RS55771B2 - Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9 - Google Patents

Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9

Info

Publication number
RS55771B2
RS55771B2 RS20170255A RSP20170255A RS55771B2 RS 55771 B2 RS55771 B2 RS 55771B2 RS 20170255 A RS20170255 A RS 20170255A RS P20170255 A RSP20170255 A RS P20170255A RS 55771 B2 RS55771 B2 RS 55771B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
pcsk9
hpcsk9
binding
seq
Prior art date
Application number
RS20170255A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark W Sleeman
Joel H Martin
Tammy T Huang
Douglas Macdonald
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41668268&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55771(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55771B1 publication Critical patent/RS55771B1/sr
Publication of RS55771B2 publication Critical patent/RS55771B2/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21061—Kexin (3.4.21.61), i.e. proprotein convertase subtilisin/kexin type 9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
Ovaj pronalazak se odnosi na humana antitela i antigen-vezujuće fragmente humanih antitela, koji specifično vezuju humani proprotein konvertaza subtilizin/keksin tipa 9 (PCSK9), i na terapeutske postupke korišćenja tih antitela.
Navodi o srodnim radovima
Proprotein konvertaza subtilizin/keksin tipa 9 (PCSK9) je proprotein konvertaza, koji pripada subfamiliji K proteinaza familije sekretornih subtilaza. Kodirani protein se sintetiše kao rastvorljivi zimogen, koji se podvrgava autokatalitičkoj intramolekularnoj preradi u endoplazmatskom retikulumu. Rezultati pokazuju da PCSK9 povećava plazmatske nivoe LDL holesterola putem podsticanja razgradnje LDL receptora, koji posreduje u endocitozi LDL-a u jetri, koji predstavlja glavni put klirensa LDL-a iz cirkulacije. Struktura PCSK9 proteina pokazuje da on poseduje signalnu sekvencu, koju sledi prodomen, katalitički domen koji sadrži konzervisanu trijadu ostataka (D186, H226 i S386), i C-terminalni domen. Sintetiše se kao rastvorljivi prekursor od 74-kDa, koji se podvrgava autokatalitičkom otcepljivanju u ER, čime se proizvodi prodomen od 14-kDa i katalitički fragment od 60-kDa. Pokazalo se da je autokatalitička aktivnost neophodna za sekreciju. Nakon otcepljivanja, prodomen ostaje snažno povezan sa katalitičkim domenom.
Antitela prema PCSK9 opisana su, primera radi, u WO 2008/057457, WO 2008/057458, WO 2008/057459, WO 2008/063382, WO 2008/125623 i US 2008/0008697.
KRATKI SAŽETAK PRONALASKA
U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje potpuno humana monoklonska antitela (mAt) i njihove antigen-vezujuće fragmente, kako su definisani u patentnim zahtevima, koji specifično vezuju i neutrališu aktivnost humanog PCSK9 (hPCSK9).
Određenije, pronalazak obezbeđuje humano antitelo ili antigen-vezujući fragment humanog antitela koji specifično vezuje humani proprotein konvertaza subtilizin/keksin tipa 9 (hPCSK9), koji sadrži HCVR od SEQ ID NO:90 i LCVR od SEQ ID NO: 92.
Ovde su opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti antitela, koji specifično vezuju hPCSK9, a karakterisani su posredstvom najmanje jedne od sledećih karakteristika:
(i) sposobnost smanjivanja nivoa ukupnog holesterola u serumu za najmanje oko 25-35% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 24 dana u odnosu na nivo pre doziranja, pri čemu je poželjno smanjivanje nivoa ukupnog holesterola u serumu najmanje oko 30-40%;
(ii) sposobnost smanjivanja nivoa LDL holesterola u seruma za najmanje oko 65-80% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 24 dana u odnosu na nivo pre doziranja ili sposobnost smanjivanja nivoa LDL holesterola u serumu za najmanje oko 40-70% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 60 do 90 dana u odnosu na nivo pre doziranja;
(iii) sposobnost smanjivanja nivoa triglicerida u serumu od najmanje oko 25-40% u odnosu na nivo pre doziranja;
Antitelo može postići jedan ili više efekata od (i) - (iii) bez smanjivanja nivoa HDL holesterola u serumu ili sa smanjivanjem nivoa HDL holesterola u serumu koje nije veće od 5% u odnosu na nivo pre doziranja; sa malim efektom ili bez merljivog efekta na jetrenu funkciju, kako se utvrđuje merenjima ALT i AST.
U jednom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment karakterisani su preko vezivanja epitopa koji sadrži ostatak aminokiseline 238 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). U još specifičnijem ostvarenju, antitelo ili njegov fragment vezuju se za epitop koji sadrži jedan ili više od aminokiselinskih ostataka 238, 153, 159 i 343 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). U još specifičnijem ostvarenju, antitelo ili njegov fragment karakterisani su posredstvom vezivanja epitopa koji ne sadrži ostatak aminokiseline na poziciji 192, 194, 197 i/ili 237 SEQ ID NO:755.
Ovde je, takođe, opisano antitelo ili njegov fragment koji su karakterisani posredstvom vezivanja epitopa koji sadrži aminokiselinski ostatak 366 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Ovde je opisan njihov fragment antitela koji vezuje epitop koji sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka na poziciji 147, 366 i 380 SEQ ID NO:755. Još određenije, antitelo ili njegov fragment mogu biti okarakterisani posredstvom vezivanja epitopa koji ne sadrži aminokiselinski ostatak na poziciji 215 i/ili 238 SEQ ID NO:755.
U jednom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment karakterisani su posredstvom<ispoljavanja pojačanog afiniteta vezivanja (K>D) za hPCSK9 pri pH 5.5, u odnosu na KD pri pH7.4, kako je izmereno uz pomoć površinske plazmonske rezonance. U specifičnom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment ispoljavaju najmanje 20-puta, najmanje 40-puta ili najmanje 50-puta povećan afinitet za PCSK9 pri kiselom pH, u odnosu na neutralni pH, kako je mereno uz pomoć površinske plazmonske rezonance.
Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti koji su karakterisani time što ne ispoljavaju povećani afinitet vezivanja za PCSK9 pri kiselom pH, u odnosu na neutralni pH, kako je izmereno pomoću površinske plazmonske rezonance. Vezivanje pri kiselom pH može biti manje, a T1/2kraći nego pri neutralnom pH.
U drugom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuje se za humani PCSK9, humani PCSK9 sa GOF mutacijom D374Y, PCSK9 cinomolgus majmuna, rezus majmuna, miša, pacova i hrčka.
Ovde su opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti, koji vezuju humani i majmunski PCSK9, ali ne vezuju PCSK9 miša, pacova ili hrčka.
mAt mogu biti pune dužine (npr., IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu da sadrže samo antigen-vezujući deo (npr., Fab, F(ab’)2ili scFv fragment), a mogu biti modifikovana da bi ispoljila funkcionalnost, npr., da se eliminišu rezidualne efektorske funkcije (Reddy et al. (2000) J. Immunol.164:1925-1933).
Ovde je opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738 i 742, ili njima suštinski slična sekenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence. HCVR može uključiti aminokiselinsku sekvencu, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:50, 66, 70, 74, 90, 94, 122, 138, 142, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 314, 330 i 334. U zahtevanom pronalasku, HCVR sadrži SEQ ID NO:90.
Antitelo ili njegov fragment, kao što su ovde opisani, mogu dalje da sadrže varijabilni region lakog lanca (LCVR), odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740 i 744, ili njima suštinski slična sekvenca koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvenci. LCVR može sadržavati aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 58, 68, 72, 82, 92, 96, 130, 140, 144, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 322, 332 i 336. U zahtevanom pronalasku, LCVR sadrži SEQ ID NO:92.
Ovde opisano antitelo ili njegov fragment mogu sadržavati par sekvenci HCVR i LCVR (HCVR/LCVR), koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 i 742/744. HCVR i LCVR mogu biti odabrani od parova aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 i 334/336. U zahtevanom pronalasku, par HCVR/LCVR uključuje SEQ ID NO:90/92.
Ovde je, takođe, opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji sadrži CDR3 (HCDR3) domen teškog lanca, odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488, 512, 536, 560, 584, 608, 632, 656, 680, 704 i 728, ili sekvence, koje su suštinski slične njima, i koje poseduju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvenci; i CDR3 (LCDR3) domen lakog lanca, odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472, 496, 520, 544, 568, 592, 616, 640, 664, 688, 712 i 736, ili sekvence suštinski slične njima, koje poseduju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvenci. Par sekvenci HCDR3/LCDR3 može biti SEQ ID NO:56/64, 80/88, 128/136, 224/232, 248/256 ili 320/328. HCDR3/LCDR3 može uključiti SEQ ID NO:80/88 ili 224/232.
Ovde je, isto tako, opisano antitelo ili njegov fragment, koji dalje sadrže CDR1 (HCDR1) domen teškog lanca, odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484, 508, 532, 556, 580, 604, 628, 652, 676, 700 i 724, ili njima suštinski slična sekvenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence; CDR2 (HCDR2) domen teškog lanca, koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486, 510, 534, 558, 582, 606, 630, 654, 678, 702 i 726, ili njima suštinski slična sekvenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence; CDR1 (LCDR1) domen lakog lanca, odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468, 492, 516, 540, 564, 588, 612, 636, 660, 684, 708 i 732, ili njima suštinski slična sekvenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence; i CDR2 (LCDR2) domen lakog lanca, odabran iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470, 494, 518, 542, 566, 590, 614, 638, 662, 686, 710 i 734, ili njima suštinski slična sekvenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence. CDR sekvence teškog i lakog lanca mogu biti SEQ ID NO:52, 54, 56, 60, 62, 64; 76, 78, 80, 84, 86, 88; 124, 126, 128, 132, 134, 136; 220, 222, 224, 228, 230, 232; 244, 246, 248, 252, 254, 256 i 316, 318, 320, 324, 326, 328. CDR sekvence teškog i lakog lanca mogu biti SEQ ID NO: 76, 78, 80, 84, 86, 88; ili 220, 222, 224, 228, 230, 232.
Ovde je, takođe, opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji specifično vezuje hPCSK9, pri čemu antitelo ili fragment sadrže CDR domene teškog i lakog lanca, sadržane u okviru parova sekvenci teškog i lakog lanca, odabranih iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 i 742/744. CDR sekvence, koje su sadržane unutar HCVR i LCVR mogu biti odabrane od parova aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 i 334/336. U specifičnim ostvarenjima, CDR sekvence, sadržane unutar HCVR i LCVR, odabrane su od parova aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 90/92.
Ovde je, isto tako, opisano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji specifično vezuje, neutrališe aktivnost hPCSK9, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljava jednu ili više od sledećih karakteristika:
(i) sposobnost smanjivanja nivoa ukupnog holesterola u serumu za najmanje oko 25-35% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 24 dana u odnosu na nivo pre doziranja, pri čemu je poželjno smanjivanje nivoa ukupnog holesterola u serumu najmanje oko 30-40%;
(ii) sposobnost smanjivanja nivoa LDL holesterola u seruma za najmanje oko 65-80% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 24 dana u odnosu na nivo pre doziranja;
(iii) sposobnost smanjivanja nivoa triglicerida u serumu od najmanje oko 25-40% u odnosu na nivo pre doziranja;
(iv) izostanak smanjivanja nivoa HDL holesterola u serumu ili redukovanje serumske koncentracije HDL holesterola za iznos koji nije veći od 5% u odnosu na nivo pre doziranja;
(v) vezivanje za epitop koji sadrži aminkiselinski ostatak 238 hPCSK9 (SEQ ID NO:755); (vi) ispoljavanje povećanog afiniteta vezivanja (KD) za hPCSK9 pri pH 5.5, u odnosu naKDpri pH 7.4, kako je utvrđeno uz pomoć površinske plazmonske rezonance, pri čemu povećani afinitet čini povećanje afiniteta od najmanje oko 20- do 50-puta;
(vii) vezivanje humanog PCSK9, humanog PCSK9 sa GOF mutacijom D374Y, PCSK9 cinomolgus majmuna, rezus majmuna, miša, pacova i hrčka;
(viii) uključivanje CDR3 sekvenci teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NO:80 i 88; (ix) uključivanje CDR sekvenci iz SEQ ID NO:90 i 92.
Ovde je, takođe, opisano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji specifično vezuje i neutrališe aktivnost hPCSK9, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljavaju jednu ili više od sledećih karakteristika:
(i) sposobnost smanjivanja nivoa serumskog LDL holesterola za najmanje oko 40-70% i održavanje smanjenog nivoa tokom perioda od najmanje 60 ili 90 dana u odnosu na nivo pre doziranja;
(ii) sposobnost smanjivanja nivoa serumskih triglicerida za najmanje oko 25-40% u odnosu na nivo pre doziranja;
(iii) odsustvo smanjivanja nivoa HDL holesterola u serumu ili redukovanje serumske koncentracije HDL holesterola za iznos koji nije veći od 5% u odnosu na nivo pre doziranja;
(iv) vezivanje za epitop koji sadrži aminokiselinski ostatak 366 hPCSK9 (SEQ ID NO:755);
(v) izostanak ispoljavanja povećanog afiniteta vezivanja za PCSK9 pri kiselom pH u odnosu na neutralni pH, kako je utvrđeno posredstvom površinske plazmonske rezonance;
(vi) vezivanje humanog i majmunskog PCSK9, ali izostanak vezivanja PCSK9 miša, pacova ili hrčka;
(vii) uključivanje CDR3 sekvenci teškog i lakog lanca, koje obuhvataju SEQ ID NO:224 i 232; i
(viii) uključivanje CDR sekvenci iz SEQ ID NO:218 i 226.
U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-PCSK9 antitela ili njihove fragmente. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline pronalaska, i ćelije domaćina u koje se takvi vektori uvode, takođe su obuhvaćeni pronalaskom. Isto tako su opisani postupci proizvodnje antitela putem kultivisanja domaćinskih ćelija pod uslovima koji omogućuju proizvodnju antitela, i povraćaj proizvedenih antitela.
Ovde je, takođe, opisano antitelo ili njegov fragment, koji sadrže HCVR, kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 521, 525, 529, 545, 549, 553, 569, 573, 577, 593, 597, 601, 617, 621, 625, 641, 645, 649, 665, 669, 673, 689, 693, 697, 713, 717, 721, 737 i 741, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije. HCVR može biti kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 49, 65, 69, 73, 89, 93, 121, 137, 141, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 313, 329 i 333. HCVR može biti kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 89 i 217.
Antitelo ili njegov fragment može dalje da sadrži LCVR, koji je kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499, 503, 513, 523, 527, 537, 547, 551, 561, 571, 575, 585, 595, 599, 609, 619, 623, 633, 643, 647, 657, 667, 671, 681, 691, 695, 705, 715, 719, 729, 739 i 743, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije. LCVR može biti kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 57, 67, 71, 81, 91, 95, 129, 139, 143, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 321, 331 i 335. LCVR može biti kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 91 i 225.
Ovde je, isto tako, opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji sadrže HCDR3 domen, koji je kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439, 463, 487, 511, 535, 559, 583, 607, 631, 655, 679, 703 i 727, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije, i LCDR3 domen, kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471, 495, 519, 543, 567, 591, 615, 639, 663, 687, 711 i 735, ili suštinski identična sekvenca, koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homolgije. HCDR3 i LCDR3 sekvence mogu biti kodirane od strane sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 55/63, 79/87, 127/135, 223/231, 247/255, odnosno 319/327. Par sekvenci HCDR3 i LCDR3 može biti kodiran od strane sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 79/87 i 223/231.
Antitelo ili njegov fragment mogu, dalje, da sadrže HCDR1 domen, koji je kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe, koju sačinjavaju SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483, 507, 531, 555, 579, 603, 627, 651, 675, 699 i 723, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije; HCDR2 domen, kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO:5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485, 509, 533, 557, 581, 605, 629, 653, 677, 701 i 725, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije, LCDR1 domen, kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467, 491, 515, 539, 563, 587, 611, 635, 659, 683, 707 i 731, ili suštinski identična sekvenca, koja sadrži najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije, i LCDR2 domen, kodiran od strane nukleotidne sekvence, odabrane iz grupe koju sačinjavaju SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469, 493, 517, 541, 565, 589, 613, 637, 661, 685, 709 i 733, ili suštinski identična sekvenca koja poseduje najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% njihove homologije. CDR sekvence teškog i lakog lanca mogu biti kodirane od strane sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 51, 53, 55, 59, 61, 63; 75, 77, 79, 83, 85, 87; 123, 125, 127, 131, 133, 135; 219, 221, 223, 227, 229, 231; 243, 245, 247, 251, 253, 255 i 315, 317, 319, 323, 325, 327. CDR sekvence teškog i lakog lanca mogu biti kodirane od strane sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO: 75, 77, 79, 83, 85, 87; and 219, 221, 223, 227, 229, 231.
Ovde je, takođe, opisano izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji specifično vezuje hPCSK9, i koji sadrži HCDR3 i LCDR3, pri čemu HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>- X<9>- X<10>- X<11>- X<12>- X<13>-X<14>- X<15>- X<16>- X<17>- X<18>- X<19>- X<20>(SEQ ID NO:747), pri čemu: X<1>je Ala, X<2>je Arg ili Lys, X<3>je Asp, X<4>je Ser ili Ile, X<5>je Asn ili Val, X<6>je Leu ili Trp, X<7>je Gly ili Met, X<8>je Asn ili Val, X<9>je Phe ili Tyr, X<10>je Asp, X<11>je Leu ili Met, X<12>je Asp ili nije prisutan, X<13>je Tyr ili nije prisutan, X<14>je Tyr ili nije prisutan, X<15>je Tyr ili nije prisutan, X<16>je Tyr ili nije prisutan, X<17>je Gly ili nije prisutan, X<18>je Met ili nije prisutan, X<19>je Asp ili nije prisutan i X<20>je Val ili nije prisutan; a LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>-X<9>(SEQ ID NO:750) pri čemu: X<1>je Gin ili Met, X<2>je Gin, X<3>je Tyr ili Thr, X<4>je Tyr ili Leu, X<5>je Thr ili Gin, X<6>je Thr, X<7>je Pro, X<8>je Tyr ili Leu, a X<9>je Thr.
Antitelo ili njegov fragment mogu dalje da sadrže sekvencu HCDR1 sa formulom X<1>-X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>(SEQ ID NO:745), pri čemu: X<1>je Gly, X<2>je Phe, X<3>je Thr, X<4>je Phe, X<5>je Ser ili Asn, X<6>je Ser ili Asn, X<7>je Tyr ili His, a X<8>je Ala ili Trp; sekvencu HCDR2 sa formulom X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>(SEQ ID NO:746), pri čemu: X<1>je Ile, X<2>je Ser ili Asn, X<3>je Gly ili Gin, X<4>je Asp ili Ser, X<5>je Gly, X<6>je Ser ili Gly, X<7>je Thr ili Glu, a X<8>je Thr ili Lys; LCDR1 sekvencu formule X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6>- X<7>- X<8>- X<9>- X<10>- X<11>- X<12>(SEQ ID NO:748), pri čemu: X<1>je Gin, X<2>je Ser, X<3>je Val ili Leu, X<4>je Leu, X<5>je His ili Tyr, X<6>je Arg ili Ser, X<7>je Ser ili Asn, X<8>je Asn ili Gly, X<9>je Asn, X<10>je Arg ili Asn, X<11>je Asn ili Tyr, a X<12>je Phe ili nije prisutan; sekvencu LCDR2 sa formulom X<1>- X<2>- X<3>(SEQ ID NO:749), pri čemu: X<1>je Trp ili Leu, X<2>je Ala ili Gly, a X<3>je Ser. Slika 1 prikazuje slaganje sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca za mAt 316P i 300N.
Ovde je, isto tako, opisano humano anti-PCSK9 antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR), koji je kodiran od strane segmenata nukleotidne sekvence, dobijenih iz germinativnih sekvenci VH, DHi JH, i varijabilni region lakog lanca (LCVR), kodiran od strane segmenata nukleotidne sekvence, koji su dobijeni iz germinativnih sekvenci VKi JK, pri čemu su germinativne sekvence (a) segment 3-23 gena VH, segment 7-27 gena DH, segment 2 gena JH, segment 4-1 gena VKi segment 2 gena JK; ili (b) segment 3-7 gena VH, segment 2-8 gena DH, segment 6 gena JK, segment 2-28 gena VKi segment 4 gena JK.
U nekim ostvarenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se za PCSK9 protein SEQ ID NO:755, pri čemu je vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za varijantu PCSK9 proteina manje od 50% vezivanja koje se odvija između antitela ili njegovog fragmenta i proteina PCSK9 SEQ ID NO:755. U specifičnom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment vezuje se za varijantu PCSK9 proteina sa afinitetom vezivanja (KD), koji je manji od približno 50%, manji od oko 60%, manji od oko 70%, manji od oko 80%, manji od oko 90% ili manji od oko 95%, u poređenju sa vezivanjem za PCSK9 (SEQ ID NO:755).
U jednom ostvarenju, varijanta proteina PCSK9 sadrži najmanje jednu mutaciju na poziciji 238 SEQ ID NO:755. U još specifičnijem ostvarenju, mutacija je D238R. U jednom ostvarenju, afinitet vezivanja antitela ili fragmenta antitela za varijantu proteina PCSK9 je najmanje 90% manji u odnosu na protein divljeg tipa sa SEQ ID NO:755, pri čemu varijanta proteina sadrži mutaciju na ostatku 238. U jednom ostvarenju, afinitet vezivanja antitela ili fragmenta antitela za varijantu PCSK9 proteina je najmanje 80% manji u odnosu na protein divljeg tipa sa SEQ ID NO:755, pri čemu varijanta proteina sadrži mutaciju na jednom ili više od ostataka 153, 159, 238 i 343. U još specifičnijem ostvarenju, mutacija je jedna od: S153R, E159R, D238R i D343R.
Ovde je, isto tako, opisana varijanta proteina PCSK9 koja sadrži najmanje jednu mutaciju na poziciji 366 SEQ ID NO:755. Mutacija može biti E366K. Afinitet vezivanja antitela ili fragmenta antitela za varijantu proteina PCSK9 može biti najmanje 95% manji u odnosu na protein divljeg tipa sa SEQ ID NO:755, pri čemu varijanta proteina sadrži mutaciju na ostaku 366. Afinitet vezivanja antitela ili fragmenta antitela za varijantu proteina PCSK9 može biti najmanje 70%, 80% ili 90% manji u odnosu na protein divljeg tipa sa SEQ ID NO:755, pri čemu varijanta proteina sadrži mutaciju na jednom ili više od ostataka: 147, 366 i/ili 380. Mutacija može biti jedna od: S147F, E366K i V380M.
Pronalazak obuhvata anti-PCSK9 antitela, koja poseduju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim aplikacijama, od koristi može biti modifikacija radi odstranjivanja nepoželjnih glikozilacijskih položaja, ili, npr., odstranjivanja dela fukoze da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (vidi, Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim aplikacijama, može biti izvršena modifikacija galaktozilacije, da bi se modifikovala komplement-zavisna citotoksičnost (CDC).
U daljem aspektu, pronalazak predstavlja farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment, kako su definisani u patentnim zahtevima, koji specifično vezuje hPCSK9, i farmaceutski prihvatljivi nosač. U jednom ostvarenju, pronalazak prikazuje kompoziciju koja je kombinacija antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela pronalaska, i drugog terapeutskog sredstva. Drugo terapeutsko sredstvo može biti bilo koje sredstvo koje se na pogodan način kombinuje sa antitelom ili fragmentom antitela pronalaska, na primer, sredstvo koje je u stanju da indukuje iscrpljivanje sinteze holesterola na ćelijskom nivo, putem inhibiranja 3-hidroksi-3-metilglutaril (HMG)-koenzim A (CoA) reduktaze, kao što je, na primer, cerovastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastin, ros uvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, itd.; sredstvo koje je u stanju da inhibira prihvatanje holesterola i ili re-apsorpciju žučnih kiselina; sredstvo koje je u stanju da povećava katabolizam lipoproteina (kao što je niacin); i/ili aktivatori LXR transkripcionog faktora koji igra ulogu u eliminaciji holesterola, kao što je 22-hidroksiholesterol.
Ovde su, takođe, opisani postupci za inhibiranje aktivnosti hPCSK9 korišćenjem anti-PCSK9 antitela ili antigen-vezujućeg dela antitela pronalaska, pri čemu terapeutski postupci uključuju primenu terapeutski efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela pronalaska. Lečeni poremećaj je bilo koja bolest ili stanje, koje se poboljšava, ublažava, inhibira ili sprečava putem uklanjanja, inhibiranja ili redukovanja aktivnosti PCSK9. Specifične populacije koje se mogu podvrći lečenju uz pomoć terapeutskih postupaka obuhvataju ispitanike kojima je indikovana LDL afereza, ispitanike sa PCSK9-aktivirajućim mutacijama (mutacije sticanja funkcije, "GOF"), ispitanike sa heterozigotnom familijarnom hiperholesterolemijom (heFH); ispitanike sa primarnom hiperholesterolemijom koji imaju intoleranciju na statine ili nisu kontrolisani statinima; i ispitanike koji su pod rizikom od razvijanja hiperholesterolemije koji mogu biti preventivno podvrgnuti lečenju. Ostale indikacije uključuju dislipidemiju udruženu sa sekundarnim uzrocima, kao što su dijabetes melitus tipa 2, holestazne bolesti jetre (primarna bilijarna ciroza), nefrotski sindrom, hipotireoza, gojaznost, i prevenciju i lečenje aterosklerotskih i kardiovaskularnih bolesti.
Anti-hPCSK9 antitelo ili fragment antitela pronalaska mogu biti od koristi za smanjivanje povišenog nivoa ukupnog holesterola, non-HDL holesterola, LDL holesterola i/ili apolipoproteina B (apolipoprotein B100).
Antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska mogu biti korišćeni sami ili u kombinaciji sa drugim sredstvom, na primer, inhibitorom HMG-CoA reduktaze i/ili drugim lekovima za snižavanje lipida.
Dalja ostvarenja uključuju antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, kao što su prethodno definisani, za korišćenje za ublažavanje ili inhibiranje bolesti ili stanja posredovanih sa PCSK9.
Otkriće uključuje upotrebu antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela kao što je prethodno definisano, u proizvodnji leka za korišćenje za ublažavanje ili inhibiranje bolesti ili stanja posredovanih sa PCSK9. U specifičnim ostvarenjima, koriste se u slučajevima u kojima su bolest ili stanje posredovani sa PCSK9: hiperholesterolemija, hiperlipidemija, LDL afereza, heterozigoti za familijarnu hiperholesterolemiju, intolerancija na statine, nekontrolisanost statinima, rizik za razvijanje hiperholesterolemije, dislipidemija, holestazna bolest jetre, nefrotski sindrom, hipotireoza, gojaznost, ateroskleroza i kardiovaskularne bolesti.
Ostala ostvarenja će postati očigledna iz predstavljanja detaljnog opisa koji sledi.
KRATKI OPIS SLIKA
Slika 1. Tabele poređenja sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (A) i lakog lanca (B) i CDR-a antitela H1H316P i H1M300N.
Slika 2. Koncentracije antitela u serumu tokom vremena.316P 5 mg/kg (); 300N 5 mg/kg (); 316P 15 mg/kg (v); 300N 15 mg/kg (●).
Slika 3. Nivo ukupnog holesterola u serumu kao procenat promene iznad puferske kontrole. Kontrola (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (); 300N 15 mg/kg (∆).
Slika 4. Serumski nivo LDL holesterola kao procenat promene iznad puferske kontrole. Kontrola (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (); 300N 15 mg/kg (∆).
Slika 5. Serumski nivo LDL holesterola normalizovan prema puferskoj kontroli. Puferska kontrola (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (); 300N 15 mg/kg (∆).
Slika 6. Serumski nivo HDL holesterola kao procenat promene iznad puferske kontrole. Kontrola (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (); 300N 15 mg/kg (∆).
Slika 7. Nivo triglicerida u serumu kao procenat promene iznad puferske kontrole. Puferska kontrola (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (σ); 316P 15 mg/kg (); 300N 15 mg/kg (∆).
Slika 8. Nivo LDL holesterola u serumu izražen kao procenat promene iznad bazalnog nivoa nakon subkutane primene jedne doze.316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (●).
Slika 9. Koncentracije antitela u serumu tokom vremena nakon subkutane primene jedne doze. 316P 5 mg/kg (●); 300N 5 mg/kg (σ).
Slika 10. Western blot za mišji LDL receptor ukupnih jetrenih homogenata. Uzorci su uzeti 24 sata nakon primene PBS (trake 1-3), 5 mg/kg 316P (trake 4-6) ili 5 mg/kg non-hPCSK9 specifičnih mAt (trake 7-8) i 4 sata nakon primene 1.2 mg/kg hPCSK9-mmh (sve trake). Slika 11. Efekti antitela 316P na serumski nivo LDL holesterola na PCSK9<hu/hu>miševima. Puferska kontrola ( );316P 1 mg/kg ( ); 316P 5 mg/kg ( ); 316P 10 mg/kg ( ). Slika 12. Farmakokinetički profil anti-hPCSK9 mAt u serumu na C57BL/6 miševima. Jedna doza mAt Kontrole I (l) u količini od 10 mg/kg; 316P (σ) u količini od 10 mg/kg i 300N (n) u količini od 10 mg/kg.
Slika 13. Farmakokinetički profil anti-hPCSK9 mAt u serumu na hPCSK9 heterozigotnim miševima: jedna doza u količini od 10 mg/kg: mAt Kontrole I (l); 316P (σ) i 300N (n).
Slika 14. Efekat antitela 316P na serumske nivoe LDL holesterola na sirijskom hrčku držanom na normalnoj ishrani. Puferska kontrola (●); 316P u dozi od 1 mg/kg (n); 316P u dozi od 3 mg/kg (σ); 316P u dozi od 5 mg/kg (t).
DETALJNI OPIS
Pre opisa tekućih postupaka, trebalo bi da se shvati da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i eksperimentalne uslovi koji su opisani, budući da ti postupci i uslovi mogu varirati. Isto tako bi trebalo da se razume da je terminologija, koja je ovde korišćena, upotrebljena samo u svrhu opisa pojedinih ostvarenja, i nije joj namera da bude ograničavajuća, budući da će okvir tekućeg pronalaska biti ograničen isključivo priključenim patentnim zahtevima.
Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini, koji su ovde korišćeni, imaju isto značenje kakvo se obično podrazumeva od strane lica uobičajene stručnosti u ovoj oblasti kojoj pronalazak pripada. Iako bilo koji postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni u praktičnoj primeni ili testiranju ovog pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.
Definicije
Naziv "humani proprotein konvertaza subtilizin/keksin tipa 9" ili "hPCSK9", kako je ovde korišćen, odnosi se na hPCSK9, koji poseduje sekvencu nukleinske kiseline, koja je prikazana u SEQ ID NO:754 i sekvencu aminokiseline od SEQ ID NO:755, ili njihov biološki aktivni fragment.
Naziv "antitelo", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi se odnosio na imunoglobulinske molekule, koji su sastavljeni od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac je sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca ("HCVR" ili "VH") i konstantnog regiona teškog lanca (koji je sastavljen od domena CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca ("LCVR ili "VL") i konstantnog regiona lakog lanca (CL). VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji se označavaju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su prošarani regionima koji su očuvaniji, i koji se nazivaju regionima okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, koji su raspoređeni od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Takođe je moguća supstitucija jednog ili više ostataka CDR-a ili izostavljanje jednog ili više CDR-a. U naučnoj literaturi su opisana antitela, u kojima jedan ili više CDR-a može biti oslobođen za vezivanje. Padlan i saradnici (1995 FASEB J.9:133-139) su analizirali kontaktne regione između antitela i njihovih antigena, bazirane na publikovanim kristalnim strukturama, i zaključili su da je samo oko jedne petine do oko jedne trećine ostataka CDR-a stvarno u kontaktu sa antigenom. Padlan je, isto tako, pronašao mnoga antitela u kojima u jednom ili više CDR-a nije bilo aminokiselina koje su u kontaktu sa antigenom (vidi, takođe, Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320:415-428).
Ostaci CDR-a koji nisu u kontaktu sa antigenom mogu biti identifikovani na osnovu ranijih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu neophodni), iz regiona Kabat CDR-a koji se prostiru van Chothia CDR-a, uz pomoć molekularnog modeliranja i/ili empirijski. Ukoliko su CDR ili njegov ostatak(ostaci) izostavljeni, uglavnom je izvršena supstitucija sa aminokiselinom koja zauzima odgovarajući položaj u sekvenci drugog humanog antitela ili konsenzusom takvih sekvenci. Položaji za supstituciju unutar okvira CDR-a i aminokiseline za supstituisanje mogu, isto tako, biti odabrani empirijski. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne ili ne-konzervativne supstitucije.
Naziv "humano antitelo", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi uključio antitela koja poseduju varijabilne i konstantne regione, dobijene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana mAt pronalaska mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani od strane imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije (npr., mutacije koje su uvedene posredstvom nasumične mutageneze ili mutageneze sa specifičnošću prema položaju in vitro ili uz pomoć somatske mutacije in vivo), na primer u CDR-ima, a posebno CDR3. Međutim, naziv "humano antitelo", kako je ovde korišćen, nije utvrđen kako bi uključio mAt u kojima su CDR sekvence, dobijene iz germinativne linije druge vrste sisara (npr., miša), nanesene kao graft na humane FR sekvence.
Izraz "specifično se vezivati", ili slični izrazi, znače da antitelo ili njegov antigenvezujući fragment obrazuje kompleks sa antigenom, koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može biti okarakterisano uz pomoć konstante ravnotežne disocijacije od najmanje oko 1 x10<-6>M ili manje (npr., manja KDoznačava čvršće vezivanje). Postupci za utvrđivanje da li se dva molekula specifično vezuju dobro su poznati u ovoj oblasti i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonske rezonancu i slične postupke. Izolovano antitelo koje specifično vezuje hPCSK9 može, međutim, da ispolji unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su molekuli PCSK9 iz drugih vrsta. Nadalje, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), koja se vezuju sa PCSK9 i sa jednim ili više dodatnih antigena, razmotrena su kao dodatna antitela koja "specifično vezuje" hPCSK9, kako su ovde korišćena.
Izraz antitelo "visokog afiniteta" odnosi se na ona mAt koja poseduju afinitet vezivanja za hPCSK9 koji je najmanje 10<-10>M; poželjno 10<-11>M; još poželjnije 10<-12>M, kako je utvrđeno posredstvom površinske plazmonske rezonance, npr., BIACORE™ ili rastvorafinitetnog ELISA testa.
Pod izrazom "slow off brzina", "Koff" ili "kd" misli se na antitelo koje disocira od hPCSK9 sa konstantom brzine od 1 x 10<-3>S<-1>ili manje, poželjno 1 x 10<-4>s<-1>ili manje, kako je utvrđeno uz pomoć površinske plazmonske rezonance, npr., BIACORE™.
Izraz "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "fragment antitela"), kako je ovde korišćen, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju sa hPCSK9. Fragment antitela može uključiti: Fab fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, dAt fragment, fragment koji sadrži CDR ili izolovani CDR.
Specifična ostvarenja, antitelo ili fragmenti antitela pronalaska, mogu biti konjugovani sa terapeutskim delom ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresivno sredstvo ili radioizotop.
"Izolovano antitelo", kao što je ovde korišćeno, utvrđeno je kako bi se odnosilo na antitelo koje je suštinski oslobođeno prisustva drugih mAt koja poseduju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje hPCSK9 je suštinski oslobođeno prisustva mAt koja specifično vezuju antigene koji nisu hPCSK9). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hPCSK9, može, međutim, pokazivati unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su molekuli PCSK9 iz drugih vrsta.
"Neutrališuće antitelo", kako je ovde korišćeno (ili "antitelo koje neutrališe aktivnost PCSK9"), utvrđeno je kako bi se odnosilo na antitelo, čije vezivanje za hPCSK9 dovodi do inhibicije najmanje jedne od bioloških aktivnosti PCSK9. Ova inhibicija biološke aktivnosti PCSK9 može se proceniti putem merenja jednog ili više indikatora biološke aktivnosti PCSK9 uz pomoć jednog ili više od nekolicine standardnih in vitro ili in vivo testova, poznatih u struci (vidi primere u nastavku).
Izraz "površinska plazmonske rezonanca", kako je ovde korišćen, odnosi se na optički fenomen koji omogućuje analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, posredstvom detekcije promena u koncentracijama proteina unutar matriksa biosenzora, na primer, korišćenjem sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Švedska i Piscataway, NJ).
<Naziv "K>D", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi se odnosio na konstantu ravnotežne disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.
Naziv "epitop" je region antigena za koji se vezuje antitelo. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su uopšteno podgrupa strukturnih epitopa, a sačinjeni su od onih ostataka koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu, isto tako, biti konformacijski, to jest, sastavljeni od ne-linearnih aminokiselina. U određenim ostvarenjima, epitopi mogu uključiti determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula, kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe ili sulfonil grupe, a, u određenim ostvarenjima, mogu posedovati specifične tro-dimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.
Izraz "suštinska istovetnost" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada se optimalno poravnaju sa odgovarajućim nukleotidnim umecima ili delecijama, sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplemenarnim lancem), postoji istovetnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 90%, a još poželjnije, najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, kako je utvrđeno uz pomoć bilo kog dobro-poznatog algoritma istovetnosti sekvenci, kao što je: FASTA, BLAST ili GAP, kako je, u nastavku, razmotreno.
Kada se primenjuje na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada se optimalno poslože, kao na primer uz pomoć programa GAP ili BESTFIT, koristeći zadate težine šupljina, dele najmanje 90% istovetnosti sekvenci, još poželjnije, najmanje 95%, 98% ili 99% istovetnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični, razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr., naelektrisanje ili hidrofobičnost). Uopšteno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne karakteristike proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci jedna od druge razlikuju po konzevativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može biti podešen na gore, da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za izvršenje ovog podešavanja dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Vidi, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim karakteristikama uključuju 1) alifatske bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatske-hidroksil bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazične bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitvnu vrednost u PAM250 log-verovatnoća matriksu, koji je izložen u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima ne-negativnu vrednost u PAM250 log-verovatnoća matriksu.
Sličnost sekvenci za polipeptide uobičajeno se utvrđuje korišćenjem softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina slaže slične sekvence korišćenjem mera sličnosti koje se pripisuju raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe, kao što su GAP i BESTFIT, koji se mogu koristiti sa zadatim parametrima da bi se utvrdila homolognost sekvenci ili isovetnost sekvenci između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Vidi, npr., GCG verzija 6.1. Polipeptidne sekvence mogu, isto tako, biti upoređene korišćenjem FASTA programa sa zadatim ili preporučenim parametrima; program u GCG verzija 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje izravnavanje i procenat istovetnosti sekvenci u regionima najboljeg preklapanja između ispitivanih i traženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se vrši poređenje sekvence pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama, jeste kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koji koristi zadate parametre. Vidi, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
215: 403410 i (1997) Nucleic Acids Res.25:3389402.
U specifičnim ostvarenjima, antitelo ili fragment antitela za korišćenje u postupku pronalaska, može biti: monospecifično, bispecifično ili multispecifično. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope ciljnog polipeptida ili mogu sadržavati antigen-vezujuće domene, specifične za epitope više od jednog ciljnog polipeptida. Primerni format bi-specifičnog antitela koji može biti korišćen u kontekstu tekućeg pronalaska uključuje korišćenje prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog po najmanje jednoj aminokiselini, i pri čemu razlika u najmanje jednoj aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A, ako se uporedi sa bi-specifičnim antitelom bez razlike u aminokiselini. U jednom ostvarenju, prvi Ig CH3 domen vezuje Protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju, koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A, kao što je H95R modifikacija (prema IMGT brojčanom označavanju egzona; H435R prema EU brojčanom označavanju). Drugi CH3 može dalje da sadrži Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći u okviru drugog CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 mAt; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 mAt; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 mAt. Varijacije na formatu bi-specifičnog antitela, koje su prethodno opisane, razmotrene su okviru ovog pronalaska.
Pod izrazom "terapeutski efektivna količina" podrazumeva se količina koja proizvodi željeni efekat zbog koga se ona i primenjuje. Egzaktna količina će zavisiti od svrhe tretmana, i biće utvrđena od strane stručnjaka u ovoj oblasti uz korišćenje poznatih tehnika (vidi, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Izrada humanih antitela
Poznati su postupci za proizvodnju humanih antitela u transgenskim miševima (vidi, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE™). VELOCIMMUNE™ tehnologija obuhvata stvaranje transgenskog miša koji poseduje genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca, koji su operativno povezani na endogene lokuse konstantnog regiona miša, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i mišji konstantni region u odgovoru na stimulaciju antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela izoluje se i operativno povezuje na DNK koja kodira konstantne regione humanog teškog i lakog lanca. DNK se, nakon toga, ekspresuje u ćeliji u kojoj je moguće ekspresovanje potpuno humanog antitela. U specifičnom ostvarenju, ćelija je CHO ćelija.
Antitela mogu biti terapeutski korisna u blokiranju interakcije ligand-receptor ili u inhibiranju interakcije receptorske komponente, pre nego u uništavanju ćelija posredstvom fiksacije komplementa i participacije u komplement-zavisnoj citotoksičnosti (CDC), ili uništavanju ćelija uz pomoć ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Konstantni region antitela je, sledstveno tome, značajan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od ćelija. Iz tih razloga, izotip antitela može biti odabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.
Humana antitela mogu postojati u dva oblika, koja su povezana sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, molekul antitela sadrži stabilnu četvero-lančanu konstrukciju od približno 150-160 kDa, u kojoj se dimeri drže zajedno uz pomoć interlančane disulfidne veze u teškom lancu. U drugom obliku, dimeri nisu povezani uz pomoć interlančanih disulfidnih veza i obrazuje se molekul od približno 75-80 kDa, koji je sastavljen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ovi oblici su izuzetno teški za razdvajanje, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.
Učestalost pojavljivanja drugog oblika u različitim izotipovima intaktnog IgG, posledica je, ali bez ograničavanja na njih, strukturnih razlika povezanih sa zglobnim regionom izotipa antitela. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu zgloba humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavljivanje drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se obično zapažaju kada se koristi zglob humanog IgG1. Tekući pronalazak obuhvata antitela koja poseduju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu, koje mogu biti poželjne, primera radi, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.
Uopšteno, VELOCIMMUNE™ miš je izazvan sa antigenom od značaja, a ćelije limfocitne loze (kao što su B-ćelije), koje ekspresuju antitela izvučene su iz miševa. Ćelije limfocitne loze mogu se spojiti sa ćelijskim nizom mijeloma, da bi se izradili obesmrćeni ćelijski nizovi hibridoma, a takvi ćelijski nizovi hibridoma su podvrgnuti skriningu i selekciji, da bi se identifikovali ćelijski nizovi hibridoma koji proizvode antitela koja su specifična za antigen od značaja. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može biti izolovana i povezana za konstantne regione željenog izotipa teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerična antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita.
U početku, izoluju se himerična antitela visokog afiniteta koja poseduju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kako je u nastavku opisano, vrši se karakterizacija i selekcija antitela prema željenim karakteristikama, koje uključuju, afinitet, selektivnost, epitop, itd.. Mišji konstantni regioni se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionom, da bi se proizvelo potpuno humano antitelo pronalaska, na primer IgG1 ili IgG4 divljeg tipa ili modifikovani IgG1 ili IgG4 (na primer, SEQ ID NO:751, 752, 753). Dok odabrani konstantni region može varirati u skladu sa specifičnom upotrebom, karakteristike visoko-afinitetnog vezivanja antigena i ciljane specifičnosti nalaze se u varijabilnom regionu.
Mapiranje epitopa i vezane tehnologije
Da bi se skrinirala antitela koja se vezuju sa određeni epitop (npr., ona koja blokiraju vezivanje IgE za njegov visoko afinitetni receptor), može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja , kao što je onaj koji je opisan u Antibodies, Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Ostali postupci uključuju: analize alanin skeniranje mutanata, peptidne blotove (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) ili analizu peptidnog cepanja. Pored toga, mogu se koristiti postupci, kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
Naziv "epitop" odnosi se na položaj na antigenu na koji odgovaraju B i/ili T-ćelije. B-ćelijski epitopi mogu biti obrazovani i od susednih aminokiselina i od aminokiselina koje nisu susedne, koje se postavljaju jedne pored drugih savijanjem proteina. Epitopi koji se obrazuju od susednih aminokiselina obično se zadržavaju nakon izlaganja denaturirajućim rastvaračima, dok se epitopi koji se obrazuju tercijarnim savijanjem obično gube nakon tretmana sa denaturirajućim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, a još češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
Modifikacijski-asistirano profilisanje (MAP), poznato, takođe, kao profilisanje antitela na osnovu strukture antigena (ASAP) jeste postupak kojim se vrši kategorizacija velikog broja monoklonskih antitela (mAt), usmerenih prema istom antigenu, prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovane antigene površine (US 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop, koji se ili jasno razlikuje ili se delimično preklapa sa epitopom, koji je predstavljen drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućuje brzo filtriranje genetski identičnih mAt, tako da karakterizacija može biti fokusirana na genetski zasebna mAt. Kada se primenjuje na skriniranje hibridoma, MAP-om se može olakšati identifikovanje retkih klonova hibridoma, koji proizvode mAt koja poseduju željene karakteristike. MAP može biti korišćen za sortiranje anti-PCSK9 mAt pronalaska u grupe mAt koja se vezuju za različite epitope.
Ovde su opisana anti-hPCSK9 antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji se vezuju za epitop u okviru katalitičkog domena, koji je na poziciji od približno 153 do 425 SEQ ID NO:755; još određenije, vezuju se za epitop od oko pozicije 153 do oko 250 ili od približno 250 do približno 425; još specifičnije, antitelo ili fragment antitela vezuju se za epitop u okviru fragmenta od oko 153 do oko 208, od približno 200 do približno 260, od oko 250 do oko 300, od oko 275 do oko 325, od oko 300 do oko 360, od oko 350 do oko 400, i/ili od oko 375 do oko 425.
Anti-hPCSK9 antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji su ovde opisani, mogu da se vezuju za epitop unutar propeptidnog domena (ostaci 31 do 152 SEQ ID NO:755); još određenije, vezuju se za epitop od približno ostatka 31 do približno ostatka 90 ili od približno ostatka 90 do približno ostatka 152; još specifičnije, antitelo ili fragment antitela vezuje se za epitop unutar okvira fragmenta od otprilike ostatka 31 do otprilike ostatka 60, od otprilike ostatka 60 do otprilike ostatka 90, od otprilike ostatka 85 do otprilike ostatka 110, od otprilike ostatka 100 do otprilike ostatka 130, od otprilike ostatka 125 do otprilike ostatka 150, od otprilike ostatka 135 do približno ostatka 152 i/ili od približno ostatka 140 do otprilike ostatka 152.
Anti-hPCSK9 antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela može da vezuje epitop unutar C-terminalnog domena, (ostaci 426 do 692 SEQ ID NO:755); još određenije, vezuju se za epitop od približno ostatka 426 do otprilike ostatka 570 ili od približno ostatka 570 do približno ostatka 692; još specifičnije, antitelo ili fragment antitela može da se vezuje za epitop unutar fragmenta od približno ostatka 450 do približno ostatka 500, od približno ostatka 500 do približno ostatka 550, od približno ostatka 550 do približno ostatka 600 i/ili od približno ostatka 600 do približno ostatka 692.
Antitelo ili fragment antitela može da se vezuje za epitop, uključujući više od jednog od nabrojanih epitopa, unutar okvira katalitičkog, propeptidnog ili C-terminalnog domena i/ili unutar dva ili tri različita domena (na primer, epitopi unutar katalitičkih i C-terminalnih domena, ili unutar propeptidnih i katalitičkih domena, ili unutar propeptidih, katalitičkih i C-terminalnih domena).
U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuje se za epitop na hPCSK9, koji sadrži aminokiselinski ostatak 238 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Eksperimentalni rezultati (Tabela 27) pokazuju da kada je D238 mutiran, KDza mAt 316P pokazivao je smanjenje afiniteta vezivanja od >400-puta (~1 x10<-9>M do ~410 x10<-9>M) i smanjeno T1/2za >30-puta (od -37 do -1 minuta). U specifičnom ostvarenju, mutacija je bila D238R. U specifičnim ostvarenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska vezuje se za epitop hPCSK9, koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka na položajima 153, 159, 238 i 343.
Kako je u nastavku prikazano, mutacija na aminokiselinskom ostatku 153, 159 ili 343 dovela je do smanjenja afiniteta od približno 5- do 10-puta ili sličnog skraćivanja T1/2. U specifičnim ostvarenjima, mutacija je bila S153R, E159R i/ili D343R.
Antitelo ili antigen-vezujući fragmenti, koji su ovde opisani, mogu da se vezuju za epitop na hPCSK9, koji sadrži aminokiselinski ostatak 366 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Eksperimentalni rezultati (Tabela 27) pokazuju da kada je E366 mutiran, afinitet mAt 300N je pokazivao smanjenje od oko 50-puta (-0.7 x10<-9>M do ~36 x10<-9>M) i slično skraćenje T1/2(od -120 do -2 minuta). U specifičnom ostvarenju, mutacija je E366K.
Ovde su opisana anti-PCSK9 antitela koja se vezuju za isti epitop kao bilo koje od specifičnih primernih antitela, koja su ovde opisana. Ovde su, takođe, opisana anti-PCSK9 antitela koja ulaze u kompeticiju za vezivanje sa PCSK9 ili fragmentom PCSK9, sa bilo kojim od specifičnih primernih antitela, koja su ovde opisana.
Moguće je lako utvrditi da li se antitelo vezuje za isti epitop ili ulazi u kompeticiju za vezivanje sa referentnim anti-PCSK9 antitelom, uz korišćenje rutinskih postupaka, koji su poznati u struci. Na primer, da bi se utvrdilo da li se test antitelo vezuje za isti epitop kao i referentno anti-PCSK9 antitelo pronalaska, referentno antitelo je ostavljeno da se vezuje za protein ili peptid PCSK9 pod saturirajućim uslovima. Nakon toga se procenjuje sposobnost test antitela da se vezuje za molekul PCSK9. Ukoliko je test antitelo u stanju da se vezuje za PCSK9 nakon saturirajućeg vezivanja sa referentnim anti-PCSK9 antitelom, može se izvesti zaključak da se test antitelo vezuje za drugačiji epitop nego referentno anti-PCSK9 antitelo. Sa druge strane, ukoliko test antitelo nije u stanju da se vezuje za molekul PCSK9 nakon saturirajućeg vezivanja sa referentnim anti-PCSK9 antitelom, tada se test antitelo može vezivati za isti epitop kakav je epitop za koji se vezuje referentno anti-PCSK9 antitelo pronalaska.
Da bi se utvrdilo da li antitelo ulazi u kompeticiju za vezivanje sa referentnim anti-PCSK9 antitelom, prethodno-opisana metodologija vezivanja vrši se u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentno antitelo je ostavljeno da se vezuje za molekul PCSK9 pod saturirajućim uslovima, nakon čega je sledila procena vezivanja test antitela za PCSK9 molekul. U drugoj orijentaciji, test antitelo je ostavljeno da se vezuju za molekul PCSK9 pod saturirajućim uslovima, nakon čega je sledila procena vezivanja referentnog antitela za PCSK9 molekul. Ukoliko je, u obe orijentacije, samo prvo (saturirajuće) antitelo u stanju da se vezuje za molekul PCSK9, tada se izvodi zaključak da test antitelo i referentno antitelo ulaze u kompeticiju za vezivanje za PCSK9. Kako će lice uobičajeno stručnosti u ovoj oblasti proceniti, antitelo koje ulazi u kompeticiju za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora se neizostavno vezivati za identični epitop kao i referentno antitelo, ali može sterički blokirati vezivanje referentnog antitela, vezivanjem za preklapajući ili susedni epitop.
Dva antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop ukoliko svako od njih kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje onog drugog za antigen. To jest, višak jednog antitela od 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-puta inhibira vezivanje onog drugog za najmanje 50%, a poželjno 75%, 90% ili čak 99%, kako je izmereno kompetitivnim testom vezivanja (vidi, npr., Junghans et al., Cancer Res.
1990 50: 1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ukoliko suštinski sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu i vezivanje drugog antitela. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ukoliko neke aminokiselinske mutacije koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje onog drugog.
Nakon toga se mogu izvršiti dodatni rutinski eksperimenti (npr., analize peptidnih mutacija i vezivanja), da bi se potvrdilo da li je zapaženi izostanak vezivanja test antitela stvarno posledica vezivanja antitela za isti epitop kao i referentno antitelo ili je steričko blokiranje (ili drugi fenomen) odgovorno za odsustvo zapaženog vezivanja. Eksperimenti ove vrste mogu se izvršiti korišćenjem ELISA testa, RIA testa, površinske plazmonske rezonance, protočne citometrije ili bilo kog drugog, kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela, koji je raspoloživ u struci.
U specifičnom ostvarenju, pronalazak uključuje anti-PCSK9 antitelo ili antigenvezujući fragment antitela koji se vezuje za protein PCSK9 SEQ ID NO:755, pri čemu je vezivanje između antitela ili njegovog fragmenta za PCSK9 i varijante proteina PCSK9, manje od 50% vezivanja između antitela ili fragmenta i PCSK9 proteina SEQ ID NO:755. U jednom specifičnom ostvarenju, varijanta proteina PCSK9 sadrži najmanje jednu mutaciju ostatka na poziciji, odabranoj iz grupe, koju sačinjavaju pozicije 153, 159, 238 i 343. U još specifičnijem ostvarenju, najmanje jedna mutacija je: S153R, E159R, D238R i D343R. Varijanta PCSK9 proteina može sadržavati najmanje jednu mutaciju ostatka na poziciji, odabranoj iz grupe koju čini pozicija 366. Varijanta PCSK9 proteina može da sadrži najmanje jednu mutaciju ostatka na poziciji, koja je odabrana iz grupe koju sačinjavaju pozicije 147, 366 i 380. Mutacija može biti: S147F, E366K i/ili V380M.
Imunokonjugati
Pronalazak obuhvata humano anti-PCSK9 monoklonsko antitelo, koje je konjugovano sa terapeutskim delom ("imunokonjugat"), kao što je: citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresivno sredstvo ili radioizotop. Citotoksična sredstva uključuju bilo koje sredstvo koje ima štetno dejstvo na ćelije. Primeri pogodnih citoksičnih sredstava i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje imunokonjugata poznati su u struci, vidi, na primer, WO 05/103081.
Bispecifična antitela
Antitela ovog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična mAt mogu biti specifična za epitope koji se razlikuju od epitopa ciljnog polipeptida ili mogu sadržavati antigen-vezujuće domene, koji su specifični za više od jednog ciljnog polipeptida. Vidi, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol.147:60-69. Humana anti-PCSK9 mAt mogu biti povezana ili ko-ekspresovana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili fragment antitela može biti funkcionalno povezan (npr., posredstvom hemijskog kuplovanja, genetske fuzije, ne-kovalentnog povezivanja ili na drugi način) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela, da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja.
Primerni format bi-specifičnog antitela koji može biti korišćen u kontekstu ovog pronalaska uključuje korišćenje prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog po najmanje jednoj aminokiselini, i pri čemu razlika u najmanje jednoj aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A, ako se uporedi sa bi-specifičnim antitelom bez razlike u aminokiselini. U jednom ostvarenju, prvi Ig CH3 domen vezuje Protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju, koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A, kao što je H95R modifikacija (prema IMGT brojčanom označavanju egzona; H435R prema EU brojčanom označavanju). Drugi CH3 može dalje da sadrži Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći unutar drugog CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije na formatu bi-specifičnog antitela, koje su prethodno opisane, razmotrene su okviru ovog pronalaska.
Bioekvivalenti
Anti-PCSK9 antitela i fragmenti antitela ovog pronalaska obuhvataju proteine koji poseduju aminokiselinske sekvence, koje se razlikuju od sekvenci opisanog mAt, ali koje zadržavaju sposobnost vezivanja humanog PCSK9. Takve varijante mAt i fragmenti antitela uključuju jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina, kada se uporede sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna aktivnosti opisanih mAt. Isto tako, DNK sekvence koje kodiraju anti-PCSK9 antitelo ovog pronalaska obuhvataju sekvence koje uključuju jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukleotida, kada se uporede sa prikazanom sekvencom, ali koje kodiraju anti-PCSK9 antitelo ili fragment antitela koji je suštinski bioekvivalentan anti-PCSK9 antitelu ili fragmentu antitela pronalaska. Primeri takvih varijanti aminokiselina i sekvenci DNK razmotreni su ranije.
Dva antigen-vezujuće proteina, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ukoliko, su, primera radi, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative, čija brzina i stepen apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku u slučaju primene u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, ili u pojedinačnoj dozi ili u višestrukoj dozi. Neka antitela će biti smatrana ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama, ukoliko su ona ekvivalentna po stepenu njihove apsorpcije, ali nisu ekvivalentna po brzini apsorpcije, a još se mogu smatrati bioekvivalentnima zato što su razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se na obeležavanje, a nisu od suštinskog značaja za postizavanje efektivnih telesnih koncentracija leka tokom, npr., dugotrajnog korišćenja, i smatra se da nemaju medicinskog značaja za određeni ispitivani proizvod leka. U jednom ostvarenju, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ukoliko nema klinički značajnih razlika u njihovoj bezbednosti, čistoći i jačini.
U jednom ostvarenju, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ukoliko pacijent može biti prebacivan jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od štetnih efekata, uključujući klinički značajnu promenu imunogeničnosti, ili smanjenu efikasnost, ako se uporedi sa kontinuiranom terapijom bez takvog prebacivanja.
U jednom ostvarenju, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ukoliko oba deluju pomoću zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili stanja za koja se koriste, do stepena do kog su takvi mehanizmi poznati.
Bioekvivalentnost se može demonstrirati uz pomoć in vivo i in vitro postupaka. Mere bioekvivalentnosti uključuju, npr., (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita određuje u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti u funkciji vremena; (b) in vitro test koji je doveden u korelaciju i postavljen kao prihvatljivi prediktivni pokazatelj humanih in vivo podataka o bioraspoloživosti; (c) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, u kome se odgovorajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meri u funkciji vremena, i (d) dobro-kontrolisana klinička ispitivanja koja utvrđuju bezbednost, efikasnost ili bioraspoloživost ili bioekvivalentnost antitela.
Bioekvivalentne varijante anti-PCSK9 antitela pronalaska mogu biti konstruisane, na primer, pravljenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanjem terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci, koje nisu neophodne za biološku aktivnost. Primera radi, cisteinski ostaci koji nisu od suštinskog značaja za biološku aktivnost mogu biti izbrisani ili zamenjeni drugim aminokiselinama, da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili nepravilnih intramolekularnih disulfidnih mostova nakon renaturacije.
Tretman populacija
Pronalazak se odnosi na terapeutske postupke za lečenje humanog pacijenta kome je potrebna kompozicija pronalaska. Dok su modifikacije životnog stila i lečenje konvencionalnim lekovima često uspešni u smanjenju koncentracija holesterola, svi pacijenti nisu u stanju da postignu preporučene ciljne nivoe holesterola korišćenjem ovog pristupa. Izgleda da su razna stanja, kao što je familijarna hiperholesterolemija (FH), otporna na snižavanje nivoa LDL-C uprkos agresivnom korišćenju konvencionalne terapije. Homozigotna i heterozigotna familijarna hiperholesterolemija (hoFH, heFH) jeste stanje udruženo sa preuranjenom aterosklerotskom vaskularnom bolešću. Međutim, pacijenti sa dijagnozom hoFH uglavnom ne odgovaraju na terapiju konvencionalnim lekovima i imaju ograničene mogućnosti lečenja. Određenije, lečenje sa statinima, koji redukuju nivoe LDL-C putem inhibicije sinteze holesterola i ushodne regulacije jetrenih LDL receptora, može imati slab efekat na pacijentima kod kojih ne postoje LDL receptori ili su isti manjkavi. Srednja vrednost smanjenja LDL-C od samo nešto manje od približno 20% nedavno je prikazana kod pacijenata sa hoFH, potvrđenom na nivou genotipa, koji su lečeni sa maksimalnom dozom statina. Dodavanje ezetimiba u dozi od 10 mg/dnevno ovom režimu lečenja za rezultat je imalo ukupno smanjenje nivoa LDL-C od 27%, što je još uvek daleko od optimalnih rezultata. Isto tako, mnogi pacijenti ne odgovaraju na statine, bivaju slabo kontrolisani terapijom sa statinima, ili ne podnose statinsku terapiju; uopšteno, ovi pacijenti su u nemogućnosti da uspostave kontrolu nivoa holesterola alternativim tretmanima. Postoji velika neispunjena medicinska potreba za novim vidovima lečenja koji se mogu pozvati na nedostatke postojećih mogućnosti lečenja.
Specifične populacije koje je moguće lečiti terapeutskim postupcima uključuju: pacijente sa indikacijom za LDL aferezu, ispitanike sa PCSK9-aktivirajućim (GOF) mutacijama, heterozigote sa familijarnom hiperholesterolemijom (heFH); ispitanike sa primarnom hiperholesterolemijom koji su intolerantni na statine ili se ne mogu kontrolisati statinima i ispitanike koji su pod rizikom da razviju hiperholesterolemiju i koji mogu biti preventivno lečeni.
Terapeutska primena i formulacije
Pronalazak obezbeđuje terapeutske kompozicije koje sadrže anti-PCSK9 antiitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente tekućeg pronalaska. Primena terapeutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom biće izvršena sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim sredstvima koja se uključuju u formulacije da bi se obezbedio poboljšani prenos, oslobađanje, podnošljivost i slične karakeristike. Veliki broj pogodnih formulacija se može naći u formularu, koji je poznat svim stručnjacima u oblast farmaceutske hemije: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, primera radi, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN™), konjugate DNK, anhidrovane apsorptivne paste, emulzije tipa ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovoskova (polietilen glikoli raznih molekulskih težina), polu-čvrste gelove i polu-čvrste mešavine koje sadrže karbovosak. Vidi, takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
Doza može varirati u zavisnosti od starosti i veličine ispitanika kome se primenjuje, ciljane bolesti, stanja, puta primene i sličnog. Kada se antitelo ovog pronalaska koristi za lečenje raznih stanja i bolesti, povezanih sa PCSK9, koje uključuju hiperholesterolemiju, poremećaje povezane sa LDL-om i apolipoproteinom B, poremećaje lipidnog metabolizma i slična stanja, kod odraslog pacijenta, pogodno je da se primena antitela tekućeg pronalaska vrši intravenski, obično u pojedinačnoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do približno 5, ili oko 0.05 do približno 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje tretmana može se podešavati.
Poznati su razni sistemi oslobađanja koji mogu biti korišćeni za primenu farmaceutskih kompozicija pronalaska, npr., inkapsulacija u liposomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje su u stanju da ekspresuju mutant viruse, endocitoza posredovana receptorom (vidi, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uključuju, ali bez ograničavanja na njih, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. Kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem, na primer, putem infuzije ili bolus injekcije, putem apsorpcije preko epitelnih ili mukokutanih podloga (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.), a može se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
Farmaceutska kompozicija se, isto tako, može oslobađati u vezikuli, posebno u liposomu (vidi Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein i Fidler (eds.), Liss, New York, pp.
353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; vidi uopšteno ibid.).
U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti oslobođena sistemom kontrolisanog oslobađanja. U jednom ostvarenju, može biti korišćena pumpa (vidi Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom ostvarenju, mogu biti korišćeni polimerni materijali; vidi, Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). U jednom drugom ostvarenju, sistem za kontrolisano oslobađanje može biti postavljen u blizini ciljanog delovanja kompozicije, čime se, sledstveno tome, zahteva, samo frakcija sistemske doze (vidi, npr., Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138, 1984).
Injekcioni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, kapajuće infuzije, itd.. Ovi injekcioni preparati mogu biti izrađeni opšte-poznatim postupcima. Na primer, injekcioni preparati mogu biti pripremljeni, npr., putem rastvaranja, suspendovanja ili emulgovanja ovde opisanog antitela ili njegove soli, u sterilnom vodenom medijumu ili uljnom medijumu, koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, u upotrebi se nalaze, primera radi, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćna sredstva, itd., koji mogu biti korišćeni u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za solubilizaciju, kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd.. Kao uljni medijum, u upotrebi se nalazi, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji mogu biti korišćeni u kombinaciji sa sredstvom za solubilizaciju, kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd.. Na taj način izrađena injekcija poželjno se puni u odgovarajuću ampulu. Farmaceutska kompozicija tekućeg pronalaska može biti oslobođena subkutano ili intravenski sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, kada se radi o subkutanom oslobađanju, aparat za oslobađanje tipa penakala lako može biti primenjen pri oslobađanju farmaceutske kompozicije tekućeg pronalaska. Takav aparat za oslobađanje tipa penkala može biti namenjen za višekratno ili jednokratno korišćenje. Aparat za oslobađanje tipa penkala koji se može višekratno koristiti uopšteno koristi zamenjivi kertridž u kome se nalazi farmaceutska kompozicija. Čim je celokupna farmaceutska kompozicija unutar kertridža primenjena, i kertridž je prazan, ispražnjeni kertridž se može lako odstraniti i zameniti novim kertridžom u kome se nalazi farmaceutska kompozicija. Nakon toga aparat za oslobađenje tipa penkala može biti ponovo korišćen. U aparatu za oslobađanje tipa penkala za jednokratno korišćenje, kertridž nije moguće zameniti. Zapravo, aparat za oslobađanje tipa penkala dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru u okviru aparata. Čim se kompozicija isprazni iz rezervoara, celokupni aparat se odstrani.
Brojni aparati za oslobađanje tipa penkala za višekratno korišćenje i autoinjekcione sprave za oslobađanje nalaze primene pri subkutanom oslobađanju farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Primeri uključuju, ali se određeno ne ograničavaju na njih, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ penkalo (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ penkalo, HUMALOG™ penkalo, HUMALIN 70/30™ penkalo (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), BD™ penkalo (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK ™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Nemačka), da pomenemo samo nekoliko. Primeri aparata za oslobađanje tipa penkala, namenjenih jednokratnom korišćenju, koji nalaze primene pri subkutanom oslobađanju farmaceutske kompozicije ovog pronalaska, uključuju, ali bez određenog ograničavanja istima, SOLOSTAR™ penkalo (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Na pogodan način, farmaceutske kompozicije za oralno ili parenteralno korišćenje, koje su ovde opisane, izrađuju se u doznim oblicima u jedinici doze, koji su pogodni za prilagođavanje doze aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jedinici doze uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd.. Prethodno pomenuto antitelo sadržano je, uopšteno, u količini od oko 5 do približno 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželjno je da je prethodno-pomenuto antitelo sadržano u količini od približno 5 do približno 100 mg i od približno 10 do približno 250 mg za druge dozne oblike.
Pronalazak se odnosi na terapeutske postupke, u kojima je antitelo ili fragment antitela pronalaska od koristi za lečenje hiperholesterolemije, udružene sa različitim stanjima koja uključuju hPCSK9. Anti-PCSK9 antitela ili fragmenti antitela pronalaska posebno su korisni za lečenje hiperholesterolemije i sličnih stanja. Kombinovane terapije mogu uključiti anti-PCSK9 antitelo pronalaska sa, primera radi, jednim ili više sredstava koja (1) indukuju ćelijsko iscrpljivanje sinteze holesterola, putem inhibiranja 3-hidroksi-3-metilglutaril (HMG)-koenzim A (CoA) reduktaze, kao što je cerivastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin; (2) inhibiraju prihvatanje holesterola i ili re-apsorpciju žučnih kiselina; (3) povećavaju katabolizam lipoproteina (kao što je niacin); i aktivatorima LXR transkripcionog faktora koji igra ulogu u eliminaciji holesterola, kao što je 22-hidroksiholesterol ili u fiksnim kombinacijama, kao što su ezetimib plus simvastatin; statin sa žučnom smolom (npr., holestiramin, kolestipol, kolesevelam), fiksnim kombinacijama niacin plus statin (npr., niacin sa lovastatinom); ili sa drugim sredstvima za snižavanje lipida, kao što su etil estri omega-3-masnih kiselina (na primer, omakor).
PRIMERI
Sledeći primeri su predstavljeni tako da licima uobičajene stručnosti u ovoj oblasti pružaju potpuni prikaz i opis na koji način se pripremaju i koriste postupci i kompozicije pronalaska, a namera im nije da na bilo koji način ograničavaju okvir onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Poduzeti su napori da se obezbedi tačnost u vezi sa korišćenim brojevima, ali bi se trebalo računati sa nekim eksperimentalnim greškama i odstupanjima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, molekulska težina je srednja molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je atmosferski pritisak ili je blizu atmosferskog pritiska.
Primer 1: Proizvodnja humanih antitela prema humanom PCSK9
VELOCIMMUNE™ miševi su imunizovani sa humanim PCSK9, a imuni odgovor posredstvom antitela praćen je uz pomoć antigen-specifičnog imuno-testa, koristeći serum dobijen od ovih miševa. B-ćelije koje ekspresuju anti-hPCSK9 sakupljene su iz slezina imunizovanih miševa, za koje se pokazalo da imaju povišene titrove anti-hPCSK9 antitela, uz spajanje sa ćelijama mišjeg mijeloma, da bi se obrazovali hibridomi. Izvršeno je skriniranje i selekcija hibridoma, da bi se identifikovali ćelijski nizovi koji ekspresuju hPCSK9-specifična antitela, uz korišćenje testova, kao što su u nastavku opisani. Testovima je identifikovano nekoliko ćelijskih nizova, koji su proizvodili himerična anti-hPCSK9 antitela, označena kao: H1M300, H1M504, H1M505, H1M500, H1M497, H1M498, H1M494, H1M309, H1M312, H1M499, H1M493, H1M496, H1M503, H1M502, H1M508, H 1 M495 i H1M492.
Humana PCSK9-specifična antitela su, isto tako, direktno izolovana iz B-ćelija imunizovanih antigenom, bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S.
2007/0280945A1. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca klonirani su kako bi se proizvela potpuno humana anti-hPCSK9 antitela, označena kao: H1H313, H1H314, H1H315, H1H316, H1H317, H1H318, H1H320, H1H321 i H1H334. Ustanovljeni su stabilni rekombinanti antiteloekspresujući CHO ćelijski nizovi koji ekspresuju ova antitela.
Primer 2. Analiza korišćenja gena
Da bi se analizirala struktura proizvedenih mAt, klonirane su i sekvencirane nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione antitela. Pretpostavljene aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona potvrđene su putem sekvenciranja N-terminalnih aminokiselina. Iz sekvenci nukleinskih kiselina i pretpostavljenih aminokiselinskih sekvenci mAt, identifikovano je korišćenje gena za svaki lanac antitela.
Tabela 1
Primer 3. Određivanje afiniteta vezivanja antigena
Konstante ravnotežne disocijacije (KD) za vezivanje hPCSK9 za mAt antitela, koja su proizvedena od strane, prethodno opisanih, ćelijskih linija hibridoma, utvrđene su posredstvom površinske kinetike u testu površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu na biosenzoru (BIACORE™ T100). Svako antitelo je prihvaćeno pri brzini protoka od 4 µl/min tokom 90 sekundi na površini od kozjih anti-mišjih IgG poliklonskih antitela, pri čemu je površina kreirana kroz direktno hemijsko kuplovanje za BIACORE™ čip, da bi se obrazovala površina sa pričvršćenim antitelom. hPCSK9-myc-myc-his (hPCSK9-mmh) u koncentraciji od 50 nM ili 12.5 nM injiciran je preko površina sa prihvaćenim antitelom pri brzini protoka od 50 µl/min tokom 300 sekundi, a antigen-antitelo disocijacija je praćena tokom 15 minuta na 25°C ili 37°C (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 2
Konstante ravnotežne disocijacije (KD) za vezivanje hPCSK9 za mAt antitela, koja su proizvedena direktnom izolacijom splenocita, utvrđene su posredstvom površinske kinetike u testu površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu na biosenzoru (BIACORE™ T100). Svako odabrano antitelo je prihvaćeno pri brzini protoka od 2 µl/min tokom 6 minuta na površini od kozjih anti-humanih IgG poliklonskih antitela, pri čemu je površina kreirana kroz direktno hemijsko kuplovanje za BIACORE™ čip, da bi se obrazovala površina sa pričvršćenim antitelom. Humani hPCSK9-mmh u koncentraciji od 50 nM ili 12.5 nM injiciran je preko površine sa prihvaćenim antitelom pri brzini protola od 70 µl/min tokom 5 minuta, a disocijacija antigenantitelo je praćena tokom 15 minuta na 25°C ili 37°C (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 3
Brzina disocijacije (kd) odabranih mAt za PCSK9 sa tag-om (mmPCSK9; SEQ ID NO:756) rezus majmuna (Macaca mulata) (mmPCSK9-mmh) na 25°C uvrđena je kao što je prethodno opisano.
Tabela 4
Primer 4. Uticaj pH na afinitet vezivanja antigena
Efekti pH na afinitet vezivanja za antigen potpuno humanih anti-hPCSK9 mAt proizvedenih od strane CHO ćelija, procenjeni su kao što je prethodno opisano. Testirana mAt su potpuno humane verzije H1H316P ("316P") (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 90/92; CDR sekvence SEQ ID NO: 76/78/80 i 84/86/88) i H1M300N ("300N") (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 218/226; CDR sekvence SEQ ID NO:220/222/224 i 228/230/232). hPCSK9-mmh je pričvršćen na anti-myc mAt površinu ili u visokoj gustini (otprilike 35 do 45 rezonantnih jedinica) (RU) ili u niskoj gustini (oko 5 do 14 RU). Svako antitelo, u koncentraciji od 50 nM u HBST (pH 7.4 ili pH 5.5) je injicirano preko površine sa prihvaćenim hPCSK9 pri brzini protoka od 100 µl/min tokom 1.5 minuta na 25°C, a disocijacija antigen-antitelo je praćena tokom 10 minuta. Kontrola I: antihPCSK9 mAt SEQ ID NO:79/101 (WO 2008/063382) (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 5
Antigen-vezujuće karakteristike antitela 316P i 300N pri pH 7.4 ili pH 5.5 određene su uz pomoć modifikovanog BIACORE™ testa, kao što je prethodno opisano. Ukratko, mAt su imobilisana na BIACORE™ CM5 senzorskim čipovima posredstvom kuplovanja amina. Različite koncentracije hPCSK9 sa myc-myc-his tagom, PCSK9 miša (mPCSK9, SEQ ID NO:757), hPCSK9 sa tačkastom mutacijom sticanja funkcije (GOF) D374Y (hPCSK9(D374Y)), PCSK9 cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) (mfPCSK9, SEQ ID NO:761) (mfPCSK9), PCSK9 pacova (Rattus norvegicus) (rPCSK9, SEQ ID NO:763) i PCSK9 sirijskog zlatnog hrčka sa his tag-om (Mesocricetus auratus) (maPCSK9, SEQ ID NO:762) (maPCSK9), u rasponu od 11 do 100 nM, injicirane su preko površine sa antitelom pri brzini protoka os 100 µl/min tokom 1.5 minuta, a disocijacija antigen-antitelo praćena je u realnom vremenu tokom 5 minuta na 25°C (Tabela 6) ili 37°C (Tabela 7). Kontrola II: anti-hPCSK9 mAt SEQ ID NO:67/12 (WO 2009/026558). NB: nije zapaženo vezivanje pod uslovima eksperimenta (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 6. Efekat pH na 25°C
Tabela 7. Efekat pH na 37°C
Primer 5. Vezivanje anti-hPCSK9 mAt za hPCSK9 sa tačkastom mutacijom D374Y
Afinitet vezivanja odabranih anti-hPCSK9 mAt za hPCSK9 sa tačkastom mutacijom sticanja funkcije (GOF) D374Y (hPCSK9(D374Y)-mmh) utvrđen je kao što je prethodno opisano. Svako antitelo je prihvaćeno pri brzini protoka od 40 ul/min, tokom 8-30 sekundi na površini od kozjih anti-humanih IgG poliklonskih antitela, pri čemu je površina stvorena direktnim hemijskim kuplovanjem za BIACORE™ čip, kako bi se obrazovala površina sa pričvršćenim antitelom. hPCSK9(D374Y)-mmh u različitim koncentracijama od 1.78 nM do 100 nM injicirani su preko površine sa prihvaćenim antitelom pri brzini protoka od 50 µl/min tokom 5 minuta, a disocijacija hPCSK9(D374Y)-mmh i antitela praćena je tokom 15 minuta na 25°C. Kontrola III: anti-hPCSK9 mAt SEQ ID NO:49/23 (WO 2009/026558) (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 8
Primer 6. Specifičnost vezivanja anti-hPCSK9 mAt
mAt 316P, 300N i Kontrola I anti-hPCSK9 prihvaćeni su na anti-hFc CM5 čipu, kuplovanom sa aminom, na BIACORE™2000. Humani PCSK9 sa tag-om (myc-myc-his), humani PCSK1 (hPCSK1) (SEQ ID NO:759), humani PCSK7 (hPCSK7) (SEQ ID NO:760) ili mišji PCSK9 injicirani su (100 nM) preko površine sa pričvršćenim mAt i ostavljeni u da se vezuju na 25°C tokom 5 minuta. Beležene su promene RU. Rezultati: antielo 300N i Kontrola I vezivali su samo za hPCSK9, a antitelo 316P se vezivalo i za hPCSK9 i za mPCSK9.
Specifičnosti vezivanja anti-hPCSK9 mAt utvrđene su uz pomoć ELISA testa. Ukratko, anti-hPCSK9 antitelom je obložena ploča sa 96 reakcionih čašica. Humani PCSK9-mmh, mPCSK9-mmh, maPCSK9-h, hPCSK1-mmh ili hPCSK7-mmh, u koncentraciji od 1.2 nM, dodati su na ploče obložene antitelom i inkubirani su na RT tokom 1 h. PCSK protein koji je vezan na ploči je, nakon toga, detektovan pomoću anti-His antitela, konjugovanog sa HRP. Rezultati su pokazali da se antitelo 316P vezuje za humani, mišji PCSK9 i PCSK9 hrčka, dok se antitelo 300N i Kontrola l vezuju samo za hPCSK9. Nijedno od anti-hPCSK9 mAt nije ispoljavalo značajno vezivanje za hPCSK1 ili hPCSK7.
Primer 7. Unakrsna reaktivnost anti-hPCSK9 mAt
Unakrsna reaktivnost anti-hPCSK9 mAt sa mmPCSK9, mfPCSK9, mPCSK9, maPCSK9 ili rPCSK9 utvrđena je korišćenjem BIACORET™3000. Anti-hPCSK9 mAt su pričvršćena na anti-hFc površinu, stvorenu direktnim hemijskim kuplovanjem za BIACORE™ čip. Prečišćeni hPCSK9 sa tag-om, hPCSK9(D374Y), mmPCSK9, mfPCSK9, mPCSK9, maPCSK9 ili rPCSK9, svaki u koncentraciji od 1.56 nM do 50 nM, injicirani su preko površine antitela na 25°C ili 37°C. Utvrđeno je vezivanje između antitela 316P, antitela 300N, Kontrole I, Kontrole II ili Kontrole III i proteina PCSK9 (KD= pM; T1/2= min).
Tabela 9.316P mAt
Tabela 10.300N mAt
Tabela 12. Kontrola II mAt
Tabela 13. Kontrola III mAt
Primer 8. Inhibicija vezivanja između hPCSK9 i domena hLDLR
Sposobnost odabranih anti-hPCSK9 mAt da blokiraju vezivanje hPCSK9 za ekstracelularni domen humanog LDLR pune dužine (hLDLR-ekto SEQ ID NO:758), EGF-A domen hLDLR (aminokiseline 313-355 SED ID NO:758) ili EGF-AB domene hLDLR (aminokiseline 314-393 SEQ ID NO:758) (LDLR Genbank broj NM_000527) procenjena je korišćenjem BIACORE™ 3000. Ukratko, hLDLR-ekto, EGF-A-hFc ili EGF-AB-hFc protein aminski je kuplovan na CM5 čip, da bi se obrazovala površina sa receptorom ili fragmentom receptora. Odabrana anti-hPCSK9 mAt u koncentraciji od 62.5 nM (u višku od 2.5-puta u odnosu na antigen) prethodno su izmešana sa 25 nM hPCSK9-mmh, nakon čega je sledila 40-minutna inkubacija na 25°C, kako bi se omogućilo da vezivanje antitelo-antigen postigne ravnotežu, da bi se obrazovali uravnoteženi rastvori. Uravnoteženi rastvori su injicirani preko površina sa receptorom ili fragmentom receptora pri brzini od 2 µl/min tokom 40 minuta na 25°C. Utvrđene su promene RU zbog vezivanja anti-hPCSK9 mAt za hLDLR-ekto, EGF-A-hFc ili EGF-AB-hFc. Rezultati pokazuju da su H1H316P i H1M300N blokirali vezivanje hPCSK9-mmh za hLDLR-ekto, EGF-A domen hLDLR i EGF-AB domene hLDLR; H1H320P je blokirao vezivanje hPCSK9-mmh za hLDLR-ekto i EGF-A domen hLDLR; a H1 H321 P je blokirao vezivanje hPCSK9-mmh za EGF-A domen hLDLR.
Takođe je utvrđena sposobnost mAt da blokiraju vezivanje hPCSK9 za hLDLR-ekto, EGF-A domen hLDLR ili EGF-AB domene hLDLR, uz pomoć imuno-testa na bazi ELISA testa. Ukratko, sa hLDLR-ekto, hLDLR EGF-A-hFc ili hLDLR EGF-AB-hFc, svaki u koncentraciji od 2 µg/ml u PBS puferu, obložena je ploča sa 96 reakcionih čašica, preko noći na 4°C, a nespecifični vezujući položaji su blokirani sa BSA. Ova ploča je korišćena za merenje slobodnog hPCSK9-mmh u PCSK9-mmh rastvoru, koji je prethodno uravnotežen sa različitim koncentracijama anti-hPCSK9 mAt. Konstantna količina hPCSK9-mmh (500 pM) je prethodno izmešana sa različitim količinama antitela, koje se kreću u rasponu od 0 do -50 nM u serijskim razblaženjima, nakon čega je sledila inkubacija od 1 h na sobnoj temperaturi (RT), da bi se omogućilo da vezivanje antitelo-antigen postigne ravnotežu. Uravnoteženi rastvori uzoraka preneseni su na ploče obložene receptorom ili fragmentom receptora. Nakon vezivanja u trajanju od 1 sata, ploče su isprane, a vezani hPCSK9-mmh detektovan je korišćenjem anti-myc antitela, konjugovanog sa HRP. Vrednosti IC50(u pM) određene su kao količina antitela koja je potrebna da se postigne 50%-tna redukcija hPCSK9-mmh vezanog za ploču, koja je obložena receptorom ili fragmentom receptora. Rezultati pokazuju da specifična mAt funkcionalno blokiraju vezivanje PCSK9 za tri receptora i pri neutralnom pH (7.2) i pri kiselom pH (5.5).
Tabela 14
Sposobnost mAt da blokiraju vezivanje hPCSK9 GOF mutant hPCSK9(D374Y)-mmh za EGF-A domen hLDLR ili EGF-AB domen hLDLR (vrednosti IC50u pM), takođe je procenjena prethodno opisanim imuno-testom na bazi ELISA testa, uz korišćenje konstantne količine od 0.05 nM hPCSK9(D374Y)-mmh.
Tabela 15
Sposobnost mAt da blokiraju vezivanje mmPCSK9 ili mPCSK9 za hLDLR-ekto domen, EGF-A domen hLDLR ili EGF-AB domen hLDLR (vrednosti IC50u pM) utvrđena je pri neutralnom pH (7.2) imuno-testom na bazi ELISA-testa, koji je prethodno opisan, uz korišćenje konstantne količine od 1 nM mmPCSK9 sa mmh-tagom ili 1 nM mPCSK9.
Tabela 16
Sposobnost mAt da blokiraju vezivanje hPCSK9, mmPCSK9, rPCSK9, maPCSK9, mfPCSK9 ili mPCSK9 za EGF-A domen hLDLR (vrednosti IC50u pM) određena je pri neutralnom pH (7.2) (Tabela 17) ili kiselom pH (5.5, Tabela 18) imuno-testom na bazi ELISA-testa, koji je prethodno opisan, uz korišćenje konstantne količine od 0.5 nM hPCSK9-mmh, 1 nM mmPCSK9-mmh, 1 nM rPCSK9-mmh, 1 nM maPCSK9-h, 0.3 nM mfPCSK9-mmh ili 1 nM mPCSK9-mmh.
Tabela 17
Tabela 18
Takođe je utvrđena sposobnost antitela 316P i Kontrole I da blokiraju vezivanje hPCSK9 za hLDLR. Ukratko, rekombinantni hLDLR ili hLDLR-EGFA-mFc je imobilisan na BIACORE™ CM5 čipovima posredstvom kuplovanja amina. Mešavina antigen-antitelo od 100 nM hPCSK9-mmh i antitela 316P, mAt Kontrole I ili ne-hPCSK9 specifičnog mAt (svaki u koncentraciji od 250 nM) inkubirana je na RT tokom 1 h, a nakon toga je injicirana preko površine sa hLDLR ili hLDLR-EGFA, pri brzini protoka od 10 µl/min tokom 15 minuta na 25°C. Beležene su promene RU zbog vezivanja između slobodnog hPCSK9-mmh u mešavini i hLDLR ili hLDLR-EGFA. Vezivanje hPCSK9 za hLDLR ili hLDLR-EGFA u potpunosti je blokirano od strane antitela 316P i 300N, ali ne i od strane mAt Kontrole I.
Primer 9. Mapiranje epitopa
Da bi se odredila specifičnost vezivanja za epitop, proizvedena su tri himerična PCSK9-mmh proteina u kojima su specifični humani PCSK9 domeni supstituisani domenima mišjeg PCSK9. Himerični protein #1 sastoji se od pro-domena mišjeg PCSK9 (aminokiselinski ostaci 1-155 SEQ ID NO:757), koga sledi katalitički domen humanog PCSK9 (ostaci 153-425 SEQ ID NO:755) i C-terminalni domen mišjeg PCSK9 (ostaci 429-694 SEQ ID NO:757) (mProhCat-mC-term-mmh). Himerični protein #2 sastoji se od pro-domena humanog PCSK9 (ostaci 1-152 SEQ ID NO:755), koga sledi katalitički domen mišjeg PCSK9 (ostaci 156-428 SEQ ID NO:757) i C-terminalni domen mišjeg PCSK9 (hPro-mCat-mC-term-mmh). Himerični protein #3 sastoji se od pro-domena mišjeg PCSK9 i katalitičkog domena mišjeg PCSK9, koga sledi C-terminalni domen humanog PCSK9 (ostaci 426-692 SEQ ID NO:755) (mPro-mCat-hC-termmmh). Pored toga, proizveden je hPCSK9 sa tačkastom mutacijom D374Y (hPCSK9(D374Y)-mmh).
Specifičnost vezivanja mAt za test proteine: hPCSK9-mmh, mišji PCSK9-mmh, himerične proteine #1, #2 i #3, i hPCSK9(D374Y)-mmh ispitana je na sledeći način: ploča sa 96 reakcionih čašica obložena je sa mAt, preko noći na 4°C, nakon čega je svaki test protein (1.2 nM) dodat na ploču. Nakon vezivanja tokom 1 h na RT, ploča je isprana, a detekcija vezanog test proteina je izvršena sa anti-myc poliklonskim antitelom, konjugovanim sa HRP (++ = OD>1.0; = OD 0.4 - 1.0; - = OD < 0.4).
Tabela 19
Specifičnost vezivanja antitela 316P, antitela 300N i kontrolnih anti-hPCSK9 mAt za: hPCSK9-mmh, mPCSK9-mmh, mmPCSK9-mmh, mfPCSK9-mmh, rPCSK9-mmh, himerične proteine #1, #2 i #3, i hPCSK9(D374Y)-mmh, ispitana je kao što je prethodno opisano, s izuzetkom što je koncentracija proteina 1.7 nM (- = OD < 0.7; = OD 0.7 - 1.5; + = OD > 1.5).
Tabela 20
Slični rezultati za odabrana mAt dobijeni su testom vezivanja na BIACORE™. Ukratko, antitelo 316P, antitelo 300N ili mAt Kontrole I prihvaćena su na anti-hFc CM5 čipu kuplovanom sa aminom, a 100 nM svakog proteina injicirano je preko površine sa prihvaćenim mAt. Utvrđene su promene RU zbog vezivanja svakog proteina za mAt površinu.
Tabela 21
Da bi se dalje procenila specifičnost vezivanja antitela 316P, koje unakrsno reaguje sa mPCSK9-mmh, razvijen je ELISA test sa unakrsnom kompeticijom, kako bi se odredila specifičnost vezivanja u odnosu na domene. Ukratko, ploča sa 96 reakcionih čašica najpre je obložena sa mAt, specifičnim za himerični protein #1, #2 ili #3, i to preko noći u koncentraciji od 1 µg/ml. U svaku čašicu je, nakon toga, dodat humani PCSK9-mmh (2 µg/ml), nakon čega je sledila inkubacija tokom 1 h na RT. Dodato je antitelo 316P (1 µg/ml), a inkubacija je trajala tokom narednih sat vremena na RT. Antitelo 316P, vezano za ploču, detektovano je korišćenjem anti-hFc poliklonskog antitela, konjugovanog sa HRP. Premda na vezivanje antitela 316P za hPCSK9-mmh nema uticaja prisustvo mAt specifičnih za himerični protein #2 ili himerični protein #3, vezivanje antitela 316P za hPCSK9-mmh u velikoj meri je smanjeno zbog prisustva antitela, specifičnog za himerični protein #1.
Primer 10. Utvrđivanje profila vezivanja antigena na bazi BIACORE™
Profili vezivanja antitela ustanovljeni su, takođe, za antitelo 316P, antitelo 300N, mAt Kontrole I, II i III, uz korišćenje BIACORE™1000. Ukratko, hPCSK9-mmh je prihvaćen na antimyc površinu. Prvo anti-hPCSK9 mAt (50 µg/ml) je injicirano preko površine sa vezanim PCSK9, tokom 10 minuta, pri brzini protoka od 10 µl/min na 25°C. Nakon toga je drugo antihPCSK9 mAt (50 µg/ml) injicirano preko površine sa vezanim prvim mAt, tokom 10 minuta, pri brzini protoka od 10 µl/min na 25°C. Izmerena je sposobnost prvog mAt da blokira vezivanje dugog mAt i izražena je kao procenat inhibicije.
Tabela 22
Primer 11. Povećanje prihvatanja LDL od strane anti-hPCSK9 antitela
Sposobnost anti-hPCSK9 mAt da povećavaju prihvatanje LDL in vitro utvrđena je korišćenjem ćelijskog niza humanog hepatocelularnog karcinoma jetre (HepG2). Na ploče sa 96 reakcionih čašica u gustini od 9 x 10<4>ćelija po čašici nanesene su HepG2 ćelije u DMEM kompletnim medijumima i inkubirane su na 37°C sa 5% CO2, tokom 6 h, da bi se obrazovali monoslojevi HepG2. Dodati su humani PCSK9-mmh u koncentraciji od 50 nM u lipoproteindeficijentnom medijumu (LPDS) i test mAt u različitim koncentracijama od 500 nM do 0.98 nM u LPDS medijumu. Podaci su izraženi kao IC50vrednosti za svaki eksperiment (IC50= koncentracija antitela pri kojoj se prihvatanje LDL povećava za 50%). Pored toga, eksperiment je, takođe, pokazao da su i antitelo 316P i antitelo 300N bili u stanju da u potpunosti ukinu inhibitorni efekat hPCSK9 na prihvatanje LDL, dok su mAt Kontrole l ili H1M508 anti-hPCSK9 mAt poništila inhibitorni efekat za približno 50%.
Tabela 23
Sposobnost anti-hPCSK9 mAt da ponište inhibitorni efekat na prihvatanje LDL od strane PCSK9 proteina iz različitih vrsta sisara ispitana je, takođe, na HepG2 ćelijskom nizu, kao što je prethodno opisano. Ukratko, HepG2 ćelije su inkubirane preko noći sa serijskim razblaženjima antitela u LPDS medijumu (započinjući sa koncentracijom od 500 nM) i 50 nM hPCSK9-mmh, mfPCSK9-mmh, mPCSK9-mmh, rPCSK9-mmh ili maPCSK9-h. HepG2 ćelije su, isto tako, inkubirane preko noći sa serijskim razblaženjima antitela u LPDS (započinjući sa koncentracijom od 50 nM) i 1 nM hPCSK9(D374Y). Kao što je prikazano u Tabeli 24, dok je antitelo 316P bilo u stanju da u potpunosti poništi inhibitorni efekat na LDL od strane svih testiranih PCSK9 proteina, antitelo 300N je bilo u stanju da poništi inhibitorni efekat na prihvatanje LDL, samo od strane hPCSK9, hPCSK9(D374Y) i mfPCSK9. Vrednosti su izražene kao IC50nM.
Tabela 24
Primer 12. Neutralizacija biološkog efekta hPCSK9 in vivo
Da bi se utvrdio biološki efekat neutralizacije PCSK9, hPCSK9 je prekomerno ekspresovan u C57BL/6 miševima, posredstvom hidrodinamskog oslobađanja (HDD) konstrukcija DNK, koje kodiraju hPCSK9-mmh pune dužine. Na 4 miša (C57BL/6) je izvršena injekciona primena mešavine rastvora bez vektora sa slanim rastvorom (kontrola), a na 16 miševa je izvršena injekciona primena mešavine 50 µg hPCSK9-mmh-DNK/slani rastvor u venu repa, što je jednako 10% njihove telesne težine. 7. dana nakon HDD, oslobađanje hPCSK9 je dovelo do povećanja ukupnog holesterola od 1.6-puta, povećanja LDL-holesterola (LDL-C) od 3.4-puta i povećanja ne-HDL holesterola (relativnog u odnosu na kontrolu) od 1.9-puta. Svi serumski nivoi hPCSK9 7. dana bili su veći od 1 µg/ml, kako je utvrđeno uz pomoć kvantitativnog ELISA testa.
Primena H1M300N 6. dana nakon HDD na 3 eksperimentalne grupe (1, 5 ili 10 mg/kg) (n=4 po grupi) posredstvom intraperitonealne (i.p.) injekcije za posledicu je imala značajno smanjenje serumskih nivoa holesterola. 18. sati nakon primene, ukupni holesterol je bio smanjen za 9.8%, 26.3% i 26.8%, LDL-C je bio smanjen za 5.1%, 52.3% i 56.7%, a ne-HDL holesterol je bio smanjen za 7.4%, 33.8% i 28.6% u grupama, tretiranim sa 1, 5, odnosno 10 mg/kg H1M300N.
Primer 13. Studije farmakokinetike i serumske hemije na majmunima
Farmakokinetička (PK) studija je izvedena na mužjacima običnih cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) sa telesnom težinom koja se kreće u rasponu između 5-7 kg i sa starošću između 3-5 godina.
Raspoređivanje u grupe. Majmuni su raspoređeni u 5 tretman grupa: Tretman grupa 1 (n=3) primala je kontrolni pufer (10 mM natrijum fosfat, pH 6, 1 ml/kg); Tretman grupa 2 (n=3) primala je antitelo 316P u dozi od 1 ml/kg (5 mg/ml); Tretman grupa 3 (n=3) primala je antitelo 300N u dozi od 1 ml/kg (5 mg/ml); Tretman grupa 4 (n=3) primala je antitelo 316P u dozi od 1 ml/kg (15 mg/ml); a Tretman grupa 5 (n=3) primala je antitelo 300N u dozi od 1 ml/kg (15 mg/ml). Svi tretmani su primenjeni uz pomoć IV bolusa, nakon čega je sledilo ispiranje sa 1 ml slanog rastvora. Ukupna zapremina doze (ml) izračunata prema najskorijoj telesnoj težini (težina svake životinje merena je dva puta tokom perioda prilagođavanja i jednom nedeljno tokom trajanja studije). Pojedinačna doza test mAt ili puferske kontrole primenjena je 1. dana.
Tretman životinja. Životinje su držane u okruženju sa praćenjem temperature i vlažnosti. Ciljni raspon temperature i relativne vlažnosti bio je između 18-29°C, odnosno 30-70%. Sistem automatskog osvetljenja je obezbeđivao 12-časovni diurnalni ciklus. Ciklus mraka mogao je biti prekinut za aktivnosti u vezi sa izvođenjem studije ili obezbeđivanjem potreba životinja. Životinje su pojedinačno smeštene u kaveze koji zadovoljavaju kriterijume Animal Welfare Act i preporuke koje su navedene u vodiču The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council 1996).
Ishrana i hranjenje životinja. Životinje su hranjene dva puta dnevno u skladu sa SNBL USA SOP. Životinjama je uskraćivana hrana kada su to zahtevale specifične procedure (npr., pre vađenja krvi za analize u serumu i sakupljanje urina, ili kada se izvode procedure koje zahtevaju sedaciju). Hrana je rutinski ispitana na prisustvo kontaminirajućih agenasa i utvrđeno je da su rezultati u okviru specifikacija proizvođača.
Dizajn eksperimenta. Odabran je odgovarajući broj životinja iz uzgajališta SNBL USA. Od strane veterinarskog osoblja ispitano je zdravstveno stanje životinja, koje su podvrgnute izvođenju analiza u serumu i hematološkom i koagulacionom skriningu. Za studiju je opredeljeno 16 mužjaka, sa potvrđenom zdravstvenom spremnošću. 15 mužjaka je raspoređeno u specifične studijske grupe, a preostala životinja je bila raspoloživa kao rezerva. Stratifikovana nasumična šema koja uključuje nivo holesterola u serumu (na osnovu srednje vrednosti dva vađenja u periodu prilagođavanja) korišćena je za raspoređivanje životinja u studijske grupe.
Period prilagođavanja. Životinje, prethodno držane u karantinu, aklimatozovane su na studijski prostor, tokom minimalno 14 dana pre započinjanja primene doza. Podaci iz faze prilagođavanja prikupljeni su za sve životinje, uključujući neraspoređenu životinju. Kod svih životinja je ispitano prisustvo abnormalnosti u ponašanju, koje bi mogle uticati na studiju. Neraspoređena životinja je vraćena u uzgajalište nakon 1 dana.
Sakupljanje krvi. Krv je sakupljena venepunkcijom iz periferne vene obuzdanih životinja u svesnom stanju. Kad god je to mogućno, krv je uzeta jednim vađenjem, nakon čega je na odgovarajući način podeljena.
PK studija. Uzorci krvi (1.5 ml) su sakupljani pre doziranja, nakon 2 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata, a nakon toga jednom dnevno svakih 24 h, u epruvete sa separatorom za serum (SST). Uzorak seruma za čuvanje prenesen je u 2 bočice i držan je na temperaturi od -60°C ili niže.
Uzorci seruma su analizirani korišćenjem optimizovane procedure ELISA testa (enzim-vezani imunosorbant test). Ukratko, mikrotitarska ploča je najpre obložena sa hPCSK9-mmh. Test mAt 316P ili 300N je, nakon toga, vezano na ploču sa hPCSK9-mmh. Pričvršćeno antitelo 316P ili 300N je detektovano korišćenjem biotinilizovanog mišjeg anti-hIgG4, nakon čega je sledilo vezivanja za NeutrAvidin-HRP. Različite koncentracije antitela 316P ili 300N, u rasponu od 100 do1.56 ng/ml, korišćene su kao standardi. Jedan procenat seruma majmuna (test matriks) bez prisustva antitela 316P ili 300N, korišćen je kao nulti (0 ng/ml) standard.
Rezultati, prikazani na Slici 2, ukazuju na dozno-zavisno povećanje nivoa antitela 316P i 300N u serumu. PK parameteri su analizirani korišćenjem WinNonlin softvera (tzv. ʺnon-compartmentalʺ analiza, Model 201- IV bolus primena).
Tabela 25
Hemijske analize u serumu. Uzorci krvi su sakupljeni pre doziranja, 12 h i 48 h nakon toga, a zatim jednom dnevno na svakih 48 h, za analize kliničke hemije, posebno za lipidne profile (t.j., holesterol, LDL-C, HDL-C, trigliceridi). S izuzetkom uzorka vađenog 12 h nakon doziranja, sve životinje se podvrgnute uskraćivanju hrane tokom noći pre sakupljanja uzorka. Zapremina uzorka je bila približno 1 ml. Hemijski parametri su određeni korišćenjem automatizovanog analizatora Olympus. Izmereni parametri su bili (Xybion kod): albumin (ALB); alkalna fosfataza (ALP); alanin aminotransferaza (ALT); aspartat transaminaza (AST); ukupni bilirubin (TBIL); kalcijum (Ca); ukupni holesterol (TCho); kreatin kinaza (CK); kreatinin (CRN); gama glutamiltransaminaza (GGT); glukoza (GLU); neorganski fosfor (IP); ukupni proteini (TP); triglicerid (TRIG); azot uree u krvi (BUN); globulin (GLOB); odnos albumin/globulin (A/G); hlorid (Cl); kalijum (K); natrijum (Na); LDL i HDL holesterol. Preostali serum je čuvan na -20°C ili niže, i odložen je ne pre jedne nedelje nakon analize.
Rezultati iz uzoraka na vremenskim tačkama sve do 105. dana nakon doziranja, prikazani su na Slikama 3-7. Nije bilo smanjenja ukupnog holesterola i LDL-C kod životinja koje su primale antitelo 316P i 300N, nezavisno od doze, u okviru 24 sata nakon primanja prve doze. Serumski nivoi ukupnog holesterola smanjivani su brzo i izrazito (~ 35%, Slika 3). Jako sniženje od ~80% zapaženo je kod LDL-C (Slike 4-5) do 6. dana. Kod životinja koje su primale dozu od 15 mg/kg antitela 300N, smanjenje nivoa ukupnog holesterola (smanjenje od ~10-15%) i LDL-C (smanjenje od ~40%) nastavljeno je barem do 80. dana studije. Pored toga, nivo HDL-C je porastao kod životinja koje su primale antitelo 316P u dozi od 15 mg/kg (Slika 6). Životinje koje su primale veću dozu (15 mg/kg) antitela 316P ili antitela 300N, takođe su ispoljile smanjenje nivoa triglicerida tokom trajanja studije (Slika 7). Antitelo 316P je ispoljilo maksimalnu supresiju nivoa LDLC do 80% u odnosu na bazalni nivo. Dužina trajanja ove supresije bila je zavisna od doze sa najmanje 60% supresije (u odnosu na bazalne nivoe LDL-C) i iznosila je približno 18 dana (doza od 5 mg/kg) i približno 45 dana (doza od 15 mg/kg). Antitelo 300N je ispoljavalo farmakodinamski profil koji se razlikuje od onog za antitelo 316P. Supresija LDL-C uz pomoć antitela 300N je održavana tokom mnogo dužeg vremenskog perioda u uporedivim dozama (supresija od 50% LDL-C tokom 28 dana nakon doze od 5 mg/kg i 50%-tna supresija LDL-C tokom približno 90 dana nakon primanja doze od 15 mg/kg). Postojala je mala ili nemerljivo mala promena funkcije jetre, ako se utvrđuje merenjima ALT i AST. Sve životinje koje su primale anti-PCSK9 antitelo u studiji ispoljile su brzu supresiju LDL-C i ukupnog holesterola.
Sličan efekat snižavanja LDL-C od strane antitela 316P i 300N zapažen je, isto tako na cinomolgus majmunima na kojima je izvršena pojedinačna subkutana (SC) primena doze od 5 mg/kg antitela 316P ili doze od 5 mg/kg antitela 300N (Slika 8). I antitelo 316P i antitelo 300N izrazito su suprimirali nivoe LDL-C, a efekat snižavanja LDL-C održavan je tokom približno 15, odnosno 30 dana (Slika 8). Izgleda da je farmakodinamski efekat (supresija LDL-C od približno 40%) u korelaciji sa nivoima funkcionalnog antitela u serumu majmuna (Slika 9). Čini se, isto tako, da kako se nivoi antitela snižavaju ispod 10 µg/ml, smanjuje se i supresija LDL-C. Pored toga, antitelo 300N je ispoljavalo značajno duži polu-život u cirkulaciji nego antitelo 316P i, sledstveno tome, dugotrajniju zapaženu supresiju LDL-C.
Tabela 26
Primer 14. Smanjivanje razgradnje LDL receptora uz pomoć anti-hPCSK9 antitela
Da bi se procenio biološki efekat PCSK9 na nivoe hepatičnih LDL receptora i sledstveni efekti na serumske nivoe LDL-C, hPCSK9 je primenjen miševima, koji ekspresuju hPCSK9, ali ne i mPCSK9 (PCSK9<hu/hu>miševi), putem intravenske injekcije. Određenije, PCSK9<hu/hu>miševima je injiciran PBS (kontrola) ili hPCSK9-mmh u dozi od 1.2 mg/kg preko vene repa. Šest sati nakon oslobađanja hPCSK9 zapaženo je povećanje od 1.4-puta (u odnosu na bazalni nivo) ukupnog holesterola i povećanje od 2.3-puta LDL-C u serumu. Analiza nivoa hepatičnih LDL receptora u zasebnoj grupi (n=3) životinja 4 sata nakon primene hPCSK9, utvrdila je značajno smanjenje detektibilnih nivoa LDL receptora u jetrenim homogenatima.
Da bi se utvrdio biološki efekat anti-hPCSK9 antitela na nivoe hepatičnih LDL receptora i sledstveni efekti na serumske nivoe LDL-C, antitelo 316P i ne-hPCSK9 specifično mAt primenjeni su PCSK9<hu/hu>miševima u ekvivalentnoj dozi (5 mg/kg i.p.) 20 sati pre, prethodno opisane, injekcije hPCSK9-mmh proteina. Četiri sata nakon primene hPCSK9, miševi su žrtvovani, sakupljeno je ukupno osam tkiva (jetra, mozak, pluća, bubreg, srce, ileum, nadbubreg i gušterača), a nivoi LDL receptora utvrđeni su posredstvom Western blot-a. Promene u nivoima LDL receptora zapažene su samo u jetri. U poređenju sa primenom doze PBS kontrole, primena antitela 316P u značajnoj meri je blokirala PCSK9-posredovana povećanja ukupnog holesterola i LDL holesterola (LDL-C = 2.49 mg/dl na bazalnom nivou i 3.1 mg/dl 6 sati nakon PCSK9; 25%-tno povećanje u poređenju sa 135%-tnim sa vehikulumom). Pre primene ne-hPCSK9 specifičnog mAt blokirano je povećanje LDL-C za približno 27% u odnosu na sam PBS (LDL-C = 4.1 mg/dl u poređenju sa PBS 5.6 mg/dl). Analiza nivoa LDL receptora u zasebnoj grupi miševa (n=3 po grupi) utvrdila je značajno smanjenje nivoa LDL receptora kada se primenjuje PCSK9 koji je blokiran od strane antitela 316P, ali ne i od strane ne-hPCSK9 specifičnog mAt (Slika 10).
Efekat različitih doza antitela 316P takođe je procenjen na PCSK9<hu/hu>miševima sapovećanim nivoima LDL-C i povećanim nivoima hPCSK9. PCSK9<hu/hu>miševi su najpre stavljeni na dijetu sa visokim nivoima ugljenih hidrata tokom 8 nedelja, što je dovelo do povećanja od ~2-puta i nivoa LDL-C i nivoa hPCSK9. Miševima je primenjeno ili antitelo 316P ili ne-hPCSK9 specifično mAt, svaki u dozi od 1 mg/kg, 5 mg/kg ili 10 mg/kg. Serumi su sakupljeni 24 sata kasnije i analizirani su nivoi LDL-C. Antitelo 316P je bilo delotvorno u snižavanju nivoa LDL-C na dozno-zavisan način (Slika 11). Pored toga, antitelo 316P, primenjeno u dozi od 10 mg/kg, veoma brzo je je smanjilo nivoe LDL-C, ponovo na početne vrednosti (pre-dijete), u okviru 24 sata (podaci nisu prikazani).
Primer 15. PK studije na miševima
PK studija je provedena na C57BL/6 miševima starosti 6 nedelja, i hPCSK9 heterozigotnim miševima starosti 11-15 nedelja. Pojedinačna injekcija Kontrole I, antitela 316P ili antitela 300N, svaki u dozi od 10 mg/kg, primenjena je SC putem. U uzorcima seruma su utvrđeni nivoi hIgG na 0 h (pre uzimanja krvi), na 6 h i 1., 3., 6., 10., 14., 21., 28., 35., 42 i 56. dana, u ukupno 12 vremenskih tačaka, koristeći pričvršćivanje anti-hFc i sendvič ELISA test sa detekcijom anti-hFc (Slike 12 i 13). Sva mAt su postigla sopstvene vrednosti Tmaxza približno 3 dana, uz odgovarajuće nivoe Cmaxod približno 47-115 µg/ml kod C57BL/6 miševa i 55-196 µg/ml kod hPCSK9 heterozigotnih miševa.56. dana su nivoi mAt Kontrole I bili oko 12 µg/ml, a nivoi antitela 300N su bili oko 11 µg/ml, dok su nivoi antitela 316P bili manji od približno 0.02 µg/ml kod C57BL/6 miševa. 56. dana u slučaju hPCSK9 heterozigotnih miševa, nivoi mAt Kontrole I bili su oko 29 µg/ml, dok su nivoi oba antitela, 300N i 316P, bili ispod granice koju je moguće kvantitativno utvrditi (BQL) od 0.02 µg/ml.
Primer 16. Vezivanje anti-hPCSK9 antitela za mutant/varijantu hPCSK9
Da bi se dalje procenilo vezivanje između hPCSK9 i anti-hPCSK9 mAt, razvijena je 21 varijanta proteina hPCSK9, pri čemu je svaka varijanta sadržavala jednu tačkastu mutaciju, i dve varijante hPCSK9 proteina, od koji je svaka sadržavala dvostruku mutaciju. Svako odabrano antitelo je pričvršćeno na F(ab’)2 anti-hIgG površinu, stvorenu direktnim hemijskim kuplovanjem na BIACORE™ čip, da bi se obrazovala površina sa prihvaćenim antitelom. Svaka varijanta hPCSK9 sa mmh tag-om, u različitim koncentracijama od 100 nM do 25 nM je, nakon toga, injicirana, preko površine sa prihvaćenim antitelom, pri brzini protoka od 60 µl/min tokom 240 sekundi, a disocijacija varijante hPCSK9 i antitela praćena je u realnom vremenu tokom 20 minuta na 25°C. nb: vezivanje nije zapaženo pod ovim eksperimentalnim uslovima (KD=M x10<-9>; T1/2= min; WT = divlji tip).
Tabela 27
Rezultati pokazuju da kada je ostatak D2380 bio mutiran, afinitet vezivanja antitela 316P za hPCSK9 bio je smanjen za >400-puta, od KDod 1 x 10<-9>M do 410 x 10<-9>M; a T1/2je skraćeno za oko 30-puta, od 37 do 1 minuta, čime se ukazuje da se antitelo 316P vezuje za epitop na hPCSK9, koji uključuje D238 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Dodatno, BIACORE™ testovi pokazuju da su afinitet vezivanja i T1/2antitela 316P bili smanjeni za oko 5- do 10-puta kada je ostatak na poziciji 153, 159 ili 343 bio mutiran. Određenije, KDje smanjena od približno 1 x 10<-9>M do vrednosti između približno 5 - 8 x10<-9>M, kada je bilo koji od ostataka S153, E159 ili D343 bio mutiran; dok je T1/2bio smanjen od približno 37 minuta do vrednosti između približno 4 - 6 minuta.
Vezivanje antitela 300N za hPCSK9 bilo je smanjeno za oko 50-puta kada je ostatak na poziciji 366 bio mutiran, što je za posledicu imalo smanjenje KDod oko 0.7 x 10<-9>M do oko 36 x 10<-9>M i kraće T1/2od približno 120 do 2 minuta. Ovi rezultati pokazuju da se antitelo 300N vezuje za epitop na hPCSK9, koji sadrži E366 hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Pored toga, BIACORE™ testovi pokazuju da su afinitet vezivanja i T1/2antitela 300N smanjeni između 2- do >10-puta, kada je ostatak na poziciji 147 ili 380 bio mutiran. Određenije, KDje smanjena od oko 0.69 x 10<-9>M do vrednosti između približno 2 - 9 x10<-9>M, kada je bilo koji od ostataka S147 ili V380 bio mutiran; dok je T1/2bilo skraćeno od približno 120 minuta do vrednosti između oko 24 66 minuta. U poređenju sa antitelom 316P, vezivanje antitela 300N za hPCSK9 nije bilo smanjeno zbog mutacije na ostatku 238.
Suprotno tome, antitelo Kontrole I nije ispoljavalo izmenjeni afinitet vezivanja ili T1/2u odgovoru na bilo koju od ispitivanih pozicionih mutacija; antitelo Kontrole II ispoljavalo je 40-puta smanjeni afinitet kada je ostatak 215 bio mutiran (R215E) (od ~0.1x10<-9>do ~4.5x10<-9>), a T1/2je bilo oko 27-puta kraće (od -333 do 12 minuta); dok je antitelo Kontrole III ispoljavalo smanjeni afinitet vezivanja kada je ostatak 237 bio mutiran (KDje smanjena od ~0.6x10<-9>do -5.9 x10<-9>, a T1/2je smanjeno od -481 do -43 minuta).
Specifičnost vezivanja antitela 316P, antitela 300N i kontrolnih anti-hPCSK9 mAt za varijante hPCSK9 testirana je korišćenjem imuno-testa na bazi ELISA testa. Ploča sa 96 reakcionih čašica presvučena je sa anti-PCSK9 mAt, tokom noći, na 4°C. Svaka varijanta hPCSK9 sa mmh tag-om u supernatantima lizata sa prolaznom transfekcijom CHO-k1 dodata je na ploču obloženu antitelom, u različitim koncentracijama, koje se kreću u rasponu od 0 do 5 nM. Nakon 1 h vezivanja na RT, ploča je isprana, a vezana varijanta hPCSK9 je detektovana korišćenjem anti-myc poliklonskog antitela, konjugovanog sa HRP (- = OD < 0.7; = OD 0.7 -1.5; + = OD > 1.5).
Tabela 28
Primer 17. Efekat antitela 316P na normolipemičnom i hiperlipemičnom hrčku
Sposobnost anti-PCSK9 mAt 316P da smanjuje serumski nivo LDL-C ispitana je na normolipemičnim ili hiperlipemičnim zlatnim sirijskim hrčcima (Mesocricetus auratus). Mužjaci sirijskih hrčaka, starosti 6-8 nedelja, sa težinama između 80-100 grama, ostavljeni su da se aklimatizuju tokom perioda od 7 dana pre ulaska u studiju. Sve životinje su stavljene na standardnu dijetalnu ishranu ili na hiperlipemijsku dijetu sa hranjivim suplementima uz 0.1% holesterola i 10% kokosovog ulja. mAt 316P je uvedeno u hrčkove posredstvom pojedinačne subkutane injekcije u dozama od 1, 3 ili 10 mg/kg za normolipemične hrčkove i u dozama od 3, 10 ili 30 mg/kg za hiperlipemične hrčkove. Uzorci seruma su uzeti od svih grupa nakon 24. sata i 7., 14. i 22. dana nakon injekcije, u kom momentu su nivoi lipida u serumu određeni i upoređeni sa bazalnim nivoima, uzetim 7 dana pre primene mAt. Nivoi ukupnog holesterola i LDL-C u cirkulaciji kod normolipemičnih hrčkova su značajno smanjeni na dozno-zavisni način, u poređenju sa injekcijom vehikuluma. Kao što je prikazano na Slici 14, primena antitela 316P je efektivno smanjila nivoe LDL-C za do 60%, sedam dana nakon injekcije u najvećoj ispitivanoj dozi (10 mg/kg). Slični efekat smanjenja holesterola od strane antitela 316P nije zapažen kod hiperlipemičnih hrčkova, kako je utvrđeno merenjima ALT i AST.

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment humanog antitela koji specifično vezuje humani proprotein konvertaza subtilizin/keksin tipa 9 (hPCSK9) koji sadrži HCVR od SEQ ID NO:90 i LCVR od SEQ ID NO: 92.
2. Antitelo prema zahtevu 1, koje je IgG1 ili IgG4.
3. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1 ili zahtevu 2.
4. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 3.
5. Postupak proizvodnje anti-humanog PCSK9 antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela koji uključuje korake uvođenja ekspresionog vektora prema zahtevu 4 u izolovanu ćeliju domaćina, uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućuju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta, i povraćaj tako proizvedenog antitela ili fragmenta.
6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
7. Antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 za korišćenje za smanjivanje ili inhibiranje PCSK9-posredovane bolesti ili stanja kod ispitanika, pri čemu je PCSK9-posredovana bolest ili stanje hiperholesterolemija.
8. Korišćenje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 u proizvodnji leka za korišćenje za smanjivanje ili inhibiranje PCSK9-posredovane bolesti ili stanja kod ispitanika, pri čemu je PCSK9-posredovana bolest ili stanje hiperholesterolemija.
RS20170255A 2008-12-15 2009-12-15 Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9 RS55771B2 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12248208P 2008-12-15 2008-12-15
US21056609P 2009-03-18 2009-03-18
US16875309P 2009-04-13 2009-04-13
US21813609P 2009-06-18 2009-06-18
US24913509P 2009-10-06 2009-10-06
US26177609P 2009-11-17 2009-11-17
EP09793408.7A EP2358756B2 (en) 2008-12-15 2009-12-15 High affinity human antibodies to pcsk9
PCT/US2009/068013 WO2010077854A1 (en) 2008-12-15 2009-12-15 High affinity human antibodies to pcsk9

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS55771B1 RS55771B1 (sr) 2017-07-31
RS55771B2 true RS55771B2 (sr) 2023-11-30

Family

ID=41668268

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170255A RS55771B2 (sr) 2008-12-15 2009-12-15 Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9
RS20211437A RS62580B1 (sr) 2008-12-15 2009-12-15 Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211437A RS62580B1 (sr) 2008-12-15 2009-12-15 Humana antitela visokog afiniteta prema pcsk9

Country Status (46)

Country Link
US (9) US8062640B2 (sr)
EP (3) EP3156422B1 (sr)
JP (2) JP5318965B2 (sr)
KR (2) KR101504494B1 (sr)
CN (2) CN102245641B (sr)
AR (1) AR077724A1 (sr)
AU (1) AU2009333326B9 (sr)
BR (1) BRPI0922885B1 (sr)
CA (1) CA2747123C (sr)
CO (1) CO6571847A2 (sr)
CR (1) CR20110296A (sr)
CY (2) CY1118896T1 (sr)
DK (2) DK2358756T4 (sr)
DO (1) DOP2011000184A (sr)
EC (1) ECSP11011134A (sr)
ES (2) ES2613489T5 (sr)
FI (2) FIC20170031I1 (sr)
FR (1) FR17C1022I2 (sr)
HN (1) HN2011001659A (sr)
HR (2) HRP20170488T4 (sr)
HU (3) HUE032681T2 (sr)
IL (2) IL213050A (sr)
JO (1) JO3672B1 (sr)
LT (3) LT2358756T (sr)
LU (1) LUC00024I2 (sr)
ME (2) ME02760B (sr)
MX (2) MX2011006197A (sr)
MY (1) MY203040A (sr)
NI (1) NI201100111A (sr)
NL (1) NL300879I2 (sr)
NO (1) NO2017029I2 (sr)
NZ (2) NZ601923A (sr)
PA (1) PA8854201A1 (sr)
PE (1) PE20120014A1 (sr)
PL (2) PL3156422T3 (sr)
PT (2) PT3156422T (sr)
RS (2) RS55771B2 (sr)
RU (2) RU2697773C2 (sr)
SI (2) SI3156422T1 (sr)
SM (1) SMT201700183T1 (sr)
TN (1) TN2011000300A1 (sr)
TW (1) TWI465249B (sr)
UA (1) UA105650C2 (sr)
UY (1) UY32329A (sr)
WO (1) WO2010077854A1 (sr)
ZA (1) ZA201103762B (sr)

Families Citing this family (310)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US20130072665A1 (en) * 2007-08-23 2013-03-21 Simon Mark Jackson Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) * 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
US8518405B2 (en) 2009-10-08 2013-08-27 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibodies and uses therefor
IN2012DN03824A (sr) 2009-10-30 2015-08-28 Merck Sharp & Dohme
AR079336A1 (es) * 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
JO3274B1 (ar) 2009-12-24 2018-09-16 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للبروتين 4 المشابه لأجيوبيوتين البشري
JP5932670B2 (ja) * 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
AU2011286024B2 (en) * 2010-08-02 2014-08-07 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9845362B2 (en) 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
CN103261230A (zh) * 2010-12-22 2013-08-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗pcsk9抗体及使用方法
SG192117A1 (en) * 2011-01-28 2013-08-30 Sanofi Sa Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treating particular groups of subjects
EP2481758A1 (en) 2011-01-28 2012-08-01 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treating particular groups of subjects (11566)
EP2650016A1 (en) 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
US8337530B2 (en) 2011-03-09 2012-12-25 Zimmer Spine, Inc. Polyaxial pedicle screw with increased angulation
AR088782A1 (es) 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
JOP20200043A1 (ar) * 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
RU2014100111A (ru) 2011-06-10 2015-07-20 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С Psl Pseudomonas, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
AR087329A1 (es) 2011-06-17 2014-03-19 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra proteina 3 de tipo angiopoietina humana
TWI687439B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
BR112014000392A2 (pt) * 2011-07-14 2017-02-21 Pfizer tratamento com anticorpos anti-pcsk9
AR087305A1 (es) * 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AR087715A1 (es) * 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
HUE069234T2 (hu) 2011-09-16 2025-02-28 Regeneron Pharma Eljárások lipoprotein(a)-szint csökkentésére proprotein-konvertáz szubtilizin/kexin 9 (PCSK9) inhibitorának beadásával
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
ITPC20110013U1 (it) 2011-10-07 2013-04-08 Giovanni Merli Struttura di protezione superiore veicoli.
HRP20201370T1 (hr) 2011-11-07 2020-11-27 Medimmune Limited Kombinacijske terapije koje koriste anti-pseudomonas psl i pcrv vezujuće molekule
KR20230143201A (ko) 2011-11-30 2023-10-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
JP6635655B2 (ja) 2011-12-08 2020-01-29 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトｌｃａｔ抗原結合タンパク質および治療法におけるそれらの使用
KR102063028B1 (ko) 2012-01-23 2020-01-07 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-ａｎｇ2 항체를 함유하는 안정화된 제형
NZ626242A (en) * 2012-01-31 2017-02-24 Regeneron Pharma Anti-asic1 antibodies and uses thereof
EP3539374A1 (en) 2012-03-16 2019-09-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
EP2825036B1 (en) 2012-03-16 2018-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
WO2013138681A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US20130281355A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
EA039663B1 (ru) 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) * 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EP2861624A1 (en) * 2012-06-15 2015-04-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
US9540449B2 (en) 2012-08-13 2017-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
SG10201709559PA (en) 2012-08-24 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
EP2703008A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Human antibodies to PCSK9 for use in methods of treating particular groups of subjects
EP2703009A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
ES2860954T3 (es) 2012-11-21 2021-10-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
ES2876009T3 (es) 2012-12-27 2021-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipéptido heterodimerizado
US20150335615A1 (en) * 2013-01-04 2015-11-26 Toshihisa Kawai Cholesterol-lowering compounds in combination with lipid metabolism-altering compounds of non-absorbable sugars, compounds that convert nh3 to nh4+, or hydrogen-generating compounds for the treatment of high cholesterol and inflammation
WO2014107739A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
WO2014150983A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
US10646664B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 Amgen Inc. Body contour adaptable autoinjector device
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
TWI614041B (zh) 2013-03-15 2018-02-11 安美基公司 用於注射器之匣盒
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
TWI682780B (zh) * 2013-05-30 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 醫藥組成物用於製造治療與ｐｃｓｋ９功能獲得性突變有關之體染色體顯性高膽固醇血症的藥物之用途
EP2810955A1 (en) 2013-06-07 2014-12-10 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
ES2901400T3 (es) * 2013-06-07 2022-03-22 Regeneron Pharma Métodos para inhibir la ateroesclerosis administrando un inhibidor de PCSK9
US10494442B2 (en) * 2013-06-07 2019-12-03 Sanofi Biotechnology Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
CA2916259C (en) 2013-06-28 2024-02-20 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ES2914978T3 (es) * 2013-10-11 2022-06-20 Sanofi Biotechnology Uso de un inhibidor de PCSK9 para tratar hiperlipidemia
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
ES2864350T3 (es) * 2013-11-12 2021-10-13 Regeneron Pharma Pautas posológicas para uso con inhibidores de PCSK9
CN118105480A (zh) * 2013-11-12 2024-05-31 赛诺菲生物技术公司 用于与pcsk9抑制剂一起使用的给药方案
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
WO2015093949A2 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Aimm Therapeutics B.V. Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
EA201691320A1 (ru) 2014-02-14 2016-11-30 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения пациентов с гиперхолестеринемией, которая устойчива к терапии умеренными дозами статинов
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
ES2913205T3 (es) 2014-05-13 2022-06-01 Bioatla Inc Proteínas biológicas activas condicionalmente
CN111840696B (zh) 2014-06-03 2022-12-20 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
WO2015200438A1 (en) * 2014-06-24 2015-12-30 Eleven Biotherapeutics, Inc. High affinity antibodies against pcsk9
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
DE202015009006U1 (de) 2014-07-15 2016-08-19 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
EP2975059A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
EP4328245A3 (en) 2014-07-15 2024-06-05 Kymab Ltd. Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
CA2955304C (en) * 2014-07-16 2023-12-12 Sanofi Biotechnology Methods for treating high cardiovascular risk patients with hypercholesterolemia
KR20230074283A (ko) 2014-07-16 2023-05-26 사노피 바이오테크놀로지 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(heFH) 환자의 치료방법
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
WO2016020798A1 (en) 2014-08-06 2016-02-11 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
WO2016020799A1 (en) 2014-08-06 2016-02-11 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
WO2016023916A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
US11554181B2 (en) 2014-09-05 2023-01-17 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibody conjugates and uses therefor
CN107001461A (zh) 2014-09-16 2017-08-01 瑞泽恩制药公司 抗胰高血糖素抗体及其使用方法
WO2016046684A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
WO2016065181A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Amgen Inc. Reducing viscosity of pharmaceutical formulations
WO2016071701A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
EP3848072A1 (en) * 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
CN105461809B (zh) * 2015-02-11 2018-10-12 康融东方（广东）医药有限公司 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
EA039310B1 (ru) * 2015-02-26 2022-01-12 Санофи Байотекнолоджи Способы снижения сердечно-сосудистого риска
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
EP3271405A1 (en) * 2015-03-20 2018-01-24 Aarhus Universitet Inhibitors of pcsk9 for treatment of lipoprotein metabolism disorders
EP4679095A3 (en) 2015-05-18 2026-05-06 Agensys, Inc. Antibodies that bind to axl proteins
WO2016187354A1 (en) * 2015-05-18 2016-11-24 Agensys, Inc. Antibodies that bind to axl proteins
CN106084058B (zh) * 2015-07-15 2019-08-27 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
TWI870789B (zh) 2015-08-04 2025-01-21 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
JP2018523684A (ja) 2015-08-18 2018-08-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． リポタンパク質アフェレーシスを受けている高脂血症の患者を治療するための抗ｐｃｓｋ９阻害抗体
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017055966A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Pfizer Inc. Low viscosity antibody compositions
CN106589127A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用
CN105348390B (zh) * 2015-10-26 2018-08-28 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
CN106810609A (zh) * 2015-11-27 2017-06-09 苏州君盟生物医药科技有限公司 抗pcsk9抗体及其应用
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3398968B1 (en) * 2015-12-31 2024-06-12 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Pcsk9 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medicinal application thereof
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
MA44234B1 (fr) * 2016-02-17 2023-10-31 Regeneron Pharma Procédés de traitement ou de prévention de l'athérosclérose par administration d'un inhibiteur d'angptl3
MA43734A (fr) 2016-03-03 2018-11-28 Regeneron Pharma Procédés de traitement de patients atteints d'hyperlipidémie par administration d'un inhibiteur de pcsk9 en combinaison avec un inhibiteur d'angptl3
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
WO2017163049A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
US11066464B2 (en) 2016-03-21 2021-07-20 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
CN107266575B (zh) * 2016-04-07 2021-12-24 天士力生物医药股份有限公司 前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin 9型的结合蛋白及其应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
CN107474140B (zh) * 2016-06-08 2022-06-03 常州博嘉生物医药科技有限公司 Pcsk9特异性的结合蛋白mv072及其应用
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
EP3487878A4 (en) 2016-07-20 2020-03-25 University of Utah Research Foundation CD229-CAR-T CELLS AND METHOD FOR USE THEREOF
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
US11858996B2 (en) 2016-08-09 2024-01-02 Kymab Limited Anti-ICOS antibodies
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3504328A1 (en) 2016-08-24 2019-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
KR20190049866A (ko) 2016-09-20 2019-05-09 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 신규한 항-ｐｃｓｋ９ 항체
WO2018054240A1 (en) * 2016-09-20 2018-03-29 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pcsk9 antibodies
EP3522918A1 (en) 2016-10-06 2019-08-14 Amgen Inc. Reduced viscosity protein pharmaceutical formulations
WO2018075621A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Vanderbilt University Human orthopoxvirus antibodies and methods of use therefor
US20190248888A1 (en) 2016-10-20 2019-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JOP20190112A1 (ar) 2016-11-14 2019-05-14 Amgen Inc علاجات مدمجة لتصلب الشرايين، شاملة مرض قلبي وعائي تصلبي
CN108239150A (zh) 2016-12-24 2018-07-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pcsk9抗体及其用途
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CN106749670B (zh) 2017-01-22 2018-06-12 北京东方百泰生物科技有限公司 抗pcsk9单克隆抗体
CN108424457B (zh) * 2017-02-13 2021-06-01 成都金洛克锶生物技术有限公司 针对pcsk9抗体与检测试剂盒的制备及其用途
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7377596B2 (ja) 2017-02-22 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
ES3023742T3 (en) 2017-03-28 2025-06-03 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system
US9989519B1 (en) * 2017-05-04 2018-06-05 Clayton Pharmaceuticals, LLC Method for determining in vitro bioequivalence of a sucralfate suspension sample to a sucralfate suspension reference listed drug (RLD)
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
TW201904608A (zh) * 2017-06-09 2019-02-01 法商賽諾菲生物技術公司 藉由投予ｐｃｓｋ９抑制劑治療糖尿病患者高血脂症之方法
US20190031774A1 (en) 2017-06-09 2019-01-31 Sanofi Biotechnology Methods for treating hyperlipidemia in diabetic patients by administering a pcsk9 inhibitor
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
BR112020000127A2 (pt) 2017-07-06 2020-07-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. método para selecionar um hidrolisado de soja, e, glicoproteína
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US12605469B2 (en) 2017-10-02 2026-04-21 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibody conjugates and uses therefor
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
EP4640703A3 (en) 2017-11-14 2026-04-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
EP3728314A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Kymab Limited Bispecific antibody for icos and pd-l1
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
MX2020006639A (es) 2017-12-22 2020-09-14 Regeneron Pharma Sistema y metodo para caracterizar las impurezas de un producto farmaceutico.
WO2019152599A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Nucleic acid monoclonal antibodies targeting pcsk9 and methods of use
BR112020013336A2 (pt) 2018-01-31 2020-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. produto farmacêutico proteico, métodos para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, para produção de um anticorpo, e para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, anticorpo, e, sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário.
TW202311746A (zh) 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
US11957745B2 (en) 2018-02-22 2024-04-16 Vanderbilt University Human Japanese Encephalitis Virus antibodies and methods of use therefor
WO2019168774A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for identifying viral contaminants
TW201945401A (zh) 2018-03-06 2019-12-01 法商賽諾菲生物技術公司 降低心血管風險的方法
HUE065344T2 (hu) 2018-03-19 2024-05-28 Regeneron Pharma Mikrochip kapilláris elektroforézis assay-k és reagensek
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
TW202519260A (zh) 2018-07-02 2025-05-16 美商安進公司 抗steap1抗原結合蛋白
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
KR102259473B1 (ko) 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
JP7511542B2 (ja) 2018-08-30 2024-07-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質複合体を特徴づけるための方法
CN110872353B (zh) * 2018-09-03 2021-05-04 深圳华大基因科技有限公司 特异性结合pcsk9抗原的纳米抗体及其制备方法和应用
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202541859A (zh) 2018-10-15 2025-11-01 美商安進公司 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
CN111110841A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 上海君实生物医药科技股份有限公司 含有抗pcsk9抗体的稳定制剂
AU2019369498A1 (en) * 2018-10-31 2021-05-20 Delinia, Inc. Multivalent regulatory T cell modulators
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
WO2020150491A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
CN109734813B (zh) * 2019-01-28 2022-06-17 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2020231992A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Improved competitive ligand binding assays
EP4696320A2 (en) 2019-05-15 2026-02-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibody
EP3969620B1 (en) 2019-05-17 2025-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome-based methods for reducing cardiovascular risk
US12559551B2 (en) 2019-05-24 2026-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-ANGPTL3 antibodies
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021061790A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
WO2021058597A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of determining whether a subject is at risk of developing arterial plaques
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CA3158119A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
WO2021119321A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a pcsk9 inhibitor to treat homozygous familial hypercholesterolemia
CN115398236B (zh) 2020-01-21 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法
EP4192864A4 (en) * 2020-08-06 2024-09-04 Stelexis Therapeutics, LLC IL-8 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022047108A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asparagine feed strategies to improve cell culture performance and mitigate asparagine sequence variants
WO2022115588A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
KR20230121854A (ko) 2020-12-17 2023-08-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 단백질-캡슐화 마이크로겔의 제작
MX2023008527A (es) 2021-01-20 2023-07-28 Regeneron Pharma Metodos para mejorar el valor proteico en cultivo celular.
JP2024512299A (ja) 2021-03-03 2024-03-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質の粘度を定量及び変更するためのシステム及び方法
AU2022243005A1 (en) 2021-03-26 2023-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing mixing protocols
TW202313682A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 英商凱麥博有限公司 抗icos抗體之用途
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
US20240316169A1 (en) 2021-07-05 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Utilization of antibodies to shape antibody responses to an antigen
US20230077710A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HIGH-THROUGHPUT AND MASS-SPECTROMETRY-BASED METHOD FOR QUANTITATING ANTIBODIES AND OTHER Fc-CONTAINING PROTEINS
CA3232463A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Philip Mellors Methods of controlling antibody heterogeneity
CA3230984A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Ross BROWNE Systems and methods of ph modeling and control
WO2023059803A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ph meter calibration and correction
TW202330104A (zh) 2021-10-26 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 用於產生實驗室用水及分配不同溫度之實驗室用水的系統及方法
KR20240164561A (ko) 2022-03-18 2024-11-19 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 폴리펩타이드 변종을 분석하기 위한 방법 및 시스템
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2024040020A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Absci Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
TW202435942A (zh) 2022-12-16 2024-09-16 美商里珍納龍藥品有限公司 評估層析管柱完整性的方法及系統
WO2024130165A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angptl3 inhibitors for triglyceride reduction in multifactorial chylomicronemia syndrome
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
EP4655595A1 (en) 2023-01-25 2025-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
WO2024163708A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asymmetrical flow field-flow fractionation with mass spectrometry for biomacromolecule analysis
EP4669963A2 (en) 2023-02-22 2025-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. SYSTEM FITNESS PARAMETERS AND COLUMN AGING
US20240366471A1 (en) 2023-05-01 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multidose antibody drug products using phenol or benzyl alcohol
EP4688822A1 (en) * 2023-05-23 2026-02-11 JLP Health GmbH Ldlr derived polypeptides for anti-viral uses
EP4467563A1 (en) * 2023-05-23 2024-11-27 JLP Health GmbH Ldlr derived polypeptides for anti-viral uses
WO2025054406A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
US20250095773A1 (en) 2023-09-18 2025-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
US20250109905A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Lyophilization using controlled nucleation
US20250129117A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
US20250145662A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity using stress
WO2025144700A1 (en) 2023-12-27 2025-07-03 Absci Corporation Nanobody library screening using bacterial surface display
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
TW202602489A (zh) 2024-03-15 2026-01-16 美商再生元醫藥公司 作為經穩定的蛋白質調配物之賦形劑的聚山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe
WO2026060350A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving photo stability and controlling formation of hmw species in biologic formulations, and biologic formulations produced by the methods
WO2026076201A2 (en) 2024-10-03 2026-04-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for producing therapeutic proteins using single pass tangential flow filtration for in-line concentration and volume reduction of production pools
WO2026080597A1 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained delivery of biologics and non-aqueous manufacture of same

Family Cites Families (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0747045B2 (ja) 1986-10-15 1995-05-24 株式会社大協精工 積層した注射器用滑栓
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
CA1341152C (en) 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5016784A (en) 1990-02-15 1991-05-21 Dexus Research Inc. Applicator for highly reactive materials
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
AU2309692A (en) 1991-07-03 1993-02-11 Cryolife, Inc. Method for stabilization of biomaterials
JP3100727B2 (ja) 1992-01-23 2000-10-23 株式会社大協精工 変性ポリシロキサン組成物及び該組成物を被覆した衛生ゴム製品
WO1993022336A1 (en) 1992-04-30 1993-11-11 Alpha Therapeutic Corporation Improved solubilization and stabilization of factor viii complex
WO1994009138A1 (en) 1992-10-20 1994-04-28 Cetus Oncology Corporation Interleukin-6 receptor antagonists
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US5888510A (en) 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
GB9410534D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd Improvements in or relating to growth factor inhibitors
CN1306963C (zh) 1994-10-21 2007-03-28 岸本忠三 用于治疗il－6产生所致疾病的药物组合物
EP0800829B2 (en) 1994-12-29 2012-07-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin
EP0811384B1 (en) 1995-02-13 2006-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Muscle protein decomposition inhibitor containing il-6 receptor antibody
JP3172057B2 (ja) 1995-04-05 2001-06-04 株式会社大協精工 ラミネートゴム栓
ES2434840T3 (es) 1995-07-27 2013-12-17 Genentech, Inc. Formulación de proteína liofilizada isotónica estable
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
JPH09154588A (ja) 1995-10-07 1997-06-17 Toagosei Co Ltd Ｖｅｇｆ結合性ポリペプチド
CA2250570A1 (en) 1996-03-26 1997-10-02 Eli Lilly And Company Formulations of ob protein
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US6692742B1 (en) 1996-06-27 2004-02-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for myeloma to be used together with nitrogen mustard antitumor agents
EP0852951A1 (de) 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
US7312196B2 (en) 1997-01-08 2007-12-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Formulations for amylin agonist peptides
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US20020187150A1 (en) 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
JP4549529B2 (ja) 1998-01-30 2010-09-22 サイオス，インコーポレーテッド ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達
CN100374159C (zh) 1998-03-17 2008-03-12 中外制药株式会社 一种包含il-6拮抗剂活性成分的炎性肠道疾病的预防或治疗剂
JP3512349B2 (ja) 1999-01-29 2004-03-29 株式会社大協精工 柱状ゴム要素の成形型
US7001892B1 (en) 1999-06-11 2006-02-21 Purdue Research Foundation Pharmaceutical materials and methods for their preparation and use
EP1514933A1 (en) 1999-07-08 2005-03-16 Research Association for Biotechnology Secretory protein or membrane protein
US7129338B1 (en) * 1999-07-08 2006-10-31 Research Association For Biotechnology Secretory protein or membrane protein
US7029895B2 (en) 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
DE60025744D1 (de) 1999-10-07 2006-04-13 Lilly Co Eli Kondensierte dihydrochinolinon-derivate zur hemmung von mrp1
EP1257572A2 (en) 2000-02-07 2002-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US7148197B2 (en) 2000-08-24 2006-12-12 The Regents Of The University Of California Orally administered small peptides synergize statin activity
MXPA03002045A (es) 2000-09-08 2003-07-24 Amgen Inc Composiciones analogas de factor estimulador de colonias de granulocitos y metodos para su elaboracion.
AU2002213441B2 (en) 2000-10-12 2006-10-26 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CN1259973C (zh) 2000-10-25 2006-06-21 中外制药株式会社 含有il－6拮抗剂作为有效成分的牛皮癣的预防或治疗剂
JP4889187B2 (ja) 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2002209975A (ja) 2001-01-19 2002-07-30 Daikyo Seiko Ltd 医薬バイアル用ラミネートゴム栓
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
MXPA04000747A (es) 2001-07-25 2004-07-08 Protein Desing Labs Inc Formulacion farmaceutica liofilizada estable de anticuerpos igg.
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US20060078531A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Osemwota Sota Method of prevention and treatment of atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, and age-related disorders including osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia and Alzheimer's disease
US20060275294A1 (en) 2002-08-22 2006-12-07 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of aging, age-related disorders and/or age-related manifestations including atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia, alzheimers disease and cancer
US20060078532A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of Atherosclerosis, Peripheral vascular disease, Coronary artery disease, aging and age-related disorders including osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia and Alzheimer's disease
US20060078533A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of aging and age-related disorders including atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia, alzheimer's disease and cancer
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
AU2003293543A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
MXPA05010555A (es) 2003-04-04 2006-03-09 Genentech Inc Formulaciones de proteina y anticuerpo de alta concentracion.
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
DE10355251A1 (de) 2003-11-26 2005-06-23 Merck Patent Gmbh Pharmazeutische Zubereitung enthaltend einen Antikörper gegen den EGF-Rezeptor
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
ATE464908T1 (de) 2004-02-11 2010-05-15 Warner Lambert Co Verfahren zur behandlung von osteoarthritis mit anti-il-6 antikörpern
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
AU2005287406B2 (en) 2004-07-26 2011-08-18 Biogen Ma Inc. Anti-CD154 antibodies
US20110313024A1 (en) 2004-08-20 2011-12-22 Leonid Beigelman RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN 9 (PCSK9) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20070036788A1 (en) 2004-09-22 2007-02-15 Ahmed Sheriff Use of a compound for reducing the biological effectiveness of il-6
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20060177436A1 (en) 2004-12-16 2006-08-10 Genentech, Inc. Methods for Treating Autoimmune Disorders
US20060147945A1 (en) 2005-01-06 2006-07-06 Edmonds Brian T Novel secreted proteins and their uses
AU2006318583A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 Wyeth Immunoglobulin fusion protein formulations
US20080131374A1 (en) 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
JP2009536222A (ja) 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
ES2366974T3 (es) 2006-05-05 2011-10-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de sglt2.
CN101484588B (zh) 2006-05-11 2013-11-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
US8080248B2 (en) 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
JP5307708B2 (ja) 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
CA2654510C (en) 2006-06-16 2015-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
US7572618B2 (en) * 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
US20100040610A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Ayesha Sitlani Antagonists of pcsk9
WO2008057459A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
US20100040611A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Sparrow Carl P Antagonists of pcsk9
WO2008057458A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CA2670563A1 (en) 2006-11-27 2008-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CN101589143A (zh) 2006-11-27 2009-11-25 Isis药物公司 用于治疗高胆固醇血症的方法
JP5100101B2 (ja) 2006-12-12 2012-12-19 キヤノン株式会社 画像形成装置
EA200901376A1 (ru) 2007-04-13 2010-12-30 Новартис Аг Молекулы и способы модуляции пропротеинконвертазы субтилизинового/кексинового типа 9(pcsk9)
CN101687927B (zh) 2007-05-15 2013-10-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对g蛋白偶联的受体（gpcr）的抗体
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US20100286021A1 (en) 2007-09-25 2010-11-11 Qun-Yong Zhou Methods of Modulating Prokineticin 2 for Treatment of Stress Response and Anxiety-Related Disorders
MX2010003329A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-receptor de il-6.
NZ584902A (en) 2007-10-26 2012-03-30 Schering Corp Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
AR070315A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
PT2331090T (pt) 2008-09-19 2018-02-07 Pfizer Formulação de anticorpo líquida estável
ES2531385T3 (es) 2008-09-19 2015-03-13 Hoffmann La Roche Formulación que comprende un anticuerpo contra la selectina P
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010068526A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
US8357371B2 (en) 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
US20100216667A1 (en) 2008-12-17 2010-08-26 Meyer Brian K Method for determining compatibility of an active pharmaceutical ingredient with materials
AU2010221156A1 (en) 2009-03-06 2011-09-22 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP5894913B2 (ja) 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
JP2012530721A (ja) 2009-06-18 2012-12-06 ワイス・エルエルシー 小モジュール免疫薬のための凍結乾燥製剤
US20110009628A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Haiyan Liu Compounds and Compositions for Modulating Lipid Levels and Methods of Preparing Same
EP2456870A1 (en) 2009-07-21 2012-05-30 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
WO2011028938A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9
US20120219558A1 (en) 2009-09-25 2012-08-30 Yan Ni Antagonists of pcsk9
WO2011039578A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of spla2 activity and lp(a) cardiovascular risk factors for the diagnosis/prognosis of a cardiovascular disease/event
IN2012DN03824A (sr) 2009-10-30 2015-08-28 Merck Sharp & Dohme
CN102596249A (zh) 2009-10-30 2012-07-18 默沙东公司 Ax1和ax189 pcsk9拮抗剂和变体
EP2501408B1 (en) 2009-11-20 2020-05-27 Biocon Limited Formulations of antibody
AR079336A1 (es) 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
JO3274B1 (ar) 2009-12-24 2018-09-16 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للبروتين 4 المشابه لأجيوبيوتين البشري
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
JP5932670B2 (ja) 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
GB201005005D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Angeletti P Ist Richerche Bio New vaccine
AU2011202239C1 (en) 2010-05-19 2017-03-16 Sanofi Long-acting formulations of insulins
DE102010024698A1 (de) 2010-06-23 2011-12-29 Eads Deutschland Gmbh Verfahren, Vorrichtung und Anordnung zur Entfernung organischer Verschmutzung von Anströmbereichen eines Luftfahrzeugs
WO2012044999A2 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Reversible protein multimers, methods for their production and use
NZ609557A (en) 2010-10-06 2014-12-24 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies
WO2012054438A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Schering Corporation Anti-pcsk9
US9518132B2 (en) 2010-11-09 2016-12-13 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
US8771696B2 (en) * 2010-11-23 2014-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of reducing the severity of stress hyperglycemia with human antibodies to the glucagon receptor
JO3756B1 (ar) * 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
WO2012076670A2 (en) 2010-12-10 2012-06-14 Novartis Ag Antibody formulation
CN103261230A (zh) 2010-12-22 2013-08-21 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗pcsk9抗体及使用方法
SG192117A1 (en) 2011-01-28 2013-08-30 Sanofi Sa Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treating particular groups of subjects
WO2012109530A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Irm Llc Pcsk9 antagonists
US8440890B1 (en) 2011-03-09 2013-05-14 Pioneer Hi Bred International Inc Maize variety inbred PH1D0D
HUE042822T2 (hu) 2011-04-20 2019-07-29 Amgen Inc Automata befecskendezõ szerkezet
AR088782A1 (es) 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
MX367097B (es) 2011-05-02 2019-08-05 Millennium Pharm Inc FORMULACION PARA ANTICUERPO ANTI-A4ß7.
US20140004122A1 (en) 2011-05-10 2014-01-02 Amgen Inc. Methods for treating or preventing cholesterol related disorders
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
CA2746171C (en) 2011-07-13 2018-11-06 William Jani Retrievable stimulation frac (rsf) plug
BR112014000392A2 (pt) 2011-07-14 2017-02-21 Pfizer tratamento com anticorpos anti-pcsk9
AR087305A1 (es) * 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
HUE069234T2 (hu) 2011-09-16 2025-02-28 Regeneron Pharma Eljárások lipoprotein(a)-szint csökkentésére proprotein-konvertáz szubtilizin/kexin 9 (PCSK9) inhibitorának beadásával
US9943594B2 (en) 2011-10-11 2018-04-17 Sanofi Biotechnology Methods for the treatment of rheumatoid arthritis
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
RS54644B1 (sr) 2012-03-08 2016-08-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Formulacija abeta antitela
WO2013158984A1 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Acetylon Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers to identify patients that will respond to treatment and treating such patients
EA039663B1 (ru) 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
KR20150059638A (ko) 2012-05-25 2015-06-01 카타베이시스 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 9형 저하 방법
US9540449B2 (en) * 2012-08-13 2017-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics
EP2703008A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Human antibodies to PCSK9 for use in methods of treating particular groups of subjects
EP2703009A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
RU2538801C2 (ru) 2013-02-07 2015-01-10 Закрытое акционерное общество "Инновационный научно-производственный центр "Пептоген" ПРИМЕНЕНИЕ ТЕТРАПЕПТИДА Arg-Pro-Gly-Pro В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
TWI682780B (zh) 2013-05-30 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 醫藥組成物用於製造治療與ｐｃｓｋ９功能獲得性突變有關之體染色體顯性高膽固醇血症的藥物之用途
US10494442B2 (en) 2013-06-07 2019-12-03 Sanofi Biotechnology Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
ES2914978T3 (es) 2013-10-11 2022-06-20 Sanofi Biotechnology Uso de un inhibidor de PCSK9 para tratar hiperlipidemia
CN118105480A (zh) 2013-11-12 2024-05-31 赛诺菲生物技术公司 用于与pcsk9抑制剂一起使用的给药方案
US9034332B1 (en) * 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8883157B1 (en) * 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
EA201691320A1 (ru) 2014-02-14 2016-11-30 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения пациентов с гиперхолестеринемией, которая устойчива к терапии умеренными дозами статинов
WO2015140079A1 (en) 2014-03-17 2015-09-24 Sanofi Methods for treating subjects with primary hypercholesterolemia that is not adequately controlled
CA2955304C (en) 2014-07-16 2023-12-12 Sanofi Biotechnology Methods for treating high cardiovascular risk patients with hypercholesterolemia
KR20230074283A (ko) 2014-07-16 2023-05-26 사노피 바이오테크놀로지 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(heFH) 환자의 치료방법
EA039310B1 (ru) 2015-02-26 2022-01-12 Санофи Байотекнолоджи Способы снижения сердечно-сосудистого риска
JP2018523684A (ja) 2015-08-18 2018-08-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． リポタンパク質アフェレーシスを受けている高脂血症の患者を治療するための抗ｐｃｓｋ９阻害抗体
US10933134B2 (en) 2017-03-16 2021-03-02 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Combination therapies for treatment of cancer
TW201904608A (zh) 2017-06-09 2019-02-01 法商賽諾菲生物技術公司 藉由投予ｐｃｓｋ９抑制劑治療糖尿病患者高血脂症之方法
US20190031774A1 (en) 2017-06-09 2019-01-31 Sanofi Biotechnology Methods for treating hyperlipidemia in diabetic patients by administering a pcsk9 inhibitor
TW201945401A (zh) 2018-03-06 2019-12-01 法商賽諾菲生物技術公司 降低心血管風險的方法
DE102023206495B3 (de) 2023-07-07 2024-11-21 Volkswagen Aktiengesellschaft Integrierter Schaltkreis, Anordnung sowie Verfahren zum Einkoppeln von optischen Signalen in einen integrierten Schaltkreis

Also Published As

Publication number Publication date
RS55771B1 (sr) 2017-07-31
KR20150013359A (ko) 2015-02-04
PL3156422T3 (pl) 2022-01-31
US20130085266A1 (en) 2013-04-04
EP3943510A3 (en) 2022-04-20
FI2358756T4 (fi) 2023-09-08
WO2010077854A1 (en) 2010-07-08
DOP2011000184A (es) 2012-08-15
MX2011006197A (es) 2011-07-20
EP3156422B1 (en) 2021-08-25
DK2358756T4 (da) 2023-09-04
LTC2358756I2 (lt) 2022-04-25
RS62580B1 (sr) 2021-12-31
MX341041B (es) 2016-08-05
US20210253735A1 (en) 2021-08-19
JP5318965B2 (ja) 2013-10-16
HUE032681T2 (en) 2017-10-30
NO2017029I1 (no) 2017-06-27
SI2358756T2 (sl) 2023-09-29
CN102245641B (zh) 2015-01-07
EP3943510A2 (en) 2022-01-26
US12269897B2 (en) 2025-04-08
US20150284474A1 (en) 2015-10-08
AU2009333326A1 (en) 2010-07-08
RU2552169C2 (ru) 2015-06-10
JP2013198487A (ja) 2013-10-03
HRP20170488T1 (hr) 2017-06-02
KR20110094067A (ko) 2011-08-19
US20100166768A1 (en) 2010-07-01
NZ601923A (en) 2013-03-28
RU2015109166A (ru) 2015-08-10
US10023654B2 (en) 2018-07-17
PL2358756T3 (pl) 2017-06-30
NI201100111A (es) 2011-12-14
EP2358756B1 (en) 2017-01-11
PT2358756T (pt) 2017-02-24
AR077724A1 (es) 2011-09-21
IL230771A (en) 2015-05-31
JO3672B1 (ar) 2020-08-27
US20250154286A1 (en) 2025-05-15
US20230340153A1 (en) 2023-10-26
ZA201103762B (en) 2012-01-25
EP2358756B2 (en) 2023-07-26
HUS1700029I1 (hu) 2017-07-28
HRP20170488T4 (hr) 2023-09-15
NO2017029I2 (no) 2017-06-27
ES2613489T5 (es) 2024-01-25
HN2011001659A (es) 2015-02-02
SI2358756T1 (sl) 2017-05-31
FR17C1022I2 (fr) 2018-07-20
TW201036633A (en) 2010-10-16
RU2697773C2 (ru) 2019-08-20
RU2011129316A (ru) 2013-01-20
US10941210B2 (en) 2021-03-09
US20170096496A1 (en) 2017-04-06
NL300879I2 (nl) 2017-11-02
ME01327B (me) 2017-07-31
CY2017021I1 (el) 2017-11-14
PE20120014A1 (es) 2012-02-07
CN102245641A (zh) 2011-11-16
DK3156422T3 (da) 2021-11-22
AU2009333326B9 (en) 2015-02-26
IL213050A (en) 2015-01-29
CA2747123C (en) 2018-01-09
CA2747123A1 (en) 2010-07-08
ECSP11011134A (es) 2011-07-29
BRPI0922885A2 (pt) 2016-10-04
UA105650C2 (uk) 2014-06-10
IL230771A0 (en) 2014-03-31
JP2012511913A (ja) 2012-05-31
FR17C1022I1 (sr) 2017-08-09
ME02760B (me) 2018-01-20
WO2010077854A8 (en) 2011-07-07
CO6571847A2 (es) 2012-11-30
LT3156422T (lt) 2021-11-25
KR101504494B1 (ko) 2015-03-20
MY203040A (en) 2024-06-05
HRP20211688T1 (hr) 2022-03-18
LUC00024I1 (sr) 2017-07-06
US8062640B2 (en) 2011-11-22
EP3156422A2 (en) 2017-04-19
IL213050A0 (en) 2011-07-31
CY1118896T1 (el) 2017-11-14
PL2358756T5 (pl) 2023-11-06
PT3156422T (pt) 2021-11-24
BRPI0922885B1 (pt) 2021-12-21
AU2009333326B2 (en) 2014-09-11
ES2613489T3 (es) 2017-05-24
CY2017021I2 (el) 2025-05-09
LTPA2017019I1 (lt) 2017-07-10
US8501184B2 (en) 2013-08-06
DK2358756T3 (en) 2017-04-10
SI3156422T1 (sl) 2022-01-31
ES2898661T3 (es) 2022-03-08
CN104447997A (zh) 2015-03-25
JP5902122B2 (ja) 2016-04-13
US20190135941A1 (en) 2019-05-09
UY32329A (es) 2010-07-30
SMT201700183T1 (it) 2017-05-08
US20110065902A1 (en) 2011-03-17
US9550837B2 (en) 2017-01-24
LUC00024I2 (sr) 2017-09-08
HUE056244T2 (hu) 2022-02-28
LT2358756T (lt) 2017-03-27
EP3156422A3 (en) 2017-07-05
FIC20170031I1 (fi) 2017-07-03
KR101699707B1 (ko) 2017-01-25
CR20110296A (es) 2011-07-14
NZ593155A (en) 2012-11-30
TWI465249B (zh) 2014-12-21
EP2358756A1 (en) 2011-08-24
TN2011000300A1 (en) 2012-12-17
RU2552169C3 (ru) 2018-01-19
PA8854201A1 (es) 2010-07-27
RU2015109166A3 (sr) 2018-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12269897B2 (en) Anti-PCSK9 antibodies
US8357371B2 (en) Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
US9724411B2 (en) Methods for treating hypercholesterolemia and reducing LDL-C using antibodies to PCSK9
AU2014262171B2 (en) High affinity human antibodies to PCSK9
HK40067101A (en) High affinity human antibodies to pcsk9
HK1155180B (en) High affinity human antibodies to pcsk9
HK1155180A (en) High affinity human antibodies to pcsk9