RS57324B1

RS57324B1 - Antitela i drugi molekuli koji vezuju b7-h1 i pd-1

Info

Publication number: RS57324B1
Application number: RS20180683A
Authority: RS
Inventors: Solomon Langermann; Linda Liu; Shannon Marshall; Sheng Yao
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2018-08-31
Also published as: AU2012245477C1; AU2012245477A1; HRP20180893T1; JP6072771B2; US20140044738A1; DK2699264T3; EP3403672A1; SMT201800294T1; KR20140048121A; RU2013151455A; WO2012145493A1; EP2699264A4; JP2017101042A; RU2625034C2; LT2699264T; CA2833636A1; CN103608040A; AU2012245477B2; MX338353B; MX2013012088A

Description

Opis

Upućivanje na redosled sekvenci:

[0001] Ova prijava sadrži jedan ili više redosleda sekvenci u skladu sa 37 C.F.R.1.821 et seq., koji su obelodanjeni kako na papiru, tako i na računarski-čitljivim medijima, i gde su obelodanjivanja na papiru i ona računarski-čitljiva ovde integrisana putem reference u celosti.

Pozadina

Polje

[0002] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na antitela i njihove antigen vezujuće fragmente i na druge molekule koji su sposobni da se imunospecifično vežu za B7-H1 ili PD-1. U nekim slučajevima takvi molekuli dodatno su sposobni da podešavaju sposobnost B7-H1 ili B7-DC da se vezuju za PD-1 ili mogu uticati na signalizaciju aktivnosti B7-H1 ili PD-1.

Obelodanjivanje se dodatno odnosi na upotrebu takvih molekula u dijagnozi i lečenju kancera i drugih bolesti.

Opis srodnog stanja tehnike:

A. Ćelijski posredovani imuni odgovori

[0003] Imuni sistem ljudi i drugih sisara odgovoran je za pružanje zaštite od infekcije i bolesti. Takva zaštita obezbeđuje i humoralni imuni odgovor i imuni odgovor posredstvom ćelija. Humoralni odgovor rezultira proizvodnjom antitela i drugih biomolekula koji su sposobni prepoznati i neutralisati strane mete (antigene). Suprotno tome, ćelijski posredovani imuni odgovor podrazumeva aktivaciju makrofaga, ćelija prirodnih ubica (NK) i antigenspecifičnih citotoksičnih T-limfocita T ćelija, i oslobađanje različitih citokina kao odgovor na prepoznavanje antigena (Dong, C. i dr. (2003) „Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res. 28(1): 39-48).

[0004] Sposobnost T ćelija za optimalno posredovanje imunog odgovora protiv antigena zahteva dve različite signalne interakcije (Viglietta, V. i dr. (2007) „Modulating CoStimulation,” Neurotherapeutics 4: 666-675; Korman, A.J. i dr. (2007) „Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol.90: 297-339). Prvo, antigen koji je raspoređen na površini ćelija koje predstavljaju antigen (APC) mora biti predstavljen antigenspecifičnoj naivnoj CD4<+>T ćeliji. Takvo predstavljanje obezbeđuje signal preko receptora T-ćelija (TCR) koji usmerava T ćeliju da inicira imuni odgovor koji će biti specifičan za predstavljeni antigen. Drugo, serija ko-stimulativnih i inhibitornih signala, posredovanih kroz interakcije između APC-a i različitih molekula površinskih T ćelija, najpre pokreću aktivaciju i proliferaciju T ćelija i na kraju njihovu inhibiciju. Dakle, prvi signal daje specifičnost imunom odgovoru dok drugi signal služi za određivanje prirode, veličine i trajanja odgovora.

[0005] Imuni sistem čvrsto kontrolišu ko-stimulativni i ko-inhibitorni ligandi i receptori. Ovi molekuli obezbeđuju drugi signal za aktivaciju T ćelija i obezbeđuju uravnoteženu mrežu pozitivnih i negativnih signala kako bi maksimizirali imune reakcije protiv infekcije, dok ograničavaju imunitet na sebe ((Wang, L. i dr. (March 7, 2011) „VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T Cell Responses,” J. Exp. Med.

10.1084/jem.20100619: 1-16; Lepenies, B. i dr. (2008) „The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8: 279-288). Od posebnog značaja je vezivanje između B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86) liganda ćelije koja predstavlja antigen i CD28 i CTLA-4 receptora CD4<+>T-(Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol.2: 116-126; Dong, C. i dr. (2003) „Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res.28(1): 39-48; Lindley, P.S. i dr. (2009) „The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229: 307-321). Vezivanje B7.1 ili B7.2 do CD28 stimuliše aktivaciju T ćelija; Vezivanje B7.1 ili B7.2 za CTLA-4 inhibira takvu aktivaciju (Dong, C. i dr. (2003) „Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,” Immunolog. Res.28(1): 39-48; Lindley, P.S. i dr. (2009) „The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229: 307-321; Greenwald, R.J. i dr. (2005) „The B7 Family Revisited,” Ann. Rev.

Immunol. 23: 515-548). CD28 je konstitutivno eksprimiran na površini T (Gross, J., i dr. (1992) „Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse,” J. Immunol.149: 380-388), dok se CTLA4 ekspresija brzo reguliše nakon aktivacije T-ćelija (Linsley, P. i dr. (1996) „Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,” Immunity 4: 535-543). Pošto je CTLA4 receptor višeg afiniteta (Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126), vezivanje prvo inicira proliferaciju T ćelije (preko CD28) i zatim je inhibira (preko uzročne ekspresije CTLA4), čime se smanjuje efekat kada proliferacija više nije potrebna.

[0006] Dalja ispitivanja liganda CD28 receptora su dovela do identifikacije i karakterizacije kompleta povezanog sa B7 molekulima („B7 superfamilija”) (Coyle, A.J. i dr. (2001) „The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function,” Nature Immunol.2(3): 203-209; Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126; Greenwald, R.J. i dr. (2005) „The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23: 515-548; Collins, M. i dr. (2005) „The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol.6: 223.1-223.7; Loke, P. i dr. (2004) „Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulator T Cells.” Arthritis Res. Ther.6: 208-214; Korman, A.J. i dr. (2007) „Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol.90: 297-339; Flies, D.B. i dr. (2007) „The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3): 251-260; Agarwal, A. i dr. (2008) „The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance,” Curr. Opin. Organ Transplant.13: 366-372; Lenschow, D.J. i dr. (1996) „CD28/B7 System of T Cell Costimulation,” Ann. Rev. Immunol. 14: 233-258; Wang, S. i dr. (2004) „Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses,” Microbes Infect. 6: 759-766). Trenutno postoji nekoliko poznatih članova familije: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), inducibilni ko-stimulator ligand (ICOS-L), programirana smrt-1 ligand (PD-L1; B7-H1), programirana smrt-2 ligand (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 i B7-H6 (Collins, M. i dr. (2005) „The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol.6: 223.1-223.7; Flajnik, M.F. i dr. (2012) „Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC,” Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)

B. B7-H1/PD1 interakcije

1. B7-H1

[0007] B7-H1 (PD-L1, CD274) je posebno značajan član B7 superfamilije jer je krucijalno uključen u oblikovanje imunog odgovora na tumore (Flies, D.B. i dr. (2007) „The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3): 251-260; patenti SAD br.

6,803,192; 7,794,710; objave prijave patenata SAD br.2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT objava br. WO 01/39722; WO 02/086083). B7-H1 je transmembranski protein približno 33 kDa tipa 1. Smatra se da igraju glavnu ulogu u suzbijanju imunog sistema tokom određenih događaja kao što su trudnoća, alografi tkiva, autoimuna oboljenja i druge bolesti kao što je hepatitis.

[0008] B7-H1 je široko eksprimiran u različitim humanim i mišjim tkivima, kao što je srce, placenta, mišić, fetalna jetra, limfni čvorovi i timus za obe vrste kao i jetri, plućima i bubrezima samo kod miša (Martin-Orozco, N. i dr. (2007) „Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol.17(4): 288-298). Kod ljudi ekspresija B7-H1 proteina pronađena je u humanim endotelnim ćelijama (Chen, Y. i dr. (2005) „Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol.102: e81-e92; de Haij, S. i dr. (2005) „Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1” Kidney Int.68: 2091-2102; Mazanet, M.M. i dr. (2002) „B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T Cell Cytokine Synthesis,” J.

Immunol. 169: 3581-3588), miokardijumu (Brown, J.A. i dr. (2003) „Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T Cell Activation And Cytokine Production,” J. Immunol. 170: 1257-1266), sinciciotrofoblastima (Petroff, M.G. i dr. (2002) „B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,” Placenta 23: S95-S101), rezidualnim makrofagama nekih tkiva ili u makrofagama koji su aktivirani sa interferonom (IFN)-γ ili faktorom tumorske nekroze (TNF)-α (Latchman, Y. i dr. (2001) „PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nat. Immunol 2: 261-268), i u tumorima (Dong, H. (2003) „B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med.81: 281-287). U mišu, ekspresija B7-H1 proteina se nalazi u srčanom endotelu, ćelijskim ostrvcima pankreasa, tankim crevima i placenti (Martin-Orozco, N. i dr. (2007) „Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol.

17(4): 288-298).

2. PD-1

[0009] Programirana smrt -1 (“PD-1”) je receptor B7-H1 i B7-DC. PD-1 je otprilike 31 kD tipa I membranski proteinski član produžene CD28/CTLA4 familije regulatora T ćelija (Ishida, Y. i dr. (1992) „Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J.11: 3887-3895; patentna objava SAD br.2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; patenti SAD br. 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; objave PCT br. WO 01/14557). U poređenju sa CTLA4, PD-1 šire negativno reguliše imunološke reakcije.

[0010] PD-1 je eksprimiran u T ćelijama, B ćelijama i monocitima (Agata, Y. i dr. (1996) „Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5): 765-772; Yamazaki, T. i dr. (2002) „Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC,” J. Immunol. 169: 5538-5545) i u niskim novoima u ćelijama ubicama (NK) T ćelijama (Nishimura, H. i dr. (2000) „Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,” J. Exp. Med.191: 891-898; Martin-Orozco, N. i dr. (2007) „Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol.17(4): 288-298).

[0011] Ekstracelularni region PD-1 sastoji se iz jedinstvenog domena imunoglobulina (Ig) V sa 23% identiteta u ekvivalentnom domenu u CTLA4 (Martin-Orozco, N. i dr. (2007) „Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol.17(4): 288-298). Ekstracelularni IgV domen prati transmembranski region i intracelularni rep. Intracelularni rep sadrži dva mesta fosforilacije koja se nalaze u inhibitornom motivu zasnovanom na imunoreceptorskom tirozinu i motoru prebacivanja na bazi imunoreceptora zasnovanom na tirozinu, što ukazuje na to da PD-1 negativno reguliše TCR signale (Ishida, Y. i dr. (1992) „Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Super family, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J.11: 3887-3895; Blank, C. i dr. (Epub 2006 Dec 29) „Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,” Immunol. Immunother. 56(5): 739-745).

[0012] Prijavljena su antitela sposobna za imunospecifično vezivanje za mišji PD-1 (videti, npr., Agata, T. i dr. (1996) „Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5): 765-772).

C. Interakcije B7-H1 i PD-1

[0013] Pronađeno je da interakcija B7-H1 i PD-1 daje ključni negativni ko-stimulativni signal T i B ćelijama (Martin-Orozco, N. i dr. (2007) „Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol.17(4): 288-298) i funkcioniše kao induktor ćelijske smrti (Ishida, Y. i dr. (1992) „Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J.11: 3887-3895; Subudhi, S.K. i dr. (2005) „The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med.83: 193-202).

[0014] Interakcija između niskih koncentracija PD-1 receptora i B7-H1 liganda dovodi do prenosa inhibitornog signala koji snažno inhibira proliferaciju antigen-specifičnih CD8<+>T ćelija; u višim koncentracijama interakcije sa PD-1 ne inhibiraju proliferaciju T-ćelija, ali značajno smanjuju proizvodnju višestrukih citokina (Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). T-ćelijska proliferacija i produkcija citokina od strane onih koji su mirovali i prethodno aktiviranih CD4 i CD8 T ćelija, pa čak i naivne T ćelije iz krvi pupčane vrpce, utvrdili su da su inhibirani rastvorljivim proteinima B7-H1-Fc fuzije (Freeman, G.J. i dr. (2000) „Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med.192: 1-9; Latchman, Y. i dr. (2001) „PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nature Immunol. 2: 261-268; Carter, L. i dr. (2002) „PD-1: PD-L inhibitorni put napada na obe CD4(+) i CD8(+) T ćelije i nadmašuje ga IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3): 634-643; Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126).

[0015] B7-H1 - PD-1 interakcije dovode do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G0-G1, ali ne povećavaju ćelijsku smrt (Latchman, Y. i dr. (2001) „PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nature Immunol. 2: 261-268; Carter, L. i dr. (2002) „PD-1: PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2,” Eur. J. Immunol. 32(3): 634-643). Stoga, B7-H1 - PD-1 kompleksiranje ima sposobnost antagoniziranja B7-CD28 signala kada je antigenska stimulacija slaba ili ograničavajuća, i igra ključnu ulogu u reakcijama T-ćelija u regulaciji.

[0016] Transdukcija signala posredovana sa B7-H1 i PD-1 je složena. Oba molekula se dodatno vezuju za druge proteine. B7-H1 je sposoban da se vezuje za B7-1 (CD80) (Butte, M.J. i dr. (2008) „Interaction of PD-L1 and B7-1,” Molecular Immunol. 45: 3567-3572); PD-1 je sposoban da se vezuje za B7-DC (PD-L2) (Lázár-Molnár, E. i dr. (2008) „Crystal Structure Of The Complex Between Programmed Death-1 (PD-1) And Its Ligand PD-L2,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(30): 10483-10488). B7-1 reaguje sa CD28 da isporuči kostimulativni signal za T-ćelijsku aktivaciju koja je važna u ranim fazama imunološkog odgovora (Elloso, M.M. i dr. (1999) „Expression and Contribution of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) in the Early Immune Response to Leishmania major Infection,” J. Immunol. 162: 6708-6715). B7-DC je snažan stimulator T ćelija, povećava proliferaciju T ćelija i IFN-γ produkciju. Međutim, on takođe pokazuje inhibitorni efekat na imunološki odgovor putem interakcije sa PD-1 (Ishiwata, K. i dr. (epub January 10, 2010) „Costimulator Responses Induced by Nippostrongylus brasiliensis,” J. Immunol. 184: 2086-2094). Izgleda da su mikrobi i tumori eksploatisali PD-1 i B7-H1 kako bi izbegli eradikaciju od strane imunog sistema. Predložene su razlike u povezivanju afiniteta sa različitim receptorima i ligandima koji su u interakciji sa PD-1 i B7-H1 kako bi se obezbedili različiti funkcionalni ishodi blokade PD-1 i B7-H1 u modelima bolesti (Butte, M.J. i dr. (2008) „Interaction of PD-L1 and B7-1,” Molecular Immunol.45: 3567-3572). PD-1 put je takođe uključen kao igrajući ključnu ulogu u oštećenju imune funkcije tokom hronične infekcije (“iscrpljivanje T ćelija”), a blokada funkcije PD-1 može obnoviti mnoge funkcije T ćelija (Rodriquez-Garcia, M. i dr. (November 19, 2010) „Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulates By IL-10,” J. Leukocyte Biol.89: doi: 10.1189/jlb.0610327: 1-9).

[0017] Uloga B7-H1 i PD-1 u inhibiciji T ćelijske aktivacije i proliferacije sugerišu da ovi biomolekuli mogu poslužiti kao terapeutski ciljevi za lečenje inflamacije i kancera.

Predložena je upotreba anti-PD1 antitela za lečenje infekcija i tumora i modulacija adaptivnog imunološkog odgovora (videti, objavu patentne prijave SAD br.2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; patent SAD br.7,521,051; 7,563,869; 7,595,048; PCT objave br. WO 2004/056875; WO 2008/083174). Nasuprot tome, agensi koji moduliraju interakciju PD-1 sa B7-H1 predloženi su da imaju koristi u gornjoj- ili donjoj-modulaciji imunološkog odgovora (videti, patentni SAD br.7,029,674; 7,488,802; objava patentne prijave SAD br.2007/0122378; 2009/0076250; 2009/0110667;

2009/0263865; 2009/0297518; PCT objave br. WO 2006/133396). Takođe, predložena je upotreba anti-B7-H1 antitela za lečenje infekcija i tumora i nadogradnja adaptivnog imunološkog odgovora (objava patentne prijave SAD br.2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0317368; patenti SAD br.6,803,192; 7,794,710; PCT objave br. WO 01/39722; WO 02/086083).

[0018] Ipak, uprkos svim takvim prednostima, ostaje potreba za sastavima sposobnim za moduliranje interakcije između B7-H1 i PD-1. Predmetno obelodanjivanje je usmereno na takve sastave i njihovu upotrebu za lečenje kancera i drugih bolesti i stanja.

[0019] Hirano F i dr., (Cancer Res.2005 Feb 1;65(3): 1089-96) odnosi se na blokadu B7-H1 i PD-1 monoklonska antitela koja potenciraju terapeutski imunitet kancera.

Rezime obelodanjivanja

[0020] Ovaj pronalazak je onakav kako je definisano u patentnim zahtevima. Ovi aspekti/primeri sadašnjeg obelodanjivanja koji čine pronalazak su definisani patentnim zahtevima.

[0021] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na antitela i njihove fragmente vezane za antigen i na druge molekule koji su sposobni imunospecifično vezati za B7-H1 ili PD-1. U nekim slučajevima takvi molekuli su dodatno sposobni da modulišu sposobnost B7-H1 da se veže na PD-1 ili mogu uticati na signalizirajuću aktivnost B7-H1 ili PD-1. Obelodanjivanje se dodatno odnosi na upotrebu takvih molekula u dijagnozi i lečenju kancera i drugih bolesti.

[0022] Detaljnije, obelodanjivanje daje molekul, koji sadrži fragment antitela koji se vezuje za antigen koji se imunospecifično vezuje za B7-H1 ili PD-1, a posebno humani B7-H1 ili humani PD-1, poželjno eksprimiran na površini žive ćelije kod endogene ili transfektovane koncentracije. Obelodanjivanje se naročito odnosi na primer takvog molekula u kojem se antigen vezujući fragment vezuje za B7-H1, i gde je živa ćelija tumorska ćelija, ćelija inficirana patogenom ili ćelija koja pokazuje antigen, kao i primer takvog molekula u kome se antigen vezujući fragment vezuje za PD-1, a gde je živa ćelija T ćelija.

[0023] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na antitela i njihove antigen vezujuće fragmente i na druge molekule koji su sposobni za imunospecifično vezivanje za B7-H1 ili PD-1. U nekim slučajevima takvi molekuli su dodatno sposobni da modulišu sposobnost B7-H1 da se veže na PD-1 ili mogu uticati na signalizirajuću aktivnost B7-H1 ili PD-1. Obelodanjivanje se dodatno odnosi na upotrebu takvih molekula u dijagnozi i lečenju kancera i drugih bolesti.

[0024] Detaljnije, obelodanjivanje daje molekul, koji sadrži antigen vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za B7-H1 ili PD-1, a posebno humani B7-H1 ili humani PD-1, poželjno eksprimiran na površini žive ćelije kod endogene ili transfektovane koncentracije. Obelodanjivanje se naročito odnosi na primer takvog molekula u kojem se fragment koji se vezuje za antigen vezuje za B7-H1, i gde je živa ćelija tumorska ćelija, ćelija inficirana patogenom ili ćelija koja pokazuje antigen, kao i primer takvog molekula u kome se antigen vezujući fragment vezuje za PD-1, a gde je živa ćelija T ćelija.

[0025] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primere takvih molekula u kojima je molekul monoklonsko antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo.

Obelodanjivanje obuhvata slučajeve u kojima su takva antitela monospecifična, bispecifična, trispecifična ili multispecifična.

[0026] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primenu takvih molekula ili antitela koja se vezuju za B7-H1 i gde njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži šest CDR-ova, pri čemu CDR-ovi sadrže najmanje jedan konsenzusni CDR CDR-ova anti-B7-H1 antitela 1E12 , 1F4, 2G11, 3B6 i 3D10 sa svim preostalim CDR-ovima izabranim iz:

(A) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 1E12;

(B) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 1F4;

(C) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 2G11;

(D) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 3B6; ili

(E) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 3D10.

[0027] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primer takvih molekula ili antitela koja se vezuju za B7-H1, i gde njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži šest CDR-ova, pri čemu su šest CDR-ova:

(A) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 1E12;

(B) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 1F4;

(C) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 2G11;

(D) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 3B6; ili

(E) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-B7-H1 antitela 3D10.

[0028] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primer takvih antitela, gde se antitelo vezuje za B7-H1 i sadrži varijabilni domen antitela h3D10 Var 1, h3D10 Var 2, h3D10 Var 3, h3D10 Var 4, h3D10 Var 5, h3D10 Var 6, h3D10 Var 7, h3D10 Var 8, h3D10 Var 9, h3D10 Var 10, h3D10 Var 11, h3D10 Var 12, h3D10 Var 13 ili h3D10 Var 14.

1

[0029] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primer gore opisanih molekula ili antitela, pri čemu se molekuli ili antitela vezuju za PD-1, a pri čemu antigen vezujući fragment sadrži šest CDR-ova, pri čemu CDR-ovi sadrže najmanje jedan konsenzusni CDR CDR-ova anti-PD-1 antitela 1E3, 1E8 i 1H3 sa svim preostalim CDR odabranim od:

(A) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-PD-1 antitela 1E3;

(B) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-PD-1 antitela 1E8; ili

(C) tri laka lanca i tri CDR teška lanaca anti-PD-1 antitela 1H3.

[0030] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primere takvih antitela, pri čemu su šest CDR-ova:

(A) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-PD-1 antitela 1E3;

(B) tri laka lanca i tri CDR teška lanca anti-PD-1 antitela 1E8; ili

(C) tri laka lanca i tri CDR teška lanaca anti-PD-1 antitela 1H3.

[0031] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primer takvih antitela, gde se antitelo vezuje za PD-1 i sadrži varijabilni domen antitela h1H3 Var 1, h1H3 Var 2, h1H3 Var 3, h1H3 Var 4, h1H3 Var 5, h1H3 Var 6, h1H3 Var 7, h1H3 Var 8, h1H3 Var 9, h1H3 Var 10, h1H3 Var 11, h1H3 Var 12, h1H3 Var 13 ili h1H3 Var 14.

[0032] Obelodanjivanje se dalje odnosi na primer gore opisanih molekula ili antitela, pri čemu je molekul ili antitelo jasno označeno ili sadrži konjugovani toksin, lek, receptor, enzim, receptorski ligand.

[0033] Obelodanjivanje dalje odnosi se na primer gore opisanih molekula ili antitela, pri čemu molekul ili antitelo:

(A) modulira transdukciju signala posredovanom B7-H1 ili PD-1;

(B) smanjuje sposobnost B7-H1 da se veže za B7-H1 receptor ili smanjuje sposobnost PD-1 da se veže na PD-1 ligand;

(C) agonizuje transdukciju signala B7-H1 ili PD-1;

(D) posreduje proliferacijom T ćelija; ili

(E) povećava produkciju IFN-γ.

[0034] Obelodanjivanje se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu bilo kog od gore opisanih molekula ili antitela i fiziološki prihvatljivog nosača ili ekscipijensa. Obelodanjivanje se dalje odnosi na upotrebu takvog farmaceutskog sastava u lečenju kancera, autoimunih bolesti, zaraznih bolesti ili bolesti koja utiče na broj T ćelija ili zdravlje. Obelodanjivanje se dalje odnosi na upotrebu takvog farmaceutskog sastava, pri čemu je terapija profilaktička i obezbeđuju se unapred za bilo koji od simptoma kancera, autoimune bolesti, zarazne bolesti ili bolesti koja utiče na broj T ćelija ili zdravlje, ili za lečenje stanja usled transplantacije.

[0035] Obelodanjivanje se dalje odnosi na upotrebu bilo kog od gore opisanih molekula ili antitela za dijagnostikovanje kancera, autoimunih bolesti (posebno bolest grafta i bolest domaćina), zaraznih bolesti (posebno hroničnog virusnog oboljenja) ili bolesti koja pogađa broj T ćelija ili zdravstvenog stanja u subjektu testiranjem ćelija subjekta zbog njihove sposobnosti vezivanja za B7-H1 ili PD-1.

[0036] Obelodanjivanje se naročito odnosi na primenu takvih molekula, antitela i sastava, pri čemu je B7-H1 humani B7-H1 i PD-1 je humani PD-1.

[0037] Obelodanjivanje se naročito odnosi na metod za dijagnostikovanje bolesti (naročito kancera) kod subjekta koji obuhvata ispitivanje ćelija subjekta zbog njihove sposobnosti da se vezuju za bilo koji od gore opisanih B7-H1 vezujućih molekula, pri čemu metoda obezbeđuje citološki test za dijagnostikovanje prisustva bolesti u subjektu.

[0038] Obelodanjivanje se dodatno odnosi na postupak za dijagnostikovanje bolesti (naročito bolesti koja utiče na broj T ćelija i/ili na zdravlje) u subjektu koji sadrži ćelije za testiranje subjekta zbog njihove sposobnosti da se vezuju za PD-1 vezujući molekul, pri čemu metoda obezbeđuje citološki test za dijagnostikovanje prisustva i/ili napredovanja bolesti kod subjekta ili za procenu odgovora subjekta na lečenje.

Kratak opis slika

[0039]

Slika 1 pokazuje vezivanje testiranih supernatantnih hibridoma za antitela koja se vezuju za B7-H1. Pozitivna kontrola (PC): 1: 1000 razređenih seruma od miša koji se koristi za generisanje hibridoma; negativna kontrola (NC): 5% mleko/PBS. Podaci su prikazani za vezivanje na B7-H1-Fc i detekciju sa IgG protiv miša.

Slika 2 pokazuje rezultate eksperimenata za utvrđivanje da li izolovana anti-B7-H1 antitela mogu da modulišu vezivanje B7-H1 do PD-1. Pozitivna kontrola: klonovi MIH-1 i 29E.2A3 (oba anti-humana CD274 (B7-H1); dve negativne kontrole: uslovljeni medijum od nepovezanog hibridoma (slučajni Ab) i kontrola vektora (VC).

Slika 3 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) testiranih anti-B7-H1 antitela za vezivanje za CHO-hB7-H1. Nijedan od testiranih klonova nije pronađen u unakrsnoj reakciji sa roditeljskom CHO linijom, što ukazuje na to da je izraženo antitelo imunospecifično za humani B7-H1.

Slika 4 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) humanog B7-H1-ekspresivnog testa vezivanja CHO ćelija odabranih anti-humanih B7-H1 antitela. Slika 5 upoređuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) humanog B7-H1-ekspresivnog testa vezivanja CHO ćelija anti-humanih B7-H1 antitela 5H1 i 1E12. Slika 6 pokazuje vezivanje antigena i izotip izolovanih anti-humanih PD-1 antitela.

Slike 7A-7B pokazuju rezultate eksperimenata koji ukazuju da je nekoliko izolovanih hibridoma izrazilo neutralizujuće anti-humano PD-1 antitelo.

Slika 8 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) testiranih anti-PD-1 antitela za vezivanje za CHO-hPD-1. Nijedan od testiranih klonova nije pronađen u unakrsnoj reakciji sa roditeljskom CHO linijom, ukazujući da je izraženo antitelo specifično za humani PD-1.

Slika 9 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) humane PD-1 ekspresije za vezivanje CHO ćelija izabranih anti-humanih PD-1 antitela. Pozitivna kontrola: EH12 (komercijalno dostupno anti-human PD-1 antitelo iz BioLegenda); mIgG1: negativna kontrola mišijeg IgG.

Slika 10 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) rezultat testa konkurencije zasnovan na ćelijama pri različitim koncentracijama anti-humanog antitela PD-1. Slika 11 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) rezultat testa konkurencije zasnovan na ćelijama u koncentraciji od 20 mg/ml anti-human PD-1 antitela.

Slika 12 pokazuju rezultate eksperimenta u kojima su CHO ćelije transfektovane sa humanim PD-1 pune dužine prethodno inkubirane sa zasićenom dozom anti-humanih PD-1 monoklonskih antitela (mAbs) ili kontrolisanjem Ig pre nego što ih obori hB7-H1-FC ili hB7-DC mIg.

Slika 13, Paneli A-B pokazuju komparativno vezivanje: (A) komercijalno dostupnog anti-PD-1 antitela, EH12 sa (B) mišijim monoklonskim antitelom koji poseduje himerne (“ch”) mišije anti-humanog PD-1 Fab regiona i humanog IgG1 Fc regiona.

1

Slika 14, Paneli A-B pokazuje sposobnost anti-PD-1 antitela ovog prikaza da izvrše blokirajuće dejstvo na biotinilovani B7-H1-Fc i biotinilovan B7-DC-Fc vezivanje za PD-1.

Slika 15 pokazuje krivu vezivanja anti-humanog PD-1 himernog antitela na IH3 u CHO.hPD-1 ćelije, kao što je detektovano anti-hIg antitelima.

Slike 16A-16B pokazuje rezultate ispitivanja sposobnosti anti-humanog PD-1 himernog antitela za humanu primarnu T ćelije CD8 (Slika 16A) i CD4 (Slika 16B) u odnosu na negativno kontrolno antitelo (palivizumab; SYNAGIS®, Medimmune, Inc.).

Slika 17 pokazuje sposobnost antitela sadašnjeg obelodanjivanja da poboljša antigen specifične T ćelijske reakcije kao što se meri pomoću razblaživanja CFSE posle povlačenja tetanus toksina (TT).

Slike 18A-18D demonstriraju sposobnost humanizovanih 1H3 varijanti (h1H3 Var 1 -h1H3 Var 14 da se vezuju za CHO.hPDl ćelije.

Slike 19A-19B pokazuju sposobnost humanizovanih anti-PD-1 antitela za blokiranje interakcija između hPD-1-Fc i HEK293 ćelija koje eksprimiraju B7-H1 (Slika 19A) ili B7-DC (Slika 19B).

Slika 20 prikazuje krive vezivanja za h1H3 Var 1 - h1H3 Var 6.

Detaljan opis obelodanjivanja:

[0040] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na antitela i njihove antigen vezujuće fragmente i na druge molekule koji su sposobni imunospecifično vezati se za B7-H1 ili PD-1. U nekim slučajevima takvi molekuli su dodatno sposobni da modulišu sposobnost B7-H1 ili B7-DC da se vezuju za PD-1 ili mogu da utiču na signalizirajuću aktivnost B7-H1 ili PD-1.

Obelodanjivanje se dodatno odnosi na upotrebu takvih molekula u lečenju kancera i drugih bolesti.

[0041] Za molekul se kaže da je sposoban da „imunospecifično vezuje” drugi molekul ako takvo vezivanje pokazuje specifičnost i afinitet antitela njegovog srodnog antigena. Rečeno je da antibiotici mogu biti „imunospecifično vezani” za ciljni region ili konformaciju (“epitop”) antigena (a naročito antigena: B7-H1 ili PD-1) ako takvo vezivanje uključuje mesto prepoznavanja antigena molekula imunoglobulina. Antitelo koje se imunospecifično vezuje za određeni antigen može se vezati za druge antigene sa nižim afinitetom, ako drugi antigen ima neku sekvencu ili konformacionu sličnost koja je prepoznata od strane mesta za prepoznavanje antigena, kao što je to određeno npr. imunološkim testovima, BIACORE® testovima ili drugim testovima poznatim u stanju tehnike, ali se ne bi vezao za potpuno nepovezani antigen. Poželjno, međutim, antitela (i njihovi antigen vezujući fragmenti) neće reagovati sa drugim antigenima. Antitela se takođe mogu vezati za druge molekule na način koji nije imunospecifičan, kao što su FcR receptori, na osnovu vezujućih domena u drugim regionima/domenima molekula koji ne uključuju mesto prepoznavanja antigena, kao što je region Fc.

[0042] Kao što se ovde koristi termin „modulacija” odnosi se na sposobnost izmene efekta ili rezultata. Konkretno, obelodanjivanje odnosi se na molekule (posebno antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente koji imunospecifično vezuju humani B7-H1 ili humani PD-1) koji su sposobni da modulišu vezivanje između B7-H1 i PD-1 i/ili modulirajućeg transdukcijskog signala koja se javlja kao posledica vezivanja B7-H1-PD-1. Takva modulacija može dovesti do snižavanja ili u potpunosti blokiranja sposobnosti B7-H1 da se veže na PD-1. U dodatnom slučaju, takva modulacija može oslabiti ili u potpunosti neutralisati sposobnost B7-H1 ili PD-1 da posreduje transdukciji signala. U dodatnom slučaju, takva modulacija može povećati ili na drugi način agonizirati transdukciju signala preko B7-H1 ili PD-1, ili 1) poboljšanjem interakcije između B7-H1 i PD-1 i olakšavanjem vezivanja B7-H1-PD-1 ili ii ) direktno vezuju za B7-H1 i PD-1 i time imitiraju aktivnost endogenog liganda, itd. U još jednom primeru, takva modulacija može promeniti prirodu interakcije između B7-H1 i PD-1, kako bi se promenila priroda izdužene signalne transdukcije. Na primer, molekuli predmetnog obelodanjivanja mogu, vezivanjem na B7-H1 ili PD-1, promeniti sposobnost takvih molekula da se vezuju za druge ligande i receptore (npr. utiču na sposobnost PD-1 da se veže na B7- DC ili sposobnost B7-H1 da se veže na B7-1 (CD80)) i na taj način menjaju svoju ukupnu aktivnost. Poželjno, takva modulacija će obezbediti najmanje 10% promene u merljivoj aktivnosti imunog sistema, poželjnije, najmanje 50% promene u takvoj aktivnosti, ili barem dvostruke, petostruke, desetostruke ili još uvek poželjnije, najmanje stostruke promene u takvoj aktivnosti.

[0043] Kako se ovde koristi, termin „antitelo” je namenjen označavanju molekula imunoglobulina koji poseduje mesto prepoznavanja antigena „varijabilnog regiona”. Termin „varijabilni region” ima za cilj da razlikuje takav domen imunoglobulina iz domena koji su široko deljeni antitelima (kao što je Fc domen antitela). Varijabilni region obuhvata „hipervarijabilni region” čiji su ostaci odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni

1

region obuhvata aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost” ili „CDR-a” (tj. tipično pri otprilike ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u lakom lancu varijabilnog regiona i kod otprilike ostataka 27-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom regionu teškog lanca, Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili ostatke iz „hipervarijabilne petlje” (tj. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia, C. i dr. (1987) „Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol.196: 901-917). Ostatak „okvirnog regiona” ili „FR” su ostaci varijabli, različiti od ostataka hipervarijabilnog regiona, kako je ovde definisano. Termin antitelo obuhvata monoklonska antitela, multispecifična antitela, humana antitela, humanizovana antitela, sintetička antitela, himerna antitela, kamelizovana antitela (videti npr. Muyldermans i dr., 2001, Trends Biochem. Sci.26: 230; Nuttall i dr., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1: 253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth.231: 25; internacionalne objave br.. WO 94/04678 i WO 94/25591; patent SAD br.6,005,079) jednolančane Fvs (scFv) (videti, na primer, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)), jednolančana antitela , disulfidno vezana Fvs (sdFv), intratela i anti-idiotipična (anti-Id) antitela (uključujući, na primer, anti-Id i anti-anti-Id antitela obelodanjivanja). Konkretno, takva antitela uključuju molekule imunoglobulina bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.

[0044] Kao što se ovde koristi, termin „antigen vezujući fragment” antitela odnosi se na jedan ili više delova antitela koji sadrže regione za određivanje komplementarnosti antitela („CDR-ovi”) i opciono ostanak okvira koji obuhvata prepoznavanje antigena „varijabilnog regiona” antigena i pokazuje sposobnost imunospecifičnog vezivanja antigena. Takvi fragmenti uključuju Fab', F(ab')2, Fv, jednostruki lanac (ScFv) i njegove mutante, varijante koje se pojavljuju u prirodi, i fuzioni proteini koji obuhvataju mesto prepoznavanja antigena „varijabilnog regiona” i heterologni protein (npr., toksin, mesto za prepoznavanje antigena za različiti antigen, enzim, receptor ili receptorski ligand itd.). Kako se ovde koristi, termin „fragment” odnosi se na peptid ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje 5 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 10 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 15 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 20 susednih amino najmanje 25 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih

1

ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 60 susednih aminoostataka, najmanje 70 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 80 susednih amino kiselinskih ostataka, najmanje 90 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 100 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 125 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 150 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 175 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 200 susednih aminokiselinskih ostataka, ili najmanje 250 susednih aminokiselinskih ostataka.

[0045] Humana, himerna ili humanizovana antitela su posebno poželjna za upotrebu in vivo kod ljudi, međutim, mišija antitela ili antitela drugih vrsta mogu se korisno koristiti za mnoge namene (na primer, in vitro ili in situ detekcioni testovi, akutna in vivo upotreba itd,).

Potpuno humana antitela su posebno poželjna za terapeutski tretman ljudskih subjekata.

[0046] Humana antitela mogu biti izvedena pomoću različitih metoda poznatih u stanju tehnike uključujući metode opisivanja faga opisane iznad koristeći biblioteke antitela izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci (videti patent SAD 4,444,887 i 4,716,111 i međunarodne publikacije br. WO 98/46645, VO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/10741). Ljudska antitela mogu se proizvoditi pomoću transgenskih miševa koji nisu sposobni da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu eksprimirati humane imunoglobulinske gene. Na primer, kompleksi genskog teškog i lakog lanca imunoglobulinskih gena mogu biti nasumično uvođeni ili homolognom rekombinacijom u embrionalne matične ćelije miša. Alternativno, ljudski varijabilni region, konstantni region i region raznolikosti mogu se uvesti u embrionalne matične ćelije miša pored gena teškog i lakog lanca gena. Geni imunoglobulina teških i lakih lanaca mogu biti nefunkcionalno odvojeni ili istovremeno sa uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina homolognom rekombinacijom. Konkretno, homozigotno brisanje JHregije sprečava proizvodnju endogenih antitela. Modifikovane embrionalne matične ćelije se proširuju i mikroinjektiraju u blastociste kako bi se proizveli himerni miševi. Himerni miševi se tada razvijaju da bi proizveli homozigotno potomstvo koje eksprimira humana antitela. Transgenski miševi se imunizuju koristeći konvencionalne metodologije sa odabranim antigenom, npr., sve ili deo polipeptida otkrivenja. Monoklonska antitela usmerena protiv antigena mogu se dobiti od imuniziranih, transgenskih miševa korišćenjem konvencionalne tehnologije hibridoma (videti, npr., patent SAD br.5,916,771). Transgeni humanog imunoglobuline koji imaju transgenske miševe preuređuju tokom diferencijacije B

1

ćelija, a zatim prolaze prekidanje klase i somatsku mutaciju. Tako, koristeći takvu tehniku, moguće je proizvesti terapeutski korisne IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregled ove tehnologije za proizvodnju ljudskih antitela videti Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev.

Immunol.. 13: 65-93).

[0047] Za detaljnu diskusiju o ovoj tehnologiji za proizvodnju humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokola za proizvodnju takvih antitela, videti, npr., Međunarodne objave br. WO 98/24893, WO 96/34096, i WO 96/33735; i patente SAD br.5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318, i 5,939,598).

[0048] Pored toga, mogu se angažovati kompanije poput Abgenix, Inc. (Freemont, CA) i Medarex (Princeton, NJ), kako bi se obezbedila humana antitela usmerena protiv izabrane antigenske tehnologije koja je slična onoj opisanoj gore.

[0049] „Himerno antitelo” je molekul u kome različiti delovi antitela potiču iz različitih molekula imunoglobulina, kao što su antitela koja imaju varijabilni region izveden iz nehumanog antitela i humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona. Metode za proizvodnju himernih antitela poznate su u stanju tehnike. Videti, npr., Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi i dr., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies i dr., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; i patentni SAD br.6,311,415, 5,807,715, 4,816,567 i 4,816,397. Himerna antitela koja sadrže jedan ili više CDR-ova iz ne-humane vrste i okvirnih regiona od molekula humanog imunoglobulina mogu se proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u stanju tehnike uključujući, na primer, CDR-presađivanje (EP 239,400; međunarodna objava br. WO 91/09967 i US Patent No.5,225,539, 5,530,101 i 5,585,089), furniranje ili rekonstrukcija (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka i dr., 1994, Protein Engineering 7: 805; i Roguska i dr., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969), i mešanje lanaca (patent SAD br.5,565,332).

[0050] Obelodanjivanje se posebno odnosi na „humanizovana antitela” (videti, npr., evropske patente br.239,400, EP 592,106 i EP 519,596, međunarodne objave br. WO 91/09967 i WO 93/17105, patent SAD br.5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886 i 6,407,213 i Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka i dr., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska i dr., 1994, PNAS 91: 969-973; Tan i dr., 2002, J. Immunol. 169: 1119-25; Caldas i dr., 2000, Protein Eng.13: 353-60; Morea i dr.,

1

2000, Methods 20: 267-79; Baca i dr., 1997, J. Biol. Chem.272: 10678-84; Roguska i dr., 1996, Protein Eng.9: 895-904; Couto i dr., 1995, Cancer Res.55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto i dr., 1995, Cancer Res. 55: 1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409-10; Pedersen i dr., 1994, J. Mol. Biol.235: 959-73; Jones i dr., 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann i dr., 1988, Nature 332: 323-329; i Presta, 1992, Curr. Op. Struck. Biol.2: 593-596). Kako se ovde koristi, termin „humanizovano antitelo” odnosi se na imunoglobulin koji sadrži humani okvirni region i jedan ili više CDR-ova od ne-humanog (obično miša ili pacova) imunoglobulina. Nehumani imunoglobulin koji pruža CDR naziva se „donator”, a imunoglobulin čoveka koji pruža okvir se zove „primalac”. Konstantni regioni ne moraju biti prisutni, ali ukoliko su oni, moraju biti u suštini identični sa konstantnim regionima humanog imunoglobulina, tj. bar oko 85-90%, poželjno oko 95% ili više identičnih. Prema tome, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, osim eventualno CDR-ova, u suštini su identični sa odgovarajućim delovima prirodnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. Humanizovano antitelo je antitelo koje sadrži humanizovani laki lanac i humanizovani imunoglobulin teškog lanca. Na primer, humanizovano antitelo ne bi obuhvatilo tipično himerno antitelo, jer je, na primer, čitav varijabilni region himernog antitela je ne-human. Jedno kaže da je donatorsko antitelo „humanizovano” procesom „humanizacije”, jer se očekuje da se rezultujuće humanizovano antitelo vezuje za isti antigen kao donorsko antitelo koje pruža CDR. U većini slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (prijemno antitelo) u kojima su ostaci hipervarijabilnog regiona primalaca supstituisani ostacima hipervarijabilnog regiona iz ne-humane vrste (donatorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-ljudski primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci humanog imunoglobulina Okvirnog regiona (FR) zamenjuju se odgovarajućim ne-humanim ostacima. Osim toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji nisu pronađeni u prijemnom antitelu ili u antitelu donatora. Ove modifikacije su učinjene kako bi se dalje poboljšale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve najmanje jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili u suštini svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima kao kod nehumanog imunoglobulina i svi ili u suštini svi FR-ovi su oni humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog humane imunoglobulina koji se imunospecifično vezuje za FcγRIIB polipeptid, koji je izmenjen uvođenjem supstitucija aminokiselinskih ostataka, uklanjanja ili dodataka (tj., mutacije).

1

[0051] Antitela koja se koriste u metodama predmetnog obelodanjivanja mogu biti monospecifična. Takođe su od interesa bispecifična antitela, trispecifična antitela ili antitela veće multispecifičnosti koja pokazuju specifičnost različitih ciljeva pored B7-H1 ili PD-1. U poželjnom slučaju, takva multispecifična antitela bi pokazala specifičnost na različite ciljeve ciljanih imunih ćelija. Na primer, takva antitela se mogu vezati za oba B7-H1 i B7-DC i na taj način modulirati i zavisne odgovore PD-1. Nasuprot tome, takva antitela se mogu vezati za PD-1 i B7-1 i ometaju i zavisne odgovore B7-H1. U drugom slučaju, multispecifično antitelo se vezuje za molekule (receptore ili ligande) koji su uključeni u alternativne imunomodulatorne puteve, kao što su CTLA4, TIM3, TIM4, OKS40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H4, LIGHT ili LAG3, u da bi se poboljšali imunomodulatorni efekti. Pored toga, multispecifično antitelo može se vezati za molekule efektora kao što su citokini (npr. IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-beta, IL-10, IL-17, IFNg, Flt3, BLis) i hemokini (npr., CCL21) koji mogu biti posebno relevantni za modulaciju akutnog i hroničnog imunološkog odgovora.

[0052] Pored toga, multispecifična antitela mogu se vezati za antigen koji je važan za usmeravanje antitela na određeni ćelijski tip ili tkivo. Na primer, takva antitela koja se vezuju za PD-1 i CD27 (ili B7-H1 i CD27) mogu pomoći u lokalizaciji aktiviranih memorijskih B-ćelija (mBAct) i ćelija za predstavljanje antigena (APCs), tako da PD-1 postrojeni takvim APCs mogu da komuniciraju sa ligandima na površini mBAct B-ćelija radi promovisanja opstanka mBActB-ćelija. Budući da je gubitak mBActB-ćelija naglo naginjanje u progresiji HIV infekcije AIDS-u (Titanji, K. i dr. (2010) „Acute Depletion Of Activated Memory B Cells Involves The PD-1 Pathway In Rapidly Progressing SIV-Infected Macaques,” J. Clin. Invest. 120(11): 3878-3890), antitela koja vezuju i PD-1 i CD27 imaju korisnost u lečenju HIV infekcije i sprečavanju ili odlaganju početka AIDS-a. Kao što je već́ rečeno, PD-1 put igra ključnu ulogu u oštećenju imunske funkcije tokom hronične infekcije HIV-om („iscrpljivanje T ćelija”) (Khaitan, A. i dr. (2011) „Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection,” Curr. HIV/AIDS Rep.8: 4-11; Rodriquez-Garcia, M. i dr. (November 19, 2010) „Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-10,” J. Leukocyte Biol.89: doi: 10.1189/jlb.0610327: 1-9; Grabmeier-Pfistershammer, K. i dr. (2011) „Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment,” J Acquir.

Immune Defic. Syndr.56(2): 118-124). Pokazano je da makrofagi značajno doprinose početnim koracima HIV infekcije (Carter, C. A. i dr. (2008) „Cell Biology Of HIV-1 Infection Of Macrophages,” Ann. Rev. Microbiol.62: 425-443; Noursadeghi, M. i dr. (2006)

2

„HIV-1 Inflection Of Mononuclear Phagocytic Cells: The Case For Bacterial Innate Immune Deficiency In AIDS,” Lancet Infect. Dis.6: 794-804). Prema tome, antitela (posebno ako su konjugovana toksinom) koja se vezuju za PD-1 i za marker specifičnog za makrofaga (kao što su CD14, CD68, CD163, TLR2 itd.) imaju korisnost u sprečavanju infekcije HIV-om. Pored toga, antitela koja se vezuju za višestruke markere iscrpljivanja T ćelija (npr. PD-1 i bilo koje ili sve: CTLA4, TIM3, TIM4 ili LAG-3) imaju korisnost u lečenju ili dijagnozi imunološkog odgovora. Ostali ciljni antigeni od interesa uključuju markere ćelija kancera.

[0053] Pored toga, utvrđeno je da PD-1<+>CD8<+>ćelije imaju anti-HIV aktivnost (Killian, M.S. i dr. (2011) „Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells,” J. Virol.85(4): 1696-1705). Tako se antitela koja se vezuju za PD-1 i CD8 imaju korisnost u, na primer, ex vivo sredstvu za izolaciju i proizvodnju obogaćene populacije takvih ćelija za krajnju upotrebu u lečenju HIV infekcije i AIDS-a kod pacijenata.

[0054] Ostali markeri koji se mogu koristiti u takvim bispecifičnim, trispecifičnim ili multispecifičnim antitelima anti-PD-1 ili anti-B7-H1 uključuju CD4, CD8, CD25 i CTLA-4 (videti De Keersmaecker, B. i dr. (2011) (“Fighting with the Enemy's Weapons? The Role of Costimulatory Molecules in HIV”, Curr. Molec. Med. 566-5240/11: 1-25; and Sarikonda, G. (2011) „Immunosuppressive Mechanisms During Viral Infectious Diseases;” Methods in Molec. Biol.677: 431-447).

[0055] Slično tome, iako su CD4 T ćelije obavezne da usporavaju rast i širenje M. tuberculosis, inhibicija posredovanja PD-1 je takođe potrebna kako bi se sprečilo da CD4<+>T ćelije promovišu tešku bolest (Barber, D.L. i dr. (2011) „CD4 T Cells Promote Rather than Control Tuberculosis in the Absence of PD-1-Mediated Inhibition,” J. Immunol. 186: 1598-1607; Sakai, S. i dr. (2010) „PD-1-PD-L1 pathway impairs Th1 immune response in the late stage of infection with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin,” Intl. Immunol. 22(12): 915-925; Lázár-Molnár, E. i dr. (2010) „Programmed Death-1 (PD-1)-Deficient Mice Are Extraordinarily Sensitive To Tuberculosis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 107(30):

13402-13407). Tako se antitela koja se vezuju za CD4 i PD-1 imaju korisnost u lečenju tuberkuloze i sprečavanju ili odlaganju pojave tuberkuloze.

[0056] DNK sekvence kodirajuće za poželjne okvirne sekvence ljudskog primaoca obuhvataju ali nisu ograničene na FR segmente iz VH segmenta VH1-18 i JH6 humane linije VH i VL segmenta VK-A26 i JK4. U određenom slučaju, jedan ili više CDR-ova su ubačene unutar okružnih regija koristeći rutinske rekombinantne DNK tehnike. Okvirni regioni mogu biti prirodni ili konsenzusni okvirni regioni, a poželjno i ljudski okvirni regioni (videti, npr., Chothia i dr., 1998, J. Mol. Biol.278: 457-479 za popis regiona humanog okvira).

[0057] Humanizovano ili himerno antitelo obelodanjivanja može sadržati u suštini sve najmanje jedan, a tipično dva, varijabilna regiona u kojima svi ili u suštini svi CDR regioni odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina (tj. donatorskog antitela) i sve ili u suštini svi okvirni regioni su oni u sekvenci humanog imunoglobulina. Poželjno, antitelo obelodanjivanja takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog čovečeg imunoglobulina. Konstantni domeni antitela obelodanjivanja mogu biti izabrani u odnosu na predloženu funkciju antitela, posebno efektorsku funkciju koja može biti potrebna. U nekim slučajevima, konstantni domeni antitela obelodanjivanja su (ili sadrže) humane IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM domene. U konkretnom slučaju koriste se humani IgG konstantni domeni, naročito izotopi IgG1 i IgG3, kada su humanizovana antitela opisanog namenjena za terapeutske primene i funkcije efektora antitela, kao što je antitela zavisna ćelijsko posredovana citotoksičnost (ADCC) i citotoksičnost zavisno-komplementnu (CDC). Na primer, PD-1 je visoko izražen u T ćelijama, kao i retki periferni limfomi T ćelija kao što je angioimunoblastični T-ćelijski limfom (AITL). Anti-PD-1 antitela sa ADCC ili CDC aktivnošću su naročito relevantna kao terapeutska sredstva za lečenje takvih karcinoma. U alternativnim slučajevima, izotopi IgG2 i IgG4 se koriste kada je antitelo obelodanjivanja namenjeno za terapeutske svrhe, a funkcija efektora antitela nije potrebna. Na primer, ako želite da povećate aktivnost T ćelija ciljanjem PD-1 na površinu T ćelija, onda efektorske funkcije koje bi ubile T ćeliju mogu biti nepoželjne. Obelodanjivanje obuhvata Fc konstantne regione koji sadrže jednu ili više modifikacija aminokiselina koje menjaju funkcije efektora antitela, kao što su one obelodanjene u objavama SAD-a br.2005/0037000 i 2005/0064514.

[0058] U nekim slučajevima, antitelo obelodanjivanja sadrži i laki lanac, kao i najmanje varijabilni region teškog lanca. U drugim slučajevima, antitelo obelodanjivanja može dalje da sadrži jedan ili više CH1, šarnirskih, CH2, CH3 i CH4 regiona teškog lanca. Antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U nekim slučajevima, konstantni domen je konstantni domen za određivanje komplementa, gde je poželjno da antitelo pokazuje citotoksičnu aktivnost, a klasa je tipično IgG1. U drugim slučajevima, kada takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantni domen može biti od IgG2 klase. Antitelo obelodanjivanja može sadržati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa, a odabir određenih konstantnih domena za optimizaciju željenih efektorskih funkcija je poznato u struci.

[0059] Okvir i CDR regioni humanizovanog antitela ne moraju precizno odgovarati roditeljskim sekvencama, npr., CDR donatora ili konsenzusni okvir mogu biti mutageni zamenom, ubacivanjem ili brisanjem bar jednog ostatka, tako da CDR ili okvirni ostatak u tom site ne odgovara niti konsenzusu niti donatorskom antitelu. Takve mutacije, međutim, poželjno nisu ekstenzivne. Obično, najmanje 75% humanizovanih ostataka antitela će odgovarati onima u okruženju roditeljskog okvira (FR) i CDR, često 90%, a najpoželjnije više od 95%. Humanizovana antitela mogu se proizvoditi korišćenjem raznih tehnika poznatih u stanju tehnike, uključujući, ali bez ograničenja, CDR-presađivanje (evropski patent SAD br. EP 239,400; međunarodna objava br. WO 91/09967; i patent SAD br.

5,225,539, 5,530,101, i 5,585,089), furniranje ili obnavljanje (evropski patent br. EP 592,106 i EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka i dr., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; i Roguska i dr., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.91: 969-973), mešanje lanaca (patent SAD br.5,565,332), i tehnike obelodanjene u npr., patent SAD br. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, međunarodna objava br. WO 9317105, Tan i dr., 2002, J. Immunol. 169: 1119-25, Caldas i dr., 2000, Protein Eng.13: 353-60, Morea i dr., 2000, Methods 20: 267-79, Baca i dr., 1997, J. Biol. Chem.272: 10678-84, Roguska i dr., 1996, Protein Eng.9: 895-904, Couto i dr., 1995, Cancer Res.55 (23 Supp): 5973s-5977s, Couto i dr., 1995, Cancer Res.55: 1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150: 409-10, Pedersen i dr., 1994, J. Mol. Biol.235: 959-73, Jones i dr., 1986, Nature 321: 522-525, Riechmann i dr., 1988, Nature 332: 323, i Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol.2: 593-596. Često, okvirni ostaci u okvirnim regionima će biti supstituisani sa odgovarajućom ostatkom iz antitela donorskog CDR-a da bi se promenili, poželjno poboljšati vezivanje antigena. Ove okvirne supstitucije se identifikuju metodama koje su dobro poznate u struci, npr., modeliranjem interakcija CDR-a i okvirnih ostataka za identifikaciju okvirnih ostataka značajnih za vezivanje antigena i poređenje sekvence kako bi se identifikovale neobične okvirne ostatke u određenim položajima (videti, Kueen i dr., patent SAD br.5,585,089; objave SAD br.2004/0049014 i 2003/0229208; patent SAD br.6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 i 5,530,101 i Riechmann i dr., 1988, Nature 332: 323).

2

[0060] Antitela predmetnog obelodanjivanja mogu se proizvesti bilo kojim postupkom koji je poznat u stanju tehnike koji je koristan za proizvodnju polipeptida, npr., in vitro sintezom, proizvodnjom rekombinantne DNK i slično. Poželjno, humanizovana antitela se proizvode pomoću tehnologije rekombinantne DNK. Antitela obelodanjivanja mogu se proizvoditi pomoću tehnologije rekombinantne imunoglobulinske ekspresije. Rekombinantna proizvodnja molekula imunoglobulina, uključujući humanizovana antitela, opisana su u patentu SAD br.4,816,397 (Boss i dr.), patentu SAD 6,331,415 i 4,816,567 (oba za Cabilli i dr.), UK patent GB 2,188,638 (Winter i dr. ), i UK patent GB 2,209,757. Tehnike rekombinantne ekspresije imunoglobulina, uključujući i humanizirane imunoglobuline, takođe se mogu naći u Goeddel i dr., Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991), and Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992). Dodatne informacije u vezi sa generacijom, dizajnom i ekspresijom rekombinantnih antitela mogu se naći u Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993).

[0061] Primerni postupak za proizvodnju rekombinantnih himernih antitela obelodanjivanja može sadržati sledeće: a) konstruisati, konvencionalnim metodama molekularne biologije, ekspresioni vektor koji kodira i eksprimira težak lanac antitela u kojem su CDR i varijabilni region mišijeg anti-B7-H1 (ili anti-PD-1) monoklonsko antitelo spojeni su sa Fc regionom izvedenim iz humanog imunoglobulina, čime se dobija vektor za ekspresiju teškog lanca himernog antitela; b) konstruisanje, putem konvencionalnih molekularnih bioloških metoda, ekspresionog vektora koji kodira i eksprimira laki lanac antitela mišijeg anti-B7-H1 (ili anti-PD-1) monoklonskog antitela, čime se dobija vektor za ekspresiju himernog antitela lagan lanac; c) prenošenje vektora ekspresije u ćeliju domaćina konvencionalnim metodama molekularne biologije da bi se proizvela transfektovana ćelija domaćina za ekspresiju himernih antitela; i d) kultivisanje transfektovane ćelije konvencionalnim tehnikama ćelijske kulture kako bi se proizvelo himerna antitela.

[0062] Primerni postupak za proizvodnju rekombinantnih humanizovanih antitela u obelodanjivanju može sadržati sledeće: a) konstruisanje, putem konvencionalnih molekularnih bioloških metoda, ekspresionog vektora koji kodira i eksprimira težak lanac antitela u kojem su CDR i minimalni deo okvira varijabilnog regiona koji su potrebni da zadrže specifičnost vezivanja donatorskih antitela, izvedeni su iz nehumanog imunoglobulina, kao što je mišije anti-B7-H1 (ili anti-PD-1) monoklonsko antitelo, a ostatak antitela izveden iz humanog imunoglobulina, čime se dobija vektor za ekspresiju teškog lanca humanizovanog antitela; b) konstruisanje, putem konvencionalnih molekularnih bioloških metoda, ekspresionog vektora koji kodira i eksprimira laki lanac antitela u kome CDR i minimalni deo okvira varijabilnog regiona koji su potrebni da zadrže specifičnost vezivanja donatorskih antitela izvedeni su od ne-humanog imunoglobulina, kao što je mišije anti-B7-H1 (ili anti-PD-1) monoklonalno antitelo, a ostatak antitela izveden je od humanog imunoglobulina, čime se dobija vektor za ekspresiju lakog lanca humanizovanog antitela; c) prenošenje vektora ekspresije u ćeliju domaćina konvencionalnim metodama molekularne biologije kako bi se proizvela transfektovana ćelija domaćina za ekspresiju humanizovanih antitela; i d) kultivisanje transfekovane ćelije konvencionalnim tehnikama ćelijske kulture kako bi se proizvelo humanizovano antitelo.

[0063] S obzirom na jednu od primernih metoda, ćelije domaćina mogu biti kotransfektovane sa takvim ekspresionim vektorima, koji mogu sadržati različite selektibilne markere, ali su, s izuzetkom sekvenci kodiranja teškog i lakog lanca, poželjnije identični. Ovaj postupak obezbeđuje jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i polipeptide teškog i lakog lanca. Serijske sekvence za teške i lake lance mogu sadržati cDNK ili genomsku DNK ili oboje. Ćelija domaćina koja se koristi za ekspresiju rekombinantnog antitela obelodanjivanja može biti ili bakterijska ćelija kao što je Escherichia coli ili poželjnije ćelija eukariota (npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelija HEK-293). Izbor vektora ekspresije zavisi od izbora ćelije domaćina i može se odabrati tako da ima željenu ekspresiju i regulatorne karakteristike u izabranoj ćeliji domaćina. Ostale ćelijske linije koje mogu biti korišćene uključuju, ali nisu ograničene na, CHO-K1, NSO i PER.C6 (Crucell, Leiden, Holandija). Štaviše, upotreba kodona može se optimizirati kada se odabere ćelija domaćina da bi se objasnila odstupanja u upotrebi specifičnih kodona i povećala ekspresija proteina. Na primer, za ekspresiju CHO ćelija DNK koja kodira antitela može uključiti kodone koji se koriste pretežno Cricetulus griseus (odakle potiču ćelije jajnika kineskog hrčka). Metode optimizacije kodona mogu se koristiti za olakšanje poboljšane ekspresije od željene ćelije domaćina (videti, npr., Wohlgemuth, I. i dr. (2011) „Evolutionary Optimization Of Speed And Accuracy Of Decoding On The Ribosome,” Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.366(1580): 2979-2986; Jestin, J.L. i dr. (2009) „Optimization Models And The Structure Of The Genetic Code,” J. Mol. Evol.69(5): 452-457; Bollenbach, T. i dr. (2007) „Evolution And Multilevel Optimization Of The Genetic Code,” Genome Res. 17(4): 401-404; Kurland, C.G. i dr. (1984) „Optimization Of Translation Accuracy,” Prog. Nucleic

2

Acid Res. Mol. Biol.31: 191-219; Grosjean, H. i dr. (1982) „Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interactions Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes,” Gene 18(3): 199-209).

[0064] Bilo koja od gore opisanih antitela može se koristiti za stvaranje anti-idiotipskih antitela korišćenjem tehnika koje su dobro poznate stručnjacima (videti npr. Greenspan, N.S. i dr. (1989) „Idiotypes: Structure And Immunogenicity,” FASEB J.7: 437-444; and Nisinoff, A. (1991) „Idiotypes: Concepts And Applications,” J. Immunol.147(8): 2429-2438).

[0065] Vezujuća svojstva bilo kog od gore navedenih antitela mogu, ako je poželjno, dalje poboljšati skriningom za varijante koje pokazuju takve željene karakteristike. Na primer, takva antitela mogu biti generisana korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatih u stanju tehnike. U metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koji nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. U određenom slučaju, takav fag može se koristiti za prikazivanje antigen vezujućih domena, kao što su Fab i Fv ili stabilizovani Fv stabilizovani sa disulfidnom vezom, izraženi iz biblioteke repertoara ili kombinatornog antitela (npr., čoveka ili glodara). Fag koji eksprimira antigen vezujući domen koji vezuje antigen koji je od interesa, može se odabrati ili identifikovati sa antigenom, npr. koristeći označeni antigen ili antigen vezan ili zarobljen na čvrstu površinu ili zglobu. Fag korišćeni u ovim metodama su tipično filamentni fag, uključujući fd i M13. Antigen vezujući domeni su izraženi kao rekombinantno spojeni protein ili sa fagnim genom III ili sa proteinom gena VIII. Primeri metoda prikaza faga koji se mogu koristiti za stvaranje imunoglobulina ili njihovih fragmenata sadašnjeg obelodanjivanja obuhvataju one obelodanjene u Brinkman, U. i dr. (1995) „Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragment,” J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; Ames, R.S. i dr. (1995) „Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins,” J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough, C.A. i dr. (1994) „Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The ReKonstruktion Of Whole Antibodies From These Antibody Fragment,” Eur. J. Immunol., 24: 952-958, 1994; Persic, L. i dr. (1997) „An Integrates Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries,” Gene, 187: 9-18; Burton, D.R. i dr. (1994) „Human Antibodies From Combinatorial Libraries,” Adv. Immunol.57: 191-280; PCT objave WO 92/001047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO

2

95/15982; WO 95/20401; i patenti SAD br.5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108

[0066] Kao što je opisano u gore navedenim referencama, nakon izbora faga, regioni za kodiranje antitela iz faga mogu se izolovati i koristiti za stvaranje celih antitela, uključujući humanizirana antitela ili bilo koji drugi željeni fragment i izražene u bilo kojem željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, kvasac i bakterije, npr. kao što je detaljno opisano u nastavku. Na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2fragmenata takođe mogu biti korišćene korišćenjem postupaka poznatih u struci kao što su oni obelodanjene u PCT objavi WO 92/22324; Mullinax, R.L. i dr. (1992) „Expression Of A Heterodimeric Fab Antibody Protein In One Cloning Step,” BioTechniques, 12(6): 864-869; i Sawai i dr. (1995) „Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNK Expression Vectors,” Am. J. Reprod. Immunol. 34: 26-34; i Better, M. i dr. (1988) „Escherichia coli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment,” Science 240: 1041-1043). Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju Fv-ova i antitela sa jednim lancem uključuju one opisane u patent SAD br.4,946,778 i 5,258,498; Huston, J.S. i dr. (1991) „Protein Engineering Of Single-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins,” Methods in Enzymology 203: 46-88; Shu, L. i dr., „Secretion Of A Single-Gene-Encoded Immunoglobulin From Myeloma Cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 7995-7999; i Skerra. A. i dr. (1988) „Assembly Of A Functional Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichia coli,” Science 240: 1038-1040.

[0067] Tehnologija prikaza faga može se koristiti za povećanje afiniteta antitela obelodanjivanja za B7-H1 i/ili PD-1. Ova tehnika bi bila korisna za dobijanje visoko afinitetnih antitela koja bi se mogla koristiti u kombinatornim metodama obelodanjivanja. Ova tehnologija, koja se naziva zrelost sazrevanja, koristi mutagenezu ili CDR-hodanje i ponovnu selekciju koristeći takve receptore ili ligande (ili njihove ekstracelularne domene) ili njegovog antigenskog fragmenta za identifikaciju antitela koja se vezuju sa većim afinitetom prema antigenu u poređenju sa inicijalnim ili roditeljskim antitelo (videti npr., Glaser, SM i dr. (1992) „Inženjering antitela putem mutacije na osnovi kodona u vektorskom sistemu filamentnog faga”, J. Immunol., 149: 3903-3913). Mutagenizacija čitavih kodona umjesto pojedinačnih nukleotida dovodi do polu-nasumičnog repertoara aminokiselinskih mutacija.

2

Biblioteke mogu biti izgrađene u obliku bazena varijantnih klonova, od kojih se svaki razlikuje u jednoj izmeni aminokiselina u jednom CDR-u i koji sadrže varijante koje predstavljaju svaku moguću supstituciju aminokiselina za svaki CDR ostatak. Mutanti sa povećanim vezivnim afinitetom za antigen mogu biti prikazani kontaktiranjem imobilizovanih mutanata sa označenim antigenom. Bilo koji metod skrininga koji je poznat u stanju tehnike može se koristiti za identifikaciju mutantnih antitela sa povećanom potrebom za antigenom (npr. ELISA) (videti, npr., Wu, H. i dr. (1998) „Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11): 6037-6042; Yelton, D.E. i dr. (1995) „Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,” J. Immunol. 155: 1994-2004). Hodanje CDR-a koje nasumično obrađuje laki lanac može se koristiti (videti, Schier i dr. (1996) „Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,” J. Mol. Biol.263: 551-567).

[0068] Obelodanjivanje stoga razmatra upotrebu nasumične mutageneze u skladu sa metodama prikaza faga za identifikaciju poboljšanih CDR i/ili varijabilnih regiona.

Tehnologija prikaza faga može alternativno da se koristi za povećanje (ili smanjenje) afiniteta CDR-a usmerenom mutagenezom (npr. sazrevanje afiniteta ili „hodanje CDR-om”). Ova tehnika koristi ciljani antigen ili njegov antigenski fragment za identifikaciju antitela koja imaju CDR-ove koji se vežu sa višim (ili nižim) afinitetom prema antigenu u poređenju sa inicijalnim ili roditeljskim antitelom (videti, npr., Glaser, S.M. i dr. (1992) „Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filanaentous Phage Vector System,” J. Immunol. 149: 3903-3913). Mutagenizacija čitavih kodona umesto pojedinačnih nukleotida dovodi do polu-nasumičnog repertoara aminokiselinskih mutacija. Biblioteke mogu biti izgrađene u obliku bazena varijantnih klonova, od kojih se svaki razlikuje u jednoj izmeni aminokiselina u jednom CDR-u i koji sadrže varijante koji predstavljaju svaku moguću supstituciju aminokiselina za svaki CDR ostatak. Mutanti sa povećanim (ili smanjenim) afinitetom vezivanja za antigen mogu biti prikazani kontaktiranjem imobilizovanih mutanata sa označenim antigenom. Bilo koji metod skrininga koji je poznat u stanju tehnike može se koristiti za identifikaciju mutantnih antitela sa povećanom (ili smanjenom) potrebom za antigenom (npr., ELISA) (videti Wu, H. i dr. (1998) „Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11): 6037-6042; Yelton, D.E. i dr. (1995) „Affinity Maturation Of The BR96 Anti-

2

Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,” J. Immunol. 155: 1994-2004). Hodanje CDR-a koje nasumično obrađuje laki lanac može se koristiti (videti, Schier i dr. (1996) „Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,” J. Mol. Biol.263: 551-567).

[0069] Metode za postizanje takvih afinitetskih sazrevanja su opisane u npr.: Krause, J.C. i dr. (2011) „An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody,” MBio.2(1) pii: e00345-10. doi:

10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. i dr. (2010) „Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,” Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. i dr. (2010) „Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionaliy Landscapes,” J. Mol. Biol.401(1): 84-96; Montgomery, D.L. i dr. (2009) „Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41,” MAbs 1(5): 462-474; Gustchina, E. i dr. (2009) „Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Deprived Front A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth,” Virology 393(1): 112-119; Finlay, W.J. i dr. (2009) „Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,” J. Mol. Biol.388(3): 541-558; Bostrom, J. i dr. (2009) „Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development,” Methods Mol. Biol.525: 353-376; Steid1, S. i dr. (2008) „In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification,” Mol. Immunol.46(1): 135-144; and Barderas, R. i dr. (2008) „Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26): 9029-9034.

[0070] Obelodanjivanje posebno obuhvata proizvodnju i upotrebu „derivata” bilo kojeg od gore opisanih antitela i njihovih antigen vezujućih fragmenata. Termin „derivat” odnosi se na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen, ali koji sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, dodataka, brisanja ili modifikacije u odnosu na „roditeljsko” (ili divlji tip) molekula. Takve supstitucije ili dodaci aminokiselina mogu uvesti prirodno nastale (tj. kodirane sa DNK) ili ostatke

2

aminokiselina koje se ne pojavljuju u prirodi. Takve aminokiseline mogu biti glikozilovane (npr. izmenjene manoze, 2-N-acetilglukozamin, galaktoza, fukoza, glukoza, sijalinska kiselina, 5-N-acetilneuraminska kiselina, 5-glikolneuraminska kiselina itd.), acetilovani, pegilovani, fosforilovani , amidirani, derivatizovani poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezanim sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinima itd. U nekim slučajevima, izmenjene ugljovodoniče modifikacije modulišu jedan ili više od sledećih: solubilizacija antitela, olakšanje unutar-celularnog transporta i sekreciju antitela, promocija skupa antitela, konformacioni integritet i efektorska funkcija posredovana antitelom. U određenom slučaju, izmenjene modifikacije ugljenih hidrata povećavaju efektorsku funkciju posredovane antitelom u odnosu na antitelo koje nema modifikaciju ugljenih hidrata. Modifikacije ugljenih hidrata koje dovode do izmenjene efektorske funkcije posredovane antitelom su dobro poznate u tehnici (na primer, videti Shields, R.L. i dr. (2002) „Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.,” J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. i dr. (2001) „Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII,” Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). Metode izmene sastava ugljenih hidrata su poznate onima stručnim u struci, videti, npr., Wallick, S.C. i dr. (1988) „Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen,” J. Exp. Med.168(3): 1099-1109; Tao, M.H. i dr. (1989) „Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region,” J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, NPR. i dr. (1995) „The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody,” Transplantation 60(8): 847-53; Elliott, S. i dr. (2003) „Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering,” Nature Biotechnol.21: 414-21; Shields, R.L. i dr. (2002) „Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcganama RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.,” J. Biol. Chem.277(30): 26733-26740).

[0071] U nekim slučajevima, humanizovano antitelo je derivat. Takvo humanizovano antitelo sadrži supstitucije ostataka aminokiseline, uklanjanje ili dodatke u jednoj ili više nehumanih CDR-ova. Derivat humanizovanog antitela može imati suštinski isto vezivanje, bolje vezivanje ili lošije vezivanje u poređenju sa ne-derivativnim humanizovanim antitelima. U određenim slučajevima jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka CDR-a su supstituisani, izbrisani ili dodati (tj. mutirani).

[0072] Derivatno antitelo ili fragment antitela mogu se modifikovati hemijskim modifikacijama koristeći tehnike poznate stručnjacima u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunicamicina, itd. U jednom slučaju, derivat antitela će imati sličnu ili identičnu funkciju kao roditeljsko antitelo. U drugom slučaju, derivat antitela će pokazati izmenjenu aktivnost u odnosu na roditeljsko antitelo. Na primer, derivativno antitelo (ili njegov fragment) može se više vezati za svoj epitop ili biti otpornije na proteolizu nego roditeljsko antitelo.

[0073] Supstitucije, dodaci ili uklanjanje u derivatizovanim antitelima mogu biti u Fc regionu antitela i na taj način mogu služiti za modifikaciju afiniteta vezivanja antitela na jedan ili više FcγR. Metode za modifikovanje antitela sa modifikovanim vezivanjem na jedan ili više FcγR su poznate u struci, videti, npr., PCT objave br. WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089, i patente SAD br.5,843,597 i 5,642,821. U nekim slučajevima obelodanjivanje obuhvata antitela koja su promenila afinitet za aktivirajuće FcγR, npr., FcγRIIIA. Poželjno, takve modifikacije takođe imaju izmenjenu Fc posredovano efektorsku funkciju. Modifikacije koje utiču na Fc posredovane efektorske funkcije su dobro poznate u struci (videti patent SAD br.

6,194,551, i WO 00/42072). U jednom posebnom primeru, modifikacija regiona Fc rezultuje antitelo sa izmenjenom efektorskom funkcijom posredovanim antitelom, izmenjeno vezivanje za druge Fc receptore (npr. receptore za aktivaciju Fc), izmenjena citotoksičnost posredovana ćelijama (ADCC ) aktivnost, izmenjena aktivnost vezivanja C1q, izmenjena aktivnost vezana za citotoksičnost (CDC) zavisna od komplementa, fagotna aktivnost ili bilo koja njihova kombinacija.

[0074] Derivatizovana antitela mogu se koristiti za promenu poluraspada (npr., polu-života seruma) roditeljskih antitela kod sisara, poželjno čoveka. Poželjno, takva promena rezultiraće polu-životom većim od 15 dana, poželjno većim od 20 dana, većim od 25 dana, većim od 30 dana, većim od 35 dana, većem od 40 dana, većim od 45 dana, većim od 2 dana meseci većim od 3 meseca, većim od 4 meseca, ili većim od 5 meseci. Povećani polu-život humanizovanih antitela sadašnjeg obelodanjivanja ili njegovih fragmenata kod sisara, poželjno čoveka,

1

rezultira višim titrom seruma navedenih antitela ili fragmenata antitela kod sisara, i time smanjuje učestalost primene navedena antitela ili fragmenti antitela i/ili smanjuju koncentraciju pomenutih antitela ili fragmenata antitela za primenu. Antitela ili fragmenti od njih koji imaju povećan in vivo polu-život mogu biti se generisati tehnikama poznatim stručnjacima u tehnici. Na primer, antitela ili fragmenti sa povećanim in vivo polu-životima mogu se generisati modifikovanjem (npr. supstitucija, brisanje ili dodavanje) ostataka aminokiselina identifikovanih kao interakcije između Fc domena i FcRn receptora.

Humanizovana antitela obelodanjivanja mogu biti konstruisana da bi se povećala biološka poluraspada (videti, npr., patent SAD br.6,277,375). Na primer, humanizovana antitela obelodanjenja mogu se projektovati u domenu Fc-zavisnih da bi povećali in vivo ili poluživot u serumu.

[0075] Antitela ili fragmenti sa povećanim in vivo polu-životima mogu se generisati vezivanjem na pomenuta antitela ili fragmente antitela polimernih molekula kao što je polietilenglikol visoke molekulske mase (PEG). PEG se može povezati sa navedenim antitelima ili fragmentima antitela sa ili bez multifunkcionalnog veznika bilo putem specifične lokacije konjugacije PEG-a na N- ili C- terminus navedenih antitela ili fragmenata antitela ili putem epsilon-amino grupa prisutnih na ostacima lizina. Koristi se linearna ili razgranata derivatizacija polimera koja rezultira minimalnim gubitkom biološke aktivnosti. Stepen konjugacije će pažljivo pratiti SDS-PAGE i masena spektrometrija kako bi se osigurala pravilna konjugacija PEG molekula na antitela. Nereagovani PEG može biti odvojen od antitela-PEG konjugata, npr., isključivanjem veličine ili jonoizmenjivačkom hromatografijom.

[0076] Antitela obelodanjivanja mogu takođe biti modifikovana metodama i sredstvima za kuplovanje koje opisuje Davis i dr. (videti patent SAD br.4,179,337) kako bi se obezbedili sastavi koje se mogu ubrizgati u sistem za cirkulaciju sisara bez značajnog imunogenog odgovora.

[0077] Obelodanjivanje obuhvata modifikaciju okvirnih ostataka humanizovanih antitela obelodanjenja. Okvirni ostaci u okviriranim regionima mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom iz antitela donorskog CDR-a da bi se promenili, poželjno poboljšati vezivanje antigena. Ove okvirne supstitucije se identifikuju metodama poznatim u stanju tehnike, npr. modeliranjem interakcija CDR-a i okvirnih ostataka za identifikaciju okvirnih

2

ostataka značajnih za vezivanje antigena i poređenje sekvence kako bi se identifikovale neobične okvirne ostatke na određenim položajima. (Videti, npr., patent SAD br.5,585,089; i Riechmann, L. i dr. (1988) „Reshaping Human Antibodies For Therapy,” Nature 332: 323-327).

[0078] Predmetno obelodanjivanje obuhvata i anti-human B7-H1 i anti-human PD-1 antitela (i još poželjnije, humanizirana antitela) i fragmenti koji se vezuju za antigen koji su rekombinantne kondenzovani ili hemijski konjugirani (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) na heterologni molekul (tj. nepovezani molekul). Fuzija ne mora nužno biti direktna, ali se može pojaviti kroz veznikske sekvence.

[0079] Fc deo fuzije fuzionog proteina može se menjati izotipom ili podklasom, može biti himeričan ili hibridan, i/ili može biti modifikovan, na primer za poboljšanje efektorskih funkcija, kontrolu poluraspada, dostupnost tkiva, povećanje biofizičkih karakteristika kao što su stabilnost i poboljšanje efikasnosti proizvodnje (i manje skupo). Mnoge modifikacije korisne u izgradnji otkrivenih fuzionih proteina i postupaka za njihovo izradu su poznate u struci, videti na primer Mueller, J.P. i dr. (1997) „Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells,” Mol. Immun. 34(6): 441-452, Swann, P.G. (2008) „Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies,” Curr. Opin. Immun. 20: 493-499 (2008), and Presta, L.G. (2008) „Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies,” Curr. Opin. Immun. 20: 460-470. U nekim slučajevima region Fc je prirodni IgG1, IgG2 ili IgG4 Fc region. U nekim slučajevima Fc region je hibrid, na primer himerni koji se sastoji od konstantnih regiona IgG2/IgG4 Fc. Modifikacije u Fc region uključuju, ali nisu ograničene na, IgG4 modifikovane da sprečavaju vezivanje za Fc gama receptore i komplement, IgG1 modifikovan da poboljša vezivanje za jedan ili više Fc gama receptora, IgG1 modifikovan da minimizira efektorsku funkciju (promene aminokiselina), IgG1 sa promenjenim/bez glikana (tipično izmenom ekspresionog domaćina) i IgG1 sa izmenjenim pH-zavisnim vezivanjem na FcRn. Fc region može obuhvatiti čitavo zavisno područje ili manje od čitavog zavisnog područja.

[0080] Terapeutski ishod kod pacijenata tretiranih rituksimabom (himernim monoklonskim antitelom miša/čoveka IgG1 protiv CD20) za ne-Hodgkinov limfom ili Valdenstromovom makroglobulinemijom korelisao je sa individualnom ekspresijom alelnih varijanti Fcg receptora sa različitim inherentnim afinitetima za Fc domen humanog IgG1. Naročito, pacijenti sa visokim afinitetnim alelima aktivirajućeg Fc receptora CD16A (FcgRIIIA) sa niskim afinitetom pokazali su veću brzinu odgovora i, u slučajevima ne-Hodgkinovog limfoma, poboljšali preživljavanje bez progresije. U drugom slučaju, Fc domen može sadržati jednu ili više inserta, uklanjanja ili supstitucija aminokiselina koji smanjuju vezivanje za inhibitor Fc receptora niske afiniteta CD32B (FcγRIIB) i zadržavaju nivoe divljeg tipa vezivanja ili povećavaju vezivanje za aktivaciju sa niskim afinitetom Fc receptor CD16A (FcγRIIIA).

[0081] Još jedan primer uključuje hibride IgG2-4 i IgG4 mutante koji imaju smanjenje vezivanja za FcR koji povećavaju njihov polu-život. Reprezentativni IG2-4 hibridi i IgG4 mutanti su opisani u Angal, S. i dr. (1993) „A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (IgG4) Antibody,” Molec. Immunol. 30(1): 105-108; Mueller, J.P. i dr. (1997) „Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells,” Mol. Immun.34(6): 441-452; i patent SAD br.6,982,323. U nekim slučajevima domen IgG1 i/ili IgG2 se, na primer, briše, Angal i dr. opisuje IgG1 i IgG2 koje imaju serin 241 zamenjen sa prolinom.

[0082] U poželjnom primeru, domen Fc sadrži inserte aminokiselina, uklanjanje ili supstitucije koji povećavaju vezivanje za CD16A. Veliki broj zamena u domenu Fc humane IgG1 koji povećavaju vezivanje za CD16A i smanjuju vezivanje za CD32B su poznati u struci i opisani su u Stavenhagen, J.B. i dr. (2007) „Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res.57(18): 8882-8890. Primerne varijante humanih IgG1 Fc domena sa smanjenim vezivanjem na CD32B i/ili povećanom vezivanjem za CD16A sadrže zamene F243L, R929P, I300L, V305I ili P296L. Ove aminokiselinske supstitucije mogu biti prisutne u humanom IgG1 Fc domenu u bilo kojoj kombinaciji. U jednom slučaju, varijabla domena IgG1 Fc sadrži supstituciju F243L, R929P i I300L. U drugom slučaju, humani IgG1 Fc domen varijante sadrži supstituciju F243L, R929P, I300L, V305I i P296L. U drugom slučaju, varijanta humane IgG1 Fc domena sadrži supstituciju N297K, jer ova mutacija ukida vezivanje FcR.

4

[0083] U jednom slučaju takvi heterologni molekuli su polipeptidi koji imaju najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 aminokiselina . Takvi heterologni molekuli mogu alternativno biti enzimi, hormoni, receptori na površini ćelija, lekovi, kao što su: toksini (kao što su abrin, ricin A, pseudomonas eksotoksin (tj. PE-40), difterijski toksin, ricin, gelonin ili pokeveed antivirusni protein ), proteini (kao faktor tumorske nekroze, interferon (npr., αinterferon, β-interferon), faktor rasta nerava, faktor rasta koji se dobija od trombocita, aktivator tkiva plazminogena ili apoptotički agens (npr. faktor nekroze tumora-a, tumor faktor nekroze b)), modifikatori biološkog odgovora (na primer, limfokin (npr. interleukin-1 („IL-1”), interleukin-2 („IL-2”), interleukin-6 („IL-6”)), faktor stimulacije kolonije granulocitne makrofage („GM-CSF”), faktor stimulacije kolonije granulocita („G-CSF”) ili faktor stimulacije kolonije makrofaga („M-CSF”) ili faktori rasta (npr. hormon rasta („GH”))), citotoksini (npr. citostatički ili citocidni agens, kao što su paklitaksol, citokalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mimetamicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi , prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, monometil auristatin F (MMAF), monometil auristatin E (MMAE, npr. vedotin) i puromicin i njihovi analogi ili homologi), antimetaboliti (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin , 5-fluorouracil dekarbazin), sredstva za alkilovanje (npr. meclorethamine, tioepa chlorambucil, melfalan, BiCNU® (carmustine; BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cisdichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin) daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mithramicin i anthramicin (AMC)) ili anti-mitotici (npr. vinkristin i vinblastin).

[0084] Dobre su poznate tehnike za konjugovanje takvih terapijskih delova prema antitelima; videti, npr., Arnon i dr., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld i dr. (eds.), 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom i dr., „Antibodies For Drug Delivery”, in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson i dr. (eds.), 1987, pp.623-53, Marcel Dekker, Inc. ); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, u MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera i dr. (eds.), 1985, pp.475-506); „Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, u MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin i dr. (eds.), 1985, pp.303-16, Academic Press; Thorpe i dr. (1982) „The Preparation And Cytotoxic Propertied Of Antibody-Toxin Conjugates,” Immunol. Rev.62: 119-158; Carter, P.J. i dr. (2008) „Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy,” Cancer J.14(3): 154-169; Alley, S.C. i dr. (2010) „Antibody-Drug Conjugates: Targeted Drug Delivery For Cancer,” Curr. Opin. Chem. Biol.14(4): 529-537; Carter, P. i dr. (2005) „Designer Antibody-Based Therapeutics For Oncology,” Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book.2005(1): 147-154; Carter, P.J. i dr. (2008) „Antibody-Drug Conjugates For Cancer Therapy,” Cancer J.14(3): 154-169; Chari, R.V.J. (2008) „Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity To Cytotoxic Drugs,” Acc. Chem Res. 41(1): 98-107; Doronina, S.O. i dr. (2003) „Development Of Potent Monoclonal Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy,” Nat.

Biotechnol. 21(7): 778-784; Ducry, L. i dr. (2010) „Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads To Monoclonal Antibodies,” Bioconjug Chem.21(1): 5-13; Senter, P.D. (2009) „Potent Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3): 235-244; i Teicher, B.A. (2009) „Antibody-Drug Conjugate Targets,” Curr Cancer Drug Targets. 9(8): 982-1004.

[0085] Bilo koji od molekula predmetnog obelodanjenja može biti spojen sa markerskim sekvencama, kao što je peptid, kako bi se olakšalo prečišćavanje. U poželjnim slučajevima, aminokiselinska sekvenca markera je heksa-histidin peptid, oznaka hemaglutinina „HA”, koja odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina influence (Wilson, I.A. i dr. (1984) „The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein,” Cell, 37: 767-778) i oznaka „zastava” (Knappik, A. i dr. (1994) „An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments,” Biotechniques 17(4): 754-761).

[0086] Predmetno obelodanjivanje takođe obuhvata antitela ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji su konjugovani sa dijagnostičkim ili terapijskim agensom ili bilo kojim drugim molekulom za koji se želi povećati polu-život u serumu. Antitela se mogu koristiti dijagnostički (in vivo, in situ ili in vitro) da, na primer, prate razvoj ili progresiju bolesti, poremećaja ili infekcije kao deo postupka kliničkog ispitivanja, npr., određivanje efikasnosti date režim lečenja. Otkrivanje može biti olakšano spajanjem antitela u detektabilnu supstancu. Primeri detektabilnih supstanci obuhvataju različite enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminiscene materijale, radioaktivne materijale, pozitron koji emituju metale i neradioaktivni paramagnetni metalni joni.

Detektabilna supstanca može biti spojena ili konjugovana ili direktno antitelu ili indirektno, posredstvom (kao što je, na primer, veznika poznatog u stanju tehnike) korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike. Videti, na primer, patent SAD br.4,741,900 za metalne jone koji mogu biti konjugovani sa antitelima za upotrebu kao dijagnostički postupak prema predmetnom obelodanjivanju. Takva dijagnoza i detekcija se mogu postići spajanjem antitela u detektabilne supstance, uključujući, ali ne ograničavajuća se na, različite enzime, enzime uključujući, ali bez ograničenja na, horseradish perokidase, alkalne fosfataze, betagalaktozidaze ili acetilholinesteraze; kompleksi prostetskih grupa kao što su, ali ne ograničavajući se na, streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentne materijale kao što su, ali bez ograničenja, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocianat, rhodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentni materijal kao što je, ali nije ograničen na, luminol; bioluminisceni materijali kao što su, ali bez ograničenja, luciferaza, luciferin i aekuorin; radioaktivni materijal, kao što je, ali nije ograničen na, bizmut (<213>Bi), ugljenik (<14>C), hromijum (<51>Cr), kobalt (<17>Co), fluorin (<18>F), gadolinijum (<153>Gd,<159>Gd), galijum (<68>Ga,<67>Ga), germanijum (<68>Ge), holmijum (<166>Ho), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In), jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I), lantan (<140>La), lutetijum (<177>Lu), mangan (<54>Mn), molibden (<99>Mo), pakadijum (<103>Pd), fosfor (<32>P), praseodimijum (<142>Pr), prometijum (<149>Pm), renijum (<186>Re,<188>Re), rodijum (<105>Rh), rutemijum (<97>Ru), samarijum (<153>Sm), skandijum (<47>Sc), selen (<75>Se), stroncijum (<85>Sr), sumpor (<35>S), tecnetijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), kalaj (<113>Sn,<117>Sn), tricijum (<3>H), ksenon (<133>Xe), iterbijum (<169>Yb,<175>Yb), itrijum (<90>Y), cink (<65>Zn); pozitron koji emituje metale koristeći različite pozitronske emisione tomografije i neradioaktivne paramagnetne metalne jone.

[0087] Molekuli predmetnog obelodanjivanja mogu biti konjugovani sa drugim antitelom da bi se formirao heterokonjugat antitela kako je opisano u Segal in patent SAD br.4,676,980. Takva heterokonjugatna antitela mogu se dodatno vezati za haptene (kao što je fluorescein, itd.) ili za ćelijske markere (npr., 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47, itd.) ili citokine (itd., IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-beta, IL-10, IL-17, IFNγ, Flt3, BLys) ili chemokines (itd., CCL21), itd.

[0088] Molekuli predmetnog obelodanjenja mogu biti pričvršćeni za čvrste nosače, koji su posebno korisni za imuno ispitivanje ili prečišćavanje ciljnog antigena ili drugih molekula koji su sposobni da se vezuju za ciljani antigen koji je bio imobilizovan na podlogu putem vezivanja za antitelo ili antigen-vezujući fragment sadašnjeg obelodanjivanja. Takva čvrsta podloga uključuje, ali nije ograničena na, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinilhlorid ili polipropilen.

[0089] Predmetno obelodanjivanje dodatno uključuje molekule nukleinske kiseline (DNK ili RNK) koji kodiraju bilo koja takva antitela, fuzione proteine ili fragmente, kao i vektorske molekule (kao što su plazmidi) koje su sposobne da prenose ili replikacije takvih molekula nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline mogu biti jednostruke, dvostruke, mogu sadržati i jednostruke i dvostruke delove.

A. Poželjni modulatorski sastav predmetnog obelodanjivanja

[0090] Obelodanjivanje se posebno odnosi na antitela koja se imunospecifično vezuju za B7-H1 ili PD-1 i/ili moduliraju sposobnost B7-H1 da se veže za PD-1 kod subjekta. Kao što se ovde koristi, „subjekt” je poželjno sisar kao što je ne primat (npr., krave, svinje, konji, mačke, psi, psi itd.) i primat (npr. majmun i čovek), najpoželjnije čovek. Obelodanjivanje se naročito odnosi na humanizovana antitela i fragmente koji se vezuju za antigen, koji se imunospecifično vezuju za čoveka B7-H1 ili za PD-1 i moduliraju sposobnost B7-H1 da se veže na PD-1 kod čoveka ili u ljudskom tkivu (in situ ili ex vivo).

[0091] Najpoželjnije, takva antitela i fragmenti vezujući za antigen će imati dovoljno žudnje da modulišu sposobnost B7-H1 (naročito kada se ispolji u endogenu koncentraciju i) na površini APC-a subjekta da se veže na PD-1 (naročito kada se termini kod endogene koncentracije i) na površini T ćelije takvog subjekta i obrnuto. Termin „endogena koncentracija” odnosi se na nivo na kome se prirodno eksprimira endogeni molekul (tj. u odsustvu vektora ekspresije ili rekombinantnih promotera) u normalnoj, kanceru ili inficiranoj ćeliji.

[0092] U jednom slučaju, takva modulacija će obuhvatati inhibiranje ili na drugi način ometanje vezivanja takvih (poželjno endogeno izraženih i) raspoređenih B7-H1 i takvih (poželjno endogeno izraženih i) postavljeni PD-1. U alternativnom slučaju, takva modulacija će obuhvatiti poboljšanje ili na drugi način omogućiti vezivanje endogeno izraženog i raspoređenog B7-H1 i endogeno izraženog i raspoređenog PD-1. U još jednom slučaju, takva modulacija uključuje direktni agonizam, pri čemu vezivanje anti-B7-H1 ili anti-PD-1 aktivira transdukciju signala kroz odgovarajući receptor.

(1) Poželjna anti-humana B7-H1 antitela i njihovi CDR-ovi

[0093] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, takvi molekuli se mogu proizvoditi skriningom linija hibridoma za one koji proizvode antitela koji su imunospecifični za čoveka B7-H1, a zatim opciono skrining među takvim linijama za one koji pokazuju modulirajuću aktivnost (npr. neutralizirajuća aktivnost, agonizirajuća aktivnost , izmenjena aktivnost prenosa signala itd.). Obelodanjivanje posebno pruža anti-humane B7-H1 klonove: 1E12, 1F4, 2G11, 3B6 i 3D10.

[0094] Antitela izražena klonovima anti-humanim B7-H1 su sekvencirana da bi otkrili svoje varijabilne domene. CDR sekvence prikazane su podebljanim i podvučenim:

Anti-humani B7-H1 klon 1E12

[0095]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani B7-H1 klon 1F4

[0096]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani B7-H1 klon 2G11

[0097]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani B7-H1 klon 3B6

[0098]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani B7-H1 klon 3D10:

[0099]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

(2) Poželjna anti-humana PD-1 antitela i njihovi CDR-ovi

[0100] Alternativno, takva antitela mogu se proizvoditi skriningom linija hibridoma za one koji proizvode za one imunospecifične za PD-1, a zatim za one koji pokazuju modulirajuću aktivnost (npr. neutralizirajuća aktivnost, agonizirajuća aktivnost, izmenjena aktivnost prenosa signala itd.). Obelodanjivanje posebno pruža anti-humane PD-1 klonove: 1E3, 1E8 i 1H3.

[0101] Antitela izražena klonovima anti-humanog PD-1 su sekvencirana da bi otkrila svoje varijabilne domene. CDR sekvence prikazane su podebljanim i podvučenim:

Anti-humani PD-1 klon 1E3:

4

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani PD-1 klon 1E8:

[0103]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

Anti-humani PD-1 klon 1H3:

[0104]

Varijabilni region lakog lanca:

Varijabilni region teškog lanca:

(3) Konsenzusni CDR-ovi anti-humanih B7-H1 i anti-humanih PD-1 antitela predmetnog obelodanjivanja

[0105] Analize CDR identifikovanih antitela su sprovedene kako bi se identifikovale konsenzusne CDR sekvence i verovatno varijantne CDR sekvence koje bi dale slične obavezne atribute. Ovakve varijante CDR-a izračunate su korišćenjem Blosum62.iij analize prema Tabeli 1. Tabela 1 prikazuje rezultate zamene Blosum62.iij. Što je veći rezultat, to je konzervativnija supstitucija i stoga će verovatnije supstitucija neće uticati na funkciju.

[0106] Predmetno obelodanjivanje dozvoljava formiranje novih antitela i vezujućih fragmenata za antigen koji imaju 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 varijantnih CDR-ova. Pošto su metode predmetnog obelodanjivanja identifikovale značajan broj posebnih CDR-ova, obelodanjivanje dozvoljava prepoznavanje CDR ostataka koji će verovatno biti potrebni u bilo kojoj varijanti određenog identifikovanog CDR-a. Ovakvi ostaci su prikazani podebljano u Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5. Za one ostatke za koje se utvrdi da variraju između upoređenih CDR-ova, rezultati zamene Tabele 1 pružaju sredstvo za određivanje identiteta dozvoljenih supstitucija. Na primer, ako se utvrdi da određeni ostatak određenog CDR-a varira u zavisnosti od R ili S, onda pošto R i S imaju stopu supstitucije od -1, svaka supstitucija za R ili S sa supstitucionom ocenom od -1 ili većom su kao verovatno kao i posmatrane varijante (R ili S) (ili su verovatnije od R ili S), da bi se kreirala varijanta CDR koja ima obavezne atribute koji su dovoljno slični onima od određenog CDR-a, kako bi se omogućila primena varijante CDR, pa tako kako bi se formiralo funkcionalno anti-B7-H1 ili anti-PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen. Za svaku poziciju, izbor ostatka koji ima viši rezultat zamene je poželjan u odnosu na izbor ostatka koji ima niži rezultat zamene.

[0107] Tabela 2 predstavlja analizu CDR lakog lanca anti-B7-H1 antitela i daje konsenzusnu sekvencu posmatranih i poželjnih varijanti lakih lanaca anti-B7-H1 CDR-ova predmetnog obelodanjivanja.

4

[0108] Tabela 3 predstavlja analizu CDR teškog lanca anti-B7-H1 antitela i daje konsenzusnu sekvencu posmatranih i poželjnih varijanti CDR teškog lanca anti-B7-H1 ovog obelodanjivanja.

4

[0109] Prema tome, pored antitela i antigen vezujućih fragmenta koji poseduju CDR-ove anti-B7-H1 antitela: 1E12, 1F4, 2G11, 3B6 i 3D10, obelodanjenje dodatno obezbeđuje antitela i antigen vezujuće fragmente koji poseduju CDR imaju gore opisane konsenzusne sekvence lakog i/ili teškog lanca.

[0110] Tabela 4 predstavlja analizu CDR-a lakog lanca anti-PD-1 antitela i daje konsenzusnu sekvencu posmatranih i poželjnih varijanti lakih lanaca anti-PD-1 CDR-ova predmetnog obelodanjivanja.

4

[0111] Tabela 5 predstavlja analizu CDR teških lanaca anti-PD-1 antitela i daje konsenzusnu sekvencu posmatranih i poželjnih varijanti CDR-ova teškog lanca anti-PD-1 ovog prikazivanja.

1

[0112] Prema tome, pored antitela i antigen vezujućih fragmenata koji poseduju CDR-ove antitela anti-PD-1: 1E3, 1E8 i 1H3, opisivanje dodatno obezbeđuje antitela i fragmente koji se vezuju za antigen koji poseduju CDR-ove koji imaju gorenavedene anti-opisane konsenzusne sekvence lakih i/ili teških lanaca.

2

[0113] Predmetno obelodanjivanje obuhvata antitela ili njihove fragmente koji sadrže aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca i/ili varijabilnog lakog lanca najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65% , najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog teškog lanca i/ili lakog lanca monoklonalnog antitela miša proizvedenog bilo kojim od gore navedenih klonova, i koji pokazuju imunospecifično vezivanje za B7-H1 ili PD-1. Predmetno obelodanjivanje dalje obuhvata antitela ili njihove fragmente koji sadrže CDR koji je najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom CDR gore navedenih klonova i koji pokazuju imunospecifično vezivanje za B7-H1 ili PD-1. Određivanje procenta identiteta dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću BLAST poređenja proteina.

[0114] U određenom slučaju, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ovog obelodanjivanja će obuhvatati jedan, dva, tri, četiri, pet ili još poželjnije, svih šest CDR-ova gore opisanih poželjnih antitela i pokazati sposobnost povezivanja sa ljudskim B7-H1 ili PD-1.

B. Terapeutske i profilaktičke upotrebe poželjnih sastava predmetnog obelodanjivanja [0115] Obelodanjivanje se posebno odnosi na terapeutsku i/ili profilaktičku upotrebu molekula (naročito antitela ili njihovih fragmenata vezanih za antigen) koji imunospecifično vezuju humani B7-H1 ili PD-1 čoveka i/ili koji su sposobni za moduliranje vezivanja između B7- H1 i PD-1 kao takvi molekuli (B7-H1 ili PD-1) su endogeno izraženi i raspoređeni u subjektu (npr., humanom pacijentu) i/ili su sposobni da moduliraju signalizaciju preko PD-1 ili B7-H1.

[0116] Kao što se ovde koristi, termini „tretiranje”, „lečenje”, „tretman” i „terapeutska upotreba” odnose se na eliminaciju, smanjenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja koji su pogoršani interakcijama B7-H1 i PD -1. Kako se ovde koristi, „terapeutski efikasna količina” odnosi se na tu količinu terapeutskog sredstva koji je dovoljan da posreduje klinički relevantnom eliminisanju, redukciji ili poboljšanju takvih simptoma. Efekat je klinički relevantan ako je njegova veličina dovoljna da utiče na zdravlje ili prognozu subjekta primaoca. Terapeutski efikasna količina može odnosi seti na količinu terapeutskog sredstva koja je dovoljna da odloži ili minimizira pojavu bolesti, npr. odloži ili minimizira širenje kancera. Terapeutski efikasna količina takođe može da odnosi se na količinu terapeutskog sredstva koja pruža terapeutsku korist u lečenju ili upravljanju bolesti. Pored toga, terapeutski efikasna količina u odnosu na terapeutski agens obelodanjivanja znači pomenu terapijskog agensa samo ili u kombinaciji sa drugim terapijama koje obezbeđuje terapeutsku korist u lečenju ili upravljanju bolestima, npr. dovoljno za poboljšanje terapijska efikasnost terapijskog antitela koja je dovoljna za lečenje ili upravljanje bolesti.

[0117] Kako se ovde koristi, termin „profilaktički agens” odnosi se na sredstvo koje se može koristiti u prevenciji poremećaja ili bolesti pre obelodanjivanja bilo kakvih simptoma takvog poremećaja ili oboljenja. „Profilaktički efikasna” količina je količina profilaktičkog sredstva koja je dovoljna da posreduje u takvoj zaštiti. Profilaktički efikasna količina može se takođe odnositi na količinu profilaktičkog sredstva koja pruža profilaktičku korist u prevenciji bolesti. Nadalje, profilaktički efikasna količina u odnosu na profilaktički agens obelodanjivanja označava količinu samo profilaktičnog agensa ili u kombinaciji sa drugim agensima koja pruža profilaktičku korist u prevenciji bolesti.

[0118] Količina doze i frekvencija davanja navedene u ovom tekstu obuhvaćeni su terminima koji su terapeutski efikasni i profilaktički efikasni. Doziranje i učestalost dalje će se obično varirati u skladu sa faktorima specifičnim za svaki pacijent u zavisnosti od specifičnih terapijskih ili profilaktičkih sredstava kojima se primenjuju, težine i vrste karcinoma, načina primene, kao i starosti, telesne težine, odgovora i prošlosti medicinska istorija pacijenta. Odgovarajuće režime može izabrati stručnjak u struci tako što se uzimaju u razmatranje takve faktore i slede, na primer, doze prijavljene u literaturi i preporučene u referentu za lekare (56. izdanje, 2002).

1. Upotreba up-modulatora imunog sistema

[0119] U poželjnom slučaju, takva antitela i antigen vezujući fragmenti na jednom ili više mesta na B7-H1 ili PD-1 proksimalnom i uznemiravajućem mestu vezivanja B7-H1-PD-1. Kao što je gore rečeno, interakcije između PD-1 i B7-H1 inhibiraju proliferaciju T ćelija i smanjuju proizvodnju višestrukih citokina (videti Sharpe, A.H. i dr. (2002) „The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2: 116-126). Tako, u poželjnom slučaju, primena molekula predmetnog obelodanjivanja subjektu modulira imunološki sistem subjekta antagonizacijom vezivanja B7-H1-PD-1. U drugom slučaju, avidnost i/ili afinitet anti-PD-1 antitela može biti takva da se vezuje samo za (i blokira B7-H1 vezivanje za) T ćelije koje

4

eksprimiraju vrlo visoke nivoe PD-1, što su iscrpljene ili disfunkcionalne T ćelije i time omogućavaju specifično ciljanje ove populacije ćelija. Prema tome, obelodanjivanje odnosi se na upotrebu antitela predmetnog obelodanjivanja radi pospešivanja povećane proizvodnje IFN-γ. Tako odnosi se na upotrebu takvih antitela u lečenju bolesti i stanja koje se mogu lečiti IFN-γ, kao što su jajnik i drugi oblici kancera, hronična granulomatozna bolest, osteopetroza, Friedreichova ataksija itd. Pored toga, obelodanjivanje se posebno odnosi na upotrebu antitela predmetnog obelodanjivanja radi posredovanja povećane proliferacije T ćelija. Tako odnosi se na upotrebu takvih antitela u lečenju bolesti i stanja koje se mogu lečiti povećanjem proliferacije T ćelija, kao što su: AIDS; teška kombinovana imunodeficijencija (SCID); Omenn sindrome; Hipoplazija hirurgije; T ćelijski gubitak ili ablacija incidenta na transplantaciju organa ili tkiva ili hemoterapiju; hipogamaglobulinemija; X-vezana agamaglobulinemija; prelazna hipogamaglobulinemija; disgamaglobulinemija; IgA deficit • IgG deficijent • IgM deficijencija • Hiper IgM sindrom • Viskott-Aldrichov sindrom • Hiper-IgE sindrom; obična varijabilna imunodeficijencija; ICF sindrom; timska hipoplazija (npr. Di George-ov sindrom, Nezelofov sindrom, ataksijska telangiektazija); nedostatak purinske nukleozidne fosforilaze; nedostatak adenozin deaminaze • nedostatak ZAP70 • sindrom golog limfocita; leukopenija; limfocitopenija (npr. idiopatska CD4+ limfocitopenija); ili nedostatak komplementa. Obelodanjivanje se posebno odnosi na upotrebu antitela predmetnog obelodanjivanja radi posredovanja i povećane proizvodnje IFN-γ i povećane proliferacije T ćelija.

[0120] Povećavajuća modulacija imunološkog sistema je naročito poželjna u lečenju kancera i hroničnih infekcija, i stoga je ovo obelodanjivanje korisno u lečenju takvih poremećaja. Oba PD-1 i B7-H1 su previše eksprimirana nakon infekcije HIV-om (Xu, Huanbin i dr. (2010) „Increased B7-H1 Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death 1 Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression,” J. Immunol. 185: 7340-7348; Grabmeier-Pfistershammer, K. i dr. (2011) „identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment,” J Acquir. Immune Defic. Syndr.56(2): 118-124). Tako se ekspresija B7-H1 na takvim ćelijama može koristiti za dijagnozu HIV-a kod ljudi. Prema tome, anti-PD-1 i anti-B7-H1 antitela ovog prikazivanja imaju posebno korisnost kao terapeutika za HIV infekciju i lečenje AIDS-om. Kao što se ovde koristi, termin „kancera” odnosi se na neoplazu ili tumor koji je rezultat abnormalnog nekontrolisanog rasta ćelija. Kao što se ovde koristi, kancer eksplicitno uključuje leukemije i limfome. Termin „kancer” odnosi se na bolest koja uključuje ćelije koje imaju potencijal da metastaziraju na distalne lokacije i pokazuju fenotipske osobine koje se razlikuju od onih kod ne-kancerogenih ćelija, na primer, formiranje kolonija u trodimenzionalnoj podlozi, kao što je mekani agar ili formiranje tubularnih mreža ili mrežastih matrica u trodimenzionalnoj podložnoj membrani ili ekstracelularnom matričnom preparatu. Nekancerogene ćelije ne formiraju kolonije u mekanom agaru i formiraju posebne strukture slične sferi u trodimenzionalnoj membrani bazena ili ekstracelularnim matričnim preparatima.

[0121] Otkucaji i srodni poremećaji koji se mogu tretirati ili sprečiti metodama i sastavima predmetnog obelodanjivanja obuhvataju, ali bez ograničenja, sledeće: leukemije uključujući, ali ne ograničavajući se na, akutnu leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutne mijelocitske leukemije kao što je mijeloblastik, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna, eritroleukemija leukemije i mijelodisplastični sindrom, hronične leukemije kao što su, ali bez ograničenja, hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija, hronična limfocitna leukemija, leukemija dlakave ćelije; polycythemia vera; limfomi kao što su, ali bez ograničenja, Hodgkinova bolest ili ne-Hodgkinove bolesti limfoma (npr., difuzna anaplastična limfoma kinaza (ALK) negativna, veliki limfom B-ćelija (DLBCL); difuzni anaplastični limfomkinaza (ALK) pozitivan, veliki B-ćelijski limfom (DLBCL); anaplastični limfom kinaza (ALK) pozitivna, ALK+ anaplastični velikocelični limfom (ALCL), akutni mijeloidni limfom (AML)); višestruki mijelomi kao što su, ali ne ograničavajući se na, tinjanje višestrukog mijeloma, nesekretni mijelom, osteosklerotični mijelom, leukemija plazamskih ćelija, usamljeni plazmacitom i ekstramedularni plazmacitom; Valdenstromova makroglobulinemija; monoklonalna gamopatija neodređenog značaja; benigna monoklonalna gamopatija; bolesti teškog lanca; sarkom kostiju i vezivnog tkiva, kao što su, ali bez ograničenja, kostni sarkom, osteosarkom, hondrosarkom, Evingov sarkom, tumor malignih tumora gigantskih ćelija, fibrosarkom kostiju, hordoma, periostealni sarkom, sarkomi mekog tkiva, angiosarkom (hemangiosarkom), fibrosarkom, Kaposijev sarkom, leiomiosarkom, liposarkomom, limfangiosarkomom, neurilemomom, rabdomiosarkomom, sinovijalnim sarkomom; tumori na mozgu, uključujući ali bez ograničenja, gliom, astrocitoma, gliom mozga, ependimoma, oligodendroglioma, nonglijskog tumora, akustični neurinoma, kraniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, primarni moždani limfom; kancer dojke, uključujući, ali ne ograničavajući se na, adenokarcinom, lobularni (mali ćelijski) karcinom, intraktalni karcinom, medularni karcinom dojke, kancer dojke, tubularni rak dojke, papilarni kancer dojke, Pagetova bolest i inflamatorni kancer dojke; karcinom nadbubrežne nadlaktice, uključujući, ali ne ograničavajući se na, feohromocitom i adrenokortikalni karcinom; karcinom tiroidne žlezde, kao što je, ali nije ograničen na, papilarni ili folikularni karcinom tiroidne žlezde, medularni karcinom štitne žlezde i anaplastični karcinom štitne žlezde; kancer pankreasa, uključujući, ali bez ograničenja, insulinom, gastrinom, glukagonomu, vipoma, tumor koji sekretira somatostatin i tumor karcinoidnih ili otočnih ćelija; karcinoma hipofize, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Cushingovu bolest, tumor koji izlučuje prolaktin, akromegaliju i inicijus dijabetesa; kancer karcinoma oka, uključujući, ali ne ograničavajući se na, melanom oka, kao što su melanom irisa, horoidalni melanom i melanom tela i retinoblastom; karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinoma i melanoma, uključujući, ali bez ograničenja; karcinom vulvara, uključujući, ali bez ograničenja, karcinom skvamoznih ćelija, melanom, adenokarcinom, karcinom bazalnih ćelija, sarkom i Pagetovu bolest; karcinom grlića materice uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinom skvamoznih ćelija, i adenokarcinom; karcinoma materice uključujući, ali bez ograničenja, karcinom endometrijuma i sarkom uterusa; karcinom jajnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinom jajnika epitela, granični tumor, tumor germinativnih ćelija i stromalni tumor; rakovi esophageal uključujući, ali ne ograničavajući se na, skvamozni kancer, adenokarcinom, adenoidni karcinom karcinoma, mukoepidermoidni karcinom, adenoskvamozni karcinom, sarkom, melanom, plazmacitom, verrucni karcinom, i karcinoma ovsnih ćelija (malih ćelija); rak želuca uključujući, bez ograničenja, adenokarcinom, gljiviranje (polipidno), ulcerozno, površno širenje, difuzno širenje, maligni limfom, liposarkom, fibrosarkom i karcinosarkom; kancer kancera; rektalni kancer; kancer karcinoma jetre uključujući, ali ne ograničavajući se na, hepatocelularni karcinom i hepatoblastom, kanceri žučne kese, uključujući, bez ograničenja, adenokarcinom; holangiokarcinom, uključujući, ali bez ograničenja, papilarni, nodularni i difuzni; karcinom pluća (epidermoid karcinoma), adenokarcinom, karcinom velikih ćelija i malokalibrični kancer pluća, uključujući, ali bez ograničenja, karcinom pluća bez malih ćelija; kancere testisa uključujući, ali ne ograničavajući se, embrionalnih tumor, seminom, anaplastični, klasika (tipično), spermatocitni, nonseminom, embrionalni karcinom, Teratoma karcinom, horiokarcinom (iolk-sac tumora), kancere prostate uključujući, ali ne ograničavajući se, adenokarcinom, leiomiosarkom i rabdomiosarkomom; melanom, nodularni melanom, lentigo maligni melanom, akralni lentiginozni melanom; kancer karcinoma bubrega uključujući, ali ne ograničavajući se na, rak bubrežnih ćelija, adenokarcinom, hipernefrom, fibrosarkom, rak transientnih ćelija (bubrežna karlica i/ili uterer); Vilmsov tumor; rak mokraćne bešike, uključujući, ali bez ograničenja, prelazni ćelijski karcinom, kancer skvamoznih ćelija, adenokarcinom, karcinosarkom. Pored toga, kanceri uključuju miksosarkom, osteogeni sarkom, endoteliosarkom, limfangioendoteliosarkom, mezoteliom, sinoviom, hemangioblastom, epitijelni karcinom, cistadenokarcinom, bronhogeni karcinom, karcinoma znojne žlezde, karcinom lojnih žlezda, papilarni karcinom i papilarni adenokarcinom (za pregled takvih poremećaja, videti Fishman i dr., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy i dr., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

[0122] Shodno tome, metode i sastavi obelodanjivanja su takođe korisni u lečenju ili prevenciji različitih vrsta kancera ili drugih abnormalnih proliferativnih oboljenja, uključujući (ali ne ograničavajući se na) sledeće: karcinom, uključujući i karcinom mokraćne bešike, dojke, debelog creva, bubrega, jetre, pluća, jajnika, pankreasa, želuca, vrata, štitaste žlezde i kože; uključujući karcinom skvamoznih ćelija; hematopoetski tumori limfoidnog porekla, uključujući leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, B-ćelijski limfom, T-ćelijski limfom, Burkit-ov limfom; hematopoetski tumori mijelodnog porekla, uključujući akutne i hronične mijelogene leukemije i promijelocitnu leukemiju; tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomiosarkom; drugi tumori, uključujući melanom, seminoma, tetratokarcinom, neuroblastom i gliom; tumori centralnog i perifernog nervnog sistema, uključujući astrocitom, neuroblastom, gliom i švanone; tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosafkom, rabdomioskarama i osteosarkom; i drugi tumori, uključujući melanom, ksenoderma pegmentosum, keratoaktantom, seminoma, kancer tiroidnih folikula i teratokarcinom. Smatra se, takođe, da se kanceri uzrokovani aberacijama apoptoze tretiraju i metodama i sastavima obelodanjivanja. Takvi kanceri mogu uključivati, ali se i ne ograničavaju na, folikularne limfome, karcinome sa p53 mutacijama, hormonski zavisne tumore dojke, prostate i jajnika, kao i prekomerne lezije kao što su famozna adenomatozna polipoza i mijelodisplastični sindromi. U određenim slučajevima, malignitet ili disproliferativne promene (kao što su metaplazija i displazija) ili hiperproliferativni poremećaji tretiraju se ili sprečavaju metodama i sastavima obelodanjivanja u jajniku, bešiku, grudima, debelom crevu, pluća, kožu, pankreasu ili materici . U drugim specifičnim slučajevima, sarkom, melanom ili leukemija se tretiraju ili sprečavaju metodama i sastavima obelodanjivanja.

[0123] Ćelije kancera stiču karakterističan skup funkcionalnih sposobnosti tokom njihovog razvoja, iako kroz različite mehanizme. Takve sposobnosti uključuju izbegavanje apoptoze, samodovoljnost u signalima rasta, neosetljivost na signale protiv rasta, invaziju tkiva/metastaze, neograničeni eksplikativni potencijal i trajnu angiogenezu. Termin „ćelija kancera” treba da obuhvati i pre-maligne i maligne ćelije kancera. U nekim slučajevima, kancer odnosi se na benigni tumor, koji je ostao lokalizovan. U drugim slučajevima, kancer odnosi se na maligni tumor koji je upadao i uništio susedne strukture tela i proširio se na daleke lokacije. U drugim slučajevima, kancer je povezan sa specifičnim antigenom kancera (npr. antigen pan-karcinoma (KS 1/4), antigen karcinomom jajnika (CA125), antigen specifični za prostate (PSA), karcinoembrionski antigen (CEA), CD 19 , CD20, HER2/neu itd.).

[0124] Antitela i fragmenti antitela predmetnog obelodanjivanja su posebno korisni za lečenje kancera koji su povezani sa ćelijama (npr. iscrpljene T ćelije, B ćelije, monociti, itd.) koje eksprimiraju abnormalno visoke nivoe PD-1 (Youngblood, B. (2011) „Chronic Virus Infection Enforces Demethylation Of The Locus That Encodes PD-1 In Antigen-Specific CD8(+) T Cells,” Immunity 35(3): 400-412; Spahn, J. i dr. (2011) „Ineffective CD8(+) T-Cell Immunity To Adeno-Associated Virus Can Result In Prolonged Liver Injury And Fibrogenesis,” Amer. J. Pathol.179(5): 2370-2381; Wang, C. i dr. (2011) „Phenotype, Effector Function, And Tissue Localization Of PD-1-Expressing Human Follicular Helper T Cell Subsets,” BMC Immunol. 12: 53, 1-15; Eichbaum, Q. (2011) „PD-1 Signaling In HIV And Chronic Viral Infection Potential For Therapeutic Intervention?” Curr. Med. Chem. 18(26): 3971-3980; Hallett, W.H. i dr. (2011) „Immunosuppressive Effects Of Multiple Myeloma Are Overcome By PD-L1 Blockade,” Biol Blood Marrow Transplant.17(8): 1133-1145; Ni, L. i dr. (2010) „PD-1 Modulates Regulatory T Cells And Suppresses T-Cell Responses In HCV-Associated Lymphoma,” Immunol. Cell. Biol.89(4): 535-539; Inozume, T. i dr. (2010) „Selection Of CD8+PD-1+ Lymphocytes In Fresh Human Melanomas Enriches For Tumor-Reactive T Cells,” J. Immunother. 33(9): 956-964; and Jin, H.T. i dr. (2010) „Cooperation Of Tim-3 And PD-1 In CD8 T-Cell Exhaustion During Chronic Viral Infection,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 107(33): 14733-14738).

[0125] Slično njihovoj primeni na tumore kao što je prethodno razmotreno, antitela i fragmenti vezani za antigen predmetnog obelodanjivanja mogu se koristiti sami, ili kao adjuvans, u kombinaciji sa vakcinama ili antimibrobijalnim agensima, kako bi se stimulisao imuni odgovor na toksine ili samo antigene ili protiv patogena (npr. virusa, kao što su HIV, HTLV, virus hepatitisa, virus gripa, respiratorni sincicijalni virus, virus vakcine, virus besnila, bakterije, kao što su one Mycobacteria, Staphylococci, Streptococci, Pneumonococci, Meningococci, Conococci, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Corynebacteria, Salmonella, Vibrio, Clostridia, Bacilli, Pasteurella, Leptospirosis, Bordatella, i naročito takvi patogeni povezani sa kolerom, tetanusom, botulizmom, antraksom, kugom i Lajmskom bolesti; ili gljivične ili parazitske patogene, kao što su Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, itd.), Cryptococcus, Aspergillus (jumigatus, niger, itd.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix (schenkii), Blastomyces (dermatitidis), Paracoccidioides (brasiliensis), Coccidioides (immitis) i Histoplasma (capsulatum), Entamoeba, histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondi, etc.)., Sporothrix, Blastomyces, Paracoccidioides, Coccidioides, Histoplasma, Entamoeba, Histolytica, Balantidium, Naegleria, Acanthamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Pneumocystis, Plasmodium, Babesia, ili Trypanosoma, itd. Prema tome, antitela i antigen vezujući fragment predmetnog obelodanjivanja imaju korisnost u lečenju zarazne bolesti.

2. Upotreba smanjujućih modulatora imunog sistema

[0126] U alternativnom slučaju, anti-B7-H1 ili anti-PD-1 antitela predmetnog obelodanjivanja se koriste za proizvodnju anti-idiotipskih peptida ili antitela (Wallmann, J. i dr. (2010) „Anti-Ids in Allergy: Timeliness of a Classic Concept,” World Allergy Organiz. J.

3(6): 195-201; Nardi, M. i dr. (2000) „Antiidiotype Antibody Against Platelet Anti-Gpiiia Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP Patients,” J. Exp. Med.

191(12): 2093-2100) ili mimetika (Zang, Y.C. i dr. (2003) „Human Anti-Idiotypic T Cells Induced By TCR Peptides Corresponding To A Common CDR3 Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells,” Int. Immunol. 15(9): 1073-1080; Loiarro, M. i dr. (Epub 2010 Apr 8) „Targeting TLR/IL-1R Signalling In Human Diseases,” Mediators Inflamm. 2010: 674363) of B7-H1 ili PD-1. Takvi molekuli služe kao surogati za B7-H1 ili PD-1, i stoga njihova administracija subjektu smanjuju modulaciju imunološki sistem takvog subjekta imitiranjem ili olakšavanjem vezivanja B7-H1-PD-1. Takvi molekuli imaju korisnost u lečenju bolesti grafta i domaćina. Slično tome, agonistička antitela koja i) povećavaju vezivanje između takvih antitela i takvog receptora/liganda ili ii) pokreću transdukciju signala kada se direktno vezuju za B7-H1 ili PD-1, imaju korisnost kao agonisti signala B7-H1-PD-1 i na taj način imaju korisnost u lečenju upale i autoimune bolesti, direktnim ili indirektnim agonizacijom aktivnosti receptora.

[0127] Bi-specifična antitela, koja pokazuju imunospecifično vezivanje za oba PD-1 i B7-H1 mogu se vezati i za APC i T-ćelije, te na taj način olakšavaju kolokalizaciju APCs i T-ćelija. Takva kolokalizacija olakšava sposobnost takvih ćelija da se zajedno vezuju pomoću molekula B7-H1 i PD-1 koji nisu kompleksirani antitelom, ili koinhibitornim molekulima. Ovakvo vezivanje omogućava smanjenje modulacije imunog sistema primaoca.

[0128] Dole-modulacija imunog sistema je poželjna u lečenju inflamatornih i autoimunih bolesti i bolesti grafta protiv domaćina (GvHD). Primeri autoimunih poremećaja koji se mogu lečiti primenom antitela ovog prikazivanja uključuju, ali se i ne ograničavaju na, alopecia areata, ankilozni spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunu Addisonovu bolest, autoimune bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunski hepatitis , autoimunski oofritis i orhitis, autoimunska trombocitopenija, Behcetova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, celiak spru-dermatitis, sindrom hronične zamorne imunske disfunkcije (CFIDS), hronična inflamatorna demijelinizirajuća polinevropatija, Churg-Straussov sindrom, cicatricni pemfigoid, CREST sindrom, bolest hladnog aglutinina, Crohnova bolest, diskoidni lupus, esencijalna miješana krioglobulinemija, fibromialgijafibromiozitis, glomerulonefritis, Gravesova bolest, Guillain-Barre, Hashimotov tiroiditis, idiopatska plućna fibroza, idiopatska trombocitopenija purpura ITP), IgA neuropatija, maloljetni artritis, lihen planus, lupus erthematosus, Menierova bolest, mešovita bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza, Neuromielitis optica (NMO), tip 1 ili imunološki posredovani dijabetes melitus, miastenija gravis, pemphigus vulgaris, perniciozna anemija, poliarteritis nodosa, polihrondritis, poliglundularni sindromi, polimialgia reumatica, polimiozitis i dermatomiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza, psorijaza, psoriatični artritis, Rainauldov fenomen, Reiterov sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidoza, skleroderma, Sjogrenov sindrom, sindrom stiffmanovog sistema, eritematozu, lupus eritematozu, takaiasu arteritis, temporalni arteristis/arteritis gigantskih ćelija, transverzalni mielitis, ulcerativni kolitis, uveitis, vaskulitidi kao što je vaskulitis herpetiformis dermatitis, vitiligo i Vegenerova granulomatoza.

[0129] Primeri inflamatornih poremećaja koji se mogu sprečiti, tretirati ili upravljati u skladu sa metodama obelodanjivanja uključuju, ali nisu ograničeni na, astmu, encefilitis,

1

inflamatornu bolest creva, hroničnu opstruktivnu plućnu bolest (COPD), alergijske poremećaje, septični šok, plućne fibroze, nediferencirane spondiloartropatije, nediferencirane artropatije, artritis, inflamatorne osteolize i hronične inflamacije nastale usled hroničnih virusnih ili bakterijskih infekcija.

[0130] Prema tome, antitela i antigen vezujući fragmenti predmetnog obelodanjivanja imaju korisnost u lečenju inflamatornih i autoimunih bolesti.

C. Metode davanja

[0131] Različiti sistemi davanja su poznati i mogu se koristiti za davanje terapeutskih ili profilaktičkih preparata predmetnog obelodanjivanja, npr., enkapsulacije u lipozomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantnim ćelijama sposobnim za ekspresiju antitela ili fuzionog proteina, endocitozom posredovanog receptorom (videti npr., Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem.262: 4429-4432), konstrukcija nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd.

[0132] Metode davanja humanizovanog antitela obelodanjivanja uključuju, ali se ne ograničavaju na, injekciju, kao što je parenteralnom primenom (npr., intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno i subkutano), epiduralom i mukozom (npr., intranazalnim i oralnim putem). U određenom slučaju, antitela obelodanjivanja se daju intramuskularno, intravenski ili subkutano. Sastavi mogu biti primenjene bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolusom, pomoću apsorpcije preko epitelnih ili sluzokožnih obloga (npr. oralna mukoza, rektalna i creva, i itd.) i mogu se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno. Pored toga, pulmonalna primena se takođe može koristiti, npr., pomoću inhalatora ili nebulizatora i formulacije sa sredstvom za aerosolizaciju. Videti, npr., patentno obelodanjivanje SAD br.6,019,968; 5,985, 20; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,54u; i 4,880,078; i objava PST br. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; i WO 99/66903. U konkretnom slučaju može biti poželjno da se farmaceutski sastavi obelodanjenja daju lokalno u područje u kojem je potrebno tretiranje; ovo se može postići, na primer, a ne ograničenjem, lokalna infuzija, injekcijom ili pomoću implantata, pomenuti implantat je poroznog, neporoznog ili želatinskog materijala, uključujući membrane, kao što su sialastični membrane ili vlakna. Poželjno, kada se daje antitelo

2

obelodanjivanja, mora se voditi računa da se koriste materijali za koje antitelo ili fuzioni protein ne apsorbuju.

[0133] U nekim slučajevima, humanizovana ili himerna antitela obelodanjivanja su formulisana u lipozomima za ciljanu isporuku antitela obelodanjivanja. Lipozomi su mehurići sastavljeni od koncentrično naručenih dvoslojnih fopsholipidnih oblika koji sadrže vodenu fazu. Lipozomi obično sadrže različite vrste lipida, fosfolipida i/ili površinskih aktivnih materija. Komponente lipozoma su raspoređene u dvoslojnoj konfiguraciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana. Lipozomi su posebno poželjni nosači za isporuku, delimično zbog njihove biokompatibilnosti, niske imunogenosti i niske toksičnosti. Metode za pripremu lipozoma su poznati u stanju tehnike i obuhvaćeni su u okviru obelodanjivanja, videti, na primer, Epstein i dr., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688; Hwang i dr., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4; U.S. Patent Nos.4,485,045 and 4,544,545.

[0134] Obelodanjivanje obuhvata i postupke za proizvodnju lipozoma sa produženim poluživotom u serumu, tj. pojačano vreme cirkulacije, kao što su oni obelodanjeni u patentu SAD br. 5,013,556. Poželjni lipozomi koji se koriste u metodama obelodanjivanja nisu brzo obrađeni iz cirkulacije, tj. nisu uzeti u mononuklearni fagocitni sistem (MPS).

Obelodanjivanje obuhvata sterički stabilizovane lipozome koji su pripremljeni korišćenjem zajedničkih metoda poznatih stručnjaku. Iako ne nameravaju da budu vezani određenim mehanizmom delovanja, sterički stabilizovani lipozomi sadrže lipidne komponente sa velikim i visoko fleksibilnim hidrofilnim delovima, što smanjuje neželjenu reakciju lipozoma sa serumskim proteinima, smanjuje opozonizaciju sa serumskim komponentama i smanjuje prepoznavanje MPS-a. Sterizno stabilizovani lipozomi se poželjno pripremaju koristeći polietilen glikol. Za pripremu lipozoma i sterički stabilizovanog lipozoma, videti, na primer, Bendas i dr., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224; Allen i dr., 1987 FEBS Lett.223: 42-6;

Klibanov i dr., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7; Blum i dr., 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7; Torchilin i dr., 1996, J. Liposome Res.6: 99-116; Litzinger i dr., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107; Maruyama i dr., 1991, Chem. Pharm. Bull., 39: 1620-2;

Klibanov i dr., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allen i dr., 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309. Obelodanjivanje obuhvata i lipozome koji su prilagođeni za specifično ciljanje organa, videti, na primer, patent SAD br.4,544,545, ili specifično ciljanje na ćelije, vidite, na primer,objava patentne prijave SAD br.2005/0074403. Posebno korisni lipozomi za upotrebu u sastavima i metodama obelodanjivana mogu se generisati postupkom isparavanja sa reverznom fazom sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. U nekim slučajevima, fragment antitela obelodanjivanja, npr. F(ab'), može biti konjugovan na liposome koristeći prethodno opisane metode, videti, npr., Martin i dr., 1982, J. Biol. Chem.

257: 286-288.

[0135] Humanizovana ili himerna antitela obelodanjivanja mogu se takođe formulisati kao imunolipozomi. Imunolipozomi se odnose na liposomalni sastav, pri čemu je antitelo obelodanjivanja ili njegov fragment povezano, kovalentno ili nekovalentno na površini lipozoma. Hemija povezivanja antitela sa liposomskom površinom je poznata u stanju tehnike i obuhvaćena unutar obelodanjivanja, videti, npr., patentu SAD br.6,787,153; Allen i dr., 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44; Hansen i dr., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 133-144. U većini slučajeva, imunolipozomi za upotrebu u metodama i sastavima obelodanjivanja dalje su sterički stabilizovani. Poželjno, humanizovana antitela obelodanjivanja su povezana kovalentno ili nekovalentno sa hidrofobnim sidrom, koji je stabilno ukorenjen u lipidni dvosloj lipozoma. Primeri hidrofobnih sidra uključuju, ali se ne ograničavaju na, fosfolipide, npr., fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilinositol (PI). Da bi se postigla kovalentna veza između antitela i hidrofobnog sidra, može se koristiti bilo koja poznata biohemijska strategija u struci, videti, na primer, J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p.399-435. Na primer, funkcionalna grupa na molekulu antitela može reagovati sa aktivnom grupom na hidrofobnom sidru povezane sa lipozomom, npr., Amino grupa lizinskog bočnog lanca na antitelu može biti spojena sa N-glutaril-fosfatidil-etanolaminom povezanim sa lipozomom aktiviranim sa karbodiimidom rastvorljivim u vodi; ili tiolna grupa redukovanih antitela može se spojiti sa lipozomima putem reaktivnih tiola, kao što je piridiltiopropionilfosfatidiletanolamin. Videti, npr., Dietrich i dr., 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105; Loughrey i dr., 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901: 157-160; Martin i dr., 1982, J. Biol. Chem.257: 286-288; Martin i dr., 1981, Biochemistry, 20: 4429-38. Iako ne nameravaju da budu vezani određenim mehanizmom delovanja, imunolipozomske formulacije koje sadrže antitelo obelodanjivanja su posebno efikasne kao terapeutski agensi, pošto isporučuju antitelo citoplazmi ciljne ćelije, tj. ćeliji koja sadrži receptor za koji antitelo se veže. Imunolipozomi poželjno imaju povećan polu-život u krvi, posebno ciljane ćelije, i

4

mogu se internalizovati u citoplazmi ciljnih ćelija, čime se izbegava gubitak terapeutskog sredstva ili degradacija endolizozomskim putem.

[0136] Imunolipozomni sastavi obelodanjivanja sadrže jedan ili više lipida formirajućih vezikula, antitelo obelodanjivanja ili njegov fragment ili njegov derivat i, opciono, hidrofilni polimer. Lipid koji formira mehurić je poželjno lipid sa dva ugljovodonična lanca, kao što su lanci acila i grupa polarne glave. Primeri lipida koji oblikuju mehuriće uključuju fosfolipide, npr. fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidnu kiselinu, fosfatidilinositol, sfingomijelin i glikolipide, npr., cerebroside, ganglioside. Dodatni lipidi koji su korisni u formulacijama obelodanjivanja su poznati stručnjaku i obuhvaćeni u okviru obelodanjivanja. U nekim slučajevima, imunolipozomski preparati dalje sadrže hidrofilni polimer, npr. Polietilen glikol i gangliozid GM1, što povećava polu-životni period lipoma u serumu. Metode konjugujućih hidrofilnih polimera prema liposomima su dobro poznate u struci i obuhvaćene u okviru obelodanjivanja. Za pregled imunolipozoma i postupaka za njihovu pripremu, vidite, na primer, objava patentne prijave SAD br.2003/0044407; međunarodna objava PCT br. WO 97/38731, Vingerhoeads i dr., 1994, Immunomethods, 4: 259-72; Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7): 791-799; Abra i dr., 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2): 1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2): 267-281; Bendas i dr., 2001 BioDrugs, 14(4): 215-224, J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p.399-435.

[0137] Obelodanjivanje takođe predviđa da su humanizovana ili himerna antitela obelodanjivanja upakovana u hermetički zatvorenoj posudi, kao što je ampula ili kesica, što ukazuje na količinu antitela. U jednom slučaju, antitela iz obelodanjivanja se isporučuju kao suvi sterilizovani liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru i mogu se rekonstruisati, npr., sa vodom ili fiziološkim rastvorom do odgovarajuće koncentracije za davanje subjektu. Poželjno, antitela iz obelodanjivanja se isporučuju kao suvi sterilni liofilizovani prah u hermetički zatvorenom kontejneru u jediničnoj dozi od najmanje 5 mg, poželjnije najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg ili najmanje 75 mg. Liofilizovana antitela iz obelodanjivanja treba da se čuvaju između 2 i 8 °C u originalnom kontejneru i antitela treba davati u roku od 12 časova, poželjno u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku od 3 sata ili u roku od 1 sata nakon rekonstitucije. U alternativnom slučaju antitela obelodanjivanja se isporučuju u tečnom obliku u hermetički zatvorenom posudu koja ukazuje na količinu i koncentraciju antitela, fuzionog proteina ili konjugovanog molekula. Poželjno, tečni oblik antitela se isporučuje u hermetički zatvorenom kontejneru najmanje 1 mg/ml, poželjnije najmanje 2,5 mg/ml, najmanje 5 mg/ml, najmanje 8 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 100 mg/ml, najmanje 150 mg/ml, najmanje 200 mg/ml antitela.

[0138] Precizna doza koja će biti upotrebljena u formulaciji takođe će zavisiti od načina primene i težine stanja, i treba da bude odlučena prema proceni praktičara i okolnosti svakog pacijenta. Efektivne doze mogu biti ekstrapolirane iz krivih doza-odgovora dobijenih iz sistema za testiranje in vitro ili životinjskog modela. Za antitela obuhvaćena obelodanjivanjem, doza davana pacijentu je tipično 0.01 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine pacijenta. Poželjno, doziranje dati pacijentu između 0.01 mg/kg i 20 mg/kg, 0.01 mg/kg i 10 mg/kg, 0.01 mg/kg i 5 mg/kg, 0.01 i 2 mg/kg, 0.01 i 1 mg/kg, 0.01 mg/kg i 0.75 mg/kg, 0.01 mg/kg i 0,5 mg/kg, 0.01 mg/kg do 0.25 mg/kg, 0.01 do 0.15 mg/kg, 0.01 do 0.10 mg/0.05 mg/kg ili 0.01 do 0.025 mg/kg telesne težine pacijenta. Konkretno, otkriveno je da je doza dati pacijentu 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg ili 10 mg/kg. Doza koja je niža od 0.01 mg/kg je predviđena da bi pokazala znatne farmakodinamične efekte.

Predviđeno je da su nivoi doze od 0.10-1 mg/kg najprikladniji. Takođe se očekuje veća doza (npr., 1-30 mg/kg). Uglavnom, ljudska antitela imaju duži poluživot u ljudskom telu od antitela drugih vrsta zbog imunog odgovora na strane polipeptide. Prema tome, često su moguća manja doza humanih antitela i manje česta administracija. Nadalje, doziranje i učestalost primene antitela obelodanjivanja ili njihovih fragmenata mogu se smanjiti poboljšanjem uzimanja i penetracije tkiva antitela modifikacijama poput, na primer, lipidacije.

[0139] U još jednom primeru, sastavi se mogu isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem ili sistemom sa produženim oslobađanjem. Bilo koja tehnika poznata stručnjacima u stanju tehnike može se koristiti za proizvodnju formulacija sa trajnim oslobađanjem koja sadrži jedno ili više antitela iz obelodanjivanja. Vidite, na primer, patent SAD br.4,526,938; PTC objava WO 91/05548; PTC objava WO 96/20698; Ning i dr., 1996, „Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song i dr., 1995, „Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek i dr., 1997, „Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854; and Lam i dr., 1997, „Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24: 759-760. U jednom slučaju, pumpa se može koristiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem (Videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14: 20; Buchwald i dr., 1980, Surgery 88: 507; and Saudek i dr., 1989, N. Engl. J. Med.321: 574). U drugoj instanci, polimerni materijali mogu biti korišćeni kako bi se postiglo kontrolisano puštanje antitela (videti npr., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; See also Levy i dr., 1985, Science 228: 190; During i dr., 1989, Ann. Neurol.25: 351; Howard i dr., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); patent SAD br.5,679,377; patent SAD br.5,916,597; patent SAD br.

5,912,015; patent SAD br.5,989,463; patent SAD br.5,128,326; objava PCT br. WO 99/15154; i objava PCT br. WO 99/20253). Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa zadržanim oslobađanjem obuhvataju, ali bez ograničenja, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilna kiselina), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakril kiselina), poliglikolidi(PLG), polianhidridi, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilenglikol), polilaktidi(PLA), poli(laktid-ko-glikolidi) poliortoester. U još jednom slučaju, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem se može postaviti u blizinu terapeutskog cilja (npr. pluća), tako da se zahteva samo mali deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138 (1984)). U drugom slučaju, polimerni sastavi korisni kao implantati sa kontrolisanim oslobađanjem koriste se u skladu sa Dunn i dr. (Videti U.S.5,945,155). Ova posebna metoda zasniva se na terapeutskom efektu in situ kontrolisanog oslobađanja bioaktivnog materijala iz polimernog sistema. Uglavnom se implantacija može desiti bilo gde u telu pacijenta sa potrebom terapijskog lečenja. U drugom slučaju, koristi se nepolimerni sistem sa trajnim isporukama, pri čemu se nepolimerni implant u telu subjekta koristi kao sistem za isporuku lekova. Nakon implantacije u telu, organski rastvarač implantata će disipirati, dispergovati ili izlečiti iz sastava u okolnu tkivnu tečnost, a nepolimerni materijal će postepeno koagulirati ili precipitirati kako bi se formirala čvrsta, mikroporozna matrica (videti US 5,888,533). Sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem govore u pregledu Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku u stanju tehnike može se koristiti za proizvodnju formulacija sa trajnim oslobađanjem koja sadrži jedan ili više terapeutskih agenasa obelodanjivanja. Vidite, na primer, patent SAD br.4,526,938; međunarodna objava br. WO 91/05548 i WO 96/20698; Ning i dr., 1996, Radiotherapy & Oncology 39: 179-189; Song i dr., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek i dr., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24: 853-854; i Lam i dr., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24: 759-760.

[0140] U konkretnom slučaju kada je terapeutski ili profilaktički sastav obelodanjivanja nukleinska kiselina koja kodira antitelo obelodanjivanja ili njegov antigen vezujući fragment, nukleinska kiselina može se davati in vivo radi promovisanja ekspresije njegovog kodiranog antitela, konstrukcijom kao deo odgovarajućeg ekspresionog vektora nukleinske kiseline i administrira je tako da postaje intracelularna, npr. pomoću retrovirusnog vektora (videti US patent br.4,980,286), ili direktnim ubrizgavanjem ili korišćenjem bombardovanja mikropartikla (npr., genski pištolj, Biolistic, Dupont) ili prevlake sa lipidima ili receptorima ćelijske površine ili sredstvima za transfekciju ili njihovim davanjem u vezu sa peptidom poput homeoboka koji je (videti npr., Joliot i dr., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), itd. Alternativno, nukleinska kiselina može biti uvedena intracelularno i inkorporirana unutar DNK ćelije domaćina za ekspresiju homolognom rekombinacijom.

[0141] Lečenje subjekta sa terapeutski ili profilaktički efikasnom količinom antitela obelodanjivanja može obuhvatiti jedinstveni tretman ili, poželjno, može obuhvatiti niz tretmana.

D. Farmaceutski sastavi

[0142] Sastavi obelodanjivanja obuhvataju sastave velikih lekova korisne za proizvodnju farmaceutskih sastava (tj. preparati pogodni za primenu na subjektu ili pacijentu) koji se mogu koristiti za pripremu jediničnih doznih oblika. Takvi preparati sadrže profilaktički ili terapeutski efektivnu količinu profilaktičkog i/ili terapeutskog sredstva opisanog ovde ili kombinacije ovih sredstava i farmaceutski prihvatljivog nosača. Poželjno, sastavi obelodanjivanja sadrže profilaktički ili terapeutski efektivnu količinu humanizovanih antitela obelodanjivanja i farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0143] U konkretnom slučaju termin „farmaceutski prihvatljiv” podrazumeva odobren od regulatorne agencije Savezne vlade ili državne vlade ili se nalazi u SAD farmakopeji ili drugoj opštepoznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a naročito kod ljudi. Termin „nosač” odnosi se na razređivač, adjuvans (npr. Freund-ov adjuvans (potpun i nepotpun), ekscipijens, surfaktant, krioprotektant ili sredstvo sa kojim se primenjuje terapeutik. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti kao što su voda i ulja, uključujući i naftu, životinjsko, biljno ili sintetičko poreklo, kao što je ulje od kikirikija, soje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je poželjna nosilac kada se farmaceutska kompozicija daje intravenozno. Salinski rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, naročito za injektibilna rastvora. Pogodni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kreč, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijumhlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, polisorbat-80 i slično. Sastav, po želji, može sadržati i manje količine sredstava za vlaženje ili emulziju ili sredstva za puferovanje pH. Ovi sastojci mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzije, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa trajnim oslobađanjem i slično.

[0144] Generalno, sastojci sastava obelodanjivanja se isporučuju ili pojedinačno ili pomešani zajedno u jediničnoj doznoj formi, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili kesica, što ukazuje na količinu aktivnog sredstva. Kada se sastava primenjuje infuzijom, može se izdati infuziona bočica koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološku rastvor farmaceutske vode. Kada se sastav daje injekcijom, može se obezbediti ampule sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, tako da se sastojci mogu mešati pre davanja.

[0145] Sastavi obelodanjivanja mogu se formulisati kao neutralne ili solne forme.

Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali se ne ograničavaju na one, formirane sa anjonima kao što su one izvedene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline itd., i one koje se formiraju sa katjonima kao što su one koje su dobijene natrijumom, kalijumom, amonijumom, kalcijum, hidroksidi gvožđa, izopropilamin, trietilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain itd.

E. Kompleti

[0146] Obelodanjivanje daje farmaceutski paket ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera ispunjenih humanizovanim antitelima obelodanjivanja. Dodatno, jedno ili više drugih profilaktičkih ili terapeutskih sredstava korisnih za lečenje bolesti mogu takođe biti uključene u farmaceutski paket ili komplet. Obelodanjivanje takođe obezbeđuje farmaceutski paket ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera ispunjenih jednim ili više sastojaka farmaceutskih sastava obelodanjivanja. Opciono povezano sa takvim kontejnerima može biti obaveštenje u obliku propisanom od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih proizvoda ili bioloških proizvoda, a to obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku primenu.

[0147] Predmetno obelodanjivanje nudi komplete koje se mogu koristiti u gore navedenim metodama. U jednom slučaju, komplet sadrži jedno ili više humanizovanih antitela iz obelodanjivanja. U drugom slučaju, komplet dalje sadrži jedan ili više drugih profilaktičkih ili terapeutskih sredstava korisnih za lečenje kancera u jednom ili više kontejnera. U drugom slučaju, komplet dalje sadrži jedno ili više citotoksičnih antitela koja se vezuju za jedan ili više antigena kancera koji su povezani sa rakom. U određenim slučajevima, drugi profilaktički ili terapeutski agens je hemoterapeutski. U drugim slučajevima, profilaktički ili terapeutski agens je biološki ili hormonski terapeutski.

F. Metode dijagnostike

[0148] Antitela obelodanjivanja i njihovi antigen vezujući fragmenti mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe, kao što su otkrivanje, dijagnostikovanje ili nadgledanje bolesti, poremećaja ili infekcija povezanih sa ekspresijom B7-H1 ili PD-1. Obelodanjivanje omogućava otkrivanje ili dijagnozu bolesti, poremećaja ili infekcije, naročito autoimune bolesti koja obuhvata: (a) testiranje ekspresije B7-H1 ili PD-1 u ćelijama ili u uzorku tkiva subjekta koji koristi jedan ili više antitela (ili njihovi fragmenti) koji se imunospecifično vezuju za takve antigene; i (b) upoređivanje nivoa antigena sa kontrolnim nivoom, npr. nivoom u normalnom uzorku tkiva ili pre tretmana, pri čemu je povećanje ili smanjenje testiranog nivoa antigena u poređenju sa kontrolnim nivoom antigena indikativan bolesti, poremećaja ili infekcije, ili odgovor subjekta na lečenje. Stoga otkrivanje takođe omogućava praćenje progresije bolesti, poremećaja ili infekcije, koje obuhvata: (a) testiranje ekspresije B7-H1 ili PD-1 u ćelijama ili u uzorku tkiva subjekta u jednom trenutku koristeći jedno ili više antitela (ili njihove fragmente) koje se imunospecifično vezuju za takve antigene; i (b) upoređivanje nivoa ekspresije B7-H1 ili PD-1 u ćelijama ili u uzorku tkiva subjekta u nekom drugom trenutku ili tokom vremena, pri čemu povećanje ili smanjenje testiranog nivoa antigen pokazuje progresiju bolesti, poremećaja ili infekcije.

Obelodanjivanje dodatno obezbeđuje nadgledanje odgovora na tretman, koji obuhvata: (a) ispitivanje ekspresije B7-H1 ili PD-1 u ćelijama ili u uzorku tkiva subjekta pre lečenja sa jednim ili više antitela (ili njihovih fragmenata ) koji se imunospecifično vezuju za takve antigene; i (b) ispitivanje ekspresije B7-H1 ili PD-1 u ćelijama ili u uzorku tkiva subjekta pre jednog ili više vremenskih tačaka posle terapije, i upoređivanje nivoa antigena tokom vremena, pri čemu povećanje ili smanjenje testiranog nivoa antigena u poređenju sa nivoom predtretanja antigena pokazuje odgovor na tretman. Takva antitela i fragmenti su poželjno korišćeni u imunološkim ispitivanjima, kao što je antitelo povezan imunosorbentni test (ELISA), radioimuno test (RIA) i sortiranje ćelija aktivirane fluorescencijom (FACS).

[0149] Jedan aspekt obelodanjivanja odnosi se na upotrebu takvih antitela i fragmenata, a naročito takvih antitela i fragmenata koji se vezuju za čoveka B7-H1, kao reagensi za IHC analizu u ćelijama in vitro ili in situ uzorka tkiva ili in vivo. Na primer, s obzirom da je B7-H1 izražen ćelijama karcinoma, ali ne i normalnim tkivom (Dong, H. (2003) „B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,” J. Mol. Med.81: 281-287), obelodanjivanje njegovog prisustva na ćeliji vezivanjem takvih ćelija na takva antitela ili fragmente je indikativna i dijagnostička stanica kancera. Prema tome, predmetno obelodanjivanje daje citološki test za dijagnostikovanje prisustva kancera kod subjekta.

[0150] Utvrđeno je da prisustvo B7-H1 na tumorskim ćelijama povećava apoptozu T ćelija koje reaguju na tumor (patent SAD br.7,794,710). Tako, utvrđivanjem stepena ili stepena do kog tumorske ćelije kod pacijenta pokazuju B7-H1 na svojim površinama, predmetno obelodanjivanje daje sredstvo za određivanje kliničkog značaja kancera i stepen do kog će biti otporan na imunološki odgovor.

[0151] Slično tome, B7-H1 se eksprimira na limfoidnim i mukoznim dendritskim ćelijama (i mijeloidnim i plazmacitidnim dendritičkim ćelijama), a njegov termin značajno povećava nakon SIV infekcije (Xu, Huanbin i dr. (2010) „Increased B7-H1 Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death 1 Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression,” J. Immunol. 185: 7340-7348). Tako se ekspresija B7-H1 na takvim ćelijama može koristiti za dijagnozu HIV-a kod ljudi. Pored toga, utvrđeno je da se ekspresija PD-1 na CD8 ćelijama povećava u kontekstu HIV infekcije (Killian, M.S. i dr. (2011) „Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells,” J. Virol.85(4): 1696-1705). Tako se antitela koja se vezuju za oba PD-1 i CD8 imaju posebnu korisnost u dijagnozi HIV infekcije i progresije AIDS-a.

1

[0152] Dalji aspekt obelodanjivanja odnosi se na upotrebu takvih antitela i fragmenata, a naročito takvih antitela i fragmenata koji se vezuju za humani PD-1. PD-1 ima posebnu korist kao oznaku hronične imunske aktivacije i iscrpljivanja T ćelija. Njegova ekspresija se povećava na T ćelijama viremičnog HIV-inficiranog pacijenta i korelira sa virusnim opterećenjem kod ovih pacijenata (Khaitan, A. i dr. (2011) „Revisiting Immune Exhaustion During HIV Inflection,” Curr. HIV/AIDS Rep.8: 4-11; Grabmeier-Pfistershammer, K. i dr. (2011) „Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment,” J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2): 118-124). Prema tome, PD-1 ima posebnu korist kao oznaka progresije HIV-a. Najpoželjnija ekspresija PD-1 biće procenjena korišćenjem protočne citometrije. Kroz upotrebu takvih antitela i fragmenata, T ćelije (koje eksprimiraju PD-1) mogu se analizirati za više parametara (npr. broj ćelija, veličina ćelije, fenotip i zdravlje ćelija, itd.) Iako su prisutni u heterogenim preparatima. Tako, u dogovoru sa antitelima na PD-1 i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, takve metode mogu se koristiti za dijagnostikovanje obima ili težine AIDS-a, leukemija i druge bolesti koja utiče na broj ćelija T i ćelija. Metode protočne citometrije koja se može prilagoditi svrsi ovog obelodanjivanja su otkrivena u Peters, J.M. i dr. (2011) „Multiparameter Flow Cytometry In The Diagnosis And Management Of Acute Leukemia,” Arch. Pathol. Lab. Med. 135(1): 44-54; Meyerson, H.J. (2010) „A Practical Approach To The Flow Cytometric Detection And Diagnosis Of T-Cell Lymphoproliferative Disorders,” Lab. Hematol. 16(3): 32-52; Vandewoestyne, M. i dr. (Epub 2010 Aug 3) Laser Capture Microdissection In Forensic Research: A Review,” Int. J. Legal. Med.124(6): 513-521;

Ornatsky, O. i dr. (Epub 2010 Jul 21) „Highly Multiparametric Analysis By Mass Cytometry,” J. Immunol. Meth.361(1-2): 1-20; Mach, W.J. i dr. (Epub 2010 Jul 13) „Flow Cytometry And Laser Scanning Cytometry, A Comparison Of Techniques,” J. Clin. Monit. Comput. 24(4): 251-259; and Chattopadhyay, P.K. i dr. (2010) „Good Cell, Bad Cell: Flow Cytometry Reveals T-Cell Subsets Important In HIV Disease,” Cytometry A.77(7): 614-622; i u patentima SAD br.7,876,436; 7,847,923; 7,842,244; 7,746,466; 7,590,500; 7,527,978; 7,507,548; 7,491,502; 7,486,387; 7,479,630; 7,465,543; 7,354,773; 6,794,152 i 6,784,981

[0153] Tako, antitela i fragmenti predmetnog obelodanjivanja imaju korisnost u otkrivanju i dijagnozi bolesti, poremećaja ili infekcije kod čoveka. U jednom slučaju, takva dijagnoza obuhvata: a) davanje subjektu (na primer, parenteralno, subkutano ili intraperitonealno) efikasnu količinu označenog antitela ili fragmenta vezivanja antigena koji se imunospecifično vezuje za B7-H1 ili PD-1; b) čekajući vremenski interval nakon davanja da bi se označeni

2

molekul poželjno koncentrisao na mesta u subjektu u kojem je ekspresija B7-H1 ili PD-1 (i za neobavezan molekul koji se obeležava na nivou pozadine); c) određivanje nivoa pozadine; i d) otkrivanje označenog antitela u subjektu, tako da otkrivanje označenog antitela iznad nivoa pozadine ukazuje na to da subjekt ima bolest, poremećaj ili infekciju. U skladu sa ovim primerom, antitelo je označeno slikovitim sistemom koji se može detektovati pomoću sistema za snimanje poznatom stručnjaku iz oblasti. Nivo pozadine može se odrediti različitim metodama uključujući, upoređujući količinu označenog molekula detektovanog na standardnu vrednost prethodno određenu za određeni sistem.

[0154] U struci se razume da veličina subjekta i sistema za snimanje odrediće količinu slikovitog sistema potrebnog za proizvodnju dijagnostičkih slika. In vivo tumorska slika je opisana u S.W. Burchiel i dr., „Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.” (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).

[0155] U zavisnosti od nekoliko varijabli, uključujući vrstu korišćene etikete i način davanja, vremenski interval nakon davanja za dozvolu označenom molekulu poželjno koncentriše na mesta u subjektu i za neobavezan molekul koji se obeležava na nivou pozadine je 6 do 48 sati ili 6 do 24 sata ili 6 do 12 sati. U drugom slučaju vremenski interval nakon davanja je 5 do 20 dana ili 5 do 10 dana.

[0156] U jednom slučaju, nadgledanje bolesti, poremećaja ili infekcije vrši se ponavljanjem metode za dijagnostikovanje bolesti, poremećaja ili infekcije, na primer, mesec dana nakon inicijalne dijagnoze, šest meseci nakon početne dijagnoze, godinu dana nakon inicijalne dijagnoze itd.

[0157] Prisustvo označenog molekula može se detektovati u subjektu korišćenjem postupaka poznatih u struci za in vivo skeniranje. Ovi postupci zavise od vrste upotrebljene etikete. Kvalifikovani stručnjaci će moći da odrede odgovarajući metod za detekciju određene etikete. Metode i uređaji koji se mogu koristiti u dijagnostičkim metodama obelodanjivanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kompjuterizovanu tomografiju (CT), skeniranje celog tela, kao što je emisiona tomografija položaja (PET), magnetna rezonanca (MRI) i sonografija.

[0158] U određenom slučaju, molekul je označen radioizotopom i detektovan je kod pacijenta pomoću hirurškog instrumenta koji odgovara zračenju (Thurston i dr., patent SAD br.

5,441,050). U drugom slučaju, molekul je obeležen fluorescentnim jedinjenjem i otkriven je kod pacijenta koristeći instrument za skeniranje koji odgovara fluorescenciji. U drugom slučaju, molekul je označen sa metalom koji emituje pozitron i otkriven je kod pacijenta koristeći pozitronsku emisionu tomografiju. U još jednom slučaju, molekul je označen paramagnetskom etiketom i detektovan je kod pacijenta koji koristi magnetnu rezonancu (MRI).

[0159] Pošto sada generalno opisuje obelodanjivanje, isto će se lakše razumeti i na osnovu sledećih primera, koji su dati na ilustraciji i nisu namenjeni da ograniče predmetno obelodanjivanje, osim ukoliko nije navedeno.

Primer 1

Izolacija i karakterizacija anti-humanih B7-H1 antitela

[0160] Da bi se izolovala anti-humana B7-H1 antitela sa visokim afinitetom, miševi su prvo imunizirani, a potom se povećavaju sa humanim B7-H1-Fc. Splenociti iz anti-B7-H1 pozitivnih životinja su spojeni s ćelijama mijeloma sledeći standardni protokol. Dobijeni mišji hibridomi su prikazani za one koji eksprimiraju B7-H1-imunoreaktivna monoklonska antitela. Antitela su dodatno procenjena kako bi se utvrdilo da li su to IgG ili IgM antitela. Shodno tome, B7-H1-Fc ili negativna kontrola imobilisana je na čvrstu podlogu. Supernatanti hibridoma su zatim postavljeni u kontakt sa nosačem, a prisustvo antitela anti-B7-H1 određeno je korišćenjem označenog anti-miš IgG ili anti-miš IgM. Slika 1 prikazuje rezultate testiranih supernatanta hibridoma i ukazuje na izolaciju linija višestrukih hibridoma koji eksprimiraju imunoreaktivna antitela sa ljudskim B7-H1.

[0161] Identifikovani hibridomi su pregledani kako bi se utvrdilo da li su njihova eksprimirana antitela neutralizujuća antitela i kao takva mogu blokirati vezivanje između B7-H1 i PD-1. PD-1-Fc je imobilisana na čvrstu podlogu, koja je zatim inkubirana u prisustvu razblaženih uslovljenih medija koji sadržavaju biotinilovani B7-H1-Fc. Sposobnost B7-H1 i PD-1 da se vezuju jedna s drugom otkrivena je testiranjem za vezivanje peroksidaze streptavidinskog konja (SA-HRP) na čvrstu podlogu. Anti-B7-H1 antitelo sposobno za moduliranje vezivanja B7-H1 do PD-1 tako posreduje smanjenju vezivanja SA-HAS u ovom testu. Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 2 i ukazuju na to da je nekoliko izolovanih

4

hibridoma terminilo humanog B7-H1 neutralizujućeg antitela. Antitelo MIH-1 (anti-human CD274 (B7-H1) (Chen, Y. i dr. (Epub 2005 Nov 11) „Expression Of B7-H1 In Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells,” Nephron. Exp. Nephrol.102(3-4): e81-e92) je korišćena kao pozitivna kontrola 29E.2AE je anti-PD-1 antitelo, ali je pokazano da nije neutralizovano u ovom testu. Uslovljeni medijum od nepovezanog hibridoma (rand Ab) i kontrola vektora (VC) korišćena je kao negativna kontrola.

[0162] Da bi se utvrdilo da li eksprimirana neutralizirajuća antitela mogu da se vezuju za B7-H1 koji je raspoređen na površini ćelije, izvršen je analiza vezivanja ćelija. Supernatant iz svakog klon hibridoma je razblažen 1: 4 i inkubiran u prisustvu roditeljskih CHO ćelija i klonalne CHO linije koja je prekomerno izražena čoveka B7-H1 pune dužine. Nakon što se dozvoljava vezivanje, ćelije su isprane i otkriveno je prisustvo ostatka ćelija vezanih anti-B7-H1 antitela korišćenjem fluorescentno označenog anti-miš IgG antitela. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za vezivanje za CHO-hB7-H1 je prikazan na slici 3. Nijedan od testiranih klonova nije pronađen u unakrsnoj reakciji sa roditeljskom CHO linijom, što ukazuje na to da je izraženo antitelo specifično za humani B7-H1.

[0163] Kao dodatna procena, razne koncentracije tri klona upoređene su sa anti-B7-H1 antitelom MIH-1. Antitelo je prečišćeno korišćenjem proteina G i procenjeno za sposobnost vezivanja za B7-H1 kada je prisutan na endogenim nivoima i kao na površini APC-a. CHO ćelije koje su eksprimirale humani B7-H1 su inkubirane sa različitim koncentracijama (10, 1 ili 0.1 µg/ml) antitela anti-B7-H1 praćene inkubacijom APC-konjugovanim anti-miš antitelima magarca. Vezivanje je prijavljeno merenjem intenziteta fluorescencije medijuma. Rezultati pokazuju da je ispitivana antitela pokazala veću avidnost prema B7-H1 od kontrolnog antitela (MIH1) (Slika 4) i da je antitelo 1E12 pokazalo veću avidnost prema B7-H1 nego kontrolno anti-B7-H1 antitelo (5H1) (Dong, H. i dr. (2002) „Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion,” Nature Med.

8(8): 793-800) (Slika 5).

[0164] Ukratko, podaci pokazuju da su dobijeni višestruki anti-humani B7-H1-ekspresioni hibridomi. Svi klonovi su IgG antitela koja prepoznaju B7-H1-Fc. Klonovi 1B3, 1D11, 1E2, 1E4, 1E10, 2A6, 2E12, 2F2, 2F5, 2F11, 3A4 i 3B1 su slabi u testu vezivanja za skrining. Nizak signal može biti zbog slabog nivoa ekspresije i/ili slabog afiniteta.

[0165] Značajno, nekoliko klonova (npr. klonovi: 1D5, 1E12, 1F4, 2A7, 2G11, 3B6, 3D10) pokazali su snažnu neutralizaciju aktivnosti. Svi su neutralizovani u svim testiranim koncentracijama i čini se da se vezuju za antigenski otvor. MFI za vezivanje na CHO-B7-H1 ćelije je kao što sledi: 1D5 = 50,821; 1E12 = 56,152; 1F4 = 62,015; 2A7 = 49,008; 2G11 = 55,947; 3B6 = 59,638; 3D10 = 53,114.

Primer 2

Izolacija i karakterizacija anti-humanih PD-1 antitela

[0166] Da bi se izolovala anti-humana PD-1 antitela sa visokim afinitetom, miševi su prvo imunizirani i potom povećani sa humanim PD-1-Fc. Splenociti iz anti-PD-1 pozitivnih životinja su spojeni sa ćelijama mijeloma sledeći standardni protokol. Dobijeni mišji hibridomi su prikazani za one koji eksprimiraju visoko afinitetne humane PD-1-imunoreaktivne monoklonske antitela. Antitela su dodatno procenjena kako bi se utvrdilo da li su to IgG ili IgM antitela. Shodno tome, PD-1-Fc ili negativna kontrola (B7-H4-Fc) je imobilisana na čvrstu podlogu. Supernatanti hibridoma su zatim postavljeni u kontakt sa nosačem, a prisustvo anti-PD-1 antitela je određeno korišćenjem označenog anti-miš IgG ili anti-miš IgM. Slika 6 pokazuje vezivanje antigena i izotip izolovanih antitela humanih PD-1 protiv čoveka i ukazuje na izolaciju linija višestrukih hibridoma koji eksprimiraju imunoreaktivna antitela sa ljudskim PD-1.

[0167] Identifikovani hibridomi su prikazani kako bi se utvrdilo da li su njihova eksprimirana antitela neutralizujuća antitela i kao takva mogu blokirati vezivanje između B7-DC i PD-1. B7-DC-Fc, fuzioni protein koji se vezuje za PD-1, imobilizovan je na čvrstu podlogu, koja je zatim inkubirana u prisustvu razblaženih uslovljenih medija koji sadrže biotinilovani PD-1-Fc. Sposobnost B7-DC i PD-1 da se vezuju jedna s drugom otkrivena je testiranjem za vezivanje peroksidaze (SA-HRP) streptavidin rena na čvrstu podlogu. Anti-PD-1 antitelo sposobno blokirati vezivanje B7-DC u PD-1 tako posreduje u smanjenju vezivanja SA-HRP u ovom testu. Rezultati eksperimenta su prikazani na Slikama 7A i 7B i ukazuju da je nekoliko izolovanih hibridoma terminilo humane PD-1 neutralizujuća antitela (Slika 7B pokazuje isti grafik kao što je Slika 7A, ali u različitoj skali).

[0168] Test za vezivanje ćelija je sproveden kako bi se utvrdilo da li eksprimirana neutralizujuća antitela mogu da se vezuju za PD-1 raspoređene na površini ćelije. Supernatant iz svakog klon hibridoma je razblažen 1: 4 i inkubiran u prisustvu roditeljskih CHO ćelija i klonalne CHO linije koja je prekomerno izražena PD-1 u punoj dužini. Posle doziranja vezivanja, ćelije su isprane i otkriveno je prisustvo rezidualnih ćelija vezanih anti-PD-1 antitela korišćenjem fluorescentno označenog anti-miš IgG antitela. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za vezivanje na CHO-hPD-1 prikazan je na Slici 8. Rezultati pokazuju da su antitela 1E3, 1E8 i 1H3 naročito sposobna za vezivanje za PD-1 čoveka izraženu na površini ćelije. Nijedan od testiranih klonova nije pronađen u unakrsnoj reakciji sa roditeljskom CHO linijom, ukazujući da je izraženo antitelo specifično za humani PD-1. J116 je komercijalno dostupno anti-human PD-1 kontrolno antitelo (eBioscience, Inc.).

Izotipizacija je pokazala da su 1E3, 1E8, 1H3 IgG1/kappa.

[0169] Dva klona (1E3 i 1H3) su izabrana za dalje istraživanje. Kao dodatna procena, razne koncentracije dva klona upoređene su sa anti-PD-1 antitela M3 i EH-12. Antitelo je prečišćeno korišćenjem proteina G i procenjeno za sposobnost vezivanja za PD-1, izraženo na površinama CHO ćelija. Ćelije CHO-hPD1 su obojene neoznačenim anti-PD-1 antitelom (10,1 i 0.1 µg/mL) praćeno antitelom protiv konjugacije magnezijuma APC i prijavljen je srednji intenzitet fluorescencije. Rezultati testa su navedeni na Slici 9. Negativna kontrola je mišji IgG (mIgG1); pozitivne kontrole su M3 (neutralizirajuće monoklonsko anti-humano antitelo PD-1 (Wu, K. i dr. (2009) „Kupffer Cell Suppression of CD8+ T Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Is Mediated by B7-H1/Programmed Death-1 Interaction,” Cancer Res 69(20): 8067-8075) i anti-PD-1 antibody EH12 (Dorfman, D.M. i dr. (2006) „Programmed Death-1 (PD-1) Is A Marker Of Germinal Center-Associated T Cells And Angioimmunoblastic T-Cell Lymphoma,” Am. J. Surg. Pathol.30(7): 802-810).

[0170] Test konkurencije zasnovan na ćelijama obavljen je inkubiranjem 50.000 CHO-hPD1 ćelija tokom 30 minuta sa anti-PD-1 antitelom (prisutno u koncentracijama u rasponu od 0-0.1 mg/ml). Zatim je dodato 10 mg/ml APC-označenog B7-DC-Fc i inkubacija se nastavila dodatnih 30 minuta, nakon čega je merena fluorescencija vezane B7-DC-Fc. Srednji intenzitet fluorescencije je prikazan na Slici 10. Konkurencija je ponovljena kod fiksne koncentracije antitela od 20 µg/mL (Slika 11).

[0171] Ukratko, rezultati pokazuju da klonovi 1E3, 1E8 i 1H3 pokazuju neutralizirajuću aktivnost i prepoznaju antigen dobro. Klon 1E6 je u mogućnosti da unakrsno povezuje PD-1 bez neutralizacije, čime daje poboljšano vezivanje. Međutim, čini se da ovaj klon ne vezuje PD-1 na površini ćelije.

Primer 3

Proizvodnja humanizovanih antitela: generalna metodologija

[0172] Kao što je gore navedeno, u određene svrhe, uključujući na primer, upotrebu u in vivo tretmanu ljudskih bolesti, poželjno je da se koristi humanizovani derivat gore opisanog antihumanog B7-H1 i/ili anti-humanog PD-1 antitela.

[0173] Za formiranje takvih derivata, okvirne sekvence antitela 3D10 ili 1H3 (“roditeljske” sekvence) prvo su poravnate sa okvirnim sekvencama seta ljudskih antitela „primaoca”, kako bi se identifikovale razlike u okvirnim sekvencama. Humanizacija je postignuta supstitucijom neosporivnih okvirnih ostataka između roditelja i primaoca. Supstitucije na potencijalno važnim pozicijama kao što su one u Vernier zoni, VH/VL inter-lančani interfejs ili CDR kanonične položaje za određivanje klase su analizirane za potencijalne povratne mutacije (videti, Foote, J. i dr. (1992) „Antibody Framework Residues Affecting The Conformation Of The Hypervariable Loops,” J. Molec. Biol.224: 487-499). Identifikovane su ukupno 14 humanizovanih varijantnih sekvenci.

[0174] Baza konzerviranih domena (COD) (Marchler-Bauer, i dr. (2011) „COD: A Conserved Domain Database For The Functional Annotation Of Proteins,” Nucleic Acids Res. 39: D225-D229) korišćena je za određivanje sadržaja domena svakog lanca aminokiselina i približnih granica svakog domena. Varijabilne granice domena su bile tačno određene uz granice područja za određivanje komplementarnosti (CDR) u skladu sa nekoliko najčešće korištenih definicija (Kabat, E.A. i dr. (1991) „Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242; Chothia, C. i dr.

(1987) „Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196: 901-917); Honegger, A. i dr. (2001) „Yet Another Numbering Scheme For Immunoglobulin Variable Domains: An Automatic Modeling And Analysis Tool,” J. Molec. Biol. 309(3): 657-670; Chothia's CDR definition (Chothia, C. i dr. (1987) „Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol.196: 901-917) dole će se koristiti u odnosu na takve humanizovane sekvence.

[0175] Više usaglašavanja roditeljske sekvence sa sekvencom miša i humane germinalne linije generisane su korišćenjem MAFFT (Katoh, K. i dr. (2002) „MAFFT: A Novel Method For Rapid Multiple Sequence Alignment Based On Fast Fourier Transform,” Nucleic Acids Res. 30: 3059-3066) i unosi u svako poravnanje su naručeni prema identitetu sekvence sa roditeljskom sekvencom. Referentni skupovi su svedeni na jedinstveni niz sekvenci sakupljanjem pri identitetu od 100% sekvence i isključujući ponavljajuće unose.

[0176] Optimalni izbor primaoca okvira baziran je na ukupnom identitetu roditeljskog antitela sa primaocem u okviru oba lanca; međutim, pozicije koje sastavljaju VH/VL interlančani interfejs su od posebnog interesa. Pored toga, dužine CDR-petlje i CDR pozicije odgovorne za diskretni skup kanoničnih struktura koji je definisan za 5 CDR-ova (Chothia, C. i dr. (1987) „Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol.196: 901-917; Martin, A.C. i dr. (1996) „Structural Families In Loops Of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling And Application To Antibodies,” J. Molec. Biol 263: 800-815; Al-Laziniki, B. i dr. (1997) „standard Conformation For The Canonical Structures Of Immunoglobulins,” J. Molec. Biol.273: 927-948) upoređeni su sa germinalnim linijama, kako bi se utvrdilo koji okviri germinalne linije imaju iste ostatke interfejsa i za koje je poznato da podržavaju slične konformacije CDR-petlje. Tabela 6 i Tabela 7 pokazuju konzervisane pozicije unutar VH/VL interfejsa i položaje koji određuju CDR kanonsku klasu (odnosno), sa redosledom u skladu sa Chothia definicijom.

[0177] Na osnovu poravnanja sekvence roditeljskog antitela prema ljudskim germinalnim linijama pronađeni su najbliži upisi. Izbor željenog čovečijeg germinalne linije zasnovan je na naručenim kriterijumima: (1) identitet sekvence kroz okvir; (2) identični ili kompatibilni međusektorski ostaci interfejsa; (3) pomoćne petlje sa kanonskim konformacijama roditeljskog CDR-a; (4) Kombinacija teških i laganih klica linija se nalazi u izraženim antitelima; i (5) prisustvo lokacija N-glikozilacije koje treba ukloniti.

[0178] Izrađen je strukturni model Fv-regiona 1H3 antitela. Faktori strukturalnog šablona kandidata za okvirne (FR) i regione za određivanje komplementarnosti (CDR), kao i kompletni Fv su postignuti, rangirani i odabrani iz baze podataka antitela na osnovu njihovog identiteta sekvence do cilja, kao i kvalitativnih kristalografskih mera struktura šablona kao što je rezolucija, u Angstrom-u (Å).

[0179] Da bi strukturalno usklađivali CDR sa FR predlošcima, 5 ostataka sa obe strane CDR-a su uključeni u CDR šablon. Poravnanje fragmenata je generisano na osnovu preklapajućih segmenata i generisane poravnanje sekvence. Delovi šablona zajedno sa poravnanjem su obrađeni od strane MODELLER (Sali, A. i dr. (1993) „Comparative Protein Modelling By Satisfaction Of Spatial Restraints,” J. Molec. Biol.234: 779-815). Ovaj protokol stvara konformaciona ograničenja izvedena iz skupa usklađenih strukturnih šablona. Ansambl struktura koji zadovoljava ograničenja stvoren je konjugatnim gradijentom i simuliranim metodama optimizacije žarenja. Modelirane strukture su odabrane iz ovog ansambla na bazi rezultata energije, izvedenog iz rezultata strukture proteina i zadovoljavanja konformacionih ograničenja. Modeli su pregledani i bočni lanci položaja koji su se razlikovali između cilja i šablona optimizovani su pomoću algoritma za optimizaciju bočnih lanaca i minimizirane energije. Kompleks vizuelizacije i računskih alata korišćeni su za procenu konformacijske varijabilnosti CDR-a, lokalnog pakovanja i površinske analize za odabir jednog ili više poželjnih modela.

[0180] Strukturalni model roditeljskog antitela je sagrađen i pregledan zbog nesavršenosti kao što su siromašna atomska ambalaža, zatezanje dužine veze, vezni uglovi ili dihedral uglovi. Ove nepravilnosti mogu ukazivati na potencijalne probleme sa strukturnom stabilnošću antitela. Model protokola pokušava da minimizira takve nesavršenosti. Inicijalni strukturni model humanizovanog FV sadrži sve sigurne supstitucije (tj. supstitucije koje ne bi trebalo da utiču na afinitet vezivanja ili stabilnost) i oprezne supstitucije (tj. izvršena je supstitucija položaja, ali položaj može biti važan za afinitet vezivanja). Supstitucije na pozicijama za koje se smatra da su povezani sa rizikom smanjeni vezujući afinitet ili smanjena stabilnost se ne menjaju. Pretraga i odabir šablona je izvršen odvojeno za pretraživanje roditeljskog šablona kako bi se stvorio dobar samostalni model, a ne odgovarajući varijantni model roditelja. Kako je izvršena procena potencijalnih supstitucija, model je ažuriran da odražava željene supstitucije i efekat povratka.

Primer 4

Proizvodnja humanizovanih anti-humanih B7-H1 antitela

[0181] Da bi se ilustrovala proizvodnja takvih humanizovanih derivata, humanizovani derivati anti-humanog B7-H1 antitela 3D10 su proizvedeni u skladu sa gore opisanom procedurom.

[0182] Usaglašavanje redosleda upoređujući varijabilne domene 3D10 lakog lanca sa ljudskim germinacijskim linijama generisane su pomoću: IGKV3 lakih lanaca (IGKV3-11*01, IGKV3-11*02, IGKV3-NL5*01, IGKV3D-11*01, IGKV3-NL4*01, IGKV3D-7*01, IGKV3D-20*01, IGKV3-20*01, IGKV3-20*02, i IGKV3-15*01), IGKV1 germinacijske linije lakog lanca (IGKV1-9*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-13*01, IGKV1-16*01, IGKV1-8*01, IGKV1-13*02, IGKV1-NL1*01, IGKV1D-43*01, IGKV1-27*01, i IGKV1-12*01) i IGKJ germinacijske linije lakog lanca (IGKJ4*01, IGKJ2*02, IGKJ2*01, IGKJ2*04, IGKJ2*03, IGKJ5*01, IGKV1*01, i IGKJ3*01).

[0183] Usaglašavanje redosleda upoređujući varijabilne domene 3D10 teškog lanca sa ljudskim germinacijskim linijama generisane su pomoću: IGHV1 germinacijske linije teškog lanca (IGHV1-2*02, IGHV1-2*04, IGHV1-f*01, IGRV1-48*01, IGHV1-2*03, IGHV1-2*01, IGHV1-46*02, IGHV1-2*05, IGHV1-3*01, i IGKV1-8*01), IGHV3 germinacijske linije teškog lanca (IGHV3-49*04, IGHV3-49*01, IGHV3-49*02, IGHV3-49*03, IGHV3-64*01, IGHV3-64*02, IGHV3-72*01, IGKV3-66*01, i IGHV3-23*01), i IGHJ germinacijske linije teškog lanca (IGHJ3*02, IGHJ6*01, IGHJ3*01, IGHJ6*03, IGHJ5*02, IGHJ5*01, IGHJ4*01, IGHV1*01, IGHJ6*04, i IGHJ2*01).

(A) Humanizacija lakog lanca

1

[0184] Na osnovu gore navedenih kriterijuma, laki lanac antitela 3D10 je najsličniji lakom lancu germinacijske linije IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 78):

sa IGKV3-11*01 kao što je prikazano u Tabeli 8 (CDR ostaci antitela 3D10 su prikazani kurzivom, identični usaglašeni ostaci su podvučeni):

2

[0185] Geni J-segmenta upoređeni su sa roditeljskom sekvencom iznad FR4, a J-segment IGKJ4*01 (SEQ ID NO: 80: LTFGGGTKVEIK) je izabran za laki lanac.

[0186] Kao što je već prikazano, laki lanac antitela 3D10 ima kratak deset ostataka CDR L1 sličan kanonskim klapama I klase. Čovekove germinacijske linije nemaju tako kratak CDR L1. Svaka od odabranih germinacijskih linija, IGKV3-11*01 i IGKV1-9*01, imaju kraće L1 petlje koje sadrže tačne okvirne ostatke za podršku ove vrste petlje. Dobra sličnost celokupnog sekvenca primećuje se između oba okvira primaoca i roditeljske sekvence, međutim, važne razlike se primećuju na pozicijama interakcije I33 i P45. Ostatak I33 je u CDR LI i dok dve izabrane porodice primaoca ne sadrže tirozin na ovoj poziciji, druge sekvence germinalne linije rade. Razlika između okvira primaoca i roditeljske sekvence na položaju P45 je posledica roditeljske kliničke linije koja poseduje FR2 koja se razlikuje od bilo kog čoveka. Kao rezultat, promene u ovom regionu su predložene bez obzira na odabrani okvir prihvatača, tako da su IGKV3-11*01 i IGKV1-9*01 napredovali kao okvir primaoca.

[0187] Tri humanizovana lanca su kreirana za svaki od dva poželjna primaoca okvira, IGKV3-11*01 i IGKV1-9*01. Tri LC1 lanca potiču iz IGKV3-11*01; tri LC2 lanca potiču iz IGKV-9*01. Prvi humanizovani lanac za svakog primaoca okvira sadrži sve humanizovane supstitucije koje se smatraju mogućim i najomiljenije su od tri lanca. Drugi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadržao je nekoliko povratnih mutacija na pozicijama koje menjaju punjenje, potencijalno ometaju jezgro pakovanja ili mogu uticati na konformaciju CDR-ova. Treći lanac, za svaki od prihvatnih okvira, sadrži najdalje mutacije, uključujući supstitucije koje menjaju punjenje i mogu potencijalno promeniti afinitet vezivanja. Sekvence ovih šest humanizovanih lanaca su prikazane u ispod.

[0188] Sekvence za ovih šest humanizovanih lanaca prikazane su u Tabeli 9 sa razlikama u odnosu na roditeljski 3D 10 laki lanac prikazan podebljano i podvučeno.

4

(B) Humanizacija teškog lanca

[0189] U svetlu gore opisanih kriterijuma, dva humana kandidata germinacijske linije primaoca okvira: IGHV1-2*02 (IGHV1 germinacijska linija) i IGHV3-49*04 (IGHV3 germinacijska linija) su izabrani za humanizaciju teškog lanca antitela 3D10.

[0190] Okvir primaoca IGHV 1-2*02 je izabran zbog sličnosti sa roditeljskom sekvencom i činjenicom da sadrži vrlo slične ostatke uključene u jezgro pakovanja domena. Okvir primaoca IGHV3-49*04 je izabran nakon razmatranja i odbacivanje drugih sekvenci za germinalnu liniju sličan IGHV 1-2*02. Kao okvir primaoca IGHV3-49*04 je malo više različit od roditeljske sekvence od IGHV 1-2*02, neophodan je veći broj supstitucija, međutim ovaj okvir za prihvatanje germline može podržati roditeljske CDR-ove. Sekvence okvira primaoca IGHV 1-2*02 i okvir primaoca IGHV3-49*04 prikazane su ispod:

[0191] Okvir primaoca IGHV 1-2*02 (SEQ ID NO: 87):

[0193] Tabela 10 pokazuje poravnanje ovih sekvenci sa teškim lancem antitela 3D10 (CDR ostaci antitela 3D10 su prikazani kurzivom, podebljani, identični ostaci su podvučeni):

[0194] Geni J-segmenta upoređeni su sa roditeljskom sekvencom iznad FR4, a za teški lanac je izabran J-segment IGHJ3*02 (SEQ ID NO: 89: DAFDIVGKGTMVTVSS).

[0195] Tri humanizovana lanca su stvorena za svaki od dva poželjna okvira prihvatljivosti, IGHV1-2*02 i IGHV3-49*04. Tri HC1 lanca potiču iz IGHV1-2*02; tri HC2 lanca potiču iz IGHV3-49*04). Prvi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadrži sve humanizirajuće supstitucije koje se smatraju mogućim i najomiljenije su od tri lanca. Drugi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadržao je nekoliko povratnih mutacija na pozicijama koje menjaju punjenje, potencijalno ometaju jezgro pakovanja ili mogu uticati na konformaciju CDR-ova. Treći lanac, za svaki od prihvatnih okvira, sadrži najsevernije mutacije, uključujući supstitucije koje menjaju punjenje i mogu potencijalno promeniti afinitet vezivanja. Nizovi ovih šest humanizovanih lanaca prikazani su ispod:

[0196] Sekvence za ove šest humanizovanih lanaca su prikazane u Tabeli 11 sa razlikama u odnosu na teški lanac roditeljskog 3D 10 koji je prikazan podebljano i podvučeno.

(C) Humanizovani derivati antitela 3D10

[0197] Potraga potvrdila da postoje antitela sa kombinacijom germinalnih linija, slično kao uparivanje IGKV3-11*01 sa IGHV1-2*02. Uparivanje je označeno primalac 1. Pored toga, pronađena su antitela sa kombinacijom bakterijskih linija, slično kao uparivanje IGKV 1-9*01 sa IGHV3-49*04. Uparivanje je označeno sa primalac 2.

[0198] Prethodno opisani laki i teški humanizovani lanci su kombinovani tako da kreiraju 14 varijantnih humanizovanih antitela, čije su sekvence opisane u Tabeli 12.

Primer 5

Proizvodnja humaniziranih anti-humanih PD-1 antitela

[0199] Da bi se ilustrovala proizvodnja takvih humanizovanih derivata, humanizovani derivati antihumanog PD-1 antitela 1H3 su proizvedeni u skladu sa gore opisanom procedurom (himerno antitelo koje sadrži varijabilni region od 1H3 i humani IgG1 Fc region korišćen je kao roditeljsko antitelo).

[0200] Poravnanja redosleda upoređujući varijabilne regione lakog lanca 1H3 sa ljudskim germinacijskim linijama generisane su pomoću: IGKV3 lakih lanaca (IGKV3-11*01, IGKV3-11*02, IGKV3D-11*01, IGKV3D-20*01, IGKV3-NL4*01, IGKV3D-7*01, IGKV3-20*01, IGKV3-NL5*01, IGKV3-15*01, IGKV3-NL1*01, IGKV3-20*01, IGKV3-NL2*01, IGKV3-NL3*01), IGKV1 germinacijske linije lakog lanca (IGKV1-9*01, IGKV1D-43*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-13*02, IGKV1-8*01, IGKV1D-13*01, IGKV1-12*01, IGKV1D-16*01, IGKV1-5*01, i IGKV1-NL1*01) i IGKJ germinacijske linije lakog lanca (IGKJ2*02, IGKJ2*01, IGKJ2*04, IGKJ2*03, IGKJ5*01, IGKJ4*01, IGKJ3*01 i IGKJ1*01).

[0201] Poređanja redosleda upoređujući varijabilne domene H3 liganda sa ljudskim germinacijskim linijama generisane su pomoću: IGHV3 germinacijske linije teškog lanca (IGHV3-48*01, IGHV3-48*02, IGHV3-48*03, IGHV3-11*01, IGKV3-21*01, IGHV3-11*03, IGHV3-30*03, IGHV3-9*01, IGHV3-7*01, i IGHV3-30*10), IGHV1 germinacijske linije teškog lanca (IGHV1-3*01, IGHV1-69*08, IGHV1-69*11, IGHV1-46*01, IGHVI-69*05, IGHV1-69*06, IGHV1-69*01, IGHV1-46*02, IGHV1-69*02, i IGHV1-69*10), i IGHJ germinacijske linije teškog lanca (IGHJ6*01, IGHJ6*03, IGHJ4*01, IGHJ6*04, IGHJ5*02, IGHJ3*02, IGHJ5*01, IGHJ3*01, IGHJ2*01, i IGHJ1*01).

[0202] Na osnovu ukupnog identiteta sekvence, odgovarajućih pozicija interfejsa i slično klasifikovanih CDR kanoničnih pozicija, dve familije germinacijske linije su identifikovane za svaki od lakih i teških lanaca, što je moguće prihvatljivim okvirima prihvatljivosti (IGKV3 i IGKV1 za laki lanac i 1GHV3 i IGHV1 za teški lanac) . Utvrđeno je da je antitelo 1H3 najslabije slično onome sa lancem laka lanca 1GKV3-11*01 i teškim IGHV3-48*01. Na osnovu ukupnog identiteta sekvence, odgovarajućih položaja interfejsa i slično klasifikovanih CDR kanonskih pozicija, za svaki od lakših i teških lanaca su identifikovane dve prihvatljive okvira (IGKV3 i IGKV1 za laki lanac i IGHV3, IGHV1 za teški lanac.

(A) Humanizacija lakog lanca

[0203] Antitelo 1H3 ima kratkih 10 ostataka CDR L1 i spada u kanoničnu klasu I. Nijedna humanitarna linija nema tako kratak CDR L1, ali najbliži rodni liniji u svakoj odabranoj porodici (IGKV3-II*01 i IGKV1-9*01 imaju kratak L1 petlje i sadrže tačne ostatke okvira za podršku LI petlji klase I. Ukupna sličnost sekvenci bila je dobra za obe prihvatne okvire, ali postoje razlike na dve pozicije interfejsa (I33 i P45). Y33 leži u CDR L1 i dok su dva porodice primaoca ne sadrže tirozin na ovoj poziciji, a druge potencijalne porodice primaoca to rade. Razlika kod P45 je bila povezana sa brojnim drugim razlikama u FR2 roditeljskog lakog lanca. Uglavnom, roditeljska germinacijska linija pripada porodici germinacijskih linija miševa sa FR2 drugačijoj od bilo čega kod humanih germinacijskih linija.

[0204] Germne linije 1GKV3-11*01 i IGKV 1-9*01 su izabrane kao okvir lakih lanaca. Serije lakih lanaca 1GKV3-11*01 i IGKV 1-9*01 su prikazane iznad kao SEQ ID NO: 78 i SEQ ID NO: 79, respektivno. Usklađivanje ovih sekvenci sa lakim lancem antitela 1H3 prikazano je u Tabeli 13 (CDR ostaci antitela 1H3 su prikazani kurzivom, podebljani identični ostaci su podvučeni):

1

[0205] Geni J-segmenta upoređeni su sa roditeljskom sekvencom preko FR4, a J-segment IGKJ2*02 (SEQ ID NO: 96: CTFGKGTKLEIK) je izabran za laki lanac.

[0206] Dva humanizovana lanca su kreirana za svaki od dva poželjna okvira primaoca, IGKV3-11*01 i IGKV1-9*01. Dva LC1 lanca dobijena su od IGKV3-11*01; dva LC2 lanca dobijena su od IGKV1-9*01. Prvi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadrži sve humanizovane supstitucije koje se smatraju mogućim i najomiljenije su od tri lanca. Drugi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadržao je nekoliko povratnih mutacija na pozicijama koje menjaju punjenje, potencijalno ometaju jezgro pakovanja ili mogu uticati na konformaciju CDR-ova. Sekvence ova četiri humanizovana lanca su prikazane u nastavku:

[0207] Sekvence za ova četiri humanizovana lanca prikazana su u Tabeli 14 sa razlikama u odnosu na roditeljski lanac 1H3 Var1 lanac prikazan je podebljano i podvučeno.

2

(B) Humanizacija teškog lanca

[0208] U svetlu gore opisanih kriterijuma, izabrana su dva humanitarna okvira: IGHV3-48*01 (IGHV3 germinacijska linija) i IGRV1-3*01 (IGHV1 germinacijska linija) za humanizaciju teškog lanca antitela 1H3 Var1.

[0209] Okvir primaoca 1GHV3-48*01 je izabran kao primarni okvir teškog primaoca, zahvaljujući ukupnoj sličnosti sekvenci. Ostaci interfejsa se porede sa H35, pozicijom u kojoj su dozvoljene neke varijacije i sadrži tačne ostatke za određivanje kanonične klase za CDR H1. CDR H2 ne spada u nikakvu kanonsku klasu zasnovanu na sekvenci usled tirozina na poziciji 56. Izbor drugog okvira teškog primaoca napravljen je posle uklanjanja bilo koje germinacijske linije koja je usko povezana sa IGHV3-48*01. Najbliža germinacijska linija je postala IGHV1-3*01. Broj razlike koje treba uzeti u obzir postaju veće pošto je pakovanje donjeg jezgara različito, međutim, linija žarišta treba da podržava CDR i funkcioniše kao odgovarajući okvir primaoca. Primećeno je da roditeljska sekvenca sadrži cistein na konzerviranoj poziciji 60, gde su sve ljudske germinacijske linije imale tirozin. Sekvence okvira primaoca 1GHV3-48*01 i okvir primaoca IGHV1-3*01 prikazane su ispod:

[0210] Okvir primaoca IGHV3-48*01 (SEQ ID NO: 101):

[0212] Tabela 15 prikazuje usaglašavanje ovih sekvenci sa teškim lancem antitela 1H3 (CDR ostaci antitela 1H3 su prikazani kurzivom, podebljani identični ostaci su podvučeni):

4

[0213] Geni J-segmenta upoređeni su sa roditeljskom sekvencom preko FR4, a za teški lanac izabran je J-segment IGHJ6*01 (SEQ ID NO: 103: VGKGTTVTV).

[0214] Tri humanizovana lanca su stvorena za svaki od dva poželjna okvira prihvatljivosti, IGHV3-48*01 i IGHV1-3*01. Tri HC1 lanca potiču iz IGHV3-48*01; tri HC2 lanca potiču iz IGHV1-3*01). Prvi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadrži sve humanizovane supstitucije koje se smatraju mogućim i najomiljenije su od tri lanca. Drugi humanizovani lanac za svaki okvir primaoca sadržao je nekoliko povratnih mutacija na pozicijama koje menjaju punjenje, potencijalno ometaju jezgro pakovanja ili mogu uticati na konformaciju CDR-ova. Treći lanac, za svaki od okvira primaoca, sadrži najdalje mutacije, uključujući supstitucije koje menjaju punjenje i mogu potencijalno promeniti afinitet vezivanja. Sekvence ovih šest humanizovanih lanaca prikazane su ispod:

[0215] Sekvence za ovih šest humanizovanih lanaca su prikazane u Tabeli 16 sa razlikama u odnosu na teški roditeljski lanac 1H3 prikazane su podebljano i podvučeno.

(C) Humanizovani derivati antitela 1H3

[0216] Potraga je potvrdila da postoje antitela sa kombinacijom germinacijskih linija u blizini uparivanja IGKV3-11*01 sa teškim IGKV3-48*01. Uparivanje je označeno sa primalac 1. Nakon toga pronađena su antitela s sličnim uparivanjem IGKVI-9*01 sa IGHVI-3*01.

Uparivanje je označeno sa primalac 2.

[0217] Prethodno opisani laki i teški humanizovani lanci su kombinovani tako da kreiraju 14 varijantnih humanizovanih antitela, čije su sekvence opisane u Tabeli 17.

Primer 6

Karakterizacija anti-humanog PD-1 antitela 1H3

[0218] Da bi se procenila svojstva anti-PD-1 antitela predmetnog obelodanjivanja, proizveden je konstrukt koji poseduje himerne (“ch”) mišije anti-humane PD-1 Fab regione antitela 1H3 i humani IgG1 Fc region ( 1H3 konstrukt). Konstrukt je testiran na njegovu sposobnost vezivanja humanog PD-1.

[0219] Na slici 12 prikazani su rezultati eksperimenta u kojima su CHO ćelije transfektovane sa humanim PD-1 pune dužine prethodno inkubirane sa zasićenom dozom PD-1 mAbs pre nego što su ih obojili anti-hB7-HI-Fc označenim sa biotinom, hB7-DC mFc. Na slici 12 prikazano je da konstrukcija mišijeg monoklonskog antitela koje poseduje humane PD-1 Fabove miševa humanih (“h”) miševa antitela 1H3 i regiona humana IgG1 Fc blokira vezivanje B7-H1-Fc i B7-DC-Fc na ćelije koje eksprimiraju humani PD-1, kao rezultat vezivanja antitela na ćelije. M1, m3 i 1E8 su sve pozitivne kontrolne anti-PD-1 antitela. Na neredukcionim gelovima, konstrukt je migrirao kao jedan opseg od oko 200 MW; ovaj opseg je supstituisan sa opsegom približno 52 MW u uslovima smanjenja.

[0220] 1H3 konstrukt je pokazao sklonost KDod 2.19 nM, „na stopi” Kaod 0.734 x 10-<5>/Ms i „van stope” Kdod 1.61 x 10<-4>/s. Utvrđeno je da EC50konstrukta iznosi 75 ng. Slika 13 upoređuje vezivanje dobijeno sa ovim konstruktom onom komercijalno dostupnog anti-PD-1 antitela, EH12. Utvrđeno je da je konstrukt u potpunosti blokirao sposobnost hPD-1 (izraženog sa CHO ćelijama) da se veže na B7-H1-Fc ili B7-DC-Fc kao što je prikazano na Slici 14. Na slici 15 je pokazano da je himerni 1H3 konstrukt bio sposoban da se veže na hPD-1-Fc i blokira vezivanje takvih hPD-1-Fc do hB7-H1 izraženih CHO ćelijama.

[0221] Sposobnost da se 1H3 konstrukt poveže sa ljudskim primarnim T ćelijama procenjen je u odnosu na kontrolno antitelo (palivizumab, SINAGIS®, Medimmune, Inc.); 1H3 je pokazao poboljšano vezivanje za ćelije CD8 i CD4 (slike 16A-16B).

[0222] Da bi se ilustrovale funkcionalne karakteristike antitela ovog prikaza, sposobnost konstrukta 1H3 i konstrukcija himernih antitela koji imaju FAB regione antitela 1H3 (“1H3 konstrukt”), 1E3 (“1E3 konstrukt”) i antitela 3D10 ( „3D10 konstrukt”) kako bi se poboljšala aktivnost T ćelija. Nezrele dendritičke ćelije (DC) su bile izložene TNFa i PGE2 tokom dva dana (ćelije su inkubirane u prisustvu 50 mg/ml tetanusnog toksoida (TT) tokom noći na drugom danu sazrevanja). Utvrđene su rezultujuće ćelije koje su postale zrele DC kao što je utvrđeno njihovom stečenom sposobnošću da eksprimiraju B7-H1 i B7-DC. Zrele DC ćelije su zatim inkubirane dve nedelje u prisustvu autolognih T ćelija i 100 ng/ml TT i gorenavedenih antitelskih konstrukta u prisustvu karboksifluorescein sukcinimidil estera (CFSE). Kao što je prikazano na Slici 17, antitela predmetnog obelodanjivanja su bila u stanju da blokiraju interakcije B7-H1-PD-1, merene ekspresijom T ćelija specifične za specifični antigen. Na dan 7, izvršena je analiza citokina prisutnih u supernatantima ćelija (Tabela 18).

[0223] Kao što je prikazano u Tabeli 18, oba konstrukta antitela protiv hPD-1 su promovisala i Th1 i Th2 odgovore. U supernatantima su pronađena vrlo niska količina IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10 i G-CSF. Svi mAbs imaju veoma nizak endotoksin, manje od 0.01 EU/mg; Pored toga, DC i T ćelije su držane u medijumima bez seruma. Intracelularno IFN-γ bojenje ćelija dan 7 otkrilo je da je samo 0.15% kontrolnih ćelija IFN-γ<+>, 1.9% ćelija koje su inkubirane sa 1H3 konstrukt, 0.91% ćelija koje su bile inkubirane sa 1E3 konstrukt, i 3.2% ćelija koje su bile inkubirane sa 3D10 konstruktom su IFN-γ<+>.

[0224] Prema tome, u zbiru je utvrđeno da je 1H3 konstrukt posredno uvećao približno 7 puta povećanje proliferacije T ćelija i približno 12 puta povećanje proizvodnje IFN-γ po ćeliji. Kumulativni efekat takvog dejstva je približno 100 puta povećanje sekrecije IFN-γ.

[0225] Kao dalja funkcionalna karakterizacija, DC iz derivata monociti su sazreli inkubacijom sa NFα i PGE2. Ćelije su zatim pulsirane u trajanju od 2 sata u prisustvu grupe mešanih CEF peptida (tj. peptida citomegalovirusa, Epstein-Barr virusa i virusa gripa) klase I, i inkubirane sa autolognom T ćelijom označenom sa CFSE ( LD kolona, 95% pročišćavanjem) dve nedelje. Tretirane ćelije su zatim inkubirane dve nedelje u prisustvu autolognih T ćelija označenih sa CFSE (LD kolona, 95% pročišćavanjem) i gore opisanim konstrukcijama antitela. Na dan 7, utvrđeno je da je procenat CF razređenih T ćelija 40% za ćelije inkubirane kontrolnim antitelom, 37% za ćelije inkubirane sa 1H3 konstrukt, 50% za ćelije inkubirane sa 3D10 konstrukt i 57% za ćelije inkubirani antitelom CA-18C3 (monoklonsko antitelo specifično anti-IL-1α). Na dan 11, ponovo je procenjen procenat CF razređenih T ćelija. Utvrđeno je da je procenat CF razređenih T ćelija bio 17% za ćelije inkubirane kontrolnim antitelom, a 38% za ćelije inkubirane sa 1H3 konstrukt. Utvrđeno je da je procenat CF razređenih T ćelija 27% za ćelije inkubirane antitelom CA-18C3.

[0226] Supernatanti tretiranih ćelija takođe su analizirani za IL-2 i FN-γ citokine na dan 7 (Tabela 19).

[0227] Supernatanti tretiranih ćelija takođe su analizirani za citokine IFN-γ, TNFα i GM-CSF na dan 11. Utvrđeno je da 1H3 konstrukt posreduje poboljšanje sva tri citokina u odnosu na kontrolno antitelo (Tabela 20).

1

[0228] Kao dodatna funkcionalna karakterizacija, DC (izveden iz HLA-A2 pozitivnih donorskih PBMC-ova) su sazreli izloženost TNFa i PGE2, a zreli DC su zatim impulsirani s HLA-A2 ograničenim MART-1 i Flu M1 peptidima tokom 2 sata . Nakon toga, ćelije su inkubirane dve nedelje u prisustvu autologne T ćelije označene CFSE (LD kolona, 95% pročišćavanjem) i gore opisanim 1H3 Konstrukt ili 3D10 Konstrukt. Uticaj MART-1 i M1 peptida na proizvodnju citokina prikazan je u Tabela 21.

[0229]

Primer 7

Karakterizacija humanizovanih anti-PD-1 antitela

[0230] Prethodno opisana humanizovana 1H3_var 1 -1H3_var 14 antitela (videti Tabelu 17) su procenjena kako bi se potvrdila njihova sposobnost vezivanja za PD-1 i njihove terapeutske sposobnosti. Polipeptidi koji kodiraju antitela su izraženi u CHO ćelijama i titrima funkcionalnih antitela su određeni pomoću ELISA (Tabela 22).

1 1

[0231] Da bi se osiguralo da je vezivanje specifično za humani PD-1, vezivanje je procenjeno korišćenjem CHO ćelija koje su transfektovane da eksprimiraju humani PD-1. Rezultati takvih vezujućih eksperimenata su prikazani na slikama 18A-18D. Ponavljanje takvih vezujućih eksperimenata u prisustvu 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 ili 3000 ng varijante h1H3, utvrđeno je da je sposobnost takvih humanizovanih antitela da se vezuju za PD-1 u svim slučajevima zavisno od koncentracije antitela.

[0232] Da bi se demonstrirala sposobnost humanizovanih anti-PD-1 antitela predmetnog obelodanjivanja da blokiraju interakcije između PD-1 i njegovih prirodnih liganda, HEK293 ćelije ekspresije PD-1 su inkubirane u prisustvu B7-H1 (ili B7 -DC) i odabrane varijante h1H3. Utvrđeno je da h1H3 varijantna antitela može blokirati vezivanje B7-H1 na HEK293 ćelije (Slika 19A (B7-H1); Slika 19B (B7-DC) (Ctl = synagis, WT = himerni 1H3).

[0233] Tabela 23 daje rezultate dobijene u prolaznoj ekspresiji i postupku prečišćavanja od 500 ml. Neredukcioni gelovi pokazali su da izražena antitela pretežno migriraju kao jedan pojas od približno 160kD; kada se analizira u redukciji gelova, ovaj opseg je supstituisan sa trakama od približno 60 kD i 30 kD. Rezultati pokazuju da varijante Primaoca 1 h1H3: h1H3 Var1, h1H3 Var3, h1H3 Var4 i h1H3 Var6 pokazuju dobro vezivanje za PD-1, dok su varijante Primaoca 2 h1H3: h1H3 Var7-h1H3 Var14 pokazali slabije vezivanje za humani PD-1. Prema tome, teški i lagani lanci iz varijanti primaoca 1 h1H3: h1H3 Var1 - h1H3 Var6 su klonirani u Double Gene Vector (DGV; Lonza Biologics, Berkshire, UK; Bebbington, C.R. i dr. (1992) „High-Level Expression Of A Recombinant Antibody From Myeloma Cells Using A Glutamine Synthetase Gene As An Amplifiable Selectable Marker,” Biotechnology

1 2

(NY) 10(2): 169-175) i transfektuje u CHO ćelije kako bi se omogućilo stvaranje stabilnih ćelijskih linija za proizvodnju antitela.

[0234] Analiza vezivanja pri koncentracijama antitela od 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150 i 500 ng/ml, kao i 1,5, 5, 15 i 50 mg/ml otkrila je da je vezivanje zavisno od koncentracije. PD-1-specifična vezujuća sposobnost varijanti je određena u koncentracijama antitela u rasponu od 0 do približno 350 nM. Slika 20 prikazuje rezultujuće krivine za h1H3 Var 1 - h1H3 Var 6 i ukazuje na to da se ova antitela vezuju za PD-1. Antitela h1H3 Var 1 i h1H3 Var 4 pokazuju smanjeno vezivanje u odnosu na antitelo roditelja. Nasuprot tome, h1H3 Var2, h1H3 Var3, h1H3 Var 5 i h1H3 Var6 pokazuju vezivanje koje je upotrebljivo sa onim iz roditeljskog antitela. EC50 podaci za ova antitela prikazani su u Tabeli 23.

[0235] Iako je obelodanjivanje opisano u vezi sa konkretnim slučajevima, može se shvatiti da je sposobno za dalje modifikacije i da je ova primena namenjena za pokrivanje svih varijacija, upotreba ili prilagođavanja obelodanjivanja, sledeći generalne principe obelodanjivanja i uključivanje takvih odstupanja od predmetnog obelodanjivanja koja se nalaze u okviru poznate ili uobičajene prakse u okviru veštine na koje se obelodanjivanje odnosi i koja se mogu primeniti na bitne karakteristike koje su ovde navedene.

LISTA SEKVENCI

[0236]

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

��

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koje se vezuje za humani PD-1, koji sadrži laki lanac varijabilnog regiona koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106.

2. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo ili njegov antigen vezujući fragment

(A) smanjuje sposobnost liganda PD-1 da se veže na PD-1;

(B) oslobađa ili u potpunosti neutrališe sposobnost PD-1 da posreduje u transdukciji signala;

(C) posreduje proliferaciju T ćelija; ili

(D) povećava produkciju IFN-γ.

3. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 koje sadrži barem deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc).

4. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 3, gde imunoglobulinski konstantni region (Fc) jeste humani imunoglobulinski konstantni region (Fc).

5. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema patentnom zahtevu 4, gde humani konstantni domeni jesu IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM domeni.

6. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, gde humani IgG konstantni domeni jesu IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 domeni

7. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment jasno označen ili sadrži konjugovani toksin, lek, receptor, enzim, receptorski ligand.

8. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je antitelo monoklonsko antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili jednolančano antitelo.

9. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, gde je antitelo bispecifično, trispecifično ili multispecifično antitelo.

10. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 i fiziološki prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

11. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u tretiranju kancera ili infektivne bolesti.

1