RS55930B1

RS55930B1 - Antitela za receptor 3 faktora rasta epiderma (her3)

Info

Publication number: RS55930B1
Application number: RS20170303A
Authority: RS
Inventors: Winfried Elis; Seth Ettenberg; Andrew Paul Garner; Nicole Haubst; Christian Carsten Silvester Kunz; Sprague Elizabeth Anne Reisinger
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2017-09-29
Also published as: AU2011290672A1; PE20140230A1; CU20130023A7; KR102027011B1; WO2012022814A1; HRP20170462T1; IL226712B; HUE031855T2; JP6771002B2; JP2017019815A; EA036314B1; CN103080134A; PL2606070T4; JP2018090590A; EA201300256A1; CN105037552A; CL2014002750A1; DOP2013000044A; GT201300046A; UA114883C2

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na antitela ili njihove fragmente koji interaguju sa HER familijom receptora, npr, HER3 receptorom. Naročito se odnosi na antitela ili njihove fragmente koji prepoznaju konformacioni epitop HER receptora (npr, HER3) koji sadrži rezidue domena 2 i 4 što vodi inhibiciji oba signalna puta - ligand-zavisnog kao i ligandnezavisnog. Pronalazak se takođe odnosi na antitela i njihove fragmente koja se vezuju za HER receptore (npr, HER3 receptor) istovremeno sa ligandom (npr, neuregulinom), sprečavajući aktivaciju prenosa signala indukovanu ligandom.

Osnova pronalaska

[0002] Receptor 3 humanog faktora rasta epiderma (engl. “human epidermal growth factor receptor 3” - ErbB3, takođe poznat i kao HER3) je receptorska protein tirozin kinaza i pripada receptorima epidermalnog faktora rasta (engl. “epidermal growth factor receptor” - EGFR) -podfamiliji receptorskih protein tirozin kinaza koja obuhvata EGFR (HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, Neu) i HER4 (ErbB4) (Plowman i sar., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

87:4905-4909; Kraus i sar., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:9193-9197; i Kraus i sar., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2900-2904). Kao prototip receptora faktora rasta epiderma, transmembranski receptor HER3 se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezujućeg domena (engl. “extracellular ligand-binding domain” - ECD), dimerizacionog domena unutar ECD, transmembranskog domena, intracelularnog proteinskoj tirozin kinazi-sličnog domena (engl. “tyrosine kinase” - TKD) i C-terminalnog fosforilacionog domena. Za razliku od ostalih članova HER familije, kinazni domen HER3 ispoljava veoma nisku intrinzičku kinaznu aktivinost.

[0003] Ligandi neuregulin 1 (NRG) ili neuregulin 2 se vezuju za eksracelularni domen HER3 i aktiviraju receptorom-posredovani signalni put pospešivanjem dimerizacije sa drugim dimerizacionim partnerima kao što je HER2. Heterodimerizacija dovodi do aktivacije i transfosforilacije intracelularnog domena HER3 i predstavlja način ne samo diverzifikacije, već i pojačavanja signala. Osim toga, do heterodimerizacije HER3 može takođe da dođe u odsustvu aktivirajućih liganda što se uobičajeno naziva ligand-nezavisnom HER3 aktivacijom. Na primer, kada je nivo eksprimiranja HER2 visok kao rezultat amplifikacije gena (npr. kod kancera dojke, pluća, ovarijuma ili kancera želuca) mogu nastati spontani dimeri HER2/HER3. U tom slučaju, HER2/HER3 se smatra najaktivnijim ErbB signalnim dimerom i zbog toga ima veliku moć transformacije ćelija.

[0004] Povišeni nivo HER3 je nađen kod nekoliko tipova kancera kao što je kancer dojke, pluća, gastrointestinalni i kancer pankreasa. Dokument WO 2007/077028 A2 obelodanjuje humana anti-HER3 antitela usmerena protiv ekstracelularnog domena HER3. Zanimljivo, pokazana je korelacija između ekspresije HER2/HER3 i progresije od neinvazivnog do invazivnog stadijuma (Alimandi i sar., (1995) Oncogene 10:1813-1821; DeFazio i sar., (2000) Cancer 87:487-498; Naidu i sar., (1988) Br. J. Cancer 78:1385-1390). U skladu sa tim, potrebna su sredstva koja interferiraju sa HER3-posredovanim prenosom signala.

Suština pronalaska

[0005] Pronalazak se zasniva na otkriću antigen-vezujućih proteina (npr, antitela ili njihovih fragmenata) koji se vezuju za konformacioni epitop HER3 receptora koji sadrži aminokiselinske rezidue u domenu 2 i domenu 4 u HER3. Ovo vezivanje antitela ili njihovih fragmenata sa domenom 2 i domenom 4 stabilizuje HER3 receptor u neaktivnoj ili zatvorenoj konformaciji tako da je aktivacija HER3 sprečena. Iznenađujuće, vezivanje antitela ili njihovih fragmenata sa ovim konformacionim epitopom sprečava i ligand-zavisne (npr. neuregulin) i ligand-nezavisne HER3 signalne puteve. Osim toga, inhibicija ligandom indukovanog prenosa signala koja je posredovana antitelom se dešava bez sprečavanja vezivanja liganda (tj. i ligand i antitelo mogu da se vežu za HER3) verovatno zato što HER3 ne može da podlegne konformacionim preuređenjima potrebnim za aktivaciju.

[0006] Pronalazak je u najširem smislu definisan u nezavisnim patentnim zahtevima.

[0007] Antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od monoklonskog antitela, poliklonskog antitela, himernog antitela, humanizovanog antitela i sintetisanog antitela. Vezivanje antitela prema jednom aspektu pronalaska može da stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju, tako da HER3 ligand može istovremeno da se veže za ligand-vezujuće mesto na HER3 receptoru. U jednom primeru izvođenja, vezivanje liganda HER3 za ligand-vezujuće mesto ne dovodi do konformacione promene HER3 receptora u aktivno stanje. U sledećem primeru izvođenja, vezivanje liganda HER3 za ligand-vezujuće mesto ne dovodi do aktivacije prenosa signala. Prema jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za konformacioni epitop HER3 receptora, gde konformacioni epitop obuhvata aminokiselinske rezidue 265-277, 315 (domena 2), 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) HER3 receptora sa sekvencom SEQ ID NO: 1. U jednom primeru izvođenja, VH antitela ili njegov fragment se vezuje za najmanje jednu od sledećih rezidua HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. U jednom primeru izvođenja, VL antitela ili njegov fragment se vezuje za najmanje jednu od sledećih rezidua HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

[0008] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili njegov fragment koji prepoznaje konformacioni epitop prvog HER3 receptora, gde vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za prvi HER3 receptor, u odsustvu liganda HER3 receptora, smanjuje ligand-nezavisno formiranje proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor u ćeliji koja eksprimira prvi HER3 receptor i drugi HER3 receptor. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje prvi HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da ne dolazi do dimerizacije prvog HER receptora sa drugim HER3 receptorom i formiranja proteinskog kompleksa prvi HER receptora-drugi HER receptor. U jednom primeru izvođenja, izostanak formiranja proteinskog kompleksa prvi HER receptor-drugi HER receptor sprečava aktivaciju prenosa signala. U jednom primeru izvođenja, vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za HER3 receptor u odsustvu HER3 liganda smanjuje ligandnezavisno formiranje HER2-HER3 proteinskog kompleksa u ćeliji koja eksprimira HER2 i HER3. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da izostaje dimerizacija HER3 receptora sa HER2 receptorom i formiranje HER2-HER3 proteinskog kompleksa. U jednom primeru izvođenja, izostanak formiranja proteinskog kompleksa HER2-HER3 sprečava aktivaciju prenosa signala. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da HER3 receptor može i dalje da dimerizuje sa HER2 ali obrazuje neaktivni HER2-HER3 proteinski kompleks. U jednom primeru izvođenja, obrazovanje neaktivnog HER2-HER3 proteinskog kompleksa sprečava aktivaciju prenosa signala.

[0009] U jednom primeru izvođenja, vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za prvi HER3 receptor u prisustvu HER3 liganda umanjuje ligand-zavisno formiranje proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor u ćeliji koja eksprimira prvi HER3 receptor i drugi HER3 receptor. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje prvi HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da izostaje dimerizacija HER3 receptora sa drugim HER3 receptorom u prisustvu prvog HER3 liganda i formiranje proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor. U jednom primeru izvođenja, izostanak obrazovanja proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor sprečava aktivaciju prenosa signalna. U jednom primeru izvođenja, HER ligand je odabran iz grupe koju čine neuregulin 1 (NRG), neuregulin 2, neuregulin 3, neuregulin 4, betacelulin, heparin-vezujući faktor rasta epiderma, epiregulin, faktor rasta epiderma, amfiregulin i transformišući faktor rasta alfa.

[0010] U jednom primeru izvođenja, vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za HER3 receptor u prisustvu HER3 liganda snižava ligand-zavisno obrazovanje HER2-HER3 proteinskog kompleksa u ćeliji koja eksprimira HER2 i HER3. Ligand je odabran iz grupe koju čine neuregulin 1 (NRG) i neuregulin 2. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da izostaje dimerizacija HER3 receptora sa HER2 receptorom u prisustvu HER3 liganda i obrazuje HER2-HER3 proteinskog kompleksa. U jednom primeru izvođenja, izostanak obrazovanja HER2-HER3 proteinskog kompleksa sprečava aktivaciju prenosa signala.

[0011] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment inhibira fosforilaciju HER3 kako je procenjeno pomoću testa fosforilacije nezavisnog od liganda HER3. U jednom primeru izvođenja, test fosforilacije nezavisan od liganda HER3 koristi ćelije sa umnoženim HER2, u kome ćelije sa umnoženim HER2 predstavljaju SK-Br-3 ćelije.

[0012] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment inhibira fosforilaciju HER3 kako je procenjeno pomoću testa fosforilacije zavisnog od liganda HER3. U jednom primeru izvođenja, test fosforilacije zavisan od liganda HER3 koristi MCF7 ćelije stimulisane neuregulinom (NRG).

[0013] Antitelo može da ima konstantu disocijacije (KD) od najmanje 1 x 107 M-1 , 108 M-1 , 109 M-1 , 1010 M-1 , 1011 M-1 , 1012 M-1 , 1013 M-1. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment inhibira fosforilaciju HER3 kada se meri in vitro vezivanje za humani HER3 u testu fosforilacije odabranom iz grupe koja se sastoji od fosfo-HER3 i fosfo-Akt.

[0014] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment za HER3 receptor, je antitelo ili njegov fragment koje ispoljava unakrsnu kompeticiju sa antitelom opisanim u tabeli 1; antitelo ili njegov fragment koje interaguje sa (npr, vezivanjem, sternim ometanjem, stabilizacijom/destabilizacijom, prostornom distribucijom) istim epitopom kao antitelo opisano u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je monoklonsko antitelo. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je humano ili humanizovano antitelo. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je himerno antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment sadrži konstantni region humanog teškog lanca i konstantni region humanog lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je jednolančano antitelo. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je Fab fragment. U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je scFv. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje i za humani HER3 i za HER3 cinomologus majmuna. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment je IgG izotip. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment sadrži okvirne sekvence (engl. “framework”) u kojim su aminokiseline supstituisane u okvirne sekvence antitela iz odgovarajućih VH ili VL sekvenci humane germinativne linije.

[0015] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment za HER3 sadrži 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR-ova prema računici Kabat ili Chothia bilo kog od antitela u tabeli 1.

[0016] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor sadrži teški lanac CDR3 izabran iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 346, i SEQ ID NO: 364.

[0017] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 14, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0018] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 32, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0019] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 51 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 50, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0020] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 69 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 68, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0021] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 87 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 86, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0022] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 105 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 104, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0023] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 123 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 122, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0024] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 141 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 140, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0025] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 159 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 158, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0026] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 177 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 176, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0027] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 195 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 194, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0028] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 213 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 212, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0029] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 231 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 230, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0030] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 249 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 248, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0031] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 267 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 266, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0032] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 285 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 284, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0033] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 303 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 302, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0034] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 321 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 320, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0035] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 339 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 338, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0036] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 357 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 356, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0037] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment na HER3 receptor gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 375 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 374, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

[0038] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu SEQ ID NO: 493.

[0039] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu SEQ ID NO: 494.

[0040] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu SEQ ID NO: 493 i varijabilnu sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu SEQ ID NO: 494.

[0041] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijantu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR1, CDR2, i CDR3, u kojoj varijanta ima najmanje jednu do četiri aminokiselinske izmene u jednom od regiona CDR1, CDR2, ili CDR3.

[0042] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 2; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 3; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 4; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 5; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 6; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 7.

[0043] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 20; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 21; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 22; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 23; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 24; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 25.

[0044] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 38; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 39; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 40; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 41; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 42; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 43.

[0045] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 56; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 57; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 58; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 59; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 60; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 61.

[0046] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 74; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 75; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 76; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 77; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 78; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 79.

[0047] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 92; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 93; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 94; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 95; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 96; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 97.

[0048] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 110; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 111; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 112; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 113; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 114; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 115.

[0049] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 128; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 129; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 130; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 131; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 132; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 133.

[0050] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 146; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 147; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 148; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 149; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 150; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 151.

[0051] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 164; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 165; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 166; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 167; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 168; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 169.

[0052] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 182; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 183; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 184; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 185; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 186; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 187.

[0053] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 200; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 201; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 202; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 203; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 204; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 205.

[0054] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 218; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 219; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 220; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 221; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 222; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 223.

[0055] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 236; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 237; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 238; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 239; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 240; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 241.

[0056] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 254; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 255; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 256; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 257; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 258; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 259.

[0057] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 272; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 273; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 274; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 275; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 276; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 277.

[0058] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 290; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 291; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 292; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 293; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 294; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 295.

[0059] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 308; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 309; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 310; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 311; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 312; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 313.

[0060] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 326; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 327; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 328; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 329; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 330; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 331.

[0061] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 344; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 345; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 346; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 347; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 348; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 349.

[0062] U jednom primeru izvođenja, izolovano antitelo ili njegov fragment, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 362; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 363; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 364; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 365; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 366; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 367.

[0063] U jednom primeru izvođenja, fragment antitela koji se vezuje za HER3 je odabran iz grupe koju čine Fab, F(ab2)’, F(ab)2’, scFv, VHH, VH, VL, dAbs.

[0064] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili fragment i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija dalje sadrži dodatno terapijsko sredstvo, kao što je antitelo, mali molekul, mTOR inhibitor ili inhibitor PI3 kinaze. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo ili fragment antitela pronalaska i inhibitor HER1 uključujući, ali bez ograničenja na, Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuksimab, Vectibix® /Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® /Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® /Lapatinib-ditosilat, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, i Tovok®.

[0065] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pronalaska ili njegov fragment i inhibitor HER2 uključujući, ali bez ograničenja na, Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib ili lapatinib- ditosilat /Tykerb®.

[0066] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pronalaska ili njegov fragment i inhibitor HER3 uključujući, ali bez ograničenja na, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech); male molekule koji inhibiraju HER3.

[0067] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pronalaska ili njegov fragment i inhibitor HER4.

[0068] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pronalaska ili njegov fragment i inhibitor PI3 kinaze uključujući, ali bez ograničenja na, GDC 0941 BEZ235, BMK120 i BYL719.

[0069] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pronalaska ili njegov fragment i inhibitor mTOR uključujući, ali bez ograničenja na, Temsirolimus/ Torisel®, ridaforolimus/ Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus/ Affinitor®. U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva u dobijanju leka za lečenje kancera posredovano HER3 ligand-zavisnom signalnom transdukcijom ili ligand-nezavisnom signalnom transdukcijom izabran iz grupe koju čine kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer pluća, multipli mijelom, kancer ovarijuma, kancer jetre, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer prostate, akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, osteosarkoma, karcinom skvamoznih ćelija, tumori perifernih neravnih ovojnica , švanom, kancer glave i vrata, kancer bešike, ezofagealni kancer, glioblastom, sarkom mekog tkiva jasnih ćelija, maligni mezoteliom, neurofibromatoza, kancer bubrega i melanom.

[0070] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 15 i VL sekvence SEQ ID NO: 14, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0071] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 33 i VL sekvence SEQ ID NO: 32, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0072] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 51 i VL sekvence SEQ ID NO: 50, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0073] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 69 i VL sekvence SEQ ID NO: 68, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0074] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 87 i VL sekvence SEQ ID NO: 86, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0075] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 105 i VL sekvence SEQ ID NO: 104, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0076] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 123 i VL sekvence SEQ ID NO: 122, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0077] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 141 i VL sekvence SEQ ID NO: 140, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0078] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 151 i VL sekvence SEQ ID NO: 158, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0079] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 177 i VL sekvence SEQ ID NO: 176, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0080] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 195 i VL sekvence SEQ ID NO: 194, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0081] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 213 i VL sekvence SEQ ID NO: 212, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0082] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 231 i VL sekvence SEQ ID NO: 230, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0083] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 249 i VL sekvence SEQ ID NO: 248, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0084] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 267 i VL sekvence SEQ ID NO: 266, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0085] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 285 i VL sekvence SEQ ID NO: 284, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0086] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 303 i VL sekvence SEQ ID NO: 302, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0087] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 321 i VL sekvence SEQ ID NO: 320, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0088] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 339 i VL sekvence SEQ ID NO: 338, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0089] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 357 i VL sekvence SEQ ID NO: 356, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala.

[0090] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 375 i VL sekvence SEQ ID NO: 374, za upotrebu u lečenju kancera posredovanog HER3 ligand-zavisnim prenosom signala ili ligand-nezavisnim prenosom signala. U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 15 i VL sekvence SEQ ID NO: 14 za upotrebu kao lek.

[0091] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 33 i VL sekvence SEQ ID NO: 32 za upotrebu kao lek.

[0092] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 51 i VL sekvence SEQ ID NO: 50 za upotrebu kao lek.

[0093] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 69 i VL sekvence SEQ ID NO: 68 za upotrebu kao lek.

[0094] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 87 i VL sekvence SEQ ID NO: 86 za upotrebu kao lek.

[0095] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 105 i VL sekvence SEQ ID NO: 104 za upotrebu kao lek.

[0096] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 123 i VL sekvence SEQ ID NO: 122 za upotrebu kao lek.

[0097] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 141 i VL sekvence SEQ ID NO: 140 za upotrebu kao lek.

[0098] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 159 i VL sekvence SEQ ID NO: 158 za upotrebu kao lek.

[0099] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 177 i VL sekvence SEQ ID NO: 176 za upotrebu kao lek.

[0100] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 195 i VL sekvence SEQ ID NO: 194 za upotrebu kao lek.

[0101] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 213 i VL sekvence SEQ ID NO: 212 za upotrebu kao lek.

[0102] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 231 i VL sekvence SEQ ID NO: 230 za upotrebu kao lek.

[0103] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 249 i VL sekvence SEQ ID NO: 248 za upotrebu kao lek.

[0104] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 267 i VL sekvence SEQ ID NO: 266 za upotrebu kao lek.

[0105] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 285 i VL sekvence SEQ ID NO: 284 za upotrebu kao lek.

[0106] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 303 i VL sekvence SEQ ID NO: 302 za upotrebu kao lek.

[0107] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 321 i VL sekvence SEQ ID NO: 320 za upotrebu kao lek.

[0108] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 339 i VL sekvence SEQ ID NO: 338 za upotrebu kao lek.

[0109] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 357 i VL sekvence SEQ ID NO: 356 za upotrebu kao lek.

[0110] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je antitelo koje ima VH sekvence SEQ ID NO: 375 i VL sekvence SEQ ID NO: 374 za upotrebu kao lek.

Kratak opis slika

[0111]

Slika 1: Reprezentativne MOR10701 SET krive dobijene korišćenjem humanog, mišjeg, pacovskog i HER3 majmuna cynomologus.

Slika 2: Određivanje vezivanja SK-Br-3 ćelija primenom FACS titracije

Slika 3: ELISA test za vezivanje HER3 domena

Slika 4: Mapiranje epitopa vodonik/deuterijum razmenom. A) HER3 ECD peptidi ponovo dobijeni nakon HDX-MS analize su naznačeni isprekidanim linijama. Potencijalna N-vezana mesta glikozilacije su istaknuta. B) Relativni stepen deuterizacije primećene u peptidima identifikovane primenom MS. C) Zaštićene rezidue mapirane na objavljenoj kristalnoj strukturi HER3.

Slika 5: A) Prikaz površine HER3/MOR09823 i HER3/ MOR09825 kristalne strukture dobijene x-zracima. HER3 (svetlije sivo) je u zatvorenoj konformaciji, i MOR09823 ili MOR09825 (tamnije sivo) vezan za oba domena 2 i 4. B). Površinski izgled HER3 iz HER3/MOR09823 strukture prikazan u sličnoj orjentaciji kao (A). MOR09823 je izostavljen zbog jasnoće. C) HER3/MOR09823 struktura ilustrovana kao ribon struktura, viđena pod 90° rotacije od panela (A), (B) i (D). D) Ribon prikaz neaktivne HER3 konformacije prepoznate od strane MOR09823 Fab sa pogledom iz bliza na domen 2/domen 4 tačku dodira, uz obeležavanje HER3 rezidua koje su unutar 5Å od Fab. E) Vezivanje mutiranog HER3/ MOR10703 je određeno primenom ELISA titracije.

Slika 6: Inhibicija ligandom indukovane (A) ili ligand-nezavisne (B) HER3 fosforilacije.

Slika 7: Inhibicija nishodnih signalnih puteva zavisnih od HER3 u ćelijskim linijama sa umnoženim HER2.

Slika 8: Uticaj inhibicije HER3 na ćelijski rast u A) BT-474 i B) neuregulinom stimulisanim MCF7 ćelijama.

Slika 9: Uticaj MOR09823 i MOR09825 na vezivanje neuregulina za MCF7 ćelije.

Slika 10: Uticaj vezivanja MOR09823 na stvaranje kompleksa HER3/ neuregulin kao što je pokazano u testu BiacoreTM . Odsustvo antitela (crni stubići), MOR09823 (beli stubići), 105.5 (sivi) i kontrolni IgG (isprekidani stubići).

Slika 11: Inhibicija posredovana sa MOR09823 (A) ligand -nezavisnog (BT-474) i (B) ligandzavisnog (BxPC3) HER3 prenosa signala in vivo.

Slika 12: Uticaj MOR10701 i MOR10703 na rast tumora BT-474.

Slika 13: Uticaj MOR10701 i MOR10703 na rast tumora BxPC3.

Slika 14: MOR10703 in vitro izobolograma (analiza doza/odgovor površine) kombinacije lekova (A) MOR09823/ trastuzumab, (B) MOR09823/ lapatinib, (C) MOR10703/ BEZ235, (D) MOR10703/ BKM120, (E) MOR10703/ BYL719, (F) MOR10703/ RAD001, (G) MOR10703/ cetuksimab i (H) MOR10703/ erlotinib.

Slika 15: MOR10701 ili MOR10703 in vivo kombinacije sa (A) trastuzumabom i (B) erlotinibom u BT-474 i L3.3.

Detaljan opis pronalaska

[0112] Pronalazak je u najširem smislu definisan u nezavisnim patentnim zahtevima.

Definicije

[0113] U cilju boljeg razumevanja prikazanog pronalaska, pojedini izrazi će najpre biti definisani. Dodatne definicije su prikazane dalje u tekstu kroz detaljni opis pronalaska.

[0114] Izraz “signalna transdukcija (prenos signala)” ili “signalna aktivnost” kako se ovde koristi, odnosi se na biohemijski uzrokovanu povezanost pokrenutu uglavnom protein-protein interakcijom kao što je vezivanje faktora rasta za receptor, što za posledicu ima prenos signala iz jednog u drugi deo ćelije. U slučaju HER3, prenos signala uključuje specifičnu fosforilaciju jedne ili više tirozinskih, serinskih, ili treoninskih rezidua na jednom ili više proteina u nizu reakcija što vodi prenosu signala. Predposlednji u nizu procesa obično uključuje događaje u jedru, što vodi promeni u ekspresiji gena.

[0115] “HER receptor” je receptorska protein tirozin kinaza koja pripada HER familiji receptora i uključuje EGFR, HER2, HER3 i HER4 receptore i drugi ostali članovi ove familije tek treba da se identifikuju u budućnosti. HER receptor najčešće sadrži vanćelijski domen, koji može da veže HER ligand; lipofilni transmembranski domen; očuvani intracelularni tirozin kinazni domen; i karboksil-terminalni signalni domen koji sadrži nekoliko tirozinskih ostataka koji mogu da se fosforilišu. Poželjno, HER receptor predstavlja prirodnu sekvencu humanog HER receptora.

[0116] Izrazi “HER1,” “ErbB1,” “receptor faktora rasta epiderma” i “EGFR” se ovde koriste naiznenično i odnose na EGFR kao što je prikazano, na primer, kod Carpenter i sar. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), uključujući njihove mutantne forme koje se javljaju u prirodi (npr. delecioni mutant EGFR kao kod Humphrey i sar., (1990) PNAS (USA) 87:4207-4211). Izraz erbB1 se odnosi na gen koji kodira EGFR proteinski proizvod.

[0117] Izrazi “HER2” i “ErbB2” se ovde koriste naiznenično i odnose na humani HER2 protein opisan, na primer, kod Semba i sar., (1985) PNAS (USA) 82:6497-6501 i Yamamoto i sar. (1986) Nature 319:230-234 (Genebank pristupni broj X03363). Izraz “erbB2” se odnosi na gen koji kodira humani ErbB2 i “neu”se odnosi na gen koji kodira p185<neu>pacova.

[0118] Izrazi “HER4” i “ErbB4” se u ovom tekstu odnose na polipeptidni receptor kao što je opisano, na primer, u EP Pat Appln No 599,274; Plowman i sar., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750; i Plowman i sar., (1993) Nature, 366:473-475, uključujući njihove izoforme, npr, kao što je opisano u WO99/19488, objavljenoj 22. aprila 1999.

[0119] Izraz “HER3” ili “HER3 receptor” takođe poznat kao “ErbB3” kako se ovde koristi, odnosi se na sisarski protein HER3 i “her3” ili "erbB3" se odnosi na sisarski her3 gen. Poželjni HER3 protein je humani HER3 protein prisutan u ćelijskoj membrani. Humani her3 gen je opisan u U.S. Pat. No.5,480,968 i Plowman i sar., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909.

[0120] Humani HER3 kako je definisano u Accession No. NP_001973 (humani), i prikazano dalje u tekstu kao sekvenca SEQ ID NO: 1. Sva nomenklatura se odnosi na punu dužinu, nezrelog HER3 (aminokiseline 1-1342). Nezreli HER3 se iseca između položaja 19 i 20, što vodi nastanku zrelog HER3 proteina (aminokiseline 20-1342).

mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm

gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm

lnyntnssha lrqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeivvkdng

rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqcnghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd

tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts

cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn

ldflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg

rslynrgfsl limknlnvts lgfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee

rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc rnysrggvcv thcnflngep

refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi

ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg

gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf

gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg

sslqlvtqyl plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhrnlaarnv

llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt

vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke

laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld ldldleaeed

nlatttlgsa lslpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr

pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll

tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededeeyeym

nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd lsaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy

eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd

safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO: 1)

[0121] Izraz “HER ligand” kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji se vezuju i aktiviraju HER receptore kao što su HER1, HER2, HER3 i HER4. Primeri HER liganda uključuju, ali nisu ograničeni na neuregulin 1 (NRG), neuregulin 2, neuregulin 3, neuregulin 4, betacelulin, heparin-vezujući factor rasta epiderma, epiregulin, faktor rasta epiderma, amfiregulin i transformišući faktor rasta alfa. Izraz uključuje biološki aktivne fragmente i/ili varijante prirodno postojećih polipeptida.

[0122] Izraz “HER3 ligand” kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji se vezuju i aktiviraju HER3. Primeri HER3 liganda uključuju, ali nisu ograničeni na, neuregulin 1 (NRG) i neuregulin 2, betacelulin, heparin-vezujući faktor rasta epiderma i epiregulin. Izraz uključuje biološki aktivne fragmente i/ili varijante prirodno postojećih polipeptida.

[0123] “proteinski kompleks HER-HER” je nekovalentno vezani oligomer koji sadrži HER ko-receptore u bilo kojoj kombinaciji (npr, HER1-HER2, HER1-HER3, HER1-HER4, HER2-HER3, HER3- HER4, i slično). Ovaj kompleks može da nastane kada ćelija koja eksprimira oba receptora bude izložena HER ligandu npr, NRG, ili kada je HER receptor aktivan ili prekomerno eksprimiran.

[0124] “proteinski kompleks HER2-HER3” je nekovalentno vezani oligomer koji se sastoji od HER2 receptora i HER3 receptora. Ovaj kompleks može da nastane kada ćelija koja eksprimira oba receptora bude izložena HER3 ligandu npr, NRG ili kada je HER2 aktivan/prekomerno eksprimiran.

[0125] Izraz “aktivnost HER3” ili “aktivacija HER3” kako se ovde koristi, odnosi se na porast oligomerizacije (npr. porast broja kompleksa koji sadrže HER3), fosforilaciju HER3, preuređenja konformacije (na primer ona indukovana ligandima) i nishodni prenos signala posredovan od strane HER3.

[0126] Izraz “stabilizacija” ili “stabilizovani” kada se koristi u kontekstu HER3, odnosi se na antitelo ili njegov fragment koji direktno održava (zaključava, zatvara, drži, prvenstveno vezuje, favorizuje) neaktivno stanje ili konformaciju HER3 bez sprečavanja vezivanja liganda za HER3, tako da ovo vezivanje liganda nije više u mogućnosti da aktivira HER3. Testovi opisani u odeljku Primeri se mogu koristiti za merenje vezivanja liganda za stabilizovani HER3 receptor, npr, “Biacore” test.

[0127] Izraz “ligand-zavisni prenos signala” kako se ovde koristi, odnosi se na aktivaciju HER (npr, HER3) putem liganda. Aktivaciju HER3 dokazuje povećana oligomerizacija (npr. heterodimerizacija) i/ ili HER3 fosforilacija tako da se takvi nishodni signalni putevi (npr. PI3K) aktiviraju. Antitelo ili njegov fragment može statistički značajno da smanji količinu fosforilisanog HER3 u stimulisanoj ćeliji izloženoj antigen-vezujućem proteinu (npr, antitelu) u odnosu na netretiranu (kontrolnu) ćeliju, mereno primenom testova opisanih u odeljku Primeri. Ćelija koja eksprimira HER3 može da bude prirodna ćelijska linija (npr. MCF7) ili može biti rekombinantno dobijena uvođenjem nukleinskih kiselina koje kodiraju HER3 protein u ćeliju-domaćina. Stimulacija ćelije može da se dogodi putem egzogenog dodavanja aktivatorskog HER3 liganda ili endogenom ekspresijom aktivatorskog liganda.

[0128] Antitelo ili njegov fragment koji “smanjuje aktivaciju HER3 indukovanu neuregulinom u ćeliji” je ono koje statistički značajno smanjuje fosforilaciju HER3 tirozina u odnosu na netretiranu (kontrolnu) ćeliju, mereno primenom testova opisanih u odeljku Primeri. Ovo se može odrediti na osnovu nivoa fosfotirozina u HER3 nakon izlaganja HER3 delovanju NRG i antitela od interesa. Ćelija koja eksprimira HER3 protein može biti ćelija ili ćelijska linija (npr. MCF7) koja postoji u prirodi ili može biti dobijena rekombinacijom.

[0129] Izraz “ligand-nezavisni prenos signala” kako se ovde koristi, odnosi se na ćelijsku aktivnost HER3 (e.g fosforilaciju) u odsustvu potrebe za vezivanjem liganda. Na primer, ligand-nezavisna aktivacija HER3 može da bude posledica prekomerne ekspresije HER2 ili aktivirajućih mutacija u HER3 heterodimernim partnerima kao što su EGFR i HER2. Antitelo ili njegov fragment mogu statistički značajno da smanje količinu fosforilisanog HER3 u ćeliji izloženoj antigen-vezujućem proteinu (npr, antitelu) u odnosu na netretiranu (kontrolnu) ćeliju. Ćelija koja eksprimira HER3 može da bude prirodna ćelijska linija (npr. SK-Br-3) ili dobijena primenom rekombinantne tehnike uvođenjem nukleinskih kiselina koje kodiraju HER3 protein u ćeliju domaćina.

[0130] Izraz “sprečava” kako se ovde koristi, odnosi se na zaustavljanje ili sprečavanje interakcije ili procesa, npr, zaustavljanje ligand-zavisnog ili ligand-nezavisnog prenosa signala.

[0131] Izraz “prepoznaje” kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo ili njegov fragment koje pronalazi i interaguje (npr, vezuje se) sa njegovim konformacionim epitopom.

[0132] Izraz “istovremeno se vezuje”, kako se ovde koristi, odnosi se na HER ligand koji može da se veže za ligand vezujuće mesto na HER receptoru uporedo sa antitelom na HER. To znači da i ligand i antitelo mogu da se vežu za HER receptor zajedno. Samo u svrhu ilustracije, HER3 ligand NRG, može da se veže za HER3 receptor uporedo sa HER3 antitelom. Testovi kojim se meri istovremeno vezivanje liganda i antitela su opisani u odeljku Primeri (npr, “Biacore”).

[0133] Izraz “izostaje” kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo ili njegov fragment koje ne dovodi do određenog događaja. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji “ne uspeva da aktivira prenos signala” je ono koje ne aktivira prenos signala; antitelo ili njegov fragment koji “ne uspeva da indukuje konformacionu promenu” je ono kojo ne izaziva strukturne promene u HER receptoru; antitelo ili njegov fragment koje stabilizuje HER receptor u neaktivnom stanju tako da HER receptor “ne uspeva da dimerizuje” je ono kojo ne obrazuje komplekse protein-protein.

[0134] Izraz “antitelo” kako se ovde koristi, odnosi se na cela antitela koja interaguju sa (npr, putem vezivanja, sternim ometanjem, stabilizovanjem/destabilizovanjem, prostornom distribucijom) HER3 epitopom i inhibiraju prenos signala. Prirodno "antitelo" je glikoprotein koji obuhvata najmanje dva teška (engl. heavy -H) lanca i dva laka (engl. light -L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde se koristi skraćenica VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde se koristi skraćenica VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VLregioni se dalje mogu podeliti na hipervarijabilne regione, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (engl. complementarity determining regions - CDR), sa umetnutim regionima koji su više očuvani, nazvanim okvirne sekvence (engl. “framework regions” - FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a poređanih od amino-terminalnog dela do karboksi-terminalnog dela sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni of the teški i laki lanci sadrže vezivni domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr, efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. Izraz “antitelo” uključuje na primer, monoklonska antitela, humana antitela, humanizovana antitela, “kamilja” antitela, himerna antitela, jednolančani Fvs (scFv), disulfidnom vezom povezani Fvs (sdFv), Fab fragmente, F (ab') fragmente i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr, anti-Id antitela na antitela iz pronalaska) i epitop-vezujuće fragmente bilo čega pomenutog u prethodnom tekstu. Antitela mogu biti bilo kog izotipa (npr, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.

[0135] I laki i teški lanci su podeljeni u regione strukturne i funkcionalne homologije. Izrazi “konstantni” i “varijabilni” se koriste funkcionalno. U tom smislu, biće razumljivo da varijabilni domeni i lakog (VL) i teškog (VH) lanca određuju prepoznavanje antigena i antigenu specifičnost. Nasuprot tome, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) doprinose važnim biološkim svojstvima kao što je sekrecija, transplacentalna pokretljivost, vezivanje za Fc receptor, vezivanje komplementa i slično. Prema dogovoru, numeracija domena konstantnog regiona raste kako se oni udaljavaju od antigen-vezujućeg mesta ili amino-terminalnog dela antitela. Na N-terminalnom delu je varijabilni region, a na C-terminalnom delu je konstantni region; CH3 i CL domeni zapravo sadrže karboksi-terminalni deo teškog i lakog lanca, navedenim redom.

[0136] Izraz “fragment antitela”, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više delova antitela koji zadržava sposobnost da specifično interaguje (npr, vezivanjem, sternim ometanjem, stabilizovanjem/destabilizovanjem, prostornom distribucijom) sa HER3 epitopom i inhibira prenos signala. Primeri vezujućih fragmenata uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2fragment, bivalentni fragment koji obuhvata dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela; dAb fragment (Ward i sar., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; izolovani region koji određuje komplementarnost (engl. “complementarity determining region” - CDR).

[0137] Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu da budu spojeni, primenom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetisanog linkera koji omogućava da budu napravljeni kao jedinstveni proteinski lanac u kome VL i VH regioni čine par tako da obrazuju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr, Bird i sar., (1988) Science 242:423-426; i Huston i sar., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.

85:5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena izrazom “fragment antitela”. Ovi fragmenti antitela se dobijaju primenom uobičajenih postupaka poznatih onima koji su upoznati sa stanjem tehnike, i fragmenti se ispituju za upotrebu na isti način kao intaktna antitela.

[0138] Fragmenti antitela mogu takođe da budu ugrađeni u antitela koja se sastoje od pojedinačnog domena, maksi-antitela (engl. maxibodies), mini-antitela (engl. minibodies), intra-antitela (engl. intrabodies), di-antitela (engl. diabodies), tri-antitela (engl. triabodies), tetra-antitela (engl. tetrabodies), v-NAR i bis-scFv (videti, npr, Hollinger i Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136). Fragmenti antitela mogu da budu presađeni na molekulske nosače zasnovane na polipeptidima kao što je fibronektin tip III (Fn3) (videti U.S. Pat. No.6,703,199, gde su opisana fibronektin polipeptidna mono-antitela).

[0139] Fragmenti antitela mogu da budu ugrađeni u jednolančane molekule koji obuhvataju par tandemskih Fv segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim lakim polipeptidnim lancem, obrazuje par antigen vezujućih regiona (Zapata i sar., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; i U.S. Pat. No.5,641,870).

[0140] Izraz “epitop” uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili drugačiju interakciju sa molekulom. Determinante epitopa uglavnom se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili ugljeni hidrati ili bočni lanci šećera i mogu imati posebne trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može da bude “linearni” ili “konformacioni.”

[0141] Izraz “linearni epitop” odnosi se na epitop kod koga se sve tačke interakcije između proteina i molekula sa kojim interaguje (kao što je antitelo) događaju linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina (kontinuirano). Jednom kada je željeni epitop na antigenu određen, moguće je stvoriti antitela na taj epitop, npr, primenom postupaka opisanih u predmetnom pronalasku. Na drugi način, tokom procesa istraživanja, stvaranje i karakterizacija antitela mogu razjasniti podatke o željenim epitopima. Na osnovu ovog podatka, moguće je zatim sprovesti kompetetivno ispitivanje antitela za vezivanje za isti epitop. Jedan od pristupa da se ovo postigne su studije unakrsne kompeticije kako bi se pronašla antitela koja se kompetitivno vezuju jedno za drugo, npr, antitela su u kompeticiji za vezivanje za antigen. Efikasan proces za izdvajanje antitela zasnovan na njihovoj unakrsnoj kompeticiji je opisan u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2003/48731. Kao što je jasno stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, praktično bilo šta, za šta antitelo može specifično da se veže, može da bude epitop. Epitop može da sadrži rezidue za koje se antitelo vezuje.

[0142] Izraz “konformacioni epitop” odnosi se na epitop u kome diskontinuirane aminokiseline dolaze u dodir u trodimenzionalnoj konformaciji. Kod konformacionog epitopa, tačke interakcije se dešavaju sa aminokiselinskim reziduema proteina koje su međusobno razdvojene. U jednom primeru izvođenja, epitop označava epitop opisan u odeljku Primeri ove specifikacije. U jednom primeru izvođenja, konformacioni epitop je definisan pomoću (i) HER3 aminokiselinskih ostataka 265-277 i 315 (domena 2) i (ii) HER3 aminokiselinskih ostataka 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) sekvence SEQ ID NO: 1, ili njihov podset. Kao što je jasno stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, prostor koji zauzima specifična rezidua ili bočni lanac koji stvara oblik molekula omogućava da se odredi koji epitop je u pitanju.

[0143] Uopšteno govoreći, antitela specifična za određeni ciljni antigen će prvenstveno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.

[0144] Regioni datog polipeptida koji uključuju epitop se mogu odrediti korišćenjem bilo kog broja tehnika za mapiranje epitopa, dobro poznatih u stanju tehnike. Videti, npr, Epitope Mapping Protocols u Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na primer, linearni epitopi mogu se odrediti npr, putem istovremene sinteze velikog broja peptida na čvrstim nosačima, peptida koji odgovaraju delovima proteinskih molekula, i reakcijom peptida sa antitelima dok su peptidi još uvek pričvršćeni na nosače. Takvi postupci su poznati u stanju tehnike i opisani u, npr, U.S. Patent No. 4,708,871; Geysen i sar., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen i sar., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen i sar., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Slično, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina primenom, npr, razmene vodonik/deuterijum, kristalografije x-zraka i dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom. Videti, npr, u prethodnom tekstu naveden Epitope Mapping Protocols. Antigeni regioni proteina mogu takođe da budu identifikovani primenom standardnih dijagrama antigenosti i hidropatije, kao što su oni izračunati korišćenjem, npr, Omiga verzija 1.0 softverskog programa dostupnog kod “Oxford Molecular Group”. Ovaj kompjuterski program koristi “Hopp/Woods” metod, Hopp i sar., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; za određivanje profila antigenosti, i “Kyte-Doolittle” tehnike, Kyte i sar., (1982) J.MoI. Biol.157:105-132; za dijagrame hidropatije.

[0145] Izraz “paratop” kako se ovde koristi, odnosi se na opštu strukturu vezujućeg regiona koja određuje vezivanje za epitop. Ova struktura utiče na to da li, ili ne, i na koji način vezujući region može da se veže za epitop. Paratop može da se odnosi na antigeno mesto antitela koje je odgovorno za vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za antigenu determinantu. Paratop se takođe odnosi na idiotop antitela, i region koji određuje komplementarnost (CDR) - region koji se vezuje za epitop. U jednom primeru izvođenja, paratop je region antitela koji se vezuje za konformacioni epitop koji obuhvata (i) HER3 aminokiselinske rezidue 265-277 i 315 (domena 2), i (ii) HER3 aminokiselinske rezidue 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) sekvence SEQ ID NO: 1, ili njihov podset. U jednom primeru izvođenja, paratop je region antitela koji sadrži CDR sekvence. U jednom primeru izvođenja, paratop sadrži sekvence navedene u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, paratop sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak koji se vezuje za HER3 rezidue: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. U jednom primeru izvođenja, paratop sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak koji se vezuje za HER3 rezidue: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Kao što je poznato stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, paratop bilo kog antitela, ili njegova varijanta, može da se odredi na način opisan u predmetnoj patentnoj prijavi.

[0146] Izrazi “monoklonsko antitelo” ili “kompozicija monoklonskih antitela” kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide, uključujući antitela, fragmente antitela, bispecifična antitela, itd. koja imaju suštinski istu aminokiselinsku sekvencu ili su dobijena iz istog genetskog izvora. Ovaj pojam takođe uključuje dobijanje molekula antitela jedinstvenog molekularnog sastava. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava jedinstvenu specifičnost vezivanja i afiniteta prema određenom epitopu.

[0147] Izraz “humano antitelo”, kako se ovde koristi, uključuje antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i okvirne sekvence i CDR regioni dobijeni od sekvenci humanog porekla. Osim toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe dobijen iz takvih humanih sekvenci, npr, sekvence humane germinativne linije, ili mutirane verzije sekvence humane germinativne linije ili antitelo sadrži konsenzus okvirne sekvence izvedene iz analize humanih okvirnih sekvenci, na primer, kao što je opisano kod Knappik i sar., (2000) J Mol Biol 296:57-86). Struktura i položaj imunoglobulinskih varijabilnih domena, npr, CDR-ova, mogu da se definišu pomoću dobro poznatih shema numeracije, npr, Kabat shema numeracije, Chothia shema numeracije, ili kombinacija Kabat i Chothia shema numeracije (videti, npr, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health i Human Services (1991), eds. Kabat i sar.; Lazikani i sar., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat i sar., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje, NIH Publication no.

91-3242 U.S. Department of Health i Human Services; Chothia i sar., (1987) J. Mol. Biol.

196:901-917; Chothia i sar., (1989) Nature 342:877-883; i Al-Lazikani i sar., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948.

[0148] Humana antitela predmetnog pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske rezidue koje nisu kodirane humanom sekvencom (npr, mutacije uvedene slučajnom ili dirigovanom mutagenezom in vitro ili somatskim mutacijama in vivo, ili konzervativnom supstitucijom u cilju pospešivanja stabilnosti ili proizvodnje antitela).

[0149] Izraz “humano monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitela koja ispoljavaju jedinstvenu specifičnost vezivanja i imaju varijabilne regione u kojima su i okvirne sekvence i CDR regioni poreklom od humanih sekvenci. U jednom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela potiču iz hibridoma koji uključuje B ćeliju, dobijenu iz transgene životinje (koja nije čovek), npr, transgenog miša, čiji genom sadrži transgeni humani teški lanac i transgeni laki lanac, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0150] Izraz “rekombinantno humano antitelo”, kako se ovde koristi, uključuje sva humana antitela koja su dobijena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na rekombinantne načine, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr, miša) koja je transgena ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene ili hibridoma dobijenog iz nje, antitela izolovana iz ćelijedomaćina transformisane tako da eksprimira humano antitelo, npr, iz transfektoma, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, i antitela dobijena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsing (engl. splicing) celog ili jednog dela sekvenci humanog imunoglobulinskog gena, sa drugim DNK sekvencama. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su okvirne sekvence i CDR regioni dobijeni iz imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije. U pojedinim primerima izvođenja, međutim, takva rekombinantna humana antitela mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) i stoga aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene iz, i povezane sa VHi VLsekvencama humane germinativne linije, ne moraju prirodno da postoje u repertoaru humanih antitela germinativne linije in vivo.

[0151] Specifično vezivanje dva entiteta označava vezivanje pri kome je konstanta ravnoteže (KA) (kon/koff) najmanje 102M-1 , najmanje 5x102M-1 , najmanje 103M-1 , najmanje 5x103M-1 , najmanje 104M- 1najmanje 5x104M-1 , najmanje 105M-1 , najmanje 5x105M-1 , najmanje 106M-1 , najmanje 5x106M-1 , najmanje 107M-1 , najmanje 5x107M-1 , najmanje 108M-1 , najmanje 5x108M-1 , najmanje 109M-1 , najmanje 5x109M-1 , najmanje 1010M-1 , najmanje 5x1010M-1 , najmanje 1011M-1 , najmanje 5x1011M-1 , najmanje 1012M-1 , najmanje 5x1012M-1 , najmanje 1013M-1 , najmanje 5x1013 M-1 , najmanje 1014M-1 , najmanje 5x1014M-1 , najmanje 1015M-1 , ili najmanje 5x1015M-1.

[0152] Izraz “specifično (ili selektivno) vezuje” za antitelo (npr, antitelo koje se vezuje za HER3) odnosi se na reakciju vezivanja koja potvrđuje prisustvo srodnog antigena (npr, humani HER3) u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških molekula. Osim ranije u tekstu pomenute konstante ravnoteže (KA), HER3 vezujuće antitelo predmetnog pronalaska uobičajeno ima i konstantu disocijacije (KD) (koff/kon) koja iznosi manje od 5x10-2M, manje od 10-2M, manje od 5x10-3M, manje od 10-3M, manje od 5x10-4M, manje od 10-4M, manje od 5x10-5M, manje od 10-5M, manje od 5x10-6M, manje od 10-6M, manje od 5x10-7M, manje od 10-7M, manje od 5x10-8M, manje od 10-8M, manje od 5x10-9M, manje od 10-9M, manje od 5x10-10M, manje od 10-10M, manje od 5x10-11M, manje od 10-11M, manje od 5x10-12M, manje od 10-12M, manje od 5x10-13M, manje od 10-13M, manje od 5x10-14M, manje od 10-14M, manje od 5x10-15M, ili manje od 10-15M ili nižu, i vezuje se za HER3 sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta vezivanja za nespecifični antigen (npr, HSA).

[0153] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment ima konstantu disocijacije (Kd) koja iznosi manje od 3000 pM, manje od 2500 pM, manje od 2000 pM, manje od 1500 pM, manje od 1000 pM, manje od 750 pM, manje od 500 pM, manje od 250 pM, manje od 200 pM, manje od 150 pM, manje od 100 pM, manje od 75 pM, manje od 10 pM, manje od 1 pM kako je utvrđeno primenom ovde opisanog postupka ili poznato onima koji su upoznati sa stanjem tehnike (npr, “BIAcore” test, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). Izraz “Kasoc” ili “Ka”, kako se ovde koristi, odnosi se na brzinu asocijacije određene antitelo-antigen interakcije, dok se izraz “Kdis” ili “Kd,” kako se ovde koristi, odnosi na brzinu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Izraz “KD”, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije, koja je dobijena iz odnosa Kdsa Ka(tj. Kd/Ka) i izražena kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela se mogu odrediti primenom postupaka dobro poznatih u stanju tehnike. Postupak za određivanje KDantitela se zasniva na primeni rezonancije površinskog plazmona (engl. surface plasmon resonance), ili biosenzorskog sistema kao što je Biacore<®>sistem.

[0154] Izraz “afinitet” kako se ovde koristi, odnosi se na jačinu interakcije između antitela i antigena na pojedinačnim antigenim mestima. Unutar svakog antigenog mesta, varijabilni region “kraka” (engl. arm) antitela interaguje putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što je više interakcija, jači je afinitet.

[0155] Izraz “aviditet” kako se ovde koristi, odnosi se na informativnu meru ukupne stabilnosti ili jačine kompleksa antitelo-antigen. Ona se nalazi pod kontrolom tri glavna faktora: afiniteta antitelo - epitop; valence antigena i antitela; i prostornog rasporeda delova koji interaguju. Konačno ovi faktori određuju specifičnost antitela, koja predstavlja verovatnoću da se neko antitelo veže za određeni epitop antigena.

[0156] Izraz “valenca” kako se ovde koristi, odnosi se na broj mogućih ciljanih mesta vezivanja u polipeptidu. Svako ciljano mesto vezivanja specifično vezuje jedan ciljani molekul ili specifično mesto (tj, epitop) na ciljanom molekulu. Kada polipeptid sadrži više od jednog ciljanog mesta vezivanja, svako ciljano mesto vezivanja može specifično da veže iste ili različite molekule (npr, može da se veže za različite molekule, npr, različite antigene, ili različite epitope na istom molekulu).

[0157] Izraz “antagonističko antitelo” kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje se vezuje za HER3 i neutralizuje biološku aktivnost HER3 prenosa signala, npr, smanjuje, snižava i/ili inhibira signalnu aktivnost indukovanu od strane HER3, npr, u fosfo-HER3 ili fosfo-Akt testu. Primeri testova su detaljnije opisani u primerima u nastavku teksta. U skladu sa tim, antitelo koje “inhibira” jedno ili više od ovih funkcionalnih svojstava HER3 (npr, biohemijske, imunohemijske, ćelijske, fiziološke ili druge biološke aktivnosti, ili slično) kako je određeno prema metodologiji poznatoj u stanju tehnike i opisano ovde u tekstu, treba razumeti da se odnosi na statistički značajno smanjenje nivoa određene aktivnosti u odnosu na onu primećenu u odsustvu antitela (npr, ili kada je kontrolno antitelo sa irelevantnom specifičnošću prisutno). Antitelo koje inhibira aktivnost HER3 postiže takvo statistički značajno smanjenje nivoa od najmanje 10% vrednosti merenog parametera, od najmanje 50%, 80% ili 90%, i u određenim primerima izvođenja antitelo predmetnog pronalaska može da inhibira više od 95%, 98% ili 99% funkcionalne aktivnosti HER3 kao što se vidi na osnovu smanjenja nivoa ćelijske fosforilacije HER3.

[0158] Izraz “izolovano antitelo” odnosi se na antitelo koje je bitno ili suštinski slobodno od drugih antitela koja imaju drugačiju antigenu specifičnost (npr, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za HER3 je suštinski bez antitela koja se specifično vezuju za antigene koji nisu HER3). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za HER3 može, u svakom slučaju, da ispoljava ukrštenu reaktivnost prema drugim antigenima. Osim toga, izolovano antitelo može da bude suštinski slobodno od drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0159] Izraz “konzervativno modifikovana varijanta” se primenjuje na aminokiselinske sekvence i sekvence nukleinske kiseline. Kada su u pitanju određene sekvence nukleinske kiseline, izraz konzervativno modifikovane varijante se odnosi na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili u slučaju da nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, na suštinski identične sekvence. Zbog izrođenosti (degenerativnosti) genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU kodiraju aminokiselinu alanin. Stoga, na svakoj poziciji gde je alanin određen kodonom, kodon može da bude zamenjen bilo kojim od odgovarajućih opisanih kodona bez izmene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinske kiseline su “tihe varijacije” koje predstavljaju jednu vrstu konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka ovde opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak iz oblasti će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može da se izmeni tako da se dobije funkcionalno identični molekul. Prema tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid se podrazumeva u svakoj opisanoj sekvenci.

[0160] Za polipeptidnu sekvencu, “konzervativno modifikovane varijante” uključuju pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije u polipeptidnoj sekvenci koje dovode do supstitucije aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje prikazuju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u stanju tehnike. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak i ne isključuju polimorfne varijante, homologe kod različitih vrsta i alele ovog pronalaska. Sledećih osam grupa sadrže aminokiseline koje predstavljaju konzervativne supstitucije jedne drugima: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M) (videti, npr, Creighton, Proteins (1984)). U pojedinim primerima izvođenja, izraz "konzervativne modifikacije sekvence" se koristi da označi modifikacije aminokiselina koje ne utiču značajno ili ne menjaju karakteristike vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu.

[0161] Izrazi “ispoljava unakrsnu kompeticiju” i “unakrsna kompetcija” se ovde koriste naizmenično da označe sposobnost antitela ili drugog vezujućeg sredstva da interferira sa vezivanjem drugih antitela ili vezujućih sredstava sa HER3 u standardnom testu kompetitivnog vezivanja.

[0162] Sposobnost ili stepen do koga je antitelo ili drugo vezujuće sredstvo sposobno da interferira sa vezivanjem drugog antitela ili vezujućeg molekula za HER3, i da li se prema tome može označiti kao da ispoljava unakrsnu kompeticiju u skladu sa pronalaskom, može se odrediti primenom standardnog testa kompetitivnog vezivanja. Jedan od odgovarajućih testova uključuje primenu “Biacore” tehnologije (npr. korišćenjem BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Uppsala, Sweden)), koji može da meri stepen interakcija primenom tehnologije rezonancije površinskog plazmona. Još jedan test za merenje unakrsne kompeticije primenjuje pristup zasnovan na ELISA testu.

[0163] Izraz “optimizovan” kako se ovde koristi, odnosi se na nukleotidnu sekvencu izmenjenu tako da kodira aminokiselinsku sekvencu koristeći kodone koji su poželjni pri sintezi u ćeliji ili organizmu, uopšteno eukariotskoj ćeliji, na primer, ćeliji kvasca Pichia, ćeliji gljive Trichoderma, ćeliji ovarijuma Kineskog hrčka (engl. Chinese Hamster Ovary -CHO) ili humanoj ćeliji. Optimizovana nukleotidna sekvenca je konstruisana tako da zadrži u potpunosti. ili što je više moguće, aminokiselinsku sekvencu izvorno kodiranu početnom nukleotidnom sekvencom, koja je takođe poznata kao “parentalna” sekvenca.

[0164] Standardni testovi za ocenu sposobnosti vezivanja antitela za HER3 različitih vrsta su poznati u stanju tehnike, uključujući na primer, ELISA testove, “western blot” testove i RIA testove. Odgovarajući testovi su detaljno opisani u odeljku Primeri. Kinetika vezivanja (npr, afinitet vezivanja) antitela takođe može da se odredi standardnim testovima poznatim u stanju tehnike, kao što je “Biacore” analiza, ili FACS relativni afinitet (Scatchard). Testovi za procenu efekata antitela na funkcionalna svojstva HER3 (npr, test za vezivanje receptora, modulacijom Her signalnog puta) su detaljno opisani u odeljku Primeri.

[0165] Izrazi “procentualno identično” ili “procentualna identičnost,” u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnosi se na dve ili više sekvenci ili subsekvenci koje su iste. Dve sekvence su "suštinski identične" ako te sekvence imaju preciziran procenat aminokiselinskih ostaka ili nukleotida koji su isti (tj., 60% identičnosti, po slobodnom izboru 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identičnosti u okviru određenog regiona, ili, kada nije precizirano, u celoj sekvenci), pri poređenju i poravnanju za najveće podudaranje u prozoru za poređenje, ili označenom regionu, mereno primenom jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvence ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom. Po slobodnom izboru, identičnost postoji duž regiona koji je dugačak najmanje oko 50 nukleotida (ili 10 aminokiselina), ili poželjnije duž regiona koji ima dužinu od 100 do 500 ili 1000 ili više nukleotida (ili 20, 50, 200 ili više aminokiselina).

[0166] Za poređenje sekvence, obično jedna sekvenca ima ulogu referentne sekvence, sa kojom se testirane sekvence porede. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, ispitivana i referentna sekvenca se unose u kompjuter, označavaju se koordinate subsekvence, ako je neophodno, i zadaju parametri programa u algoritmu za poređenje sekvenci. Mogu se koristiti unapred određeni (standardni) parametri programa, ili mogu da se zadaju drugačiji parametri. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava procenat identičnosti sekvenci za ispitivane sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu parametara programa.

[0167] “Prozor za poređenje”, kako se ovde koristi, može da upućuje na segment bilo kog broja susednih pozicija izabranog iz grupe koju čine od 20 do 600, obično oko 50 do oko 200, još češće oko 100 do oko 150 u kojima sekvenca može da se poredi sa referentnom sekvencom istog broja susednih pozicija. nakon što su dve sekvence optimalno poravnate. Postupci za poravnanje sekvenci za poređenje su dobro poznati u stanju tehnike. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može sprovesti, npr, pomoću algoritma za lokalnu homologiju prema Smith i Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pomoću algoritma za poravnanje za utvrđivanje homologije prema Needleman i Wunsch, (1970) J. Mol. Biol.

48:443, pomoću postupka za pretragu sličnosti prema Pearson i Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, kompjuterizovanim izvršavanjem ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledanjem (videti, npr, Brent i sar., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

[0168] Dva primera algoritama koji su pogodni za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani kod Altschul i sar., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; i Altschul i sar., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, navedenim redom. Softver za sprovođenje BLAST analiza je javno dostupan putem Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information). Ovaj algoritam uključuje prvo pronalaženje visoko vrednovanih parova sekvenci (engl. high scoring sekvenca pairs - HSPs) identifikovanjem kratkih reči (sekvence slova) dužine W u ispitivanoj sekvenci, koje ili odgovaraju ili zadovoljavaju neki pozitivno procenjen prag vrednosti T pri poravnanju sa rečju iste dužine u bazi podataka za sekvence. “T” se odnosi na prag vrednosti susedne reči (Altschul i sar., supra). Ovi početni pogodci u susednoj reči služe kao “seme” za početak pretrage za duže HSP-ove koji ih sadrže. Ovo uspešno pronalaženje reči se proširuje u oba smera duž svake sekvence sve dotle dok kumulativni rezultat poravnanja može da se povećava. Kumulativni rezultati se računaju korišćenjem, u slučaju nukleotidne sekvence, parametara M (nagradni poen za par odgovarajućih ostataka; uvek > 0) i N (kazneni poen za pogrešan par ostataka; uvek < 0). Za aminokiselina sekvence, matriks za vrednovanje se koristi za računanje kumulativnog rezultata. Proširivanje uspešnog pronalaženja reči u oba smera duž sekvence se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja opada za veličinu X u odnosu na najveću dostignutu vrednost; kumulativni rezultat opadne na nulu ili niže, zahvaljujući nakupljanju jedne ili više negativnih poena pri poravnanju ostataka; ili kada se dođe do kraja bilo koje od sekvenci. Parametri W, T, i X u okviru BLAST algoritma određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao standardnu dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4 i poređenje oba stranda. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi standardnu dužinu reči od 3, i očekivane (E) od 10, i BLOSUM62 matriks za vrednovanje (videti Henikoff i Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnanja (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4, i poređenje oba stranda.

[0169] BLAST algoritam takođe sprovodi statističku analizu sličnosti između dve sekvence (videti, npr, Karlin i Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedna mera sličnosti koju daje BLAST algoritam je najmanji zbir verovatnoća (engl. smallest sum probability - P(N)), koja ukazuje na verovatnoću sa kojom će se podudaranje između dva nukleotida ili aminokiselinske sekvence dogoditi po principu slučajnosti. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom referentnoj sekvenci ako je najmanji zbir verovatnoća pri poređenju ispitivane nukleinske kiseline prema referentnoj nukleinskoj kiselini manji od oko 0.2, poželjnije manji od oko 0.01, i najpoželjnije manje od oko 0.001.

[0170] Percenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence se takođe može odrediti primenom algoritma prema E. Meyers i W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) koji je sastavni deo ALIGN programa (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele za težinu rezidua, kaznenih poena za dužinu praznine (engl. gap length penalty) od 12 i kaznenih poena za prazninu (engl. gap penalty) od 4. Osim toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi korišćenjem algoritma prema Needleman i Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) koji je sastavni deo GAP programa u GCG softverskom paketu (dostupan na sajtu www.gcg.com), korišćenjem ili Blossom 62 matriksa ili PAM250 matriksa, i vrednosti za prazninu (engl. gap) od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i vrednosti za dužinu od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

[0171] Osim procenta identičnosti sekvence opisanog u prethodnom tekstu, još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline ili polipeptida suštinski identične je da polipeptid kodiran prvom nukleinskom kiselinom imunološki unakrsno reaguje sa antitelima na polipeptid kodiran drugom nukleinskom kiselinom, kao što je opisano dalje u tekstu. Prema tome, polipeptid je obično suštinski identičan sa drugim polipeptidom, na primer, ukoliko se dva peptida razlikuju samo prema konzervativnim supstitucijama. Drugi pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je da dva molekula ili njihovi komplementi hibridizuju jedan sa drugim pod striktnim uslovima, kao što je opisano dalje u tekstu. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je taj da isti prajmeri mogu da se koriste za umnožavanje sekvence.

[0172] Izraz “nukleinska kiselina” se ovde koristi naizmenično sa “polinukleotid” i odnosi se na deoksiribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere bilo u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate nukleotidne analoge ili izmenjene rezidue u osnovi lanca, ili veze, koji su sintetisane, prirodne, i one koje se ne javljaju u prirodi, koji imaju slične osobine vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i koji se metabolišu na način sličan kao referentni nukleotidi. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničenja, fosforotioate, fosforamidate, metil fosfonate, hiral-metil fosfonate, 2-O-metil ribonukleotide, peptid-nukleinske kiseline (engl. peptide-nucleic acids - PNAs).

[0173] Osim ako nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe obuhvata njihove konzervativno modifikovane varijante (npr, supstitucije sa degenerativnim kodonom) i komplementarne sekvence, kao i izričito navedena sekvenca. Naročito, kako je detaljno opisano u nastavku teksta, supstitucije sa degenerativnim kodonom mogu da se postignu stvaranjem sekvenci kod kojih je treći položaj jednog ili više izabranih (ili svih) kodona supstituisan sa mešovitim bazama (engl. mixed-base) i/ili deoksiinozinskim reziduema (Batzer i sar., (1991) Nucleic pAcid Res. 19:5081; Ohtsuka i sar., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; i Rossolini i sar., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).

[0174] Izraz “operativno vezano” odnosi se na funkcionalnu vezu između dva ili više polinukleotidna (npr, DNA) segmenta. Uobičajeno, odnosi se na funkcionalni odnos transkripcionih regulatornih sekvenci sa transkribovanom sekvencom. Na primer, promotorska sekvenca ili stimulatorska sekvenca (engl. enhancer) je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom ako pospešuje ili menja transkripciju kodirajuće sekvence u odgovarajućoj ćeliji-domaćinu ili drugom ekspresionom sistemu. Uopšteno, promotorske transkripcione regulatorne sekvence koje su operativno povezane sa transkribovanom sekvencom su susedne u fizičkom smislu sa transkribovanom sekvencom, tj., one su cisdelujuće. U svakom slučaju, neke transkripcione regulatorne sekvence, kao što su stimulatorske sekvence, ne moraju da budu fizički susedne ili smeštene u blizini kodirajuće sekvence čiju transkripciju pojačavaju.

[0175] Izrazi “polipeptid” i “protein” se ovde koriste naizmenično da označe polimer aminokiselinskih ostataka. Izrazi se primenjuju na aminokiselinske polimere u kojima je jedna ili više aminokiselinskih rezidua veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne aminokiselinske polimere i aminokiselinske polimere koji se ne nalaze u prirodi. Osim ako nije drugačije naznačeno, određena polipeptidna sekvenca takođe obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante.

[0176] Izraz “ispitanik” uključuje ljude i životinje (koje nisu ljudi). Životinje (koje nisu ljudi) uključuju sve vertebrate, npr, sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovca, pas, krava, pilići, vodozemci i gmizavci. Osim kada je naglašeno, izrazi “pacijent” ili “ispitanik” se koriste međusobno zamenljivo.

[0177] Izraz “anti-kancersko sredstvo ” označava bilo koje sredstvo koje može da se koristi za lečenje proliferativnih ćelijskih poremećaja kao što je kancer, uključujući citotoksična sredstva, hemoterapijska sredstva, radioterapiju i radioterapijska sredstva, ciljna antikancerska sredstva, i imunoterapijska sredstva.

[0178] “Tumor” se odnosi na rast i umnožavanje neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i sve prekancerozne i kancerozne ćelije i tkiva.

[0179] Izraz “anti-tumorska aktivnost” označava smanjenje brzine umnožavanja tumorskih ćelija, njihove vijabilnosti, ili metastatičke aktivnosti. Mogući način ispoljavanja antitumorske aktivnosti je pokazano smanjenje brzine rasta abnormalnih ćelija koje se javlja tokom lečenja ili stabilnost ili smanjenje veličine tumora. Takva aktivnost se može proveriti prihvaćenim in vitro ili in vivo tumorskim modelima, uključujući ali bez ograničenja, ksenograftske modele, alograftske modele, MMTV modele, i druge poznate modele u stanju tehnike za proučavanje anti-tumorske aktivnosti.

[0180] Izraz “malignitet” odnosi se na tumor koji nije benigni ili kancer. Kako se ovde koristi, izraz “kancer” uključuje malignitet koji se karakteriše loše regulisanim ili nekontrolisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera uključuju: karcinome, sarkome, leukemije i limfome. Izraz “kancer” uključuje primarne maligne tumore (npr, one čije ćelije nisu migrirale na druga mesta u ispitanikovom telu van mesta prvobitnog tumora) i sekundarne maligne tumore (npr, one nastale iz metastaza, migracijom tumorskih ćelija na mesta različita od mesta nastanka prvobitnog tumora).

[0181] Različiti aspekti pronalaska su detaljno opisani u sledećim odeljcima i pododeljcima.

Struktura i mehanizam aktivacije HER receptora

[0182] Sva četiri HER receptora imaju vanćelijski ligand-vezujući domen, pojedinačni transmembranski domen i citoplazmatski domen koji sadrži tirozin kinazu. Unutarćelijski tirozinkinazni domen HER receptora je visoko konserviran, iako kinazni domen HER3 sadrži supstitucije kritičnih aminokiselina i zbog toga mu nedostaje kinazna aktivnost (Guy i sar., (1994): PNAS 91, 8132-8136). Ligandom-indukovana dimerizacija HER receptora dovodi do aktivacije kinaze, transfosforilacije receptora na tirozinskim reziduama na C-terminalnom kraju, što je praćeno angažovanjem i aktivacijom unutarćelijskih signalnih efektora (Yarden i Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen i sar., (2003) Exp Cell Res 284, 31-53.

[0183] Kristalne strukture vanćelijskih domena HER receptora su pružile uvid u proces aktivacije receptora indukovane ligandom (Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672). Vanćelijski domen svakog HER receptora sastoji se od četiri subdomena: subdomen I i III sarađuju u obrazovanju ligand-vezujućeg mesta, dok subdomen II (i moguće takođe i subdomen IV) učestvuje u dimerizaciji receptora putem neposrednih receptor-receptor interakcija. U strukturama HER1 vezanog za ligand, β ukosnica (označena kao dimerizaciona petlja) u subdomenu II interaguje sa dimerizacionom petljom receptora-partnera, posredujući u dimerizaciji receptora (Garrett et al, (2002) Cell 110, 763-773; Ogiso i sar., (2002) Cell 110, 775-787). Nasuprot tome, u strukturama neaktivnih HER1, HER3 i HER4, dimerizaciona petlja učestvuje u međumolekularnim interakcijama sa subdomenom IV, što sprečava dimerizaciju receptora u odsustvu liganda (Cho i Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson i sar., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Bouyan i sar., (2005) PNAS102, 15024-15029). Struktura HER2 je jedinstvena među HER-ovima. U odsustvu liganda, HER2 ima konformaciju nalik ligandom-aktiviranom stanju HER1 sa ispupčenom dimerizacionom petljom, pristupačnom za interakciju sa drugim HER receptorima (Cho i sar., (2003) Nature 421, 756-760; Garrett i sar., (2003) Mol Cell 11, 495-505). Ovo može da bude objašnjenje za pojačanu sposobnost heterodimerizacije HER2.

[0184] Iako kristalna struktura HER receptora daje model homo- i heterodimerizacije HER receptora, pozadina preovlađivanja nekih HER homo- i heterodimera u odnosu na druge (Franklin i sar., (2004) Cancer Cell 5, 317-328), kao i uloga konformacije svakog od domena u dimerizaciji i autoinhibiciji receptora (Burgess i sar., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoon i sar., (2004) PNAS101, 923-928) ostaje donekle nejasna. Kao što je opisano u nastavku teksta kristalna struktura HER3 dobijena X-zracima donosi jasnije sagledavanje.

Struktura i konformacioni epitopi HER3

[0185] U tekstu je obezbeđen konformacioni epitop za koji se vezuju antigen-vezujući proteini, npr, anti-HER3 antitela. Prvi put je prikazana trodimenzionalna struktura skraćenog oblika (rezidue 20-640) vanćelijskog domena kompleksa HER3 sa antitelom. HER3-MOR09823 Fab kompleks i HER3-MOR09825 su određeni pri rezoluciji od 3.2Å i 3.4 Å, navedenim redom, i prikazani na slici 5A. Predmetni pronalazak takođe prvi put prikazuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za neaktivni oblik HER3 i stabilizuje receptor u neaktivnom stanju. Antitela pronalaska takođe dozvoljavaju istovremeno vezivanje liganda HER3, kao što je neuregulin, sa HER3 receptorom.

[0186] Bez obaveze da predstavlja teorijsko objašnjenje, jedan od mogućih modela mehanizma delovanja je taj da HER3 obično postoji u neaktivnom (zatvorenom, sputanom) ili aktivnom (otvorenom) stanju. Vezivanje liganda dovodi do konformacione promene takve da HER3 postoji u aktivnom (otvorenom) stanju koje ima mogućnost da veže heterodimerne partnere dovodeći do aktivacije nishodnog signalnog puta. Antitela kao što su MOR09823 se vezuju za neaktivni (zatvoreni) oblik HER3 ali ne blokiraju mesto vezivanja liganda. Antitela kao što su MOR09823 inhibiraju HER3 sprečavanjem strukturnih preuređenja indukovanih ligandom neophodnih da bi HER3 zadobio aktivnu konformaciju, sprečavajući na taj način prenos signala. U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska ili njihovi fragmenti se vezuju za neaktivni (zatvoreni) oblik HER3 ali ne blokiraju mesto vezivanja liganda. U sledećem primeru izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti inhibiraju HER3 sprečavanjem strukturnih preuređenja indukovanih ligandom neophodnih da bi HER3 zadobio aktivnu konformaciju, sprečavajući na taj način prenos signala. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuju (direktno održava, zaključava, zatvara, drži, prvenstveno vezuje, ili favorizuje) HER3 receptor u neaktivnom obliku ili konformaciji. U jednom primeru izvođenja, neaktivni HER3 receptor može biti podložan prioritetnoj internalizaciji ili razgradnji što vodi gubitku HER3 receptora ćelijske površine. Biološki podaci prikazani u odeljku Primeri podržavaju ova izvođenja.

[0187] Kristali HER3 mogu da se dobiju eksprimiranjem nukleotidne sekvence koja kodira HER3 ili njene varijante u pogodnoj ćeliji-domaćinu, i potom kristalizacijom prečišćenog/prečišćenih proteina u prisustvu ciljanih Fab za relevantni HER3. Poželjno HER3 polipeptid sadrži vanćelijski domen (aminokiseline 20 do 640 humanog polipeptida ili njegova skraćena verzija, koja poželjno obuhvata aminokiseline 20-640) ali ne sadrži transmembranske i unutarćelijske domene.

[0188] Polipeptidi HER3 mogu takođe da se dobiju kao fuzioni proteini, na primer kako bi se olakšalo izolovanje i prečišćavanje. Primeri partnera fuzionog proteina uključuju glutation-S-transferazu (GST), histidin (HIS), heksahistidin (6HIS), GAL4 (DNA vezujući i/ili domene za aktivaciju transkripcije) i beta-galaktozidaza. Takođe može da bude pogodno uključivanje mesta za proteolitičko sečenje proteina između partnera fuzionog proteina i proteinske sekvence od interesa da bi se omogućilo uklanjanje sekvence fuzionog proteina.

[0189] Posle ekspresije, proteini mogu da se prečišćavaju i/ili koncentruju, na primer putem metal-helatne hromatografije (engl. immobilised metal affinity chromatography), jonoizmenjivačke hromatografije, i/ili gel filtracije.

[0190] Protein(i) mogu da se kristalizuju primenom ovde opisanih tehnika. Uobičajeno, u postupku kristalizacije, kap koja sadrži rastvor proteina se meša sa puferom za kristalizaciju i ostavlja da postigne ravnotežno stanje u zatvorenoj posudi. Ravnotežno stanje može da se postigne poznatim tehnikama kao što je postupak “viseća kap” ili “stojeća kap”. U ovim postupcima, kap visi iznad ili je postavljena pored mnogo većeg suda sa kristalizacionim puferom i ravnotežno stanje se dostiže putem difuzije pare. Pored ovog, ravnoteža može da se postigne drugim postupcima, na primer pod uljem, kroz polu-propustljivu membranu, ili difuzijom kroz slobodnu površinu (Videti npr, Chayen i sar., (2008) Nature Methods 5, 147 -153.

[0191] Jednom, kada se kristali dobiju, struktura može da se odredi poznatim tehnikama sa X-zracima. Mnoge tehnike koriste hemijski modifikovane kristale, kao što su oni izmenjenu derivatizacijom teškim atomom do približnih faza. U praksi, kristal se potapa u rastvor koji sadrži soli teških metala, ili organometalna jedinjenja, npr, olovo hlorid, zlato tiomalat, timerosal ili uranil acetat, koji mogu da difunduju kroz kristal i da se vežu za površinu proteina. Pozicija(e) vezanog/vezanih atoma teškog metala mogu zatim da se odrede analizom difrakcije X-zraka na uronjenom kristalu. Obrasci dobijeni difrakcijom monohromatskog snopa X-zraka na atomima kristala (centri rasipanja) mogu da se izraze matematičkim jednačinama da bi se dobile matematičke koordinate. Podaci o difrakciji se koriste za izračunavanje mape gustine elektrona jedinice kristala koja se ponavlja. Još jedan postupak za dobijanje fazne informacije je korišćenje tehnike poznate kao molekularna zamena. U ovom postupku, rotacioni i translacioni alogritmi se primenjuju za pretragu modela izvedenog iz povezanih struktura, čime se dobija približna orijentacija proteina od interesa (Videti Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82). Mape elektronske gustine se koriste za utvrđivanje položaja pojedinačnih atoma u okviru jedinične ćelije kristala (Blundel i sar., (1976) Protein Crystallography, Academic Press).

[0192] Prikazani pronalazak opisuje prvi put, trodimenzionalnu strukturu HER3 i Fab anti-HER3 antitela. Približne granice domena vanćelijskog domena HER3 su navedene u nastavku; domen 1: aminokiseline 20-207; domen 2: aminokiseline 208-328; domen 3: aminokiseline 329-498; i domen 4: aminokiseline 499-642. Trodimenzionalna struktura HER3 i antitela takođe omogućava identifikaciju ciljnog mesta vezivanja za potencijalne HER3 modulatore. Poželjna ciljna mesta vezivanja su ona uključena u aktivaciju HER3. U jednom primeru izvođenja, ciljno mesto vezivanja je smešteno unutar domena 2 i domena 4 HER3. Stoga antitelo ili njegov fragment koji se vezuje ili za domen 2 ili domen 4, i poželjno za oba domena, može da izmeni HER3 aktivaciju putem sprečavanja disocijacije dva domena ili menjanjem relativnog položaja domena. Prema tome, vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za aminokiselinske rezidue u okviru domena 2 ili domena 4 može dovesti do toga da protein stekne konformaciju koja sprečava aktivaciju. Ovde prikazani pronalazak takođe donosi prvi put antitelo ili njegov fragment koji može da se veže istovremeno sa HER3 ligandom, kao što je neuregulin.

[0193] U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment prepoznaje specifično konformaciono stanje HER3 takvo da antitelo ili njegov fragment sprečava HER3 da interaguje sa koreceptorom (uključujući, ali bez ograničenja na, HER1, HER2 i HER4). U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment sprečava međusobno delovanje HER3 i koreceptora stabilizacijom HER3 receptora u neaktivnom ili zatvorenom stanju. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor vezivanjem za aminokiselinske rezidue unutar domena 2 i domena 4 u HER3. U ovakvom neaktivnom stanju, dimerizaciona petlja smeštena u nutar domena 2 nije izložena i zbog toga nije dostupna za dimerizaciju sa drugim koreceptorima (uključujući, bez ograničenja, HER1, HER2 i HER4). U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za humani HER3 protein koji ima konformacioni epitop koji obuhvata (i) HER3 aminokiselinske rezidue 265-277 i 315 (domena 2) i (ii) HER3 aminokiselinske rezidue 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) sekvence SEQ ID NO: 1, ili njihov podset. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za aminokiseline u okviru, ili koje se preklapaju sa aminokiselinskim reziduema 265-277 i 315 (domena 2) i (ii) HER3 aminokiselinskim reziduema 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) sekvence SEQ ID NO: 1. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za aminokiseline u okviru (i/ili aminokiselinske sekvence koje sadrže (i) aminokiseline 265-277 i 315 (domena 2) i (ii) HER3 aminokiselinske rezidue 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (domena 4) sekvence SEQ ID NO: 1, ili njihov podset. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za konformacioni epitop tako da smanjuje pokretljivost domena 2 i domena 4, stabilizujući ih u neaktivnoj ili zatvorenoj konformaciji. Izostanak obrazovanja aktivne konformacije dovodi do izostanka aktivacije prenosa signala. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za konformacioni epitop čime se zatvara dimerizaciona petlja u domenu 2, čineći ga na taj način nedostupnim za receptor-receptor interakciju. Izostanak obrazovanja homo- ili heterodimera dovodi do izostanka aktivacije prenosa signala.

[0194] U sledećem aspektu, antitelo ili njegov fragment se vezuje za konformacioni epitop HER receptora, kao što je HER3 receptor. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom obliku. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za aktivan oblik HER3 receptora i dovodi ga u neaktivan oblik. Tako, antitelo ili njegov fragment može da se veže ili za aktivni ili neaktivni oblik HER3, ali favorizuje obrazovanje neaktivnog oblika i dovodi aktivni oblik HER3 u neaktivni oblik, što za posledicu ima izostajanje aktivacije prenosa signala.

[0195] U sledećem aspektu, antitelo ili njegov fragment se vezuje za konformacioni epitop HER receptora, kao što je HER3 receptor gde vezivanje antitela ili njegovog fragmenta stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju tako da HER3 receptor ne uspeva da formira dimer sa koreceptorom da bi obrazovao receptor-receptor kompleks. Izostanak obrazovanja kompleksa receptor-receptor sprečava aktivaciju i ligand-zavisnog i ligand-nezavisnog prenosa signala.

[0196] U sledećem aspektu, antitelo ili njegov fragment se vezuje za konformacioni epitop HER receptora kao što je HER3 receptor, gde vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za HER3 receptor omogućava dimerizaciju sa koreceptorom i obrazovanje neaktivnog receptorreceptor kompleka. Obrazovanje neaktivnog receptor-receptor kompleka.sprečava aktivaciju ligand-nezavisnog prenosa signala. Na primer, kod ligand-nezavisnog prenosa signala, HER3 može da postoji u neaktivnom obliku, u svakom slučaju prekomerna ekspresija HER2 dovodi do nastanka kompleksa HER2-HER3, što dovodi do toga da su komplesi neaktivni i sprečava aktivaciju ligand-nezavisnog prenosa signala.

[0197] Prikazana struktura takođe omogućava identifikovanje aminokiselinskih rezidua jezgra HER3 specifičnih za površinu interakcije antitela ili njegovog fragmenta (npr, MOR09823) sa HER3. Ovo je definisano kao rezidue koji se nalaze u okviru 5Å od MOR09823 proteina VH lanca. Rezidue jezgra su: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597.

[0198] Strukture se takođe mogu koristiti za identifikovanje graničnih aminokiselinskih rezidua u HER3 za površinu interakcije antitela ili njegovog fragmenta (npr, MOR09823). Ove rezidue mogu biti HER3 rezidue koji se nalaze 5-8Å od MOR09823 proteina VH lanca. Granične rezidue su sledeće: Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321, Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581, Gly582, Gly595, Gly598, Ile600.

[0199] Prikazana struktura takođe omogućava identifikaciju specifičnih centralnih HER3 aminokiselinskih rezidua koje formiraju površinu interakcije antitela ili njegovog fragmenta (npr, MOR09823) sa HER3. One su definisane kao rezidue koji su u okviru 5Å od MOR09823 proteina VL lanca. Centralne rezidue su sledeće: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

[0200] Struktura je takođe korišćena za identifikovanje graničnih aminokiselinskih ostataka u HER3 za obrazovanje površine interakcije sa antitelom ili njegovim fragmentom (npr, MOR09823). Ove rezidue su HER3 rezidue koji se nalaze u okviru 5-8Å od MOR09823 proteina VL lanca. Granične rezidue su sledeće: Asn266, Thr269, Asp571, Arg580, Asp581, His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601, Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621, Gly623, Pro624.

[0201] Kao što se može videti u tabelama 11 i 12 (MOR09823) i tabelama 13 i 14 (MOR09825), navedenim redom, teški lanac je uglavnom uključen u antigen-vezujuće vezivanje proteina za aminokiselinske rezidue unutar domena 2 epitopa sa manje interakcija sa aminokiselinskim reziduema domena 4, dok je laki lanac uglavnom uključen u vezivanje za aminokiselinske rezidue unutar domena 4 epitopa sa manje interakcija sa aminokiselinskim reziduema domena 2.

[0202] Prema tome, osoba upoznata sa stanjem tehnike, može na osnovu prikazanog, da predvidi koje rezidue i oblasti antigen-vezujućih proteina mogu da budu izmenjene bez nepotrebnog uticaja na sposobnost antigen-vezujućih proteina da se vežu za HER3.

[0203] Aminokiseline jezgra aktivne površine su identifikovane kao aminokiselinske rezidue sa najmanje jednim atomom udaljenim manje od ili jednako 5Å od proteina partnera HER3.

5Å je izabrano kao granična razdaljina za jezgro da bi se uključili atomi u okviru oblasti delovanja Van der Valsovih sila i mogućih vodoničnih veza posredovanih vodom. Aminokiseline koje ograničavaju aktivnu površinu su određene kao sve aminokiselinske rezidue sa najmanje jednim atomom udaljenim manje od ili jednako 8Å od proteina koji stupa u interakciju sa HER3, ali nisu uključene u listu aminokiselina jezgra aktivne površine.

[0204] U pojedinim primerima izvođenja, bilo koji antigen vezujući protein koji se vezuje za, pokriva, ili sprečava MOR09823 da interaguje sa bilo kojim od gore navedenih ostataka može da se koristi za vezivanje ili neutralizaciju HER3. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ili interaguju sa najmanje jednim od sledećih HER3 ostataka (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. U pojedinim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti se vezuju za ili interaguju sa najmanje jednim od sledećih HER3 ostataka (SEQ ID NO: 1): Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ili interaguju sa najmanje jednim od sledećih HER3 ostataka (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ili interaguju sa kombinacijom sledećih HER3 ostataka (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. U pojedinim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ili interaguju sa svim navedenim HER3 reziduema (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment je unutar 5 angstrema od jednog ili više gore navedenih ostataka. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment je 5 do 8 angstrema od jednog ili više gore navedenih ostataka. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment interaguje, blokira, ili je unutar 8 angstrema od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 gore navedenih ostataka.

[0205] Dostupnost 3D struktura HER3 i kompleksa HER3:MOR09823, na primer, pruža okvir za detaljnije istraživanje ostalih HER3 antitela. 3D struktura HER3 omogućava mapiranje epitopa za monoklonska antitela i proučavanje njihovog načina delovanja, budući da neki inhibiraju, neki pospešuju, a drugi nemaju uticaja na ćelijski rast. Konformacioni epitop za MOR09823 je lociran u domenima 2 i 4 u HER3. Dostupnost 3D struktura ovog receptora će olakšati određivanje preciznog mehanizma delovanja inhibitornih sredstava i dizajn novih pristupa za interferiranje sa ulogom HER3 receptora. U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska se vezuju za isti konformacioni epitop kao MOR09823.

[0206] U pojedinim primerima izvođenja, konformacioni epitop vezan za bilo koje od antitela pobrojanih u tabeli 1 je naročito koristan. U određenim primerima izvođenja, HER3 konformacioni epitop se može koristiti za izolovanje antitela ili njihovih fragmenata koji se vezuju za HER3. U određenim primerima izvođenja, HER3 konformacioni epitop se može koristiti za dobijanje antitela ili njihovih fragmenata koji se vezuju za HER3. U određenim primerima izvođenja, HER3 konformacioni epitop može da se koristi kao imunogen za dobijanje antitela ili njihovih fragmenata koji se vezuju za HER3 konformacioni epitop. U određenim primerima izvođenja, HER3 konformacioni epitop se može primeniti kod životinje, i antitela koja se vezuju za HER3 mogu zatim da se dobiju iz životinje.

[0207] U pojedinim primerima izvođenja, domen(i)/region(i) koji sadrže rezidue koje su u kontaktu sa ili su prekrivene antitelom mogu da se identifikuju mutiranjem specifičnih ostataka u HER3 (npr, divlji tip (engl. wild-type) antigen) i određivanjem da li antitelo ili njegov fragment može da se veže za mutirani HER3 protein ili njegovu varijantu ili merenjem promene afiniteta u odnosu na divlji tip. Stvaranjem određenog broja pojedinačnih mutacija, rezidue koji igraju direktnu ulogu u vezivanju ili se nalaze dovoljno blizu antitela tako da mutacija može da utiče na vezivanje antitela i antigena mogu da budu identifikovane. Poznavanjem ovih aminokiselina, mogu se izdvojiti domen(i) ili region(i) antigena (HER3) koji sadrže rezidue u kontaktu sa antitelom ili su pokriveni antitelom. Mutageneza upotrebom poznatih tehnika kao što je alanin-skeniranje može da pomogne u definisanju funkcionalno relevantnih epitopa. Mutageneza primenom arginin/glutaminska kiselina protokola za skeniranje može takođe da bude uključena (videti, npr, Nanevicz i sar., (1995), J. Biol. Chem.

270(37):21619-21625 i Zupnick i sar., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473). Uopšteno, arginini i glutaminske kiseline su supstituisani (obično pojedinačno) aminokiselinom u polipeptidu divljeg tipa jer su ove aminokiseline naelektrisane i glomazne i stoga imaju potencijal da raskinu vezu između antigen-vezujućeg proteina i antigena u regionu antigena u kome je uvedena mutacija. Arginini koji postoje u divljem tipu antigena su zamenjeni glutaminskom kiselinom. Spektar takvih individualnih mutanata može biti dobijen i prikupljeni podaci o njihovom vezivanju analizirani u cilju dobijanja informacije koji rezidue utiču na vezivanje. Nizovi mutiranih HER3 antigena mogu da se dobiju, tako da svaki mutirani antigen ima pojedinačnu mutaciju. Vezivanje svakog mutiranog HER3 antigena sa različitim HER3 antitelima ili njihovim fragmentima može da se izmeri i uporedi sa sposobnošću odabranih antitela ili njihovih fragmenata da se vežu za divlji tip HER3 (SEQ ID NO: 1).

[0208] Promena (na primer smanjenje ili povećanje) u stepenu vezivanja između antitela ili njegovog fragmenta i mutiranog HER3 ili varijante HER3, kako se ovde koristi, označava da postoji promena u afinitetu vezivanja (npr, kada se merenje obavlja poznatim metodama kao što je “Biacore” ispitivanje ili test zasnovan na perlama opisan dalje u tekstu u odeljku Primeri), EC50, i/ili promena (na primer smanjenje) ukupnog kapaciteta vezivanja antigenvezujućeg proteina (na primer, kako je zabeleženo smanjenjem Bmaxna grafikonu koji prikazuje koncentraciju antigen-vezujućeg proteina u odnosu na koncentraciju antigena). Značajna promena u vezivanju ukazuje na to da je mutirani ostatak uključen u vezivanje za antitelo ili njegov fragment.

[0209] U pojedinim primerima izvođenja, značajno smanjenje vezivanja znači da je afinitet vezivanja, EC50, i/ili kapacitet između antitela ili njihovih fragmenata i mutiranog HER3 antigena smanjen više od 10%, više od 20%, više od 40%, više od 50%, više od 55%, više od 60%, više od 65%, više od 70%, više od 75%, više od 80%, više od 85%, više od 90% ili više od 95% u odnosu na vezivanje između antitela ili njegovog fragmenta i divljeg tipa HER3 (npr, SEQ ID NO: 1).

[0210] U pojedinim primerima izvođenja, vezivanje antitela ili njihovih fragmenata je značajno smanjeno ili povećano za mutirani HER3 protein koji ima jednu ili više (npr, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više) mutacija u poređenju sa divljim tipom HER3 proteina (npr, SEQ ID NO: 1).

[0211] Iako se varijante odnose na sekvencu divljeg tipa prikazanu u SEQ ID NO: 1, treba primetiti da u alelnim ili splajsovanim varijantama HER3 aminokiseline mogu da se razlikuju. Antitela ili njihovi fragmenti koji pokazuju značajno izmenjeno vezivanje (npr, manje ili veće vezivanje) za takve alelne oblike HER3 su takođe obuhvaćeni.

[0212] Osim opštih strukturnih aspekata antitela, još specifičnija interakcija između paratopa i epitopa može da bude istražena strukturnim pristupom. U jednom primeru izvođenja, struktura CDR-ova doprinosi paratopu, preko koga antitelo može da se veže za epitop. Oblik takvog paratopa može da se odredi na razne načine. Mogu da se koriste tradicionalni pristupi strukturnim ispitivanjima, kao što je NMR ili kristalografija x-zraka. Ovi pristupi mogu da istraže oblik samog paratopa, ili dok je vezan za epitop. Allternativno, molekularni modeli mogu da nastanu in silico. Struktura se može dobiti primenom homolognog modelovanja, pomognutog komercijalnim paketom kao što je “InsightII” paket za modelovanje Accelrys (San Diego, Calif.). Ukratko, ispitivana sekvenca antitela koja se ispituje se pretražuje u bazi podataka proteina poznate strukture, kao što je Protein Data Bank. Nakon što se identifikuju homologni proteini poznate strukture, ovi homologni proteini se koriste za modelovanje obrazaca. Svaki od mogućih obrazaca može da se poravna, čime se dobija struktura zasnovana na poravnanju sekvence među obrascima. Sekvenca antitela nepoznate strukture tada može da se poravnja sa ovim obrascima da bi se dobio molekularni model antitela nepoznate strukture. Kao što je poznato stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, postoji mnogo različitih postupaka za dobijanje takvih struktura in silico (kompjuterskom simulscijom), od kojih bilo koja može da se koristi. Na primer, postupk sličan onom opisanom kod Hardman i sar., publikovan U.S. Pat. No.5,958,708 koji koristi QUANTA (Polygen Corp., Waltham, Mass.) i CHARM (Brooks i sar., (1983), J. Comp. Chem. 4:187) mogu da se koriste.

[0213] Nije samo oblik paratopa značajan za to da li će se koliko dobro će se mogući paratop vezati za epitop, već je i sama interakcija između epitopa i paratopa dobar izvor podataka za oblikovanje određene varijante antitela. Kao što je razumljivo stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, postoje brojni načini na koje se ove interakcije mogu proučavati. Jedan od načina je korišćenjem napravljenog prostornog modela, na primer kako je opisano dalje u tekstu, a zatim primenom programa kao što je InsightII (Accelrys, San Diego, Calif.), koji ima modul za predviđanje interakcije proteina – doking modul (engl. docking module), koji, između ostalog, može da izvede “Monte Carlo” pretraživanje konformacionih i orijentacionih prostornih odnosa paratopa i njegovog epitopa. Na osnovu ovoga, može se proceniti gde i kako epitop i paratop međusobno deluju. U jednom primeru izvođenja, samo fragment, ili varijanta epitopa se koristi za određivanje bitnih interakcija. U jednom primeru izvođenja, ceo epitop se koristi za pravljenje modela međusobnih delovanja paratopa i epitopa.

[0214] Korišćenjem ovih strukturnih modela, može se predvideti koji rezidue su najvažnije u međusobnom delovanju epitopa i paratopa. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, omogućeno je da se lako odabere koje rezidue traba da budu izmenjene kako bi se promenile osobine vezivanja antitela. Na primer, može da bude očigledno na osnovu doking modela da bočni lanci određenih rezidua u paratopu mogu da prostorno otežavaju vezivanje epitopa, tako da zamena ovih rezidua reziduama sa manjim bočnim lancima može da bude korisna. Ovo se može odrediti na mnogo načina. Na primer, moguće je pogledati dva modela i proceniti interakcije na osnovu funkcionalnih grupa i blizine. Na drugi način, mogu se praviti različiti parovi epitopa i paratopa, kao što je opisano u prethodnom tekstu, kako bi se dobile energetski najpovoljnije interakcije. Mogu se odrediti ove interakcije za različite varijante antitela kako bi se odredili različiti načini na koje antitelo može da se vezuje za epitop. Takođe se mogu kombinovati različiti modeli da bi se odredilo kako treba menjati strukturu antitela in da bi se dobilo antitelo sa poželjnim osobinama.

[0215] Modeli dobijeni na način opisan u prethodnom tekstu mogu da se ispituju primenom različitih tehnika. Na primer, energija interakcije može da se odredi upotrebom gore opisanih programa, u cilju određivanja koje varijante treba dalje ispitivati. Takođe, Kulonove i Van der Valsove sile se koriste za određivanje energije interakcija epitopa i varijanti paratopa. Osim toga, dirigivana mutageneza se koristi da bi se utvrdilo da li predviđene promene u strukturi antitela zaista dovode do željenih promena karakteristika vezivanja. Drugačije, epitop može da bude izmenjen da bi se potvrdilo da su modeli ispravni ili da bi se utvrdile opšte osobine vezivanja do koga može doći između paratopa i epitopa.

[0216] Kao što je poznato stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, iako će ovi modeli obezbediti uputstva neophodna za dobijanje antitela i negovih varijanti predmetnog izvođenja, još uvek može da bude poželjno izvođenje njihovog rutinskog ispitivanja na in silico modelima, na primer putem in vitro studija. Uz to, kao što će biti očigledno stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike, bilo kakve izmene mogu da imaju dodatne sporedne uticaje na aktivnost antitela. Na primer, dok bilo kakve izmene za koje je predviđeno da će dovesti do jačeg vezivanja, mogu da izazovu jače vezivanje, mogu takođe da dovedu do drugih strukturnih promena koje mogu da smanje ili izmene aktivnost antitela. Utvrđivanje da li će se to dogoditi ili ne, je rutina u stanju tehnike i može se postići na mnogo načina. Na primer, aktivnost se može ispitati primenom ELISA testa. Drugačije, uzorci mogu da se ispitaju primenom aparata za rezonancu površinskog plazmona.

Antitela usmerena protiv HER3

[0217] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja prepoznaju konformacioni epitop HER3. Pronalazak se zasniva na iznenađujućem otkriću da klasa antitela na HER3 sprečava oba, i ligand-zavisni i ligand-nezavisni HER3 put prenosa signalna. Klasa antitela koja se vezuju za određeni konformacioni epitop u HER3 je obelodanjena u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, antitela inhibiraju oba, i ligand-zavisni i ligand-nezavisni HER3 put prenosa signalna. U sledećem primeru izvođenja, antitela se vezuju za HER3 i ne sprečavaju vezivanje HER liganda za ligand vezujuće mesto (tj. i ligand i antitelo mogu da se vežu za HER3 istovremeno).

[0218] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus), pomenuta antitela sadržre VH domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, i 375. Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus), pomenuta antitela sadrže VL domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, i 374. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela kkoja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus), pomenuta antitela sadrže VH CDR koji ima sekvencu aminokiselina kao bilo koji od VH CDR-ova navedenih u tabeli 1, dalje u tekstu. Naročito, pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus), gde pomenuta antitela sadrže (ili se, alternativno, sastoje od) jednog, dva, tri, četiri, pet ili više VH CDR-ova koji imaju sekvencu aminokiselina bilo kog od VH CDR-ova pobrojanih u tabeli 1, dalje u tekstu.

[0219] Ostala antitela pronalaska uključuju aminokiseline koje su mutirane, ali još uvek imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, ili 98 procenata identičnosti u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u sekvencama opisanim u tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja, to uključuje mutirane aminokiselinske sekvence gde je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutairano u CDR regionima u poređenju sa CDR regionima prikazanim u sekvencama opisanim u tabeli 1, zadržavajući i dalje svoju specifičnost za izvorni epitop antitela.

Ostala antitela pronalaska uključuju aminokiseline koje su mutirane, ali još uvek imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, ili 98 procenata identičnosti u okvirnim regionima sa okvirnim regionima prikazanim u sekvencama opisanim u tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja, to uključuje mutirane aminokiselinske sekvence u kojima je ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 aminokiselina mutirano u okvirnim regionima u poređenju sa okvirnim regionima prikazanim u sekvencama opisanim u tabeli 1, dok je pri tome i dalje očuvana njihova specifičnost za izvorni epitop antitela. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju VH, VL, celu dužinu teškog lanca, i celu dužinu laki lanca antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus).

[0220] HER3 antitela pronalaska se vezuju za konformacioni epitop HER3 koji obuhvata aminokiselinske rezidue domena 2 i domena 4 HER3.

Tabela 1: Primeri antitela na HER3 prikazanog pronalaska

[0221] Ostala antitela pronalaska uključuju ona u kojima su aminokiseline ili nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiseline mutirane, ali i dalje imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, i 99 procenata identičnosti sa sekvencama opisanim u tabeli 1. U pojedinim primerima izvođenja, to uključuje mutirane aminokiselinske sekvence u kojima je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano u varijabilnim regionima u poređenju sa varijabilnim regionima prokazanim u sekvencama opisanim u tabeli 1, koje pri tome zadržavaju suštinski istu terapijsku aktivnost.

[0222] Budući da svako od ovih antitela ili njihovih fragmenata može da se veže za HER3, VH, VL, laki lanac cele dužine, i teški lanac cele dužine, sekvence (aminokiselinske sekvence i nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence) mogu da budu "pomešane i sparene" da bi se dobila druga HER3-vezujuća antitela pronalaska. Takvo "mešanje i sparivanje" HER3-vezujućih antitela može da se ispita testovima koji ispituju vezivanje poznatim u stanju tehnike (npr, ELISA testovi i drugi testovi opisani u odeljku Primeri). Kada se ovi lanci podvrgnu mešanju i sparivanju, VH sekvenca iz određenog VH/VL para treba da bude zamenjena VH sekvencom slične strukture. Na isti način, sekvenca teškog lanca cele dužine iz određenog para teški lanac cele dužine / laki lanac cele dužine treba da bude zamenjena sekvencom teškog lanca cele dužine slične strukture. Na isti način, VL sekvenca iz određenog VH/VL sparivanja treba da bude zamenjena VL sekvencom slične strukture. Na isti način, sekvenca lakog lanca cele dužine iz određenog para teški lanac cele dužine / laki lanac cele dužine treba da bude zamenjena sekvencom lakog lanca cele dužine slične strukture. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji ima: varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, i 375; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, i 374; u kojima se antitelo specifično vezuje za HER3 (npr, humani i/ili majmuna cynomologus).

[0223] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje HER3-vezujuća antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 regione teškog lanca i lakog lanca kao što je opisano u tabeli 1, ili njihove kombinacije. Aminokiselinske sekvence CDR1regiona VH antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, i 368. Aminokiselinske sekvence CDR2 regiona VH antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, i 369. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona VH antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, i 370. Aminokiselinske sekvence CDR1 regiona VL antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, i 371. Aminokiselinske sekvence CDR2regiona VL antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona VL antitela su prikazane u SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, i 373. CDR regioni su označeni prema Kabat sistemu (Kabat i sar., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No.91-3242; Chothia i sar., (1987) J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia i sar., (1989) Nature 342: 877-883; i Al-Lazikani i sar., (1997) J. Mol. Biol.

273, 927-948).

[0224] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 2; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 3; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 4; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 5; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 6; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 7.

[0225] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 20; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 21; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 22; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 23; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 24; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 25.

[0226] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 38; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 39; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 40; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 41; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 42; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 43.

[0227] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 56; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 57; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 58; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 59; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 60; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 61.

[0228] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 74; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 75; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 76; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 77; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 78; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 79.

[0229] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 92; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 93; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 94; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 95; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 96; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 97.

[0230] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 110; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 111; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 112; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 113; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 114; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 115.

[0231] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 128; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 129; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 130; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 131; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 132; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 133.

[0232] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 146; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 147; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 148; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 149; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 150; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 151.

[0233] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 164; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 165; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 166; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 167; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 168; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 169.

[0234] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 182; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 183; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 184; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 185; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 186; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 187.

[0235] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 200; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 201; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 202; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 203; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 204; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 205.

[0236] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 218; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 219; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 220; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 221; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 222; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 223.

[0237] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 236; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 237; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 238; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 239; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 240; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 241.

[0238] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 254; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 255; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 256; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 257; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 258; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 259.

[0239] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 272; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 273; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 274; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 275; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 276; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 277.

[0240] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 290; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 291; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 292; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 293; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 294; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 295.

[0241] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 308; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 309; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 310; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 311; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 312; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 313.

[0242] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 326; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 327; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 328; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 329; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 330; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 331.

[0243] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 344; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 345; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 346; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 347; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 348; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 349.

[0244] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 362; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 363; CDR3 sekvence SEQ ID NO: 364; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 365; CDR2 sekvence SEQ ID NO: 366; i CDR3 sekvence SEQ ID NO: 367.

[0245] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO. 15 i VL sekvence SEQ ID NO: 14. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 33 i VL sekvence SEQ ID NO: 32. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 51 i VL sekvence SEQ ID NO: 50. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži a SEQ ID NO: 69 i VL sekvence SEQ ID NO: 68. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 87 i VL sekvence SEQ ID NO: 86. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 105 i VL sekvence SEQ ID NO: 104. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 123 i VL sekvence SEQ ID NO: 122. [0221] U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 141 i VL sekvence SEQ ID NO: 140. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 159 i VL sekvence SEQ ID NO: 158. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 177 i VL sekvence SEQ ID NO: 176. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 195 i VL sekvence SEQ ID NO: 194. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 213 i VL sekvence SEQ ID NO: 212. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 231 i VL sekvence SEQ ID NO: 230. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 249 i VL sekvence SEQ ID NO: 248. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 267 i VL sekvence SEQ ID NO: 266. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 285 i VL sekvence SEQ ID NO: 284. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 303 i VL sekvence SEQ ID NO: 302. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 321 i VL sekvence SEQ ID NO: 320. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 339 i VL sekvence SEQ ID NO: 338. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 357 i VL sekvence SEQ ID NO: 356. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 375 i VL sekvence SEQ ID NO: 374.U jednom primeru izvođenja, HER3 antitela su antagonist antitela. U određenim primerima izvođenja, antitelo koje se vezuje za HER3 je antitelo opisano u Tabeli 1.

[0246] Kako se ovde koristi, humano antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca ili teški ili laki lanac cele dužine koji su "proizvod" ili "dobijeni iz" određene germinativne sekvence ukoliko su varijabilni regioni ili lanci cele dužine antitela dobijeni iz sistema koji koristi humane imunoglobulinske gene germinativne linije. Takvi sistemi uključuju imunizaciju transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene antigenom od interesa ili pretraživanje biblioteke humanog gena za imunoglobulin ispoljene u fagu, antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "dobijeno iz" humane germinativne imunoglobulinske sekvence može da se identifikuje kao takvo poređenjem sekvence aminokiselina humanog antitela sa humanom imunoglobulinskom germinativnom sekvencom aminokiselina i selektovanjem germinativne sekvence humanog imunoglobulina koja je najsličnija (tj., najveći je % identičnosti) sa sekvencom humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "dobijeno iz" germinativne sekvence humanog imunoglobulina može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa germinativnom sekvencom, zahvaljujući, na primer, somatskim mutacijama koje se prirodno događaju ili namerno izazvanim mestospecifičnim mutacijama. U svakom slučaju, u okvirnim regionima VH ili VL, odabrano humano antitelo obično je najmanje 90% identično u sekvenci aminokiselina sa sekvencom aminokiselina kodiranom humanim imunoglobulinskim genom germinativne linije i sadrži aminokiselinske rezidue koji identifikuju humano antitelo kao humano kada se uporedi sa imunoglobulinskom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije drugih vrsta (npr, sa mišjom nerearanžiranom sekvencom). U određenim slučajevima, humano antitelo može da bude najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom germinativne linije. Obično, rekombinantno humano antitelo će ispoljiti ne više od 10 razlika u aminokiselinama u odnosu na sekvencu aminokiselina kodiranu imunoglobulinskim genom germinativne linije u okvirnim regionima VH ili VL. U određenim slučajevima, humano antitelo može da ispolji ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 razlike u aminokiselinama u odnosu na sekvencu aminokiselina kodiranu imunoglobulinskim genom germinativne linije. Različite verzije germinativne sekvence, korišćenjem VH i VL germinativne sekvence za reprezentativni broj HER3 antitela, su prikazane u tabeli 2, numeracijom prema Kabat-u. Položaji CDR su naznačeni podebljanim (boldiranim) slovima. Oznake korišćene u tabelama sa germinativnim sekvencama su sledeće: MOR10701-VH_3-07 označava MOR10701 CDR petlje u okvirnim regionima VH germinativne sekvence 3-07 (nomenklatura je data prema Vbase), MOR10703-VK_L1 označava CDR iz MOR10703 u okvirnim regionima germinativne sekvence iz VK_L1, gde VK označava kapa laki lanac.

Tabela 2: Različite verzije germinativne sekvenceodabranog broja reprezentativnih antitela

Tabela 3: JH segmenti

Tabela 4: JK segmenti

[0247] Bilo koja kombinacija germinativnih VH sekvenci sa JH segmentima može da se koristi. Reprezentativni primeri kombinacija su prikazani u tabeli 5.

Tabela 5: Reprezentativni primeri kombinacija germinativne VH sekvence sa JH segmentima.

[0248] Bilo koja kombinacija germinativne VL sekvence sa JK segmentima može da se koristi. Reprezentativni primeri kombinacija su prikazani u tabeli 6.

Tabela 6: Reprezentativni primeri kombinacija germinativne VK sekvence sa JK segmentima.

[0249] Jednom kada se VH iskombinuje sa JH i VK sa JK, tada bilo koja kombinacija VH ili JH sa VK ili JK, može da se koristi. U jednom primeru izvođenja, bilo koji od VH regiona germinativne linije može da se kombinuje sa bilo kojim od VK (VL) regiona germinativne linije za svako antitelo. Reprezentativni broj primera kombinacija je prikazan u tabeli 7.

Tabela 7: Reprezentativni primeri kombinacija germinativnih sekvenci

[0250] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu Xaa1-HCDR1-Xaa2-HCDR2-Xaa3-HCDR3-Xaa4gde HCDR1, HCDR2, HCDR3 teškog lanca predstavljaju bilo koje CDR-ove teškog lanca odabrane iz tabela 1 i 2. Samo u svrhe ilustracije, sekvenca može da bude:

Xaa1- SYAMS - Xaa2- AINSQGKSTYYADSVKG - Xaa3- WGDEGFDI - Xaa4(SEQ ID NO: 493), u kojoj,

Xaa1predstavlja okvirni region bilo kojih 30 aminokiselina;

Xaa2predstavlja okvirni region bilo kojih 14 aminokiselina;

Xaa3predstavlja okvirni region bilo koje 32 aminokiseline;

Xaa4predstavlja okvirni region bilo kojih 11 aminokiselina;

[0251] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvencu Xaa1-LCDR1-Xaa2-LCDR2-Xaa3-LCDR3-Xaa4, u kojoj LCDR1, LCDR2, LCDR3 lakog lanca predstavlja bilo koje CDR-ove lakog lanca odabrane iz tabela 1 i 2. Samo u svrhe ilustracije, sekvenca može da bude:

Xaa1- RASQGISNWLA - Xaa2- GASSLQS - Xaa3- QQYSSFPTT - Xaa4(SEQ ID NO: 494), u kojoj,

Xaa1predstavlja okvirni region bilo koje 23 aminokiseline;

Xaa2predstavlja okvirni region bilo kojih 15 aminokiselina;

Xaa3predstavlja okvirni region bilo koje 32 aminokiseline; i

Xaa4predstavlja okvirni region bilo kojih 10 aminokiselina.

[0252] Antitela obelodanjena u ovom tekstu mogu biti izvedena iz jednolančanih antitela, diantitela, domen-antitela, nano-antitela i uni-antitela. "Jednolančano antitelo" (engl. single chain antibody - scFv) se sastoji od jednog polipeptidnog lanca koji obuhvata VL domen povezan sa VH domenom, gde su VL domen i VH domen spareni tako da formiraju monovalentni molekul. Jednolančano antitelo može da se dobije prema postupku poznatom u stanju tehnike (videti, na primer, Bird i sar., (1988) Science 242:423-426 i Huston i sar., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). “Di-antitelo” se sastoji od dva lanca, od kojih svaki lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca spojen sa varijabilnim regionom lakog lanca na istom polipeptidnom lancu kratkom peptidnom sponom, gde se dva regiona na istom lancu ne sparuju međusobno već sa komplementarnim domenima na drugom lancu čime se obrazuje bispecifični molekul. Postupci za dobijanje di-antitela su poznati u stanju tehnike (Videti, npr, Holliger i sar., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, i Poljak i sar., (1994) Structure 2:1121-1123). Domen-antitela (dAbs) su male jedinice antitela, sposobne da se vezuju, koje odgovaraju varijabilnim regionima teških ili lakih lanaca antitela. Domenantitela se dobro eksprimiraju u bakterijama, kvascima, i sisarskim ćelijskim sistemima. Dalji detalji o domen-antitelima i postupcima za njihovo dobijanje su poznati u stanju tehnike (videti, na primer, U.S. Pat. Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; European Patents 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 i WO03/002609). Nano-antitela su dobijena iz teških lanaca antitela. Nano-antitelo obično sadrži pojedinačni varijabilni domen i dva konstantna domena (CH2 i CH3) i zadržava sposobnost vezivanja antigena izvornog antitela. Nano-antitela mogu da se dobiju prema postupcima poznatim u stanju tehnike (Videti npr, U.S. Pat. No.

6,765,087, U.S. Pat. No. 6,838,254, WO 06/079372). Uni-antitela se sastoje od jednog lakog lanca i jednog teškog lanca IgG4 antitela. Uni-antitela mogu da se dobiju uklanjanjem regiona zgloba iz IgG4 antitela. Dalji detalji o uni-antitelima i postupci za njihovo dobijanje mogu da se nađu u WO2007/059782.

Homologna antitela

[0253] U još jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji obuhvata aminokiselinske sekvence koje su homologne sa sekvencama opisanim u tabeli 1, i pomenuto antitelo se vezuje za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus) i zadržava željene funkcionalne osobine antitela opisanih u tabeli 1.

[0254] Na primer, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo (ili njegov funkcionalni fragment) koji obuhvata varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, i 375; varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, i 374; antitelo se vezuje za HER3 (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus) i neutralizuje signalnu aktivnost HER3, što se može meriti testom fosforilacije ili nekim drugim načinom merenja signalne aktivnosti HER (npr, fofo-HER3 testovi, fosfo-Akt testovi, ćelijska proliferacija i testovi blokiranja liganda, kao što je opisano u odeljku Primeri). U oblast predmetnog pronalaska, takođe su uključene parentalne nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca; i sekvence teškog i lakog lanca cele dužine, optimizovane za ekspresiju u sisarskim ćelijama. Ostala antitela pronalaska uključuju aminokiseline ili nukleinske kiseline koje su mutirane, ali i dalje imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, ili 98% procenata identičnosti sa sekvencama opisanim u prethodnom tekstu. U pojedinim primerima izvođenja, to uključuje mutirane aminokiselinske sekvence u kojima je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano putem delecija, insercija ili supstitucija aminokiselina u varijabilnim regionima u poređenju sa varijabilnim regionima navedenim u gore opisanim sekvencama.

[0255] U ostalim primerima izvođenja, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu da budu 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa sekvencama datim u tabeli 1. U ostalim primerima izvođenja, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu da budu identične osim aminokiselinskih supstitucija na ne više od 1,2,3,4 ili 5 aminokiselinskih položaja. Antitelo koje ima VH i VL regione sa visokim stepenom (tj, 80% ili više) identičnosti sa VH i VL regionima antitela opisanih u tabeli 1 može da se dobije mutagenezom (npr, mesto-specifičnom ili PCR-posredovanom mutagenezom), praćenom ispitivanjem očuvanja funkcije kodiranog izmenjenog antitela primenom ovde opisanih funkcionalnih testova.

[0256] U ostalim primerima izvođenja, nukleotidne sekvence varijabilnih regiona teškog lanca i/ili lakog lanca mogu da budu 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa gore opisanim sekvencama.

[0257] Kako se ovde koristi, “procenat identičnosti” između dve sekvence predstavlja funkciju broja identičnih položaja koje te sekvence dele (tj., % identičnosti je jednak broju identičnih položaja/ukupni broj položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina (engl. gap), i dužinu svake praznine, koja treba da bude uvedena zbog optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkih algoritama, kao što je opisano u primerima dalje u tekstu, ali bez ograničenja na njih.

[0258] Dodatno ili na drugi način, proteinske sekvence predmetnog pronalaska mogu dalje da se upotrebe kao “ispitujuća sekvenca” za pretraživanje javnih baza podataka u cilju, na primer, pronalaženja povezanih sekvenci. Na primer, takve pretrage mogu da se sprovedu upotrebom BLAST programa (verzija 2.0) prema Altschul i sar., (1990) J.Mol. Biol.215:403-10.

Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0259] U izvesnim primerima izvođenja, antitelo pronalaska ima varijabilni region teškog lanca koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, u kojima jedna ili više od ovih CDR sekvenci ima naznačene aminokiselinske sekvence zasnovane na ovde opisanim antitelima ili njihove konzervativne modifikacije, i gde antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine HER3-vezujućih antitela pronalaska.

[0260] U skladu sa tim, pronalazak obezbeđuje izolovano HER3 monoklonsko antitelo, ili njegov fragment, koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varijabilnog regiona lakog lanca koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, u kojima su: aminokiselinske sekvence CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, i 368, i njihove konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, i 369 i njihove konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, i 370 i njihove konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, i 371 i njihove konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372, i njihove konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, i 373, i njihove konzervativne modifikacije; antitelo ili njegov fragment specifično se vezuje za HER3, i neutralizuje HER3 aktivnost inhibicijom HER signalnog puta, što se može proceniti testom fosforilacije ili drugim načinima procene HER prenosa signala (npr, fosfo-HER3 testovi, fosfo-Akt testovi, ćelijska proliferacija i test blokiranja liganda, kao što je opisano u odeljku Primeri).

Antitela koja se vezuju za isti epitop

[0261] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja interaguju sa (npr, vezivanjem, sternim ometanjem, stabilizovanjem/destabilizovanjem, prostornom distribucijom) istim epitopom kao i HER3-vezujuća antitela opisana u tabeli 1 i na slici 7. Dodatna antitela mogu, prema tome da budu identifikovana na osnovu njihove sposobnosti unakrsne kompeticije (npr, da kompetitivno inhibiraju vezivanje, na statistički značajan način) sa ostalim antitelima pronalaska u testu za vezivanje HER3. Sposobnost ispitivanog antitela da inhibira vezivanje antitela predmetnog pronalaska za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus) pokazuje da ispitivano antitelo može da stupi u kompeticiju sa tim antitelom za vezivanje za HER3; takvo antitelo može, prema neograničavajućoj teoriji, da se veže za isti ili srodni (npr, strukturno sličan ili prostorno blizak) epitop na HER3 proteinu kao antitelo sa kojim je u kompeticiji. U određenom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje za isti epitop na HER3 kao antitela predmetnog pronalaska je humano monoklonsko antitelo. Takva humana monoklonska antitela se mogu dobiti i izolovati kao što je ovde opisano.

[0262] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njihovi fragmenti se vezuju i za domen 2 i za domen 4 u HER3 i održavaju HER3 u neaktivnoj konformaciji što sprečava izlaganje dimerizacione petlje prisutne u okviru domena 2. Ovo sprečava heterodimerizaciju sa drugim članovima familije, kao što su HER1, HER2 i HER4. Antitela ili njihovi fragmenti inhibiraju i ligand-zavisni i ligand-nezavisni HER3 prenos signala.

[0263] U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za domen 2 i za domen 4 u HER3 a da pri tome ne sprečava istovremeno vezivanje liganda, kao što je neuregulin, za HER3. Bez namere da se postavi teorija, moguće je da antitelo ili njegov fragment vezivanjem za domen 2 i domen 4 u HER3, održava HER3 u neaktivnoj konformaciji bez blokiranja mesta vezivanja liganda na HER3. Stoga HER3 ligand (npr, neuregulin) može da se veže za HER3 istovremeno sa antitelom ili njegovim fragmentom.

[0264] Antitela pronalaska ili njihovi fragmenti inhibiraju i ligand-zavisnu i -nezavisnu aktivaciju HER3 a da pri tome ne sprečavaju vezivanje liganda. To se smatra prednošću iz sledećih razloga:

(i) Terapijsko antitelo bi imalo klinički značaj kod širokog spektra tumora u odnosu na antitelo koje deluje samo jednim mehanizmom na HER3 aktivaciju (tj. ligand-zavisnim ili ligand-nezavisnim) budući da su različiti tipovi tumora pod uticajem svakog od ova dva mehanizma.

(ii) Terapijsko antitelo bi bilo efikasno u tipovima tumora gde su oba mehanizma HER3 aktivacije istovremeno zastupljena. Antitelo koje deluje samo na jedan mehanizam aktivacije HER3 (tj. ligand-zavisni ili ligand-nezavisni) bi ispoljilo malo ili nimalo efikasnosti kod takvih tipova tumora.

(iii) Manje je verovatno da bi efikasnost antitela koje inhibira ligand-zavisnu aktivaciju HER3, a da pri tome na sprečava vezivanje liganda, bila ugrožena povećanjem koncentracija liganda. Ovo bi vodilo ili povećanju efikasnosti kod tipa tumora pospešivanog veoma visokim koncentracijama HER3 liganda ili smanjenoj podložnosti otpornosti na lekove u slučajevima kada je ta otpornost posredovana ushodnom regulacijom HER3 liganda.

(iv) Antitelo koje inhibira aktivaciju HER3 tako što stabilizuje njegov neaktivni oblik bi bilo manje podložno otpornosti na lekove pokrenutoj alternativnim mehanizmima aktivacije HER3.

[0265] Kao posledica toga, antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje stanja kod kojih su postojeća terapijska antitela klinički neefikasna.

Projektovana i modifikovana antitela

[0266] Antitelo pronalaska dalje može da se dobije upotrebom antitela koje ima jednu ili više VH i/ili VL sekvenci koje su ovde prikazane kao početnog materijala za projektovanje i modifikovanje antitela, pri čemu modifikovano antitelo može da ima izmenjena svojstva u odnosu na početno antitelo. Antitelo može da bude projektovano modifikovanjem jednog ili više ostataka u jednom ili oba varijabilna regiona (tj, VH i/ili VL), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili jednom ili više okvirnih regiona. Dodatno ili alternativno, antitelo može da bude projektovano modifikovanjem ostataka u konstantnom(im) regionu(ima), na primer da bi se izmenila efektorska funkcija(e) antitela.

[0267] Jedan tip projektovanja varijabilnog regiona koji se može izvesti je kalemljenje CDR (engl. grafting). Antitela interaguju sa ciljnim antigenima predominantno putem aminokiselinskih ostataka koji su smešteni u šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) na teškom i lakom lanacu. Iz ovog razloga, kod različitih antitela, aminokiselinske sekvence u CDR-ovima se međusobno više razlikuju nego sekvence izvan CDR-ova. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu antitelo-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju osobine određenih prirodno prisutnih antitela putem konstruisanja ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz određenih prirodno prisutnih antitela kalemljenih na okvirne sekvence iz drugog antitela sa drugačijim osobinama (videti, npr, Riechmann i sar., (1998) Nature 332:323-327; Jones i sar., (1986) Nature 321:522-525; Queen i sar., (1989) Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; patentne prijave U.S. Patent No. 5,225,539 prema Winter, i U.S. Patent Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 prema Queen i sar.)

[0268] U skladu sa tim, sledeće izvođenje pronalaska se odnosi na izolovano HER3 vezujuće monoklonsko antitelo, ili njegov fragment, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, i 368; CDR2 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, i 369; CDR3 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, i 370, navedenim redom; i varijabilni region lakog lanca koji ima CDR1 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, i 371; CDR2 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372; i CDR3 sekvence koji se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, i 373, navedenim redom. Prema tome, takva antitela sadrže VH i VL CDR sekvence monoklonskih antitela, ali mogu da sadrže drugačije okvirne sekvence nego monoklonska antitela. Takve okvirne sekvence mogu da se pronađu u javnim bazama podataka DNK ili objavljenim referencama koje uključuju genske sekvence antitela germinativne linije. Na primer, DNK sekvence germinativne linije za humane gene varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu da se nađu u “Vase” bazi podataka humanih sekvenci germinativne linije (dostupna na Internetu na stranici www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), kao i kod Kabat i sar., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No.91-3242; Chothia i sar., (1987) J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia i sar., (1989) Nature 342:877-883; i Al-Lazikani i sar., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Tomlinson i sar., (1992) J. fol. Biol. 227:776-798; i Cox i sar., (1994) Eur. J Immunol.24:827-836.

[0269] Primer okvirnih (engl. framework) sekvenci za upotrebu u antitelima pronalaska su one koje su strukturno slične okvirnim sekvencama korišćenim u odabranim antitelima pronalaska, npr, konsenzus sekvence i/ili okvirne sekvence upotrebljene u monoklonskim antitelima pronalaska. CDR1, 2 i 3 sekvence VH regiona i CDR1, 2 i 3 sekvence VL regiona mogu da budu kalemljene na okvirne regione koji imaju identične sekvence kao one nađene u imunoglobulinskim genima germinativne linije od kojih okvirna sekvenca potiče, ili CDR sekvence mogu da budu kalemljene na okvirne regione koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama germinativne linije. Na primer, nađeno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati rezidue u okvirnim regionima da bi se održala ili pospešila antigen-vezujuća sposobnost antitela (videti npr, U.S. Patent Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 prema Queen et al).

[0270] Drugi tip modifikacije varijabilnog regiona je izazivanje mutacija aminokiselinskih ostataka u CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regionima VH i/ili VL, kako bi se poboljšala jedna ili više osobina vezivanja (npr, afinitet) antitela od interesa, poznato kao "sazrevanje afiniteta". Dirigovana mutageneza (mutageneza usmerena na određenui položaj) ili PCR-posredovana mutageneza može da bude izvedena kako bi se uvela mutacija(e) i efekat na vezivanje antitela, ili druge funkcionalne osobine od interesa, mogu se proceniti in vitro ili in vivo testovima kao što je ovde opisano i prikazano u odeljku Primeri. Konzervativne modifikacije (kao štoje razmatrano u prethodnom tekstu) mogu da budu uvedene. Mutacije mogu da budu aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije. Osim toga, obično su izmenjeni ne više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka u CDR regionu.

[0271] U skladu sa tim, u još jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovana HER3-vezujuća monoklonska antitela, ili njihov fragment, koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca koji ima: VH CDR1 region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja ima SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 i 368 ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 i 368; VH CDR2 region koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 i 369 ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, i 369; VH CDR3 region koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 i 370, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, i 370; VL CDR1 region koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 i 371, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, i 371; VL CDR2 region koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372; i VL CDR3 region koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 i 373, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, i 373.

Kalemljenje fragmenata antitela na alternativne okvirne sekvence ili nosače sekvence

[0272] Širok opseg varijanti okvirnih sekvenci ili nosača sekvence (engl. scaffolds) za antitelo/ imunoglobulin može da se koristi sve dok tako nastali polipeptid uključuje najmanje jedan vezujući region koji se specifično vezuje za HER3. Ovakve okvirne sekvence ili nosači sekvence uključuju pet glavnih idiotipova humanih imunoglobulina, ili njihove fragmente, i uključuju imunoglobuline drugih životinjskih vrsta, poželjno one koji imaju humanizovane oblike. Novije okvirne sekvence, nosači sekvence i fragmenti se i dalje otkrivaju i razvijaju od strane onih upoznatih sa stanjem tehnike.

[0273] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na dobijanje antitela koje nije zasnovano na imunoglobulinu upotrebom neimunoglobulinskih nosača na koje mogu da se nakaleme CDR-ovi pronalaska. Dosada poznate ili buduće neimunoglobulinske okvirne sekvence i nosači sekvence mogu da se koriste, sve dok uključuju vezujući region specifičan za ciljni HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus). Poznate neimunoglobulinske okvirne sekvence ili nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, fibronektin (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), ankirin (Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), domen-antitela (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, i Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), lipokalin (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), male modularne imuno-farmaceutike (Trubion Farmaceutskes Inc., Seattle, WA), maksi-antitela (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Protein A (Affibody AG, Sweden) i afilin (gama-kristalin ili ubikvitin) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).

[0274] Fibronektinski nosači se zasnivaju na fibronektin tip III domenu (npr, deseti element (engl. module) fibronektina tip III (10 Fn3 domen)). Fibronektin tip III domen ima 7 ili 8 beta lanaca koji su raspoređeni između dve beta naborane ravni, koje zauzimaju položaj jedna prema drugoj tako da obrazuju jezgro proteina, i osim toga sadrži petlje (analogne sa CDR-ovima) koje povezuju beta lance jedne sa drugima i izložene su rastvaraču. Postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča od beta naboranih ploča, gde ivica predstavlja granicu proteina normalnu na pravac beta lanaca (videti US 6,818,418). Ovi nosači zasnovani na fibronektinu ne predstavljaju imunoglobulin, mada je njihov celokupan sklop blisko povezan sa onim kod najmanjih funkcionalnih fragmenta antitela, varijabilnom regionu teškog lanaca, koji sadrži celi jedinicu za prepoznavanje antigena u IgG kamila i lama. Zbog ovakve strukture, neimunoglobulinsko antitelo oponaša antigen vezujuće osobine koje su slične po svojoj prirodi i afinitetu vezujućim osobinama antitela. Ovi nosači mogu da se koriste u strategiji mešanja i nasumičnog izbora petlji in vitro koja je slična procesu afinitetnog sazrevanja antitela in vivo. Ovi molekuli zasnovani na fibronektinu mogu da se koriste kao nosači tamo gde regioni petlje molekula mogu da budu zamenjeni CDR-ovima pronalaska primenom uobičajenih tehnika kloniranja.

[0275] Tehnoloogija ankirina je zasnovana na korišćenju proteina sa ponovljenim elementima izvedenim iz ankirina kao nosačima za varijabilne regione koji se mogu koristiti za vezivanje za različite ciljne molekule. Ponovljeni element ankirina je 33 aminokiseline dugačak polipeptid koji se sastoji od dva anti-paralelna α-heliksa i β-okreta. Vezivanje varijabilnih regiona se uglavnom optimizuje upotrebom ribozomalnog prikaza.

[0276] Avimeri su izvedeni iz prirodnih proteina koji sadrže A-domen kao što je HER3. Ovi domeni se u prirodi koriste u protein-protein interakcijama i kod čoveka je više od 250 proteina strukturno zasnovano na A-domenima. Avimeri se sastoje od brojnih različitih “A-domen” monomera (2-10) spojenih putem aminokiselinskih spona. Avimeri mogu da se dobiju tako da mogu da se vežu za ciljani antigen primenom postupka opisanog u, na primer, U.S. Patent Application Publication Nos. 20040175756; 20050053973; 20050048512; i 20060008844.

[0277] Afi-antitela afinitetni ligandi su mali, jednostavni proteini koji se sastoje od snopa od tri heliksa oslonjena na nosač jednog od IgG-vezujućih domena Proteina A. Protein A je površinski protein bakterije Staphylococcus aureus. Domen ovog nosača se sastoji od 58 aminokiselina, od kojih su 13 slučajno odabrane da stvore biblioteku afi-antitela sa velikim brojem varijanti liganda (Videti npr, patentnu prijavu US 5,831,012). Molekuli afi-antitela oponašaju antitela, i imaju molekulsku težinu od 6 kDa, u poređenju sa molekulskom težinom antitela, koja iznosi 150 kDa. Nasuprot njegovoj maloj veličini, mesto vezivanja molekula afiantitela je slično kao i kod antitela.

[0278] Antikalini su proizvodi koje je razvila kompanija Pieris ProteoLab AG. Oni su izvedeni iz lipokalina, široko rasprostranjene grupe malih i otpornih proteina koji su obično uključeni u fiziološki transport ili skladištenje hemijski osetljivih ili nerastvorljivih jedinjenja. Nekoliko prirodnih lipokalina se mogu naći u humanim tkivima ili telesnim tečnostima. Arhitektura proteina podseća na onu kod imunoglobulina sa hipervarijabilnim petljama na vrhu rigidne okvirne sekvence.

[0279] U svakom slučaju, nasuprot antitelima ili njihovim rekombinantnim fragmentima, lipokalini se sastoje od jednog polipeptidnog lanca sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, tako da su neznatno veći od pojedinačnog imunoglobulinskog domena. Grupa od četiri petlje, koje čine vezujući džep, pokazuje izraženu strukturnu savitljivost i dozvoljava različite bočne lance. Mesto vezivanja može prema tome da bude preoblikovano u patentiranom procesu kako bi prepoznavalo unapred određene ciljne molekule različitog oblika sa visokim afinitetom i specifičnošću. Jedan protein lipokalin familije, bilin-vezujući protein (BBP) leptira vrste Veliki kupusar (Pieris Brassicae) je iskorišćen za razvoj antikalina izazivanjem mutacija u grupu od četiri petlje. Jedan primer patentne prijave koja opisuje antikaline je PCT Publication No.WO 199916873.

[0280] Afilin molekuli su mali neimunoglobulinski proteini dizajnirani tako da ispoljavaju određeni afinitet prema proteinima i malim molekulima. Novi afilin molekuli mogu brzo da budu selektovani iz dve biblioteke, od kojih je svaka zasnovana na različitim proteinskim nosačima humanog porekla. Afilin molekuli ne pokazuju stukturnu homologiju sa imunoglobulinskim proteinima. Trenutno su u upotrebi dva nosača na bazi afilina, od kojih je jedan gama kristalin, humani strukturni protein sočiva oka, a drugi je član "ubikvitin" superfamilije proteina. Oba humana nosača su veoma mala, pokazuju visoku temperaturnu stabilnost i praktično su otporni na promene pH i denaturišuća sredstva. Ova izražena stabilnost je uglavnom posledica proširene strukture beta naborane ploče proteina. Primeri proteina izvedenih iz gama kristalina su opisani u patentnoj prijavi WO200104144 a primeri za "ubikvitinu slične" proteine su opisani u WO2004106368.

[0281] Mimetici proteinskih epitopa (engl. protein epitop mimetics - PEM) su srednje veličine, ciklični i peptidu slični molekuli (MW 1-2kDa) oponašajući sekundarnu strukturu beta-ukosnice proteina, najznačajniju sekundarnu strukturu uključenu u protein-protein interakcije.

[0282] U pojedinim primerima izvođenja, Fabs su prevedeni u tihi IgG1 oblik izmenom Fc regiona. Na primer, antitela u tabeli 1 mogu da budu prevedena u IgG oblik.

Humana ili humanizovana antitela

[0283] Predmetni pronalazak obezbeđuje potpuno humana antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus/miša/pacova). U poređenju sa himernim ili humanizovanim antitelima, humana HER3-vezujuća antitela pronalaska ispoljavaju dodatno smanjenu antigenost kada se primenjuju kod humanih ispitanika.

[0284] Humana HER3-vezujuća antitela mogu da se dobiju primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, “humaneering” tehnologija koja se primenjuje da bi se antitela koja nisu humanog porekla pretvorila u projektovana humana antitela. U.S. Patent Publication No.

20050008625 opisuje in vivo postupak za zamenu varijabilnog regiona antitela koje nema humano poreklo humanim varijabilnim regionom u antitelu pri čemu se zadržavaju iste ili dobijaju bolje osobine vezivanja u odnosu na početno ne-humano antitelo. Postupak se zasniva na epitopom vođenoj zameni varijabilnih regiona ne-humanog referentnog antitela potpuno humanim antitelom. Tako nastalo humano antitelo uglavnom nije strukturno slično referentnom ne-humanom antitelu, ali se vezuje za isti epitop na istom antigenu kao i referentno antitelo. Ukratko, pristup koji podrazumeva niz epitopom vođenih komplementarnih zamena je omogućen uspostavljanjem kompeticije u ćelijama između "kompetitora" i biblioteke različitih hibrida referentnog antitela ("test antitela") za vezivanje za ograničene količine antigena u prisustvu reporterskog sistema koji odgovara na vezivanje test antitela za antigen. Kompetitor može da bude referentno antitelo, ili njegov derivat kao što je jednolančani Fv fragment. Kompetitor takođe može da bude prirodni ili veštački ligand antigena koji se vezuje za isti epitop kao referentno antitelo. Jedini zahtev za kompetitor je taj da se vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo, i da stupa u kompeticiju sa referentnim antitelom za vezivanje za antigen. Test antitela imaju jedan antigen-vezujući V-region zajednički sa ne-humanim referentnim antitelom, i drugi V-region odabran slučajnim izborom iz različitih izvora kao što je biblioteka humanih antitela. Zajednički V-region iz referentnog antitela služi kao vodič, postavljajući test antitela na isti epitop na antigenu, i u istu prostornu orijentaciju, tako da je izbor usmeren na najveću doslednost u vezivanju antigena u odnosu na referentno antitelo.

[0285] Mnogo vrsta reporterskih sistema može da se koristi za detekciju željenih interakcija test antitela i antigena. Na primer, komplementrajući reporterski fragmenti mogu da budu vezani za antigen i test antitelo, navedenim redom, tako da se aktivacija reportera nakon komplementacije fragmenta događa samo kada se test antitelo veže za antigen. Kada su fuzije fragmenata test-antitelo i antigen-reporter koeksprimirane sa kompetitorom, aktivacija reportera postaje zavisna od sposobnosti test-antitela da se takmiči sa kompetitorom, a ona je proporcionalna afinitetu test-antitela prema antigenu. Drugi reporterski sistemi koji mogu da se koriste uključuju reaktivacioni sistem reaktivatora auto-inhibiranog reportera (engl. reactivation of auto-inhibited reporter - RAIR) kao što je prikazano u U.S. Patent Application Ser. No. 10/208,730 (Publication No. 20030198971), ili sistem kompetitivne aktivacije obelodanjen u U.S. Patent Application Ser. No.10/076,845 (Publication No.20030157579).

[0286] Primenom serije sistema epitopom vođenih zamena komplementarnosti, selekcijom dolazi do identifikacije ćelija koje eksprrimiraju pojedinačno test-antitelo zajedno sa kompetitorom, antigenom i reporterskim komponentama. U ovim ćelijama, svako test-antitelo stupa u kompeticiju jedan-na-jedan sa kompetitorom za vezivanje za ograničenu količinu antigena. Aktivnost reportera je proporcionalna količini antigena vezanog za test-antitelo, koja je, za uzvrat, proporcionalna afinitetu test-antitela prema antigenu i stabilnosti test-antitela. Test-antitela se početno selektuju na osnovu njihove aktivnosti u odnosu na aktivnost referentnog antitela kada je eksprimirano kao test-antitelo. Rezultat prvog ciklusa selekcije je grupa "hibridnih" antitela, od kojih sesvako sastoji od istog ne-humanog V-regiona iz referentnog antitela i humanog V-regiona iz biblioteke, i od kojih se svaki vezuje za isti epitop na antigenu kao i referentno antitelo. Jedno ili više hibridnih antitela odabranih u prvom ciklusu će imati afinitet prema antigenu koji se može porediti ili veći od afiniteta referentnog antitela.

[0287] U drugom koraku zamene V-regiona, humani V-regioni selektovani u prvom koraku se koriste kao vodič za selekciju zamene preostalih ne-humanih V-regiona referentnog antitela srodnim humanim V-regionima raznovrsne biblioteke. Hibridna antitela selektovana u prvom ciklusu mogu takođe da se koriste kao kompetitori za drugi ciklus selekcije. Rezultat drugog ciklusa selekcije je grupa u potpunosti humanih antitela koja se strukturno razlikuju od referentnog antitela, ali koja stupaju u kompeticiju sa referentnim antitelom za vezivanje za isti antigen. Neka od selektovanih humanih antitela se vezuju za isti epitop na istom antigenu kao i referentno antitelo. Među ovim selektovanim humanim antitelima, jedno ili više se vezuje za isti epitop sa afinitetom koji se može uporediti ili je veći od afiniteta referentnog antitela.

[0288] Korišćenjem mišjeg ili himernog HER3-vezujućeg antitela opisanog gore u tekstu kao referentnog antitela, ovaj postupak može pogodno da se upotrebi za dobijanje humanih antitela koja se vezuju za humani HER3 sa istom specifičnošću vezivanja i istim ili većim afinitetom vezivanja. Osim toga, takva humana HER3-vezujuća antitela mogu takođe da budu komercijalno nabavljena od kompanija koje uobičajeno proizvode humana antitela, npr, KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).

Antitela Kamelida

[0289] Proteini antitela dobijenih od članova familije kamila i dromedara (Camelus bactrianus i Calelus dromaderius) uključujući članove iz novog sveta kao što su različite vrste lama (Lama paccos, Lama glama i Lama vicugna) su okarakterisani po pitanju veličine, strukturne kompleksnosti i antigenosti za humane ispitanike. Određenim IgG antitelima kod ovih familija sisara, nađenim u prirodi, nedostaju laki lanci i zbog toga su strukturno udaljena od četvorolančane kvaternarne strukture sa dva teška i dva laka lanca, uobičajene za antitela ostalih životinja. Videti PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 objavljenu 3. marta 1994.).

[0290] Region antitela kamila koje predstavlja mali jednolančani varijabilni domen identifikovan kao VHH može da se dobije genetičkim inženjeringom da bi se dobio mali protein koji ima veliki afinitet za ciljani molekul, što za rezultat ima malu molekulsku težinu proteina izvedenog iz antitela poznat kao “kamilje nano-antitelo”. Videti U.S. patent broj 5,759,808 objavljen 2. juna 1998; videti takođe Stijlemans i sar., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin i sar., (2003) Nature 424:783-788; Pleschberger i sar., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo i sar., (2002) Int J Cancer 89:456-62; i Lauwereys i sar., (1998) EMBO J 17:3512-3520. Projektovane biblioteke kamiljih antitela i fragmenti antitela su komercijalno dostupni, na primer, kod Ablynx, Ghent, Belgium. (npr, US20060115470; Domantis (US20070065440, US20090148434). Kao i kod drugih antitela koja nisu humanog porekla, aminokiselinska sekvenca kamiljeg antitela može da bude rekombinantno izmenjena da bi se dobila sekvenca koja ima više sličnosti sa humanom sekvencom, tj., nano-antitelo može da bude “humanizovano”. Stoga prirodno niska antigenost antitela kamile za ljude može da bude dodatno smanjena.

[0291] Kamilja nano-antitela imaju molekulsku težinu približno jednoj desetini molekulske težine humanog IgG molekula, i protein fizički dijametar od svega nekoliko nanometara. Jedna posledica male veličine je to da kamilja nano-antitela mogu da se vežu za antigena mesta koja su funkcionalno nevidljiva za veće proteine antitela, tj., kamilja nano-antitela su korisna kao reagensi za otkrivanje antigena koji su drugačije skriveni kada se koriste uobičajene imunološke tehnike, i kao moguća terapijska sredstva. Prema tome, još jedna posledica male veličine molekula je ta da kamilja nano-antitela mogu da inhibiraju kao posledica vezivanja za specifično mesto u žljebu ili uskoj pukotini ciljanog proteina, i stoga mogu da posluže na način koji više liči na način delovanja uobičajenih lekova male molekulske težine nego uobičajeno antitelo.

[0292] Mala molekulska težina i kompaktna veličina dalje imaju za posledicu da su kamilja nano-antitela izrazito termostabilna, stabilna pri ekstremnom pH i prema proteolitičkoj razgradnji i slabo antigena. Sledeća posledica je ta da se kamilja nano-antitela lako kreću iz cirkulatornog sistema u tkiva, i čak prolaze krvno-moždanu barijeru i mogu da se koriste za lečenje poremećaja koji pogađaju nervno tkivo. Nano-antitela mogu dalje da olakšaju transport lekova kroz krvno-moždanu barijeru. Videti U.S. patent application 20040161738 objavljenu 19. avgusta 2004. Ove osobine zajedno sa niskom antigenošću za ljude ukazuju na veliki terapijski potencijal. Dalje, ovi molekuli mogu da budu u potpunosti eksprimirani u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli i eksprimiraju se kao fuzioni proteini sa bakteriofagom i funkcionalni su.

[0293] U skladu sa tim, odlika predmetnog pronalaska je kamilje antitelo ili nano-antitelo koje ima visok afinitet za HER3. U određenim ovde navedenim primerima izvođenja, kamilje antitelo ili nano-antitelo je prirodno proizvedeno u kamili, tj., dobijeno je od kamile nakon imunizacije sa HER3 ili njegovim peptidnim fragmentom, korišćenjem ovde opisanih tehnika za druga antitela. Na drugi način, HER3-vezujuća kamilja nano-antitela su projektovana, tj., proizvedena selekcijom na primer iz biblioteke faga koji ispoljavaju odgovarajuće mutirane proteine kamiljih nano-antitela korišćenjem postupka “paninga” (in vitro selekcije prema afinitetu) sa HER3 kao ciljnog molekula kao što je opisano u primerima u tekstu. Projektovana nano-antitela mogu dalje da se prilagode genetičkim inženjeringom da imaju polu-život u ispitaniku koji ih je primio od 45 minuta do dve nedelje. U određenom primeru izvođenja, kamilje antitelo ili nano-antitelo je dobijeno kalemljenjem CDR sekvenci teških ili lakih lanaca humanih antitela pronalaska u nano-antitela ili okvirne sekvence jednodomenskog antitela, kao što je opisano, na primer, u PCT/EP93/02214. U jednom primeru izvođenja, kamilje antitelo ili nano-antitelo se vezuje za najmanje jedan od sledećih HER3 ostataka : Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. U jednom primeru izvođenja, kamilje antitelo ili nano-antitelo se vezuje za najmanje jedan od sledećih HER3 ostataka : Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

Bispecifični molekuli i multivalentna antitela

[0294] U sledećem aspektu, prikazani pronalazak donosi biparatopske, bispecifične ili multispecifične molekule koji obuhvataju HER3-vezujuće antitelo predmetnog pronalaska, ili njegov fragment. Antitelo pronalaska, ili njegovi fragmenti, može da bude izmenjeno ili povezano sa drugim funkcionalnim molekulom, npr, drugim peptidom ili proteinom (npr, drugim antitelom ili ligandom za receptor) da bi se dobio bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljna molekula. Antitelo pronalaska može u stvari da bude izmenjeno ili povezano sa više od jednim dodatnim funkcionalnim molekulom da bi se dobili biparatopski ili multi-specifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljna molekula; tj. biparatopski ili multi-specifični molekuli. Da bi se dobio bispecifični molekul pronalaska, antitelo pronalaska može da bude funkcionalno povezano (npr, hemijskim sprezanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) sa jednim ili više dodatnih vezujućih molekula, kao što je dodatno antitelo, fragment antitela, peptidni ili vezujući mimetik, što za rezultat ima dobijanje bispecifičnog molekula.

[0295] Dalje kliničke koristi mogu da se obezbede vezivanjem dva ili više antigena unutar jednog antitela (Coloma i sar., (1997); Merchant i sar., (1998); Alt i sar., (1999); Zuo i sar., (2000); Lu i sar., (2004); Lu i sar., (2005); Marvin i sar., (2005); Marvin i sar., (2006); Shen i sar., (2007); Wu i sar., (2007); Dimasi i sar., (2009); Michaelson i sar., (2009)). (Morrison i sar., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt i sar. (1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuo i sar., (2000) Protein Engineering 13:361-367; Lu i sar., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu i sar., (2005) JBC 280:19665-19672; Marvin i sar., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin i sar., (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen i sar., (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wu i sar., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi i sar., (2009) J Mol Biol.393:672-692; i Michaelson i sar., (2009) mAbs 1:128-141.

[0296] Bispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu da budu dobijeni konjugovanjem konstituenata koji određuju specifičnost vezivanja, primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, svaki konstituenat koji određuje specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može da bude proizveden odvojeno i zatim konjugovan sa drugim. Kada su konstituenati specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, raznovrsna sredstva za sprezanje ili stvaranje unakrsnih veza (engl. cross-linking) mogu da budu upotrebljena za kovalentno sprezanje. Primeri unakrsno-vezujućih sredstava uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-l-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti npr, Karpovsky i sar., (1984) J. Exp. Med.160:1686; Liu i sar., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Ostali postupci uključuju one opisane kod Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No.

78:118-132; Brennan i sar., (1985) Science 229:81-83), i Glennie i sar., (1987) J. Immunol.

139: 2367-2375). Sredstva za sprezanje su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna kod Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0297] Kada su konstituenati specifičnosti vezivanja antitela, ona mogu da budu spregnuta sulfhidrilno-posredovanim vezivanjem C-terminalnih regiona zgloba dva teška lanca. U određenom primeru izvođenja, region zgloba je, pre reakcije sprezanja, izmenjen tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, na primer jedan.

[0298] U drugom slučaju, oba konstituenta specifičnosti vezivanja mogu da budu kodirana istim vektorom i eksprimirana i sklopljena u istoj ćeliji-domaćinu. Ovaj postupak je naročito koristan kada je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični molekul pronalaska može da bude jednolančani molekul koji obuhvata antitelo sastavljeno od jednog lanca i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji obuhvata dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za dobijanje bispecifičnih molekula su opisani na primer u U.S. Patent No 5,260,203; U.S. Patent No. 5,455,030; U.S. Patent No.

4,881,175; U.S. Patent No.5,132,405; U.S. Patent No.5,091,513; U.S. Patent No.5,476,786; U.S. Patent No.5,013,653; U.S. Patent No.5,258,498; i U.S. Patent No.5,482,858.

[0299] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljne molekule može da bude potvrđeno primenom, na primer, enzimskog imunosorbentnog testa (engl. enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA), radioimunoeseja (engl. radioimmunoassay - REA), ćelijskog sortiranja aktiviranog fluorescencijom (engl. Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS analiza), biološkim testovima (engl. bioassay) (npr, inhibicija rasta), ili Western Blot testom. Svaki od ovih testova uopšteno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od naročitog interesa upotrebom obeleženog reagensa (npr, antitela) specifičnog za kompleks koji se traži.

[0300] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje multivalentna jedinjenja koja obuhvataju najmanje dva identična ili različita fragmenta antitela pronalaska koja se vezuju za HER3. Fragmenti antitela mogu da budu povezani preko proteinske fuzije ili kovalentne ili nekovalentne veze. Tetravalentna jedinjenja mogu da budu dobijena, na primer, unakrsnim povezivanjem antitela povezivanjem antitela pronalaska sa antitelom koje se vezuje za konstantne regione antitela pronalaska, na primer Fc ili region zgloba. Trimerni domeni su opisani na primer u Borean patent EP 1012280B1. Pentamerni elementi su opisani na primer u PCT/EP97/05897.

[0301] U jednom primeru izvođenja, biparatopski/bispecifični molekul se vezuje za aminokiselinske rezidue u okviru domena 2 i domena 4 u HER3.

[0302] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na antitela sa dvjnom ulogom kod kojih je pojedinačno monoklonsko antitelo izmenjeno tako da se mesto vezivanja antigena vezuje za više od jednog antigena, kao što je dvojna uloga antitela koje se vezuje i za HER3 i za još jedan antigen (npr, HER1, HER2, i HER4). U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na antitelo sa dvojnom ulogom koje ima za cilj antigene sa istom konformacijom, na primer antigen koji ima istu konformaciju kao HER3 u “zatvorenom” ili “neaktivnom” stanju. Primeri antigena sa istom konformacijom kao HER3 u “zatvorenom” ili “neaktivnom” stanju uključuju, ali nisu ograničeni na, HER1 i HER4. Prema tome, antitelo sa dvojnom ulogom može da se veže za oba HER3 i HER1; HER3 i HER4, ili HER1 i HER4. Specifičnost dvojnog vezivanja antitela sa dvojnom ulogom može dalje da se prenese na dvojn aktivnost, ili inhibiciju aktivnosti. (Videti npr, Jenny Bostrom i sar., (2009) Science: 323; 1610-1614).

Antitela sa produženim polu-životom

[0303] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za HER3 protein koja imaju produženi polu-život in vivo.

[0304] Mnogi faktori mogu da utiču na polu-život proteina in vivo. Na primer, filtracija u bubrezima, metabolizam u jetri, razgradnja proteolitičkim enzimima (proteazama) i imunološki odgovori (npr, neutralizacija proteina antitelima i resorpcija od strane makrofaga i dentritskih ćelija). Različite strategije mogu da se koriste za produženje polu-života antitela predmetnog pronalaska. Na primer, hemijskom vezom sa polietileneglikolom (PEG), reCODE PEG, nosačem antitela, polisijalinskom kiselinom (PSA), hidroksietil skrobom (HES), albumin-vezujućim ligandima, i ugljovodoničnim zaštitnim grupama; genetičkom fuzijom sa proteinima koji se vezuju sa serumskim proteinima, kao što je albumin, IgG, FcRn, i transferin; sprezanjem (genetički ili hemijski) sa drugim veziujućim reziduema (grupama) koji se vezuju za proteine seruma, kao što su nano-antitela, Fab-ovi, dizajnirani ankirin ponavljajući proteini (engl. designed ankyrin repeat proteins – DARPins), avimeri, afi-antitela i antikalini; genetičkom fuzijom sa rPEG, albuminom, domenom albumina, albuminvezujućim proteinima i Fc; ili ugrađivanjem u nanonosače, formulacije sa sporim oslobađanjem ili medicinska sredstva za primenu.

[0305] Da bi se produžilo cirkulisanje antitela u serumu in vivo, inertni polimerni molekuli kao što je PEG visoke molekularne težine može da bude pripojen antitelu ili njegovom fragmentu sa ili bez multifunkcionalne spone bilo putem mesto-specifične konjugacije PEG sa N- ili C-terminalnim delom antitela ili preko epsilon-amino grupa prisutnih na lizinskim reziduama. Da bi se pegilovalo antitelo, antitelo, ili njegov fragment, uobičajeno reaguje sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa pripaja antitelu ili fragmentu antitela. Pegilacija može da bude sprovedena reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom koji je rastvorljiv u vodi). Kako se ovde koristi, izraz "polietilen glikol" obuhvata bilo koji oblik PEG koji se koristi za dobijanje derivata drugih proteina, kao što je mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim primerima izvođenja, antitelo namenjeno za pegilaciju je aglikozilovano antitelo. Derivatizacija linearnog ili razgranatog polimera koja dovodi do najmanjeg mogućeg gubitka biološke aktivnosti će biti korišćena. Stepen sprezanja može da bude pažljivo praćen primenom SDS-PAGE i masene spektrometrije kako bi se osiguralo pravilno sprezanje PEG molekula sa antitelima. Neizreagovali PEG može da bude odvojen od antitelo-PEG konjugata primenom hromatografije za razdvajanje na osnovu veličine čestica (engl. size-exclusion) ili jono-izmenjivačke hromatografije. Kod PEG-derivatizovanih antitela može da se ispita aktivnost vezivanja kao i in vivo efikasnost primenom postupaka dobro poznatih onima upoznatim sa stanjem tehnike, na primer, primenom ovde opisanih imunoeseja. Postupci za pegilaciju proteina su poznati u stanju tehnike i mogu da budu primenjeni na antitela pronalaska. Videti na primer, EP 0154 316 od Nishimura i sar. i EP 0401 384 od Ishikawa i sar.

[0306] Ostale modifikovane tehnike pegilacije uključuju “reconstituting chemically orthogonal directed engineering” tehnologiju (ReCODE PEG), postupak kod koga se hemijski specifični bočni lanci ugrađuju u biosintetičke proteine putem rekonstituisanih sistema koji uključuju tRNA sintetazu i tRNA. Ova tehnologija omogućava ugrađivanje više od 30 novih aminokiselina u biosintetičke proteine u E.coli, kvascima i sisarskim ćelijama. tRNA ugrađuje ne-nativne aminokiseline na bilo kom položaju na kome se nalazi amber kodon, prevodeći amber iz stop kodona u onaj koji signalizira ugradnju hemijski specifične aminokiseline.

[0307] Rekombinantna pegilaciona tehnologija (rPEG) takođe može da se koristi za produženje polu-života u serumu. Ova tehnologija uključuje genetičko fuzionisanje 300-600 aminokiselina nestrukturiranog proteinskog repa sa postojećim farmaceutskim proteinom. Budući da je molekulska težina takvog nestrukturiranog proteinskog lanca je oko 15 puta veća od njegove stvarne molekulske težine, polu-život proteina u serumu je značajno povećan. Nasuprot uobičajenoj PEGilaciji, koja zahteva hemijsko sprezanje i ponovno prečišćavanje, proces dobijanja je značajno pojednostavljen i proizvod je homogen.

[0308] Polisijalizacija je još jedna tehnologija, koja koristi prirodnu polimernu polisijalinsku kiselinu (PSA) za produžavanje aktivnog života i poboljšanje stabilnosti terapijskih peptida i proteina. PSA je polimer sijalinske kiseline (šećer). Kada se koristi za isporuku leka u vidu proteina i terapijskog peptida, polisijalinska kiselina obezbeđuje zaštitno mikrookruženje za reakciju konjugacije. Ovo povećava aktivni život terapijskog proteina u cirkulaciji i sprečava da on bude prepoznat od strane imunog sistema. PSA polimer se prirodno nalazi u ljudskom telu. Određene bakterije koje su evoluirale tokom miliona godina su obavile svoje zidove njime. Ove bakterije prirodno ovavijene polisijalinom su tada postale sposobne da, molekulskom mimikrijom, zavaraju odbrambeni sistem tela. PSA, tehnologija skrivanja koja potiče iz prirode, može da bude lako dobijena iz bakterija u velikim količinama i sa unapred određenim fizičkim karakteristikama. Bakterijska PSA je u potpunosti neimunogena, čak i kada se kupluje sa proteinima, jer je hemijski istovetna sa PSA ljudskog tela.

[0309] Sledeća tehnologija uključuje upotrebu derivata hidroksietil skroba (“HES”) vezanih za antitela. HES je izmenjeni prirodni polimer izveden iz voštanog kukuruznog skroba i može da bude metabolizovan enzimima tela. Rastvori HES-a se obično primenjuju za nadoknađivanje određene zapremine krvi i za poboljšanje reoloških osobina krvi. Dodavanje HES (engl. hesylation) antitelu omogućava produžavanje polu-života u cirkulaciji povećanjem stabilnosti molekula, kao i smanjenjem bubrežnog klirensa, što za rezultat ima povećano biološko delovanje. Menjanjem različitih parametara, kao što je molekulska težina HES-a, konjugati HES- antitelo se mogu prilagođavati potrebama.

[0310] Antitela koja imaju produžen polu-život in vivo mogu takođe da budu proizvedena uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih modifikacija (tj., supstitucija, insercija ili delecija) u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno fragment Fc ili domena zgloba u Fc). Videti, npr, International Publication No. WO 98/23289; International Publication No. WO 97/34631; i U.S. Patent No.6,277,375.

[0311] Dalje, antitela mogu da budu konjugovana sa albuminom u cilju dobijanja antitela ili fragmenta antitela koji je stabilniji in vivo ili ima duži polu-život in vivo. Tehnike su dobro poznate u stanju tehnike, videti, npr, International Publication Nos. WO 93/15199, WO 93/15200, i WO 01/77137; i European Patent No. EP 413,622.

[0312] HER3 antitelo ili njegov fragment mogu takođe da budu fuzionisani sa jednim ili više polipeptida humanog serum albumina (HSA), ili sa jednim njihovim delom. HSA, protein od 585 aminokiselina u zrelom obliku, je odgovoran za značajan deo osmotskog pritiska seruma i takođe ima ulogu nosača endogenih i egzogenih liganda. Uloga albumina kao molekula nosača i njegova inertna priroda su poželjne osobine za njegovo korišćenje kao nosača i transportera polipeptida in vivo. Upotreba albumina kao komponente albumin fuzionog proteina kao nosača za različite proteine je predložena u WO 93/15199, WO 93/15200, i EP 413 622. Upotreba N-terminalnih fragmenata HSA za fuzionisanje sa polipeptidima je takođe predložena (EP 399 666). U skladu sa tim, genetičkim ili hemijskim fuzionisanjem ili konjugovanjem antitela ili njihovih fragmenata sa albuminom, može se stabilizovati ili produžiti polu-život, i/ili zadržati aktivnost molekula tokom produženog perioda vremena u rastvoru, in vitro i/ili in vivo.

[0313] Fuzionisanje albumina sa drugim proteinom može da se postigne genetskom manipulacijom, takvom da se DNK koja kodira HSA, ili njegov fragment, spoji sa DNK koja kodira protein. Zatim se sprovodi transformacija ili transfekcija odgovarajućeg domaćina sa fuzionisanom nukleotidnom sekvencom, tako aranžiranom na pogodnom plazmidu da eksprimira fuzioni polipeptid. Ekspresija može da se postigne in vitro u, na primer, prokariotskim ili eukariotskim ćelijama, ili in vivo npr. u transgenim organizmima. Dodatni postupci koji se odnose na fuzionisanje HSA mogu da se nađu, na primer, u WO 2001077137 i WO 200306007. U određenom primeru izvođenja, ekspresija fuzionog proteina se izvodi u sisarskim ćelijskim linijama, na primer, CHO ćelijskim linijama. Izmenjeno diferencialno vezivanje antitela za receptor na niskim ili visokim pH vrednostima je takođe obuhvaćeno oblašću pronalaska. Na primer, afinitet antitela može da se izmeni tako da ono ostaje vezano za svoj receptor na niskom pH, npr, niskom pH unutar lizozoma, izmenom antitela tako da uključuje dodatne aminokiseline kao što je histin u CDR regionu antitela (Videti npr, Tomoyuki Igawa i sar. (2010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207).

Konjugati antitela

[0314] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji se specifično vezuju za HER3 protein rekombinantno fuzionisan ili hemijski konjugovan (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) sa heterologim proteinom ili polipeptidom (ili njegovim fragmentom, poželjno sa polipeptidom od najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 aminokiselina) da se dobiju fuzioni proteini. Naročito, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine koji obuhvataju ovde opisan fragment antitela (npr, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, F(ab)2 fragment, VH domen, VH CDR, VL domen ili VL CDR) i heterologi protein, polipeptid, ili peptid. Postupci fuzinisanja ili konjugovanja proteina, polipeptida, ili peptida sa antitelom ili fragmentom antitela su poznati u stanju tehnike. Videti, npr, U.S. Patent Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, i 5,112,946; European Patent Nos. EP 307,434 i EP 367,166; International Publication Nos. WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi i sar., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng i sar., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; i Vil i sar., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.

[0315] Dodatni fuzioni proteini mogu da budu proizvedeni primenom tehnika “mešanja” gena, motiva, egzona, i/ili kodona (pod zajedničkim nazivom “mešanje DNA”). Mešanje DNA može biti upotrebljeno za menjanje aktivnosti antitela pronalaska ili njihovih fragmenata (npr, antitela ili njihovi fragmenti sa većim afinitetima i nižim stopama disocijacije). Videti, uopšteno, U.S. Patent Nos.5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, i 5,837,458; Patten i sar., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson i sar., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; i Lorenzo i Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313. Antitela ili njihovi fragmenti, ili kodirana antitela ili njihovi fragmenti, mogu biti izmenjeni podvrgavanjem nasumičnoj mutagenezi primenom metode PCR sklone greškama (engl. error-prone), nasumičnom insercijom nukleotida ili drugim postupcima pre rekombinacije. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za HER3 protein može da se rekombinuje sa jedanim ili više komponenti, motiva, sekcija, delova, domena, fragmenata, itd. jednog ili više heterologih molekula.

[0316] Osim toga, antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu fuzionisani sa marker sekvencama, kao što je peptid kako bi se olakšalo prečišćavanje. U poželjnim primerima izvođenja, marker aminokiselinska sekvenca je heksa-histidinski peptid, kao što je tag peptid obezbeđen u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), između ostalih, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Kako je opisano kod Gentz i sar., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, na primer, heksa-histidin obezbeđuje pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Ostali peptidni tag-ovi korisni za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, hemaglutinin (“HA”) tag, koji odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina virusa gripa (Wilson i sar., (1984) Cell 37:767), i “flag” tag.

[0317] U drugim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska ili njihovi fragmenti konjugovani su sa dijagnostičkim sredstvom ili sredstvom za detekciju. Takva antitela mogu da budu korisna za praćenje ili predviđanje početka, razvoja, napredovanja i/ili ozbiljnosti bolesti ili poremećaja kao dela procedure kliničkog ispitivanja, kao što je određivanje efikasnosti određene terapije. Takva dijagnostika i detekcija može buti obavljena sprezanjem antitela sa supstancama koje mogu da se detektuju uključujući, ali bez ograničenja na, različite enzime, kao što je, ali bez ograničenja na, peroksidaza rena, alkalna fosfataza, betagalaktozidaza, ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što je, ali bez ograničenja na, streptavidin-biotin i avidin/biotin; fluorescentni materijali, kao što je, ali bez ograničenja na, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocinat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentni materijali, kao što je, ali bez ograničenja na, luminol; bioluminescentni materijali, kao što je, ali bez ograničenja na, luciferaza, luciferin i ekvorin; radioaktivni materijali, kao što je, ali bez ograničenja na, jod (<131>I,<125>I,<123>I, i<121>I,), ugljenik (14C), sumpor (35S), tricijum (3H), indijum (115In, 113In, 112In, i 111In,), tehnicijum (99Tc), talijum (201Ti), galijum (68Ga, 67Ga), paladijum (103Pd), molibden (99Mo), ksenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, i 117Tin; i metali koji emituju pozitrone korišćenjem različitih pozitron emisionih tomografija, i neradioaktivne paramagnetne jone metala.

[0318] Predmetni pronalazak dalje obuhvata upotrebu antitela ili njihovih fragmenata konjugovanih sa terapijskom grupom. Antitelo ili njegov fragment može da bude konjugovan sa terapijskom grupom kao što citotoksin, npr, citostatsko ili citocidno sredstvo, terapijsko sredstvo ili radioaktivni metalni jon, npr, alfa-emiteri. Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje je štetno za ćelije.

[0319] Osim toga, antitelo ili njegov fragment može da bude konjugovano sa terapijskom grupom ili grupom leka koja menja dati biološki odgovor. Terapijske grupe ili grupe čeka ne moraju da budu konstruisane pod ograničenjima koja važe za uobičajena hemijska terapijska sredstva. Na primer, grupa leka može da bude protein, peptid, ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, toksin kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, toksin kolere, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, α-interferon, β-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta izveden iz trombocita, tkivni aktivator plazminogena, apoptotsko sredstvo, anti-angiogenezno sredstvo; ili, modifikator biološkog odgovora kao što je, na primer, limfokin. U jednom primeru izvođenja, anti-HER3 antitelo, ili njegov fragment, konjugovan sa terapijskom grupom, kao što je citotoksin, lek (npr, imunosupresor) ili radiotoksin. Takvi konjugati se ovde nazivaju “imunokonjugati”. Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina se ovde nazivaju “imunotoksini.” Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje oštećuje (npr, ubija) ćelije. Primeri uključuju takson, citohalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, t. kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi-antracin-dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1 -dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapijska sredstva takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr, metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), ablaciona sredstva (npr, mehloretamin, tiotepa hlorambucil, meifalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin, antraciklini (npr, daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (npr, daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), i anti-mitotička sredstva (npr, vinkristin i vinblastin). (Videti npr, Seattle Genetics US20090304721).

[0320] Ostali primeri terapijskih citotoksina koji mogu da budu konjugovani sa antitelom pronalaska uključuju duokarmicine, kaliheamicine, maitansine i auristatine i njihove derivate. Primer kaliheamicin-antitelo konjugata je komercijalno dostupan (MylotargTm; Wyeth-Ayerst).

[0321] Citotoksini mogu da budu konjugovani sa antitelima pronalaska primenom tehnologije spojnica (engl. linker) dostupnom u stanju tehnike. Primeri tipova spojnica koje su korišćene za konjugovanje citotoksina sa antitelom uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i spojnice koje sadrže peptide. Spojnica može da bude izabrana tako da, na primer, bude podložna isecanju na niskom pH unutar lizozomalnog odeljka ili podložna isecanju proteazama, kao što su proteaze prvenstveno eksprimirane u tumorskom tkivu kao što su katepsini (npr, katepsini B, C, D).

[0322] Za dalju diskusiju o tipovima citotoksina, spojnica i postupaka za konjugovanje terapijskih sredstva sa antitelima, videti takođe Saito i sar., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.

55:199-215; Trail i sar., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan i Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter i Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.

53:247-264.

[0323] Antitela predmetnog pronalaska takođe mogu da budu konjugovana sa radioaktivnim izotopom da bi se dobili citotoksični radiofarmaceutici, nazvani i radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji mogu da budu konjugovani sa antitelima za primenu u dijagnostici ili lečenju uključuju, ali nisu ograničeni na, jod<l31>, indijum<111>, itrijum<90>, i lutecijum177. Postupci za dobijanje radioimunkonjugata su uspostavljeni u stanju tehnike. Primeri radioimunokonjugata su komercijalno dostupni, uključujući Zevalin<TM>(DEC Farmaceutskes) i BexxarTM (Corixa Farmaceutskes), i slični postupci mogu da se koriste za dobijanje radioimunokonjugata upotrebom antitela pronalaska. U određenim primerima izvođenja, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N’,N’’,N’’’-tetra sirćetna kiselina (DOTA) koja može da bude pridodata antitelu preko linker molekula. Takvi linker molekuli su opšte poznati u stanju tehnike i opisani kod Denardo i sar., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson i sar., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; i Zimmerman i sar., (1999) Nucl. Med. Biol.26(8):943-50.

[0324] Tehnike za konjugovanje terapijskih grupa sa antitelima su dobro poznate, videti, npr, Arnon i sar., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antitela And Cancer Therapy, Reisfeld i sar. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i sar., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson i sar. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i sar. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i sar. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe i sar., (1982) Immunol. Rev. 62:119-58.

[0325] Antitela mogu takođe da budu pripojena čvrstim nosačima, koji su posebno korisni za imunoeseje ili prečišćavanje ciljanog antigena. Takvi čvrsti nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.

Kombinacije antitela

[0326] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na HER3 antitela, ili njihove fragmente pronalaska, korišćena sa drugim terapijskim sredstvima kao što su druga antitela, inhibitori malog molekula, mTOR inhibitori ili inhibitori PI3-kinaza. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:

HER1 inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa HER1 inhibitorima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuksimab (Imclone), Vectibix® /Panitumumab (Amgen), mAb 806, i Nimotuzumab (TheraCIM), Iressa® /Gefitinib (Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (Pfizer), Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline), Tykerb® /Lapatinib Ditosilat (SmithKlineBeecham), Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774) (OSI Pharma), i PKI-166 (Novartis), i N-[4-[(3-Hloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3''S'')-tetrahidro-3-furanil]oksi]-6-kvinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamid, koji se prodaje pod zaštićenim imenom Tovok® by Boehringer Ingelheim).

HER2 inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa HER2 inhibitorima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Pertuzumab (koji se prodaje pod zaštićenim imenom Omnitarg®, Genentech), Trastuzumab (koji se prodaje pod zaštićenim imenom Herceptin®, Genentech/Roche), MM-111, neratinib (takođe poznat kao HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-hloro-4-[(piridin-2-il)metoksi]fenil]amino]-3-cijano-7-etoksikvinolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2-enamid, i opisan u patentnoj prijavi PCT Publication No. WO 05/028443), lapatinib ili lapatinib ditosilat (koji se prodaje pod zaštićenim imenom Tykerb®, GlaxoSmithKline).

HER3 inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa HER3 inhibitorima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech), i malim molekulima koji inhibiraju HER3.

HER4 inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa HER4 inhibitorima.

PI3K inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa inhibitorima PI3 kinaze koji uključuju, ali nisu ograničeni na, 4-[2-(1H-Indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazin-1-il]metil]tieno[3,2-d]pirimidin-4-il]morfolin (takođe poznat kao GDC 0941 i opisan u PCT Publication Nos. WO 09/036082 i WO 09/055730), 2-Metil-2-[4-[3-metil-2-okso-8-(kvinolin-3-il)-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]kvinolin-1-il]fenil]propionitril (takođe poznat kao BEZ 235 ili NVP-BEZ 235, i opisan u PCT Publication No. WO 06/122806), BMK120 i BYL719.

mTOR inhibitori: HER3 antitela ili njihovi fragmenti mogu da budu primenjeni sa mTOR inhibitorima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Temsirolimus (koji se prodaje pod zaštićenim imenom Torisel®, Pfizer), ridaforolimus (ranije poznat kao deferolimus, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroksi-19,30-dimetoksi-15,17,21,23,29,35-heksametil-2,3,10,14,20-pentaokso-11,36-dioksa-4-azatriciklo[30.3.1.04,9] heksatriakonta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoksicikloheksil dimetilfosfinat, takođe poznat kao Deforolimus, AP23573 i MK8669 (Ariad Pharm.), i opisan u PCT Publication No. WO 03/064383), everolimus (RAD001) (koji se prodaje pod zaštićenim imenom Afinitor® by Novartis). Jedno ili više terapijskih sredstava mogu da se primene ili istovremeno ili pre ili posle primene HER3 antitela ili njegovog fragmenta predmetnog pronalaska.

Postupci za dobijanje antitela pronalaska

(i) Nukleinske kiseline koje kodiraju antitela

[0327] Pronalazak obezbeđuje suštinski prečišćene molekule nukleinske kiseline koja kodira polipeptide koji sadrže segmente ili domene lanaca HER3-vezujućeg antitela koji su opisani u prethodnom tekstu. Neke od nukleinskih kiselina pronalaska obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca HER3 antitela, i/ili nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca. U određenom primeru izvođenja, molekuli nukleinske kiseline su kao što je navedeno u tabeli 1. Neki drugi molekuli nukleinske kiseline pronalaska sadrže nukleotidne sekvence koje su suštinski istovetne sa (npr, najmanje 65, 80%, 95%, ili 99%) nukleotidnim sekvencama koje su navedene u tabeli 1. Kada se eksprimiraju sa odgovarajućih ekspresionih vektora, polipeptidi kodirani ovim polinukleotidima mogu da ispoljavaju HER3 antigen-vezujuću sposobnost.

[0328] Pronalazak isto tako obezbeđuje i polinukleotide koji kodiraju najmanje jedan CDR region i obično sva tri CDR regiona teškog ili lakog lanca HER3-vezujućeg antitela opisanog u prethodnom tekstu. Neki drugi polinukleotidi kodiraju sve ili suštinski sve varijabilne regione sekvence teškog lanca i/ili lakog lanca HER3-vezujućeg antitela opisanog u prethodnom tekstu. Zbog degeneracije koda, raznovrsne sekvence nukleinske kiseline će kodirati svaku od imunoglobulinskih aminokiselinskih sekvenci.

[0329] Molekuli nukleinske kiseline pronalaska mogu da kodiraju i varijabilni region i konstantni region antitela. Neke od sekvenci nukleinske kiseline pronalaska sadrže nukleotide koji kodiraju zreli oblik sekvence varijabilnog regiona teškog lanca koja je suštinski istovetna (npr, najmanje 80%, 90%, ili 99%) sa zrelim oblikom sekvence varijabilnog regiona teškog lanca HER3 antitela opisanim u tabeli 1. Neke druge sekvence nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide koji kodiraju zreli oblik sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koji je suštinski istovetan (npr, najmanje 80%, 90%, ili 99%) sa zrelim oblikom sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca HER3 antitela navedenim u tabeli 1.

[0330] Polinukleotidne sekvence mogu da se dobiju putem de novo DNA sintze na čvrstoj fazi ili pomoću PCR mutageneze postojeće sekvence (npr, sekvence kao što je opisano u odeljku Primeri u daljem tekstu) koja kodira HER3-vezujuće antitelo ili njegov vezujući fragment. Direktna hemijska sinteza nukleinskih kiselina može da bude ostvarena primenom postupka poznatog u stanju tehnike, kao što je postupak koji uključuje fosfotriestar prema Narang i sar., (1979) Meth. Enzymol. 68:90; postupak koji uključuje fosfodiestar prema Brown i sar., (1979) Meth. Enzymol. 68:109; postupak koji uključuje dietilfosforamidit prema Beaucage i sar., (1981) Tetra. Lett., 22:1859; i postupak sa čvrstom potporom prema U.S. Patent No.

4,458,066. Uvođenje mutacija u polinukleotidnu sekvencu pomoću PCR tehnike može da bude urađeno kao što je opisano u, npr, PCR Technology: Principles i Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods i Applications, Innis i sar. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila i sar., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; i Eckert i sar., (1991) PCR Methods i Applications 1:17.

[0331] Pronalazak takođe obezbeđuje ekspresione vektore i ćelije-domaćine za dobijanje HER3-vezujućih antitela opisanih gore u tekstu. Raznovrsni ekspresioni vektori modu da budu uključeni u eksprimiranje polinukleotida koji kodiraju lance HER3-vezujućeg antitela ili vezujuće fragmente. I ekspresioni vektori zasnovani na virusima i oni koji to nisu mogu da budu upotrebljeni za dobijanje antitela u sisarskim ćelijama-domaćinima. Neviralni vektori i sistemi uključuju plazmide, epizomalne vektore, obično sa ekspresionom kasetom za eksprimiranje proteina ili RNK, i humane veštačke hromozome (videti, npr, Harrington i sar., (1997) Nat Genet 15:345). Na primer, neviralni vektori korisni za ekspresiju HER3-vezujućih polinukleotida i polipeptida kod sisarskim (npr, humanih) ćelija uključuju pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV vektore, i brojne druge vektore poznate u stanju tehnike za eksprimiranje drugih proteina. Korisni viralni vektori uključuju vektore zasnovane na retrovirusima, adenovirusima, virusima povezanim sa adenovirusima, herpes virusima, vektori koji se zasnivaju na SV40, papiloma virusu, HBP Epštajn-Bar virusu, vakcinija virusni vektori i Semliki Forest virus (SFV). Videti, Brent i sar., (1995) supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; i Rosenfeld i sar., (1992) Cell 68:143.

[0332] Izbor ekspresionog vektora zavisi od planiranih ćelija-domaćina u kojim će vektor biti eksprimiran. Uobičajeno, ekspresioni vektori sadrže promotor i druge regulatorne sekvence (npr, pojačivače) koji su operativno povezani sa polinukleotidima koji kodiraju lanac HER3-vezujućeg antitela ili fragment. U pojedinim primerima izvođenja, inducibilni promotor je uključen u sprečavanje ekspresije ubačene sekvence osim pod indukujućim uslovima. Inducibilni promotori uključuju, npr, arabinozu, lacZ, metalotionein promotor ili promotor toplotnog šoka. Kulture transformisanih organizama mogu da budu umnožavane pod neindukujućim uslovima bez usmeravanja populacije ka kodiranju sekvence čiji proizvodi ekspresije se bolje tolerišu od strane ćelija-domaćina. Osim promotora, drugi regulatorni elementi mogu takođe da budu potrebni ili poželjni za efikasnu ekspresiju lanca HER3-vezujućeg antitela ili fragmenta. Ovi elementi obično uključuju ATG inicijacioni kodon i mesto vezivanja za pripajanje ribozoma ili druge sekvence. Osim toga, efikasnost ekspresije može da se poboljša uključivanjem pojačivača (engl. enhancer) odgovarajućih za ćelijski sistem koji se koristi (videti, npr, Scharf i sar., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125; i Bittner i sar., (1987) Meth. Enzymol., 153:516). Na primer, pojačivač SV40 virusa ili pojačivač CMV virusa mogu da se koriste za povećanje ekspresije sisarskim ćelijamadomaćinima.

[0333] Ekspresioni vektori mogu isto tako da obezbede odvojeni položaj signalne sekvence tako da obrazuju fuzioni protein sa polipeptidima kodiranim ubačenom sekvencom HER3-vezujućeg antitela. Još češće, ubačene sekvence HER3-vezujućeg antitela su povezane sa signalnim sekvencom pre ugrađivanja u vektor. Vektori koji se koriste za umetanje sekvence koja kodira variablne domene lakog i teškog lanca HER3-vezujućeg antitela ponekad takođe kodira konstantne regione ili njihove delove. Takvi vektori dozvoljavaju ekspresiju varijabilnih regiona u obliku fuzionih proteina sa konstantnim regionima što dovodi do proizvodnje intaktnih antitela ili njihovih fragmenata. Obično, takvi konstantni regioni su humani.

[0334] Ćelije-domaćini za smeštanje i eksprimiranje lanaca HER3-vezujućeg antitela mogu da budu prokariotske ili eukariotske. E. coli je jedan od prokariotskih domaćina koristan za kloniranje i ekspresiju polinukleotida predmetnog pronalaska. Ostali mikrobni domaćini pogodni za upotrebu uključuju bacile, kao što je Bacillus subtilis, i ostale enterobakterije, kao što su Salmonella, Serratia, i različite vrste Pseudomonasa. U ovim prokariotskim domaćinima, mogu se takođe napraviti ekspresioni vektori, koji obično sadrže sekvence za kontrolu ekspresije koje su odgovarajuće za ćeliju-domaćina (npr, origin replikacije). Pored toga, bilo koji broj raznovrsnih promotora će biti prisutan, kao što je laktozni promotorski sistem, triptofan (trp) promotorski sistem, beta-laktamaza promotorski sistem, ili promotorski sistem iz lambda faga. Promotori obično kontrolišu ekspresiju, po slobodnom izboru sa operatorskom sekvencom, i imaju sekvence ribozom-vezujućeg mesta i slično, za započinjanje i završavanje transkripcije i translacije. Drugi mikroorganizmi, kao što je kvasac, mogu takođe da budu uključeni u ekspresiju HER3-vezujućih polipeptida pronalaska. Ćelije insekata u kombinaciji sa bakulovirusnim vektorima mogu takođe da se koriste.

[0335] U nekim poželjnim primerima izvođenja, sisarske ćelije-domaćini se koriste za eksprimiranje i dobijanje HER3-vezujućih polipeptida predmetnog pronalaska. Na primer, one mogu da budu ćelije linije hibridoma koje eksprimiraju endogene imunoglobulinske gene (npr, 1D6.C9 hibridoma klon mijeloma kao što je opisano u odeljku Primeri) ili sisarska ćelijska linija koja poseduje egzogeni ekspresioni vektor (npr, SP2/0 ćelije mijeloma navedene kao primer u daljem tekstu). Ovo uključuje bilo koje normalne smrtne ili normalne ili abnormalne besmrtne životinjske ili humane ćelije. Na primer, brojne pogodne linije ćelijadomaćina sposobne za sekreciju intaktnih imunoglobulina su razvijene, uključujući CHO ćelijske linije, različite Cos ćelijske linije, HeLa ćelije, mijeloma ćelijske linije, transformisane B-ćelije i hibridoma. Upotreba ćelijskih kultura sisarskog tkiva za eksprimiranje polipeptida je uopšteno diskutovana kod, npr, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Ekspresioni vektori za sisarske ćelijedomaćine mogu da uključuju sekvence za kontrolu ekspresije, kao što je oridžin replikacije, promotor, i pojačivač (videti, npr, Queen i sar., (1986) Immunol. Rev. 89:49-68), i neophodne sekvence za obradu informacija, kao što je mesto vezivanja ribozoma, sekvence za obradu (engl. splice) RNK, poliadenilacione sekvence, i sekvence za završavanje transkripcije. Ovi ekspresioni vektori obično sadrže promotore izvedene iz sisarskih gena ili iz virusa koji inficiraju sisare. Pogodni promotori mogu da budu konstitutivni, specifični za tip ćelije, specifični za stadijum, i/ili oni koji mogu da se moduliraju ili regulišu. Korisni promotori uključuju, ali nisu ograničeni na, metalotionein promotor, konstitutivni adenovirusni glavni kasni promotor, deksametazon-inducibilni MMTV promotor, SV40 promotor, MRP polIII promotor, konstitutivni MPSV promotor, tetraciklin-inducibilni CMV promotor (kao što je humani neposredni-rani CMV promotor), konstitutivni CMV promotor, i kombinacije promotora i pojačivača poznate u stanju tehnike.

[0336] Postupci za uvođenje ekspresionih vektora koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa su različiti zavisno od tipa ćelije-domaćina. Na primer, kalcijum hloridna transfekcija se obično koristi za prokariotske ćelije, tretman kalcijum fosfatom ili elektroporacija mogu da se koriste za druge ćelije-domaćine. (Videti uopšteno Sambrook, i sar., gore u tekstu). Ostali postupci uključuju, npr, elektroporaciju, tretman kalcijum fosfatom, transformaciju posredovanu lipozomom, injektovanje i mikroinjektovanje, balističke postupke, virozome, imunolipozome, konjugate polikatjon:nukleinska kiselina, golu DNK, veštačke virione, fuziju sa herpes virus strukturnim proteinom VP22 (Elliot i O'Hare, (1997) Cell 88:223), sredstvompojačana resorpcija DNA, i ex vivo transdukcija. Poželjno je postići, u dužem periodu, visok prinos proizvodnje rekombinantnih proteina i, stabilnu ekspresiju. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju lance HER3-vezujućih antitela ili vezivanje fragmenata mogu da budu dobijene korišćenjem ekspresionih vektora pronalaska koji sadrže virusne oridžine replikacije ili endogene elemente ekspresije i genske markere koji se mogu selektovati. Nakon uvođenja vektora, ćelije se mogu ostaviti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što budu prebačene u selektivni medijum. Svrha selektabilnih markera je da potvrde otpornost na selekciju, i njihovo prisustvo dozvoljava rast ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence u selektivnom medijumu. Otporne, stablno transfekovane ćelije mogu da budu umnožene primenom tehnika kulture tkiva odgovarajućih za ćelijski tip.

(ii) Obrazovanje monoklonskih antitela pronalaska

[0337] Monoklonska antitela (mAbs) mogu da budu dobijena raznovrsnim tehnikama, uključujući uobičajene postupke za dobijanje monoklonskog antitela npr, standardna tehnika hibridizacije somatskih ćelija prema Kohler i Milstein, (1975) Nature 256:495. Mnoge tehnike za dobijanje monoklonskog antitela mogu da budu upotrebljene npr, virusna ili onkogena transformacija B limfocita.

[0338] Životinjski sistem za dobijanje hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je dobro ustanovljen postupak. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u stanju tehnike. Učesnici fuzije (npr, mišje mijeloma ćelije) i postupci fuzije su takođe poznati.

[0339] Himerna ili humanizovana antitela predmetnog pronalaska mogu da se dobiju na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela dobijenog kao što je gore opisano. DNK koja kodira teški i laki lanac imunoglobulina može da bude dobijena iz mišjeg hibridoma od interesa i projektovana da sadrže ne-mišje (npr, humane) imunoglobulinske sekvence primenom standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, za dobijanje himernog antitela, mišji varijabilni regioni mogu da budu povezani sa humanim konstantnim regionima primenom postupaka poznatih u stanju tehnike (videti npr, U.S. Patent No.4,816,567, Cabilly i sar.). Za dobijanje humanizovanog antitela, mišji CDR regioni mogu da budu insertovani u humane okvirne sekvence primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti npr, U.S. Patent No.5225539 za Winter, i U.S. Patent Nos.5530101; 5585089; 5693762 i 6180370, za Queen i sar.

[0340] U određenom primeru izvođenja, antitela pronalaska su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv HER3 mogu da budu proizvedena korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe ovde označene kao HuMAb miševi i KM miševi, navedenim redom, i sve zajedno su ovde označeni kao "humani Ig miševi."

[0341] HuMAb miš<®>(Medarex, Inc.) sadrži minilokuse humanog imunoglobulinskog gena koji kodiraju ne-rearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i ĸ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i ĸ lanaca (videti npr, Lonberg i sar., (1994) Nature 368(6474): 856-859). U skladu sa tim, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili ĸ, i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca podležu promeni klase i somatskim mutacijama da bi nastalo visoko-afinitetno humano IgGĸ monoklonalno antitelo (Lonberg i sar., (1994) gore u tekstu; recenzirano u Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg i Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93, i Harding i Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Dobijanje i upotreba HuMAb miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, su dalje opisane kod Taylor i sar., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen i sar., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon i sar., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi i sar., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen i sar., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon i sar., (1994) J. Immunol.

152:2912-2920; Taylor i sar., (1994) International Immunology 579-591; i Fishwild i sar., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Videti dalje U.S. Patent Nos.5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; sve za Lonberg i Kay; U.S. Patent No. 5,545,807 za Surani i sar.; PCT Publication Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve za Lonberg i Kay; i PCT Publication No. WO 01/14424 za Korman i sar.

[0342] U sledećem primeru izvođenja, humana antitela pronalaska mogu da budu dobijena korišćenjem miša koji nosi humane imunoglobulinske sekvence na transgenima i transhomozomima kao što je miš koji nosi transgene za humani teški lanac i transhomozome za humani laki lanac. Takvi miševi, ovde označeni kao "KM miševi", su detaljno opisani u PCT Publication WO 02/43478 za Ishida i sar.

[0343] Dalje, alternativni transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene su dostupni u stanju tehnike i mogu da budu korišćeni za dobijanje HER3-vezujućih antitela pronalaska. Na primer, alternativni transgeni sistem označen kao Ksenomiš (Abgenix, Inc.) mogu da budu korišćeni. Takvi miševi su opisani u, npr, U.S. Patent Nos.5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 za Kucherlapati i sar.

[0344] Osim toga, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene su dostupni u stanju tehnike i mogu da budu korišćeni za dobijanje HER3-vezujućih antitela pronalaska. Na primer, miševi koji nose i transhromozom humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca, označeni kao "TC miševi" mogu da budu upotrebljeni; takvi miševi su opisani kod Tomizuka i sar., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Dalje, krave koje nose transhromozom za humani teški i laki lanac su opisane u stanju tehnike (Kuroiwa i sar., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu da budu korišćene za dobijanje HER3-vezujućih antitela pronalaska.

[0345] Humana monoklonska antitela pronalaska mogu takođe da se dobiju korišćenjem postupaka za pretraživanje biblioteka humanih imunoglobulinskih gena prikazanih u fagu. Takvi postupci sa fagom koji ispoljava gene za izolovanje humanih antitela su uspostavljeni u stanju tehnike ili opisani u primerima dalje u tekstu. Videti na primer: U.S. Patent Nos.

5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 za Ladner i sar.; U.S. Patent Nos. 5,427,908 i 5,580,717 za Dower i sar.; U.S. Patent Nos.5,969,108 i 6,172,197 za McCafferty i sar.; i U.S. Patent Nos.

5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 za Griffiths i sar.

[0346] Humana monoklonska antitela pronalaska mogu takođe da se dobiju korišćenjem SCID miševa u koje su rekonstituisane humane imune ćelije tako da odgovor humanog antitela može da se dobije nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani, na primer, u U.S. Patent Nos.5,476,996 i 5,698,767 za Wilson i sar.

(iii) Projektovanje okvirnih ili Fc regiona

[0347] Projektovana antitela pronalaska uključuju ona kod kojih su modifikacije napravljene u reziduama okvirnih regiona u VH i/ili VL, npr. u cilju poboljšanja osobina antitela. Obično se takve izmene okvirnih regiona sprovode u cilju smanjenja imunogenosti antitela. Na primer, jedan pristup je "povratna mutacija" jedne ili više rezidua okvirnog regiona u odgovarajuću germinativnu sekvencu. Još specifičnije, antitelo koje je bilo izloženo somatskoj mutaciji može da sadrži rezidue u okvirnoj sekvenci koji se razlikuju od germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno. Takve rezidue mogu da budu identifikovane poređenjem sekvence okvirnog regiona antitela sa germinativnom sekvencom od koje antitelo potiče. Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu da budu povratno mutirane u germinativnu sekvencu putem, na primer, dirigovane mutageneze. Takva povratno mutirana antitela su takođe obuhvaćena ovim pronalaskom.

[0348] Još jedan tip modifikacija okvirnih regiona uključuje mutiranje jednog ili više ostataka u okvirnom regionu, ili čak u jednom ili više CDR regiona, da bi se uklonili T ćelijski epitopi i na taj način smanjla moguća imunogenost antitela. Ovaj pristup takođe označen kao "deimunizacija" i detaljno je opisan u U.S. Patent Publication No.20030153043 od Carr i sar.

[0349] Kao dodatak ili alternativa izmenama urađenim u okvirnim regionima ili CDR regionima, antitela pronalaska mogu da se projektuju tako da uključuju modifikacije Fc regiona, obično da bi se izmenila jedna ili više funkcionalnih osobina antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc regiona za receptor, i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost. Pored toga, antitelo pronalaska može da bude hemijski izmenjeno (npr, jedna ili više hemijskih grupa mogu da budu dodate antitelu) ili da bude modifikovano tako da se izmeni njegova glikozilacija, u cilju promene jedne ili više funkcionalnih osobina antitela. Svako od ovih izvođenja je detaljno opisano u daljem tekstu. Numeracija ostataka u Fc regionu je urađena prema EU indeksu Kabat-a.

[0350] U jednom primeru izvođenja, region zgloba CH1 je modofokovan tako da broj cisteinskih ostataka regionu zgloba izmenjen, npr, povećan ili smanjen. Ovaj pristup je dezaljno opisan u U.S. Patent No. 5,677,425 od Bodmer i sar. Broj cisteinskih ostataka regionu zgloba CH1 je izmenjen tako da se, na primer, olakša sklapanje lakih i teških lanaca ili da se poveća ili smanji stabilnost antitela.

[0351] U sledećem primeru izvođenja, region zgloba Fc regionu antitela je mutiran da bi se smanjio biološki polu-život antitela. Još specifičnije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija su uvedene u CH2-CH3 domen regiona spoja u Fc-zglobnog fragmenta tako da antitelo ima smanjeno vezivanje Staphylococcyl proteina A (SpA) u odnosu na vezivanje nativnog Fczglobnog domena za SpA. Ovaj pristup je dezaljno opisan u U.S. Patent No. 6,165,745 od Ward i sar.

[0352] U još nekim primerima izvođenja, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jedne aminokiselinske rezidue drugom aminokiselinskom reziduom da bi se promenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu da budu zamenjene drugom aminokiselinskom reziduom tako da antitelo ima izmenjen afinitet za ligand-efektor, ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost polaznog antitela. Ligand-efektor za koji je izmenjen afinitet može da bude, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljno opisan u U.S. Patent Nos.5,624,821 i 5,648,260, obe od Winter i sar.

[0353] U sledećem primeru izvođenja, jedna ili više aminokiselina odabrana od aminokiselinskih rezidua može da bude zamenjena različitim aminokiselinskim reziduama tako da antitelo ima izmenjeno C1q vezivanje i/ili smanjenu ili eliminisanu citotoksičnost zavisna od komplementa (engl. complement dependent citotoxicity - CDC). Ovaj pristup je detaljno opisan u U.S. Patent Nos.6,194,551 od Idusogie i sar.

[0354] U sledećem primeru izvođenja, jedna ili više aminokiselinskih rezidua su izmenjene kako bi se promenila sposobnost antitela za fiksaciju komplementa. Ovaj pristup je dalje opisan u PCT Publication WO 94/29351 od Bodmer i sar.

[0355] U još jednom primeru izvođenja, Fc region je modofokovan da bi se povećala sposobnost antitela da posreduje u antitelo-zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (engl. antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) i/ili da bi se povećao afinitet antitela za Fcγ receptor modifikacijom jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je dalje opisan u PCT Publication WO 00/42072 od Presta. Pored toga, mesto vezivanja na humanom IgG1 za FcγRl, FcγRII, FcγRIII i FcRn je mapirano i varijante sa poboljšanim vezivanjem su opisane (videti Shields i sar., (2001) J. Biol. Chen.276:6591-6604).

[0356] U još jednom primeru izvođenja, glikozilacija antitela je modofokovana. Na primer, aglikozilovano antitelo može da bude pripremljeno (tj., antitelo koje nije glikozilovano). Glikozilacija može da bude izmenjena da bi se, na primer, povećao afinitet antitela za "antigen”. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da budu postignute putem, na primer, izmene jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselinskih zamena mogu da budu izvedene tako da dođe do uklanjanja jednog ili više mesta glikozilacije u okvirnim regionima varijabilnog regiona i na taj način eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može da poveća afinitet antitelo za antigen. Ovaj pristup je detaljno opisan u U.S. Patent Nos.5,714,350 i 6,350,861 od Co i sar.

[0357] Dodatno ili alternativno, antitelo može da bude napravljeno tako da ima izmenjen tip glikozilacija, kao što je hipofukozilisano antitelo koje ima smanjenu količinu fukozil ostataka ili antitelo ima povećanu količinu bisektnih GlcNac struktura. Za takve izmenjene obrasce glikozilacije je pokazano da povećavaju sposobnost antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti antitela. modifikacije ugljenih hidrata mogu da budu postignute, na primer, eksprimiranjem antitela ćeliji-domaćinu sa izmenjenim aparatom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenim aparatom za glikozilaciju su opisane u stanju tehnike i mogu da budu korišćene kao ćelijedomaćini u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pronalaska kako bi se dobilo antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 od Hang i sar. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalnim poremećajem u FUT8 genu, koji kodira a fukozil transferazu, tako da antitela eksprimiran u ovakvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. PCT Publication WO 03/035835 od Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da dodaju fukozu na Asn(297)-vezane ugljenik hidrate, takođe dovodeći do hipofukozilacije antitela eksprimiranih u takvoj ćeliji-domaćinu (videti takođe Shields i sar., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT Publication WO 99/54342 od Umana i sar. opisuje ćelijske linije projektovane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil transferaze (npr, beta(1,4)-N acetilglukozaminiltransferazu III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u projektovanim ćelijskim linijama ispoljavaju povećanu količinu bisektnih GlcNac struktura što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (videti takođe Umana i sar., (1999) Nat. Biotech.17:176-180).

[0358] U sledećem primeru izvođenja, antitelo je modofokovano da bi se produžio njegov biološki polu-život. Raznovrsni pristupi su mogući. Na primer, jedna ili više od sledećih mutacija moće da bude uvedena: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. Patent No.

6,277,375 za Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki polu-život, antitelo može da bude izmenjeno u CH1 ili CL regionu da sadrži spasonosni receptor-vezujući epitop uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona u IgG, kao što je opisano u U.S. Patent Nos. 5,869,046 i 6,121,022 od Presta i sar.

(iv) Postupci za projektovanje izmenjenih antitela

[0359] Kako je razmatrano u prethodnom tekstu, ovde prikazana HER3-vezujuća antitela koja imaju VH i VL sekvence ili sekvence cele dužine teškog i lakog lanca, mogu da budu upotrebljena za stvaranje novih HER3-vezujućih antitela modifikovanjem sekvence cele dužine teškog lanca i/ili lakog lanca, VH i/ili VL sekvence, ili konstantnog/konstantnih regiona koji su sa njima spojeni. Stoga, u još jednom aspektu pronalaska, strukturne osobine HER3-vezujućeg antitela pronalaska se koriste za stvaranje strukturno sličnog HER3-vezujućeg antitela koje zadržava najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela pronalaska, kao što je vezivanje za humani HER3 i takođe inhibicija jedne ili više funkcionalnih osobina HER3. Na primer, jedan ili više CDR regiona antitela predmetnog pronalaska, ili njihove mutirane varijante, mogu da budu kombinovane rekombinantno sa poznatim okvirnim regionima i/ili drugim CDR-ovima da se dobije dodatna, rekombinantno-projektovana, HER3-vezujuća antitela pronalaska, kako je razmatrano gore u tekstu. Drugi tipovi modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Početni materijal za postupak projektovanja je jedna ili više od ovde obezbeđenih VH i/ili VL sekvenci, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Za stvaranje projektovanog antitela, nije neophodno da se zaista pripremi (tj., eksprimira kao protein) antitelo koje ima jednu ili više od ovde obezbeđenih VH i/ili VL sekvenci, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Tačnije, informacija sadržana u sekvenci(ama) se koristi kao početni materijal za dobijanje "druge generacije" sekvence(i) izvedene iz originalne sekvence(i) i potom se "druga generacija" sekvence(i) priprema i eksprimira kao protein.

[0360] U skladu sa tim, u sledećem primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje HER3-vezujućeg antitela koje se sastoji od: sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela koji ima CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, i 368; CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, i 369; i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, i 370; i sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela koji ima CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, i 371; CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, i 372; i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, i 373; izmenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca antitela da se dobije najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela; i eksprimiranja izmenjene sekvence antitela u vidu proteina. Izmenjena sekvenca antitela može da se pripremi pregledanjem biblioteka antitela sa fiksiranom CDR3 sekvencom ili minimalnim esencijalnim determinantama vezivanja kako je opisano u US20050255552 i različitim CDR1 i CDR2 sekvencama. Pretraživanje može da bude urađeno prema bilo kojoj pogodnoj tehnici pretraživanja antitela u biblioteci antitela, kao što je tehnologija prikazivanja u fagu.

[0361] Uobičajene metode molekularne biologije mogu da se koriste za pripremanje i eksprimiranje izmenjene sekvence antitela. Antitelo kodirano izmenjenom sekvencom antitela je ono koje zadržava jednu, neke ili sve funkcionalne osobine ovde opisanih HER3-vezujućih antitela, gde funkcionalne osobine uključuju, ali nisu ograničene na, specifično vezivanje za humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus; antitelo se vezuje za HER3 i neutralizuje HER3 biološku aktivnost putem inhibicije HER signalne aktivnosti u fosfo-HER testu.

[0362] Funkcionalne osobine izmenjenih antitela mogu da budu procenjene upotrebom uobičajenih testova dostupnih u stanju tehnike i/ili ovde opisanih, kao što su oni opisani u odeljku Primeri (npr, ELISA testovi).

[0363] U izvesnim primerima izvođenja postupaka projektovanja antitela pronalaska, mutacije mogu da budu uvedene nasumično ili selektivno duž cele ili dela kodirajuće sekvence za HER3-vezujuće antitelo i tako dobijena modofokovana HER3-vezujuća antitela mogu da budu pretražena za aktivnost vezivanja i/ili druge funkcionalne osobine kako je ovde opisano. Postupci uvođenja mutacija su opisani u stanju tehnike. Na primer, PCT Publication WO 02/092780 od Short opisuje postupke za stvaranje i pretraživanje mutacija antitela primenom saturacione mutageneze, sklapanja sintetičkom ligacijom, ili njihovim kombinovanjem. Alternativno, PCT Publication WO 03/074679 od Lazar i sar. opisuje postupke korišćenja kompjuterizovanih postupaka pretraživanja za poboljšanje fizičkohemijskih osobina antitela.

Karakterizacija antitela pronalaska

[0364] Antitela pronalaska mogu da budu okarakterisana različitim funkcionalnim testovima. Na primer, mogu da budu okarakterisana na osnovu sposobnosti da neutralizuju biološku aktivnost putem inhibicije HER signalnog puta u fosfo-HER testu kako je ovde opisano, afiniteta za HER3 protein (npr, humani HER3 i/ili HER3 majmuna cynomologus), svrstavanja (mapiranja) epitopa, otpornosti na proteolizu, i sposobnosti da zaustave HER3 nishodni prenos signala. Različiti postupci mogu da se koriste za merenje HER3-posredovanog prenosa signala. Na primer, HER signalni put može da se prati (i) merenjem fosfo-HER3; (ii) merenjem fosforilacije HER3 ili drugih nishodnih signalnih proteina (npr. Akt), (iii) testova blokiranja liganda kao što je ovde opisano, (iv) obrazovanja heterodimera, (v) označavanja HER3 zavisne genske ekspresije, (vi) internalizacije receptora, i (vii) ćelijskih fenotipova izvedenih iz HER3 (npr. proliferacija).

[0365] Sposobnost antitela da se veže za HER3 može da bude praćena obeležavanjem antitela og interesa direktno, ili antitelo može da bude neobeleženo i vezivanje praćeno indirektno korišćenjem različitih oblika “sendvič” testova poznatih u stanju tehnike.

[0366] U pojedinim primerima izvođenja, HER3-vezujuća antitela pronalaska sprečavaju ili stupaju u kompeticiju sa vezivanjem referentnog HER3-vezujućeg antitela za HER3 polipeptid ili protein. Ovo mogu da budu u potpunosti humana HER3-vezujuća antitela kako je ovde opisano. Mogu takođe da budu mišja, himerna ili humanizovana HER3-vezujuća antitela koja se vezuju za isti epitop kao i referentno antitelo. Sposobnost sprečavanja ili kompeticije za vezivanje sa referentnim antitelom ukazuje da HER3-vezujuće antitelo u testu se vezuje za isti ili slični epitop kao onaj definisan referentnim antitelom, ili za epitop koji je dovoljno blizu epitopa vezanog od strane referentnog HER3-vezujućeg antitela. Takva antitela sa velikom verovatnoćom dele poželjne osobine identifikovane kod referentnog antitela. Sposobnost sprečavanja ili kompeticije sa referentnim antitelom može da se odredi putem, npr, testa kompetitivnog vezivanja. Testom kompetitivnog vezivanja, ispituje se sposobnost antitela u testu da inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen, kao što je HER3 polipeptid ili protein. Ispitivano antitelo je u kompeticiji sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za antigen ako ispitivano antitelo u višku suštinski inhibiza vezivanje referentnog antitela. Suštinska inhibicija znači da ispitivano antitelo smanjuje secifično vezivanje referentnog antitela obično za najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, ili 90%.

[0367] Postoji veliki broj poznatih testova za kompetitivno vezivanje koji mogu da budu upotrebljeni za procenu kompeticije HER3-vezujućeg antitela sa referentnim HER3-vezujućim antitelom za vezivanje za HER3 protein. Oni uključuju, npr, direktni ili indirektni radioimunoesej čvrste faze (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunoesej čvrste faze (EIA), “sendvič” kompetitivni esej (videti Stahli i sar., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); direktni biotin-avidin enzimski imunoesej (EIA) čvrste faze (videti Kirkland i sar., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619); direktni obeleženi esej čvrste faze, direktni obeleženi “sendvič” esej čvrste faze (videti Harlow & Lane, gore u tekstu); direktni obeleženi radioimunoesej čvrste faze (RIA) uz korišćenje obeležavanja sa I-125 (videti Morel i sar., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); direktni biotin-avidin enzimski imunoesej čvrste faze (EIA) (Cheung i sar., (1990) Virology 176:546-552); i direktni obeleženi radioimunoesej (RIA) (Moldenhauer i sar., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Obično, takav esej uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose ili neobeleženo ispitivano HER3-vezujuće antitelo ili obeleženo referentno antitelo. Kompetitivna inhibicija se meri određivanjem količine obeleživača vezanog za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu ispitivanog antitela. Obično je ispitivano antitelo prisutno u višku. Antitela identifikovana kompetitivnim esejem (kompetitivna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao i referentno antitelo i antitela koja se vezuju za pridruženi epitop dovoljno blizak epitopu vezanom od strane referentnog antitela da bi došlo do sternog ometanja.

[0368] Da bi se odredilo da li se izabrana HER3-vezujuća monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo može da bude obeleženo biotinom korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (npr, reagenasa od Pierce, Rockford, IL). Studije kompeticije korišćenjem neobeleženih monoklonskih antitela i biotinilovanih monoklonskih antitela mogu da budu sprovedene upotrebom ELISA ploča obloženih HER3 polipeptidom. Vezivanje MAb obeleženih biotinom može da bude detektovano streptavidin-alkalna fosfataza probom. Za određivanje izotipa prečišćenog HER3-vezujućeg antitela, izotipski ELISA testovi mogu da budu izvedeni. Na primer, bunari mikrotitar ploča mogu da budu obloženi sa 1 µg/ml anti-humanim IgG preko noći na temperaturi od 4°C. Nakon blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1 µg/ml ili manje monoklonskog HER3-vezujućeg antitela ili prečišćenih izotipskih kontrola, na sobnoj temperaturi u vremenu od jednog do dva časa. Bunari mogu zatim da reaguju sa alkalna fosfataza-konjugovanim probama specifičnim ili za humani IgG1 ili humani IgM. Ploče se zatim razvijaju i analiziraju tako da izotip prečišćenog antitela može da bude određen.

[0369] Da bi se pokazalo vezivanje monoklonskih HER3-vezujućih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju HER3 polipeptid, može se koristiti protočna citometrija (engl. flow cytometry). Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju HER3 (odgajene pod uobičajenim uslovima) mogu da budu pomešane sa različitim koncentracijama HER3-vezujućeg antitela u PBS-u (engl. phosphate-buffered saline) koji sadrži 0.1% BSA i 10% fetalnog telećeg seruma, i inkcubiraju na temperaturi od 4°C u vremenu od jednog časa. Nakon ispiranja, ćelije reaguju sa fluoresceinom obeleženim anti-humanim IgG antitelom pod istim uslovima kao za bojenje primarnog antitela. Uzorci mogu da budu analizirani pomoću FACScan instrumenta primenom bočnog rasipanja svetlosti za usmeravanje na pojedinačne ćelije. Može se koristiti alternativni test primenom fluorescentne mikroskopije (kao dodatak ili umesto) testa protočne citometrije. Ćelije mogu da budu obojene upravo na način opisan gore u tekstu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom. Ovaj postupak omogućava vizuelizaciju pojedinačnih ćelija, ali može da ima umanjenu osetljivost zavisno od gustine antigena.

[0370] HER3-vezujuća antitela pronalaska mogu da budu dalje ispitana u smislu reaktivnosti sa HER3 polipeptidom ili antigenim fragmentom pomoću “Western blotting” metode. Ukratko, prečišćeni HER3 polipeptidi ili fuzioni proteini, ili ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju HER3 mogu da se pripreme i podvrgnu natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforezi. Nakon elektroforeze, razdvojeni antigeni se prenose na nitrocelulozne membrane, blokiraju sa 10% fetalnim telećim serumom, i izlažu ispitivanim monoklonskim antitelima. Vezivanje humanog IgG može da bude detektovano upotrebom alkalna fosfataza anti-humanog IgG uz razvijanje sa tabletama supstrata BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[0371] Različita očitavanja mogu da budu korišćena za procenu efikasnosti, i specifičnosti HER3 antitela u testovima ligandom indukovanog obrazovanja heterodimera uz upotrebu ćelija. Aktivnost može da bude procenjena na jedan ili više od sledećih načina:

(i) Inhibicija ligandom indukovane heterodimerizacije HER2 drugim članovima EGF familije u ciljnoj ćelijskoj liniji, na primer MCF-7 ćelijama kancera dojke. Imunoprecipitacija HER2 kompleksa iz ćelijskih lizata može da bude izvedena sa receptor-specifičnim antitelom, i odsustvo/prisustvo drugih EGF receptora i njihovih biološki relevantnih liganda u kompleksu može da bude analizirano nakon elektroforeze/Western transfera hibridizacijom sa antitelima na druge EGF receptore.

(ii) Inhibicija aktivacije signalnih puteva ligandom aktiviranim heterodimerima. Povezivanje sa HER3 je izgleda ključno za ostale članove EGF familije receptora da bi mogli da izazovu najveći mogući ćelijski odgovor nakon vezivanja liganda. U slučaju kinaza-defektnog HER3, HER2 obezbeđuje funkcionalni tirozin-kinazni domen da omogući prenos signala nakon vezivanja liganda faktora rasta. Stoga, ćelije koje koeksprimiraju HER2 i HER3 mogu da budu izložene ligandu, na primer heregulinu, u odsustvu i prisustvu inhibitora i efekat na HER3 tirozin fosforilaciju pratiti na razne načine uključujući imunoprecipitaciju HER3 iz lizata tretiranih ćelija i nakon toga primenom “Western blotting” metode uz korišćenje antifosfotirozin antitela (videti Agus op. cit. za detalje). Alternativno, efikasni testovi mogu da budu razvijeni izdvajanjem HER3 iz rastvorenih lizata u bunarima ploče sa 96 bunara obložene sa anti-HER3 receptor antitelom, i merenjem nivoa fosforilacije tirozina korišćenjem, na primer, europijum-obeleženih anti-fosfotirozin antitela, kao što je opisano kod Waddleton i sar., (2002) Anal. Biochem. 309:150-157.

Proširivanjem ovog pristupa, efektorski molekuli za koje je poznato da se aktiviraju nishodno od aktiviranih receptorskih heterodimera, kao što je mitogenom-aktivirana protein kinaza (MAPK) i Akt, mogu da budu analizirani direktno, primenom imunoprecipitacije iz tretiranih lizata i “blotting-a” sa antitelima koja detektuju aktivirane oblike ovih proteina, ili analizom sposobnosti ovih proteina da izmene/aktiviraju specifične supstrate.

(iii) Inhibicija ligandom-indukovane ćelijske proliferacije. Za raznovrsne ćelijske linije je poznato da koeksprimiraju kombinacije ErbB receptora, na primer mnoge ćelijske linije kancera dojke i prostate. Testovi mogu da se izvode u pločama sa 24/48/96 bunara sa očitavanjima zasnovanim na DNK sintezi (ugradnja timidina obeleženog tricijumom), povećanje broja ćelija (bojenje kristal violetom) itd.

[0372] Brojna očitavanja mogu da budu korišćena za procenu efikasnosti, i specifičnosti, HER3 antitela u testovima ligand-nezavisnog obrazovanja homo- i heterodimera zasnovanim na ćelijama. Na primer, prekomerna ekspresija HER2 predstavlja okidač ligand-nezavisne aktivacije kinaznog domena kao rezultat spontanog obrazovanja dimera. Prekomerno eksprimirani HER2 stvara ili homo- ili heterodimere sa drugim HER molekulima kao što su HER1, HER3 i HER4.

[0373] Sposobnost antitela ili njihovih fragmenata da spreče in vivo rast tumorskih ksenograftova humanih tumorskih ćelijskih linija za čiji tumorogeni fenotip je poznato da najmanje delimično zavisi od aktivacije ligandom HER3 heterodimernog ćelijskog prenosa signala npr. BxPC3 ćelije kancera pankreasa itd. Ovo može da se proceni u imunokompromitovanim miševima ili pojedinačno ili u kombinaciji sa odgovarajućim citotoksičnim sredstvom za ćelijsku liniju o kojoj je reč. Primeri funkcionalnih testova su takođe opisani u odeljku Primeri u daljem tekstu.

Profilaktičke i terapijske primene

[0374] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa HER3 signalnim putem primenom kod ispitanika, za potrebe lečenja, efikasne količine antitela pronalaska. U određenom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili sprečavanje (prevenciju) kancera (npr, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer pluća, multipli mijelom, kancer ovarijuma, kancer jetre, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer prostate, akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, osteosarkom, karcinom skvamoznih ćelija, tumori perifernih nervnih ovojnica, švanom, kancer glave i vrata, kancer bešike, ezofagealni kancer, glioblastom, sarkom mekog tkiva jasnih ćelija, maligni mezoteliom, neurofibromatoza, renalni kancer i melanom) primenom kod ispitanika, za potrebe lečenja, efikasne količine antitela pronalaska. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije kancera povezanih sa HER signalnim putem primenom kod ispitanika, za potrebe lečenja, efikasne količine antitela pronalaska.

[0375] U određenom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke lečenja kancera povezanih sa HER signalnim putem koji uključuju, ali nisu ograničeni na kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer pluća, multipli mijelom, kancer ovarijuma, kancer jetre, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer prostate, akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, osteosarkom, karcinom skvamoznih ćelija, tumori perifernih nervnih ovojnica, švanom, kancer glave i vrata, kancer bešike, ezofagealni kancer, glioblastom, sarkom mekog tkiva jasnih ćelija, maligni mezoteliom, neurofibromatoza, renalni kancer i melanom.

[0376] HER3 antitela se takođe mogu upotrebiti za lečenje ili sprečavanje nastanka drugih poremećaja povezanih sa neispravnim ili nepotpunim HER prenosom signala, uključujući ali bez ograničenja na, respiratorne bolesti, osteoporozu, osteoartritis, policistično oboljenje bubrega, dijabetes, shizofreniju, vaskularne bolesti, srčane bolesti, ne-onkogene proliferativne bolesti, fibroza, i neurodegenerativne bolesti kao što je Alchajmerova bolest.

[0377] Pogodna sredstva za kombinovano lečenje sa HER3-vezujućim antitelima uključuju standardna sredstva za lečenje poznata u stanju tehnike koja su sposobna da moduliraju ErbB signalni put. Odgovarajući primeri standarda “zaštitnih sredstva” (engl. care agents) za HER2 uključuju, ali nisu ograničeni na, Herceptin i Tykerb. Odgovarajući primeri standarda “zaštitnih sredstva” za EGFR uključuju, ali nisu ograničeni na Iressa, Tarceva, Erbitux i Vectibix. Druga sredstva koja mogu da budu pogodna za kombinovano lečenje sa HER3-vezujućim antitelima uključuju, ali nisu ograničena na, ona koja moduliraju receptorske tirozin kinaze, receptore kuplovane sa G-proteinom, puteve prenosa signala za rast/preživljavanje, jedarne hormonske receptore, puteve apoptoze, ćelijski ciklus i angiogenezu.

Dijagnostičke upotrebe

[0378] U jednom aspektu, pronalazak obuhvata dijagnostičke testove za određivanje ekspresije HER3 proteina i/ili nukleinske kiseline kao i funkciju HER3 proteina, u kontekstu biološkog uzorka (npr, krv, serum, ćelije, tkivo) ili od jedinke pogođene kancerom, ili one koja je u riziku za razvoj kancera.

[0379] Dijagnostički testovi, kao što je kompetitivni esej se zasnivaju na sposobnosti obeleženog analoga “tragača” (engl. tracer) da stupi u kompeticiju sa analitom ispitivanog uzorka za ograničen broj mesta vezivanja na zajedničkom vezujućem partneru. Vezujući partner uglavnom je preveden u nerastvorni oblik pre ili nakon kompeticije i tada se tragač i analit koji su vezani za vezujućeg partnera razdvajaju od nevezanog tragača i analita. Ovo razdvajanje se postiže dekantovanjem (kada je vezujući partner bio unapred preveden u nerastvorni oblik) ili centrifugiranjem (kada je vezujući partner precipitirao nakon reakcije kompeticije). Količina analita ispitivanog uzorka je obrnuto proporcionalna količini vezanog tragača kada se meri količinom marker supstance. Krive zavisnosti doza-odgovor sa poznatim količinama analita se izrade i uporede sa rezultatima testa u cilju kvantitativnog određivanja količine analita prisutnog u ispitivanom uzorku. Ovi testovi se nazivaju ELISA sistemi kada se enzimi koriste kao markeri detekcije. U testu ovakvog oblika, kompetitivno vezivanje između antitela i HER3-vezujućih antitela dovodi do vezivanja HER3 proteina, poželjno HER3 epitopa pronalaska, koji postaje mera antitela u uzorku seruma, naročito, neutralizujućih antitela u uzorku seruma.

[0380] Značajna prednost testa je ta što se njime direktno mere neutralizujuća antitela (tj, ona koja interferiraju sa vezivanjem HER3 proteina, specifično, epitopa). Takav test, naročito u obliku ELISA testa ima značajne primene u kcliničkom okruženju i u rutinskom pregledu krvi.

[0381] Drugi aspekt pronalaska obezbeđuje postupke za određivanje ekspresije nukleinske kiseline koja kodira HER3 ili aktivnosti HER3 proteina kod jedinke da bi se na taj način odabrala odgovarajuća terapijska ili profilaktička sredstva za tu jedinku (ovde nazvano "farmakogenomika"). Farmakogenomika omogućava izbor sredstva (npr, lekova) za terapijski ili profilaktički tretman jedinke zasnovan na genotipu jedinke (npr, genotipu jedinke ispitanom da bi se odredila sposobnost jedinke da odgovori na određeno sredstvo.)

[0382] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na praćenje uticaja sredstva (npr, lekova) na ekspresiju ili aktivnost HER3 proteina u kliničkim studijama.

Farmaceutske kompozicije

[0383] Da bi se pripremile farmaceutske ili sterilne kompozicije koje uključuju HER3-vezujuća antitela (intaktna ili vezujući fragmenti), HER3-vezujuća antitela (intaktna ili vezujući fragmenti) se mešaju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Kompozicije mogu dodatno da sadrže jedan ili više dodatnih terapijskih sredstava koja su pogodna za lečenje ili prevenciju kancera (kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer pluća, multipli mijelom, kancer ovarijuma, kancer jetre, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer prostate, akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, osteosarkom, karcinom skvamoznih ćelija, tumori perifernih nervnih ovojnica, švanom, kancer glave i vrata, kancer bešike, ezofagealni kancer, glioblastom, sarkom mekog tkiva jasnih ćelija, maligni mezoteliom, neurofibromatoza, renalni kancer i melanom).

[0384] Formulacije terapijskih i diagnostičkih sredstva mogu da se dobiju mešanjem sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima, ili stabilizatorima u obliku, npr, liofilizovanih praškova, tečnih gelova, vodenih rastvora, losiona, ili suspenzija (videti, npr, Hardman i sar., (2001) Goodman i Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, i Wilkins, New York, N.Y.; Avis, i sar. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, i sar. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, i sar. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner i Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).

[0385] Izbor režima primene terapeutika zavisi od nekoliko faktora, uključujući serumski ili tkivni “turnover” entiteta, nivo simptoma, imunogenost entiteta, i pristupačnost ćelija u biološkom matriksu. U određenim primerima izvođenja, režim primene povećava količinu terapeutika dostavljenu pacijentu u skladu sa prihvatljivim nivoom sporednih efekata. U skladu sa tim, količina dostavljene biološke supstance zavisi delimično od određenog entiteta i ozbiljnosti stanja koje se leči. Vodiči pri izboru odgovarajuće doze antitela, citokina, i malih molekula su dostupni (videti, npr, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert i sar., (2003) New Engl. J. Med.348:601-608; Milgrom i sar., (1999) New Engl. J. Med.341:1966-1973; Slamon i sar., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz i sar., (2000) New Engl. J. Med.342:613-619; Ghosh i sar., (2003) New Engl. J. Med.348:24-32; Lipsky i sar., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

[0386] Određivanje odgovarajuće doze obavlja kliničar, npr, korišćenjem parametara ili faktora poznatih ili pretpostavljenih u stanju tehnike da utiču na lečenje ili se može predvideti da utiču na lečenje. Uopšteno, doza počinje sa količinom unekoliko manjom od optimalne doze i povećava se u malim koracima sve dok se ne postigne željeni ili optimalni efekat u odnosu na bilo koje neželjene sporedne efekte. Važne dijagnostičke mere uključuju simptome, npr, inflamacije ili nivo proizvedenih inflamatornih citokina.

[0387] Konkretni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu da se menjaju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna u postizanju željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju, i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Izabrani nivo doze će zavisiti od raznovrsnih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određene kompozicije predmetnog pronalaska koja je u pitanju, ili njenog estra, soli ili amida, puta primene, vremena primene, brzine ekskrecije određenog jedinjenja koje je u pitanju, trajanja tretmana, ostalih lekova, jedinjenja i/ili materijala korišćenih u kombinaciji sa određenom kompozicijom koja je u pitanju, uzrasta, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora poznatih u oblasti medicine.

[0388] Kompozicije koje obuhvataju antitela ili fragmente antitela pronalaska mogu da budu primenjena kontinuiranom infuzijom, ili dozama u intervalima od, npr, jednog dana, jedne nedelje, ili 1-7 puta nedeljno. Doze mogu da se primene intravenozno, subkutano, topikalno, oralno, nazalno, rektalno, intramuskularno, intracerebralno, ili putem inhalacije. Specifični dozni protokol uključuje najveću dozu ili učestalost doza tako da se izbegnu značajni neželjeni sporedni efekti. Ukupna nedeljna doza može da bude najmanje telesne težine, najmanje najmanje najmanje najmanje

najmanje najmanje 0.2 mg/kg, najmanje 1.0 mg/kg, najmanje 2.0 mg/kg, najmanje 10 mg/kg, najmanje 25 mg/kg, ili najmanje 50 mg/kg (videti, npr, Yang i sar., (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold i sar., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu i sar., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji i sar., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). Željena doza antitela ili njihovih fragmenata je otprilike ista kao za antitelo ili polipeptid, na bazi molova/kg telesne težine. Željena koncentracija antitela ili njihovih fragmenata u plazmi je oko, na bazi molova/kg telesne težine. Doza može da bude najmanje , najmanje najmanje najmanje najmanje

najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje

najmanje najmanje ili najmanje Broj doza primenjenih kod subjekta može da bude najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12, ili više.

[0389] Za antitela ili fragmente antitela pronalaska, doze primenjene kod pacijenta mogu da budu 0.0001 mg/kg do 100 mg/kg pacijentove telesne težine. Doza može da bude između 0.0001 mg/kg i 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg i 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg i 5 mg/kg, 0.0001 i 2 mg/kg, 0.0001 i 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg i 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg i 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg do 0.25 mg/kg, 0.0001 do 0.15 mg/kg, 0.0001 do 0.10 mg/kg, 0.001 do 0.5 mg/kg, 0.01 do 0.25 mg/kg ili 0.01 do 0.10 mg/kg pacijentove telesne težine.

[0390] Doza antitela ili fragmenata antitela pronalaska može da se izračuna korišćenjem pacijentove telesne težine u kilogramima (kg) pomnožene dozom koja će se primeniti u mg/kg. Doza antitela ili fragmenata antitela pronalaska može da bude 150 ili manje, ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje, 60 ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje, 15 ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje ili manje, ili ili manje pacijentove telesne težine .

[0391] Pojedinačna doza antitela ili fragmenata antitela pronalaska može da bude 0.1 mg do 20 mg, 0.1 mg do 15 mg, 0.1 mg do 12 mg, 0.1 mg do 10 mg, 0.1 mg do 8 mg, 0.1 mg do 7 mg, 0.1 mg do 5 mg, 0.1 mg do 2.5 mg, 0.25 mg do 20 mg, 0.25 mg do 15 mg, 0.25 mg do 12 mg, 0.25 mg do 10 mg, 0.25 mg do 8 mg, 0.25 mg do 7 m g, 0.25 mg do 5 mg, 0.5 mg do 2.5 mg, 1 mg do 20 mg, 1 mg do 15 mg, 1 mg do 12 mg, 1 mg do 10 mg, 1 mg do 8 mg, 1 mg do 7 mg, 1 mg do 5 mg, ili 1 mg do 2.5 mg.

[0392] Doza antitela ili fragmenata antitela pronalaska može da dostigne titar u serumu od najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje 5 najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje g/ml, najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje 250

jmanje najmanje najmanje 350

kod subjekta. Alternativno, doza antitela ili fragmenata antitela pronalaska može da dostigne titar u serumu od najmanje

najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje 6 najmanje najmanje najmanje 20 .mu.g/ml, najmanje najmanje najmanje najmanje najmanje

najmanje najmanje najmanje najmanje

najmanje najmanje najmanje ml, najmanje

najmanje ili najmanje kod subjekta.

[0393] Doze antitela ili fragmenata antitela pronalaska mogu da se primene ponovljeno i primene mogu da budu razdvojene najmanje 1 dan, 2 dana, 3 dana, 5 dana, 10 dana, 15 dana, 30 dana, 45 dana, 2 meseca, 75 dana, 3 meseca, ili najmanje 6 meseci.

[0394] Efikasna količina za određenog pacijenta može da se razlikuje zavisno od faktora kao što je stanje koje se leči, opšte zdravlje pacijenta, postupak, put primene i doza i ozbiljnost neželjenih efekata (videti, npr, Maynard i sar., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory i Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

[0395] Put primene može da bude, npr, topikalna ili kutana primena, injekcija ili infuzija primenjena intravenski, intraperitonealno, intracerebralno, intramuskularno, intraokularno, intraarterijalno, intracerebrospinalno, intralezionalno, ili putem sistema sa neprekidnim otpuštanjem sredstva ili implanta (videti, npr, Sidman i sar., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer i sar., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein i sar., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang i sar., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; U.S. Pat. Nos. 6,350,466 i 6,316,024). Tamo gde je neophodno, kompozicija može takođe da uključuje sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik kao što je lidokain da se umanji bol na mestu injektovanja. Osim toga, može se koristiti i pulmonalna primena, npr, upotrebom inhalera ili nebulizera, i formulacije sa sredstva za stvaranje aerosola. Videti, npr, U.S. Pat. Nos. 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, i 4,880,078; i PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903.

[0396] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe da budu primenjene preko jednog ili više puteva primene korišćenjem jednog ili više raznovrsnih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao što će primetiti stručnjak u stanju tehnike, put i/ili način primene će se menjati zavisno od željenih rezultata. Odabrani putevi primene antitela ili fragmenata antitela pronalaska uključuju intravenozni, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne puteve primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Parenteralna primena može da predstavlja načine primene drugačije od enteralne i topikalne primene, obično putem injekcije, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. Alternativno, kompozicija pronalaska može da bude primenjena preko ne-parenteralnog puta, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozalni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingualno ili topikalno. U jednom primeru izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti pronalaska se primenjuju putem infuzije. U sledećem primeru izvođenja, multispecifični epitop-vezujući protein pronalaska je primenjen subkutano.

[0397] Ako se antitela ili njihovi fragmenti pronalaska primenjuju pomoću sistema sa kontrolisanim ili neprekidnim otpuštanjem sredstva, može se koristiti pumpa za postizanje kontrolisanog ili neprekidnog oslobađanja sredstva (videti Langer, gore u tekstu; Sefton, (1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng.14:20; Buchwald i sar., (1980), Surgery 88:507; Saudek i sar., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574). Polimerni materijali mogu da budu upotrebljeni za postizanje kontrolisanog ili neprekidnog oslobađanja terapeutika pronalaska (videti npr, Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design i Performance, Smolen i Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger i Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; videti also Levy i sar., (1985) Science 228:190; During i sar., (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard i sar., (1989) J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No.

5,679,377; U.S. Pat. No. 5,916,597; U.S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT Publication No. WO 99/15154; i PCT Publication No. WO 99/20253. Primeri polimera korišćenih za neprekidno oslobađanje formulacije uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilna kiselina), poli(etilen-ko-vinil acetat), pol(metakrilna kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktidi (PLA), poli(laktid-ko-glikolidi) (PLGA), i poliortoestri. U jednom primeru izvođenja, polimer korišćen za neprekidno oslobađanje formulacije je inertan, bez nečistoća koje se mogu osloboditi, stabilan pri skladištenju, sterilan, i biorazgradiv. Sistemi za kontrolisano ili neprekidno oslobađanje mogu da budu smešteni u blizini profilaktičkog ili terapijskog cilja, zahtevajući na taj način samo deo sistemske doze (videti, npr, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, gore u tekstu, vol. 2, str. 115-138 (1984)).

[0398] Sistemi za kontrolisano oslobađanje su razmatrani u reviji autora Langer, (1990), Science 249:1527-1533). Bilo koje tehnike poznate stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike mogu da budu korišćene za proizvodnju formulacija sa neprekidnim oslobađanjem koje sadrže jedno ili više antitela ili fragmenata antitela pronalaska . Videti, npr, U.S. Pat. No.4,526,938, PCT publikaciju WO 91/05548, PCT publikaciju WO 96/20698, Ning i sar., (1996), Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song i sar., (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek i sar., (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, i Lam i sar., (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759-760.

[0399] Ako se antitela ili njihovi fragmenti pronalaska primenjuju topikalno, mogu da budu formulisana u obliku masti, kreme, transdermalnog peča, losiona, gela, šampona, spreja, aerosola, rastvora, emulzije, ili drugog oblika dobro poznatog osobi upoznatoj sa stanjem tehnike. Videti, npr, Remington's Pharmaceutical Sciences i Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Za topikalne dozne oblike koji se ne mogu primeniti putem spreja, viskozne po polu-čvrste ili čvrste oblike koji sadrže nosač ili jedan ili više ekscipijenasa kompatibilnih sa topikalnom primenom i imaju dinamički viskozitet, u nekim slučajevima, veći od vode se obično koriste. Pogodne formulacije uključuju, bez ograničenja, rastvore, suspenzije, emulzije, kreme, masti, praškove, tečne masti, meleme, i slično, koji su, po želji, sterilisani ili pomešani sa pomoćnim sredstvima (npr, konzervansi, stabilizatori, sredstva za vlaženje, puferi, ili soli) u cilju delovanja na određene osobine, kao što je, na primer, osmotski pritisak. Ostali pogodni oblici za topikalnu primenu uključuju aerosol preparate u spreju gde je aktivni sastojak, u nekim slučajevima, u kombinaciji sa čvrstim ili tečnim inertnim nosačem, upakovan u smešu sa isparljivom supstancom pod pritiskom (npr, gasoviti propelant, kao što je freon) ili u bočici koja može da se stisne. Sredstva za ovlaživanje ili protiv gubitka vlage mogu takođe da se dodaju u farmaceutske kompozicije i i dozne oblike po želji. Primeri Primeri takvih dodatnih sastojaka su dobro poznati u stanju tehnike.

[0400] Ukoliko se kompozicije koje obuhvataju antitela ili njihove fragmente primenjuju intranazalno, mogu da budu formulisane u obliku aerosola, spreja, magle ili u obliku kapi. Naročito, profilaktička ili terapijska sredstva za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da budu pogodno isporučena u obliku aerosol spreja prezentovanog u pakovanju pod pritiskom ili nebulizera, uz upotrebu pogodnog propelanta (npr, dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa). U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica može da bude određena obezbeđivanjem ventila koji oslobađa odmerenu količinu. Kapsule i kertridži (sačinjeni od, npr, želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulusane tako da se sastoje od praškaste smeše jedinjenja i odgovarajuće praškaste osnove kao što je laktoza ili skrob.

[0401] Postupci za ko-administraciju ili lečenje drugim terapijskim sredstvom, npr, citokinom, steroidom, hemoterapijskim sredstvom, antibiotikom, ili radijacijom, su poznati u stanju tehnike (videti, npr, Hardman i sar., (eds.) (2001) Goodman i Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10. izanje., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole i Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner i Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy i Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Efektivna količina terapijskog sredstva može da smanji simptome za najmanje 10%; za najmanje 20%; najmanje oko 30%; najmanje 40%, ili najmanje 50%.

[0402] Dodatne terapije (npr, profilaktička ili terapijska sredstva), koje mogu da budu koje mogu da budu primenjene sa antitelima ili fragmenatima antitela pronalaska mogu da budu primenjene sa razmakom primene koji iznosi manje od 5 minuta razmaka, manje od 30 minuta razmaka, 1 čas razmaka, oko 1 čas razmaka, od oko 1 do oko 2 časa razmaka, oko 2 časa do oko 3 časa razmaka, od oko 3 časa do oko 4 časa razmaka, od oko 4 časa do oko 5 časova razmaka, od oko 5 časova do oko 6 časova razmaka, od oko 6 časova do oko 7 časova razmaka, od oko 7 časova do oko 8 časova razmaka, od oko 8 časova do oko 9 časova razmaka, od oko 9 časova do oko 10 časova razmaka, od oko 10 časova do oko 11 časova razmaka, od oko 11 časova do oko 12 časova razmaka, od oko 12 časova do 18 časova razmaka, 18 časova do 24 časa razmaka, 24 časova do 36 časova razmaka, 36 časova do 48 časova razmaka, 48 časova do 52 časa razmaka, 52 časa do 60 časova razmaka, 60 časova to 72 časa razmaka, 72 časova do 84 časa razmaka, 84 časova do 96 časova razmaka, ili 96 časova do 120 časova razmaka u odnosu na primenu antitela ili fragmenata antitela pronalaska. Dve ili više terapija mogu da budu primenjene u okviru iste posete pacijenta.

[0403] Antitela ili fragmenati antitela pronalaska i ostale terapije mogu da se primene ciklično. Ciklična terapija uključuje primenu prve terapije (npr, prvog profilaktičkog ili terapijskog sredstva) u određenom vremenskom periodu, nakon čega se primenjuje druga terapija (npr, drugo profilaktičko ili terapijsko sredstvo) u određenom vremenskom periodu, po slobodnom izboru, praćeno primenom treće terapije (npr, profilaktičkog ili terapijskog sredstva) u određenom vremenskom periodu i tako dalje, i ponavljanjem ove sekvencijalne primene, tj, ciklusa u cilju smanjenja razvoja otpornosti na jednu od terapija, da bi se izbegli ili smanjili sporedni efekti jedne od terapija, i/ili da bi se poboljšala efikasnost terapija.

[0404] U izvesnim primerima izvođenja, antitela ili fragmenati antitela pronalaska mogu da budu formulisani tako da se osigura odgovarajuća raspodela in vivo. Na primer, krvnomoždana barijera (engl. blood-brain barrier - BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osigurao prolazak terapijskih jedinjenja kroz BBB (ako je poželjno), ona mogu da budu formulisana, na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr, U.S. Pat. Nos.4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jednu ili više grupa koje se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, poboljšavajući na taj način ciljanu iporuku leka (videti, npr, Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri grupa koje ciljanih grupa uključuju folate ili biotin (videti, npr, U.S. Pat. No. 5,416,016 za Low i sar.); manozide (Umezawa i sar., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); antitela (Bloeman i sar., (1995) FEBS Lett.357:140; Owais i sar., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor surfaktant proteina A (Briscoe i sar., (1995) Am. J. Physiol.

1233:134); p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem.269:9090); videti takođe K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

[0405] Pronalazak obezbeđuje protokole za primenu farmaceutske kompozicije koja obuhvata antitela ili fragmenate antitela pronalaska samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijama kod subjekta za potrebe lečenja. Terapije (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) kombinovanih terapija predmetnog pronalaska mogu da budu primenjene istovremeno ili uzastupno (jedna za drugom) kod subjekta. Terapija (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) kombinovanih terapija predmetnog pronalaska mogu takođe da budu primenjene ciklično. Ciklična terapija uključuje primenu prve terapije (npr, prvog profilaktičkog ili terapijskog sredstva) u određenom vremenskom periodu, nakon čega se primenjuje druga terapija (npr, drugo profilaktičko ili terapijsko sredstvo) u određenom vremenskom periodu i ponavljanja ove uzastopne primene, tj, ciklusa, u cilju smanjenja razvoja otpornosti na jednu od terapija, da bi se izbegli ili smanjili sporedni efekti jedne od terapija, i/ili da bi se poboljšala efikasnost terapija.

[0406] Terapije (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) u okviru kombinovane terapije pronalaska mogu da budu primenjene kod subjekta paralelno. Izraz "paralelno" nije ograničen na primenu terapija (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) u isto vreme, već radije označava da se farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ili fragmenate antitela pronalaska primenjuju kod subjekta u sekvencama i unutar vremenskog intervala tako da antitela pronalaska mogu da deluju zajedno sa drugom(im) terapijom(ama) da obezbede povećanu korist u odnosu na to kada bi se primenjivala drugačije. Na primer, svaka od terapija može da se primeni kod subjekta u isto vreme ili jedna za drugom bilo kojim redosledom, u različitim vremenskim tačkama; međutim, ako se ne primene u isto vreme, trebalo bi da se primene dovoljno blizu u vremenu tako da obezbede željeni terapijski ili profilaktički efekat. Svaka od terapija može da bude primenjena kod subjekta odvojeno, u bilo kom pogodnom obliku i bilo kojim pogodnim putem. U raznim primerima izvođenja, terapije (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) se primenjuju kod subjekta sa razmakom primene koji iznosi manje od 15 minuta, manje od 30 minuta, manje od 1 čas razmaka, od oko 1 čas razmaka, od oko 1 čas do oko 2 časa razmaka, od oko 2 časa do oko 3 časa razmaka, od oko 3 časa do oko 4 časa razmaka, od oko 4 časa do oko 5 časova razmaka, od oko 5 časova do oko 6 časova razmaka, od oko 6 časova do oko 7 časova razmaka, od oko 7 časova do oko 8 časova razmaka, od oko 8 časova do oko 9 časova razmaka, od oko 9 časova do oko 10 časova razmaka, od oko 10 časova do oko 11 časova razmaka, od oko 11 časova do oko 12 časova razmaka, 24 časa razmaka, 48 časa razmaka, 72 časa razmaka, ili 1 nedelju odvojeno jedna od druge. U ostalim primerima izvođenja, dve ili više terapija (npr, profilaktička ili terapijska sredstva) se primenjuju u okviru iste posete pacijenta.

[0407] Profilaktička ili terapijska sredstva kombinovanih terapija mogu da budu primenjena kod subjekta u istoj farmaceutskoj kompoziciji. Alternativno, profilaktička ili terapijska sredstva kombinovanih terapija mogu da budu primenjena paralelno kod subjekta u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Profilaktička ili terapijska sredstva mogu da budu primenjena kod subjekta istim ili različitim putevima primene.

[0408] Otkriće koje je u potpunosti opisano, u nastavku teksta je ilustrovano sledećim primerima i patentnim zahtevima, koji su ilustrativni i nisu ograničavajući.

Primeri

Primer 1: Postupci, materijali i skrining (odabir) antitela

(i) Ćelijske linije

[0409] BXPC-3, SK-Br-3, BT-474, MDA-MB-453, FaDu i MCF-7 ćelijske linije su nabavljene od ATCC i rutinski održavane u medijumu za rast obogaćenom sa 10% fetalnim goveđim serumom (engl. fetal bovine serum - FBS).

(ii) Stvaranje rekombinantnih humanih, Cyno, mišjih i pacovskih HER3 vektora

[0410] Mišji HER3 vanćelijski domen je amplifikovan primenom PCR metode iz cDNK mozga miša (Clontech) i sekvenca je proverena poređenjem sa Refseq NM_010153. Pacovski HER3 ECD je reverzno transkribovan sa iRNK Rat-2 ćelija i sekvenca je proverena poređenjem sa NM_017218. HER3 cDNK matrica (engl. template) Cynomolgus majmuna je dobijena korišćenjem RNK iz različitih tkiva cyno majmuna (Zyagen Laboratories), i proizvod dobijen primenom RT-PCR metode kloniran u pCR®-TOPO-XL (Invitrogen) pre sekvenciranja oba lanca. Humani HER3 je izveden iz cDNK biblioteke humanog fetalnog mozga (Source) i sekvenca proverena poređenjem sa NM_001982.

[0411] Da bi se dobili obeleženi (engl. tagged) rekombinantni proteini, humani, mišji, pacovski HER3 i HER3 cyno majmuna su umnoženi pomoću PCR metode uz korišćenje Pwo Taq polimeraze (Roche Diagnostics). Umnoženi PCR proizvodi su prečišćeni na gelu i klonirani u pDonR201 (Invitrogen) “Gateway” ulazni vektor koji je prethodno modofokovan da uključuje “in-frame” N-terminalnu CD33 lider sekvencu i C-terminalni TAG, npr, FLAG TAG. TAG dozvoljava prečišćavanje monomernih proteina preko anti-TAG monoklonskog antitela. Ciljni geni su uokvireni sa AttB1 i AttB2 dozvoljavajući rekombinaciju u “Gateway” prilagođene vlasničke odredišne (engl. destination) vektore (npr, pcDNA3.1) primenom Gateway® tehnologije kloniranja (Invitrogen). Reakcije rekombinacije su izvedene uz upotrebu Gateway LR reakcije sa vlasničkim odredišnim vektorima koji se sastoje od CMV promotora da bi se dobili TAG ekspresioni vektori, mada bilo koji komercijalno dostupni vektor može da se koristi.

[0412] Dalje su rekombinantni HER3 proteini proizvedeni tako što su fuzionisani HER3 ECD ushodno od C-terminalnog Factor X mesta isecanja i region zgloba humanog IgG i Fc domen da bi se dobio Fc-obeleženi protein. Da bi se to postiglo, različiti HER3 ECD-ovi su umnoženi primenom PCR metode i klonirani u vektor (npr, pcDNA3.1) modofokovan tako da se sastoji od “in-frame” C-terminalne fuzije Factor X mesto isecanja–region zgloba-hFc. Dobijeni otvoreni okvir čitanja je uokviren sa AttB1 i AttB2 sekvencama za dalje kloniranje primenom Gateway® tehnologije rekombinantnog kloniranja (Invitrogen). LR Gateway reakcije su korišćene za transfer HER3-Fc u odredišni ekspresioni konstrukt koji sadrži CMV promotor. Konstrukti koji eksprimiraju HER3 tačkastu mutaciju su dobijeni korišćenjem standardnih protokola za dirigovanu mutagenezu i sekvenca tako dobijenih vektora je proverena.

Tabela 8. Dobijanje HER3 ekspresionih vektora. Numeracija HER3 aminokiselina se zasniva na NP_001973 (humana), NP_034283 (mišja) i NP_058914 (pacovska).

(iii) Ekspresija rekombinantnih HER3 proteina

[0413] Željeni HER3 rekombinantni proteini su eksprimirani u ćelijskim linijama izvedenim iz HEK293 prethodno prilagođenim za kulturu u suspenziji i gajenih u medijumu bez seruna koji je vlasništvo Novartisa. Provera ekspresije na malom uzorku je urađena testom tranzijentne transfekcije na ploči sa 6 bunara zasnovanom na lipofekciji. Proizvodnja proteina u većim količinama putem tranzijentne transfekcije je izvedena u bioreaktorskom Wave™ sistemu zapremine 10-20 L (Wave Biotech). DNK Polietilenimin (Polysciences) je korišćen kao plazmidni nosač u odnosu 1:3 (w:w). Supernatanti ćelijske kulture su prikupljeni 7-10 dana nakon transfekcije i koncentrovani pomoću “cross-flow” filtracije i dijafiltracije pre prečišćavanja.

(iv) Prečišćavanje obeleženog proteina

[0414] Rekombinantni obeleženi HER3 proteini (npr, TAG-HER3) su prečišćeni prikupljanjem supernatanta ćelijske kulture i koncentrovanjem 10-puta pomoću tangencijalne filtracije sa 10 kDa “cut off” filterom (Fresenius). Anti-TAG kolona je pripremljena sprezanjem anti-TAG monoklonskog antitela sa CNBr aktiviranom Sefarozom 4B sa krajnjim odnosom 10 mg antitela po mL smole. Koncentrovani supernatant je nanesen na kolonu sa 35ml anti-Tag pri brzini protoka od 1- 2 mL/ minutu. Nakon osnovnog ispiranja sa PBS-om, vezani materijal je eluiran sa 100 mM glicina (pH 2.7), neutralizovan i sterilno filtriran. Koncentracije proteina su određene merenjem apsorbance na 280 nm i preračunavanjem korišćenjem teorijskog faktora od 0.66 AU/ mg. Prečišćeni protein je konačno okarakterisan pomoću SDS-PAGE metode, N-terminalnog sekvenciranja i LC-MS metode.

(v) Prečišćavanje obeleženog Fc fragmenta (Fc Tag)

[0415] Koncentrovani supernatant ćelijske kulture je nanesen na Protein A sefaroza kolonu brzog protoka (Protein A Sepharose Fast Flow column) od 50 ml pri brzini protoka od 1 ml/min. Nakon osnovnog ispiranja sa PBS-om, kolona je isprana sa 10 mM NaH2PO4/ 30%-tni (v/v) Izopropanol, pH 7.3 u količini od 10 zapremina kolone, a nakon toga sa 5 zapremina kolone PBS-a. Konačno, vezani materijal je eluiran sa 50 mM Citrata/140 mM NaCl (pH 2.7), neutralizovan i sterilno filtriran.

(vi) Stvaranje ćelijskih linija sa prekomernom ekspresijom

[0416] Za stvaranje ćelijske linije koja eksprimira visoke nivoe HER3 na površini ćelije, konstruisan je sisarski ekspresioni vektor koji nosi insert koji kodira za CD33 lider sekvencu uzvodno od aminokiselinskih ostataka 20-667 humanog HER3 fuzionisanog “in-frame” sa aminokiselinskim reziduama 669-1210 humanog EGFR. Kada se eksprimira u sisarskim ćelijama nastali himerni protein se sastoji od N-terminalnog HER3 vanćelijskog i transmembranskog domena i C-terminalnog EGFR citoplazmatskog domena. HER3/1 vektor je transfektovan u CHO-S ćelije (Invitrogen) i stabilna grupa ćelija je proizvedena nakon selekcije antibiotikom. Tako dobijena ćelijska linija (CHO HER3/1) je eksprimirala visoke nivoe vanćelijskog domena HER3 površini ćelije.

(vii) HuCAL GOLD® Paning (in vitro selekcija prema afinitetu)

[0417] Za selektovanje antitela koja prepoznaju humani HER3 korišćene su višestruke paning strategije. Terapijska antitela protiv humanog HER3 proteina su proizvedena selekcijom klonova koji imaju visoke afinitete za vezivanje, korišćenjem komercijalno dostupne biblioteke prikazane u fagu, MorphoSys HuCAL GOLD® biblioteke kao izvora različitih antitela. Fagmid biblioteka je zasnovana na HuCAL® konceptu (Knappik i sar., (2000) J Mol Biol 296:57-86) i koristi CysDisplay® tehnologiju za prikazivanje Fab na površini faga (WO01/05950 za Lohning).

[0418] Za izolaciju anti-HER3 antitela, standardne, kao i RapMAT paning strategije su izvedene korišćenjem čvrste faze, rastvora, cele ćelije i različitih pristupa paningu cele ćelije.

(viii) Paning na čvrstoj fazi

[0419] Raznovrsne strategije paninga na čvrstoj fazi su sprovedene da bi se identifikovala anti-HER3 antitela korišćenjem različitih rekombinantnih HER3 proteina. Za izvođenje svakog ciklusa paninga na čvrstoj fazi, Maxisorp ploče (Nunc) su obložene HER3 proteinom. Obeleženi proteini su ili zarobljeni korišćenjem ploča prethodno obloženih sa anti-Fc (kozji ili mišji anti-humani IgG, Jackson Immuno Research), anti-Tag antitelom ili putem pasivne adsorpcije. Obložene ploče su isprane PBS-om i blokirane. Obložene ploče su isprane dvaput PBS-om pre dodavanja HuCAL GOLD® fag-antitela u vremenu od 2 časa na sobnoj temperaturi na aparatu za mućkanje. Vezani fagi su eluirani i dodati E. coli TG-1i inkubirani da bi došlo do infekcije fagom. Nakon toga su inficirane bakterije izolovane i zasejane na ploče sa agarom. Kolonije su odstranjene sa ploča i fagi prikupljeni i umnoženi. Svaka od HER3 paning strategija je obuhvatala pojedinačne cikluse paninga i sadržala je jedinstvene antigene, koncentracije antigena i jačinu ispiranja.

(ix) Panning u tečnoj fazi

[0420] Svaki ciklus paninga u tečnoj fazi je izveden korišćenjem različitih rekombinantnih HER3 proteina obeleženih biotinom u prisustvu ili odsustvu neuregulina 1-β1 (R&D Systems). Proteini su obeleženi biotinom korišćenjem “EZ-link sulfo-NHS-LC” kita za obeležavanje biotinom (Pierce) prema uputstvima proizvođača. 800µl magnetnih perli povezanih sa streptavidinom (Dynabeads, Dynal) je isprano jednom PBS-om i blokirano preko noći sa Chemiblocker-om (Chemicon). HuCAL GOLD<®>fag-antitela i odgovarajući HER3 obeležen biotinom su inkubirani u reakcionoj epruveti. Streptavidin magnetne perle su dodate u vremenu od 20 minuta i sakupljene pomoću separatora za magnetne čestice (Dynal). Vezani fagi su isprani sa perli Dynabeads dodatkom pufera koji sadrži DTT u svaku epruvetu i dodati u E. coli TG-1. Infekcija fagom je izvedena na isti način kao što je opisano kod”-a paninga na čvrstoj fazi. Svaka od HER3 paning strategija je obuhvatala pojedinačne cikluse paninga i sadržala je jedinstvene antigene, koncentracije antigena i jačinu ispiranja

(x) Paning zasnovan na ćelijama

[0421] Za paning ćelija, HuCAL GOLD<®>fag-antitela su inkubirana sa približno 10<7>ćelija na rotatoru u vremenu od 2 časa na sobnoj temperaturi, nakon čega je urađeno centrifugiranje. Ćelijski talog je izolovan i fagi su elirani sa ćelija. Supernatant je sakupljen i dodat u E. coli TG-1 kulturu, nakon čega je postupak nastavljen kao što je opisano u prethodnom tekstu. Dve strategije zasnovane na ćelijama su upotrebljene za identifikovanje anti-HER3 antitela: a) Paning celih ćelija: U ovoj strategiji različite intaktne ćelijske linije su korišćene kao antigeni.

b) Diferencijalni paning celih ćelija: U ovoj strategiji antigeni su se sekvencijalno sastojali od ćelija i rekombinantnih HER3 proteina (videti 1981.09 kao primer). Paning zasnovan na ćelijama je izveden kao što je opisano u prethodnom tekstu kada su bili u pitanju protokoli za paning na čvrstoj fazi gde su rekombinantni proteini korišćeni kao antigeni. Ispiranja su izvedena korišćenjem PBS-a (2-3X) i PBST-a (2-3X).

(xi) RapMAT™ formiranje biblioteke i paning

[0422] U cilju povećanja afiniteta vezivanja antitela a da se u isto vreme održi raznovrsnost biblioteke, proizvodi drugog ciklusa paninga u tečnoj fazi i na čvrstoj fazi su uvedeni u RapMAT™ proces dok su proizvodi trećeg kruga paninga cele ćelije i diferencijalnog paninga cele ćelije uvedeni u proces (Prassler i sar., (2009) Immunotherapy; 1: 571-583). RapMAT™ biblioteke su proizvedene sub-kloniranjem Fab-kodirajućih inserta faga odabranih putem paninga u vektor za prikazivanje pMORPH®25_bla_LHC i dalje podvrgnute digestiji da se dobiju H-CDR2 RapMAT™ biblioteke i L-CDR3 RapMAT™ biblioteke korišćenjem specifičnih restrikcionih enzima. Inserti su zamenjeni TRIM kasetama za sazrevanje antitela (Virnekas i sar., (1994) Nucleic Acids Research 22:5600- 5607) za H-CDR2 ili L-CDR3 prema sastavu pula. Veličine biblioteka su procenjene da su u okviru 8x10<6>-1x10<8>klonova. RapMAT antitelo-fag je proizveden i podvrgnut paningu u tečnoj fazi, na čvrstoj fazi ili paningu cele ćelije u dva ciklusa, korišćenjem prethodno opisanih eksperimentalnih metoda.

Primer 2: Tranzijentna ekspresija anti-HER3 IgG-a

[0423] Suspenzija adaptiranih HEK293-6E ćelija je gajena u BioWave20 do gustine od oko 2x 106 vijabilnih ćelija/ mL. Ćelije su tranzijentno transfekovane relevantnom sterilnom DNK: PEI-MIX i dalje gajene. Sedam dana nakon transfekcije, ćelije su uklonjene tangencijalnom filtracijom korišćenjem Fresenius filtera (0.2 μm). Bezćelijski materijal je koncentrovan tangencijalnom filtracijom korišćenjem filtera sa “cut off” vrednošću od 10kDa (Fresenius) i koncentrat je sterilno profiltriran pomoću “Stericup” filtera (0.22 μm). Sterilni supernatant je čuvan na temperaturi od 4°C.

Primer 3: Prečišćavanje anti-HER3 IgG

[0424] Prečišćavanje IgG je izvedeno pomoću ÄKTA 100 explorer Air chromatography sistema na temperaturi od 6°C u kabinetu za hlađenje, korišćenjem XK16/20 kolone sa 25 mL spakovane MabSelect SuRe smole (sve GE Healthcare). Sve brzine protoka su bile 3.5 mL/min, osim za punjenje kolone, sa ograničenjem pritiska od 5 bara. Kolona je uravnotežena PBS-om zapremine jednake kao tri zapremine kolone pre nanošenja filtriranog fermentacionog supernatanta pri protoku od 2.0 mL/min. Kolona je isprana PBS-om zapremine jednake kao 8 zapremina kolone. IgG je eluiran pH gradijentom, počevši sa 50 mM citratom/70 mM NaCl (pH 4.5), snižavajući linearno u 12 zapremina kolone do 50 mM citrat/70 mM NaCl (pH 2.5), što je praćeno sa konstantnim korakom od 2 zapremine kolone istog pufera sa vrednošću od pH 2.5. Frakcije koje sadrže IgG su objedinjene i odmah neutralizovane i sterilno filtrirane (Millipore Steriflip, 0.22 um). Izmerena je vrednost OD280i izračunata koncentracija proteina na osnovu podataka o sekvenci. U svakom pulu je posebno testirana agregacija (SEC-MALS) i čistoća (SDS-PAGE i MS).

Primer 4: Ekspresija i prečišćavanje HuCAL �-Fab antitela u E. coli

[0425] Ekspresija Fab fragmenata kodiranih od pMORPH®X9_Fab_MH u TG-1 ćelijama je izvedena u kulturama sa mućkanjem boca korišćenjem 500 mL 2x YT medijuma obogaćenog sa 34 µg/mL hloramfenikola. Kulture su mućkane na temperaturi od 30°C dok vrednost OD600nm nije dostigla 0.5. Ekspresija je indukovana dodatkom 0.75 mM IPTG (izopropil-ß-D-tiogalaktopiranozida) u trajanju od 20 časova na temperaturi od 30 °C. Ćelije su razbijene korišćenjem lizozima. Fab fragmenti obeleženi sa His6su izolovani primenom IMAC (Bio-Rad). Zamena pufera sa 1x Dulbecco-vim PBS-om (pH 7.2) je izvedena korišćenjem PD10 kolona. Uzorci su sterilno filtrirani (0.2 µm). Koncentracije proteina su određene pomoću UV-spectrofotometrije. Čistoća uzoraka je analizirana pomoću denaturišuće, redukcione 15%-tne SDS-PAGE metode. Homogenost Fab preparata je određena u nativnom stanju pomoću hromatografije na molekularnim sitima (HP-SEC) sa kalibracionim standardima.

Primer 5: Merenja afiniteta (KD) atitela na HER3 pomoću titracije ravnoteže rastvora (SET)

[0426] Određivanje afiniteta u rastvoru je esencijalno izvedeno kao što je prvobitno opisano (Friguet i sar., (1985) J Immunol Methods 77:305-19). U cilju poboljšanja osetljivosti i preciznosti SET metode, prebačena je iz klasičnog ELISA testa u tehnologiju zasnovanu na ECL (Haenel i sar., (2005) Anal biochem 339:182-84).

[0427] Neobeležen HER3-Tag (humani, pacovski, mišji ili cyno majmuna) opisan u prethodnom tekstu je korišćen za određivanje afiniteta pomoću SET.

[0428] Podaci su ocenjeni pomoću XLfit softvera (ID Business Solutions) primenjujući prilagođene fitovane modele. Za određivanje KDsvakog IgG korišćen je sledeći model (modofikovan prema Piehler, et al (Piehler i sar., (1997) J Immunol Methods 201:189-206).

[IgG]: primenjena ukupna koncentracija IgG

x: primenjena ukupna koncentracija rastvorljivog antigena (mesta vezivanja)

Bmax: maksimalni signal IgG bez antigena

KD: afinitet

Primer 6: Određivanje vezivanja ćelija od strane antitela pomoću FACS metode

[0429] Vezivanje antitela za endogeni humani antigen eksprimiran na humanim ćelijama kancera je procenjen pomoću FACS metode. U cilju određivanja EC50vrednosti antitela SK-Br-3 ćelije su sakupljene akutazom i razblažene do 1 x10<6>ćelija/mL u FACS puferu (PBS/ 3% FBS/ 0.2% NaN3).1 x105 ćelija/bunaru je dodato u svaki bunar ploče sa 96 bunara (Nunc) i centrifugiranio na 210 g tokom 5 minuta na temperaturi od 4°C pre uklanjanja supernatanta. Serijska razblaženja test antitela (razblažena u koracima 1:4 FACS puferom) su dodata istaloženim ćelijama i inkubirana tokom 1 časa na ledu. Ćelije su ispirane i istaložene tri puta sa 100 µL FACS pufera. PE konjugovani kozji anti-humani IgG (Jackson ImmunoResearch) razblaženi u odnosu 1/200 FACS puferom su dodati ćelijama i inkubirani na ledu u vremenu od 1 časa. Dodatni koraci ispiranja su izvedeni tri puta sa po 100 µL FACS pufera, praćeno koracima centrifugiranja na 210 g tokom 5 minuta na temperaturi od 4°C. Konačno, ćelije su resuspendovane u 200 µL FACS pufera i vrednosti fluorescence su izmerene pomoću FACSArray aparata (BD Biosciences). Količina anti-HER3 antitela vezanog za površinu ćelije je procenjena merenjem fluorescencije srednjeg kanala.

Primer 7: HER3 domen i vezivanje mutanta

[0430] Maxisorp ploče sa 96 bunara (Nunc) su obložene preko noći na temperaturi od 4°C sa 200 ng odgovarajućeg rekombinantnog humanog proteina (HER3-Tag, D1-2- Tag, D2- Tag, D3-4- Tag, D4- Tag, HER3 K267A- Tag, HER3 L268A-Tag, HER3 K267A/ L268A i tagobeležena irelevantna kontrola). Svi bunari su zatim isprani tri puta rastvorom PBS-a sa 0.1% Tween-20, blokirani u vremenu od 1 čas rastvorom PBS/ 1% BSA/ 0.1% Tween-20 i isprani tri puta rastvorom PBS-a sa 0.1% Tween-20. Anti-HER3 antitela su dodata u odgovarajuće bunare do finalne koncentracije od 10 µg/mL i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom dva časa. Ploče su isprane tri puta rastvorom PBS-a sa 0.1% Tween-20 pre dodavanja odgovarajućeg antitela za detekciju povezanog sa peroksidazom razblaženog u odnosu 1/10000 u rastvoru PBS/ 1% BSA/ 0.1% Tween-20. Antitela upotrebljena za detekciju su bila kozja anti-mišja (Pierce, 31432), zečja anti-kozja (Pierce, 31402) i kozja anti-humana (Pierce, 31412). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom jednog časa pre ispiranja tri puta rastvorom PBS-a sa 0.1% Tween-20. 100 µl rastvora supstrata TMB (3,3’, 5,5’ tetrametil benzidin) (BioFx) je dodato u sve bunare u vremenu od 6 minuta pre zaustavljanja reakcije dodatkom 50 µl 2.5% H2SO4. Stepen vezivanja HER3 antitela za svaki rekombinantni protein je određen merenjem vrednosti OD450korišćenjem SpectraMax čitača ploča (Molecular Devices). Tamo gde je odgovarajuće, krive doza-odgovor su analizirane korišćenjem Graphpad Prism.

Primer 8: Mapiranje epitopa HER3 korišćenjem masene spektrometrije razmene vodonik/ deuterijum

Materijali

[0431] D2O pufer je napravljen rastvaranjem 25 mM TBS (pH 7.5)/ 500 mM NaCl u teškoj vodi (Sigma). Redukcioni rastvor je 50mM formatni pufer (pH 4) 500mM TCEP i rastvor za kvenčovanje reakcije 0.5% (v/v) trifluorosirćetna kiselina (TFA) u vodi. Pufer A je bio 0.25% mravlja kiselina/ 10% metanol/ 10% etilen glikol u vodi, i pufer B je bio 0.25% mravlja kiselina u acetonitrilu. Sve hemikalije su nabavljene od Sigma, a rastvarači HPLC čistoće su nabavljeni od Fisher Scientific.

Rukovanje tečnostima i hromatografija

[0432] Automatizovani eksperimenti masene spektrometrije razmene vodonik-deuterijum (HDX MS) experimenti su dizajnirani na osnovu metoda i opreme opisane kod Wales i sar., (2006) Anal. Chem. 78:1005-1014). Ukratko, za sve operacije rukovanja sa tečnostima korišćen je Pal HTS liquid-handler (LEAP Technologies) smešten u hlađenoj zatvorenoj posudi čuvanoj na temperaturi od 2ºC. Injekcioni ventil sa 6 izlaza i instalacija za ispiranje su namešteni na aparat za rukovanje tečnostima i olakšali ubrizgavanje uzorka u hromatografski sistem i ispiranje šprica. Hromatografski sistem, koji se sastojao od dodatnog ventila sa 10 izlaza, Poroszyme pepsin kolona dimenzija 2.1 mm x 30 mm (Applied Biosystems), Cap Trap kasete reverzne-faze dimenzija 0.5 mm x 2 mm (Michrom Bioresources), i spakovanog emitera elektrospreja kao analitičke kolone (100 µm x ~60 mm, Kinetex 2.6 µm C18, Phenomenex). Glava ventila sa 10 izlaza, Cap Trap kaseta i analitička kolona su čuvane u odvojenim zatvorenim od aluminijuma i držane na temperaturi od -5ºC pomoću peltierovih elemenata. Ventili i kolone su bili konfigurisani na taj način da dozvole “in-line” digestiju proteina, uklanjanje soli iz rastvora peptida, i hromatografija reverzne faze pre unošenja uzorka u izvor jonizacije elektrosprejem (ESI) masenog spektrometra (LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific).

[0433] Tokovi tečnosti potrebni za rad su obezbeđeni pomoću dve odvojene HPLC pumpe. Prva HPLC pumpa (Surveyor MS pump, Thermo Scientific) je dostavljala pufer A pri konstantnoj brzini protoka od 125 µL/min i korišćena je za kretanje uzorka kroz kasetu sa imobilisanim pepsinom na trap kasetu reverzne faze postavljenu iza ventila sa 10 izlaza. Nakon nanošenja uzorka i perioda potrebnog za uklanjanje soli, ventil sa 10 izlaza je uključen da eluira uzorak pomoću gradijent pumpe (AQUITY UPLC, Waters) za trap kasete reverzne faze, kroz analitičku kolonu i u izvor jona masenog spektrometra. Kaseta sa imobilizovanim enzimom je izolovana ka otpadu tokom elucije gradijentom. Gradijent pumpa je dostavljala segmente linearnog gradijenta od 0 do 40% mobilne faze B tokom 35 minuta pri protoku od 5 µL/min i 40 do 95% mobilne faze B pri protoku od 5 µL/min tokom 10 minuta. Protok gradijenta iz pumpe je podeljen na ventilu sa 10 izlaza korišćenjem pasivnog razdeljivanja tako da je pravi protok kroz trap kasetu i analitičku kolonu pri eluciji gradijentom bio ~1 µL/min. Ceo ciklus hromatografije je trajao 70 minuta uključujući korake ispiranja i uravnoteživanja.

Masena spektrometrija

[0434] U cilju identifikacije proteolitičkih fragmenata nastalih “online” digestijom izvedeno je nekoliko MS/MS eksperimenata zavisnih od podataka. U tom cilju, tandem MS spektra je bio dobijen LTQ analizatorom LTQ-Orbitrap hibridnog masenog spektrometra. Selekcija mase prekursora je bila zasnovana na MS skenovima dobijenim pomoću Orbitrap analizatora. Jednostepena MS ispitivanja izvedena u cilju određivanja nivoa deuterizacije su realizovana pri rezoluciji od 60,000 pomoću Orbitrap (preko m/z 400-2000) analizatora.

Dobijanje proteina i kompleksa protein:Fab

[0435] HER3 protein je pripremljen razblaživanjem 50 µg HER3-Tag sa 25 mM TBS (pH 7.5)/ 500 mM NaCl da bi se dobila konačna zapremina od 50 µL. Kompleksi Protein:Fab su pripremljeni mešanjem 50 µg HER3-Tag u molarnom odnosu 1:1 sa izučavanim Fab fragmentima. Smeše protein:Fab su razblažene do konačne zapremine od 50 µL sa 25 mM TBS (pH 7.5)/ 500 mM NaCl.

[0436] Kompleksi protein:Fab su pripremljeni i ostavljeni da se inkubiraju tokom najmanje 2 časa na temperaturi od 4ºC. Četiri ploče sa 96 bunara koje sadrže uzorak, diluent, sredstvo za kvenčovanje reakcije, i redukcione rastvore su unete u aparat za rukovanje tečnostima pre početka svakog eksperimenta. Za eksperimente sa jednom izmenom 50 µL HER3 ili HER3:Fab kompleksa je razblaženo sa 150 µL D2O pufera. Smeša je redukovana dodatkom 200 µL redukcionog pufera tokom 1 minuta pre kvenčovanja sa 600 µL pufera za kvenčovanje. Ukupna zapremina nakon svih koraka sa rukovanjem tečnošću je bila ~1mL. Jednom pomešan, kvenčovani rastvor je injektovan u hromatografski sistem gde je podvrgnut automatskoj digestiji, razdvojen i analiziran pomoću LCMS. Prosečna promena u deuterizaciji između uzorka i kontrole je izračunata kao razlika između nivoa preuzimanja deuterijuma od strane uzorka i kontrole.

Obrada podataka

[0437] Orbitrap RAW fajlovi su prevedeni u mzXML fajlove korišćenjem “in-house” programa (RawXtract). Nakon toga, tandemski podaci dobijeni pomoću MS su pretraženi korišćenjem SEQUEST (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) i rezultati pretrage automatski filtrirani korišćenjem DTASelect 2.0 (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Korišćenjem identifikacija peptidne sekvence, “in-house” napisani program je upotrebljen za automatsko izdvajanje hromatograma pojedinačnog jona za svaku identifikovanu sekvencu i stvaranje prosečnih spektara preko hromatografskog pika. Prosečni spektri su izglađeni i centrirani. Nivo preuzimanja deuterijuma je razmatran kao razlika mase između uzorka sa deuterijumom i reference bez deuterijuma. Obrađeni podaci su ručno validirani i podešeni sa bi se ispravile nepreciznosti i greške iz koraka automatske obrade podataka. Nivoi preuzimanja deuterijuma su procenjeni za svaki ostatak proteinske sekvence putem delokalizacije sadržaja deuterijuma duž svakog peptida (tj., deljenjem uočenog nivoa deuterizacije brojem aminokiselina u tom peptidu). Ako ostatak odgovara više nego jednom peptidu, izračunata je prosečna vrednost za normalizovana preuzimanja deuterijuma svih peptida koji odgovaraju tom ostatku.

Primer 9: Određivanje kristalografske strukture X-zraka humanog HER3/ MOR09823 Fab i humanih HER3/MOR09825 Fab kompleksa

[0438] Predmetni primer prikazuje kristalnu strukturu cele dužine HER3 vezanog za Fab fragment MOR09823 i Fab fragment MOR09825, određenu pri rezoluciji od 3.2Å i 3.4Å, navedenim redom. Humani HER3 obeležen Tag sekvencom je dalje prečišćen pomoću HiLoad 26/60 Superdex 200 PrepGrade kolone (GE Healthcare) uravnotežene u PBS-u (pH 7.3). MOR09823 i MOR09825 Fab fragmenti eksprimirani u E. coli su izolovani liziranjem ćelija dejstvom lizozima i Fab fragmenti obeleženi His6-tag sekvencom su vezani na HisTrap_HP (GE Healthcare) koloni. MOR09823 Fab-fragmenti su dalje prečišćeni pomoću gel-filtracione hromatografije korišćenjem Superdex 75 16/60 kolone (GE Healthcare) uravnotežene u 25 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl.

[0439] HER3 Fab kompleksi su pripremljeni mešanjem Fab fragmenta u višku sa HER3 obeleženim tag-sekvencom u molarnim odnosima 1.3-1.8:1 (koncentracija je procenjena pomoću apsorbance na 280 nm korišćenjem izračunatih ekstinkcionih koeficijenata od 0.9 i 1.4 (mg/ml)-1cm-1 za HER3 i Fab, navedenim redom) i prečišćavanjem kompleksa na Superdex 200 10/300 koloni (GE Healthcare) uravnoteženoj u 25 mM Tris-u (pH 7.5), 150 mM NaCl. Frakcije pika su analizirane pomoću SDS-PAGE i LCMS metode. Za svaki kompleks, frakcije koje sadrže i HER3 i Fab u približno ekvimolarnom odnosu su sakupljene zajedno i koncentrovane. HER3/MOR09823 kristali su se formirali na temperaturi od 293K difuzijom pare sedeće kapi iz kapi koje sadrže 150 nl HER3/ MOR09823 kompleksa i 150 nl rastvora u rezervoaru (100 mM natrijum citrat pH 5.6, 20% PEG 4000 i 20% izopropanol). Kristali su preneti u rastvor u rezervoaru koji sadrži dodatni 8%-tni glicerol i trenutno ohlađeni u tečnom azotu. HER3/MOR09825 kristali su se formirali na temperaturi od 293K difuzijom pare stojeće kapi iz kapi koje sadrže 150 nl HER3/ MOR09825 kompleksa i 150 nl rastvora u rezervoaru (100 mM bis-tris pH 6.5, 16% PEG 10,000). Kristali su preneti u 100 mM bis-tris pH 6.5, 18% PEG 10,000 i 22% glicerol i trenutno ohlađeni u tečnom azotu.

[0440] Podaci su prikupljeni korišćenjem linije zraka 17-ID na aparatu Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory). Podaci o HER3/MOR09823 Fab kompleksu su obrađeni i kalibrisani na 3.2Å primenom HKL2000 (HKL Research Inc) u prostornoj grupi 1222 sa dimenzijama ćelije a=124.16, b=139.44, c=180.25 Å, sa dobrom statistikom.

Struktura HER3/ MOR09823 Fab je razrešena molekularnom zamenom korišćenjem Phaser (McCoy i sar., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674) sa fragmentima Fab i objavljenom strukturom HER3 ECD 1mb6 kao modelima za pretraživanje. Konačni model, koji sadrži 1 molekul HER3/MOR09823 Fab kompleksa po asimetričnoj jedinici, je izgrađen u COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) i prerađen prema R i Rfreevrednostima od 19.0 i 24.5%, redom, sa rmsd od 0.010 Å i 1.37° za dužine veze i uglove veze, redom, korišćenjem BUSTER (Global Phasing, LTD). Rezidue HER3 koji sadrže atome u okviru 5Å od bilo kog atoma u MOR09823 Fab kako je identifikovano u PyMOL programu (Schrödinger, LLC) su navedeni u tabelama 11 i 12. Podaci o HER3/MOR09825 Fab kompleksu su obrađeni i kalibrisani na 3.4Å korišćenjem autoPROC programa (Global Phasing, LTD) u prostornoj grupi 1222 sa dimenzijama ćelija a=124.23, b=140.94, c=180.25 Å, sa dobrom statistikom. Struktura HER3/ MOR09825 Fab je razrešena molekularnom zamenom korišćenjem Phaser programa (McCoy i sar., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674) sa HER3/MOR09823 Fab strukturom kao modelom za pretraživanje. Konačni model koji sadrži 1 molekul HER3/MOR09825 Fab kompleksa po asimetričnoj jedinici, je izgrađen u COOT programu (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) i prerađen prema R i Rfreevrednostima 18.8 i 24.9%, redom, sa rmsd od 0.009 Å i 1.21° za dužine veze i uglove veze, redom, korišćenjem BUSTER programa (Global Phasing, LTD). Rezidue HER3 koji sadrže atome u okviru 5Å od bilo kog atoma u MOR09825 Fab kako je identifikovano u PyMOL programu (Schrödinger, LLC) su navedeni u tabelama 13 i 14.

Primer 10: Fosfo-HER3 in vitro ćelijski testovi.

[0441] MCF-7 ćelije su rutinski održavane u medijumu DMEM/F12, 15mM HEPES, L-glutamin, 10%-tni FCS i SK-Br-3 u medijumu McCoy’s 5a, 10%-tni FCS, 1.5mM L-glutamin. Sub-konfluentne MCF7 ili SK-Br-3 ćelije gajene u kompletnom medijumu su sakupljene sa akutazom (PAA Laboratories) i resuspendovane u odgovarajućem medijumu za rast pri konačnoj koncentraciji od 5x 10<5>ćelija/ mL.100 μL ćelijske suspenzije u svaki bunar ploče sa 96 bunara sa ravnim dnom (Nunc) da se dobije konačna gustina od 5x 10<4>ćelija/ bunaru. MCF7 ćelije su ostavljene da se zalepe za podlogu tokom približno 3 časa pre nego što je medijum zamenjem medijumom za gladovanje koji sadrži 0.5% FBS. Sve ploče su zatim inkubirane preko noći na temperaturi od 37°C pre delovanja odgovarajućom koncentracijom HER3 antitela (razblaženih u odgovarajućem medijumu) u vremenu od 80 minuta na temperaturi od 37°C. MCF7 ćelije su obrađene sa 50 ng/mL neuregulin 1-β1 EGF domena (R&D Systems) tokom konačnih 20 minuta da se stimuliše HER3 fosforilacija. Svi medijumi su nežno aspirirani i ćelije su isprane ledeno-hladnim PBS-om koji sadrži 1mM CaCl2i 0.5 mM MgCl2(Gibco). Ćelije su lizirane dodatkom 50 μL ledeno-hladnog pufera za liziranje (20 mM Tris (pH8.0)/ 137 mM NaCl/ 10% Glicerol/ 2mM EDTA/ 1% NP-40/ 1 mM natrijum ortovanadat/, Aprotinin (10µg/mL)/ Leupeptin (10µg/mL)) i inkubirane na ledu uz mućkanje tokom 30 minuta. Lizati su zatim sakupljeni i centirfugirani na 1800 g tokom 15 minuta na temperaturi od 4°C da se uklone rezidue ćelija. Dodato je 20 μL lizata u unapred pripremljene “hvatajuće” ploče.

[0442] HER3 “hvatajuće” (capture) ploče su proizvedene korišćenjem ploče od ugljenika (Mesoscale Discovery) obložene preko noći na temperaturi od 4°C sa 20 μL μg/mL MAB3481 “hvatajućeg” antitela (R&D Systems) razblaženog u PBS-u i zatim blokirane 3%-tnim goveđim serum-albuminom u 1x Tris puferu (Mesoscale Discovery) sa 0.1% Tween-20. HER3 je “uhvaćen” iz lizata inkubacijom ploče na sobnoj temperaturi tokom 1 čas uz mućkanje pre nego što je lizat aspiriran i bunari isprani r 1x Tris puferom (Mesoscale Discovery) sa 0.1% Tween-20. Fosforilisani HER3 je detektovan korišćenjem 0.75 μg/mL anti-fosfotirozin antitela obeleženog biotinom (R&D Systems) pripremljenih u 1% BSA/ 1x Tris/ 0.1% Tween-20 inkubiranjem uz mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Bunari su isprani četiri puta sa 1x Tris/ 0.1% Tween-20 i proteini obeleženi biotinom su detektovani inkubiranjem sa streptavidinom obeleženim S-Tag seekvencom (Mesoscale Discovery) razblaženim u 1% BSA/ 1x Tris/ 0.1% Tween-20 tokom jednog časa na sobnoj temperaturi. Sadržaj svakog bunara je aspiriran i bunar ispran četiri puta sa 1x Tris/ 0.1% Tween-20 pre dodavanja 20 μL Read pufera T sa surfaktantom (Mesoscale Discovery) i signal kvantifikovan korišćenjem Mesoscale Sector Imager aparata. Antitela MOR06391 ili MOR03207 su bila uključena u eksperimente prenosa signala kao kontrole izotipa.

Primer 11: Fosfo-Akt (S473) in vitro ćelijski testovi.

[0443] Sub-konfluentne SK-Br-3 i BT-474 ćelije gajene u kompletnom medijumu su sakupljene sa akutazom (PAA Laboratories) i resuspendovane u odgovarajućem medijumu za rast pri konačnoj koncentraciji od 5x 10<5>ćelijas/ mL. 100μL ćelijske suspenzije u svaki bunar ploče sa 96 bunara sa ravnim dnom (Nunc) da se dobije konačna gustina od 5x 10<4>ćelija / bunaru. Sve ploče su zatim inkubirane preko noći na temperaturi od 37°C pre delovanja odgovarajućom koncentracijom HER3 antitela (razblaženih u odgovarajućem medijumu) u vremenu od 80 minuta na temperaturi od 37°C. Svi medijumi su nežno aspirirani i ćelije su isprane ledeno-hladnim PBS-om koji sadrži 1mM CaCl2i 0.5 mM MgCl2(Gibco). Ćelije su lizirane dodatkom 50 μL ledeno-hladnog pufera za liziranje (20 mM Tris (pH8.0)/ 137 mM NaCl/ 10% Glicerol/ 2mM EDTA/ 1% NP-40/ 1 mM natrijum ortovanadat/, Aprotinin (10µg/mL)/ Leupeptin (10µg/mL)) i inkubirane na ledu uz mućkanje tokom 30 minuta. Lizati su zatim sakupljeni i centirfugirani na 1800 g tokom 15 minuta na temperaturi od 4°C da se uklone rezidue ćelija. 20 μL lizata je dodato u multi-spot Phospho-Akt ploču od ugljenika sa 384 bunara (Mesoscale Discovery) koja je prethodno blokirana sa 3% BSA/ 1x Tris/ 0.1% Tween-20. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom dva časa uz mućkanje pre nego što je lizat aspiriran i bunari isprani četiri puta sa 1x Tris puferom (Mesoscale Discovery) sa 0.1% Tween-20. Fosforilisana Akt je detektovana korišćenjem 20 µL SULFO-TAG antifosfo-Akt (S473) antitela (Mesoscale Discovery) razblaženog 50 puta u 1% BSA/ 1x Tris/ 0.1% Tween-20 inkubiranjem uz mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Bunari su isprani četiri puta sa 1x Tris/ 0.1% Tween-20 pre dodavanja 20 μL Read pufera T sa surfaktantom (Mesoscale Discovery) i signal kvantifikovan korišćenjem Mesoscale Sector Imager aparata. Antitela MOR06391 ili MOR03207 su bila uključena u eksperimente prenosa signala kao kontrole izotopa.

Primer 12: Testovi proliferacije ćelijske linije.

[0444] SK-Br-3 ćelije su rutinski gajene u McCoy’s 5A modifikovanom medijumu, obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i BT-474 ćelije su gajene u medijumu DMEM obogaćenom sa 10% FBS-a. Sub-konfluentne ćelije su tripsinizirane, isprane PBS-om, razblažene do 5x 10<4>ćelija/ mL medijumom za rast i zasejane u crne ploče sa 96 bunara providnog dna (Costar 3904) pri gustini od 5000 ćelija/ bunaru. Ćelije su inkubirane preko noći na temperaturi od 37°C pre dodavanja odgovarajuće koncentracije HER3 antitela (obično u konačnim koncentracijama od 10 ili 1 μg/mL). Ploče su vraćene u inkubator tokom 6 dana pre procene ćelijske vijabilnosti korišćenjem CellTiter-Glo (Promega). 100 μL CellTiter-Glo rastvora je dodato u svaki bunar i inkubirano na sobnoj temperaturi uz nežno mućkanje tokom 10 minuta. Količina luminescencije je određena korišćenjem čitača ploča SpectraMax (Molecular Devices). Stepen inhibicije rasta dobijen sa svakim antitelom je izračunat upoređivanjem vrednosti luminiscencije dobijenih sa svakim HER3 antitelom sa kontrolnim antitelom koje predstavlja standardni izotip (MOR06391).

[0445] Za testove proliferacije MCF-7 ćelije su rutinski gajene u medijumu DMEM/ F12 (1:1) koji sadrži 4 mM L-Glutamin/ 15mM HEPES/ 10% FBS. Sub-konfluentne ćelije su tripsinizirane, isprane PBS-om i razblažene do 1 x10<5>ćelija/ mL sa medijumom DMEM/ F12 (1:1) koji sadrži 4 mM L-Glutamin/ 15mM HEPES/ 10 μg/mL Humani transferrin/ 0.2% BSA. Ćelije su zasejane u crne ploče sa 96 bunara providnog dna (Costar) pri gustini od 5000 ćelija/ bunaru. Odgovarajuća koncentracija HER3 antitela (obično u konačnim koncentracijama od 10 ili 1 μg/mL) je zatim dodata.10 ng/mL NRG1-β1 EGF domena (R&D Systems) je takođe dodato u odgovarajuće bunare da se stimuliše rast ćelija. Ploče su vraćene u inkubator tokom 6 dana pre procene ćelijske vijabilnosti korišćenjem CellTiter-Glo (Promega). Stepen inhibicije rasta dobijen sa svakim antitelom je izračunat oduzimanjem bekgraund (bez neuregulina) vrednosti luminiscencije i poređenjem rezultujućih vrednosti dobijenih za svako anti-HER3 antitelo sa kontrolnim antitelom koje predstavlja standardni izotip (MOR06391).

Primer 13: Ćelijski testovi za blokiranje liganda.

[0446] MCF-7 ćelije gajene u MEM medijumu obogaćenom sa 10% FBS-a i 1 μg/mL insulina (Sigma) su isprane i sakupljene u maloj zapremini FACSmax pufera za disocijaciju ćelija (Genlantis) pre dodavanja 5 mL FACS pufera (PBS/ 1% FBS/ 0.1% natrijum azid). Gustina ćelija je izbrojana i podešena do krajnje koncentracije od 1 x10<6>ćelija/ mL. 100 μl ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunar ploče sa 96 bunara i ćelije su istaložene centrifugiranjem (220g, 3 minuta, 4°C). Ćelijski talozi su resuspendovani u 100 μL odgovarajućih test antitela razblaženih u FACS puferu (uobičajena finalne koncentracije antitela su se kretale od 100 do 0.1 nM) i ploče su inkubirane na ledu tokom 45 minuta. Antitelo koje blokira ligand MAB3481 (R&D Systems) je uključčeno kao pozitivna kontrola. Ćelije su isprane dva puta puferom za bojenje pre dodavanja 10 nM NRG1-β1 EGF domena (R&D Systems) razblaženog u FACS puferu i inkubirane na ledu tokom 45 minuta. Ćelije su isprane dva puta puferom za bojenje i vezani neuregulin je detektovan inkubiranjem ćelija sa 10 nM antihumani NRG1-β1 EGF domen antitelom (R&D Systems) na ledu tokom 45 minuta. Ćelije su isprane dvaput puferom za bojenje i inkubirane na ledu tokom 45 minuta sa anti-kozjim antitelom vezanim sa PE (Jackson ImmunoResearch) razblaženim u odnosu 1/500 FACS puferom. Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem i talog je resuspendovan u 200 μL FACS pufera. Da bi se kvantifikovao svaki uzorak 10,000 živih ćelija je izbrojano pomoću LSR II Flow Cytometer aparata (BD Biosciences) i količina neuregulin vezanog za površinu ćelija je procenjena merenjem srednje vrednosti fluorescencije kanala.

Primer 14: Biohemijski testovi za blokiranje liganda

[447] Predmetni postupak uključuje uređaj Biosenzor zasnovan na rezonanci površinskog plazmona (SPR) (BiacoreTM, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) za ispitivanje sposobnosti kompleksa HER3/ antitelo da veže neuregulin.

[0448] BiacoreTM koristi fenomen rezonance površinskog plazmona (SPR) da detektuje i izmeri interakcije vezivanja. U uobičajenom Biacore eksperimentu, jedan od interagujućih molekula (neuregulin) je imobilisan na matriksu dok interagujući partner (HER3) protiče preko površine. Interakcije vezivanja dovode do povećanja mase sa senzorskoj površini i odgovarajućoj direktnoj promeni refraktivnog indeksa medijuma u blizini senzorske površine. Promene refraktivnog indeksa ili signal se snimaju u jedinicama rezonance (R.U.). Promene signala kao posledica asocijacije i disocijacije kompleksa se prate na neinvazivni način, kontinuirano i u realnom vremenu, a rezultati se prikazuju u obliku senzorgrama.

[0449] BiacoreTM T100 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) je korišćen za izvođenje svih ovde prijavljenih eksperimenata. Pripremanje senzorske površine i analize interakcija su izvedene na temperaturi od 250C. Pufer i Biacore reagensi su nabavljeni od GE Healthcare. U testu je korišćen “running buffer” koji sadrži 10mM Hepes, pH7.4/ 150mM NaCl, 0.05% P20, 0.5% BSA.

[0450] NRG-1β1 vanćelijski domen (R&D Systems) je inkubiran na ledu tokom 45 minuta sa EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinom (Pierce) u molarnom odnosu od 5:1. Reakcija je kvenčovana dodatkom etanolamina u višku i nevezani biotin uklonjen iz biotin-vezanog NRG korišćenjem spin kolona za uklanjanje soli (Zeba). Biotin-vezani NRG je “uhvaćen” na senzorski čip CAP pre-imobilisan sa približno 3000 R.U. ssDNK-streptavidin (Biotin CAPture kit) da se dobiju površinske gustine neuregulina u opsegu 400 – 600 R.U. Referentni protok je dobijen izostavljanjem biotin-vezanog NRG u koraku injektovanja tako da je samo ssDNA-streptavidin prisutan na protočnoj površini.

[0451] Kompleksi HER3/ antitelo su proizvedeni inkubiranjem 10nM humanog HER3-Fc sa rastućim koncentracijama (0 – 50nM) odgovarajućeg test-antitela tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi pre inkubiranja u BiacoreTM na temperaturi od 10°C. Analize interakcija su izvedene injektovanjem kompleksa HER3/ antitelo preko referentne i površina sa neuregulinom u serijama tokom 180 sekundi pri protoku od 60 μL/min. Disocijacija kompleksa je praćena tokom 180 sekundi pri protoku od 60 μL/min. Regeneracija površine je izvedena na kraju svakog ciklusa analize korišćenjem injektovanja u trajanju od 120 sekundi 8M guanidina: 1M NaOH (3:1) praćeno sa 120 sekundi injektovanja smeše 30% acetonitril/ 0.25M NaOH pri brzini protoka od 30 μL/min.

Primer 15: In vivo PD studije

[0452] BxPC3 i BT-474ćelije su gajene i implantirane u ženke atimusnih nu/nu Balb/C miševa (Harlan Laboratories) kao što je opisano u primerima 16 i 17.

[0453] Jednom kada su tumori dostigli odgovarajuću veličinu, životinje su ispitane u pogledu kvaliteta tumora. Životinje sa ulceroznim tumorima ili životinje sa tumorima ispunjenim tečnošću su isključene iz studije. Preostale životinje su primile intravenouzno doze antitela putem injekcije u lateralnu repnu venu. U datim vremenskim tačkama, životinje su eutanazirane CO2asfiksijom i cela krv je sakuoljena preko kardijačne punkture i smeštena u Eppendorf epruvete za uzorke od 1.5 mL. Tumorsko tkivo je odmah disekovano, smešteno u polipropilenske epruvete za uzorke sa navojem na vrhu i brzo smrznuto u tečnom azotu. Tkivo je skladišteno na temperaturi od -80<o>C do pripremanja lizata.

Primer 16: In vivo BT-474 testovi efikasnosti

[0454] BT-474 ćelije su gajene u DMEM medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma inaktivisanog toplotom bez antibiotika, do trenutka implantacije.

[0455] Jedan dan pre inokulacije ćelija, ženkama atimusnih nu/nu Balb/C miševa (Harlan Laboratories) je potkožno inplantirana kuglica sa kontinuiranim oslobađanjem -estradiola (Innovative Research of America) kako bi se održali nivoi estrogena u serumu. Jedan dan nakon implantacije kuglice -estradiola, 5 x106 ćelija je injektovano ortotopikalno u 4. masni lobus mlečne žlezde u suspenziji koja sadrži 50% matrigel bez fenol-reda (BD Biosciences) u Hank-ovom balansiranom slanom rastvoru. Ukupna zapremina injekcije koja sadrži ćelije u suspenziji je bila nakon implantacije ćelija životinje sa tumorom čija je zapremina oko 200 mm<3>su uključene u studiju efikasnosti. Uopšteno, ukupno 10 životinja po grupi je uključeno u studije efikasnosti.

[0456] Za studije pojedinačnog sredstva, životinje su primile intravenouzno doze putem injekcije u lateralnu repnu venu MOR10701 ili MOR10703. Početna količina od 40 mg/kg je data kao prva doza. Nakon početne doze, životinje su dobijale 20 mg/kg, po rasporedu za sve ostale dane tokom trajanja studije. Za kombinovane studije, životinje su dobijale dozu MOR10701 ili MOR10703 (20mg/kg, iv, q2d) i sub-optimalnu dozu trastuzumaba (1mg/kg, iv, 2qw).

[0457] Tokom trajanja studija, zapremina tumora je merena mikrometrom dva puta nedeljno. Vrednosti procenta tretman/ kontrola (T/C) su izračunate korišćenjem sledeće formule:

% T/C = 100��T/�C if�T >0

u kojoj je:

T = prosečna zapremina tumora grupe tretirane lekom poslednjeg dana studije;

�T = prosečna zapremina tumora grupe tretirane lekom poslednjeg dana studije – prosečna zapremina tumora grupe tretirane lekom prvog dana davanja doze;

C = prosečna zapremina tumora kontrolne grupe poslednjeg dana studije; i

�C = prosečna zapremina tumora kontrolne grupe poslednjeg dana studije – prosečna zapremina tumora kontrolne grupe prvog dana davanja doze.

[0456] Telesna težina je merena dva puta nedeljno i doza je prilagođena telesnoj težini. % promene telesne težine je računat kao (BWtrenutni- BWpočetni)/(BWpočetni) x 100. Podatak je prikazan kao procenat promene telesne težine od dana početka tretmana.

[457] Svi podaci su iskazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM). Promena zapremine tumora i telesne težine su korišćeni za statističku analizu. Između grupa poređenja su izvedena korišćenjem jednosmerne ANOVA analize praćene post hoc Tukey testom. Za sve statističke procene stepen značajnosti je iznosio p < 0.05. Značajnost je prijavljena u poređenju sa kontrolnom grupom.

Primer 17: In vivo BxPC3 studije efikasnosti

[0460] BxPC3 ćelije su gajene u RPMI-1640 medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma inaktivisanog toplotom bez antibiotika, do trenutka implantacije.

[0461] Ženkama atimusnih nu/nu Balb/C miševa (Harlan Laboratories) je subkutano implantirano 10 x106 ćelija u smeši 50% fosfatno puferisanog slanog rastvora sa 50% matrigela. Ukupna zapremina injekcije koja sadrži ćelije u suspenziji je bila Jedno kada su tumori dostigli veličinu od oko 200mm<3>, životinje su uključene u studiju efikasnosti. Uošteno, ukupno 10 životinja po grupi je uključeno u studije. Životinje su isključene ako su ispoljavale neuobičajene karakteristike rasta tumora pre uključivanja u studiju.

[0462] Životinje su dobiijale doze intravenski putem injekcije u lateralnu repnu venu. Početna količina od 40 mg/kg je data kao prva doza. Nakon početne doze, životinje su dobijale 20 mg/kg, po rasporedu za sve ostale dane tokom trajanja studije (25 dana pod tretmanom). Zapremina tumora i T/C su računate kako je prethodno opisano.

Primer 18: Fosfo-Akt (S473) in vivo PD testovi.

[0463] Približno 50 mm<3>zamrznutog tumorskog tkiva (npr. BT-474 ili BXPC-3) je otopljeno na ledu i 100 - 300 μL T-PER pufera (Pierce) koji sadrži inhibitore fosfataze (Roche) i proteaze (Roche) je dodato svakom uzorku. Zapremina dodatog pufera za liziranje je zavisila od veličine uzorka tumora. Tkivo je usitnjeno korišćenjem mikrotuba za usitnjavanje od 1.5 mL (Fisher Scientific) i dobijene suspenzije su inkubirane na ledu tokom 15 minuta pre nego što su zamrznute preko noći na -80 °C. Uzorci su otopljeni i centrifugirani tokom 15 minuta na 13000 g, na temperaturi od 4 °C pre kvantifikacije koncentracije proteina u supernatantu pomoću BCA testa (Thermo Scientific). Tkivni supernatanti su razblaženi puferom za liziranje (Mesoscale Discovery) i 25 μg je dodato u multi-spot Phospho-Akt ploču od ugljenika sa 96 bunara (Mesoscale Discovery) koja je prethodno blokirana primenom Blocking Solution-A (Mesoscale Discovery). Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom jednog časa uz mućkanje pre nego što je lizat aspiriran i bunari isprani četiri puta Tris Wash puferom (Mesoscale Discovery). Fosforilisana Akt je detektovana korišćenjem 25 µL SULFO-TAG anti-fosfo-Akt (S473) antitela (Mesoscale Discovery) razblaženog u puferu za razblaživanje antitela inkubiranjem uz mućkanje na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Bunari su isprani četiri puta Tris Wash puferom pre dodavanja 150 μL Read pufera T (sa surfaktantom) (Mesoscale Discovery) i kvantifikovanjem signala korišćenjem aparata Mesoscale Sector Imager.

Primer 19: Fosfo HER3 (Y1197) in vivo PD testovi

[0462] Približno 50 mm<3>zamrznutog tkiva tumora (npr. BXPC-3) je otopljeno na ledu i 100-300 μL T-PER pufera (Pierce) koji sadrži inhibitore fosfataze (Roche) i proteaze (Roche) je dodato svakom uzorku. Tkivo je usitnjeno korišćenjem mikrotuba za usitnjavanje od 1.5 mL (Fisher Scientific) i dobijene suspenzije su inkubirane na ledu tokom 15 minuta pre nego što su zamrznute preko noći na -80 °C. Uzorci su otopljeni i centrifugirani tokom 15 minuta na 13000 g, na temperaturi od 4°C pre kvantifikacije koncentracije proteina u supernatantu pomoću BCA testa (Thermo Scientific). Tkivni supernatanti su razblaženi puferom za liziranje i 150 μg je dodato u multi-spot ploču od ugljenika sa 96 bunara (Mesoscale Discovery) koja je prethodno obložena tokom noći sa 4 μg/mL MAB3481 (R&D Systems) i blokirana 3%-tnim mlekom. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom dva časa uz mućkanje pre nego što je lizat aspiriran i bunari isprani četiri puta Tris Wash puferom (Mesoscale Discovery). Fosforilisani HER3 je vezan korišćenjem anti-HER3 pY1197 antitela razblaženih u odnosu 1/8000 sa puferom za blokiranje. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom jednog časa bunari su isprani Tris Wash puferom i anti-pY1197 antitelo je detektovano korišćenjem anti-zečjeg antitela obeleženog S-Tag sekvencom (Mesoscale Discovery) razblaženog u odnosu 1/1000 u puferu za blokiranje inkubiranjem uz mućkanje na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Bunari su isprani četiri puta Tris Wash puferom pre dodavanja 150 μl Read puferom T razblaženim u odnosu 1/4 (with surfactant) (Mesoscale Discovery) i kvantifikacijom signala korišćenjem aparata Mesoscale Sector Imager.

Primer 20: In vitro studije kombinacije lekova

[465] Da bi se procenila mogućnost da se antitelo usmereno protiv HER3 kombinuje sa ciljanim terapijama, MOR09825 ili MOR10703 su kombinovani sa trastuzumabom, lapatinibom, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001, erlotinibom i cetuksimabom u testovima za vijabilnost ćelija. Približno 1000-1500 SK-Br-3 (McCoy’s), MDA-MB-453 (RPMI), FaDu (EMEM) ili L3.3 (RPMI) ćelija je zasejano u ploče sa 384 bunara u odgovarajućem medijumu za kulturu obogaćenom 2% FBS-om i ostavljeno da se pričvrste za podlogu preko noći na temperaturi od 37°C. Odgovarajuće kombinacije lekova (obično su finalne koncentracije za lapatinib, BKM120, i BYL719 u opsegu od 3μM do 13 nM; za RAD001 u opsegu od 27nM do 0.0041nM; za erlotinib u opsegu od 1 μM do 0.0025nM; za MOR1073 u opsegu od 100nm do 0.01nm; za cetuksimab u opsegu od 100nM do 0.0015nM; i za trastuzumab u opsegu od 300nM do 0.046nM)) su jedna za drugom dodavane u bunare tako da je svaka ploča sadržala krivu doza-odgovor za svaki lek u dvodimenzionalnom matriksu. Ploče su vraćene u inkubator tokom 3-6 dana pre procene ćelijske vijabilnosti korišćenjem CellTiter-Glo (Promega). CellTiter-Glo rastvor je dodat u svaki bunar i inkubiran na sobnoj temperaturi uz nežno mućkanje u vremenu od 10 minuta. Količina luminiscencije je određena korišćenjem čitača ploča SpectraMax (Molecular Devices). Stepen inhibicije rasta dobijen sa svakom kombinacijom je izračunat i aktivnost kombinacije istaknuta korišćenjem modela aditivnosti prema Loewe-u.

Primer 21: In vivo studije kombinacije lekova u L3.3 ćelijama.

[0466] Ćelije pankreasa L3.3 su gajene u DMEM medijumu koji sadrži 10% fetalni goveđi serum inaktivisan toplotom, do trenutka implantacije. Ženkama Foxn1 nude miševa (Harlan Laboratories) je subkutano implantirano 3 x106 ćelija DMEM medijumu bez FBS-a. Ukupna zapremina injekcije koja sadrži ćelije u suspeniji je bila 100 12 dana nakon implantacije ćelija, životinje su obuhvaćene studijom efikasnosti sa prosečnom zapreminom tumora od otprilike 100mm3 za sve grupe. Uopšteno, ukupno 8 životinja po grupi je uključeno u studije.

Životinje su isključene ako su ispoljavale neuobičajene karakteristike rasta tumora pre uključivanja u studiju.

[0467] Životinje su primile dozu MOR10703 intravenouzno putem injekcije u lateralnu repnu venu od 20 mg/kg, prema rasporedu za sve druge dane tokom trajanja studije (14 dana pod tretmanom). Erlotinib je doziran sa 50mg/kg (PO) prema dnevnom rasporedu kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji sa MOR10703. Zapremina tumora i T/C vrednosti su izračunate kao što je prethodno opisano.

Rezultati i diskusija

[0468] Ukupno, ovi rezultati pokazuju da se klasa antitela vezuje za aminokiselinske rezidue u okviru domena 2 i domena 4 konformacionog epitopa HER3 i stabilizuje HER3 u neaktivnoj ili zatvorenoj konformaciji. Vezivanje ovih antitela inhibira i ligand-zavisni i ligand-nezavisni prenos signala. Ova antitela su takođe u stanju da se vežu istovremeno sa HER3 ligandom.

(i) Određivanje afiniteta

[0469] Afinitet antitela je određen titracijom ravnoteže rastvora (SET) kao što je opisano u prethodnom tekstu. Rezultati su sumirani u tabeli 9 i primer titracione krive za MOR10701 su prikazani na slici 1. Podaci ukazuju na to da je identifikovan broj antitela koja se čvrsto vezuju za humani, cyno, pacovski i mišji HER3.

Tabela 9: KDvrednosti anti-HER3 IgGs kako je određeno postupkom titracije ravnoteže rastvora (SET). Hu (čovek), Cy (cynomolgus majmun), Mu (miš) i ra (pacov)

(ii) Određivanje EC50SK-Br-3 ćelije

[0470] Mogućnost da se identifikovana antitela vežu za ćelije koje eksprimiraju HER3 je određena izračunavanjem EC50vrednosti njihovog vezivanja ćelija linije SK-Br-3 sa amplifikovanim HER2 (videti sliku 2 i tabelu 10).

Tabela 10: FACS EC50vrednosti anti-HER3 IgG na SK-Br-3 ćelijama. n.d. (nije definisano)

(iii) Vezivanje domena HER3

[0471] Podset anti-HER3 antitela je okarakterisan prema njihovoj sposobnosti da se vežu za različite vanćelijske domene humanog HER3 u ELISA testu. Da bi se ovo postiglo, vanćelijski domen HER3 je podeljen na njegova četiri konstitutivna domena i različite kombinacije ovih domena su klonirane, eksprimirane i prečišćene kao nezavisni proteini kao što je ovde opisano. Korišćenjem ove strategije sledeći domeni su uspešno proizvedeni kao rastvorljivi proteini: domeni 1 i 2 (D1-2), domen 2 (D2), domeni 3 i 4 (D3-4) i domen 4 (D4). Određeni broj interno stvorenih mišjih anti-humanih HER3 antitela (8D7, 1F5 i 8P2) je takođe ispitan kao pozitivne kontrole da se demonstrrira integritet svakog izolovanog domena.

[0472] Kao što je prikazano na slici 3 za MOR09823 i MOR09825 je uočeno da se uspešno vezuju za HER3 vanćelijski domen, ali malo vezivanja za izolovane domen je zapaženo u ovom testu sa ovim antitela. Postoji nekoliko mogućih objašnjenja za ovaj obrazac vezivanja: a) MOR09823 i MOR09825 mogu da se vežu za linearni epitop koji obuhvata ganicu domena, stoga bi deo vezujućeg epitopa bio izgubljen kada se domeni eksprimiraju kao izolatovani proteini.

b) MOR09823 i MOR09825 mogu da se vežu za nelinearni epitop koji premošćava multiple domene. Kao posledica, razdvajanje HER3 na njegove sastavne jedinice može da uništi mesto vezivanja.

c) Oblik/konformacija HER3 može da bude komponenta vezivanja MOR09823 i MOR09825 za HER3 tako da je samo cela dužina vanćelijskog domena HER3 sposobna da poprimi ovaj oblik/ konformaciju dok izolovani domeni ne mogu u potpunosti da zauzmu ovu konformaciju.

(vi) Mapiranje HER3 epitopa primenom masene spektrometrije razmene vodonik/ deuterijum

[0473] HER3 epitop je dalje istražen pomoću HDX-MS analize HER3 ECD u prisustvu i odsustvu Fab verzija MOR09823, MOR09824, MOR09825 i MOR09974. Slika 4A prikazuje da je, u odsustvu vezanog Fab fragmenta, približno 69% HER3 ECD sekvence pokriveno najmanje jednim peptidom. Praznine u pokrivenosti mogu da budu posledica glikozilacije ostataka u ovim regionima ili nedovoljne redukcije disulfidnih veza u regionima bogatim cisteinom, što je naročito očigledno u domenu 2. Zanimljivo, iako je svaki Fab fragment doneo jedinstvene obrasce zaštite, jedan region jake zaštite je dosledno primećen sa MOR09823, MOR09824, MOR09825 i MOR09974 (videti sliku 4B) ukazujući na to da se ovi visoko povezani članovi familije antitela vezuju za HER3 na identičan način. Najjača zaštita je primećena za domen 2, rezidue 269-286 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (SEQ ID NO: 146) ukazujući na to da rezidue u ovom neposrednom okruženju mogu da budu značajni za mAb vezivanje. Mapiranje ostataka zaštićenih Fab fragmentom na publikovanoj HER3 kristalnoj strukturi (Cho & Leahy, (2002) Science 297:1330-1333) naglašavaju da su rezidue 269-286 unutar i blizu funkcionalno važne petlje β-ukosnice u domenu 2 (videti sliku 4C).

(vii) Kristalna struktura HER3/ MOR09823

[0474] Kristalna struktura x-zraka pri rezoluciji od 3.2Å MOR09823 Fab fragmenta vezanog za HER3 vanćelijski domen je razrešena da se dalje definiše HER3 epitop koji je prepoznat od strane ove familije srodnih antitela (videti sliku 5A). Osim toga, struktura MOR09825 Fab fragmenta dobijena pri rezoluciji od 3.4Å, vezanog za humani HER3 je rešena. U obe, MOR09823/ HER3 i MOR09825/ HER3 kristalne strukture, HER3 je u zatvorenoj (neaktivnoj) konformaciji (videti slika 5A, B, C i D). Ova konformacija je okarakterisana značajnom površinom interakcije između domena 2 i 4 posredovanom dimerizacionom petljom β-ukosnice u domenu 2. Zapažena konformacija HER3 je slična onoj prethodno opisanoj kod Cho i sar. (Cho & Leahy, (2002), Science 297:1330-1333) koji su objavili kristalnu strukturu HER3 vanćelijskog domena u odsustvu neuregulina. Budući da neuregulin može da aktivira HER3, pretpostavlja se da je zatvorena konformacija HER3 neaktivna. Slične zatvorene konformacije su takođe zapažene kada su srodni članovi EGFR familije HER4 (Bouyain i sar., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:15024-15029) i HER1 (Ferguson i sar., (2003) Molec. Cell 11:507-517) bili kristalizovani.

[0475] Prostorni odnosi između domena 1 do 4 HER3 u neaktivnom (zatvorenom) stanju se značajno razlikuju od proširenog (aktivnog) stanja. Ovo otkriće je zasnovano na kristalnim strukturama srodnih članova EGFR familije HER2 i HER1vezanog za ligand (Cho i sar., (2003) Nature 421:756-760; Ogiso i sar., (2002) Cell 110:775-787; Garrett i sar., (2002) Cell 110:763-773) od kojih su oba u proširenom (aktivnom) stanju. U proširenom stanju, dimerizaciona petlja β-ukosnice domena 2 je oslobođena inhibitorne interakcije sa domenom 4 i stoga slobodna da stupi u interakciju sa svojim proteinskim dimerizacionim partnerima. Na ovaj način, dimerizaciona petlja β-ukosnice domena 2 je funkcionalno važna za održavanje zatvorenog (neaktivnog) stanja i u posredovanju u dimerizaciji EGF receptora proširenom stanju, što vodi aktivaciji unutarćelijskog domena kinaze. Kristalne strukture MOR09823/ HER3 i MOR09825/ HER3 (videti sliku 5) zato sugerišu da MOR09823 i MOR09825 funkcionišu putem stabilizacije neaktivne konformacije HER3.

[0476] Kristalna struktura takođe otkriva da HER3 epitop prepoznat od strane MOR09823 i MOR09825 predstavlja nelinearni epitop koji uključuje rezidue oba domena 2 i 4 (videti slike 5C i D, tabele 11, 12, 13 i 14). HER3 epitop prepoznat od strane ove familije visoko srodnih antitela može, prema tome, da se definiše kao:

Domen 2: rezidue 265-277, 315

Domen 4 rezidue: 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615

[0477] Vezivanje oba domena, 2 i 4 od strane MOR09823 ili MOR09825 bi sledstveno stabilizovalo zatvorenu konformaciju HER3 na taj način antagonizujući njegovu sposobnost prenosa signala.

[0478] Model vezivanja MOR09823/ MOR09825 zapažen u kristalnoj strukturi je dosledan sa našim ostalim studijama mapiranja epitopa. Specifično, eksperimenti vezivanja domena izvedeni ELISA testom pokazuju da je afinitet MOR09823 i MOR09825 značajno veći za intaktni HER3 vanćelijski protein nego za bilo koji izolovani domen (npr. D1, D1-D2, D3, ili D3-D4 fragmenti) (videti sliku 3). Postoji takođe slaganje sa HER3 HDX-MS podacima (videti sliku 4B), koji indentifikuju β-ukosnicu domena 2 kao deo epitopa koji prepoznaje antitelo. Konačno, obe kristalne strukture ukazuju na to da ligand-vezujuća površina HER3, koja je mapirana po analogiji sa HER1 domenima 1 i 3 (Ogiso i sar., (2002) Cell, 110:775-787; Garrett i sar., (2002) Cell, 110:763-773) nije zatvorena vezivanjem bilo MOR09823 ili MOR09825 (videti sliku 5B). Ovo je dosledno sa našim nalazima da ni MOR09823 ni MOR09825 ne blokira vezivanje neuregulina za MCF7 ćelije (videti sliku 9) i da kompleksi HER3/MOR09823 mogu da se vežu za imobilisani neuregulin u “biacore” studijama (videti sliku 10).

Tabela 11: Interakcije između teškog lanca MOR09823 Fab i humanog HER3. Fab VH rezidue su numerisane na osnovu njihove linearne aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 15). HER3 rezidue su numerisane na osnovu NP_001973. Prikazane HER3 rezidue imaju najmanje jedan atom u okviru 5Å od atoma u MOR09823 Fab.

Tabela 12: Interakcije između lakog lanca MOR09823 Fab i humanog HER3. Fab VL rezidue su numerisane na osnovu njihove linearne aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 14). HER3 rezidue su numerisane na osnovu NP_001973. Prikazane HER3 rezidue imaju najmanje jedan atom u okviru 5Å od atoma u MOR09823 Fab.

Tabela 13: Interakcije između teškog lanca MOR09825 Fab i humanog HER3. Fab VH rezidue su numerisane na osnovu njihove linearne aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 51). HER3 rezidue su numerisane na osnovu NP_001973. Prikazane HER3 rezidue imaju najmanje jedan atom u okviru 5Å od atoma u MOR09825 Fab.

Tabela 14: Interakcije između lakog lanca MOR09825 Fab i humanog HER3. Fab VL rezidue su numerisane na osnovu njihove linearne aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 50). HER3 rezidue su numerisane na osnovu NP_001973. Prikazane HER3 rezidue imaju najmanje jedan atom u okviru 5Å od atoma u MOR09825 Fab.

[0479] Vizuelni pregled kristalnih struktura MOR09823/ MOR09825 je istakao da HER3 rezidue Lys267 i Leu268 formiraju višestruke interakcije sa raznovrsnim CDR regionima antitela sugerišući da oni mogu da budu važni za vezivanje antitela. Otuda, Lys267 i/ ili Leu268 su mutirani u alanin, eksprimirani i dobijeni rekombinantni proteini su prečišćeni u cilju procene njihove uloge u vezivanju antitela. ELISA testovi vezivanja su ukazali na to da mutacija Lys267 ili Leu268 ukida vezivanje MOR10703 za HER3 (slika 5F) sugeriše da su oba ostatka integralni deo HER3 epitopa i time podržava predložene interakcije između MOR09823/ MOR09825 i HER3.

(viii) Inhibicija ćelijskog prenosa signala

[0480] Da bi se razjasnio efekat anti-HER3 antitela na ligand-zavisnu HER3 aktivnost MCF7 ćelije su inkubirane sa IgG pre stimulacije neuregulinom. Primeri inhibicione krive su ilustrovani na slici 6A i sumarani u tabeli 15. Efekat anti-HER3 antitela na HER2-posredovanu HER3 aktivaciju je takođe proučavana korišćenjem ćelijske linije SK-Br-3 sa amplifikovanim HER2 (slika 6B i tabela 15).

Tabela 15: pHER3 IC50i vrednosti stepena inhibicije anti-HER3 IgG u MCF7, i SK-Br-3 ćelijama.

[0481] Da bi se odredilo da li inhibicija HER3 aktivnosti utiče na nishodni put ćelijskog prenosa signala, fosforilacija Akt je takođe merena u ćelijama sa amplifikovanim HER2 nakon tretmana sa anti-HER3 antitelima (videti sliku 7 i tabelu 16).

Tabela 16: pAkt (S473) IC50i vrednosti stepena inhibicije anti-HER3 IgG u SK-Br-3 BT-474 i MCF7 ćelijama.

[0482] Ukratko MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 MOR10703, MOR12609 i MOR12610 je svaki sposoban da inhibira ćelijsku HER3 aktivnost i na ligand-zavisni i na ligand-nezavisni način.

(ix) Inhibicija proliferacije

[0501] Budući da su MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 i MOR10703 svi inhibirali HER3 aktivnost i nishodni put prenosa signala ispitivana je njihova sposobnost da spreče ligand-zavisni i -nezavisni in vitro ćelijski rast (Podaci iz primera su prikazani na slici 8 i sumirani u tabeli 17). Sva ispitivana anti-HER3 antitela su bila efikasni inhibitori ćelijske proliferacije.

Tabela 17: Inhibicija proliferacije nakon tretmana sa 10 μg/ml anti-HER3 IgG u SK-Br-3, BT-474 i MCF7 ćelijama.

(x) Procena sprečavanja vezivanja liganda

[0484] Sposobnost opisanih anti-HER3 antitela da spreče vezivanje liganda je procenjena ispitivanjem vezivanja neuregulina za MCF7 ćelije prethodno tretirane sa MOR09823 ili MOR09825. Prisustvo MOR09823 ili MOR09825 nije imalo značajan efekat na sposobnost neuregulina da se veže za MCF7 ćelije dok je pozitivna kontrola korišćena u eksperimentu (Mab3481) bila sposobna da značajno interferira sa vezivanjem neuregulina (videti sliku 9). Ovi rezultati su dosledni sa kristalnom strukturom budući da MOR09823 interaguje sa domenima 2 i 4 dok se za glavne tačke kontakta za interakciju HER3 sa neuregulinom pretpostavlja da su primarno smeštene u domenima 1 i 3. S obzirom da je neuregulin u stanju da se veže za neaktivnu konformaciju HER3 (Kani i sar., (2005) Biochemistry 44: 15842-15857) verovatno je da MOR09823 i MOR09825 deluju sprečavajući rearanžmane HER3 domena neophodne za prenos signala ili putem interferencije sa dimerizacijom receptora.

(xi) Procena sprečavanja vezivanja liganda (biohemijski)

[0485] Da bi se istražilo da li MOR09823 i neuregulin mogu sa se vežu istovremeno za HER3 biohemijski test je ustanovljen korišćenjem Biacore<TM>tehnologije. Analize interakcije su izvedene “hvatanjem” neuregulina obeleženog biotinom na površini Biacore<TM>sensor čipa CAP (GE Healthcare) korišćenjem Biotin CAPture kita (GE Healthcare). Kompleksi HER3 su proizvedeni inkubiranjem humanog HER3-Fc fragmenta sa rastućim koncentracijama MOR09823, 105.5 (Thermo Scientific) ili humanog IgG. Unapred obrazovani kompleksi HER3/ antitelo su injektovani preko referentne i aktivnih površina i interakcija HER3 sa neuregulinom je posmatrana.

[0486] Kontrolni IgG nije imao efekta na obrazovanje kompleksa HER3/ neuregulin dok je za 105.5 primećeno da značajno inhibira sposobnost HER3 da vezuje neuregulin potvrđujući njegov opis kao antitela koje sprečava vezivanje liganda (slika 10). Nasuprot tome, kompleksi HER3/ MOR09823 su bili u stanju da vezuju neuregulin pokazujući da MOR09823 ne sprečava vezivanje liganda. Zanimljivo, dozno-zavisno povećanje RU vrednosti je bilo zapaženo samo kada su kompleksi MOR09823/ HER3 bili injektovani. Ovi podaci ukazuju na to da su trimerni kompleksi koji sadrže neuregulin, HER3 i MOR09823 nastali na površini čipa. Sposobnost ovih trimernih kompleksa da se formiraju je predviđena kristalnom strukturom HER3/ MOR09823 budući da vezivanje MOR09823 ne zatvara mesto vezivanja liganda HER3 sugerišući da se vezivanje neuregulina i MOR09823 međusobno ne isključuju.

[0487] U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment se vezuje za domen 2 i domen 4 HER3 bez sprečavanja istovremenog vezivanja liganda HER3 kao što je neuregulin.

[0488] Bez namere da se postavlja teorija, moguće je da se antitelo ili njegov fragment vezuje i za domen 2 i za domen 4 HER3, održava HER3 u neaktivnoj konformaciji bez blokiranja mesta vezivanja liganda na HER3. Stoga je HER3 ligand (npr, neuregulin) sposoban da se veže za HER3 u isto vreme kad i antitelo.

[0489] Antitela pronalaska ili njihovi fragmenti inhibiraju i ligand-zavisnu i -nezavisnu aktivacija HER3 bez sprečavanja vezivanja liganda. Ovo se smatra prednošću iz sledećih razloga:

(i) Terapijsko antitelo bi imalo kliničku kod širokog spektra tumora u odnosu na antitelo koje ciljano deluje na jedan mehanizam HER3 aktivacije (tj. ligand-zavisni ili ligand-nezavisni) budući da različiti tipovi tumora pokretani svaki od ovih mehanizama.

(ii) Terapijsko antitelo bi bilo efikasno kod tipova tumora su oba mehanizma HER3 aktivacije istovremeno uključena. Antitelo koje ciljano deluje na pojedinačni mehanizam aktivacije HER3 (tj. ligand-zavisni ili ligand-nezavisni) bi ispoljilo malo ili nimalo efikasnosti kod ovih tipova tumora.

(iii) Za efikasnost antitela koje inhibira ligand-zavisnu aktivaciju HER3 bez sprečavanja vezivanja liganda bi bilo manje verovatno da bude pod negativnim uticajem povećanja koncentracija liganda. Ovo bi vodilo ili povećanoj efikasnosti kod tipova tumora pokretanih vrlo visokim koncentracijama liganda HER3 ili smanjenom pojavom otpornosti na lekove tamo gde je otpornost posredovana ushodnom regulacijom HER3 liganda.

(iv) Antitelo koje inhibira HER3 aktivaciju stabilizovanjem neaktivnog oblika bi bilo manje podložno otpornosti na lekove izazvanoj alternativnim mehanizmima aktivacije HER3.

[0490] Zbog toga, antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje stanja kod kojih su postojeća terapijska antitela klinički neefikasna.

(xii) In vivo inhibicija HER3 aktivnosti i efekat na rast tumora

[0491] Da bi se odredila in vivo aktivnost opisanih anti-HER3 antitela, MOR09823 je ispitivan u oba, BxPC-3 i BT-474 modelu tumora. Za MOR09823 je pokazano da inhibira HER3 aktivnost što je dokazano značajnim smanjenjem nivoa pHER3 u tumoru (slika 11). Prenos signala nishodno od HER3 je slično inhibiran kako je pokazano sniženim nivoima pAkt u BxPC-3 i BT-474 (slika 11). U BT-474 studiji efikasnosti pokretanoj sa HER2, ponovljeni tretman sa MOR10701 je dao 74% inhibicije rasta tumora (videti sliku 12A) dok je MOR10703 dao 83% inhibicije. U BxPC3 modelu rasta tumora, i MOR10701 i MOR10703 su veoma efikasno inhibirali rast tumora pokretan ligandom (videti sliku 13).

(xiii) In vitro kombinacije lekova i uticaj na rast ćelija.

[0492] Budući da je rast ćelija tumora često pokretan višestrukim signalnim putevima, procenjivali smo da li bi kombinacije MOR09823 ili MOR10703 sa različitim ciljanim sredstvima bile od koristi u sprečavanju ćelijske proliferacije. Izabrana sredstva sa ciljanim delovanjem su primarno inhibirala HER2 (trastuzumab, lapatinib) EGFR (cetuksimab, erlotinib), PI3K/mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) i mTOR (RAD001) budući da su ovi ciljani molekuli obično aktivirani u humanim tumorima. Analiza izobologramom (videti sliku 14) je ukazala na to da MOR09823 i MOR10703 ispoljavaju sinergistički efekat kombinacija leka sa trastuzumabom, lapatinibom, erlotinibom, cetuksimabom, BEZ235, BKM120, BYL719 i RAD001. Ovi podaci sugerišu da je inhibicija HER3 signalnog puta od izuzetne koristi za inhibitore koji ciljano deluju na receptorske tirozin kinaze ili PI3K signalni put.

(xiv) In vivo MOR10703 kombinacije lekova

[0493] Budući da je inhibicija HER3 kombinovana sa sredstvima sa ciljanim delovanjem na receptorsku tirozin kinazu in vitro, procenjivali smo uticaj MOR10701 ili MOR10703 u kombinaciji sa trastuzumabom i erlotinibom in vivo. U BT-474 ksenograftovima (videti sliku 15A), kombinacija MOR10701 ili MOR10703 (20mg/kg) sa sub-optimalnom dozom trastuzumaba (1mg/kg) je bila dovoljna da indukuje regresiju tumora (%T/C= -50 i -37 redom). U L3.3 ksenograftovima pankreasa, kombinacija MOR10703 (20mg/kg) sa dnevnom dozom erlotiniba (50mg/kg) je dovela do staze tumora (%T/C= 3, videti sliku 15B). U oba modela, kombinacija dva leka je bila značajno efikasnija nego bilo koji lek samostalno primenjen, podržavajući na taj način naše ranije in vitro nalaze o koristi od kombinovanja antitela upravljenih protiv HER3 sa sredstvima koja ciljano deluju na ErbB.

[0494] Ukratko, jedinstvena sposobnost ove familije antitela da stabilizuju neaktivnu konformaciju HER3 dovodi do značajne in vivo efikasnosti u modelima u kojima je HER3 aktiviran ili aa ligand-zavisni ili na ligand-nezavisni način. Osim toga, inhibicija HER3 od strane ove familije antitela je očigledno korisna u kombinaciji sa raznovrsnim terapijama koje ciljano deluju.

Ekvivalenti

[0495] Gore navedene pisane specifikacije se smatraju dovoljnim da omoguće stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike da praktično izvede pronalazak. Gore navedeni opisi i primeri daju detalje određenih poželjnih primera izvođenja pronalaska i opisuju najbolji način po mišljenju pronalazača. Podrazumeva se, međutim, da bez obzira koliko je detalja navedeno gore u tekstu, pronalazak može da se izvede na mnogo načina i pronalazak treba tumačiti u skladu sa priloženim patentnim zahtevima i njihovim ekvivalentima.

LISTA SEKVENCI

[0496]

<110> Novartis AG GARNER, et al., Andrew

<120> ANTIBODIES FOR EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (HER3) <130> 54345

<160> 494

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1342

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 1

Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu 1 5 10 15

Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr 35 40 45

Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu 50 55 60

Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile 65 70 75 80

Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr

85 90 95

Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp

100 105 110

Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser 115 120 125

His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser 130 135 140

Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr 145 150 155 160

Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val

165 170 175

Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly

180 185 190

Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr 195 200 205

Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn 210 215 220

Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp 225 230 235 240

Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val

245 250 255

Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu

260 265 270

Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala 275 280 285

Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala 290 295 300

Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys 305 310 315 320

Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser

325 330 335

Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val

340 345 350

Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu 355 360 365

Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu 370 375 380

Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln 385 390 395 400

Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr

405 410 415

Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile

420 425 430

Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu 435 440 445

Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu 465 470 475 480

Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu

485 490 495

Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro

500 505 510

Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val 515 520 525

Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala 530 535 540

His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu 545 550 555 560

Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys

565 570 575

Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly

580 585 590

Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn 595 600 605

Glu Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro 610 615 620

Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr 625 630 635 640

His Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe

645 650 655

Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln

660 665 670

Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu 675 680 685

Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe 690 695 700

Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe 705 710 715 720

Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys

725 730 735

Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser

740 745 750

Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His 755 760 765

Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln 770 775 780

Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg 785 790 795 800

Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val

805 810 815

Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His

820 825 830

Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val 835 840 845

Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys 850 855 860

Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu 865 870 875 880

Glu Ser Ile His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser

885 890 895

Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr

900 905 910

Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu 915 920 925

Arg Leu Ala Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met 930 935 940

Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu 945 950 955 960

Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu

965 970 975

Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro

980 985 990

His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu 995 1000 1005

Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala 1010 1015 1020

Thr Thr Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu 1025 1030 1035

Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly 1040 1045 1050

Tyr Met Pro Met Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu 1055 1060 1065

Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser 1070 1075 1080

Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu 1085 1090 1095

Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser 1100 1105 1110

Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly 1115 1120 1125

Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val 1130 1135 1140

Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly 1145 1150 1155

Tyr Val Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg 1160 1165 1170

Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr 1175 1180 1185

Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg 1190 1195 1200

Arg Arg His Ser Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu 1205 1210 1215

Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala 1220 1225 1230

Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile 1235 1240 1245

Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met 1250 1255 1260

Asn Arg Gln Arg Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala 1265 1270 1275

Met Gly Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg 1280 1285 1290

Ala Phe Gln Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala 1295 1300 1305

Arg Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe 1310 1315 1320

Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn 1325 1330 1335

Ala Gln Arg Thr

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 2

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 3

Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 4

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 5

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 6

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 7

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 9

Gly Ala Val Gly Arg

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 10

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 11

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 12

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 12

Gly Ala Ser

1

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 13

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 16

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 17

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 17

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt actggtgctg ttggtcgtac ttattatcct 180

gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg ttggggtgat 300

gagggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca

348

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 20

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 21

Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 22

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 24

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 25

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 26

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 26

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 27

Ser Ala Trp Gly His Val

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 28

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 29

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 30

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 30

Gly Ala Ser

1

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 31

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 34

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 35

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 35

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt atttctgctt ggggtcatgt taagtattat 180

gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300

gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a

351

<210> 36

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 37

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 38

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 39

Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 40

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 40

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 41

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 42

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 43

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 44

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 45

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 45

Asn Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 46

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 47

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 48

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 48

Gly Ala Ser

1

<210> 49

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 49

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 52

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 53

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 53

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct attaattctc agggtaagtc tacttattat 180

gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300

gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351

<210> 54

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 55

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 56

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 57

Val Ile Asn Pro Ser Gly Asn Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 58

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 60

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 61

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 62

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 63

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 63

Asn Pro Ser Gly Asn Phe

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 64

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 65

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 66

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 66

Gly Ala Ser

1

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 67

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 68

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 69

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Asn Pro Ser Gly Asn Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 70

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 71

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 71

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attaatcctt ctggtaattt tactaattat 180

gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300

gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a

351

<210> 72

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 73

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Asn Pro Ser Gly Asn Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 74

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 75

Asn Thr Ser Pro Ile Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly 1 5 10 15

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 76

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 77

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 78

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 78

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 79

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 80

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 81

Ser Pro Ile Gly Tyr

1 5

<210> 82

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 82

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 83

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 83

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 84

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 84

Gly Ala Ser

1

<210> 85

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 85

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 86

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 87

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Asn Thr Ser Pro Ile Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 88

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 88

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 89

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 89

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcaat acttctccta ttggttatac ttattatgct 180

ggttctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg ttggggtgat 300

gagggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca

348

<210> 90

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Ala

210

<210> 91

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Asn Thr Ser Pro Ile Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215

<210> 92

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 92

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 93

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 94

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 95

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 95

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 96

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 97

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 98

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 98

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 99

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 99

Gly Ala Val Gly Arg Ser

1 5

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 100

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 101

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 101

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 102

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 102

Gly Ala Ser

1

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 104

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 104

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 105

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 105

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 106

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 106

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 107

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 107

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg acaggcgccg tgggcagaag cacctactac 180

cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 108

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 108

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 109

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 109

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 110

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 110

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 111

Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 112

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 113

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 113

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 114

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 114

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 115

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 115

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 116

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 116

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 117

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

Ser Ala Trp Gly His Val

1 5

<210> 118

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 118

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 119

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 119

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 120

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 120

Gly Ala Ser

1

<210> 121

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 121

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 122

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 122

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 123

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 123

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 124

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 124

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 125

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 125

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg atcagcgcct ggggccacgt gaagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351

<210> 126

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 126

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 127

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 127

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ala Trp Gly His Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 128

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 128

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 129

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 129

Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 130

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 131

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 132

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 132

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 133

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 134

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 134

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 135

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 135

Asn Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 136

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 137

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 137

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 138

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 138

Gly Ala Ser

1

<210> 139

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 139

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 140

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 140

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 141

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 141

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 142

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 142

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 143

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 143

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcaacagcc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 144

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 144

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 145

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 146

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 147

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 147

Ala Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 148

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 149

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 149

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 150

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 150

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

<210> 151

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 151

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 152

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 152

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 153

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 153

Ser Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 154

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 154

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 155

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 155

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 156

Gly Ala Ser

1

<210> 157

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 157

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 158

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 158

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 159

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 160

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 160

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 161

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 161

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcagcagcc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 162

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 162

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 163

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 163

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 164

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 164

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 165

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 165

Ala Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 166

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 167

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 167

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 168

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 168

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 169

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 169

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 170

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 171

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 171

Gly Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 172

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 172

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 173

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 173

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 174

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 174

Gly Ala Ser

1

<210> 175

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 175

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 176

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 176

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 177

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 177

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 178

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 178

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 179

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 179

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcggcagcc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 180

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 180

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 181

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 181

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 182

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 182

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 183

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 183

Ala Ile Ser Asn Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 184

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 184

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 185

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 185

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 186

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 187

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 188

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 188

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 189

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 189

Ser Asn Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 190

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 190

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 191

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 191

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 192

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 192

Gly Ala Ser

1

<210> 193

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 193

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 194

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 195

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 195

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Asn Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 196

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 196

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 197

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 197

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcagcaacc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a 351

<210> 198

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 198

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 199

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 199

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Asn Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 200

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 200

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 201

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 201

Val Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 202

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 202

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 203

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 204

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 205

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 205

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 206

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 206

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 207

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 207

Ser Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 208

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 208

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 209

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 209

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 210

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 210

Gly Ala Ser

1

<210> 211

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 211

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 212

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 212

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 213

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 213

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 214

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 214

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 215

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 215

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtc atcagcagcc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 216

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 216

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 217

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 217

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 218

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 219

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 219

Val Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 220

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 220

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 221

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 221

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 222

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 222

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 223

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 223

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 224

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 224

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 225

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 225

Gly Ser Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 226

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 226

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 227

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 227

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 228

Gly Ala Ser

1

<210> 229

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 229

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 230

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 230

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 231

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 232

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 232

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 233

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 233

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtc atcggcagcc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 234

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 234

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 235

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 235

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 236

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 236

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 237

Ala Ile Asn Ala Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 238

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 238

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 239

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 239

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 240

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 240

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 241

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 241

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 242

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 243

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 243

Asn Ala Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 244

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 244

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 245

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 245

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 246

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 246

Gly Ala Ser

1

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 247

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 248

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 248

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 249

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 249

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 250

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 250

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 251

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcaacgccc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 252

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 252

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 253

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 253

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 254

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 254

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 255

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 255

Ala Ile Asn Thr Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 256

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 257

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 257

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 258

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 258

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 259

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 259

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 260

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 260

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 261

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 261

Asn Thr Gln Gly Lys Ser

1 5

<210> 262

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 262

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 263

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 263

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 264

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 264

Gly Ala Ser

1

<210> 265

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 265

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 266

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 266

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 267

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 267

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Thr Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 268

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 268

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 269

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 269

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcaacaccc agggcaagag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 270

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 270

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 271

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 271

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Thr Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 272

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 272

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 273

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 273

Val Thr Gly Ala Val Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 274

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 274

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 275

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 275

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 276

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 276

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 277

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 277

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 278

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 278

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 279

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 279

Gly Ala Val Gly Ser Ser

1 5

<210> 280

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 281

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 281

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 282

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 282

Gly Ala Ser

1

<210> 283

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 283

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 284

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 284

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 285

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 285

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 286

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 287

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 287

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg acaggcgccg tgggcagcag cacctactac 180

cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 288

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 288

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 289

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 289

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 290

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 290

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 291

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 291

Val Thr Gly Ala Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 292

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 292

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 293

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 293

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 294

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 295

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 295

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 296

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 296

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 297

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 297

Gly Ala Val Gly Gly Ser

1 5

<210> 298

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 298

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 299

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 299

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 300

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 300

Gly Ala Ser

1

<210> 301

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 301

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 302

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 302

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 303

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 303

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 304

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 304

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 305

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 305

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg acaggcgccg tgggcggaag cacctactac 180

cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 306

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 306

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 307

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 307

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 308

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 309

Val Thr Gly Ala Val Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 310

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 310

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 311

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 311

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 312

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 312

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 313

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 313

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

<210> 314

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 314

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 315

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 315

Gly Ala Val Gly Lys Ser

1 5

<210> 316

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 316

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 317

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 317

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 318

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 318

Gly Ala Ser

1

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 319

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 320

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 320

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 321

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 321

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 322

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 322

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 323

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 323

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg acaggcgccg tgggcaaaag cacctactac 180

cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagatggggc 300

gacgagggct tcgacatctg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc a

351

<210> 324

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 324

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 325

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 325

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 326

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 326

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 327

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 327

Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15

<210> 328

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 328

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 329

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 329

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 330

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 330

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 331

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 331

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 332

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 332

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 333

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

Gly Ala Val Gly Arg Thr

1 5

<210> 334

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 334

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile 1 5

<210> 335

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 335

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 336

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 336

Gly Ala Ser

1

<210> 337

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 337

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 338

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 338

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 339

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 339

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 340

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 340

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc aactggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcagct tccccaccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa g

321

<210> 341

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 341

gaggtgcaat tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgtg acaggcgccg tgggcagaac ctactacccc 180

gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag atggggcgac 300

gagggcttcg acatctgggg ccagggcacc ctggtcaccg tcagctca

348

<210> 342

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 342

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 343

<211> 446

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 343

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 344

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 344

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 345

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 345

Val Ile Asn Gly Leu Gly Tyr Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 346

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 346

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 347

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 348

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 348

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 349

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 349

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr

1 5

<210> 350

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 350

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 351

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 351

Asn Gly Leu Gly Tyr Thr

1 5

<210> 352

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 352

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 353

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 353

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 354

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 354

Gly Ala Ser

1

<210> 355

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 355

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 356

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 356

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 357

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 357

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Asn Gly Leu Gly Tyr Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 358

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 358

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 359

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 359

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attaatggtc ttggttatac tactttttat 180

gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300

gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a

351

<210> 360

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 360

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 361

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapien

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Asn Gly Leu Gly Tyr Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 362

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 363

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 363

Gly Thr Gly Pro Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15

<210> 364

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 364

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 365

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 365

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 366

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 366

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 367

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 367

Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr 1 5

<210> 368

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 368

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 369

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 369

Gly Pro Tyr Gly Gly

1 5

<210> 370

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 370

Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

1 5

<210> 371

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 371

Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 372

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 372

Gly Ala Ser

1

<210> 373

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 373

Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

1 5

<210> 374

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 374

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 375

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 375

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly Thr Gly Pro Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 376

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 376

gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60

attacctgca gagcgagcca gggtatttct aattggctgg cttggtacca gcagaaacca 120

ggtaaagcac cgaaactatt aatttatggt gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180

cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240

gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300

ggtacgaaag ttgaaattaa a

321

<210> 377

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapien

<400> 377

caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcggt actggtcctt atggtggtac ttattatcct 180

gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg ttggggtgat 300

gagggttttg atatttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca

348

<210> 378

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 378

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 379

<211> 446

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 379

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly Thr Gly Pro Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 380

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 380

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 381

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 381

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 382

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 383

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 383

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 384

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 384

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 385

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 385

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 386

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 386

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 387

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 388

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 388

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 389

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 389

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 390

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 390

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 391

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 391

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 392

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 392

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 393

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 393

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 394

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 394

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 395

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 396

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 396

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 397

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 397

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 398

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 398

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 399

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 399

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 400

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 400

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 401

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 401

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Lys Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 402

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 402

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 403

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 403

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 404

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 404

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

<210> 405

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 405

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 406

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 406

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 407

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 407

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 408

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 408

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 409

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 409

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 410

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 410

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 411

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 411

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 412

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 412

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 413

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 413

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 414

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 414

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 415

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 415

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 416

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 416

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 417

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 417

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 418

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 419

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 419

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 420

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 420

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 421

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 421

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 422

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 422

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 423

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 423

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Lys Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile

100 105

<210> 424

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 424

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 425

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 425

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 426

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 426

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 427

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 427

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 428

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 428

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 429

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 429

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 430

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 430

Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 431

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 432

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 432

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 433

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 433

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 434

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 434

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 435

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 435

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95 Thr

<210> 436

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 436

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 437

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 437

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 438

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 438

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 439

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 440

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 440

Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 441

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 441

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 442

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 442

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 443

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 443

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 444

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 445

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 445

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 446

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 446

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 447

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 447

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 448

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 448

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95 Thr

<210> 449

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 449

Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 450

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 450

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 451

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 451

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 452

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 453

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 453

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 454

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 454

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 455

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 455

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 456

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 456

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 457

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 457

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 458

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 458

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 459

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 459

Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 460

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 460

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<210> 461

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 461

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 462

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 463

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 463

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 464

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 464

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 465

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 465

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 466

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 466

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 467

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 468

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 468

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 469

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 469

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 470

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 470

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 471

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 471

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 472

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 472

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 473

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 473

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 474

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 474

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 475

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 475

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 476

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 476

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 477

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 478

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 478

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 479

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 479

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 480

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 480

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 481

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 481

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

<210> 482

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 482

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 483

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 483

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 484

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 484

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 485

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 485

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 486

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 486

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 487

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 487

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 488

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 488

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 489

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 489

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 490

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 490

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 491

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 491

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 492

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 492

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 493

<211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapien

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is a framework region of any 30 amino acids

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa is a framework region of any 14 amino acids

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> Xaa is a framework region of any 32 amino acids

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa is a framework region of any 11 amino acids

<400> 493

Xaa Ser Tyr Ala Met Ser Xaa Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr 1 5 10 15

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Xaa Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp

20 25 30

Ile Xaa

<210> 494

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapien

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is a framework region of any 23 amino acids <220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa is a framework region of any 15 amino acids <220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa is a framework region of any 32 amino acids <220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa is a framework region of any 10 amino acids <400> 494

Xaa Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala Xaa Gly Ala Ser 1 5 10 15

Ser Leu Gln Ser Xaa Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr Xaa

20 25 30

Claims

PATENTNI ZAHTEVI:

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji prepoznaje konformacioni epitop HER3 receptora, naznačeno time što konformacioni epitop uključuje aminokiselinske rezidue 265-277, 315 unutar domena 2 i aminokiselinske rezidue 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 unutar domena 4 HER3 receptora, i naznačeno time što antitelo ili njegov fragment blokiraju i ligand-zavisni i ligand-nezavisni prenos signala.

2. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što se antitelo ili njegov fragment:

a) vezuje za HER3 receptor u neaktivnom stanju; ili

b) stabilizuje HER3 receptor u neaktivnom stanju.

3. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što vezivanje antitela stabilizuje HER3 receptor u njegovom neaktivnom stanju, i naznačeno time što HER3 ligand može istovremeno da se veže za ligand-vezujuće mesto na HER3 receptoru.

4. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 3, naznačeno time što vezivanje HER3 liganda za ligand-vezujuće mesto ne može da:

a) indukuje konformacionu promenu u HER3 receptoru, u aktivno stanje; ili

b) aktivira prenos signala.

5. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što:

a) se VH antitela ili njegov fragment vezuju za najmanje jednu od sledećih aminokiselinskih HER3 rezidua: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597; ili

b) se VL antitela ili njegov fragment vezuju za najmanje jednu od sledećih aminokiselinskih HER3 rezidua: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

6. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što izolovano antitelo ili njegov fragment prepoznaje konformacioni epitop prvog HER3 receptora, naznačeno time što:

a) vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za prvi HER3 receptor u odsustvu liganda za HER3 receptor redukuje ligand-nezavisno formiranje proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor u ćeliji koja ispoljava prvi HER3 receptor i drugi HER3 receptor; ili

b) vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za prvi HER3 receptor u prisustvu liganda za HER3 redukuje ligand-zavisno formiranje proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor u ćeliji koja ispoljava prvi HER3 receptor i drugi HER3 receptor.

7. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 6, naznačeno time što:

a) u odsustvu liganda za HER3 receptor, antitelo ili njegov fragment stabilizuju prvi HER3 receptor u njegovom neaktivnom stanju tako da prvi HER3 receptor ne može da dimerizuje sa drugim HER3 receptorom i formira proteinski kompleks prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor; ili

b) u prisustvu liganda za prvi HER3, antitelo ili njegov fragment stabilizuje prvi HER3 receptor u njegovom neaktivnom stanju tako da HER3 receptor ne može da dimerizuje sa drugim HER3 receptorom i formira proteinski kompleks prvi HER3 receptor- drugi HER3 receptor.

8. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 7, naznačeno time što nemogućnost formiranja proteinskog kompleksa prvi HER3 receptor-drugi HER3 receptor sprečava aktivaciju prenosa signala.

9. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što:

a) vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za HER3 receptor u odsustvu liganda za HER3 redukuje ligand-nezavisno formiranje proteinskog kompleksa HER2-HER3 u ćeliji koja ispoljava HER2 i HER3; ili

b) vezivanje antitela ili njegovog fragmenta za HER3 receptor u prisustvu liganda za HER3 redukuje ligand-zavisno formiranje proteinskog kompleksa HER2-HER3 u ćeliji koja ispoljava HER2 i HER3.

10. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 9, naznačeno time što:

a) u odsustvu liganda, antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u njegovom neaktivnom stanju tako da HER3 receptor ne može da dimerizuje sa HER2 receptorom i formira proteinski kompleks HER2-HER3; ili

b) u prisustvu liganda za HER3 antitelo ili njegov fragment stabilizuje HER3 receptor u njegovom neaktivnom stanju tako da HER3 receptor ne može da dimerizuje sa HER2 receptorom i formira proteinski kompleks HER2-HER3.

11. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 10, naznačeno time što nemogućnost formiranja proteinskog kompleksa HER2-HER3 sprečava aktivaciju prenosa signala.

12. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što je antitelo izabrano iz grupe koju sačinjavaju monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo i sintetisano antitelo.

13. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnih zahteva 3, 6 ili 9, naznačeno time što je ligand za HER3 izabran iz grupe koju sačinjavaju neuregulin 1 (NRG), neuregulin 2, betacelulin, heparin-vezujući faktor rasta epiderma, i epiregulin.

14. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što antitelo ili njegov fragment inhibira fosforilaciju HER3 kao što je procenjeno primenom:

a) eseja fosforilacije nezavisnog od HER3 liganda ili

b) eseja fosforilacije zavisnog od HER3 liganda.

15. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 14, naznačeno time što:

a) test HER3-ligand nezavisne fosforilacije, koristi HER2 amplifikovane ćelije, gde su HER2 amplifikovane ćelije SK-Br-3 ćelije i

b) test HER3-ligand zavisne fosforilacije, koristi stimulisane MCF7 ćelije u prisustvu neuregulina (NRG).

16. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što je antitelo ili njegov fragment u unakrsnoj kompeticiji sa ili se vezuje za isti konformacioni epitop kao antitelo MOR9823; MOR9824; MOR9825; MOR9974; MOR10452; MOR10701; MOR10702; MOR10703; MOR10703 N52S; MOR10703 N52G; MOR10703 N52S_S52aN; MOR10703 A50V_N52S; MOR10703 A50V_N52G; MOR10703 S52aT; MOR10701 R55S; MOR10701R55G; MOR10701 R55K; MOR10701 delS56; MOR12609 ili MOR12610.

17. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što je antitelo izabrano iz grupe koju sačinjavaju monoklonsko antitelo, himerno antitelo, jednolančano antitelo, Fab fragment i scFv.

18. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što je antitelo humano.

19. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što u sastav antitela ulazi konstantni region humanog teškog lanca i konstantni region humanog lakog lanca.

20. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što se antitelo ili njegov fragment vezuju i za HER3 čoveka i za HER3 majmuna cynomologus.

21. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što je antitelo ili njegov fragment IgG izotipa.

22. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od gore navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo sadrži okvirne sekvence (framework) nastale zamenom aminokiselinama iz odgovarajućih germinativnih sekvenci humanih regiona VH ili VL.

23. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, u čiji sastav prema računici Kabat ili Chothia ulazi 6 regiona CDR bilo kog od sledećih antitela MOR9823; MOR9824; MOR9825; MOR9974; MOR10452; MOR10701; MOR10702; MOR10703; MOR10703 N52S; MOR10703 N52G; MOR10703 N52S_S52aN; MOR10703 A50V_N52S; MOR10703 A50V_N52G; MOR10703 S52aT; MOR10701 R55S; MOR10701R55G; MOR10701 R55K; MOR10701 delS56; MOR12609 ili MOR12610.

24. U sastav izolovanog antitela ili njegovog fragmenta iz patentnog zahteva 1, ulazi: a) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 14, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

b) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 32, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

c) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 51 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 50, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

d) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 69 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 68, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

e) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 87 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 86, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

f) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 105 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 104, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

g) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 123 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 122, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

h) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 141 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 140, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

i) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 159 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 158, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

j) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 177 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 176, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

k) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 195 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 194, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

l) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 213 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 212, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

m) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 231 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 230, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

n) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 249 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 248, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

o) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 267 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 266, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

p) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 285 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 284, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

q) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 303 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 302, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

r) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 321 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 320, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

s) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 339 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 338, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

t) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 357 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 356, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična; ili

u) VH koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 375 i VL koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 374, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je 97-99% identična.

25. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca koja poseduje SEQ ID NO: 493 i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja poseduje SEQ ID NO: 494.

26. Izolovano antitelo ili njegov fragment iz patentnog zahteva 1, sadrži;

a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 2; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 3; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 4; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 5; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 6; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 7; ili

b) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 20; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 21; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 22; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 23; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 24; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 25; ili

c) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 38; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 39; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 40; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 41; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 42; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 43; ili

d) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 56; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 57; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 58; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 59; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 60; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 61; ili

e) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 74; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 75; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 76; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 77; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 78; i CDR3 of SEQ ID NO: 79; ili

f) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 92; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 93; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 94; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 95; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 96; i CDR3 of SEQ ID NO: 97; ili

g) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 110; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 111; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 112; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 113; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 114; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 115; ili

h) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 128; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 129; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 130; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 131; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 132; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 133; ili

i) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 146; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 147; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 148; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 149; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 150; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 151; ili

j) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 164; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 165; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 166; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 167; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 168; i CDR3 of SEQ ID NO: 169; ili

k) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 182; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 183; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 184; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 185; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 186; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 187; ili

l) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 200; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 201; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 202; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 203; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 204; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 205; ili

m) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 218; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 219; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 220; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 221; CDR2 sa sekvencom of SEQ ID NO: 222; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 223; ili

n) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 236; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 237; CDR3 sa sekvencom of SEQ ID NO: 238; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 239; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 240; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 241; ili

o) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 254; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 255; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 256; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 257; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 258; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 259; ili

p) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 272; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 273; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 274; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 275; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 276; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 277; ili

q) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 290; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 291; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 292; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 293; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 294; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 295; ili

r) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 308; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 309; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 310; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 311; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 312; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 313; ili

s) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 326; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 327; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 328; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 329; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 330; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 331; ili

t) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 344; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 345; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 346; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 347; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 348; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 349; ili

u) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 362; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 363; CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 364; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 365; CDR2 sa sekvencom SEQ ID NO: 366; i CDR3 sa sekvencom SEQ ID NO: 367.

27. Fragment antitela iz bilo kog prethodnog patentnog zahteva, izabran je iz grupe koja se sastoji od; Fab, F(ab2)’, F(ab)2’, scFv, VHH, VH, VL, d antitela .

28. Farmaceutska kompozicija se sastoji od antitela ili njegovog fragmenta izabranog iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljivog nosača.

29. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 28, osim toga sadrži dodatni terapijski agens.

30. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 29, naznačeno time što je dodatni terapijski agens izabran iz grupe koja sadrži inhibitor HER1, inhibitor HER2, inhibitor HER3, inhibitor HER4, inhibitor mTOR i inhibitor PI3 kinaze.

31. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 30, naznačeno time što je:

a) kada je dodatni terapijski agens inhibitor HER1, inhibitor HER1 je izabran iz grupe u čiji sastav ulaze Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuximab, Vectibix® /Panitumumab, monoklonskog antitela 806, Nimotuzumab, Iressa® /Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® /Lapatinib Ditosylate, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, i Tovok®; inhibitor HER2 je izabran iz grupe u čiji sastav ulaze Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib ili lapatinib ditosylate /Tykerb®; inhibitor HER3 je izabran iz grupe u čiji sastav ulaze MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech) i mali molekuli koji inhibiraju HER3; i inhibitor HER4;

b) kada je dodatni terapijski agens inhibitor mTOR, inhibitor mTOR je izabran iz grupe u čiji sastav ulaze Temsirolimus/Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus /Affinitor® ;

c) kada je dodatni terapijski agens inhibitor PI3 kinaze, inhibitor PI3 kinaze je izabran iz grupe u čiji sastav ulaze GDC 0941, BEZ235, BMK120 i BYL719.

32. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 27 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 28 do 31 za upotrebu u svojstvu leka.

33. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 27 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 28 do 31 za upotrebu u lečenju kancera.

34. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 27 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 28 do 31 za upotrebu u lečenju kancera prema patentnom zahtevu 33, naznačeno time što je kancer posredovan HER3 signalnim putem.

35. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 27 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 28 do 31 za upotrebu u lečenju kancera prema patentnom zahtevu 34, naznačeno time što je kancer izabran iz grupe u kojoj se nalaze kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer pluća, multipli mijelom, kancer jajnika, kancer jetre, kancer želuca, kancer pankreasa, kancer prostate, akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, osteosarkom, karcinom skvamoznih ćelija, tumori ovojnice perifernog nerva, švanom, kancer glave i vrata, kancer mokraćne bešike, kancer jednjaka, glioblastom, sarkom svetlih ćelija mekog tkiva, maligni mezoteliom, neurofibromatoza, kancer bubrega, i melanom.