これらのアッセイのそれぞれのプロトコルは，米国特許出願０９／０９９，８４２（図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に見いだすことができる。
細胞毒性の測定
治療用化合物は，細胞毒性効果を示すよりもレセプターチロシンキナーゼ活性においてより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は，治療指数，すなわち，ＩＣ50／ＬＤ50を決定することにより得ることができる。ＩＣ50（５０％の阻害を達成するのに必要な用量）は，本明細書に記載されるもの等の標準的な手法を用いて測定することができる。ＬＤ50（５０％の毒性をもたらす用量）もまた，放出されるＬＤＨの量を測定することにより（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３，Ｄｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１），または動物モデルにおける致死用量を測定することにより，標準的な手法により測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３）。より大きい治療指数を有する化合物が望ましい。治療指数は，２より高くあるべきであり，好ましくは少なくとも１０，より好ましくは少なくとも５０である。
当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して置換基の変更および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載されている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である特許請求の範囲も完全に記載されている。
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (7)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 0003677501
     ［式中，
    Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，ハロアルコキシ，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；
    Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである）からなる群より選択され；
    Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
    Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
    Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17（下で定義される）からなる群より選択され；
    Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され；
    Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
    Ｒ9およびＲ10は，一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
    Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキル，ヒドロキシアルキル，およびアリールからなる群より選択され；またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し；
    Ｒ17は，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヒドロキシおよびヘテロアリールからなる群より選択される］
    の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
  2. Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである）からなる群より選択され；
    Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
    Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
    Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17（下で定義される）からなる群より選択され；
    Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され；
    Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
    Ｒ9およびＲ10は，一緒になってヘテロシクロ基を形成し；
    Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキルおよびアリールからなる群より選択され，またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になって複素環を形成し；
    Ｒ17は，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヒドロキシおよびヘテロアリールからなる群より選択される，請求項１記載の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
  3. 化合物が，
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
     からなる群より選択される，請求項１記載の化合物または塩。
  4. 化合物が，
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
    Figure 0003677501
     からなる群より選択される，請求項３記載の化合物または塩。
  5. 式（Ｉａ）：
    Figure 0003677501
     ［式中，
    Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は水素であり；
    Ｒ2はフルオロであり，インドリノン環の５位に位置しており；および
    Ｚはモルホリン−４−イルであり；
    Ｒ6およびＲ7はメチルであり；および
    ＊Ｃにおける立体化学は（Ｓ）である］
    の化合物。
  6. 式（ＩＩ）：
    Figure 0003677501
     ［式中，
    Ｒは，水素またはアルキルであり；
    Ｒ1は，水素，ハロ，アルキル，ハロアルコキシ，シクロアルキル，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−ＮＲ9Ｒ10および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13からなる群より選択され；
    Ｒ2は，水素，ハロ，アルキル，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，シアノ，−ＮＲ9Ｒ10，−ＮＲ9Ｃ（Ｏ）Ｒ10，−Ｃ（Ｏ）Ｒ8，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ9Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ14（ここで，Ｒ14は，アルキル，アリール，アラルキル，ヘテロアリールおよびヘテロアラルキル）からなる群より選択され；
    Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は，独立して，水素またはアルキルであり；
    Ｚは，アリール，ヘテロアリール，複素環，または−ＮＲ15Ｒ16であり，ここで，Ｒ15およびＲ16は，独立して，水素またはアルキルであり；またはＲ15およびＲ16は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し；
    Ｒ6は，水素またはアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ7は，水素，アルキル，アリール，ヘテロアリール，および−Ｃ（Ｏ）Ｒ17（下で定義される）からなる群より選択され；
    Ｒ8は，ヒドロキシ，アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され；
    Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，シアノアルキル，シクロアルキル，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または
    Ｒ9およびＲ10は，一緒になって，ヘテロシクロアミノ基を形成し；
    Ｒ12およびＲ13は，独立して，水素，アルキル，ヒドロキシアルキル，およびアリールからなる群より選択され；またはＲ12およびＲ13は，これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し；
    Ｒ17は，アルキル，シクロアルキル，アリール，ヒドロキシ，およびヘテロアリールからなる群より選択される］
    の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
  7. 化合物が，
    Figure 0003677501
     からなる群より選択される，請求項６記載の化合物または塩。
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