RS58641B1 - Bakterija za upotrebu kao probiotik za nutritivne i medicinske primene - Google Patents

Description

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Smatra se da su ljudska creva, koja su u početku sterilna u materici, odmah po rođenju izložena velikom broju akušerskih i mikroba iz okruženja. Naredni događaji kolonizacije i sukcesije u stomaku su dinamični tokom prvih godina života, nakon čega mikroflora postaje poput one kod odraslih osoba i relativno stabilna (1). Ljudska crevna mikroflora sadrži više od 500 različitih filotipova koji u suštini pripadaju dvema glavnim bakterijskim podelama, Bacteroidetes i Firmicutes (2). Uspešni simbitiočki odnosi koji proizilaze iz kolonizacije ljudskih creva bakterijama su dali širok spektar metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih korisnih funkcija. Proširene metaboličke aktivnosti kolonizovanog creva osiguravaju da hranljive komponente, koje su inače nesvarljive, budu degradirane uz oslobađanje nusproizvoda koji pružaju važan izvor hranljivih materija za domaćina. Slično tome, imunološki značaj crevne mikroflore je dobro prepoznat i potvrđen kod germ-free životinja sa oslabljenim imunim sistemom koji je funkcionalno rekonstituisan nakon uvođenja komensalnih bakterija (3-5).

[0002] Nasuprot produkciji sekretornog intestinalnog IgA na koji utiče kolonizacija mikroba per se (6, 7), izgleda da razvoj i diferencijacija T ćelija, zahtevaju kolonizaciju specifičnih komensalnih mikroorganizama. Izgleda da su Clostridium vrste, posebno segmentirane filamentozne bakterije koje obrazuju spore (SFB), glavni pokretač maturacije intestinalnih Th1, Th17 i Treg (8, 9). Nedavne studije su, međutim, pokazale da druge crevne bakterije uključujući i one od izmenjene Schaedler flore mogu izazvati de novo generaciju Treg dok mono-kolonizacija sa Bacteroides fragilis može popraviti disbalans Th1/Th2 kod germfree miševa promovisanjem ekspanzije Treg (5, 10).

[0003] Ovaj pronalazak ima za cilj da rasvetli ostale rezidentne crevne bakterije koje mogu da modulišu metaboličku aktivnost u crevima i/ili da igraju značajnu ulogu u imunoregulatornim procesima.

OPIS PRONALASKA

[0004] Ovaj pronalazak je usmeren na aktivnosti bakterijskih vrsta Roseburia hominis, člana Firmicutes phylum. Studije podnosioca prijave su pokazale da ova vrsta bakterija igra važnu ulogu u imunoregulaciji i metaboličkoj aktivnosti u crevima, kao i da utiče na gene za apetit i sitost. Uloge gena bakterija koji učestvuju u kolonizaciji i adaptaciji na creva miša, kao i gena domaćina koji odgovaraju na kolonizaciju ovom bakterijom su detaljnije opisane u nastavku.

[0005] Aspekti pronalaska, zajedno sa poželjnim izvođenjima, navedeni su u pratećim patentnim zahtevima.

[0006] Prvi apsekt ovog pronalaska odnosi se na bakterijski soj koji ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029; za upotrebu u medicini.

[0007] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutski kompoziciju koja sadrži bakterijski soj koji ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj prod pristupnim brojem NCIMB 14029 ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji priprada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029; i farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, nosačem ili razblaživačem.

[0008] Još jedan aspekt prema pronalasku se odnosi na nutririvni dodatak koji sadrži bakteriju koja ima (a) 16S rRNK identitčnu bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod prijemnim brojem NCIMB 14029 ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% idnetičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029; i nutritivno prihvatljivi ekscipijens, nosač ili razblaživač .

[0009] Još jedan aspekt prema pronalasku se odnosi na kompoziciju probiotika, hranu za životinje, prehrambene proizvode, dijetetski suplement ili dodatak ishrani koji sadrži (a) bakterijski soj koji ima 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj prod pristupnim brojem NCIMB 14029 ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji priprada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029.

[0010] Još jedan aspekt prema pronalasku se odnosi na postupak za dobijanje farmaceutske kompozicije ili nutritivnog dodatka koji sadrži (a) bakterijski soj koji ima 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029 ili (b) DNK-DNK homologije bar 95% identične sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupim brojem NCIMB 14029, pomenutim postupakom koji obuhvata mešanje bakterijskog soja sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, nosačem ili razblaživačem.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0011] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na bakterijski soj koji ima Roseburia hominis (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029 za upotrebu u jednom ili više:

• lečenja imunog poremećaja;

• lečenja crevnog poremećaja;

• poboljšanja crevne mikroflore;

• regulisanja urođenog imunog sistema subjekta;

• regulisanja adaptivnog imunog sistema subjekta;

• promovisanja Treg i imune tolerancije;

• promovisanja zdravlja creva kod subjekta; i/ili

• održavanja imune homeostaze kod subjekta.

Roseburia hominis

[0012] Roseburia hominis, nedavno opisana komensalna, crevna, anaerobna bakterija filogenetskog klastera XIVa u okviru razdela Firmicutes, pripada dominantnoj grupi bakterija u ljudskim crevima i veliki je proizvođač butirata (11). Podnosilac prijave je rasvetlio kompletnu sekvencu genoma i anotaciju ove bakterije. Dalja istraživanja su ispitivala odgovore transkriptoma bakterije i domaćina kod germfree miševa mono-kolonizovanih R. hominisom. Ovde su opisane uloge gena bakterija koji učestvuju u kolonizaciji i adaptaciji na creva miša, kao i gena domaćina koji odgovaraju na kolonizaciju ovom bakterijom.

[0013] Eksperimenti podnosioca su pokazali da je aktivnost Roseburia hominis veoma specifična. Studije su pokazale da su važni genomi Roseburia vrsta veoma različiti, što ukazuje na različitu funkcionalnost. Zaista, eksperimenti su pokazali da bakterije iz Clostridium klastera XIVa, uključujući i bakterijsku vrstu Roseburia intestinalis, Roseburia hominis i Eubacterium rectale (od kojih su sve proizvođači butirata) iznenađujuće izazivaju vrlo različite i posebne efekte na ćelije creva.

[0014] U jednom poželjnom rešenju, bakterijska vrsta je soj deponovan pod uslovima Budimpeštanskog Ugovora u Nacionalnoj Zbirci Industrijske hrane i Morskih bakterija (NCIMB) pri NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB219YA, 21. Oktobra 2004. godine, u ime Rowett Research Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Greenburn Road, Aberdeen, AB219SB, Scotland, UK, pod pristupnim brojem NCIMB 14029T Roseburia hominis A2-183<T>(DSM = 16839<T>).

[0015] Vrsta bakterija je poželjno Roseburia hominis kao što je opisano u Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol.56:2437-2441.

[0016] U jednom poželjnom izvođenju, bakterijska vrsta je u obliku žive bakterijske populacije, liofilizovane bakterijske populacije, nevijabilnog bakterijskog preparata, ili njihovih ćelijskih komponenti. Poželjno, kada je bakterijska vrsta u obliku nevijabilnog bakterijskog preparata, ona se bira od termički ubijenih, ozračenih ili liziranih bakterija.

[0017] U jednom poželjnom rešenju, bakterijska vrsta je u obliku živih bakterija ili njihovih ćelijskih komponenata.

[0018] U jednom poželjnom rešenju, bakterijska vrsta je u izolovanom obliku. Kako se ovde koristi, termin "izolovan" znači izdvojen od svog prirodnog okruženja.

[0019] U jednom poželjnom rešenju, bakterijska vrsta je u biološki čistom obliku. Kako se ovde koristi termin "biološki čist" se odnosi na laboratorijsku kulturu koja je u suštini oslobođena od drugih vrsta organizama. Poželjno, bakterijska vrsta je u obliku kulture jedne vrste organizama.

[0020] Pronalazak takođe obuhvata upotrebu mutanata bakterijskih vrsta ili sojeva koji su ovde opisani. Kako se ovde koristi, termin "mutant" uključuje izvedene sojeve bakterija koja imaju najmanje 96% homologije, poželjnije 98% homologije sa polinukleotidnom sekvencom referentnog soja, ali inače sadrže mutacije u drugim sekvencama u genomu bakterije. Mutanti se dobijaju tehnikama genetskog inženjeringa što podrazumeva promenu genetskog materijala sojeva iz pronalaska ili podrazumeva rekombinaciju genetskog materijala sojeva iz pronalaska sa drugim molekulima. U cilju dobijanja takvih mutiranih sojeva, stručnjak u ovoj oblasti obično može koristiti standardne tehnike mutageneze poput UV zračenja ili izlaganja mutagenim hemijskim proizvodima.

[0021] Kako se ovde koristi, termin "mutacije" uključuje prirodne ili indukovane mutacije koje sadrže najmanje pojedinačnu izmenu baze uključujući delecije, insercije, transverzije i druge modifikacije koje su poznate stručnjacima u tehnici, uključujući genetske modifikacije unete u matični nukleotid ili aminokiselinsku sekvencu uz održavanje najmanje 95% homologije sa roditeljskom sekvencom. Kako se ovde koristi, "homologija" sekvenci se može odrediti korišćenjem standardnih tehnika poznatih stručnjacima u tehnici. Na primer, homologija se može odrediti pomoću on-line algoritma za homologiju "BLAST" programa, koji je javno dostupan na http)://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

[0022] Pronalazak takođe obuhvata upotrebu homologa bakterijskih vrsta ili sojeva koji su ovde opisani. Kako se ovde koristi termin "homolog" se odnosi na bakterijski soj koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima izvestan stepen identičnosti sekvence ili homologije sekvence sa nukleotidnom sekvencom roditeljskog bakterijskog soja u (dalje u tekstu "homologna sekvenca(e)"). Ovde, termin "homologne" označava entitet koji ima određenu homologiju sa sekvencom predmetnog nukleotida. Ovde se termin "homologija" može izjednačiti sa "identitet".

[0023] U ovom kontekstu, se podrazumeva da homologna sekvenca uključuje nukleotidnu sekvencu koja može biti najmanje 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom roditeljskog bakterijskog soja (predmetne sekvence).

[0024] Poređenja homologije se mogu izvesti vizuelno ili još češće pomoću lako dostupnih programa za poređenje sekvenci. Ovi komercijalno dostupni kompjuterski programi mogu izračunati % homologije između dve ili više sekvenci. % Homologije se može izračunati preko susednih sekvenci, tj jedna sekvenca se poravna sa drugom sekvencom i svaka amino kiselina jedne sekvence se direktno poredi sa odgovarajućom aminokiselinom druge sekvence, jedne rezidue u datom trenutku. To se zove poravnavanje bez preklapanja. Obično, takva poravnavanja bez preklapanja se vrše samo na relativno manjem broju rezidua.

[0025] Iako je ovo vrlo jednostavan i konzistentan metod, on ne uzima u obzir da će, na primer, u inače identičnom paru sekvenci, jedna insercija ili delecija uzrokovati da sledeće aminokiselinske rezidue ne budu poravnate, što potencijalno dovodi do velikog smanjenja % homologije kada se vrši globalno poravnavanje.

[0026] Proračun maksimalnog % homologije zato prvo zahteva stvaranje optimalnog poravnavanja, uzimajući u obzir penale za praznine (eng. gap penalties). Pogodan kompjuterski program za obavljanje takvog poravnanja je vektor NTI (Invitrogen Corp.). Primeri softvera koji mogu da obavljaju poređenja sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, BLAST paket (vidi Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), BLAST 2 (vidi FEMS Microbiol Lett 1999174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999177 (1): 187-8), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol Biol 403-410) i AlignX na primer. Bar BLAST, BLAST 2 i FASTA su dostupni za offline i online pretraživanja (pogledajte Ausubel et al 1999, str 7-58 do 7-60). Poželjno, stepen identiteta u pogledu nukleotidne sekvence se utvrđuje na najmanje 20 susednih nukleotida, poželjno na najmanje 30 susednih nukleotida, poželjno na bar 40 susednih nukleotida, poželjno na najmanje 50 susednih nukleotida, poželjno na najmanje 60 susednih nukleotida, poželjno na najmanje 100 susednih nukleotida. Poželjno, stepen identiteta u pogledu nukleotidne sekvence se može odrediti na celom nizu.

[0027] Tradicionalno identifikacija bakterija na osnovu fenotipskih karakteristika obično nije precizna kao identifikacija zasnovana na genotipskim metodama. Poređenje bakterijske genske sekvence 16S rRNK je nastala kao poželjna genetska tehnika i omogućava da novi sojevi budu identifikovani poređenjem sekvenci sa poznatim bakterijskim DNK sekvencama, korišćenjem BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.giov/Blast .cgi). genska sekvenca 16S rRNK je univerzalna kod bakterija, pa se odnosi mogu meriti kod mnogih različitih bakterija. U principu, poređenje 16S rRNK sekvence omogućava diferencijaciju organizama na nivou roda za sve glavne podgrupe bakterija, pored klasifikacije sojeva na više nivoa, uključujući i nivoe vrsta i podvrsta. 16S rRNK genska sekvenca je utvrđena za veliki broj sojeva. GenBank, najveća baza podataka sekvenci nukleotida, ima preko 20 miliona deponovanih sekvenci, od kojih je preko 90.000 iz 16S rRNK gena. To znači da postoje mnoge ranije deponovane sekvence sa kojima se može porediti sekvenca nepoznatog soja.

[0028] Kako se ovde koristi, termin "16S rRNK identitet" se odnosi na procenat identiteta sa poznatim bakterijskim sojem. U jednom poželjnom rešenju, bakterijski soj ima 16S rRNK identitet od najmanje 99,5% sa sojem deponovanim pod gornjim pristupnim brojem.

[0029] Pronalazak takođe obuhvata mutirane sojeve koji se mogu dobiti iz gore navedenog deponovanog soja i sojeva koji pokazuju DNK-DNK homologiju od najmanje 95% i/ili 16S RNK identiteta od najmanje 99,5% sa sojem deponovanim pod gornjim pristupnim brojem.

[0030] U kontekstu ovog pronalaska, termin "DNK-DNK homologija" se odnosi na to koliko su srodna dva ili više zasebnih lanaca DNK, na osnovu njihove nukleotidne sekvence. Ovo se obično meri u smislu % njihovog identiteta. U jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj ima DNK-DNK homologiju od najmanje 95% sa sojem deponovanim pod gornjim pristupnim brojem.

[0031] U jednom vrlo poželjnom rešenju, bakterijski soj ima DNK-DNK homolognost od najmanje 95% i 16S rRNK identitet od najmanje 99,5% sa sojem deponovanim pod gornjim pristupnim brojem.

Terapeutske Primene

[0032] Još jedan aspekt aspekt pronalaska se odnosi na bakterijsku vrstu koja ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 1409 za upotrebu u medicini.

[0033] Još preciznije, bakterijski soj je za upotrebu u lečenju poremećaja izabranog od inflamatornog poremećaja, imunog poremećaja i crevnog poremećaja kod subjekta.

[0034] Kako se ovde koristi, termin "medikament" obuhvata lekove za humanu i životinjsku primenu u humanoj i veterinarskoj medicini. Pored toga, izraz "medikament" kako se ovde koristi, označava bilo koju supstancu, koja pruža terapeutsko i/ili blagotvorno dejstvo. Termin "medikament" kako se ovde koristi nije obavezno ograničen na supstance, koje zahtevaju tržišna odobrenja, ali može uključivati supstance koje, se mogu koristiti u kozmetici, nutraceutici, prehrani (uključujući npr. hranu i pića), probiotskim kulturama, dodacima ishrani i prirodnim preparatima. Pored toga, izraz "medikament" kako se ovde koristi obuhvata proizvod dizajniran za inkorporaciju u hranu za životinje, na primer stočnu hranu i/ili hranu za kućne ljubimce.

[0035] U jednom poželjnom izvođenju pronalaska, poremećaj je odabran od sledećeg: sindrom iritabilnog creva (IBS), kolitis, inflamatorna bolest creva (IBD), uključujući Kronovu bolest i ulcerativni kolitis, paučitis, funkcionalnu dispepsiju, funkcionalnu konstipaciju, funkcionalnu dijareju (uključujući sa antibioticima povezanu dijareju, putničku i pedijatrijsku dijareju), funkcionalni abdominalni bol, funkcionalnu nadutost, sindrom epigastričnog bola, postprandijalni distres sindrom, gastrointestinalnu refluksnu bolest (GERD), autoimune bolesti kao što su dijabetes, artritis, multipla skleroza i psorijaza, atopične bolesti npr. atopijski dermatitis, nekrotizirajući enterokolitis, druge infekcije, i njihove kombinacije.

[0036] U jednom naročito poželjnom izvođenju, poremećaj je inflamatorni poremećaj. Poželjno, ekspresija proinflamatornih gena je negativno regulisana kod subjekta-domaćina. Dalji detalji ovih istraživanja su predstavljeni u nastavku.

[0037] Još poželjnije, inflamatorni poremećaj je kolitis, još poželjnije, Kronova bolest, ulcerativni kolitis ili paučitis.

[0038] U jednom naročito poželjnom izvođenju, intestinalni poremećaj je IBS. Precizna patofiziologija IBS treba da bude rasvetljena. Nedavne studije su opisale mukozno zapaljenje i promene u intestinalnoj mikroflori kod IBS pacijenata i korelaciju bolesti sa crevnim infekcijama.

[0039] U jednom naročito poželjnom izvođenju, intestinalni poremećaj je IBD. Kod subjekta-domaćina se poželjno, povećava ekspresija gena barijere. Dalji detalji ovih istraživanja su predstavljeni u nastavku.

[0040] U jednom naročito poželjnom izvođenju, intestinalni poremećaj je Kronova bolest.

[0041] U jednom naročito poželjnom izvođenju, poremećaj je imuni poremećaj. Poželjno, imuni poremećaj je odabran od ulceroznog kolitisa, paučitisa, drugih autoimunih stanja uključujući reumatoidni artritis, psorijazu, multiplu sklerozu, alergije, uključujući celijakiju, atopični dermatitis i rinitis.

[0042] U jednom aspektu, bakterijski soj je za upotrebu u regulisanju imunog sistema subjekta. Poznato je da je imuna regulacija pomoću bakterijskih vrsta veoma specifična (8). Konkretno, imuno regulatorno delovanje Klastera XIVa i VI bakterija je veoma komplikovano i nezavisno od proizvodnje butirata (41).

[0043] U jednom poželjnom izvođenju, urođeni imuni sistem subjekta je modulisan.

[0044] U sledećoj poželjnoj varijanti, adaptivni imuni sistem subjekta je modulisan ka imunskoj regulaciji (a ne imunskoj aktivaciji, a samim tim i smanjenju inflamacije).

[0045] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi bakterijski soj za poboljšanje crevne flore kod subjekta.

[0046] Crevna flora se odnosi na mikroorganizme koji žive u probavnom traktu životinja domaćina. Ovi mikroorganizmi obavljaju raznovrsne metaboličke, strukturne, zaštitne i druge korisne funkcije. Kako se ovde koristi, "popravljanje crevne flore" se odnosi na povećanje broja i/ili ili vrste mikroorganizama prisutnih u crevima domaćina i/ili povećanje aktivnosti navedenih mikroorganizama u pogledu njihove metaboličke, strukturne, zaštitne i drugih korisnih funkcija.

[0047] Poželjno, bakterijski soj naseljava kolon i/ili ileum, poželjnije kolon.

[0048] U jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj reguliše ekspresiju najmanje jednog gena za mobilizaciju ili hemotaksu.

[0049] Još poželjnije, bakterijski soj pozitivno reguliše ekspresiju najmanje jednog gena za mobilizaciju ili hemotaksu. Još poželjnije, gen za mobilizaciju ili hemotaksu je odabran od MobA i MobL.

[0050] U sledećoj poželjnoj realizaciji, bakterijski soj reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog od FlaA1, FlaA2, Fla3 i FIaB.

[0051] Specifična serumska antitela za proteine FLA tipa su prisutna kod inflamatorne bolesti creva. Tako, u jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj je za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti creva.

[0052] U sledećoj poželjnoj realizaciji, bakterijski soj reguliše ekspresiju jedne ili više od sledećih: acetil-CoA acetiltransferaza, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenaza, butiril-CoA dehidrogenaza, beta podjedinica elektron-prenosnog-flavoproteina i alfa podjedinica elektron-prenosnog-flavoproteina.

[0053] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na bakterijsku vrstu koja ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 1409 za regulisanje urođenog imunog sistema subjekta.

[0054] Kako se ovde koristi, termin "urođeni imuni sistem", takođe poznat kao nespecifični imuni sistem, obuhvata ćelije i mehanizme koji obezbeđuju neposrednu odbranu domaćina od infekcije drugim organizmima na nespecifičan način. To znači da ćelije urođenog sistema prepoznaju i reaguju na patogene na generički način, ali za razliku od adaptivnog imunog sistema, on domaćinu ne pruža dugotrajan zaštitni imunitet.

[0055] Kako se ovde koristi, termin "reguliše urođeni imuni sistem" označava indukovanje aktivnosti urođenog imunog sistema i/ili povećanje nivoa aktivnosti u odnosu na osnovni nivo aktivnosti tako da promoviše homeostazu imunog sistema.

[0056] Gubitak ili poremećaj urođenih imunih funkcija, bilo zbog gubitka epitelne barijere, urođenih imunih peptida poput defensina, hemokina i citokina ili defektne TLR signalizacije su povezane sa povećanim rizikom od inflamatornih bolesti, u nekoliko organa u telu, uključujući creva. Takve bolesti uključuju inflamatornu bolest creva. Tako, u jednom veoma poželjnom izvođenju, Roseburia hominis je za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti creva.

[0057] U jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog od Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, ltln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20 , Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a. Mnogi od ovih gena su geni crevne barijere i antimikrobna sredstva pa samim tim deluju na smanjenje invazivnosti crevnih patogena a takođe i smanjuju broj živih patogena.

[0058] Još jedan aspekt ovog pronalaska se odnosi bakterijsku soj koja ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 1409 za regulisanje adaptivnog imunog sistema subjekta.

[0059]Kako se ovde koristi, termin "adaptivni imuni sistem", inače poznat kao "specifični imuni sistem" se odnosi na visoko specijalizovane sistemske ćelije i procese koji eliminišu ili sprečavaju rast patogena. Adaptivni imuni odgovor daje imunom sistemu kičmenjaka mogućnost da prepozna i pamti specifične patogene (za generisanje imuniteta), i za pokretanje još žešćih napada svaki put kada se patogen pojavi.

[0060] Kako se ovde koristi, termin "regulisanje adaptivnog imunog sistema" označava indukovanje aktivnosti adaptivnog imunog sistema i/ili promovisanje mehanizama imune homeostaze povećanjem nivoa aktivnosti u odnosu na osnovni nivo aktivnosti. Poželjno, adaptivni imuni sistem se moduliše ka imunskoj regulaciji (a ne ka imunskoj aktivaciji i samim tim i smanjenju inflamacije).

[0061] Nedostaci i poremećaji povezani sa adaptivnim imunim sistemom, koji su posebno povezani sa funkcijom T ćelija, su povezani sa brojnim inflamatornim i autoimunim bolestima. Odgovori T ćelija povezani sa Th1, Th2 i Th17 su povezani sa atopijskim, inflamatornim i autoimunim bolestima. Terapije koje poboljšavaju ili povećavaju T regulatorne (Treg) ćelijske populacije su važne u kontroli bolesti koje pokreću preterani Th1, Th2 i Th17 ćelijski odgovori.

[0062] U jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj aktivira najmanje jedan gen za imuni odgovor u kolonu ili ileumu.

[0063] U jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj reguliše adaptivni imuni sistem modulacijom ekspresije gena povezanih sa regulacijom T-ćelija, po mogućnosti u kolonu. Poželjnije, bakterijski soj indukuje T regulatorne ćelije (Treg). Porast broja Treg će sprečiti efekte drugih efektorskih T ćelija, kao što su Th1, Th17 i Th2 koje pokreću inflamaciju, autoimunost i alergijska/atopična stanja. Tako ovo svojstvo bakterijskog soja može biti iskorišćeno protiv mnogih bolesti kod kojih je narušena ravnoteža Teff/Treg ćelija, npr. Kronova bolest i ulcerozni kolitis

[0064] U jednom naročito poželjnom izvođenju, bakterijski soj pozitivno reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog od Ly6g6c i Ly6g6e u uzlaznom kolonu. Sniženje nivoa Ly6g6c i Ii6g6e povećava rizik od infekcija, kako creva tako i disajnih puteva i povezano je sa bolestima poput neutropenije. Tako, u jednom poželjnom izvođenju, bakterijski soj je za upotrebu u lečenju neutropenije.

[0065] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na bakterijski soj koja ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 1409 za upotrebu u održavanju imune homeostaze kod subjekta. Kako se ovde koristi "održavanje imune homeostaze" se odnosi na samoregulaciju imunog sistema za održavanje oralne tolerancije ili imune stabilnost kao odgovora na promene uslova. Oralna tolerancija se odnosi na normalne imune odgovore na hranu i komensalne bakterije u zdravim crevima. Oni se gube kod celijakije i inflamatornih bolesti creva kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis. Tako je u jednom naročito poželjnom izvođenju, bakterijski soj je za upotrebu u lečenju celijakije i inflamatornih bolesti creva kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis.

[0066] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na bakterijski soj koja ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijski sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 1409 za upotrenu u regulisanju apetita subjekta.

[0067] Kako se ovde koristi, "regulisanje apetita" se odnosi na sposobnost modulacije (na primer povećanje ili smanjenje) želje za domaćina za konzumiranjem hrane. Poželjno, bakterijski soj ispoljava stimulativno dejstvo na apetit domaćina negativnom regulacijom ekspresije gena povezanih sa supresijom apetita. Poželjno, bakterijski soj negativno reguliše ekspresiju najmanje jednog gena odabranog od Agt, Cartpt, Cck, Ckcl12 i Gcg. Poželjnije, bakterijski soj negativno reguliše, ekspresiju hormona sitosti Kck i Gcg.

[0068] Bakterijski soj iz ovog pronalaska takođe se može koristiti za profilaktičku primenu. U profilaktičkim aplikacijama, bakterijska vrsta ili kompozicije prema pronalasku se administriraju pacijentu podložnom, ili na drugi način pod rizikom od određene bolesti u količini koja je dovoljna da bar delimično smanji rizik od nastanka bolesti. Takva količina je definisana kao "profilaktički efikasna doza". Precizna količina zavisi od brojnih faktora specifičnih za pacijenta kao što je pacijentovo stanje zdravlja i težina.

[0069] Predmetni pronalazak je dalje opisan putem sledećih slika, gde:

Slika 1 prikazuje brojnost i lokalizaciju R. hominisa u uzlaznom kolonu. (A) R. Hominisomkolonizovan uzlazni kolon miša pokazuje blisku povezanost bakterija sa epitelom domaćina, pomoću A2-183 FISH probe. Originalno uvećanje x630. (B) PCR pomoću R. hominis-specifičnih prajmera je pokazala jak pozitivan signal post-kolonizacije u fekalnoj DNK, dok su fekalije GF životinja bile negativne na prisustvo bilo kakvih bakterija. (C) PCR analize u realnom vremenu pokazuju nivo kolonizacije R. hominis/mg izmeta.

Slika 2 prikazuje sekvencu i anotaciju R. hominis genoma. (A) R. hominis kružna mapa genoma sa lokacijom PCR eksperimenata naznačenim u regionima ciljanim targeted prajmerima. Trake na mapamagenoma, počev od spoljne trake 0, su: traka 0 - (plava) PCR eksperimenti u realnom vremenu označeni podeocima sa brojevima; traka 1 - (svetlo plava) Forward CDS; traka 2 -(svetlo plava) Reverse CDS; traka 3 - (plava) rRNK; traka 4 - (zelena) tRNA; traka 5 - (crvena) STS obeleženi regioni ciljani sa PCR u realnom vremenu; graf 1 - GC sadržaj; graf 2 - GC bias. (B) Funkcionalna anotacija genoma R. hominis.

Slika 3 identifikuje transkripte diferencijalno eksprimirane u R. hominis posle kolonizacije i adaptacije na creva miša. (A) Bakterijska RNK je izolovana iz sadržaja cekuma miša, obeležena bilo sa dCTP-Cy3 ili dCTP-Cy5 tokom sinteze cDNK i hibridizovana na micročip slajdovima sa naizmeničnim bojenjem (eng. dye-swap). Podaci su smatrani značajnim kada je količnik promene> 2 i P <0,05. 50 diferencijalno eksprimiranih gena (in vivo vs in vitro) je otkriveno analizom na mikročipu. (B) RT PCR validacija gena uključenih u transfer konjugacija /mobilizacija. (C) RT PCR validacija gena uključenih u Motilitet i Hemotaksu. (D) Western blot analiza sadržaja uzlaznog kolona imuno-obojenog sa afinitetno-prečišćenim Fla2 antitelom na 14d (traka 1: merdevine, trake 2-6: sadržaj iz creva životinja 1-5, trake 7-8: prazne, trake 9-10: R. hominis biomasa (pozitivna kontrola)). Slika R. hominis koja prikazuje flagelu (crne strelice) i (E) PCR u realnom vremenu za proveru gena uključenih u metabolizam butirata. (F) PCR analiza u realnom vremenu transkripta R. hominis tokom in vitro izlaganja humanim crevnim epitelnim ćelijama. Rezultati PCR u realnom vremenu su srednje vrednosti triplikata, *P<0.05, **P <0.01, ***P<0.001.

Slika 4 identifikuje transkripte diferencijalno eksprimirane u crevima miša nakon monoasocijacije sa R. hominisom. (A) Affymetrix analiza micro-čipa različito eksprimiranih gena R. Hominisom kolonizovanih miševa u odnosu na GF. Grafikoni sa stupcima predstavljaju broj više i manje eksprimiranih gena nakon 14. i 28. dana. (B) Toplotna karta dobijena iz različito eksprimiranih gena sa funkcionalnom značajnosšću - između GF i R. hominis-kolonizovanih miševa na dan 14 i dan 28. Kolone predstavljaju pojedinačne mikro-čipove, i redove specifičnih gena od interesa. Z-skor odslikava odstupanje, standardnih devijacija od srednje vrednosti. Relativna vrednost za svaki gen je izražena intenzitetom boje, sa zelenom koja ukazuje na veću eksprimiranost i crvenom koja pokazuje manju eksprimiranost. (C) RT-PCR validacija gena je pokazala značajnost razlike između R. hominis-kolonizovanih i GF miševa. Rezultati PCR u realnom vremenu su srednje vrednosti triplikata, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Slika 5 prikazuje ekspresiju i lokalizaciju markera T ćelija u kolonu. Imunofluorescencija i analiza ćelija lamine proprie obeleženih sa anti-Ly6G (A), anti-CD3 (B) i anti-CD11b (C) u lamini propria kod GF miševa i R. hominisom-tretiranih miševa. * P <0.05.

Slika 6 prikazuje anti-inflamatorne efekte R. hominisa u eksperimentalnom modelu kolitisa. IL-10KO miševi su dozirani tri puta nedeljno tokom 14 nedelja. (A) Netretirani IL-10KO miševi su imali snažan porast svih gena u odnosu na divlji tip miševa, dok je diferencijalna ekspresija gena niža kod R. hominisom tretiranih životinja. Rezultati RT PCR su srednje vrednosti triplikata, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (B) Telesne težine netretiranih IL-10KO i R. hominisom-tretiranih IL-10KO životinja na kraju ispitivanja. (C) Uzlazni kolon (obojen hematoksilinom/eozinom) IL-10KO i R. hominisom-tretiranih IL-10KO životinja. Originalno uvećanje x100.

Slika 7 prikazuje RT PCR analizu iRNK nivoa IL-10, IL-17 i IFN-i. PCR u realnom vremenu je izvedena na tkivu uzlaznog kolona za merenje markera T ćelija. Rezultati PCR u realnom vremenu su srednje vrednosti triplikata, *P<0.05, **p<0,01.

Slika 8 prikazuje efekte mono-asocijacije GF miševa sa R. hominisom na kompoziciju telesne mase. Izvedena je analiza suve telesne mase i analiza lipida trupa. (A) Težine suvog trupa sa R. hominisom-asociranih miševa su bile znatno veće u odnosu na GF životinje. (B) Dalja analiza lipida trupa je pokazala da je ukupna gojaznost takođe znatno veća kod R. hominisomtretiranih životinja u 14d.

Slika 9 ilustruje poređenje podataka ekspresije gena za tri soja bakterija iz Cluster-a XIVa (Firmicutes), odnosno Roseburia hominis, E.rectale i Roseburia intestinalis.

Slika 10 prikazuje da Roseburia hominis izaziva A20, negativni regulator NF-kB signalizacije uz snažnu antiinflamatornu aktivnost, dok drugi sojevi bakterija nisu imali nikakav uticaj. Flagelinski deo Roseburia hominisa (FLA1 u R. hominis) takođe indukuje A20 za razliku od srodne bakterije Eubacterium rectale. Preciznije, Slika 10 prikazuje višestrukost indukovanja A20 za E. rectale, R. hominis, FLA od E. rectale, FLA1 od R. hominisa, EAV9, FLA od SV1400 u odnosu na kontrole.

Slika 11 prikazuje Distribuciju Subsistema u Kategorije za R. hominis A2-183 određenu pomoću RAST-a, koja prikazuje funkcionalne Subsisteme i broj gena u svakoj subkategoriji.

Slika 12 prikazuje Distribuciju Subsistema u Kategorije za R. inulinivorans DSM 16841 A2-183 određenu pomoću RAST-a, koja prikazuje funkcionalne subsisteme i broj gena u svakoj subkategoriji.

Slika 13 prikazuje Distribuciju Subsistema u Kategorije za R. intestinalis L1-82 određenu pomoću RAST-a, koja prikazuje funkcionalne subsisteme i broj gena u svakoj subkategoriji.

Slika 14 prikazuje Distribuciju Subsistema u Kategorije za R. intestinalis M50/1 određenu pomoću RAST-a, koja prikazuje funkcionalne subsisteme i broj gena u svakoj subkategoriji.

Slika 15 prikazuje Distribuciju Subsistema u Kategorije za Eubacterium rectale ATCC 33656 određenu pomoću RAST-a, koja prikazuje funkcionalne subsisteme i broj gena u svakoj subkategoriji.

R. hominis prvenstveno naseljava kolon

[0070] Zdravi odrasli C3H/HEN germfree (GF) miševi su inokulisani sa tri gavaže R. hominisa na uzastopne dane. Uspešna kolonizacija je postignuta primenom medijuma za inokulaciju koji sadrži 3% askorbinske kiseline i 2% cisteina za zaštitu bakterija od izloženosti kiseoniku. Analiza tkiva creva fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) otkrila je da je R. hominis kolonizovao ileum i kolon, ali je pronađen u mnogo većem broju u kolonu. Pronađeno je da su bakterije usko povezane sa mukozom kolona (Sl.1A). Kolonizacija je dodatno potvrđena i kvantitativno određena pomoću PCR-a R. hominisspecifičnih prajmera u brojevima aproksimativno 1x10<10>bakterija/g fekalija (Sl.1B i 1 C). Fekalije GF životinja su bile negativne na prisustvo bilo kakvih bakterija.

R. hominis genom otkriva jedinstvene gene koji promovišu interakcije domaćina

[0071] Kompletna genomska sekvenca R. hominis A2-183 je razjašnjena (Sl.2A), što je predstavljeno jednim 3.592, 125-bp hromozomom (Sl.2B). Automatska i ručna anotacija genoma korišćenjem RAST platforme je otkrila prisustvo četiri ribozomalna operona, 66 RNK i 3,273 predviđena proteina. Najveća grupa gena je pripadala Subsistemskoj Kategoriji ugljenih hidrata (271 gena), koji kodiraju proteine uključene u metabolizam ugljenih hidrata, zatim sledi Metabolizam Proteina (197) i Amino kiseline i Derivati (175) (Sl.2B). Druge važne funkcionalne kategorije su uključivale Motilitet i Hemotaksu (49) i Dormanciju i Sporulaciju (12). Komparativna analiza genoma je utvrdila da je najbliži srodnik u pogledu strukture i funkcije genoma između kompletnih bakterijskih genoma, Eubacterium rectale (12), što nije iznenađujuće s obzirom na blisku taksonomsku povezanost ovih organizama (11, 13). Komparativna rekonstrukcija ova dva genoma sa 1.095 gena je otkrila da se razlikuju za oko 25% gena. Konkretno, ove razlike su obuhvatale gene koji kodiraju važne funkcije za interakciju sa domaćinom. Na primer, geni za Motilitet i Hemotaksu koji kodiraju tip IV fimbrijalne proteine PiIB i PiIC su bili prisutni u E. rectale ali ih nije bilo u R. hominis, dok su flagelarni bazalni štapićasti protein FIGC, flagelarni kompleksni protein FliE, flagelin protein FlaB i flagelarni motor switch protein FliG bili karakteristični za R. Hominis. Dva bakterijska genoma se takođe razlikuju za 42 gena za ugljene hidrate, što odražava njihove divergentne nutritivne zahteve.

R. hominis reaguje na crevnu sredinu pozitivnim-regulisanjem gena za mobilizaciju i hemotaksu

[0072] Za određivanje diferencijalno eksprimiranih gena pomoću R. hominisa kao odgovor na udruživanje sa domaćinom i ishranu, genski mikročip je konstruisan korišćenjem 6.000 PCR fragmenata iz biblioteke malih inserata za sekvenciranje. Kasnija RT PCR validacija je izvedena na 42 diferencijalno eksprimirana gena koji klasteruju u specifičnim regionima genoma R. hominis kao što je prikazano na Sl.2B. Da se napravi razlika između delovanja crevne sredine i dijetetskih komponenti, bakterijska RNK je izolovana u četiri različite vrste eksperimentalnih uslova: (I) in vivo, iz cekuma mono-asociranih miševa; (ii) in vitro, iz bakterija gajenih u medijumu kulture; (iii) in vitro, iz bakterija gajenih u prisustvu dijetetskih komponenti; i (iv) iz bakterija inkubiranih na površini konfluentnih Caco-2 i HT-29 ćelija.

[0073] Pedeset diferencijalno eksprimiranih gena je identifikovano (in vivo vs in vitro) (Sl.3A). Najviše je iznenadilo otkriće izuzetno visoke pozitivne regulacije in vivo gena uključenih u transfer konjugacija/ mobilizacija mobA- i mobL-sličnih gena (Sl.3B). Prisustvo takvih gena u studijama transkripcije je bilo iznenađujuće pošto nijedan prepoznatljiv gen nije bio dodeljen Fagima, Profagima, Transpozabilnim elementima i Plazmidima na prikazu Kategorija Subsistema. Ova razlika u otkrivanju i raspodeli gena je verovatno zbog poznatih ograničenja anotacije Subsistema u Kategorije. Stimulativni efekat dijetetskih jedinjenja je bio mnogo manje izražen, sugerišući da je crevna sredina per se glavni induktor gena uključenih u horizontalni transfer gena.

[0074] Drugi crevnim okruženjem-indukovani subsistemi su uključivali Membranski Transport, naročito transport magnezijuma, i Motilitet i Hemotaksu uključujući multiple hemotaksične proteine koji vezuju metil grupu (eng. methyl-accepting chemotaxis proteins) i gene flagelarnih operona (sl.3C). R. hominis poseduje više gena za flagelin flaA1, flaA2, flaA3 i flaB i zanimljivo gajenje u crevima miša je promovisalo ekspresiju flagelina u ovoj bakteriji kao što se vidi iz western-blot testa bakterija izolovanih iz miševa kolonizovanih in vivo sa R. hominis-specifičnim flagelinskim antitelima (Sl. 3D). Ovo je u skladu sa prethodnim izvještajima koji ukazuju na to da samo određene podgrupe Firmikuta proizvode flagele in vivo (14).

Ne iznenađuje što je ekspresija gena kataboličkog metabolizma u R. hominisu u crevnom okruženju bila uglavnom pod uticajem dijetetskih jedinjenja (sl.3e). Geni koji su bili uključeni obuhvataju acetil-CoA acetiltransferazu, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenazu, butiril-CoA dehidrogenazu i fosfoenolpiruvat karboksikinazu [ATP]. Iako je regulacija ovih gena uglavnom pokretana ishranom, u kasnijoj fazi uzorkovanja, bio je očigledan i uticaj domaćina. Neočekivano, okruženje domaćina je negativno regulisalo neke gene koji učestvuju u metabolizmu supstanci koje potiču od domaćina poput glukuronata, koji je uobičajen u ugljenohidratnim lancima mukoznih proteoglikana.

[0075] Za dodatno ispitivanje uticaja adaptacije domaćina na transkriptome R. Hominisa, izvršena je in vitro stimulacija humanih intestinalnih epitelnih ćelija (Caco-2 i HT-29). Ovo je pokazalo da je transfer gen za konjugaciju/mobilizaciju mobA/mobL protein1, koji je indukovan adaptacijom na creva miša, takođe povećan kod obe ćelijske linije (Sl.3F). U skladu sa podacima in vivo, flagelin gen MotA je pozitivno regulisan u Caco-2 ćelijama. Geni uključeni u metabolizam butirata su pokazali razliku između dve ćelijske linije, sa negativnom regulacijom u Caco-2 ćelijama i pozitivnom regulacijom u HT-29 ćelijama.

R. hominis utiče na puteve T ćelija uglavnom u kolonu

[0076] Kolonizacija GF miševa sa R. hominisom je bila u korelaciji sa povećanom ekspresijom gena u crevima koja je bila najviša u kolonu. (Sl.4A). Diferencijalna ekspresija je najizraženija na 28d posle kolonizacije, sa 159 pozitivno regulisana gena i 143 negativno regulisana gena. Broj diferencicijalno eksprimiranih gena u ileumu na 14d je bio sličan onom u uzlaznom kolonu, sa 79 pozitivno regulisanih gena i 119 negativno regulisanih gena. Diferencijalna ekspresija u ileumu je bila veoma niska na 28d, u skladu sa smanjenim nivoima kolonizacije. Odgovor transkriptoma se razlikovao u dve vremenske tačke, kao što pokazuje jasno razdvajanje značajnih transkripta u analizi toplotnim kartama (sl.4B). Na Sl.4C je prikazana pozitivna validacija Affimetrix podataka pomoću PCR u realnom vremenu.

[0077] Većina puteva pogođenih na 14d u ileumu i uzlaznom kolonu su grupisani u kategorije ćelijske diferencijacije, regulacije ćelijskog ciklusa i remodelovanja tkiva. Što je značajno, imuni odgovor je bio glavna grupa puteva indukovana u uzlaznom kolonu na 28d. 36 značajno pogođenih puteva u ovoj kategoriji su bili uglavnom uključeni u funkcionisanje T ćelija i IL-10 signalni put, ICOS put T ćelijapomagača i regulaciju funkcije T ćelija pomoću CTLA-4. Geni koji su uključeni u ove puteve su pokazali i pozitivnu i negativnu regulaciju, tako da dok je na ove puteve značajno uticalo prisustvo R. hominisa, precizni neto funkcionalni uticaj na diferencijaciju T ćelija zahteva dalje istraživanje. Međutim, poboljšani IL-10, CD3ε i IL-13 i promenjena ekspresija IFN-γ je potvrđena pomoću PCR u realnom vremenu (Sl.7), što ukazuje da kolonizacija R. hominisa može da favorizuje Treg i Th2 puteve ćelijske diferencijacije. Za dobijanje dodatnih informacija o funkcionalnoj klasifikaciji diferencijalno regulisanih gena je primenjena Analiza genske ontologije. GO-proces za 'polimerizaciju aktina' (GO: 0030041) (Arpc3, Capg, Cdc42ep5 i Rhoc) je pozitivno regulisana na 28d u kolonu kod R. hominisom kolonizovanih miševa (Sl 8.). Polimerizacija Aktina pri imunoj sinapsi je potrebna za aktivaciju T ćelija i efektorsku funkciju. Indukcija gena je dodatno potvrđena pomoću RT PCR (Sl. 4C). Sveukupno, ovi podaci ukazuju da R. hominis aktivno utiče na adaptivni imuni odgovor u debelom crevu tako što pozitivno utiče na regulaciju T ćelija.

[0078] U vezi sa ovim rezultatima je indukcija članova Ly6 porodice u uzlaznom kolonu. Konkretno, GPI-vezani genski produkt Ly6g6c je bio 25-tostruko pozitivno regulisan, a odgovarajući gen Ly6g6e je bio dvostruko pozitivno regulisan na 28d. Većina hematopoetskih ćelija eksprimiraju jedan ili više članova porodice Ly6 uključujući neutrofile i plazmacitoidne dendritične ćelije. Zatim je predložena moguća uloga Ly6 u aktivaciji, diferencijaciji i maturaciji T ćelija (15).

[0079] Imunocitohemija je potvrdila povećano prisustvo Ly6G<+>, CD11b<+>i CD3<+>ćelija u R. hominisomkolonizovanim miševima (sl.5). U skladu sa podacima koji pokazuju da T ćelijskim putevima uglavnom dominiraju Treg odgovori, je statistički značajan porast dvostruko pozitivnih CD3<+>FoxP3<+>T ćelija u debelom crevu kod R. hominisom-inokulisanih miševa. Jasno kolonizacija R. hominisom, kao pojedinačnom bakterijskom vrstom, je indukovala značajan porast u populaciji CD3<+>FoxP3<+>ćelija, naročito u kolonu ovih miševa.

R. hominis moduliše gene za urođeni imunski odgovor u ileumu i kolonu i slabi kolitis kod IL10KO miševa

[0080] Geni uključeni u prirodni imunitet i funkciju crevne barijere su značajno indukovani prisustvom R. hominisa u uzlaznom debelom crevu. GO-proces "urođeni imuni odgovor' (GO:0045087) je bio pozitivno regulisan i uključivao je TLR-povezane gene Tlr5, Tlr1 i Vnn1. Pozitivna regulacija Tlr5 je bila zanimljiva, posebno s obzirom na odgovarajuću indukciju flagelarnih gena i prisustvo flagelin proteina u R. hominisu u toku kolonizacije creva, i može podrzumevati ulogu ovog urođenog signalnog puta u posredovanju drugim urođenim i adaptivnim imunološkim odgovorima. Povezanost između TLR5 signalizacije i ćelijskih odgovora CD4+T, je nedavno pokazana za flagelatne patogene (16). Slično, je pokazana uloga TLR2 u olakšavanju kolonizacije Bacteroides fragilis, Treg propagacije i imune homeostaze (17).

[0081] Drugi urođeni imuni geni u kolonu na koje je uticao R. hominis uključuju antimikrobne peptide Defb37, Pla2g3, Muc16 i ltln i gene za funkciju crevne barijere Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3 i Magi3. Geni za urođeni imunitet koji pokazuju pozitivnu regulaciju u ileumu u odgovoru na R. hominis uključuju Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a. Zanimljivo Pcgf2 negativno reguliše ekspresiju različitih citokina, hemokina, i hemokinskih receptora i može da igra važnu ulogu u kontroli inflamatornih odgovora u crevnim tkivima kao odgovor na ovu komensalnu bakteriju. Zanimljivo je takođe da smo pokazali negativnu regulaciju NF-kB puta (GO: 0043124) pomoću R. hominisa koji, kao i B. thetaiotaomicron (19), može da doprinese imunoj homeostazi negativnom regulacijom ove inflamatorne kaskade.

[0082] IL-10 nokaut mišji model je korišćen za testiranje terapeutske efikasnosti R. hominisa, zbog kontrole inflamatornih puteva kao i pozitivnih efekata na indukciju Treg kod mono-asociranih miševa. Nakon odvikavanja od sisanja sa 20d starosti, miševi su dozirani (~50 µL, 10<10>CFU) tri puta nedeljno u periodu od 14 nedelja. Ekspresija gena panela pro-inflamatornih biomarkera je pokazala da su netretirani IL-10KO miševi imali jak porast svih ispitivanih gena u odnosu na divlji tip miševa sa indukcijom gena u rasponu od 4- do 49-puta (Sl.6A). Indukcija pro-inflamatornog gena je bila značajno niža kod R. hominis tretiranih u poređenju sa netretiranim miševima, ukazujući na snažne terapeutske prednosti oralne administracije R. hominisa. Telesne mase R. hominis-tretiranih životinja su takođe veće na kraju studije u poređenju sa netretiranim životinjama, i ovaj efekat je statistički značajan kod mužjaka (Sl. 6B). Konačno, histološka analiza je pokazala prisustvo ozbiljne inflamacije u uzlaznom kolonu netretiranih IL-10KO, dok su R. hominisom-tretirane životinje imale relativno naizgled zdravu mukozu kolona.

R. hominis kolonizacija utiče na gene za sitost i telesnu kompoziciju

[0083] Takođe je evidentno značajno metaboličko delovanje R. hominisa kod mono-asociranih miševa. GO-procesi "negativne regulacije odgovora na hranu' (GO: 0032096), negativne regulacije apetita" (GO: 0032099) i 'regulacije lučenja kateholamina' (GO: 0050433) su svi negativno regulisani u uzlaznom kolonu nakon kolonizacije sa R. hominisom. Ovi podaci ukazuju da R. hominis ispoljava stimulativno dejstvo na apetit domaćina. Geni koji su uključeni u ovaj proces su AGT, Cartpt, KZK i Ckcl12, sa višestrukim promenama u rasponu od 2 do 12 puta. Cck, posebno, igra veliku ulogu u varenju i sitosti kao supressant gladi. Gcg je takođe pokazao negativnu regulaciju na ovom mestu u crevima.

[0084] Da se utvrdi da li su te genetičke promene imale fiziološki značaj u pogledu unosa hrane i telesne kompozicije, izvršena je analiza mase suvog trupa i analiza kompozicije. Zanimljivo, težine suvog trupa sa R. hominisom-asociranih miševa su bile mnogo veće u odnosu na GF životinje, a razlike su bile najprimetnije na dan 14. Dalja analiza lipida trupa je pokazala da je ukupna gojaznost takođe značajno veća kod R. hominisom-tretiranih životinja na 14d. Ovi nalazi su u skladu sa nedavnim podacima koji otkrivaju ulogu Firmikuta u energetskom bilansu kroz fermentaciju hrane, ali i podržavaju ideju da crevne bakterije u stvari modulišu osovinu mozak-creva i hormone za regulaciju apetita.

Diskusija

[0085] Dugoročna zajednička evolucija domaćina i mikroba u simbiozi je verovatno vođena izborom funkcionalno značajnih vrsta bakterija u crevima, od kojih većina nije mnogo zastupljena u drugim ekosistemima. Trenutno, postoje ograničene informacije o doprinosu pojedinih članova zajednice mikroba crevnoj funkciji, posebno u vezi sa razvojem mukoznog imunog sistema.

[0086] Noviji rad koji je koristio model reverzibilne kolonizacije zasnovan na E. coli (HA 107) je pokazao da su žive bakterije potrebne u brojevima koji se približavaju 10<8>CFU po gramu sadržaja za indukovanje imunskih efekata na IgA (20). Nedavno su ispitivane specifične funkcije SFB i Bacteroides fragilis u crevima miša da se definišu njihovi individualni doprinosi biologiji T ćelija i obe bakterije su se pokazale kao moćni induktori Treg i Th17 ćelija (5, 8, 9). Uticaj pojedinih članova klastera XIVa Firmikute ranije nisu bile prijavljene, iako je primećeno njihovo prisustvo u ASF, koje takođe utiče na diferencijaciju T ćelija (10).

[0087]Podnosilac prijave je ovde pokazao prvu uspešnu mono-asocijaciju creva germ-free miševa sa anaerobnom bakterijom, R. hominis, koja je član Firmicutes phylum. Ekstremna osetljivost bakterije na kiseonik kao što ima Roseburia zahteva striktne tehnike anaerobne kultivacije, što otežava obavljanje funkcionalne karakterizacije. Podnosilac prijave je uspostavio stabilnu mono-kolonizaciju R. hominisa u germfree miševima i izvršio kompletnu anotaciju genomske sekvence da otkrije njenu metaboličku organizaciju, fiziologiju i simbiotička svojstva. Utvrđeno je da se transkripcioni odgovori R. hominisa nakon kolonizacije mogu pripisati kako sredini u crevima domaćina tako i ishrani. Od strane domaćina pokretani efekti su dominirali u odgovoru R. Hominisa nakon mono-asocijacije. Ovo uključuje transfer gena, membranski transport, subsisteme hemotakse i siteme za motilitet. Jaka pozitivna-regulacija gena uključenih u transfer mobilizacijom podržava stav da je crevna sredina veoma pogodna za horizontalnu razmenu gena između članova crevne mikroflore. Tako, ova sredina može da ubrza diseminaciju gena značajnih za preživljavanje bakterija, kolonizaciju i funkcionisanje unutar crevnog ekosistema.

[0088] Uloga pokretljivosti i flagelarnog aparata u kolonizaciji domaćina je dobro objašnjena za patogene bakterije, ali mnogo manje se zna o ulozi flagelarnih proteina kod komensalnih bakterija. In vivo eksperimenti su otkrili stimulativni efekat crevnog okruženja domaćina na ekspresiju gena za flagelin. TLR5 receptori domaćina prepoznaju signale za flagelin (24) a mnoge patogene strukture flagelina indukuju jake proinflamatorne odgovore (24). Signalizacija preko TLR5 kao odgovor na rezidentne komensalne bakterije koje imaju flagelu može biti važna za homeostazu, pošto delecija TLR5 dovodi do spontanog kolitisa kod miševa (25). Pojačana ekspresija flagelina R. hominisa in vivo je stoga od potencijalnog interesa. Drugi rad je pokazao da E. coli mutanti za flagelin imaju prednost u odnosu na kolonizaciju sojeva divljeg tipa, verovatno zbog nedostatka urođenog prepoznavanja putem TLR5 signalizacije (26, 27). Podnosilac prijave je pokazao da je za određene Firmicute, pozitivna regulacija flagelina prirodni odgovor na kolonizaciju creva. R. hominis flagelin protein je i dalje eksprimiran in vivo i u korelaciji je sa neprekidnom kolonizacijom, odsustvom otvorene upale i ekspanzijom T ćelija regulatornog fenotipa. Stoga, strukture komensalnih flagelina preko TLR5 mogu pomoći direktnim odgovorima imune tolerancije. Dodatni podaci na osnovu TLR5KO i flagelin mutanata R. hominisa će dodatno pojasniti značaj komensalnih flagelina u vezi imune homeostaze ali uočeno zaštitno dejstvo R. hominisa kod IL-10 KO miševa podržava ovu hipotezu, i ako druge signalne grupe poput butirata takođe mogu da doprinesu imunoj regulaciji.

[0089] Ustanovljena je jasna uloga R. hominisa u promovisanju funkcije crevne barijere i prirodnog imuniteta u kolonu miša. Čvrsti spojevi, pukotinasti spojevi i adherentni spojevi deluju tako da ograniče bakterijsku translokaciju u subepitelijalni sloj (28). I Kronova bolest i ulcerativni kolitis karakteriše gubitak funkcije barijere i integriteta čvrstih spojeva. Zanimljivo disbioza crevne mikroflore u IBD je povezana sa smanjenjem Firmikuta (1, 29). Konstatacija da R. hominis aktivno pojačava ekspresiju gena barijere sugeriše da njihov gubitak kod IBD pacijenata može biti funkcionalno značajan. Aktivacija kompleksa čvrstih spojeva nije samo privilegija R. hominisa; drugi komensali, poput Bacteroides thetaiotaomicron i Lactobacillus acidophilus takođe mogu popraviti funkciju mukozne barijere (18, 30), podrazumevajući probiotske mogućnosti ovih bakterija kod humanog IBD.

[0090] Delovanje R. hominisa na imunološki sistem creva je intrigantno. Najjači efekti su uočeni u uzlaznom kolonu a geni poput Ly6g6c su snažno pozitivno regulisani kao i putevi uključeni u regulaciju i diferencijaciju T ćelija i polimerizaciju aktina u imunoj sinapsi, koje su uključene u aktivaciju T ćelija i efektorske funkcije. Iako ekspresija Treg gena u odgovoru na kolonizaciju R. hominisa nije bila veoma jaka, najviše pogođeni putevi T ćelija su uključivali one vezane za IL-10, ICOS i CTLA-4, koji su uključeni u podršku diferencijacije Treg. Značajno podnosilac prijave je mogao da demonstrira značajan porast CD3<+>FoxP3<+>ćelija u kolonima ovih miševa. Ovi nalazi dopunjuju poslednje podatke za druge Clostridium vrste koje pokreću diferencijaciju Treg. Jasno, R. hominis može promovisati ekspanziju T ćelija u mukozi i uticati na diferencijaciju Tćelija.

[0091]Bilo je zanimljivo uočiti jake imune efekte u debelom crevu u odnosu na ileum, posebno na dan 28 posle mono-kolonizacije R. Hominis-om. Transkriptomski podaci na dan 14 ukazuju na to da je u tom trenutku mogao biti pokrenut neki imuni „priming“ u ileumu. Uticaji na različite podskupove T ćelija u uzlaznom kolonu na dan 28 tako odražavaju recirkulaciju i homing ćelija iz ileuma u mezenterični limfni čvor kolona.

[0092] Interesantan dodatni biološki uticaj kolonizacije R. hominisom je regulacija gena koji utiču na odgovor na hranu i kontrolu apetita. Posebno, su značajno smanjeni hormoni sitosti Cck i Gcg. Uticaji Cck na unos hrane su posredovani preko vagusnog aferentnog puta. Ovo je glavni nervni put kojim informacije o unetim hranljivim materijama stižu do centralnog nervnog sistema kako bi uticale na funkciju creva i hranjenje. Cck deluje na vagusni sistem za smanjenje ekspresije molekula koji stimulišu apetit i hranjenje, i na povećanje ekspresije molekula koji inhibiraju hranjenje i smanjuju apetit (u ovoj studiji, i Npy2r i Cartpt su dvostruko negativno regulisani). Do sada nije prijavljeno da postoji veza između Cck, Gcg i komensalnih bakterija, međutim, i masne kiseline i proteini su moćni induktori Cck i Gcg (31). R. hominis proizvodi masne kiseline kratkog lanca poput butirata sa alifatičnim lancima sa manje od šest ugljenika; prijavljeno je da ova metabolička aktivnost smanjuje stimulativno dejstvo na plazmu Cck uočenu kod masnih kiselina sa dužim lancem (32). Zanimljivo, analiza težine trupova je otkrila da su telesna težina i sadržaj lipida zaista značajno povećani sa R. hominisom, što je u skladu sa povećanjem telesne mase primećene kod konvencionalizacije germfree miševa (33). Da li je ovo direktan uticaj smanjenja hormona sitosti kao što se vidi u ovoj studiji, ostaje da se vidi, pošto učešće Cck i Gcg do sada nije bilo prijavljeno. Međutim, važno je da se kaže da je prethodno pokazano da postoji veza između kolonizacije mikroflore i energije dobijene iz hrane, delimično kroz oslobađanje SCFA (34). S obzirom da je R. hominis veliki proizvođač butirata, ovaj mehanizam verovatno doprinosi metaboličkoj efikasnosti uočenoj nakon tretmana R. hominisom.

[0093] Ukratko, mono-asocijacija creva miša sa R. hominisom je indukovala snažnu dvosmernu ekspresiju gena u skladu sa promenama u membranskom transportu bakterija, hemotaksiji i pokretljivosti ove bakterije prilagođene na creva i istovremenu aktivaciju urođenog i adaptivnog imunog sistema domaćina. Ova metabolički aktivna bakterija je i značajno uticala na apetit i gene sitosti što je u korelaciji sa pojačanom telesnom težinom kolonizovanih miševa.

Kompozicije

[0094] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na kompoziciju koja sadrži bakterijski soj kako je opisano u patentim zahtevima i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili diluent. Pogodni ekscipijensi, diluenti i nosači su opisani dalje u tekstu.

[0095] Kompozicija može da bude bilo koja kompozicija, ali je poželjno da se kompozicija može primenjivati oralno, enteralno ili rektalno. Na primer, kompozicija može biti jestiva kompozicija. "Jestivo" označava materijal koji je odobren za ljudsku ili životinjsku konzumaciju.

[0096] Još jedan aspekt pronalaska se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotsku vrstu bakterija kao što je opisano u patentim zahtevima.

[0097] Kako se ovde koristi, termin "probiotik" označava ćelijske preparate ili komponente ćelija mikroba sa blagotvornim delovanjem na zdravlje ili blagostanje domaćina. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol.1999:10107-10).

[0098] Poželjno, probiotska kompozicija je oralno primenljiva kompozicija metabolički aktivnih, tj, živih i/ili liofilizovanih ili nevijabilnih termički ubijenih, ozračenih ili liziranih probiotskih bakterija. Probiotska kompozicija može sadržati i druge sastojke. Probiotska kompozicija iz pronalaska može biti davana oralno, na primer u obliku tablete, kapsule ili praha. Za R. hominis su preporučljivi kapsulirani proizvodi pošto su anaerobni. Drugi sastojci (Kao što je vitamin C, na primer), mogu biti uključeni kao skavendžeri kiseonika. Prebiotski supstrati kao što su oni koji poboljšavaju kolonizaciju i preživljavanje in vivo. Alternativno, probiotska kompozicija iz pronalaska se može ordinirati oralno kao hrana ili prehrambeni proizvod, kao što je fermentisani mlečni proizvod na bazi mleka ili surutke, ili kao farmaceutski proizvod.

[0099] Pogodna dnevna doza probiotskih bakterija je od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje formiraju kolonije (CFU), poželjno od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<10>CFU, još poželjnije od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.

[0100] U jednom poželjnom ostvarenju, kompozicija kao aktivne sastojke sadrži bakterijski soj i/ili njihove ćelijske komponente, u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na težinu kompozicije, poželjno od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. Doza može biti 1 g, 3 g, 5 g, i 10 g.

[0101] Tipično, probiotik je opciono kombinovan sa najmanje jednim pogodnim prebiotskim jedinjenjem. Prebiotik je obično nesvarljiv ugljeni hidrat kao što je oligo- ili polisaharid, ili šećerni alkohol, koji se ne degradira ili apsorbuje u gornjem digestivnom traktu. Poznati prebiotici uključuju komercijalne proizvode, kao što su inulin i transgalakto-oligosaharidi.

[0102] Poželjno, kompozicija iz ovog pronalaska obuhvata prebiotik u količini od oko 1 do oko 30% težinskih, u odnosu na ukupnu težinu kompozicije, poželjno od 5 do 20 težinskih%. Poželjni ugljeni hidrati su izabrani od: frukto-oligosaharida (ili FOS), frukto-oligosaharida kratkog lanca, inulina, izomalt-oligosaharida, pektina, ksilo-oligosaharida (ili XOS), hitozan-oligosaharida (ili COS), betaglukana, gumi arabike, modifikovanog i otpornog skroba, polidekstroze, D-tagatoze, akacija vlakna, rogača, ovsa, i citrus vlakna. Posebno poželjni prebiotici su frukto-oligosaharidi kratkog lanca (zbog jednostavnosti prikazani u nastavku kao FOSs-c.c); pomenuti FOSs-c.c. nisu svarljivi ugljeni hidrati, obično se dobijaju konverzijom šećerne repe i uključuju molekul saharoze za koji su vezana tri molekula glukoze.

Hraniva/proizvodi

[0103] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na prehrambene proizvode, dodatke ishrani, nutraceutike, nutritivne formule, pića i lekove koji sadrže bakterijski soji kako je gore definisano, i njihovu upotrebu.

[0104] U jednom poželjnom ostvarenju, kompozicija dodatno sadrži bar još jednu drugu vrstu food grade bakterija, pri čemu je food grade bakterija poželjno izabrana iz grupe koju čine bakterija mlečne kiseline, bifidobakterija, propionibakterija ili njihove mešavine.

[0105] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na prehrambeni proizvod koji sadrži gore definisani bakterijski soj. Izraz "prehrambeni proizvod" ima za cilj da obuhvati sve jestive proizvode koji mogu biti čvrsti, želirani ili tečni. Pogodni prehrambeni proizvodi mogu uključivati, na primer, funkcionalne prehrambene proizvode, prehrambene preparate, hranu za kućne ljubimce, stočnu hranu, zdravu hranu, hranu i slično. U jednom poželjnom izvođenju, prehrambeni proizvod je zdrava hrana.

[0106] Kako se ovde koristi, termin "funkcionalni prehrambeni proizvod" podrazumeva hranu koja može da obezbedi ne samo hranljivo dejstvo, već je takođe sposobna da potrošaču obezbedi dodatno blagotvorno dejstvo. Shodno tome, funkcionalna hrana su obične namirnice koje sadrže komponente ili sastojke (kao što su ovde opisani) uključene u njih da hrani obezbede određenu funkcionalnu – npr. medicinsku ili fiziološku korist - pored čisto nutritivnog delovanja.

[0107] Primeri specifičnih prehrambenih proizvoda koji se primenjuju u ovom pronalasku uključuju proizvode na bazi mleka, poslastica pripremljenih za jelo, praha za rekonstituisanje sa, na primer, mlekom ili vodom, čokoladne mlečne napitke, pića od slada, gotova jela, instant jela ili pića za ljude ili prehrambene preparate koji predstavljaju kompletan ili delimični obrok namenjen za kućne ljubimce ili stoku.

[0108] U jednom poželjnom ostvarenju, kompozicija prema predmetnom pronalasku je prehrambeni proizvod namenjen za ljude, kućne ljubimce ili stoku. Kompozicija može biti namenjena za životinje odabrane iz grupe koju čine psi, mačke, svinje, goveda, konje, koze, ovce ili živina. U poželjnom izvođenju, kompozicija je prehrambeni proizvod namenjen za odrasle vrste, posebno odrasle ljude.

[0109] U predmetnom pronalasku, "proizvod na bazi mleka" označava svaki tečni ili polu-čvrsti proizvod na bazi mleka ili surutke koji ima promenljiv sadržaj masti. Proizvod na bazi mleka može biti, na primer, kravlje mleko, kozje mleko, ovčije mleko, obrano mleko, celo mleko, mleko rekombinovano sa mlekom u prahu i surutkom bez bilo kakve obrade, ili prerađen, kao što su jogurt, kiselo mleko, vurda, kiselo mleko, kiselo punomasno mleko, mlaćenica i druge fermentisane mlečne proizvode. Još jedna važna grupa uključuje mlečne napitke, kao što su napici od surutke, fermentisana mleka, kondenzovana mleka, mleka za odojčad i malu decu ili bebe; aromatizovana mleka, sladoled; hrana koja sadrži mleko kao što su slatkiši.

[0110] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na hraniva ili hranu za životinje koja sadrži gore definisani bakterijski soj.

[0111] Kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti - ili se mogu dodati - dodatcima ishrani, ovde takođe nazvani kao dijetetski ili nutritivni dodaci ishrani ili aditivi. Tako se sledeći aspekt pronalaska odnosi na dijetetski suplement ili dodatak ishrani koji sadrži jedan ili više bakterijskih sojeva prema ovom pronalasku.

[0112] Bakterijski soj i probiotske kompozicije prema pronalasku takođe se mogu koristiti u ishrani životinja (npr. u ishrani svinja), posebno u ranom periodu sisanja i periodu tova. Od probiotika se očekuje da poboljša funkciju imunog sistema, smanji i spreči zarazne bolesti, blagotvorno menja sastav mikroflore i poboljša rast i karakteristike životinja, na primer, kroz povećanu efikasnost konverzije hrane.

Diluenti, ekscipijensi i nosači

[0113] Kao što je gore pomenuto, ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompozicije, poželjnije farmaceutske kompozicije ili dodatke ishrani, koje sadrže gore definisan bakterijski soj i njihovu primenu. Određena vrsta bakterija se generalno daje u smeši sa farmaceutski ili nutritivno prihvatljivim nosačem, ekscipijensom ili diluentom, posebno za humanu terapiju. Farmaceutske kompozicije mogu biti za humanu ili životinjsku primenu u humanoj medicini ili veterini.

[0114] Primeri ovakvih pogodnih ekscipijenasa za različite oblike ovde opisanih farmaceutskih kompozicija se mogu naći u "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), koju su objavili Wade i PJ Weller.

[0115] Prihvatljivi nosači ili diluenti za terapeutsku primenu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.

1985).

[0116] Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri pogodnih diluenata uključuju etanol, glicerol i vodu.

[0117] Izbor farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili diluenta može biti izvršen s obzirom na nameravani način primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije pored, nosača, ekscipijensa ili diluenta, mogu sadržati bilo koje pogodno vezivo(a), lubrikant(e), agens(e) za suspendovanje, agens(e) za oblaganje, agens(e) za poboljšanje rastvorljivosti.

[0118] Primeri pogodnih veziva obuhvataju skrob, želatin, prirodne šećere poput glukoze, anhidrovane laktoze, free-flow laktoze, beta-laktoze, kukuruznih zaslađivača, prirodne i sintetičke gume, kao što su akacija, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetilceluloza i polietilen glikol.

[0119] Primeri pogodnih maziva obuhvataju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično.

[0120] U farmaceutskoj kompoziciji mogu biti obezbeđeni konzervansi, stabilizatori, boje i sredstva za davanje ukusa. Primeri konzervansa obuhvataju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre phidroksibenzoeve kiseline. Takođe se mogu koristiti antioksidansi i agensi za suspendovanje.

[0121] Nutritivno prihvatljivi nosači, diluenti i ekscipijensi obuhvataju one koje su pogodni za ljudsku ili životinjsku konzumaciju i koji se kao standard koriste u prehrambenoj industriji. Tipični nutritivno prihvatljivi nosači, diluenti i ekscipijensi će biti poznati stručnjaku u ovoj oblasti.

Način primene

[0122] Kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti prilagođene za oralni, rektalni, vaginalni, parenteralni, intramuskularni, intraperitonealni, intraarterijski, intratekalni, intrabronhijalni, subkutani, intradermalni, intravenozni, nazalni, bukalni ili sublingvalni način primene. Poželjno, kompozicije iz ovog pronalaska su prilagođene za oralni, rektalni, vaginalni, parenteralni, nazalni, bukalni ili sublingvalni način primene.

[0123] Za oralnu primenu se naročito koriste komprimovane tablete, pilule, tablete, kapi i kapsule.

[0124] Drugi načini primene sadrže rastvore ili emulzije koje mogu biti ubrizgane intravenozno, intraarterijalno, intratekalno, subkutano, intradermalno, intraperitonealno ili intramuskularno, a koje su pripremljene od sterilnih ili sterilisanih rastvora. Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska takođe mogu takođe biti u obliku supozitorija, globula, suspenzija, emulzija, losiona, masti, krema, gelova, sprejeva, rastvora ili prahova.

[0125] Alternativna sredstva za transdermalnu administraciju su dermalni flasteri. Na primer, aktivni sastojak može biti inkorporiran u kremu koja se sastoji od vodene emulzije polietilen glikola ili tečnog parafina. Bakterijski soj takođe može biti ugrađen u mast koja se sastoji od baze od belog voska ili belog mekog parafina zajedno sa određenim stabilizatorima i konzervansima koji mogu biti potrebni.

[0126] Kompozicije mogu biti formulisane u obliku jedinične doze, tj, u obliku odvojenih delova koji sadrže jediničnu dozu, ili višestruke ili podjedinice jedinične doze.

Doziranje

[0127] Prosečan stručnjak može jednostavno da utvrdi odgovarajuću dozu jedne od instant kompozicija za primenu na subjektu bez nepotrebnog eksperimentisanja. Lekar će obično odrediti stvarnu dozu koja će biti najpodesnija za pojedinog pacijenta i zavisiće od različitih faktora uključujući aktivnost specifičnog bakterijskog soja, metaboličku stabilnost i dužinu delovanja tog soja, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanju, pol, ishranu, način i vreme primene, brzinu ekskrecije, kombinacije lekova, ozbiljnost određenog stanja, i tekuću individualnu terapiju. Ovde otkrivene doze su primeri prosečnog slučaja. Naravno da mogu postojati pojedinačni slučajevi koji zahtevaju viši ili niži raspon doziranja.

[0128] Uobičajena efektivna dnevna doza kod ljudi je od oko 1 x 10<3>do oko 1x10<11>, poželjnije, od oko 1 x 10<7>do oko 1x 10<11>, još poželjnije, od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.

Kombinacije

[0129] U naročito poželjnom izvođenju, kompozicije iz ovog pronalaska se ordiniraju u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih agensa. U takvim slučajevima, kompozicije iz ovog pronalaska se mogu ordinirati uzastopno, simultano ili sekvencijalno sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa.

[0130]] Predmetni pronalazak je dalje opisan putem sledećih neograničavajućih primera.

PRIMERI

Materijali i metode

Uslovi gajenja bakterija

[0131] R. hominis A2-183<T>(= DSM 16839<T>= NCIMB 14029<T>) je gajen anaerobno na sintetičkom YCFA ili kompleksnom M2GSC medijumu. Kultura je inokulisana iz smrznutog bujona u Hungate epruvetama i inkubirana tokm noći na 37°C. Bakterije su zatim gajene na M2GSC agar pločama 48h u MACS-MG-1000 anaerobnim radnim stanicama (Don Whitley Scientific) u 80% N2, 10% CO2, i 10% H2na 37°C. Efekat mucina je ispitivan dodavanjem 0,5% (w/v) mucina iz creva svinje tipa III (Sigma-Aldrich) u YCFA medijum.

[0132] Za kolonizaciju germfree miševa, R. hominis je gajen u YCFA medijimu preko noći na 37°C. Kultura je centrifugirana i pelet resuspendovan u 1 mL YCFA medijuma, sa dodatkom 2% cisteina (w/v, Sigma-Aldrich) i 3% askorbinske kiseline (w/v, Sigma-Aldrich).

Eksperimenti na životinjama

[0133] Eksperimenti na germ-free životinjama su izvedeni u INRA objektima za gajenje gnotobiotičkih glodara u Joui-en-Josas (ANAXEM plateform, Institut Micalis, INRA, Joui-en-Josas, Francuska). Svi eksperimenti na životinjama su odobreni od strane lokalnog etičkog komiteta. Osamnaest germfree C3H/HeN miševa mužjaka je raspoređeno u kontrolnu (n = 8) i grupe za tretman (n = 10) i pojedinačno odvojeno plastičnim izolatorima. Miševi su hranjeni ad libitum sterilisanom komercijalnom hranom (R03-40; UAR). Na dan 0, životinje u grupi tretmana su gavažom dobile 100 µL kulture R. hominisa, dok su kontrolne životinje dobile 100 mL YCFA medijuma. Na dane 14. i 28., četiri kontrolne životinje i pet R. hominisom tretiranih životinja je žrtvovano. C57/BL6 Il-10KO eksperimenti su izvedeni na Rowett Institutu za Ishranu i Zdravlje (Aberdeen, Scotland, UK). Divljitip miša (N = 8), IL-10KO (N=12) i IL-10KO R. hominis (N=11) su analizirani 14 nedelja od početka eksperimenta. Ukratko R. hominis je administriran 3 puta nedeljno sa 109 cfu/dan.

[0134] Ileum, uzlazni kolon i silazni kolon su podeljeni na četiri jednaka dela i prebačeni u RNAlater (Ambion), neutralni puferisani formalin (Sigma-Aldrich) ili tečni azot. Ceo cekum i poprečni kolon su prebačeni u RNAlater. Kod IL-10KO miševa je takođe rađen histopathološki nalaz.

Eksperimenti sa kulturom tkiva

[0135] Svi reagensi ćelijskih kultura, ukoliko nije drugačije naznačeno, su nabavljeni kod Sigma-Aldrich.

2 x10<5>Caco-2 ili HT29 ćelije u 1.5 mL DMEM (high glucose, HEPES) medijuma sa toplotno-inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Gibco), penicilinom, streptomicinom, amfotericinom B i L-glutaminom su zasejane u gornje odeljke Transvell ploča sa šest velova (Corning). Donje pregrade su sadržale 3.0 mL istog medijuma. Ćelije su inkubirane na 37°C u atmosferi sa 5% CO2do 3 dana post-konfluentno, isprane Hanksovim rastvorom za uklanjanje antibiotika i FCS, i ostavljene u DMEM obogaćen sa L-glutaminom, natrijum selenitom i transferinom tokom 24h bez antibiotika. Transvell inserti su zatim prebačeni u kutiju za anaerobne kulture u anaerobnoj stanici na 37°C. Gornji odeljak svakog umetka je bio ispunjen anaerobnim DMEM ćelijskim medijumom, dok je donja pregrada bila ispunjena oksigenisanim DMEM.

[0136] R. hominis A2-183 kultura je u eksponencijalnoj fazi sakupljena centrifugiranjem na 3.500xg tokom 5 min. Ovaj pelet je opran i resuspendovan u 0.8 mL anaerobnog DMEM. Sto mikrolitara bakterijske suspenzije (108 CFU/mL) je dodato u eksperimentalne velove. Kontrolni velovi su dobili istu količinu medijuma bez bakterijskih ćelija. Dodatne kontrole su uključivale bakterijske ćelije inkubirane bez Caco-2 ili HT29 ćelija.

[0137] Bakterijske i eukariotske ćelije su sakupljene posle 2h i 4h inkubacije. Sakupljene su i neadherentne i adherentne bakterije i čuvane u RNAlater. Viabilnost R. hominis ćelija je testirana oblaganjem na YCFA ploče. Iz velova su sakupljene Caco-2 ćelije ili HT-29 ćelije i takođe čuvane u RNAlater.

Konstrukcija R. hominis biblioteke

[0138] Hromozomska DNK R. hominisa za konstruisanje male biblioteke i pirosekvenciranje je izolovana pomoću UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kita (Mo Bio Laboratories Inc), a DNK velike molekulske težine za biblioteku fazmida je izolovana pomoću Wizard Genomic DNA Purification Kita (Promega). Integritet DNK je proveren elektroforezom u gelu.

[0139] DNK je mehanički presečena pomoću Nebulzer kit-a (Invitrogen) i frakcionisana gel elektroforezom. DNK fragmenti željene veličine su izvađeni iz gela i prečišćeni pomoću Wizard<®>SV Gel i PCR Clean-Up sistema (Promega). Završna popravka je urađena sa DNK Terminator End Repair kitom (Lucigen).1.5-3.5 kb fragmenti su klonirani pomoću CloneSmart<®>LCAmp kita (Lucigen) i konstruisana je biblioteka od 4-8 kb pomoću pJAZZ®-OC vektora (Lucigen). Biblioteke fazmida su konstruisane pomoću CopyControl™ Fosmid Library Production Kita (Epicentre Biotechnologies). Kolonije su sakupljene pomoću automatskog uređaja za sakupljanje kolonija (BioRobotics BioPick, Genomic Solutions) i arhivirane u 384-komorne mikrotitarske ploče koje su sadržale 70 mL 2kLB medijuma sa dodatkom 10% glicerola i odgovarajućeg antibiotika. Ćelije su gajene preko noći na 37°C uz mućkanje i čuvane na -80°C.

Sekvenciranje, sklapanje i anotacija

[0140] Šabloni za sekvenciranje standardnih malih biblioteka su dobijeni korišćenjem PCR pomoću jednog µL biomase klona i prajmera SL1 i SR2 koji okružuju mesto kloniranja pSMART-LCAmp. Produkti PCR su prečišćeni pomoću Multiscreen PCR Clean up filter ploča (Millipore). Rekombinantna DNK klonova pJAZZ®-OC je izolovana korišćenjem Wizard® SV 96 Plazmid DNK Purification sistema (Promega). Fazmid DNK je izolovan korišćenjem FosmidMAKS™ DNA Purification kita (Epicentre). Očitavanja krajeva DNK fragmenata iz R. hominis WGS biblioteka sa različitim veličinama inserata su dobijena korišćenjem CEQ8000 (Beckman Coulter) i ABI 3770 (Applied Biosystems) DNK sekvenatora. Genomska DNK R. hominisa je takođe sekvencirana pomoću 454 GS20 (454 Life Sciences) i 454 FLX sekvenatora (Roche). Podaci dobijeni pomoću Sangera i 454 su sastavljeni pomoću MIRA verzije 3 (http://chevreuk.org/projects mira.html; (35) RAST postupak u razvoju za anotaciju (http://rast.nmpdr.org; (36)) se koristi za automatsku i ručnu anotaciju genoma i za komparativne genomske analize. Dodeljena genomska sekvenca R. hominisa A2-183 je dostavljena GenBank pod pristupnim brojem CP003040.

Analize genskih čipova (microarray analize)

[0141] Bakterijska RNK je izolovana iz sadržaja mišjih cekuma pomoću RNeasy mini kita, i dalje prerađena pomoću MICROBEnrich™ kita (Ambion), MICROBExpress™ bacterial mRNA enrichment kita (Ambion), i MessageAmp™ II-bacteria RNA kita za amplifikaciju (Applied Biosystems). RNK je obeležena ili sa dCTP-Cy3 ili dCTPCy5 tokom sinteze cDNK (CyScribe First strand cDNA labeling kita; Amersham). Obeleženi proizvodi su prečišćeni pomoću kita za prečišćavanje CyScribe GFX (Amersham). PCR produkti su amplifikovani od 6000 klonova u biblioteci RA8 su raspoređeni u duplikatu na aminosilanom-obložene mikroskopske slajdove (Corning) pomoću MicroGrid II TAS (BioRobotics). Pojačani fragmenti housekeeping gena rpoD i gyrA su nasumično raspoređeni na mikročipu kao kontrola. Hibridizacija na genskom čipu je izvedena u stanici za hibridizaciju GeneTAC (Genomic Solutions). Obeležavanje bojom za drugu hibridizaciju je naizmenično menjano (eng. dye-swap), a zasebno prečišćena RNK je takođe obeležena i dvaput hibridizovana, da se osigura reproduktivnost i da se dobiju statistički značajni rezultati. Za svako upoređivanje su hibridizovane ukupno četiri pločice, za ukupno 12 hibridizacionih tačaka po amplifikovanom klonu. Fluorescencija je merena na dva kanala pomoću GeneTAC LS IV (Genomic Solutions) sa GeneTac Integrator softverskom verzijom 3.0.1. Intenziteti tačaka su log-transformisani i primenjena je Loess normalizacija da se eliminišu razlike u obeležavanju proba i efikasnost hibridizacije. Za ispitivanje diferencijalne ekspresije su korišćeni ttestovi za jedan uzorak sa vrednostima log-količnik promene. Podaci su smatrani značajnim kada je količnik promene> 2 i P<0.05.

Analiza genskih čipova miša

[0142] Tkivo ileuma i uzlaznog kolona je uklonjeno iz RNAlater rastora i lizirano u Trizolu (Invitrogen). RNK je izolovana standardnim hloroform-izopropanol koracima. Ukupna RNK je zatim prečišćena korišćenjem RNneasy kita (Qiagen), uključujući korak digestije sa Rnase-free DNase I (Qiagen). Integritet RNK je utvrđen pomoću Agilent 2100 Byoanalizer (Agilent Technologies). Ukupna RNK je obrađena u biotinom obeleženoj cRNK pomoću One-Cycle Target Labeling Kita (Affymetrix). Hibridizacija GeneChip Mouse Genom Array (Affimetrix) je izvedena u Institutu Medicinskih nauka Microarray Core Facility (University of Aberdeen, UK), na GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix). Čipovi su skenirani na Affymetrix GeneChip Skeneru 3000 (Affymetrix). Analiza kvaliteta slike je izvršena pomoću Gene Chip Operativnog Softvera (GCOS) (Affymetrix). Dalja analiza podataka je izvršena sa komercijalno dostupnim softverskim paketima R (http://vvv.r-proiect.org) i Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Za testiranje diferencijalne ekspresije je korišćen moderirani F-test obezbeđen kod Bioconductor paketa limma. Podaci su smatrani značajnim kada je P<0.05 po Benjamini i Hochberg metode lažnog otkrića. Statistička analiza je izvedena posebno za svaku od dve vremenske tačke. Svi diferencijalno eksprimirani geni (p <0,05) su uneti u MetaCore analitički softver (Gene-Go, St Joseph, MI) da se dobiju mape putanja. Integrisana analiza putanja obogaćivanja je obavljena pomoću na znanju zasnovanih kanonskih puteva i endogenih metaboličkih puteva. Rangiranje relevantnih integrisanih puteva je zasnovano na p-vrednostima izračunatim pomoću hipergeometrijske distribucije. P-vrednosti predstavljaju verovatnoću da se određen broj gena sa ulazne liste slučajno poklapa sa određenim brojem gena na karti, imajući u vidu broj gena u eksperimentu u odnosu na broj gena na karti u okviru celog seta svih gena na kartama.

Funkcionalno tumačenje podataka zasnovano na Ontologiji gena (GO) je obavljeno pomoću proširene verzije originalnog, programa DAVID (http://david.abccncifcrf.gov), koji je dostupan na web-u (37). Značajno različiti transkripti (P<0.05) su alocirani u GO kategoriji 'Biološki Proces" da se dobiju matrice ekspresije značajno obogaćenih gena za specifične GO pojmove. Microarray podaci su dostavljeni u National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (pristupni broj GSE25544; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

RT-PCR analiza

[0143] Bakterijski PCR prajmeri su dizajnirani korišćenjem on-line alata Primer3Plus (38) i nabavljeni kod Sigma-Aldrich. RT PCR analiza je izvedena korišćenjem 7500 Fast RT PCR Sistema (Applied Biosystems) sa Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR je izvedena na sledeći način: jedan ciklus na 95°C tokom 10 min, a zatim 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sekundi i 60°C tokom 1 min, završavajući sa korakom disocijacije. Svi uzorci su rađeni u triplikatu. GyrA je korišćen kao referentni gen za normalizaciju zbog svoje niske varijacije između uzoraka.

[0144] Za ekspresiju gena domaćina, 2 µg ukupne eukariotske RNK izolovane iz ileuma i uzlaznog kolona je reverzno transkribovano u cDNK koristeći High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) sa nasumičnim prajmerima. PCR analiza u realnom vremenu je izvedena sa 7500 Fast Real Time PCR Sistema (Applied Biosystems) sa QuantiFast SYBR Green PCR Kitom (Qiagen) i QuantiTect Primer Assays (Qiagen). Uslovi PCR termocikliranja su bili sledeći: jedan ciklus na 95°C tokom 5 min, a zatim 40 ciklusa na 95°C tokom 10 sekundi i na 60°C tokom 30 s, završavajući sa korakom disocijacije. Svi uzorci su rađeni u triplikatu. Hprt je izabran kao referentni gen za normalizaciju zbog svoje niske varijacije između uzoraka. Svi RT-PCR podaci su analizirani na logaritamskoj skali sa bazom 2 pomoću Studentovog t-testa koji omogućava različite varijanse sa graničnom značajnosti P<0.05. Razlike su povratno transformisane da se izračunaju količnici promene.

Western blot

[0145] Imunološki prečišćena zečija poliklonalna antitela protiv Roseburia hominis Fla2 su proizvedena kako je opisao Duck i saradnici (39). Ukratko, ženke Novo Zelandskih belih zečeva su imunizovane sintetičkim peptidom u kompletnom Freund Adjuvantsu i amplifikovane nekoliko puta. Korišćeni su R. hominis Fla2 peptid 261-275 (C-AQYNDDAKSVLEILK-COOH) i peptid 58-71 (C-GLNKASRNSQDGIS-CONH2). Nakon imunizacije antitela su prečišćena na imunoafinitetnoj koloni pripremljenoj kuplovanjem peptida do 1 mL aktiviranih sepharose kuglica.

[0146] Za western blot, sadržaj uzlaznog kolona je suspendovan u Lemli (Laemmli) puferu koji je sadržao 8M ureu. Biomasa R. hominisa (pozitivna kontrola) je razblažen u istom puferu. Trideset µL svakog uzorka je razliveno u velove NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) i podvrgnuto elektroforezi, a zatim dalje obrađeno pomoću WesternBreeze Hemiluminiscentnog sistema Imunodetekcije (Invitrogen). Fla2 antitelo je razblaženo 1:1000 u diluentu za antitela i inkubirano tokom noći na 4°C, a nakon toga 1 sat na sobnoj temperaturi sa anti-zečjim antitelom konjugovanim alkalnom fosfatazom. Detekcija je izvedena pomoću Fuji LAS3000 image sistema.

Suva telesna težina i analiza lipida trupova

[0147] Eviscerirani trup miša je izmeren, liofilizovan do konstantne težine a zatim samleven za analizu. Sadržaj lipida je određen ekstrakcijom (1: 100 w/v) sa hloroform/metanolom (2: 1 v/v) kao što je prethodno opisano (40).

FISH analiza

[0148] FISH analiza je izvedena na sekcijama crevnog tkiva pomoću nespecifične bakterijske probe Eub338 i novodizajnirane R. hominis A2-183-specifične probe.

[0149] Tkiva fiksirana u neutralnom puferisanom formalinu su zatopljene u Technovit-u 8100 (Heraeus Kulzer). Sekcije od dva mikrona su isečene pomoću rotacionog mikrotoma (Leica/Reichert AutoCut). Uzete su tri sekcije po slajdu od 100 µm, 200 µm i 300 µm u tkivu, što znači devet sekcija po životinji.

[0150] Slajdovi su dehidrirani uzastopnom inkubacijom u 50% (v/v), 80% i 96% etanolu i osušeni na sobnoj temperaturi. 16S rRNK FISH korišćene probe su bile nespecifična bakterijska proba Eub338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT, Cy3) i novo dizajnirana A2-183-specifična proba R. hominis (GTACATTACATACTCTGTCAGTG, FITC), čija specifičnost je opsežno testirana panelom intestinalnih bakterijskih izolata. Deset mikrotitar proba (30 ng/µL) u 100 µL pufera za hibridizaciju je primenjeno na dehidratisani uzorak i inkubirano na temperaturi specifične probe. Slajdovi su isprani puferom za ispiranje, na 50°C tokom 30 min, potopljeni u ledenu vodu da se ukloni zaostali pufer za ispiranje i osušeni u struji komprimovanog vazduha. Kontrastno bojenje je izvedeno sa 4', 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI Vector Laboratories Inc), a slajdovi su postavljeni sa Vectashield Mounting Medijumom za fluorescenciju (Vector Laboratories Inc) da se spreči da blede. Bakterije su vizualizovane pomoću Leica DM RBE fluorescentnog mikroskopa (Leitz GmbH) i fotografisane Penguin 600CL kamerom (Pixera) i Viewfinder 3.0 softverom (Studio Lite). Fotografije pri velikom uvećanju (x63) su dobijene pomoću Apochromatics sistema (Leica).

Imunofluorescencija

[0151] lmunolokalizacija markera T ćelija je ispitana na sekvencijalnim kriosekcijama (8µm). Sekcije su fiksirane ili u prethodno ohlađenom metanolu 30 min na -20°C (Ly6G FITC, CD3 FITC, CD11b FITC, sve pri 1:50 (BD Biosciences)), ili za dvostruko-obeleženi FoxP3 (1:500, Abcam) sa CD3 FITC (1:100, BD Biosciences) fiksirane u 1% paraformaldehidu (PFA) tokom 2 min na sobnoj temperaturi, a zatim 3 min u 0,01% Tritonu X u PBS. Sve sekcije su blokirane sa 10% BSA (Sigma) koji je sadržao 10% relevantnog pre-imunskog seruma u PBS (pH 7.4). Tkiva fiksirana metanolom su inkubirana sa primarnim antitelima tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Sekcije fiksirane pomoću PFA su inkubirane sa antitelima tokom noći na 4°C. FoxP3 je vizuelizovan korišćenjem Kozjeg anti-zečjeg antitela, Alexa 594 (1:1000, Molecular Probes). Sekcije su kontrastno obeležene sa DAPI i postavljene sa Vectashield medijuma (Vector Laboratories). Za kvantifikaciju pozitivnih ćelija, ispitano je najmanje pet vidnih polja svake sekcije miša, pomoću gore opisanog softvera za obradu i podešavanje mikroskopa.

Histologija

[0152] Uzorci tkiva su fiksirani tri sata u Carnoy fiksativu (60% (v/v) etanol, 30% (v/ v) hloroform i 10% (v/v) glacijalna sirćetna kiselina) na sobnoj temperaturi uz konstantnu agitaciju. Uzorci su preneti u 70% etanol i čuvani na sobnoj temperaturi sve dok nisu orijentisani za poprečno sekcionisanje i zatapanje u hladno-očvršćavajuću smolu pomoću Technovit 8100 (Heraeus Kulzer) prema uputstvima proizvođača. Zatopljeno tkivo je postavljeno na Histoblokove pomoću Technovit-a 3040 (Heraus Kulzer). Sekcije od četiri mikrona su isečene pomoću rotacionog mikrotoma (Leica AutoCut) sa staklenim nožem (TAAB Laboratories Equipment Ltd.). Delovi tkiva su obojeni primenom standardnih hemotoksilin/Eozin metoda i ispitani na mikroskopu Zeiss Axioskop sa x10 i x20 objektivima. Slike su snimljene pomoću Qlmaging kamere i Image Pro Plus softvera.

Poređenje genoma Roseburia-srodnih vrsta i sojeva

[0153] Podnosilac zahteva je proizveo kompletnu sekvencu genoma R. hominisa A2-183, koje je predstavljena jednim 3,592,125-bp hromozomom. Automatizovana i manuelna anotacija genoma pomoću RAST platforme otkrila je prisustvo četiri ribozomska operona, 66. RNK i 3.273 predviđena proteina. Distribucija Subsistema u Kategorije za R. hominis A2-183 R. inulinivorans DSM 16841 R. intestinalis L1-82 R. intestinalis M50/1 i Eubacterium rectale ATCC 33656 je prikazana na Slikama 11-15 respektivno.

[0154]Ova iformacija pokazuje razlike u broju gena (predstavljene u zagradama) u svakom funkcionalnom Subsistemu. Ovi geni su veoma važni u posredovanju odgovora domaćina na svaku pojedinačnu bakteriju. Ono što je važno ovi geni su različiti kod različitih sojeva, kako po broju tako i po funkciji. Rezultati su sumirani u sledećoj tabeli:

R. hominis A2-183

Ćelijski zid i Kapsula (57)

Membranski Transport (24)

Motilitet i Hemotaksa (49)

Regulacija i Ćelijska signalizacija (16)

Dormancija i Sporulacija (12)

Ugljeni hidrati (271)

E. rectale ATCC 33656

Ćelijski Zid i Kapsula (41)

Membranski Transport (13)

Motilitet i Hemotaksa (16)

Regulacija i Ćelijska signalizacija (9)

Dormancija i Sporulacija (6)

Ugljeni hidrati (172)

R. intestinalis L1- 82

Ćelijski zid i Kapsula (35)

Membranski Transport (36)

Pokretljivost i Hemotaksa (15)

Regulacija i Ćelijska signalizacija (10)

Dormancija i Sporulacija (17)

R. intestinalis M50 / 1

Ćelijski zid i Kapsula (28)

Membranski Transport (37)

Motilitet i Hemotaksa (17)

Regulacija i Ćelijska signalizacija (10)

Dormancija i Sporulacija (17)

Ugljeni hidrati (201)

R. inulinovorans DSM 16841

Ćelijski Zid i Kapsula (69)

Membrana Transport (26)

Pokretljivost i Hemotaksa (14)

Regulacija i Ćelijska signalizacija (9)

Dormancija i Sporulacija (17)

Ugljeni hidrati (160)

Procenat identiteta sekvence za > 3000 gena nađenih u konsezus sekvenci 1 (eng. contig1) ukazuje na razlike između genoma bakterije R. hominis i bakterija E. rectale, R. intestinalis i R. inulinivorans

[0155] Poređenja su napravljena između genoma različitih Roseburia vrsta i srodnih vrsta Eubacterium rectale, najbližeg srodnika R. hominisa.

[0156] R. hominis referentni genom 585394,12

D. rectale genom ATCC336556515619,3

R. intestinalis L1-82166486.4

R. intestinalis M50/1166486,5

R. inulinovorans DSM16841622312.3

[0157] Procenat identiteta potencijalnih gena između različitih Roseburia genoma se kreće od 0% do oko 90% identiteta sekvence. Mnogi geni su hipotetički i variraju između sojeva. Veliki broj gena je prisutan u R. hominis genomima a nema ih u genomima drugih Roseburia vrsta.

[0158] Roseburia hominis ima 924 gena koji nisu nađeni u genomima drugih Roseburia vrsta (0% identiteta) što ukazuje da je skoro 25% njenog genoma jedinstveno za R. hominis. Takođe niska homologija između drugih gena (<10-70%) ukazuje na to da se funkcije mnogih drugih gena verovatno razlikuju.

[0159] Ovaj podatak pruža ubedljive dokaze da se ove bakterije iz genomske i funkcionalne perspektive dosta razlikuju, i ne mogu da se grupišu osim prema svojoj filogenetskoj srodnosti, koja se obično zasniva na konzerviranom genu 16S ribozomalnom genu koji predstavlja očuvani deo prokariotske DNK pronađene kod svih bakterija. Sekvence 16S rRNK gena se koriste za bakterijsku filogeniju i taksonomske studije (deljeni genetski marker).

Funkcionalnost u odnosu na odgovor domaćina i imunitet je specifična za soj bakterija

[0160] Slika 9 ilustruje podatke o poređenju ekspresije gena za tri soja bakterija iz Klastera XIVa (Firmikute), naime Roseburia hominis, E. rectale i Roseburia intestinalis. Podaci pokazuju brojeve jedinstvenih gena eksprimiranih u filogenetski srodnim bakterijskim sojevima posle izlaganja ćelijama humanog epitela. Ekspresija gena je određena korišćenjem Affimetrix humanih genskih mikročipova koji sadrže 56.000 gena. Ova razlika odslikava razlike u njihovim genomima. Ovi eksperimenti su slični onima koji su opisani na drugim mestima u ovoj specifikaciji pomoću mišjih DNK mikročipova, ali su u njima korišćeni specifični humani DNK mikročipovi. GeneChip® Humane Genoma U133 Plus 2.0 predstavlja prvu i najobimniju mapu kompletnog ljudskog genoma. Affimetrix GeneChip® Human Genoma U133 plus 2,0 Array (HG-U133 plus 2.0) genski mikročip se sastoji od 1.300.000 jedinstvenih oligonukleotidnih karakteristika koje pokrivaju preko 47,000 transkripta i varijanti, koje, zauzvrat, predstavljaju oko 39.000 najbolje okarakterisanih humanih gena. Ćelijske linije korišćene za procenu odgovora na signalizaciju indukovanu različitim komensalnim bakterijama uključuju humanu ćelijsku liniju kolona Caco-2 ćelije i HT-29 ćelije i bakterije, uključujući R. hominis, E. rectale i R. intestinalis koje su poređene sa enteričkim patogenom Salmonella enteritidis.

Funkcionalne razlike bakterija Klastera XIVa - poređenje između R. hominis i E. rectale

[0161] Slika 10 pokazuje da Roseburia hominis indukuje A20 negativni regulator NF-kB signalizacije uz snažnu antiinflamatornu aktivnost dok ostali bakterijski sojevi nemaju uticaja. Flagelinski deo Roseburia hominisa takođe indukuje A20 za razliku od srodne bakterije Eubacterium rectale.

[0162] Reagensi ćelijskih kultura, ukoliko nije drugačije naznačeno, su nabavljeni kod Sigma-Aldrich. Caco-2 (ECACC Cat No.860102002) i HT29 (ATCC) ćelijske linije kultivisane u Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) dopunjenom sa10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco, UK), 200 mM L-glutamina i 1% antibiotika/antimikotika su zasejane u Transvell ploču sa šest velova (Corning). Ćelije su inkubirane na 37°C u atmosferi sa 5% CO2do 3 dana post-konfluentno, isprane u Hanks-ovom rastvoru da se uklone antibiotici i FCS i spuštene u DMEM obogaćen L-glutaminom, natrijum selenitom i transferinom tokom 24h bez antibiotika. Transvell inserti su zatim prebačeni u kutiju za anaerobne kulture unutar anaerobne stanice na 37°C. Gornja pregrada svakog inserta je bila ispunjena anaerobnim DMEM ćelijskim medijumom, dok je donja pregrada bila ispunjena oksigenisanim DMEM-om.

[0163] Roseburia hominis A2-183 i E.rectale ATCC336556 u standardnom ICFA i M2 medijumu kulture i Salmonella enteric serovar enteritidis kultivisane u LB bujonu su sakupljene u eksponencijalnoj fazi centrifugiranjem na 3,500xg tokom 5 min. Ovaj pelet je opran i resuspendovan u anaerobnom DMEM-u. Sto mikrolitara bakterijske suspenzije (108 CFU/mL) je dodato u eksperimentalne velove. U kontrolne velove je stavljena ista količina medijuma bez ćelija bakterija. Dodatna kontrola je uključivala ćelije bakterija inkubirane bez Caco-2 ili HT29 ćelija.

[0164] Bakterijske i eukariotske ćelije su sakupljene posle inkubacije od 2h i 4h. Neadherentne i adherentne bakterije su sakupljene aspiracijom i čuvane u RNAlater-u. Caco-2 ćelije ili HT-29 ćelije su sakupljene iz velova i takođe čuvane u RNAlater-u.

Luciferazni Esej za određivanje A20 ekspresije gena luciferaze

[0165] Reagens za transfekciju Fugene®6 (Roche, UK) je korišćen za transfekciju HT29 ćelija sa plazmidima koji nose reporterski gen za luciferazu pod kontrolom A20 promotora pLuc-A20 i pLuc-A20A NF-kB (mutiran u 3 nukleotida u regionu promotora A20) i GFP reporterski gen pod kontrolom A20 promotora pCAGGSGFP1A20 i pLuc-GL2\NF-kB. Posle 48 h, ćelije su stimulisane živim bakterijama R. hominis, E. rectale i S. Enteritidis i rekombinantnim flagelinima; S. Enteritidis i R. hominis (Fla 1) (100 ng/ml) tokom 9, 12 i 24 h. Rekombinatni flagelini su generisani pomoću sekvenci pune dužine kloniranih u odgovarajuće vektore i eksprimiranih u E. coli JM109, BL21 i Rosetta. Aktivnosti Luciferaza (Firefly-f-Luc i Renilla-R-Luc) su određene korišćenjem Dual-Glo® luciferaza test sistema (Promega, UK) i Envision 2102 Multilabel čitača. Relativna aktivnost reporter luciferaze je dobijena normalizacijom Renilla kontrole.

REFERENCE

[0166]

1. Spor, A., Koren, O., & Ley, R. (2011) Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat. Rev. Microbiol.9: 279-290.

2. Eckburg, P. B., Bik, E. M., Bernstein, C. N., Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent, M., Gill, S. R., Nelson, K. E., & Relman, D. A. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308: 1635-1638.

3. Macpherson, A. J., Hunziker, L., McCoy, K., & Lamarre, A. (2001) IgA responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenic microorganisms. Microbes. Infect.3: 1021-1035.

4. Macpherson, A. J., Martinic, M. M., & Harris, N. (2002) The functions of mucosal T cells in containing the indigenous commensal flora of the intestine. Cell Mol. Life Sci.59: 2088-2096.

5. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., & Kasper, D. L. (2005) An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 122: 107-118.

6. Chung, H. & Kasper, D. L. (2010) Microbiota-stimulated immune mechanisms to maintain gut homeostasis. Curr. Opin. Immunol.22: 455-460.

7. Macpherson, A. J. (2006) IgA adaptation to the presence of commensal bacteria in the intestine. Curr. Top. Microbiol. Immunol.308: 117-136.

8. Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder, I., Lan, A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De, P. M., Brandi, G. et al. (2009) The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity.31: 677-689.

9. Ivanov, I. I., Atarashi, K., Manel, N., Brodie, E. L., Shima, T., Karaoz, U., Wei, D., Goldfarb, K. C., Santee, C. A., Lynch, S. V. et al. (2009) Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell 139: 485-498.

10. Geuking, M. B., Cahenzli, J., Lawson, M. A., Ng, D. C., Slack, E., Hapfelmeier, S., McCoy, K. D., & Macpherson, A. J. (2011) Intestinal Bacterial Colonization Induces Mutualistic Regulatory T Cell Responses. Impunity.

11. Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.56: 2437-2441.

12. Mahowald, M. A., Rey, F. E., Seedorf, H., Turnbaugh, P. J., Fulton, R. S., Wollam, A., Shah, N., Wang, C., Magrini, V., Wilson, R. K. et al. (2009) Characterizing a model human gut microbiota composed of members of its two dominant bacterial phyla. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106: 5859-5864.

13. Aminov, R. I., Walker, A. W., Duncan, S. H., Harmsen, H. J., Welling, G. W., & Flint, H. J. (2006) Molecular diversity, cultivation, and improved detection by fluorescent in situ hybridization of a dominant group of human gut bacteria related to Roseburia spp. or Eubacterium rectale. Appl. Environ. Microbiol.72: 6371-6376.

14. Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., & Gordon, J. I. (2008) Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell Host. Microbe 3: 213-223.

15. Mallya, M., Campbell, R. D., & Aguado, B. (2006) Characterization of the five novel Ly-6 superfamily members encoded in the MHC, and detection of cells expressing their potential ligands. Protein Sci.

15: 2244-2256.

16. Letran, S. E., Lee, S. J., Atif, S. M., Flores-Langarica, A., Uematsu, S., Akira, S., Cunningham, A. F., & McSorley, S. J. (2011) TLR5-deficient mice lack basal inflammatory and metabolic defects but exhibit impaired CD4 T cell responses to a flagellated pathogen. J Immunol.186: 5406-5412.

17. Round, J. L., Lee, S. M., Li, J., Tran, G., Jabri, B., Chatila, T. A., & Mazmanian, S. K. (2011) The Tolllike receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota. Science 332: 974-977.

18. Hooper, L. V., Wong, M. H., Thelin, A., Hansson, L., Falk, P. G., & Gordon, J. I. (2001) Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science 291: 881-884.

19. Kelly, D., Campbell, J. I., King, T. P., Grant, G., Jansson, E. A., Coutts, A. G., Pettersson, S., & Conway, S. (2004) Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclearcytoplasmic shuttling of PPAR-gamma and ReIA. Nat. Immunol.5: 104-112.

20. Hapfelmeier, S., Lawson, M. A., Slack, E., Kirundi, J. K., Stoel, M., Heikenwalder, M., Cahenzli, J., Velykoredko, Y., Balmer, M. L., Endt, K. et al. (2010) Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science 328: 1705-1709.

21. Elkins, C. A., Moser, S. A., & Savage, D. C. (2001) Genes encoding bile salt hydrolases and conjugated bile salt transporters in Lactobacillus johnsonii 100-100 and other Lactobacillus species. Microbiology 147: 3403-3412.

22. Louis, P., McCrae, S. I., Charrier, C., & Flint, H. J. (2007) Organization of butyrate synthetic genes in human colonic bacteria: phylogenetic conservation and horizontal gene transfer. FEMS Microbiol. Lett.

269: 240-247.

23. Peterson, G., Kumar, A., Gart, E., & Narayanan, S. (2011) Catecholamines increase conjugative gene transfer between enteric bacteria. Microb. Pathog.

24. Hayashi, F., Smith, K. D., Ozinsky, A., Hawn, T. R., Yi, E. C., Goodlett, D. R., Eng, J. K., Akira, S., Underhill, D. M., & Aderem, A. (2001) The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410: 1099-1103.

25. Vijay-Kumar, M., Sanders, C. J., Taylor, R. T., Kumar, A., Aitken, J. D., Sitaraman, S. V., Neish, A. S., Uematsu, S., Akira, S., Williams, I. R. et al. (2007) Deletion of TLR5 results in spontaneous colitis in mice. J Clin. Invest 117: 3909-3921.

26. De, P. M., Gaboriau-Routhiau, V., Rainteau, D., Rakotobe, S., Taddei, F., & Cerf-Bensussan, N. (2011) Tradeoff between bile resistance and nutritional competence drives Escherichia coli diversification in the mouse gut. PloS Genet.7: e1002107.

27. Giraud, A., Arous, S., De, P. M., Gaboriau-Routhiau, V., Bambou, J. C., Rakotobe, S., Lindner, A. B., Taddei, F., & Cerf-Bensussan, N. (2008) Dissecting the genetic components of adaptation of Escherichia coli to the mouse gut. PLoS Genet.4: e2.

28. Werth, M., Walentin, K., Aue, A., Schonheit, J., Wuebken, A., Pode-Shakked, N., Vilianovitch, L., Erdmann, B., Dekel, B., Bader, M. et al. (2010) The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development 137: 3835-3845.

29. Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K. S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T. et al. (2010) A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464: 59-65.

30. Ukena, S. N., Singh, A., Dringenberg, U., Engelhardt, R., Seidler, U., Hansen, W., Bleich, A., Bruder, D., Franzke, A., Rogler, G. et al. (2007) Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity. PLoS. One.2: e1308.

31. Geraedts, M. C., Troost, F. J., Tinnemans, R., Soderholm, J. D., Brummer, R. J., & Saris, W. H. (2010) Release of satiety hormones in response to specific dietary proteins is different between human and murine small intestinal mucosa. Ann. Nutr. Metab 56: 308-313.

32. McLaughlin, J., Grazia, L. M., Jones, M. N., D’Amato, M., Dockray, G. J., & Thompson, D. G. (1999) Fatty acid chain length determines cholecystokinin secretion and effect on human gastric motility. Gastroenterology 116: 46-53.

33. Turnbaugh, P. J., Ley, R. E., Mahowald, M. A., Magrini, V., Mardis, E. R., & Gordon, J. I. (2006) An obesityassociated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444: 1027-1031.

34. Tremaroli, V., Kovatcheva-Datchary, P., & Backhed, F. (2010) A role for the gut microbiota in energy harvesting? Gut 59: 1589-1590.

35. Chevreux, B., Wetter, T., & Suhai, S. (1999) Genome sequence assembly using trace signals and additional sequence information. Computer Science and Biology: Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB) 99: 45-56.

36. Aziz, R. K., Bartels, D., Best, A. A., DeJongh, M., Disz, T., Edwards, R. A., Formsma, K., Gerdes, S., Glass, E. M., Kubal, M. et al. (2008) The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics 9: 75.

37. Dennis, G., Jr., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., & Lempicki, R. A. (2003) DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol.4: 3.

38. Untergasser, A., Nijveen, H., Rao, X., Bisseling, T., Geurts, R., & Leunissen, J. A. (2007) Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Res.35: W71-W74.

39. Duck, L. W., Walter, M. R., Novak, J., Kelly, D., Tomasi, M., Cong, Y., & Elson, C. O. (2007) Isolation of flagellated bacteria implicated in Crohn’s disease. Inflamm. Bowel. Dis.13: 1191-1201.

40. Olivera, L., Canul, R. R., Pereira-Pacheco, F., Cockburn, J., Soldani, F., McKenzie, N. H., Duncan, M., Olvera-Novoa, M. A., & Grant, G. (2003) Nutritional and physiological responses of young growing rats to diets containing raw cowpea seed meal, protein isolate (globulins), or starch. J Agric. Food Chem.

51: 319-325.

41. Sokol H., et al, PNAS, October 28, 2008, Vol 105, No 43, 16731-16736.

Claims (18)

Patentni Zahtevi

1. Bakterijski soj koji ima

(a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili

(b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029

za upotrebu u medicini.

2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bakterijski soj koji ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili diluent.

3. Nutritivni dodatak koji sadrži bakterijski soj koji ima (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029 i nutritivno prihvatljiv ekscipijens, nosač ili diluent.

4. Probiotska kompozicija, hrana za životinje, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak ishrani koja sadrži bakterijski soj (a) 16S rRNK indentitet bar 99.5% sa sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029, ili (b) DNK-DNK homologiju bar 95% identičnu sa bakterijskim sojem koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod pristupnim brojem NCIMB 14029.

5. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili farmaceutska kompozicija, nutritivni dodatak, probiotska kompozicija, hrana za životinje, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak ishrani prema bilo kom od zahteva 2-4, što bakterijski soj je soj koji pripada vrsti Roseburia hominis deponovanoj pod brojem NCIMB 14029.

6. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili farmaceutska kompozicija, nutritivni dodatak, probiotska kompozicija, hrana za životinje, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak ishrani prema bilo kom od zahteva 2-4, što se bakterijski genom sastoji od 3,592,125-bp hromozoma sa četiri ribozomalna operona i, 66 RNKs i 3,273 predviđenih proteina.

7. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili farmaceutska kompozicija, nutritivni dodatak, probiotska kompozicija, hrana za životinje, prehrambeni proizvod, dijetetski suplement ili dodatak ishrani prema bilo kom od zahteva 2-4, što bakterijski soj u obliku liofilizovane populacije bakterija.

8. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 5, gde je soj za upotrebu u regulaciji imunog sistema kod subjekta.

9. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 8, što je regulacija imunog sistema regulacija urođenog imunskog sistema subjekta.

10. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili 5 , što je poremećaj odabran za upotrebu u lečenju poremećaja izabranog od inflamatornog poremećaja, imunog poremećaja i intestinalnog poremećaja kao što je poremećaj odabran između: sindroma iritabilnog creva (IBS), kolitisa, inflamatorne bolesti creva (IBD), uključujući Kronovu bolest i ulcerozni kolitis, paučitis, funkcionalnu dispepsiju, funkcionalnu konstipaciju, funkcionalnu dijareju uključujući sa antibioticima povezanu dijareju, putničku dijareju i pedijatrijsku dijareju, funkcionalni abdominalni bol, funkcionalnu nadutost, sindrom epigastričnog bola, postprandijalni distres sindrom, gastrointestinalnu refluksnu bolest (GERD), autoimune bolesti kao što su dijabetes, artritis, multipla skleroza i psorijaza, alergije, atopične bolesti npr. atopijski dermatitis, nekrotizirajući enterokolitis, druge infekcije, celijakija , i rinitis i njihove kombinacije.

11. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 5, što je soj za upotrebu u popravljanju crevne mikroflore kod subjekta, što je za upotrebu u unapređenju zdravlja creva subjekta, što je za upotrebu u unapređenju Treg ćelija i mehanizama tolerancije imunog sistema ili je za upotrebu u održavanju imune homeostaze kod subjekta.

12. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 5, gde je soj za upotrebu u povećavanju apetita subjekta.

13. Bakterijski soj za upotrebu u zahtevu 1 ili zahtevu 5, gde soj je za upotrebu u negativnoj regulaciji ekspresije gena u vezi sa supesijom apetita, opciono gde je gen Npy2r ili Cartpt.

14. Bakterijski soj za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 5, gde je soj za upotrebu u unapređivanju telesne mase kod subjekta.

15. Bakterijski soj za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 5 - 14, pri čemu bakterijski soj:

(i) reguliše indukciju i/ili ekspresiju najmanje jednog gena za mobilizaciju ili hemotaksu, poželjnije pozitivno reguliše ekspresiju gena izabranog od MobA i MobL; ili

(ii) reguliše najmanje jedan gen odabran od FlaA1, Fla2, FlaA3, i FlaB; ili

(iii) reguliše ekspresiju najmanje jednog od sledećeg: acetil-CoA acetiltransferaza, 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenaza, butiril-CoA dehidrogenaza, beta podjedinice elektronprenosnog-flavoproteina, alfa podjedinice elektron-prenosnog-flavoproteina; ili

(iv) negativno reguliše ekspresiju najmanje jednog gena izabranog od Agt, Cartpt, Cck, Cxcl12 i Gcg; ili

(v) aktivira najmanje jedan gen za imunski odgovor u kolonu ili ileumu; ili

(vi) aktivira adaptivni imuni odgovor i reguliše indukciju i/ili ekspresiju gena povezanih sa regulacijom T-ćelija; ili

(vii) pozitivno reguliše ekspresiju najmanje jednog gena izabranog od Ly6g6c i Ly6g6e u uzlaznom kolonu; ili

(viii) reguliše ekspresiju najmanje jednog gena koji je izabran od Tlr5, Tlr1, Vnn1, Dejb37, Pla2g, Muc16, ltln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 i Tcfe2a.

16. Bakterijski soj za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 ili 5-15, gde je subjekat sisar, poželjno čovek.

17. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 2, što je kompozicija prilagođena za oralno davanje.

18. Postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije prema zahtevu 2 ili nutritivnog dodatka prema zahtevu 3, pri čemu pomenuti postupak obuhvata mešanje bakterijskog soja sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, nosačem ili diluentom ili nutritivno prihvatljivim ekscipinesom, nosačem ili diluentom.